CN115785485A - 一种白及多糖-明胶水凝胶的制备方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种白及多糖‑明胶水凝胶的制备方法及其在伤口止血和急、慢性创伤修复中的应用。本发明方法制备的包含中药有效成分白及多糖和天然生物材料明胶的水凝胶，特别适用于创伤修复和止血，是由白及多糖和明胶经改性后，再通过席夫碱反应交联形成。本发明的白及多糖‑明胶水凝胶具有良好的生物相容性、生物降解性、力学性能，适合在外科医疗领域应用。

Description

一种白及多糖-明胶水凝胶的制备方法及其应用

技术领域

本发明属于医药技术领域，涉及一种白及多糖-明胶水凝胶及其制备方法，用于急性创面包括烧伤、擦伤、手术创伤、撕裂伤、战场贯穿伤等疾病以及慢性创伤包括糖尿病足、糖尿病疮疡、褥疮等疾病。

背景技术

皮肤创伤是临床常见的外科问题。皮肤创伤主要包含四个经典修复阶段：止血期、炎症期、增殖期和组织重塑期，涉及组织和细胞之间复杂而有序的相互作用。急性创伤如烧伤、撕裂伤、挫伤、手术创伤和战场贯穿伤等通常引起出血、疼痛并伴随固有保护功能的丧失。慢性创伤如糖尿病足、糖尿病疮疡、褥疮等通常表现出长时间的炎症期和大量的炎症浸润，与炎症细胞及其分泌物(促炎细胞因子和活性氧簇)的持续存在有关。过度炎症使伤口愈合一直处于病理炎症期很难向增殖期转换，从而减缓伤口整体愈合时间，降低修复质量。每年有数百万人遭受急慢性创伤带来的伤害，外伤管理仍然是临床外科中值得关注的重要问题。

外伤的临床处理要求包括有效止血、伤口闭合、防止感染等，目前临床中常用敷料如纱布、绷带等无法满足要求，因此探索和开发新型多功能生物材料系统具有一定必要性和迫切性。水凝胶敷料在组织工程和再生医学领域受到广泛的关注，水凝胶满足“湿性愈合理论”的要求，可以模拟软组织和细胞外基质成分发挥填充、黏附、止血和促进创面愈合等作用。

白及多糖是中药白及的主要有效成分，是发挥促凝血、抗菌、抗炎、抗氧化、黏膜保护、创伤修复等多种药理作用的关键成分。白及多糖又称葡甘露聚糖，是由α-甘露糖、β-甘露糖和β-葡萄糖以糖苷键连接而成的一种中性粘多糖。白及多糖具有葡甘露聚糖的结构，能够参与细胞内或细胞间信号传导，表现出典型的免疫活性增强能力，相较于合成高分子材料容易满足多种药理需求。但是较差的力学性能和流动性限制了其在体内外的应用。借助白及多糖主链结构的稳定性和易修饰性，有望通过修饰后与其他聚合物共同设计出一种创新的生物材料，并保持原有药理性能，开拓其在创面敷料和药物传递等领域的应用。

明胶是一种通过化学、物理或酶法水解从I型胶原蛋白中提取而来的天然蛋白质，广泛应用于医药、化妆品和医疗等领域。明胶不具有细胞毒性，与胶原蛋白相比免疫原性较低，被公认为安全的生物材料。明胶的结构中含有精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸序列的生物功能片段，可以改善细胞的粘附、分化和增殖。明胶含有的羧基和氨基之间具有强烈的氢键作用，导致其在较低温度下发生胶凝。鉴于这种特性，通过引入氨基的方式可以改变羧基和氨基的比例，有效改善其流动性，开拓应用范围。

发明内容

本发明提供了一种白及多糖-明胶水凝胶的制备方法及其在伤口出血和急慢性创伤愈合中的应用。本发明以中药白及中有效成分白及多糖与天然生物材料明胶为基质材料，经改性后通过席夫碱反应制备水凝胶，该水凝胶具有良好的生物相容性、生物可降解性、力学性能以及作为药物载体的潜力。本发明的白及多糖-明胶水凝胶在急性创面包括烧伤、擦伤、手术创伤、撕裂伤、战场贯穿伤等疾病以及慢性创伤包括糖尿病足、糖尿病疮疡、褥疮等疾病中具有极大的应用前景。

为实现本发明的目的，本发明一方面提供一种白及多糖-明胶水凝胶的制备方法，包括如下步骤：

1)对白及多糖进行氧化反应，制备获得醛基白及多糖；

2)对天然生物材料明胶进行接枝反应，制备获得阳离子明胶；

3)将醛基白及多糖溶于水中，配制成醛基白及多糖水溶液；将阳离子明胶溶于水中，配制成阳离子明胶水溶液；

4)将醛基白及多糖水溶液与阳离子明胶水溶液混合，醛基白及多糖的醛基和阳离子明胶的氨基发生席夫碱反应，制成白及多糖-明胶水凝胶。

其中，步骤1)中所述氧化反应为氧化剂高碘酸钠氧化白及多糖，生成醛基白及多糖。

特别是，步骤1)中所述氧化反应按照如下步骤进行：

1A)将白及多糖溶于水中，配制成白及多糖水溶液；

1B)在避光条件下，向白及多糖水溶液中加入高碘酸钠水溶液，进行氧化反应，获得醛基白及多糖。

其中，步骤1A)中所述白及多糖水溶液中白及多糖与水的质量体积百分比浓度为0.5-1％，优选为0.72 -1％，即每100ml水中加入的白及多糖0.5-1g，优选为0.72 -1g。

特别是，步骤1B)中高碘酸钠水溶液的质量体积百分比浓度为0.04-0.22％，优选为0.048-0.214％，优选为0.128％，即每100ml水中加入的高碘酸钠0.048-0.214g，优选为0.128g。

尤其是，所述白及多糖水溶液中的白及多糖与高碘酸钠水溶液中的高碘酸钠的摩尔比为1：(0.2-1)，优选为1：0.6。

特别是，步骤1B)中氧化反应的温度为15-60℃，优选为20-60℃，进一步优选为22±2℃；反应时间为2-12h，优选为8-12h，进一步优选为8h。

尤其是，还包括在氧化反应后，向反应体系内加入反应终止剂，终止氧化反应。

特别是，所述反应终止剂为乙二醇。

尤其是，所述反应终止剂乙二醇与高碘酸钠的摩尔比为1：(0.5-1.2)，优选为1：1。

特别是，还包括步骤1C)，对氧化反应后的混合物体系进行透析处理，并对透析产物进行干燥，获得醛基白及多糖。

尤其是，所述透析处理使用截留分子量≤7000D的透析袋，醛基白及多糖被截留在透析袋内，干燥后获得醛基白及多糖。

尤其是，所述透析处理时间为2-4天，优选为3天；透析过程中每天换水3-5次，优选为4次。

尤其是，经过冷冻干燥，获得醛基白及多糖。

其中，步骤2)中所述接枝反应按照如下步骤进行：

2A)将明胶溶于磷酸二氢钠溶液中，配制成明胶-磷酸二氢钠溶液；

2B)向明胶-磷酸二氢钠溶液中加入氨基供给剂，在催化剂的作用下，进行接枝反应，制得所述的阳离子明胶。

特别是，步骤2A)中所述磷酸二氢钠溶液的浓度为0.05-0.15mol/L，优选为0.1mol/L，pH为5。

特别是，所述明胶与磷酸二氢钠溶液的质量体积之比为1：(20-30)，优选为1:25，即每1g明胶，溶解于20-30mL的磷酸二氢钠溶液中，优选为25mL。

其中，步骤2B)中所述氨基供给剂为乙二胺或精胺，优选为乙二胺。

特别是，所述乙二胺与明胶-磷酸二氢钠溶液中的明胶的体积质量比为(2 -4)：1)，优选为3.2:1。

尤其是，在加入氨基供给剂后，向混合液中加入盐酸，调节反应化合物的pH为4.5-5.5(优选为5.0)后，再加入催化剂，进行所述的接枝反应。

其中，所述催化剂选择EDC(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)。

特别是，EDC与明胶-磷酸二氢钠溶液中的明胶的质量之比为(0.5-1)：1)，优选为0.62：1。

特别是，在加入催化剂之后，再加入磷酸二氢钠溶液，提供缓冲环境，维持体系的pH为5-6，进行所述的接枝反应。

尤其是，所述接枝反应的时间为0.5-2h，优选为1h；接枝反应温度为37±0.2℃；接枝反应的pH为5-6。

特别是，还包括步骤2C)，对接枝反应后的混合物体系进行透析处理，并对透析产物进行干燥，获得阳离子明胶。

尤其是，所述透析处理使用截留分子量≤7000D的透析袋，阳离子明胶被截留在透析袋内，干燥后获得阳离子明胶干粉。

尤其是，所述透析处理时间为2-4天，优选为3天；透析过程中每天换水3-4次，优选为3次。

尤其是，透析处理后的产物经冷冻干燥，获得阳离子明胶干粉。

其中，步骤3)中所述醛基白及多糖水溶液的质量百分比浓度为3-10％，优选为4％；所述阳离子明胶溶液的质量浓度为10-50％，优选为20％。

特别是，步骤4)中所述醛基白及多糖水溶液与阳离子明胶水溶液的体积之比为1：(0.8-1.2)，优选为1：1。

尤其是，步骤4)中所述醛基白及多糖水溶液与阳离子明胶水溶液混合后，静置5-10min，胶凝反应，制得所述的白及多糖水凝胶。

其中，所述胶凝处理温度为15-35℃，优选为22±2℃；胶凝处理时间5-10min，优选为6min。

特别是，还包括步骤5)，将步骤4)制得的白及多糖水凝胶进行干燥处理，制成白及多糖水凝胶粉。

本发明另一方面提供一种按照上述方法制备而成的白及多糖-明胶水凝胶。

本发明又一方面提供一种白及多糖-明胶水凝胶应用于伤口止血和急、慢性创伤修复。

本发明再一方面提供一种白及多糖-明胶水凝胶在制备急、慢性创伤修复的药物中的应用；在制备用于创面敷料、用于药物传递载体中的应用。

其中，所述急性创面为烧伤、擦伤、手术创伤、撕裂伤、战场贯穿伤等疾病；所述慢性创伤包括糖尿病足、糖尿病疮疡、褥疮等疾病。

与现有技术相比，本发明具有如下的明显优点：

本发明通过席夫碱反应制备席夫碱交联水凝胶，白及多糖-明胶水凝胶中未引入其他有机试剂，水凝胶具有良好的生物安全性。中药有效成分白及多糖和天然生物材料明胶改性修饰处理，使其成为制备水凝胶的基质材料，其中白及多糖发挥“药辅双效”的作用，既作为基质参与水凝胶的构建，又表现出良好的促进愈合功能。

附图说明

图1为BSP、BSP-CHO的傅里叶红外变换光谱图，其中BSP：白及多糖；BSP-CHO：醛基白及多糖。

图2为B型明胶、GC的傅里叶外光变换红谱图，其中Gelatin：明胶；CG：阳离子明胶。

图3为傅里叶变换红外光谱图，其中BSP-CHO：醛基白及多糖；CG：阳离子明胶；Mixture：醛基白及多糖和阳离子明胶物理混合物；BG-gel 2：白及多糖-明胶水凝胶。

图4为白及多糖-明胶水凝胶扫描电镜图，其中(a)为BG-gel 1；(b)为BG-gel 2；(c)为BG-gel 3。

图5为BG-gel 1、2、3水凝胶共培养L929细胞株后细胞存活率图。

图6为BG-gel 2SD大鼠皮下降解水凝胶后，皮下组织的HE染色显微观察图。

图7为空白组、白及多糖水溶液组、明胶海绵组、BG-gel 2水凝胶对大鼠全层皮肤缺损模型创面愈合的评价的HE染色图。

图8为空白组、白及多糖水溶液组、明胶海绵组、BG-gel 2水凝胶对大鼠全层皮肤缺损模型创面愈合的评价的伤口面积的定量分析。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。但这些实施例仅限于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体实验条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照厂商所建议的条件。

以下通过试验例来进一步阐述本发明所述白及多糖-明胶水凝胶对创面愈合的治疗作用，这些试验例包括了本发明白及多糖-明胶水凝胶的结构表征、生物安全性实验、体内降解实验及本发明白及多糖-明胶水凝胶作为药物载体的药物释放实验和体内药效学试验。

实施例1制备醛基白及多糖(BSP-CHO)

1A、配制白及多糖-水溶液

称取1.8g白及多糖(BSP)加入到250mL去离子水中，40℃下搅拌30min使其充分溶解，配制成白及多糖-水溶液，其中白及多糖-水溶液的质量-体积百分比浓度为0.72％(通常为0.5-1.0％)。

本实施例中以质量体积百分比浓度为0.72％的白及多糖-水溶液为例进行说明，其他浓度为0.5-1.0％的白及多糖-水溶液均适用于本发明。

1B、配制高碘酸钠水溶液

称取高碘酸钠粉末(0.128g)，加入到去离子水(1mL)中，溶解，并混合均匀，配制成高碘酸钠水溶液，其中高碘酸钠水溶液的质量-体积百分比浓度为0.128％(通常为0.04-0.22％，优选为0.048-0.214％)。

本实施例中以质量-体积百分比浓度为0.128％的高碘酸钠水溶液为例进行说明，其他浓度为0.04-0.22％(优选为0.048-0.214％)的高碘酸钠水溶液均适用于本发明。

1C、氧化反应

避光条件下，将高碘酸钠水溶液逐滴加入到白及多糖水溶液中，室温(22±2℃)下避光进行氧化反应，高碘酸钠与白及多糖发生氧化反应，将白及多糖中临位羟基氧化成醛基，生成醛基白及多糖(BSP-CHO)；其中氧化反应时间为8h(通常为2-10h)；氧化反应温度为22±2℃(通常为20-60℃)；

其中：按照高碘酸钠与白及多糖的摩尔比分别为1:0.6；1:0.8；1:1进行氧化还原反应；

氧化反应8h(通常为2-10h)后，分别加入反应终止剂乙二醇(5mL)继续搅拌30min，以终止氧化反应；其中；乙二醇与高碘酸钠的摩尔比为1:1(通常为1:0.5-1.2)。

乙二醇可以终止高碘酸钠氧化白及多糖的反应，将未反应完的高碘酸钠消耗掉。

高碘酸钠只会氧化邻位羟基，变成双醛基，BSP的一个重复单元只有一个氧化位点，生成的物质是相对单一的。

1D、透析处理

将步骤1C)的反应混合液分别装入透析袋(截留分子量＝7000)中，在去离子水中进行透析处理，透析处理时间为3天(通常2-4天)，每天换水4次(通常3-5次)。

透析结束后将透析袋内的透析产物分别于-80℃冰箱预冻后，在分别于真空冷冻干燥机中进行冷冻干燥，得到醛基白及多糖(BSP-CHO)，其中：

按照高碘酸钠与白及多糖的摩尔比分别为1：0.6；1：0.8；1：1进行氧化反应之后，透析处理、冷冻干燥后得到的醛基白及多糖分别记为BSP-CHO 1-3。

透析袋的截留分子量低于7000的均适用于本发明，透析袋的截留分子量不能超过7000。

采用盐酸羟胺-氢氧化钠电位滴定法测定制备的醛基白及多糖的氧化度，步骤1D)制得的醛基白及多糖的BSP-CHO 1-3的氧化度分别为28％、41％、53％。

取步骤1D在)制得的醛基白及多糖(BSP-CHO 1)、原料白及多糖分别与溴化钾混合压片，以空白溴化钾片作为对照，在傅里叶变换红外光谱仪上对样品的红外光谱进行测定，设定波数范围为4000-400cm^-1，红外光谱测定结果如图1所示。

由图1可知，在4000-400cm^-1处为典型的多糖结构信号红外图谱，在3383cm^-1处为O-H的伸缩振动，在2927cm^-1处代表糖类-CH₂或者-CH₃中C-H伸缩振动，在1154cm^-1和1024cm^-1处为吡喃糖的特征吸收峰。此外，在898cm^-1处的吸收峰代表糖苷键构型为β型。与白及多糖相比，醛基白及多糖在1728cm^-1的吸收峰显著增强代表醛基C＝O有关的伸缩振动。红外图谱结果确认了白及多糖被氧化为醛基白及多糖。

实施例2制备阳离子明胶(CG)

2A、配制磷酸二氢钠溶液

精密称取磷酸二氢钠9.36g定容于1000mL容量瓶中，使用氢氧化钠溶液调节pH至5，制得0.1mol/L的磷酸二氢钠溶液，备用。

本发明中磷酸二氢钠溶液的浓度为0.1mol/L，pH为5。

2B、称取B型明胶(gelatin,1g)溶解在步骤2A)中配制的磷酸二氢钠溶液(25mL)中，磁力搅拌至完全溶解，配制成明胶-磷酸二氢钠溶液，其中，明胶与磷酸二氢钠溶液的质量-体积之比为1:25，即1g B型明胶溶于25mL磷酸二氢钠溶液；

通常明胶与磷酸二氢钠溶液的质量-体积之比为1:20-30，优选为1:25，即每1g B型明胶溶解于20-30mL的磷酸二氢钠溶液，优选为1g B型明胶溶解于25mL的磷酸二氢钠溶液。

2C、接着向明胶-磷酸二氢钠溶液中加入3.2mL乙二胺(氨基供给剂)，其中乙二胺与明胶-磷酸二氢钠溶液中的明胶的体积质量比为3.2:1(通常为(2 -4)：1)，搅拌均匀后用6mol/L盐酸调节溶液的pH至5(通常为4.5-5.5)；接着加入催化剂EDC(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，0.62g)，其中EDC与明胶-磷酸二氢钠溶液中的明胶的质量之比为0.62：1(通常为(0.5-1)：1)；然后加入步骤2A)配制的磷酸二氢钠溶液将体系调至50mL，以保持溶液pH 5-6(优选pH为5)，37±0.2℃下搅拌1h(通常为0.5-2h)，接枝反应1h(通常为0.5-2h)后，再将接枝反应混合液转移至透析袋(cut off Mw＝7000)中，在去离子水中进行透析处理3d(通常为2-4d)，每天换水3次；再然后将透析处理结束后，透析袋内的产物进行冷冻干燥，得到阳离子明胶(CG)。

将乙二胺接枝到B型明胶上，以提供氨基基团，氨基供给剂除了乙二胺之外，精胺也适用。

EDC催化明胶与乙二胺的接枝反应，加入磷酸二氢钠盐溶液提供缓冲环境，保持溶液弱酸性状态，pH为5-6。

取制备的阳离子明胶(CG)样品、B型明胶，分别与溴化钾混合压片，以空白溴化钾片作为对照，在傅里叶变换红外光谱仪上对样品的红外光谱进行测定，设定波数范围为4000-400cm^-1，测试结果如图2所示。

由图2可知，明胶在3400cm^-1左右处的特征吸收谱带归属于O-H和N-H伸缩振动，2932cm^-1处的特征吸收谱带归属于酰胺亚甲基的C-H反对称伸缩振动，1654cm^-1处的吸收谱带为酰胺I带的C＝O伸缩振动，1533cm^-1处的吸收峰为酰胺II带的N-H面内弯曲振动与具有双键性质C-N伸缩振动的耦合，1458cm^-1处的特征吸收谱带归属于亚甲基的C-H面内弯曲振动，1244cm^-1处的吸收峰为酰胺Ⅲ带的N-H弯曲振动和C-N伸缩振动。与明胶相比，阳离子明胶在3400cm^-1左右的特征吸收谱带更宽，在2932cm^-1处的亚甲基的伸缩振动吸收峰增强，1654cm^-1酰胺I谱带的C＝O键的伸缩振动的吸收峰附近明显增强，1533cm^-1酰胺II带的C-N伸缩振动的吸收峰有明显增强，1458cm^-1处C-H弯曲振动吸收峰有显著增强。这些都充分说明了乙二胺和明胶发生了接枝化学反应，从而引入了氨基、酰胺II键及亚甲基基团。

实施例3制备白及多糖-明胶水凝胶(BG-gel)

3A、将实施例1制备的三种醛基白及多糖BSP-CHO 1-3分别溶于水，配制成三种醛基白及多糖水溶液(简称BG-CHO溶液)，其中醛基白及多糖水溶液的质量百分比浓度为4％(通常为3-10％)

3B、称取阳离子明胶，溶于去离子水中，配制成质量浓度为20％(通常为10-50％)的阳离子明胶溶液。

3C、将3种醛基白及多糖水溶液分别和阳离子明胶溶液混合，并于室温下静置，进行胶凝处理，得到白及多糖-明胶水凝胶BG-gel，即分别制得3种白及多糖-明胶水凝胶BG-gel 1-3；其中，胶凝处理温度为室温22±2℃(通常为15-35℃)；胶凝处理时间为6min(通常为5-10min)；醛基白及多糖水溶液和阳离子明胶溶液的体积之比为1:1(通常为1:0.8-1.2)。

所述醛基白及多糖水溶液的质量百分比浓度为3-10％(优选为4％)；阳离子明胶溶液的质量百分比浓度为10-50％(优选为20％)。

试验例1红外光谱实验

将实施例3中制备的白及多糖-明胶水凝胶BG-gel 2进行冷冻干燥，将干燥后的BG-gel 2固体进行研磨，制得白及多糖-明胶水凝胶粉末(BG-gel 2粉末)；

将实施例1中制备的醛基白及多糖BSP-CHO 2与实施例2制得CG进行简单混合，其中BSP-CHO 2与CG的质量之比为1:1，制得BSP-CHO和CG的混合物(记为Mixture，BSP-CHO---CG)；

将BG-gel 2粉末、Mixture、实施例1中制备的醛基白及多糖BSP-CHO 2、实施例2制备的CG分别与溴化钾混合压片，以空白溴化钾片作为对照，在傅里叶变换红外光谱仪上对样品的红外光谱进行测定，设定波数范围为4000-400cm^-1，实验结果如图3所示。

由图3可知，与BSP-CHO相比，样品BG-gel 2粉末的红外光谱图中1728cm^-1处的醛基C＝O有关的伸缩振动消失，1636cm^-1处为C＝N的伸缩振动峰，CG中3400cm^-1处胺基的吸收峰在反应后基本消失，代表氨基被反应。这几处特征峰的变化，表明醛基白及多糖BSP-CHO的醛基与CG的胺基发生了席夫碱反应，醛基和氨基特征峰基本消失，形成了新的C＝N键峰，证明BG-gel 1、2、3水凝胶的生成。

试验例2冻干BG-gel 1、2、3的扫描电镜观察

将实施例3中制备的三种水凝胶(BG-gel 1-3)浸泡在液氮中脆断，使水凝胶的横截面暴露出来，然后将暴露横截面的水凝胶放置在扫描电镜的样品台上，于扫描电镜下观察水凝胶内部形貌，结果如图4所示，其中a、b、c分别表示为BG-gel 1、BG-gel 2、BG-gel 3的内部电镜形貌。

然后，将拍摄的BG-gel 1-3的扫描电镜照片导入使用Image J软件中，设置照片的比例尺，然后在凝胶孔径的直径位置画线，读数即为凝胶的孔径长度。

由图4可知，水凝胶内部呈现多孔结构，各孔洞之间交联互通，随着BSP-CHO氧化度的增加，交联密度呈现增加趋势，BG-gel 1、BG-gel 2和BG-gel 3水凝胶的孔径由大变小，从100μm左右减小到40μm左右。

本发明方法制备的BG-gel水凝胶具有良好的吸水性和较大的微孔尺寸，可能在创面应用中吸收血液，浓缩血细胞和凝血因子，还可能吸收创面渗出物，传递营养/代谢物，从而在止血和创面愈合中发挥关键作用。同时，水凝胶的孔隙结构可以作为药物的天然储库有效增加药物的生物利用度。

试验例3白及多糖-明胶水凝胶的细胞安全性评价

分别将实施例3中制备的BG-gel 1、BG-gel 2、BG-gel 3水凝胶于模具中取出，分别用无菌刀片切割成厚度2mm的圆盘状样品，在超净台内用无菌PBS(磷酸盐缓冲液)反复冲洗2次，切割成的圆盘状样品正反两面分别使用紫外线照射，灭菌处理2h，制得3种灭菌水凝胶样品(即BG-gel 1、BG-gel 2、BG-gel 3样品)。

将小鼠呈成纤维细胞L929按照1×10⁴/孔的密度接种于48孔聚苯乙烯培养板中，每孔含500μL完全培养基，48孔板培养细胞分为4组(对照组：Control；3个样品组：BG-gel 1组、BG-gel 2组、BG-gel 3组)，每组6个重复，其中对照组，不加入水凝胶样品，只使用完全培养基正常培养。待细胞贴壁后将灭菌处理后的3种水凝胶样品分别加入到48孔培养板中对应培养孔中继续培养24h，然后加入MTT检测试剂，然后通过酶标仪在540nm处读取吸光度值，根据下列公式计算细胞存活率。结果如图5所示。

细胞存活率(％)＝[(As-Ab)/(Ac-Ab)]×100％

As:实验孔吸光度(含细胞、培养基、CCK-8溶液和药物溶液)；Ac:对照孔吸光度(含细胞、培养基、CCK-8溶液，不含药物)；Ab:空白孔吸光度(含培养基、CCK-8溶液，不含细胞、药物)

由图5可知，3种凝胶组(即3个样品组)表现出与对照组一样的细胞活性，三种水凝胶与细胞共培养后，细胞活力与空白对照组的相同，未见差别，三种水凝胶均具有良好的生物相容性，对细胞生长代谢无影响，安全性高。

试验例4白及多糖-明胶水凝胶SD大鼠体内降解实验

将SD大鼠，购自北京维通利华实验动物技术公司(许可证号：SCXK(京)2019-0008)，于天津中医药大学动物中心饲养(伦理审查编号：TCM-LACE2021212)麻醉后使用电动剃毛器将其背部毛发剃除。

将实施例1制备的BSP-CHO 2与去离子水混合，配制成BSP-CHO 2-水溶液，其中醛基白及多糖水溶液的质量百分比浓度为4％(通常为3-10％)

将实施例2制备的阳离子明胶(CG)与去离子水混合，配制成CG-水溶液，CG的质量浓度为20％(通常为10-50％)的阳离子明胶溶液。

将制备的BSP-CHO 2水溶液与CG-水溶液等体积混合，搅拌均匀，配制成白及多糖-明胶水凝胶前驱液，然后立即用1mL注射器将混合液(即白及多糖-明胶水凝胶前驱液)注入SD大鼠背部皮下，同时注射15只大鼠，每只注射300μL，并且在注射后，于第3、7、14、21、28天切除植入的水凝胶及其周围组织，每次取三只大鼠组织，观察水凝胶在大鼠体内降解情况，组织切片采用H&E染色法进行周围组织病理学分析，结果如图6所示。

由图6可知，本发明制备的白及多糖-明胶水凝胶前驱液可以通过注射的方式，注入皮下，表明该水凝胶可以作为药物或细胞载体以注射形式进行体内给药。

注射白及多糖-明胶水凝胶前驱液后，白及多糖-明胶水凝胶前驱液在皮下胶凝成水凝胶BG gel 2，观察大鼠生存情况，发现大鼠生存状况良好，并未受到影响，所有大鼠均未出现死亡现象。

通过H&E染色法对注射后的第3d、7d、14d、21d、28d时大鼠背部隆起部位附近组织进行组织病理学分析。由H&E染色结果可知，

注射第3d，水凝胶与周围组织仍有间隙，周围组织出现轻微炎症浸润；

第7d、14d，水凝胶周围有一薄纤维包膜，组织周围可见明显的炎性细胞浸润，尤其以14d时炎症浸润严重，这表明本发明的水凝胶经体内注射后产生一定程度的急性炎症反应，是大鼠机体对外物的排斥现象；

第21d，水凝胶与周围组织融合，炎症浸润明显减弱；

第28d，水凝胶周围组织与对照组无异，证明水凝胶的体内安全性；

且第28d时观察皮下注射大鼠的背部已经没有凸起，HE染色同样表明注射组和空白对照组的皮下无异，说明本发明的水凝胶在体内降解。水凝胶的体内可降解性是避免手术风险和痛苦的重要特性。

水凝胶的体内降解情况进行了28d的测定，在注射后的21d内可见大鼠背部凸起的水凝胶结构体逐渐减小，21d后几乎消失，28d时大鼠背部外观与对照组无异。这证明本发明制备的白及多糖-明胶水凝胶在体内可以降解，并且降解速度稳定，可以作为药物或者细胞载体应用于体内。

本发明制备的水凝胶BG gel 1、3具有与BG gel 2相同的效果，在体内可以降解，且降解速度稳定，可以作为药物或者细胞载体应用于体内。

试验例5白及多糖-明胶水凝胶SD大鼠全层皮肤缺损模型愈合促进实验

SD大鼠术前饲养1周，适应良好生长的环境。所有的手术器械都经过高压灭菌和消毒。所有大鼠随机分为5组(每组6只，n＝6)：空白组、Control(对照)组、BSP(白及多糖水溶液)组、Sponge组(明胶海绵，阳性药物组)、BG-gel 2组；其中BSP(白及多糖水溶液)组中白及多糖水溶液为将白及多糖与水混合，溶解，其中白及多糖水溶液中白及多糖的浓度为4％；BG-gel 2组是BSP-CHO 2与CG反应形成的水凝胶。

首先，将各组大鼠麻醉后，用切割器及解剖剪刀在其背部制作直径10mm的全层皮肤创面，将造模大鼠随机分为4组，Control组即空白对照组用PBS处理，Sponge组：明胶海绵处理，BSP组：BSP水溶液处理，BG-gel 2水凝胶组：BG-gel 2处理。

然后，Control组创面涂无菌PBS溶液，BSP组创面涂抹BSP水溶液、Sponge组和BG-gel 2组分别用明胶海绵、BG-gel 2水凝胶覆盖大鼠的伤口，待液体吸收后，所有组均使用无菌纱布覆盖，并用绷带固定在大鼠背部。为了防止大鼠之间互相撕咬舔舐，单笼饲养大鼠。

分别于施药第0d、4d、7d、10d、14d，利用数码相机对创面进行照片采集(图7)，将采集的照片导入ImageJ软件中，用ImageJ软件测量创面面积，测定结果如图8。

由图7、8可知，各组创面部位随时间逐渐闭合，逐渐闭合的伤口的创面面积占原创面面积之比，简称创面占比，第4d时：Control组创面面积占原创面之比(创面占比)65.7±17.5％，Sponge组的创面占比为57.7±13％，BSP组的创面占比为61.2±2.8％，BG-gel组的创面占比为58.6±13.3％，其中空白组和海绵组创面可见黄色渗出物，创面炎症明显，而BSP组和BG-gel 2组创面保持湿润；第7d时：BSP组和BG-gel组愈合速度最快，创面面积占比分别为47.2±6.8％和32.5±12.6％；而Control组创面愈合呈现一种聚拢式愈合方式，虽然创面的面积逐渐缩小，但是创面并不平整，而是呈现出凹陷的状态，并未表现出上皮化，而水凝胶组(即BG-gel组)则表现出伤口的上皮化，空白组和海绵组因创面炎症严重，表现出愈合缓慢的现象；第10d和第14d时：BG-gel组明显优于其他组的创面愈合进展。与阳性对照明胶海绵相比，BG-gel的具有大微孔尺寸的水凝胶具有更好的伤口愈合性能，主要是由于其优越的止血性能和保持创面湿润的能力。在给药的第14d，BG-gel组创口几乎闭合，仅占原创面的1％左右。值得注意的是在第10d和14d时，Control组与BSP组具有相似的愈合效果，仅次于BG-gel水凝胶，但是空白组创面愈合呈现一种聚拢式愈合方式，虽然创面床的面积逐渐缩小，但是创面床并不平整，而是呈现出凹陷的状态，而BSP组和BG-gel组均表现出较好的上皮化，创面床被新生真皮填充。综上所述，本发明的白及多糖-明胶水凝胶的生物相容性和止血作用均影响其在体创面愈合性能。

本发明制备的水凝胶BG gel 1、3具有与BG gel 2相同的效果。

综上所述，本发明制备白及多糖-明胶水凝胶，操作简单，条件温和。水凝胶具良好的生物相容性和生物降解性，水凝胶还可以作为药物载体有效减缓药物释放过程。本发明的白及多糖-明胶水凝胶可以促进创面修复，加速创伤愈合，在临床外科应用中具有广阔前景。

Claims (10)

1.一种白及多糖-明胶水凝胶的制备方法，其特征是，包括如下步骤：

1)对白及多糖进行氧化反应，制备获得醛基白及多糖；

2)对天然生物材料明胶进行接枝反应，制备获得阳离子明胶；

3)将醛基白及多糖溶于水中，配制成醛基白及多糖水溶液；将阳离子明胶溶于水中，配制成阳离子明胶水溶液；

4)将醛基白及多糖水溶液与阳离子明胶水溶液混合，醛基白及多糖的醛基和阳离子明胶的氨基发生席夫碱反应，静置、胶凝处理，制成白及多糖-明胶水凝胶。

2.如权利要求1所述的制备方法，其特征是，步骤1)中采用高碘酸钠对白及多糖进行所述的氧化反应。

3.如权利要求1或2所述的制备方法，其特征是，所述氧化反应按照如下步骤进行：1A)将白及多糖溶于水中，配制成白及多糖水溶液；

1B)在避光条件下，向白及多糖水溶液中加入高碘酸钠水溶液，进行氧化反应，获得醛基白及多糖。

4.如权利要求1或2所述的制备方法，其特征是，步骤2)中所述接枝反应按照如下步骤进行：

2A)将明胶溶于磷酸二氢钠溶液中，配制成明胶-磷酸二氢钠溶液；

2B)向明胶-磷酸二氢钠溶液中加入氨基供给剂，在催化剂的作用下，进行接枝反应，制得所述的阳离子明胶。

5.如权利要求1或2所述的制备方法，其特征是，步骤3)中所述醛基白及多糖水溶液的质量百分比浓度为3-10％，优选为4％；所述阳离子明胶溶液的质量浓度为10-50％，优选为20％。

6.如权利要求1或2所述的制备方法，其特征是，步骤4)中所述醛基白及多糖水溶液与阳离子明胶水溶液的体积之比为1：(0.8-1.2)，优选为1：1。

7.如权利要求1或2所述的制备方法，其特征是，所述胶凝处理温度为15-35℃，优选为22±2℃；胶凝处理时间5-10min，优选为6min。

8.一种白及多糖-明胶水凝胶，其特征是，按照如权利要求1-7任一所述方法制备而成。

9.一种如权利要求8所述白及多糖-明胶水凝胶应用于伤口止血和急、慢性创伤修复。

10.一种如权利要求8所述白及多糖-明胶水凝胶在制备急、慢性创伤修复的药物中的应用；在制备用于创面敷料、用于药物传递载体中的应用。

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