ES2490715T3

ES2490715T3 - Composiciones que comprenden células fetales no diferenciadas para el tratamiento de trastornos cutáneos

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Publication number: ES2490715T3
Application number: ES03706830.1T
Authority: ES
Inventors: Lee Laurent-Applegate; Patrick Hohlfeld
Original assignee: Merz and Co GmbH and Co KG
Current assignee: Merz and Co GmbH and Co KG
Priority date: 2002-02-11
Filing date: 2003-02-11
Publication date: 2014-09-04
Anticipated expiration: 2023-02-11
Also published as: US9078903B2; EP1476206A1; JP2007291130A; CA2476247A1; AU2003208537A1; CN1638822A; US20130129691A1; US20030175256A1; KR20040111355A; EP1476206B1; US8394371B2; AU2003208537A2; JP2005525153A; WO2003068287A1; CA2476247C; PT1476206E

Abstract

Uso de células cutáneas fetales no diferenciadas de tejido de donante de 12-16 semanas de gestación en la preparación de un medicamento para la prevención o el tratamiento de una afección, un trastorno o una enfermedad de la piel en un sujeto sin la formación de cicatriz mediante la administración tópica, en el que el medicamento comprende una construcción de aloinjerto de tejido cutáneo tridimensional que contiene dichas células cutáneas fetales no diferenciadas integradas con una matriz de colágeno o en el que dicho medicamento comprende dichas células cutáneas fetales no diferencias combinadas con un vehículo.

Description

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DESCRIPCIÓN

Composiciones que comprenden células fetales no diferenciadas para el tratamiento de trastornos cutáneos

5 Campo de la invención

La presente invención se refiere, en general, a métodos y composiciones diseñados para el tratamiento de un sujeto que padece una afección, un trastorno o una enfermedad de la piel. Las composiciones incluyen células cutáneas fetales no diferenciadas que bien están integradas en una matriz de colágeno o están combinadas con un vehículo.

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Antecedentes de la invención

Las heridas (es decir, las laceraciones, aberturas o úlceras) pueden ser bien agudas o crónicas. Las heridas agudas normalmente son lesiones causadas por instrumentos cortantes y punzantes en la piel con poca pérdida de tejido.

15 La mayoría de las heridas agudas se cierran y cicatrizan al unir los bordes de la herida entre sí. Las heridas crónicas son heridas que no cicatrizan por completo o que lo hacen lentamente. Los ejemplos de heridas crónicas incluyen úlceras por presión (úlceras de decúbito), úlceras cutáneas diabéticas, úlceras por estasis venosa, lesiones por quemadura y defectos surgidos tras la extirpación de tumores.

20 La morfología celular de una herida consiste en tres zonas distintas: un espacio central de la herida, una zona de gradiente de isquemia local y una zona de síntesis de colágeno activo. A pesar de la necesidad de que se produzca una cicatrización más rápida de las heridas (es decir, quemaduras graves, incisiones quirúrgicas, laceraciones y otros traumatismos), hasta la fecha, solo se ha logrado acelerar de manera limitada la cicatrización de las heridas con agentes farmacológicos.

25 El objetivo principal en el tratamiento de las heridas es lograr el cierre de las mismas. Las heridas cutáneas abiertas representan una categoría importante de heridas que incluye heridas quirúrgicas y traumáticas agudas, por ejemplo, úlceras crónicas, heridas por quemaduras, así como heridas crónicas tales como úlceras neuropáticas, úlceras por presión, úlceras arteriales y venosas (estasis) o arteriovenosas mixtas, y úlceras diabéticas. Por lo general, estas

30 heridas cicatrizan según el siguiente proceso: i) inflamación, ii) proliferación de fibroblastos, iii) proliferación de vasos sanguíneos, iv) síntesis de tejido conjuntivo, v) epitelización y vi) contracción de la herida. La cicatrización de heridas se altera cuando estos componentes, ya sea individualmente o en conjunto, no funcionan correctamente. Los factores que pueden afectar a la cicatrización de heridas incluyen la malnutrición, la infección, los agentes farmacológicos (por ejemplo, fármacos citotóxicos y corticosteroides), la diabetes y la edad avanzada. Véase Hunt et

35 al., en “Current Surgical Diagnosis & Treatment” (Way; Appleton & Lange), pág. 86-98 (1988).

Hay muchos productos y protocolos diferentes disponibles para el tratamiento de las heridas crónicas. Véase, por ejemplo, Jones et al. , en “British Journal of Plastic Surgery” 55: 185-193, 2002, que se incorpora por referencia en su totalidad. Estos incluyen vendajes simples (en concreto, vendas de compresión), espumas y películas, geles y

40 coloides, y productos farmacéuticos tales como factores de crecimiento. Normalmente, para la cicatrización de las heridas se usan apósitos oclusivos húmedos en lugar de apósitos secos no oclusivos. Véase Winter, Nature 193: 293-94 (1962). Hoy en día, se usan de manera habitual numerosos tipos de apósitos en la cicatrización de heridas. Estos incluyen películas (por ejemplo, películas de poliuretano), hidrocoloides (partículas coloidales hidrófilas unidas a espuma de poliuretano), hidrogeles (polímeros reticulados que contienen aproximadamente al menos un 60 % de

45 agua), espumas (hidrófilas o hidrófobas), alginatos de calcio (materiales compuestos no tejidos de fibras de alginato de calcio) y celofán (celulosa con un plastificante). Véase Kannon et al., Dermatol. Surg. 21: 583-590 (1995); Davies, “Burns” 10: 94 (1983). Ciertos tipos de heridas (por ejemplo, úlceras diabéticas, úlceras por presión) y las heridas de ciertos sujetos (por ejemplo, receptores de corticosteroides exógenos) no cicatrizan de una manera oportuna (o en absoluto) con el uso de estos apósitos para heridas.

50 La investigación ha demostrado que es posible inducir la cicatrización de la mayoría de las úlceras mediante la aplicación de niveles adecuados de compresión graduada sostenida. Para los pacientes con enfermedad venosa, la aplicación de compresión externa graduada, forzando la circulación desde los espacios intersticiales de nuevo hacia los compartimentos vasculares y linfáticos, puede ayudar a minimizar o revertir los cambios vasculares y cutáneos

55 atribuidos a la obstrucción o al daño del sistema venoso. Hay tres tipos de vendajes que se usan comúnmente:

Tipo I: vendajes elásticos ajustables ligeros:

Estos vendajes incluyen productos que tienen una función simple de retención del apósito, y se deben ajustar bien a 60 una extremidad o articulación, sin restringir el movimiento.

Tipo II: vendajes de soporte ligeros:

Estos vendajes incluyen productos usados para prevenir la formación de edemas y dar soporte en el tratamiento de 65 esguinces leves y torceduras.

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Tipo III: vendajes de compresión:

Estos vendajes incluyen productos que se basan en la aplicación de presión. Se emplean con mayor frecuencia para controlar los edemas y reducir la inflamación en el tratamiento de los trastornos venosos de los miembros inferiores. 5 Los vendajes de compresión se han dividido en cuatro grupos según su capacidad para producir niveles predeterminados de compresión.

Tipo IIIa: vendajes de compresión ligera, que son capaces de proporcionar y mantener niveles bajos de presión, de hasta 2,66 kPa (20 mm Hg), en un tobillo de dimensiones medias. Las indicaciones clínicas para los productos de

10 este tipo incluyen el tratamiento de varices superficiales o tempranas, y la varicosis formada durante el embarazo. En general, no son adecuados para controlar ni reducir los edemas existentes, ni para aplicar siquiera niveles bajos de presión en miembros de muy gran tamaño.

Tipo IIIb: vendajes de compresión moderada, que se usan para aplicar compresión del orden de 3,99 kPa

15 (30 mm Hg) en un tobillo de dimensiones medias. Están indicados para el tratamiento de varices durante el embarazo, varices de gravedad media, y para la prevención y el tratamiento de úlceras y el control de edemas leves.

Tipo IIIc: vendajes de alta compresión, que se pueden usar para aplicar altos niveles de compresión, del orden de 5,33 kPa (40 mm Hg), en un tobillo de dimensiones medias. Las indicaciones para estos vendajes incluyen el

20 tratamiento de varices gruesas, insuficiencia venosa post-trombótica, y el tratamiento de las úlceras y edemas graves en piernas de una circunferencia media. Los productos de esta categoría no alcanzan necesariamente estos niveles de presión en miembros de muy gran tamaño que se han inflamado aún más por la presencia de un edema.

Tipo IIId: vendajes de compresión extra-alta, que son capaces de aplicar presiones superiores a 6,66 kPa

25 (50 mm Hg). La potencia en estos vendajes es tal que se puede esperar la aplicación y el mantenimiento de estas presiones incluso en los miembros de mayor tamaño y más edematosos durante largos períodos de tiempo.

Además, también se han utilizado varias modalidades farmacéuticas (por ejemplo, la administración de sulfato de cinc, vitaminas A, C y D, calcio, magnesio, cobre y hierro), en un intento por mejorar la cicatrización de las heridas.

30 Sin embargo, excepto en circunstancias muy limitadas, la estimulación de la cicatrización de las heridas con estos agentes ha tenido poco éxito.

A mediados de la década de 1980, el Dr. Howard Green concibió un método para el cultivo de células cutáneas humanas tales como los queratinocitos. Véase Green et al. (1979) Proc. Natl. Acad. Sci. 76:5665. Epicel™, un 35 producto basado en estos métodos, se usa para el tratamiento de heridas profundas que requieren un injerto (reemplazo de la piel), tales como las que se producen con quemaduras graves. Sin embargo, debido a que Epicel™ solo sustituye la capa epidérmica perdida, funciona mejor en combinación con algo que restaure la capa dérmica de la piel. De hecho, Epicel™ no es una piel artificial, sino que más bien es un método en el que una nueva capa de la epidermis se "cultiva a la medida" en un laboratorio a partir de células cutáneas recogidas quirúrgicamente tomadas

40 de una superficie no quemada del paciente. Por lo tanto, Epicel™ funciona como un injerto autólogo. Véase la patente de EE.UU. Nº 4.016.036 y 4.304.866.

En los pacientes con quemaduras muy graves que tienen poca o ninguna piel intacta, la piel artificial es un material sumamente útil que no solo cubre y protege la zona de la herida, sino que también potencia el nuevo crecimiento de

45 una piel natural en lugar de tejido cicatricial.

Muchas nuevas pieles artificiales, inicialmente, usaban piel de parientes donantes (tales como miembros de la familia que tenían marcadores genéticos similares). Sin embargo, esto requería la coadministración de potentes fármacos inmunosupresores para amortiguar el sistema inmunológico del paciente con el fin de que el injerto no

50 fuera rechazado. La paralización del sistema inmunológico del paciente de esta manera puede provocarle otros problemas graves. En su lugar, normalmente, se usa piel sana del propio paciente (a menudo del cuero cabelludo, que rara vez se quema) como la fuente del material de injerto.

No obstante, el uso de dichos injertos de piel (o incluso de piel tomada de cadáveres) no resuelve definitivamente los

55 problemas. También se necesita algún tipo de medio artificial para recuperar la piel. El uso de un producto sintético también ofrecería la ventaja de que dicho material estaría libre de virus, bacterias y otros agentes patógenos que pudieran transmitir enfermedades.

Por ejemplo, Ethicon Inc., una compañía de Johnson & Johnson, obtuvo los derechos de comercialización y

60 distribución exclusivos para Integra®, un producto que no contiene componentes vivos y, en realidad, no se ha diseñado como reemplazo de la piel. Más bien, proporciona una cubierta protectora, así como un armazón flexible sobre el cual las células cutáneas del propio paciente pueden "regenerar" la capa dérmica inferior de la piel destruida por una quemadura. Véase la patente de EE.UU. Nº 5.489.304. Al igual que se estructura la piel viva, Integra® consiste en dos capas. La capa inferior, que está diseñada para "regenerar" la capa dérmica inferior de la piel real,

65 se compone de una matriz de colágeno bovino entretejido y un glicosaminoglicano, que imita el patrón fibroso de la dermis. Esta matriz se fija después a una capa superior temporal, una lámina flexible de silicio, de grado médico, que imita la capa epidérmica, o superficial, de la piel. Se cubre la superficie de la herida con Integra® y se mantiene ahí durante 2 a 4 semanas, tiempo durante el cual las propias células del paciente se abren camino por la matriz y crean una nueva dermis. Luego se retira la capa superior de Integra® y, a continuación, se aplica una lámina muy fina de las propias células epiteliales del paciente. Con el tiempo, se reconstruye una capa epidérmica a partir de

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5 estas células.

AlloDermTM, otro producto del mercado, es comercializado y fabricado por LifeCell Corporation, de The Woodlands, Texas. Se produce eliminando de la piel de un cadáver todos los componentes celulares que hagan que el sistema inmunológico de un paciente quemado rechace un injerto de cualquier otra persona. Una característica clave de este

10 proceso es la conservación, en la mayor medida posible, de la estructura tridimensional "natural" de la dermis. La aproximación adecuada de este armazón, ya sea de dermis real (como en AlloDermTM) o de dermis artificial (como en Integra®), es crucial para que el resto de células del paciente se puedan regenerar por sí mismas en una nueva piel efectiva.

15 Dermagraft (Advanced Tissue Sciences) es un producto que se cultiva en condiciones de laboratorio a partir de células estromales humanas (por ejemplo, fibroblastos del tejido neonatal) sembradas en una base química biocompatible conocida como armazón. Véase la patente de EE.UU. Nº 5.460.939. Por lo general, dichos armazones están hechos de ácidos poliglicólicos, que son la base de muchos materiales médicos “reabsorbibles” tales como suturas quirúrgicas y pegamentos quirúrgicos. Cuando se aplica en el cuerpo, el armazón se descompone en ácido

20 glicólico y ácido láctico, que son arrastrados por el torrente sanguíneo y metabolizados en dióxido de carbono, oxígeno y agua.

Otra piel diseñada mediante ingeniería genética tisular, Apligraf®, fabricada mediante organogénesis, es un sustituto de la piel viva de dos capas que imita las capas epidérmica y dérmica de la piel. Apligraf® se fabrica con dos tipos

25 de células cutáneas humanas vivas: queratinocitos epidérmicos y fibroblastos dérmicos. Por otra parte, Apligraf® administra otras citoquinas y factores de crecimiento no proporcionados solo por una capa dérmica. Véase la patente de EE.UU. Nº 4.837.379.

Todas las técnicas y aplicaciones actuales descritas anteriormente carecen de ciertas características importantes.

30 Por lo tanto, es un objeto de la presente invención proporcionar una construcción de aloinjerto de tejido cutáneo tridimensional que resuelva uno o más de los problemas mencionados anteriormente.

Lo que se necesita es un medio seguro y eficaz para mejorar la cicatrización de las heridas, que se pueda usar independientemente del tipo de herida y de la naturaleza de la población de pacientes.

35 Resumen de la invención

En un aspecto, la invención proporciona el uso de células cutáneas fetales no diferenciadas de un tejido de donante de 12-16 semanas de gestación en la preparación de un medicamento para la prevención o el tratamiento de una 40 afección, un trastorno o una enfermedad cutánea en un sujeto, sin la formación de cicatriz, mediante la administración tópica, en el que el medicamento comprende una construcción de aloinjerto de tejido cutáneo tridimensional que contiene dichas células cutáneas fetales no diferenciadas integradas en una matriz de colágeno o en el que dicho medicamento comprende dichas células cutáneas fetales no diferenciadas combinadas con un vehículo. También se proporcionan células cutáneas fetales no diferenciadas de tejido de donante de 12-16 45 semanas de gestación para su uso en el tratamiento de una afección, un trastorno o una enfermedad cutánea, estando dichas células contenidas en una construcción de aloinjerto o combinadas con un vehículo como se ha definido anteriormente. Las construcciones de la invención se pueden aplicar en cualquier orientación, lo que las hace útiles para una variedad de aplicaciones. Las células cutáneas fetales, preferentemente, son capaces de diferenciarse en fibroblastos dérmicos o queratinocitos epidérmicos en condiciones de cultivo apropiadas. En

50 diversas realizaciones, la integración de las células fetales no diferenciadas con colágeno se puede producir mezclando, combinando, pipeteando, sembrando, emplacando o colocando las células en el colágeno. Los expertos en la materia reconocerán que es posible emplear cualquier medio de integración. En una realización preferida, la matriz de colágeno de la construcción es una matriz de colágeno equino.

55 Por ejemplo, el sujeto se puede seleccionar del grupo que consiste en seres humanos, primates no humanos, fauna silvestre, perros, gatos, caballos, vacas, cerdos, ovejas, conejos, ratas y ratones. En una realización preferida, el sujeto es un caballo. En otra realización preferida, el sujeto es un ser humano.

Los ejemplos de afecciones, trastornos o enfermedades de la piel incluyen, pero sin limitación, heridas y defectos de

60 la piel. En una realización, la herida puede ser una herida aguda seleccionada del grupo que consiste en pequeños cortes, quemaduras, piel seca, desgarros cutáneos, laceraciones de la piel, heridas quirúrgicas, traumatismo accidental y cicatrices hipertróficas. En otra realización, la herida puede ser una herida crónica seleccionada del grupo que consiste en úlceras venosas, úlceras por presión, úlceras diabéticas, úlceras arteriales y quemaduras. En otra realización más, el defecto cutáneo se puede seleccionar del grupo que consiste en eczema, soriasis,

65 radiodermititis, cáncer de piel, urticaria, vasculitis livedoide, sequedad severa y atrofia blanca.

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Una ventaja de la presente invención es la creación de un banco de células, lo que permite disponer de injertos de manera inmediata cuando y donde sea necesario, pues las células usadas en la construcción están constantemente disponibles. Es posible obtener o crear un banco de células fetales no diferenciadas mediante el método de recogida de biopsias de tejido fetal de donantes; el cultivo del tejido fetal y la proliferación de células fetales no diferenciadas 5 hasta una alta concentración en condiciones de cultivo adecuadas; el tratamiento con tripsina de los tejidos y las células de los cultivos resultantes para permitir su suspensión; la combinación de las células suspendidas para preparar una suspensión generalmente uniforme de células del cultivo; el mezclado suave con un crioprotector; el sellado de partes alícuotas de la suspensión celular en ampollas; y la congelación de las partes alícuotas, preparando de esta manera un banco de células fetales no diferenciadas. Las células fetales no diferenciadas son

10 células cutáneas fetales. Las células cutáneas fetales del banco de células pueden ser p63+. En algunas realizaciones, la congelación de las partes alícuotas se logra mediante la reducción de la temperatura a 1 ºC/min hasta alcanzarse una temperatura de -80 ºC, y luego la transferencia hasta -160 ºC aproximadamente 24 horas después.

15 Es posible preparar un banco de células fetales no diferenciadas mediante la recogida de biopsias de tejido fetal de donantes; el cultivo del tejido fetal y la proliferación de células fetales no diferenciadas hasta una alta concentración en condiciones de cultivo adecuadas; el tratamiento con tripsina de los tejidos y las células de los cultivos resultantes para permitir su suspensión; la combinación de las células suspendidas para preparar una suspensión generalmente uniforme de células del cultivo; el mezclado suave con un crioprotector; el sellado de partes alícuotas de la

20 suspensión celular en ampollas; y la congelación de las partes alícuotas, preparando de esta manera un banco de células fetales no diferenciadas. Las células fetales no diferenciadas son células cutáneas fetales. Las células cutáneas fetales del banco de células pueden ser p63+. Opcionalmente, la congelación de las partes alícuotas se logra mediante la reducción de la temperatura a 1 ºC/min hasta alcanzarse una temperatura de -80 ºC, y luego la transferencia hasta -160 ºC aproximadamente 24 horas después

25 En el presente documento, también se desvelan composiciones que contienen un vehículo y una o más células fetales no diferenciadas solas o en combinación con una o más proteínas fetales. El vehículo se puede seleccionar del grupo que consiste en una pomada, loción, crema, emulsión, microemulsión, gel y solución. Preferentemente, el vehículo es una crema. Por ejemplo, la crema puede ser una mezcla de aceite en agua o una mezcla de agua en

30 aceite. Como alternativa, el vehículo contiene un adyuvante hidrófobo y un adyuvante hidrófilo. Como alternativa, la composición puede contener un vehículo y una o más proteínas fetales solas o en combinación con una o más células fetales no diferenciadas. Los expertos en la materia reconocerán que cualquier referencia a una composición del presente documento incluye cualquier composición que contiene una o más células fetales no diferenciadas y/o una o más proteínas fetales estabilizadas en combinación con un vehículo.

35 Dicha composición se puede preparar mediante la recogida de biopsias de tejido fetal de donantes; el desarrollo de líneas celulares del tejido fetal; el cultivo del tejido fetal y la proliferación de células fetales no diferenciadas hasta una alta concentración para crear un banco de células; opcionalmente, la estabilización de proteínas fetales dentro del banco de células; y la integración de dichas células fetales con un vehículo. Además, la composición se puede

40 preparar mediante la obtención de células fetales no diferenciadas; la proliferación de las células fetales no diferenciadas; opcionalmente, la estabilización de proteínas fetales dentro de las células fetales; y la integración de las células fetales con un vehículo.

La invención proporciona el uso de células cutáneas fetales no diferenciadas para la preparación de un

45 medicamento según lo definido anteriormente para su uso en la prevención o el tratamiento de una afección, un trastorno o una enfermedad de la piel mediante la administración de una cantidad terapéuticamente eficaz de la composición de la invención en la zona susceptible o afectada de la piel del sujeto.

La afección, el trastorno o la enfermedad de la piel por tratar o prevenir puede ser una afección inflamatoria de la

50 piel, incluyendo, pero sin limitación, imperfecciones, manchas por la edad, cicatrices, quemaduras, contusiones, marcas de nacimiento, tatuajes, hiperpigmentación, dermatitis atópica, periúlceras, eczema, radiodermititis, úlceras, urticaria, sequedad severa y atrofia blanca. En una realización preferida, la afección inflamatoria de la piel es una periúlcera. En otra realización preferida, la afección inflamatoria de la piel es atrofia blanca. En otra realización preferida más, la afección inflamatoria de la piel es la hiperpigmentación.

55 El sujeto se puede seleccionar del grupo que consiste en seres humanos, primates no humanos, fauna silvestre, perros, gatos, caballos, vacas, cerdos, ovejas, conejos, ratas y ratones. En una realización preferida, el sujeto es un caballo. En otra realización preferida más, el sujeto es un ser humano.

60 La invención también proporciona células cutáneas fetales no diferenciadas de tejido de donante de 12-16 semanas de gestación para su uso en la prevención o el tratamiento de una afección, un trastorno o una enfermedad de la piel, sin la formación de cicatriz, tras la administración tópica, estando dichas células contenidas en un aloinjerto de tejido cutáneo tridimensional e integradas con una matriz de colágeno, o estando dichas células contenidas en una composición y combinadas con un vehículo.

65 En una realización, el aloinjerto y la composición de la invención se administran secuencialmente, y en otra realización, el aloinjerto y la composición se administran simultáneamente. El sujeto se puede seleccionar del grupo que consiste en seres humanos, primates no humanos, fauna silvestre, perros, gatos, caballos, vacas, cerdos, ovejas, conejos, ratas y ratones. En una realización preferida, el sujeto es un caballo. En otra realización preferida

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5 más, el sujeto es un ser humano.

La afección, el trastorno o la enfermedad de la piel se pueden seleccionar del grupo que consiste en pequeños cortes, quemaduras, piel seca, desgarros cutáneos, laceraciones de la piel, heridas quirúrgicas, traumatismos accidentales, cicatrices hipertróficas, úlceras venosas, úlceras por presión, úlceras diabéticas, úlceras arteriales,

10 eczema, soriasis, radiodermititis, cáncer de piel, urticaria, vasculitis livedoide, atrofia blanca, imperfecciones, manchas por la edad, cicatrices, contusiones, marcas de nacimiento, tatuajes, hiperpigmentación, dermatitis atópica, periúlceras, eczemas, radiodermititis, úlceras y urticaria.

Las células cutáneas fetales no diferenciadas incluyen células cutáneas fetales que se pueden diferenciar en

15 fibroblastos dérmicos o queratinocitos epidérmicos en condiciones de cultivo apropiadas. En una realización preferida, la matriz de colágeno está hecha de colágeno equino. Del mismo modo, el vehículo se puede seleccionar del grupo que consiste en una pomada, loción, crema, emulsión, microemulsión, gel y solución.

Breve descripción de las figuras

20 La Fig. 1 es un esquema que muestra la síntesis de un banco de células fetales. La Fig. 2a es una fotomicrografía que muestra los resultados del análisis de inmunohistoquímica de piel fetal teñida con anticuerpos p63 que muestran la población de queratinocitos epidérmicos p63+ de células en cultivo junto con las células de fibroblastos dérmicos (la barra equivale a 50 µm).

25 La Fig. 2b es una fotomicrografía que muestra los resultados del análisis de inmunohistoquímica de la capa de epitelio fetal. La Fig. 2c es una fotomicrografía que muestra los resultados del análisis de inmunohistoquímica de la capa dérmica fetal. La Fig. 3 es un gráfico que muestra el crecimiento celular de fibroblastos cutáneos dérmicos (número de células)

30 en función del tiempo para tres líneas individuales de células cutáneas fetales (símbolos cerrados) y tres líneas de células cutáneas de adulto (símbolos abiertos) partiendo de 1.000 células por muestra. La Fig. 4 es un gráfico que muestra el porcentaje de supervivencia de fibroblastos cutáneos dérmicos en función de la exposición a radiación UVA para tres líneas individuales de células cutáneas fetales (símbolos cerrados) y tres líneas de células cutáneas de adulto (símbolos abiertos). Cada punto de datos está representado por el

35 número medio de clones de tres placas de cultivo. La Fig. 5 es un gráfico que muestra el porcentaje de supervivencia de fibroblastos cutáneos dérmicos en función del tratamiento con peróxido de hidrógeno para tres líneas individuales de células cutáneas fetales (símbolos cerrados) y tres líneas de células cutáneas de adulto (símbolos abiertos). Cada punto de datos está representado por el número medio de clones de tres placas de cultivo.

40 La Fig. 6a es una fotografía que representa un absceso profundo en la mandíbula de un caballo con la eliminación de un absceso dental que penetra desde el interior de la boca hasta la superficie exterior dando lugar a una ulceración. La Fig. 6b es una fotografía que representa el aloinjerto de tejido cutáneo tridimensional colocado en el sitio de la herida del caballo.

45 La Fig. 6c es una fotografía que representa la superficie de la herida del caballo una semana después de la colocación del aloinjerto de tejido cutáneo tridimensional. Dicha figura muestra el cierre completo y la eliminación del absceso (úlcera). La Fig. 7a es una fotografía que representa una herida profunda en la rodilla de un caballo que penetra a través de la piel y el músculo hasta el hueso.

50 La Fig. 7b es una fotografía que representa un aloinjerto de doble capa tridimensional dentro del músculo (interno) que contiene células fetales musculares, y la piel (externo), que contiene células cutáneas fetales en un caballo. La Fig. 7c es una fotografía que representa el aloinjerto de doble capa tridimensional colocado en la zona de la herida del caballo.

55 La Fig. 7d es una fotografía que representa la superficie de la herida dos días después de la colocación del aloinjerto de doble capa tridimensional en el caballo. Dicha figura muestra que solo queda la superficie afectada. La Fig. 8 es una fotografía que representa un paciente humano con polioartritis que tiene una úlcera mixta resistente en la articulación del tobillo. La Fig. 9 es una fotografía que representa a un paciente humano que tiene cuatro úlceras en la parte inferior de

60 la pierna izquierda, presentes desde hace dos años. Después del tratamiento con el aloinjerto de tejido cutáneo tridimensional de la invención, se observa el cierre completo de 2 de las úlceras aproximadamente tras 7 meses de tratamiento. La Fig. 10 es una fotografía que representa un paciente humano con una historia de la misma úlcera en la pierna durante 10 años. Inmediatamente después del primer aloinjerto de tejido cutáneo tridimensional, se evidenciaron

65 congestión, dolor y eliminación de la producción de fibrina. En el año de seguimiento, la piel sigue atrófica, pero no hay presencia de tejido cicatricial.

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La Fig. 11 es una fotografía que representa un paciente humano que tiene una úlcera en el tobillo. Después de aproximadamente dos semanas de tratamiento con la composición de la invención, los resultados indican el cierre de la úlcera. La Fig. 12 es una fotografía que representa un paciente humano con atrofia blanca en ambas regiones inferiores

5 de la pierna. Se aplicaron un aloinjerto de tejido cutáneo tridimensional y una composición en forma de crema. Los resultados indican el cierre de las úlceras.

Descripción detallada de la invención

10 Los campos de la ingeniería de tejidos y la ciencia de materiales están produciendo con rapidez nuevos biomateriales con funciones biológicas notables. Las propiedades mecánicas de estos nuevos materiales se pueden adaptar a aplicaciones específicas, y las células que los pueblan pueden formar tejidos reales para el mantenimiento, la restauración o la mejora de la función. Por lo tanto, el origen de las células y su interacción con un biomaterial es sumamente importante para el uso terapéutico final.

15 Las diferencias fundamentales entre la piel fetal y la de adulto, y entre los entornos de las heridas de la piel fetal y la de los adultos pueden ser importantes en la inducción de la reparación del tejido sin generar cicatrices. Al principio de la gestación, la dermis es fina, relativamente acelular y hay presente una baja matriz extracelular. Durante el desarrollo posterior, se deposita el colágeno dérmico, y los glicosaminoglicanos (GAG) sulfatados reemplazan al

20 ácido hialurónico (HA), entre otros GAG no sulfatados. El crecimiento extremadamente rápido y la matriz extracelular suelta proporcionan un territorio conductor para la reparación de la piel fetal sin generar cicatrices.

Los estudios sugieren que las propias células cutáneas fetales son responsables de la reparación del tejido sin generar cicatrices, ya que el ambiente en el interior del útero parece no ser esencial ni suficiente para la reparación

25 fetal sin cicatrices. Como se ha demostrado en un modelo de zarigüeyas, se ha observado que la piel fetal fuera del ambiente amniótico cálido, estéril y rico en factores de crecimiento es muy eficaz en la curación rápida y sin generar cicatrices. Este marsupial nace como un feto, tanto fisiológica como anatómicamente, y permanece unido al pezón de su madre durante 4 a 5 semanas (Armstrong et al., Dev. Biol. 169: 242-260, 1995). A pesar de su ubicación extrauterina, las heridas de las crías con bolsa reciente se reepitelizan muy rápidamente, sintetizan colágeno y se

30 curan sin formar cicatrices. Por el contrario, las heridas de las crías con la bolsa más tiempo se curan más despacio y muestran la formación de cicatrices.

Del mismo modo, la piel fetal humana trasplantada subcutáneamente a un ratón inmunoincompetente mantuvo sus características de desarrollo y se curó sin generar cicatrices con la restauración de los folículos pilosos y la

35 disposición del colágeno reticular (Lorenz et al., “Development” 114: 253-259, 1992). Como las capacidades regenerativas de la piel fetal humana no se vieron afectadas por un entorno de la herida extrauterino de adulto ni por el contacto con sangre de ratón adulto, las capacidades de curación sin formar cicatrices parecen ser intrínsecas al propio tejido fetal.

40 Una ventaja importante del uso de células fetales por razones terapéuticas es que el tejido fetal es inmunoincompetente y está asociado con una reducción de la capacidad de evocar una respuesta inmunológica en el receptor de dichas células. Esta disminución de la inmunocompetencia se asocia con la falta de linfocitos T posttímicos antes de las 14 semanas de gestación (Crombleholme et al., Am J Obstet Gynecol 164: 218-230, 1991; Gabbianelli et al., J Immunol. 144: 3354-3360, 1990).

45 La ingeniería de tejido fetal tiene un alto potencial para el tratamiento de las afecciones, los trastornos o las enfermedades de la piel en mamíferos. Al aprovechar el potencial de expansión de la piel fetal en determinadas condiciones de cultivo y dentro de ciertas matrices asociadas diseñadas por bioingeniería, es posible congelar un gran número de células cutáneas para su uso terapéutico, pudiéndose tratar cientos de miles de sujetos a partir de

50 una sola donación de órganos.

Las construcciones y las composiciones de la presente invención son ideales para reparar, tratar y/o prevenir los síntomas de afecciones, trastornos o enfermedades de la piel. A diferencia de los autoinjertos, los métodos y las composiciones de la presente invención no requieren una biopsia de la zona del donante, algo importante para los

55 niños pequeños o los pacientes quemados, a quienes no les sobra mucho tejido cutáneo. Por otra parte, las construcciones y las composiciones se pueden obtener de inmediato, a diferencia de los procedimientos de autoinjerto, cuya producción puede tardar hasta 3 o 4 semanas. Además, estas construcciones y composiciones se pueden administrar inmediatamente y en cantidades ilimitadas.

60 Ha habido poca investigación sobre la expansión del tejido fetal con el cultivo de células y la asociación en matrices

o membranas. Con el uso de los métodos descritos en el presente documento, es posible tener células cutáneas fetales estrictamente controladas y ampliarlas en bancos de células de muy gran tamaño (por ejemplo, la donación de un órgano de 4 cm2 puede producir ~2.400.000 injertos cutáneos de ~10 cm2 por injerto). Las ventajas de usar células cutáneas fetales incluyen, pero sin limitación: 1) su capacidad para ser hasta tres veces más resistentes a la

65 radiación ultravioleta A (UVA) y hasta dos veces más resistente al tratamiento con peróxido de hidrógeno, en comparación con las células de adulto; 2) su capacidad para inducir la reparación de tejidos sin formar cicatrices, una propiedad intrínseca del propio tejido fetal que parece estar relacionada con la composición de las proteínas a diferentes edades del desarrollo (Lorenz et al., “Development” 114: 253-259, 1992); y 3) el hecho de que son preinmunocompetentes y se asocian con una reducción de la capacidad de evocar una respuesta inmunológica en el receptor de dichas células. Las líneas de células fetales no se han usado ni desarrollado previamente con fines de

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5 ingeniería de tejidos.

La presente invención se refiere, en general, a una construcción de aloinjerto de tejido cutáneo tridimensional que contiene células cutáneas fetales no diferenciadas de tejido de donante de 12-16 semanas de gestación y colágeno para su uso en el tratamiento de afecciones, trastornos o enfermedades de la piel. Además, la invención se refiere a

10 una composición que contiene una o más células cutáneas fetales no diferenciadas de tejido de donante de 12-16 semanas de gestación y un vehículo para su uso en el tratamiento de una afección cutánea.

Se ha de entender que la terminología usada en el presente documento tiene el único fin de describir realizaciones particulares y no pretende limitar el alcance de la presente invención.

15 Como se usan en el presente documento y en las reivindicaciones, las formas en singular "un", “uno”, “una”, "el" y “ella” incluyen los referentes en plural a menos que el contexto indique claramente lo contrario.

La expresión "no diferenciada" se usa en el presente documento para describir una célula inmadura o primitiva. Por

20 ejemplo, las células cutáneas fetales no diferenciadas incluyen las que pueden diferenciarse en fibroblastos dérmicos y queratinocitos epidérmicos.

El término "integrado" o la expresión "integrado con" se usa para describir cualquier medio de combinación, en particular, los relativos a la adición de las células a una matriz. El término incluye, pero sin limitación, mezclar,

25 combinar, pipetear, sembrar, emplacar o colocar.

La expresión "condiciones de cultivo adecuadas" es un medio para el cultivo de células que contiene nutrientes que potencian la proliferación. El medio de nutrientes puede contener cualquiera de los siguientes en una combinación apropiada y a las concentraciones apropiadas: solución salina isotónica, tampón, aminoácidos, suero o suero de

30 reemplazo, y otros factores añadidos exógenamente. Los expertos en la materia reconocerán que se puede usar cualquiera de las condiciones de cultivo empleadas comúnmente.

El término "colágeno" se refiere a un compuesto polipeptídico, que es de naturaleza hidrófila, que está sujeto a la degradación por enzimas extracelulares. Debido a que esta sustancia se ha estudiado bien, se pueden controlar

35 muchos parámetros clave. El colágeno es un antígeno débil, lo que resulta en un mínimo potencial de rechazo. Un colágeno preferido usado en las construcciones, los métodos y las composiciones de la invención es el colágeno caballo.

La expresión "línea celular" se refiere a un cultivo de células establecido de manera permanente que va a proliferar 40 de forma indefinida dado el medio recién preparado adecuado y el espacio suficiente.

La expresión "banco de células" se refiere a la recogida de biopsias de tejido fetal de donantes; cultivo del tejido fetal y proliferación de células fetales no diferenciadas hasta una alta concentración en condiciones de cultivo adecuadas; tratamiento con tripsina del tejido y las células de los cultivos resultantes para permitir su suspensión; combinación 45 de las células suspendidas para preparar una suspensión generalmente uniforme de células del cultivo; mezclado suave con un crioprotector; sellado de partes alícuotas de la suspensión celular en ampollas; y congelación de las partes alícuotas (por ejemplo, mediante la disminución de la temperatura de la ampolla a 1 ºC/min hasta -80 ºC y después la transferencia a -160 ºC aproximadamente 24 horas más tarde). Este banco de temperatura ultra-fría conserva las células de manera que dejan de envejecer, lo que les permite conservar la función y la actividad que

50 tenían el día en que fueron recogidas.

El término "tratamiento" (como en "tratamiento de una afección, un trastorno o una enfermedad de la piel") incluye

(1) prevención de la afección, es decir, evitar cualquier síntoma clínico de la afección, (2) inhibición de la afección, es

decir, detener el desarrollo o la progresión de los síntomas clínicos; y/o (3) alivio, reparación o inversión de la 55 afección, es decir, provocar la regresión de los síntomas clínicos.

Los términos "afección", "trastorno" y "enfermedad" se usan indistintamente en el presente documento para referirse a estados fisiológicos que se pueden prevenir o tratar mediante la administración de un principio activo como se describe en el presente documento. Los ejemplos de afecciones, trastornos y enfermedades de la piel incluyen, pero

60 sin limitación, pequeños cortes, quemaduras, piel seca, desgarros cutáneos, laceraciones de la piel, heridas quirúrgicas, traumatismos accidentales, cicatrices hipertróficas, úlceras venosas, úlceras por presión, úlceras diabéticas, úlceras arteriales , eczema, soriasis, radiodermititis, cáncer de piel, urticaria, vasculitis livedoide, atrofia blanca, imperfecciones, manchas por la edad, cicatrices, contusiones, marcas de nacimiento, tatuajes, hiperpigmentación, dermatitis atópica, periúlceras, eczemas, radiodermititis, úlceras y urticaria.

65 El término "herida" se refiere, en sentido amplio, a las lesiones de la piel y del tejido subcutáneo iniciadas en uno cualquiera de una variedad de formas (por ejemplo, úlceras por presión debidas a un reposo en cama prolongado, heridas inducidas por traumatismos, cortes, úlceras, quemaduras y similares) y con diferentes características. Las heridas se clasifican normalmente en uno de cuatro grados en función de la profundidad de las mismas: (i) Grado I:

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5 heridas limitadas al epitelio; (ii) Grado II: heridas que se extienden hacia la dermis; (iii) Grado III: heridas que se extienden hacia el tejido subcutáneo; y (iv) grado IV (o heridas de espesor completo): heridas en las que los huesos quedan al descubierto (por ejemplo, un punto de presión ósea tal como el trocánter mayor o el sacro).

La expresión "herida aguda" se refiere a una agresión o lesión producida por un instrumento cortante y punzante en

10 la piel que no implica la pérdida de tejido, síntomas graves y una trayectoria corta. Los ejemplos de heridas agudas incluyen, pero sin limitación, pequeños cortes, quemaduras, piel seca, desgarros cutáneos, laceraciones de la piel, heridas quirúrgicas, traumatismos accidentales y cicatrices hipertróficas.

La expresión "herida crónica" se refiere a una herida que no ha cicatrizado en aproximadamente treinta días. Los

15 ejemplos de heridas crónicas incluyen, pero sin limitación, úlceras venosas, úlceras por presión, úlceras diabéticas, úlceras arteriales y quemaduras.

El término "cicatrización" relativo a una herida se refiere a un proceso de reparación de una herida, tal como mediante la formación de una cicatriz.

20 La expresión "inducir o acelerar un proceso de cicatrización de una herida cutánea" se refiere bien a la inducción de la formación de tejido de granulación de contracción de la herida y/o a la inducción de epitelización (es decir, la generación de nuevas células en el epitelio). La cicatrización de heridas se mide convenientemente por una disminución de la zona de la herida.

25 El término "sujeto" (como en el tratamiento de “un sujeto") pretende referirse a un individuo mamífero afectado por, propenso a o que sufre una afección, un trastorno o una enfermedad (como se especifica en el presente documento). Este término incluye seres humanos y animales. Por ejemplo, los sujetos pueden ser, por ejemplo, seres humanos, primates no humanos, fauna silvestre, perros, gatos, caballos, vacas, cerdos, ovejas, conejos, ratas

30 o ratones. Como se usa en el presente documento, la expresión “fauna silvestre” incluye cualquier mamífero, ave o pez que no esté domesticado. Los ejemplos de dicha fauna silvestre incluyen, pero sin limitación, tejones, castores, leones, tigres, osos, halcones y venados.

Como se usa en el presente documento, una "composición" de la invención puede contener una o más células

35 fetales no diferenciadas junto con otros componentes químicos, incluyendo, pero sin limitación, fármacos tradicionales, vehículos fisiológicamente adecuados y excipientes. Como alternativa, una "composición" de la invención puede incluir una o más células fetales no diferenciadas y/o una o más proteínas fetales que se hayan estabilizado, junto con otros componentes químicos, incluyendo, pero sin limitación, fármacos tradicionales, vehículos fisiológicamente adecuados y excipientes. Dichos componentes ayudan a facilitar la administración de la

40 proteína y/o célula a un sujeto. Las composiciones de la presente invención se pueden fabricar mediante procesos bien conocidos en la técnica, por ejemplo, por medio de procesos convencionales de mezcla, disolución, granulación, elaboración de grageas, levigación, emulsión, encapsulación, atrapamiento o liofilización.

Las técnicas para la formulación y administración de principios activos se pueden encontrar en "Remington: The 45 Science and Practice of Pharmacy", Lippincott Williams & Wilkins Publishing Co., XX edición.

Aunque son posibles diversas vías para la administración de los principios activos, para el fin de la presente invención, se prefiere la vía tópica, y que esté asistida por un vehículo tópico. El vehículo tópico es aquel que sea adecuado en general para la administración tópica de principios activos e incluye cualquiera de dichos materiales 50 conocidos en la técnica. El vehículo tópico se selecciona para proporcionar la composición en la forma deseada, por ejemplo, en forma de un vehículo líquido o no líquido, una loción, una crema, una pasta, un gel, un polvo, una pomada, un disolvente, un diluyente líquido, gotas y similares, y puede estar compuesto de un material bien de origen natural o sintético. El vehículo seleccionado no debe afectar negativamente al principio activo ni al resto de los componentes de la formulación tópica, siendo estable con respecto a todos los componentes de la formulación

55 tópica. Los ejemplos de vehículos tópicos adecuados para su uso en el presente documento incluyen agua, alcoholes y otros disolventes orgánicos no tóxicos, glicerina, aceite mineral, silicona, vaselina, lanolina, ácidos grasos, aceites vegetales, parabenos, ceras y similares.

Las pomadas son preparaciones semisólidas, normalmente, a base de vaselina u otros derivados del petróleo. La

60 base de la pomada específica que se vaya a usar, como será apreciado por los expertos en la materia, es aquella que proporcione una administración óptima del fármaco y, preferentemente, que también proporcione otras características deseadas, por ejemplo, emoliencia o similares. Al igual que con otros portadores o vehículos, una base de pomada debe ser inerte, estable, no irritante y no sensibilizante. Como se explica en Remington, las bases de pomadas se pueden agrupar en cuatro clases: bases oleaginosas; bases emulsionables; bases de emulsión; y

65 bases hidrosolubles. Las bases de pomadas oleaginosas incluyen, por ejemplo, aceites vegetales, grasas obtenidas de animales e hidrocarburos semisólidos obtenidos del petróleo. Las bases de pomadas emulsionables, también conocidas como bases de pomadas absorbentes, contienen poco o nada de agua, e incluyen, por ejemplo, sulfato de hidroxiestearina, lanolina anhidra y vaselina hidrófila. Las bases de pomadas en emulsión son bien emulsiones de agua en aceite (W/O) o emulsiones de aceite en agua (O/W), e incluyen, por ejemplo, alcohol cetílico, monoestearato de glicerilo, lanolina y ácido esteárico. Las bases de pomadas hidrosolubles preferidas se preparan a

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5 partir de polietilenglicoles (PEG) de peso molecular variable. Véase Remington, supra.

Las lociones son preparaciones para aplicarlas en la superficie de la piel sin fricción y, por lo general, son preparaciones líquidas o semilíquidas en las que las partículas sólidas, incluyendo el principio activo, están presentes en una base de agua o alcohol. Normalmente, las lociones son suspensiones de sólidos y preferentemente comprenden una emulsión aceitosa líquida del tipo aceite en agua. Las lociones son formulaciones preferidas en el presente documento para tratar grandes zonas del cuerpo, debido a la facilidad de aplicación de una composición más fluida. En general, es necesario que la materia insoluble de una loción se encuentre finamente dividida. Por lo general, las lociones contienen agentes de suspensión para producir mejores dispersiones, así como compuestos útiles para localizar y mantener el principio activo en contacto con la piel, por ejemplo, metilcelulosa,

15 carboximetilcelulosa de sodio o similar. Una formulación de loción particularmente preferida para su uso en combinación con la presente invención contiene propilenglicol mezclado con una vaselina hidrófila tal como la que se puede obtener con la marca comercial Aquaphor®, disponible en Beiersdorf, Inc. (Norwalk, Conn.).

Como es conocido en la técnica, las cremas que contienen el principio activo son emulsiones líquidas o semisólidas viscosas, bien de aceite en agua o de agua en aceite. Las bases de crema son lavables con agua y contienen una fase oleosa, un emulsionante y una fase acuosa. En general, la fase oleosa está compuesta de vaselina y un alcohol graso tal como alcohol cetílico o alcohol estearílico. La fase acuosa normalmente, aunque no necesariamente, supera a la fase oleosa en volumen y, en general, contiene un humectante. El emulsionante de una formulación en crema, como se describe en Remington, supra, es generalmente un tensioactivo no iónico, aniónico, catiónico o

25 anfótero.

Las microemulsiones son termodinámicamente estables, dispersiones isotrópicamente transparentes de dos líquidos inmiscibles tales como aceite y agua, estabilizadas por una película interfacial de moléculas de tensioactivo (“Encyclopedia of Pharmaceutical Technology” (Nueva York: Marcel Dekker, 2002), II Edición). Para la preparación de microemulsiones, se necesitan un tensioactivo (emulsionante), un cotensioactivo (coemulsionante), una fase oleosa y una fase acuosa. Los tensioactivos adecuados incluyen cualquier tensioactivo que sea útil en la preparación de emulsiones, por ejemplo, los emulsionantes que se usan normalmente en la preparación de cremas. El cotensioactivo (o "coemulsionante") se selecciona generalmente del grupo de los derivados poliglicerol, derivados de glicerol y alcoholes grasos. Las combinaciones de emulsionante/coemulsionante preferidas, generalmente,

35 aunque no necesariamente, se seleccionan del grupo que consiste en: monoestearato de glicerilo y estearato de polioxietileno; palmitoestearato de polietilenglicol y etilenglicol; y triglicéridos caprílicos y cápricos, y oleilmacrogolglicéridos. La fase acuosa puede incluir no solo agua, sino también, por lo general, tampones, glucosa, propilenglicol, polietilenglicoles, preferentemente, polietilenglicoles de peso molecular inferior (por ejemplo, PEG 300 y PEG 400) y/o glicerol, y similares. La fase oleosa comprenderá generalmente, por ejemplo, ésteres de ácidos grasos, aceites vegetales modificados, aceites de silicona, mezclas de mono-, di-y tri-glicéridos, mono-y di-ésteres de PEG (por ejemplo, oleil-macrogol-glicéridos ), etc.

Las formulaciones en gel son sistemas semisólidos que consisten bien en suspensiones compuestas de pequeñas partículas inorgánicas (sistemas bifásicos) o grandes moléculas orgánicas distribuidas de manera sustancialmente

45 uniforme por un vehículo líquido (geles monofásicos). Los geles monofásicos se pueden preparar, por ejemplo, mediante la combinación del principio activo, un vehículo líquido y un agente gelificante adecuado tal como tragacanto (al 2-5 %), alginato sódico (al 2-10 %), gelatina (al 2-15 %), metilcelulosa (al 3-5 %), carboximetilcelulosa de sodio (al 2-5 %), carbómero (al 0,3-5 %) o alcohol polivinílico (al 10-20 %) entre sí y mezclando hasta la obtención de un producto semisólido característico. Otros agentes gelificantes adecuados incluyen metilhidroxicelulosa, polioxietileno-polioxipropileno, hidroxietilcelulosa y gelatina. Aunque los geles emplean comúnmente vehículo líquido acuoso, también se pueden usar alcoholes y aceites como el vehículo líquido.

En las composiciones de la invención, también se pueden incluir diversos aditivos conocidos por los expertos en la materia. Los ejemplos de dichos aditivos incluyen, pero sin limitación, solubilizantes, potenciadores de la permeación 55 de la piel, opacificadores, conservantes (por ejemplo, antioxidantes), agentes gelificantes, agentes tamponantes, tensioactivos (particularmente, tensioactivos no iónicos y anfóteros), emulsionantes, emolientes, agentes espesantes, estabilizadores, humectantes, colorantes, perfumes y similares. Se prefiere particularmente la inclusión de solubilizantes y/o potenciadores de la permeación de la piel, junto con emulsionantes, emolientes y conservantes. Los ejemplos de solubilizantes adecuados incluyen, pero sin limitación, los siguientes: éteres hidrofilos tales como dietilenglicolmonoetiléter (etoxidiglicol, disponible en el mercado como Transcutol®) y oleato de dietilenglicolmonoetiléter (disponible en el mercado como Softcutol®); derivados de aceite de ricino de polietileno tales como aceite de ricino polioxi 35, aceite de ricino hidrogenado polioxi 40, etc.; polietilenglicol, particularmente, los polietilenglicoles de peso molecular inferior tales como PEG 300 y PEG 400, y derivados de polietilenglicol tales como glicéridos caprílicos/cápricos de PEG-8 (disponible en el mercado como Labrasol®); alquilmetilsulfóxidos tales 65 como DMSO; pirrolidonas tales como 2-pirrolidona y N-metil-2-pirrolidona y DMA. Muchos solubilizantes también pueden actuar como potenciadores de la absorción. En la formulación, se puede incorporar un solo solubilizante o

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una mezcla de solubilizantes. Los emulsionantes y coemulsionantes adecuados incluyen, sin limitación, aquellos emulsionantes y coemulsionantes descritos con respecto a las formulaciones en microemulsión. Los emolientes incluyen, por ejemplo, propilenglicol, glicerol, miristato de isopropilo, propionato de miristiléter de polipropilenglicol-2 (PPG-2), y similares.

5 También se pueden incluir otros principios activos en la formulación, por ejemplo, agentes antiinflamatorios, analgésicos, agentes antimicrobianos, agentes antifúngicos, antibióticos, vitaminas, antioxidantes y agentes bloqueadores solares comúnmente encontrados en formulaciones de protección solar, incluyendo, pero sin limitación, antranilatos, benzofenonas (particularmente, benzofenona-3), derivados de alcanfor, cinamatos (por

10 ejemplo, metoxicinamato de octilo), dibenzoilmetanos (por ejemplo, butilmetoxidibenzoilmetano), ácido paminobenzoico (PABA) y derivados de los mismos, y salicilatos (por ejemplo, salicilato de octilo).

El término "eficaz" o la expresión ”cantidad terapéuticamente eficaz" de una composición pretenden significar una cantidad no tóxica, pero suficiente, que proporciona el efecto deseado en una relación beneficio/riesgo razonable 15 para llevar a cabo cualquier tratamiento médico. El efecto deseado puede ser el alivio o la prevención de los signos, síntomas o causas de una enfermedad, o cualquier otra alteración deseada de un sistema biológico.

Un experto en la materia se dará cuenta de que las células fetales no diferenciadas usadas para fabricar el aloinjerto de tejido cutáneo tridimensional y la composición de la invención pueden incluir células cutáneas fetales, para los 20 injertos de piel, y células musculares fetales, para los injertos musculares; y células óseas fetales para los injertos óseos.

En un aspecto, la invención proporciona una construcción de injerto de tejido cutáneo tridimensional que contiene células fetales no diferenciadas integradas con una matriz de colágeno (por ejemplo, colágeno equino). Por ejemplo,

25 las células fetales no diferenciadas pueden ser células cutáneas fetales tales como aquellas capaces de diferenciarse en fibroblastos dérmicos y queratinocitos epidérmicos en condiciones de cultivo adecuadas. La integración se puede realizar mediante cualquier medio conocido por los expertos en la materia, incluyendo pero sin limitación, la mezcla, la combinación, el pipeteado, la siembra, el emplacado o la colocación. Dicha construcción se puede usar para tratar un sujeto que padezca una afección, un trastorno o una enfermedad de la piel.

30 Para crear bancos celulares de células fetales no diferenciadas cultivadas, se obtienen biopsias de tejido fetal inmediatamente después de la interrupción del embarazo de conformidad con los procedimientos y las políticas del Comité de Ética de la CHUV. El tejido del donante recogido es de 12 a 16 semanas de gestación. Se divide el tejido fetal en pequeños fragmentos en múltiples placas de cultivo tisular de 10 cm2, y se cultiva en medios de cultivo

35 tisular MEM de Dulbecco (DMEM) con glutamina. A continuación, se añade suero fetal a las placas. Cuando el crecimiento celular avanza, por ejemplo, después de aproximadamente una semana, se tratan el tejido y las células con tripsina. Después, se congelan algunas de las placas en unidades individuales, por ejemplo, en nitrógeno líquido. A continuación, se centrifugan las células y se vuelven a suspender, produciendo una suspensión generalmente uniforme de las células del cultivo.

40 A continuación, se mezclan las células suavemente con un crioprotector (por ejemplo, DMEM, 5 ml + suero de ternera fetal, 4 ml + dimetilsulfóxido, 1 ml (DMSO)). Se cierran herméticamente las suspensiones celulares en partes alícuotas y se congelan, por ejemplo, en nitrógeno líquido. En una realización preferida, las partes alícuotas se congelan a una velocidad de 1 ºC/min hasta que alcanzan una temperatura de -80 ºC y luego se transfieren a

45 -160 ºC aproximadamente 24 horas más tarde. Después, las partes alícuotas de células de bancos homogéneos se pueden usar para cualquier fin deseado, tal como la producción de la construcción de aloinjerto de tejido cutáneo tridimensional y/o la composición de la invención, o para su uso en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de afecciones, trastornos o enfermedades de la piel, desprecintando una ampolla del banco de células, descongelando el contenido y transfiriéndolo a un medio de cultivo celular común.

50 El aloinjerto de tejido cutáneo tridimensional de la invención se puede producir de la siguiente manera: de tres a cinco días antes de la fecha del injerto, se siembran láminas de 9 x 12 cm de colágeno equino con las células cutáneas fetales del banco de células, por ejemplo, aproximadamente 1 x 105 células/cm2 (células usadas de los pasos 0 a 3), haciendo pequeñas incisiones en la matriz con puntas de pipeta estériles de pequeño calibre. A

55 continuación, cierto tiempo después (por ejemplo, aproximadamente 1 hora), se añade el medio a la placa de cultivo. También se cambia el medio de forma periódica, por ejemplo, una vez cada dos días.

La construcción que se produce contiene queratinocitos epidérmicos no diferenciados (aproximadamente del 10 % al aproximadamente 13,5 %) y fibroblastos dérmicos no diferenciados (aproximadamente del 90 % al 60 aproximadamente 86,5 %). Debido a la estructura tridimensional de este injerto, resulta muy fácil aplicar los injertos en cualquier orientación en un paciente o sujeto, lo que es ventajoso, ya que existen muchas afecciones, trastornos

o enfermedades de la piel en zonas del cuerpo que normalmente son difíciles de cubrir con los injertos usados actualmente por los expertos en la materia.

65 Sin quedar vinculados a ningún mecanismo en particular, es probable que las células de las construcciones de aloinjerto puedan ejercer efectos de potenciación de la adhesión, proliferación y migración de las células existentes mediante la secreción de factores de crecimiento disponibles en las células fetales. Las heridas reparadas tienden a curarse sin que quede cicatriz y la piel aparece mucho menos atrófica. Las ventajas prácticas de dicha técnica incluyen el hecho de que no es invasivo y, por lo tanto, no requiere instalaciones quirúrgicas. Dichos métodos de tratamiento se aplican fácilmente de forma ambulatoria, y se puede disponer de inmediato de las células en lugar de

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5 tener que esperar de 4-6 semanas, como con las técnicas de autoinjerto tradicionales. Finalmente, puesto que dichas construcciones se pueden usar para tratar las úlceras incluso más resistentes con una tasa de éxito muy elevada, dicha técnica será útil para el tratamiento de heridas agudas con el fin de reparar la piel dejándola en un "estado perfecto".

10 La invención también proporciona una composición que contiene células fetales y/o proteínas no diferenciadas y un vehículo. Dicha composición se puede usar para tratar una serie de defectos de la piel, incluyendo, pero sin limitación, imperfecciones, manchas por la edad, cicatrices, quemaduras, contusiones, marcas de nacimiento, tatuajes, problemas de pigmentación, periúlceras, eczemas, radiodermititis, úlceras, urticaria, sequedad severa y atrofia blanca.

15 Para preparar la composición, se pueden recoger biopsias de tejido del donante fetal y desarrollar líneas celulares como se ha descrito anteriormente. Por ejemplo, el tejido fetal se puede dividir en fragmentos pequeños en múltiples placas de cultivo tisular de 10 cm2, que se han preparado con incisiones en forma de cuadrícula realizadas con un bisturí. Se añaden medios de cultivo tisular de DMEM con glutamina y suero fetal al 10 % a las placas. Las células

20 fetales permanecen en el estado no diferenciado, y se expanden a una alta concentración, creando un banco de células del que se obtienen los injertos de piel fetal. Las células se congelan en una mezcla de DMSO, DMEM y suero fetal hasta que se necesiten.

Las células de los pasos 5-10 se preparan a una concentración de aproximadamente 5,3 x 103 células/ml. Dicha

25 concentración puede variar en función del tipo de defecto de la piel y de si el paciente es un adulto o un niño. Por ejemplo, la concentración de células puede variar de aproximadamente 5,3 x 102 células/ml a aproximadamente 5,3 x 104 células/ml. Entonces, se estabilizan las proteínas fetales y se incorporan a un vehículo, bien solo o en combinación con las células fetales.

30 La composición descrita anteriormente se puede usar para prevenir o tratar una afección, un trastorno o una enfermedad de la piel mediante la administración de una cantidad terapéuticamente eficaz de la composición en la zona susceptible o afectada de la piel de un sujeto. Por ejemplo, la afección, el trastorno o la enfermedad de la piel incluye, pero sin limitación, una afección inflamatoria de la piel. Los ejemplos incluyen, pero sin limitación, imperfecciones, manchas por la edad, cicatrices, quemaduras, contusiones, marcas de nacimiento, tatuajes,

35 hiperpigmentación, dermatitis atópica, periúlceras, eczemas, radiodermititis, úlceras, urticaria, sequedad severa y atrofia blanca. El sujeto incluye tanto seres humanos como animales. Por ejemplo, los sujetos pueden ser, por ejemplo, seres humanos, primates no humanos, fauna silvestre, perros, gatos, caballos, vacas, cerdos, ovejas, conejos, ratas o ratones.

40 Los expertos en la materia se darán cuenta de que se pueden usar cualquier vehículo y/o estabilizador adecuado con las composiciones de la invención. Por ejemplo, en una realización preferida, el vehículo es una crema tópica.

La construcción de aloinjerto de tejido cutáneo tridimensional de la invención se puede usar solo o en combinación con la composición de la invención. Por ejemplo, la construcción de aloinjerto y la composición se pueden

45 administrar simultánea o secuencialmente.

La Tabla 1 enumera una serie de afecciones que se pueden tratar usando las terapias con células fetales de la invención. La tabla también detalla el número de pacientes tratados que tienen cada afección, así como los resultados observados.

50 Los siguientes ejemplos se presentan con el fin de ilustrar de manera más completa las realizaciones preferidas de la invención. Dichos ejemplos no se deben interpretar, bajo ningún concepto, como limitantes del alcance de la invención, como se define mediante las reivindicaciones adjuntas.

Tabla 1: Patologías de la piel tratadas con terapia de células fetales

Eczema 5 Pacientes tratados, en todos se eliminó el eczema por completo.

Atrofia blanca 3 Pacientes tratados, mejoría y estabilización de la atrofia blanca.

Quemaduras 7 Pacientes tratados, se observaron dolor y reconstitución total de la piel.

Tratamiento de cicatrices 4 Pacientes tratados con buenos resultados.

Manos gravemente agrietadas 10 Pacientes tratados, buena mejoría y piel estabilizada, curación completa.

Radiodermatitis 2 Pacientes tratados, progreso sumamente bueno, piel reforzada y menor sensibilidad.

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Tabla 1: Patologías de la piel tratadas con terapia de células fetales

Soriasis 3 Pacientes tratados, 1 completamente curado, 2 tienen menos picor, queda irritación localizada.

Queloides 1 Paciente tratado, gran queloide irritado de un tamaño de más de la mitad y sin picor.

Vestibulitis 2 Pacientes tratados, sin picor.

Dermatitis atópica-Sequedad 4 Pacientes tratados, estabilización de la piel, y eliminación de todo el picor y la sequedad.

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Ejemplos

Ejemplo 1: Recogida de la piel fetal

10 Las biopsias se obtuvieron de tejido de piel fetal de un donante inmediatamente después de la interrupción del embarazo de conformidad con las políticas y los procedimientos del Comité de Ética de la CHUV. El tejido del donante es de 12 a 16 semanas de gestación.

Ejemplo 2: Síntesis del banco de células cutáneas fetales

15 A partir de la biopsia original, descrita en el Ejemplo 1, se sembraron 500 placas de 10 cm con fragmentos de tejido entero de aproximadamente 10 por placa (< 0,5 mm3). Estos fragmentos se cultivaron en DMEM suplementado solo con suero bovino fetal al 10 % (Hyclone). Cuando el crecimiento celular avanzó después de aproximadamente 1 semana, se trataron placas de tejido y células con tripsina (tripsina al 0,25 %-ácido etilendiaminotetraacético al 0,1 %

20 [EDTA]). En este momento, se congelaron 490 placas en unidades individuales en nitrógeno líquido. Se centrifugaron las células a 2.000 g durante 15 min y se volvieron a suspender en una solución de congelación de DMEM (5 ml) + FCS (4 ml) + DMSO (1 ml, Fluka), y se congelaron en partes alícuotas de un ml (~3 millones de células) a -80 ºC en recipientes aptos para congelación a 1 ºC NalgeneTM Cryo (Nalgene) hasta alcanzar una velocidad de las curvas de refrigeración y congelación de -1 ºC/min. Después de 24 horas, se transfirieron las

25 células a nitrógeno líquido para un almacenamiento más prolongado. Las células almacenadas de esta manera son capaces de permanecer almacenadas durante al menos 10 años. Se amplificaron 10 placas hasta 200 placas e incluso hasta 2.000 unidades para la solución madre congelada. Los cultivos celulares se cultivaron a 37 ºC en una atmósfera humidificada del 95 % de aire/5 % de CO2 (Véase la Figura 1).

30 Con una donación de órganos de 1-4 cm2 de piel fetal, es posible desarrollar un banco de células cutáneas capaz de producir un mínimo de 2.400.000 injertos de piel (9 x 12 cm) para su uso terapéutico. Las células cutáneas fetales se analizan de la manera habitual en busca de Mycoplasma, así como de todas las infecciones bacterianas y fúngicas. Para la donación de tejido original, el paciente se probó a los 0 y 3-6 meses, usando los anticuerpos enumerados en la Tabla 2:

35 Tabla 2:

Anticuerpos ensayados: Compañía

HBsAg-Cobas Core HbsAgll EIA: F. Hoffmann-La Roche AG

Anti-VIH-1/VIH-2: F. Hoffmann-La Roche AG

Cobas Core Anti-HIV-1/HIV-2 EIA DAGS II: F. Hoffmann-La Roche AG

Anti HCV-Cobas Core Anti-HCVEIA: F. Hoffmann-La Roche AG

AXSym Anti-HCV EIA, Versión 3.0: Abbott BmbH Diagnostika

PCR-HCV-Cobas Amplicor, Versión 2.0: F. Hoffmann-La Roche AG

Treponema pallidum: Serodia-TP.PA: Fujirebio, Al medica AG

Anti-CMV-Vidas CMV IgG: BioMérieux SA

ETI-CYTOK-M reverse: Sorin Diagnostics S.r.L

Toxoplasma gondii-Toxo-Screen DA (IgG),: BioMérieux SA

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Anticuerpos ensayados: Compañía

Toxo-ISAGA (IgM): BioMérieux SA

El tejido fetal también se examinó en el laboratorio de patología en busca de cualquier anomalía genética y/o patológica.

5 Ejemplo 3: Fuentes de radiación, condiciones de exposición y tratamientos químicos

Para determinar la resistencia de las células de piel fetal y de adulto al estrés físico y oxidativo, se ha realizado una serie de experimentos en los que se observa la radiación UVA y el tratamiento con peróxido de hidrógeno como la fuente del estrés.

10 La lámpara UVASUN 3000 (Mutzhas, Múnich, Alemania) emite longitudes de onda de entre 330 y 450 nm a una velocidad de dosis de 300 W/m2 en una posición de irradiación conveniente. Se analizó la salida espectral de la lámpara con un espectrorradiómetro calibrado modelo 742 de Optronic (Optronics Laboratories, Penn., EE.UU.) y mostró un pico ancho entre 360 y 410 nm. La lámpara UVASUN 3000 está dotada de un filtro de infrarrojos y un filtro

15 que corta bruscamente todas las longitudes de onda inferiores a 335 nm. Además, las células se irradiaron con tapas de plástico para cultivos tisulares que no permiten ninguna transmisión de la radiación UVB ni UVC. Las dosis de radiación se controlaron mediante el radiómetro International Light, IL 1700 con cabezal detector de UVA, calibrado contra el espectrorradiómetro.

20 Las biopsias de piel fetal se obtuvieron del donante inmediatamente después de la interrupción del embarazo de conformidad con los procedimientos y las políticas del Comité de Ética de la CHUV. El tejido del donante fue de aproximadamente 12 a 16 semanas de gestación.

Las muestras de piel de los donantes adultos (SW2, varón de 24 años de edad; SW12, mujer de 39 años de edad;

25 GT, varón de 27 años de edad) se obtuvieron en el Departamento de Dermatología del Hospital Universitario de Lausanne de zonas de piel no expuestas al sol con el consentimiento informado y la aprobación del Comité de Ética de la Facultad de Medicina.

Cultivo de queratinocitos epidérmicos:

30 Se lavaron las muestras de piel tres veces durante diez minutos cada vez en PBS que contenía penicilina (100 U/ml) y estreptomicina (100 µlg/ml). Se trató el tejido durante ~15 minutos con tripsina/EDTA y se raspó la capa de células epidérmicas suavemente del tejido dérmico con la ayuda de un microscopio de disección. Se fragmentó el tejido epidérmico y se centrifugó a 2.000 g durante 15 minutos. Se transfirió el sedimento a matraces de cultivo tisular

35 pequeños que contenían células 3T3 de ratón Swiss irradiadas con radiación γ (2.500 rad) al 70 % de confluencia y el siguiente medio completo de queratinocitos: medio esencial mínimo de Dulbecco:Hams diluido 3:1 (flujo); FCS al 10 %; glutamina al 1 %; 0 4, µg/ml de hidrocortisona; toxina del cólera 10-10 M; 5,0 mg/ml de insulina; 1,2 mg/ml de adenina; 2,5 mg/ml de transferrina; 0,14 mg/ml de triyodotironina; 10 µg/ml de factor de crecimiento epidérmico. Se cultivaron los queratinocitos a 37 ºC en una atmósfera humidificada con 90 % de humedad/CO2 al 10 %. Se

40 cultivaron las células usadas para los injertos de piel humana en medio libre de suero (Gibco, queratinocitos SFM) y durante las primeras 12 horas, se añadió FCS al 5 % para asegurar una mayor unión de las células.

Cultivo de fibroblastos epidérmicos:

45 Se diseccionó tejido dérmico en fragmentos < 0,5 mm3 y se cultivó en DMEM suplementado con FCS al 10 % y glutamina, y se usaron las células para la experimentación entre los pasos 0 y 3. Se cultivaron hasta la confluencia antes de la división, se enjuagaron dos veces con PBS y se realizó el recuento.

Se sembraron las células en placas de cultivo Falcon de 60 o 100 mm de diámetro y se cultivaron hasta el 75 % de

50 confluencia. Justo antes de la irradiación o del tratamiento químico de las células, se retiró el medio de cultivo y se lavó la monocapa de células dos veces con solución salina tamponada con fosfato (PBS, NaCl 0,14 M; KCl 2,7 mM; Na2HPO4 8,1 mM, KH2PO4 1,5 mM). Para la irradiación UVA, se cubrieron las células con PBS y se irradiaron a 25 ºC. Los periodos de irradiación fueron de un promedio de aproximadamente 13 a 55 minutos como máximo. Para el tratamiento de peróxido de hidrógeno, se cubrieron las células con PBS que contenía la concentración apropiada

55 de H2O2 (0,1-2,4 mM) y se trataron durante 30 min a 37 ºC en una incubadora de CO2 al 5 %.

Análisis de la supervivencia:

Se trataron con tripsina placas de células (60 mm, ~75 % de confluencia) que habían recibido bien peróxido de

60 hidrógeno o tratamientos de radiación UVA, se diluyeron y se sembraron a 200-5.000 células por placa (60 mm, tres placas por tratamiento). Se incubaron las placas a 37 ºC durante 12 a 14 días, tras lo que se tiñeron con azul de metileno, y se realizó el recuento de las colonias (> 20 células) con la ayuda de un microscopio de disección. Todos los experimentos se llevaron a cabo tanto con el sistema de iluminación de campana de flujo laminar como con las luces fluorescentes de la sala apagadas.

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Características de crecimiento celular y estabilidad:

5 Se estabilizaron las curvas de crecimiento celular para los fibroblastos de piel humana fetal y de adulto. Se trataron con tripsina las células de los matraces al 75 % de confluencia y se realizó el recuento. Se establecieron placas de

1.000 células por triplicado y se contaron en varios puntos temporales entre 5 y 20 días.

Las células (fibroblastos de piel fetal y de adulto) también se congelaron en varias condiciones como sedimentos celulares a -20 ºC, -80 ºC y con nitrógeno líquido, y también en asociación con diferentes concentraciones de DMSO. La estabilidad de las células también se determinó mediante la refrigeración de las células bien en sedimentos o asociadas en una matriz de colágeno.

15 Inmunohistoquímica:

Para la inmunohistoquímica, se usaron secciones de tejido fijadas de 5 µm de espesor. A menos que se especifique lo contrario, todas las incubaciones se realizaron en una cámara humidificada a oscuras.

Para la detección de p63, se bloqueó la unión inespecífica mediante una incubación de 2 horas a 25 ºC con una solución de PBS que contenía suero de ternera fetal al 5 % (FCS), suero normal de cabra al 7 % (NGS) y Triton X 100 al 0,1 %. A continuación, se incubaron las secciones de tejido con anticuerpos específicos de p63 (p63 [un homólogo de p53 en 3q27-29] Ab-1, clon 4A4) a una dilución 1:2.000 en PBS que contenía FCS al 5 %, NGS al 5 % y Triton X 100 al 0,1 % durante 30 minutos (Neomarkers, Fremont, California, EE.UU.). Inmediatamente después de

25 dicha incubación (p53), se lavaron las secciones de tejido 3 veces durante 10 minutos cada vez en PBS y se trataron las secciones con biotina de cabra anti-conejo en 1:2000 en una solución de PBS con FCS al 5 %, NGS al 1 % y Triton X 100 al 0,1 % durante 3 horas a 25 ºC. Se lavaron las secciones de tejido 4 veces durante 5 minutos cada vez en PBS y después se trataron con Vectastain ABC® (Vector, Burlingame, CA) según lo indicado por la empresa durante 3 horas a 25 ºC. Tras dicha incubación, se lavaron las secciones de tejido 3 veces durante 10 minutos cada vez en PBS y se trataron con 0,5 mg/ml de 3,3'-diaminobencidina con 0,32 µl de H2O2 al 30 % añadido justo antes de una incubación de 1-2 minutos. Todas las muestras se trataron al mismo tiempo. La tinción de los anticuerpos para p63 está representada por una coloración marrón. Se lavaron las muestras durante 5 minutos con agua corriente. Se tiñeron con colorante de contraste Papanicolaou (solución de hematoxilina de Harris), se deshidrataron y se montaron con Merckoglas® (Merck, Suiza).

35 Resultados:

Poblaciones de células obtenidas en grandes cantidades:

La piel, al igual que muchos otros tejidos, se repone constantemente con nuevas células producidas por células madre. Uno de los genes de las células cutáneas que es vital para el mantenimiento de las células madre epiteliales es p63, que proporciona un excelente marcador para la localización de estas células en la capa epidérmica de la piel. Se ha demostrado, al menos con un modelo murino, que, en ausencia de p63, la proliferación regenerativa para las extremidades, el desarrollo craneofacial y epitelial no es eficaz. (Yang et al., Nature 398: 714-718, 1999). En la

45 piel fetal, la epidermis solo tiene un espesor de 1-2 capas entre las 12-14 semanas de gestación y un espesor de ~24 capas de células aproximadamente a las 16 semanas. En todas las capas de la piel durante el desarrollo, es posible detectar un fuerte marcaje nuclear de p63 en todas las células epidérmicas y en el desarrollo de los folículos pilosos. Estas células (células madre, queratinocitos epidérmicos p63+) han recibido mucha atención debido a su capacidad para producir diferentes tipos de células, pero poco se sabe de cómo funcionan y de por qué son capaces de proliferar de manera constante, aunque parece que p63 desempeña un papel en el mantenimiento de la población de las células madre epiteliales. El tejido dérmico no contiene células p63+ individuales y todavía no existe un marcador identificado que caracterice a los fibroblastos dérmicos que son capaces de una rápida regeneración

Se cultivaron por separado tanto queratinocitos epidérmicos como fibroblastos dérmicos de piel fetal. Todas las

55 células epidérmicas eran p63+ (Fig. 2a) y se obtuvieron cultivos de células puras a partir del epitelio (Fig. 2b) y del tejido dérmico (Fig. 2c). Los queratinocitos son mucho más resistentes al estrés oxidativo que los fibroblastos dérmicos subyacentes (Applegate et al., European Journal of Dermatalogy 7:215-219, 1997; Applegate et al., “Landmarks in Photobiology”, pág. 259-263, 1998; y Applegate et al., JID 111: 159-163, 1998). Como esto también se observó para las células fetales, se usaron los fibroblastos de piel fetal y de piel de adulto para caracterizar las diferencias en la resistencia a los estreses de tipo físico y oxidativo.

Crecimiento celular y estabilidad de los fibroblastos de piel fetal frente a los de piel de adulto:

El crecimiento celular de los fibroblastos de piel fetal ha demostrado ser mucho mayor que el de los fibroblastos de

65 piel de donantes adultos. Desde el primer día en que los fragmentos de piel fetal se colocan en placas de cultivo, es posible diferenciar la excrecencia de los fibroblastos, véase la Fig. 3, fragmentos de piel fetal (representados por círculos cerrados (FS1), cuadrados cerrados (FS2) y triángulos cerrados (FS3)) En general, se observa lo mismo tras 5-6 días para los fragmentos de piel de adulto tratados en las mismas condiciones, véase la Fig. 3, fragmentos de piel de adulto (representados por círculos abiertos (GT/29), cuadrados abiertos (SW2/24) y triángulos abiertos (SW12/39)). Una vez establecidos los cultivos, las células fetales siguen creciendo a un ritmo mucho más rápido que

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5 las células de los adultos. (Véase la Fig. 3). Por analizar simplemente el número de células en función de los días en cultivo cuando se comienza con un bajo número de células (100 o 1.000), existe una marcada diferencia a los 12 días de cultivo. Esto quizás se deba a la diferencia en la eficacia de clonación, que es aproximadamente del 83-91 % para las células fetales y del 10-22 % para las células de adulto.

10 De la misma manera, las células fetales congeladas como simples sedimentos celulares incluso a -20 ºC durante un máximo de 3 meses pueden mostrar una excrecencia parecida a la mostrada cuando se encuentran en condiciones de congelación normales con DMSO en nitrógeno líquido. Los fibroblastos de piel del adulto (dos de las tres líneas celulares) pueden mostrar una cantidad limitada de crecimiento celular en condiciones de congelación de -80 ºC con DMSO como agente de conservación, pero no a -20 ºC. Los fibroblastos de piel fetal pudieron incluso mostrar un

15 crecimiento celular considerable tras una refrigeración de 2 semanas.

Supervivencia celular de fibroblastos de la piel fetal frente a los de piel de adulto tras la radiación UVA:

Los fibroblastos neonatales de tejido de prepucio son más resistentes al estrés oxidativo. (Applegate et al., JID 102:

20 7672-767, 1994). Fue interesante ver cómo las células de diferentes edades de gestación también reaccionaban al el estrés oxidativo y comparar su resistencia con las células de piel de adulto. A pesar de que existe una gran diferencia entre las células fetales y las células de adulto en cuanto a la resistencia a la radiación UVA como al estrés oxidativo, no se observaron diferencias entre las edades de 12-16 semanas de gestación. Al observar el porcentaje de supervivencia en función de la dosis de radiación UVA, hay una extrema resistencia marcada en las

25 tres líneas celulares de piel fetal (representadas por círculos cerrados (FS1), cuadrados cerrados (FS2) y triángulos cerrados (FS3) ensayadas en el número de pases anterior en comparación con las líneas de células de piel de adulto (representadas por los círculos abiertos (GT/29), cuadrados abiertos (SW2/24) y triángulos abiertos (SW12/39) en el mismo paso. (Véase la Fig. 4). Incluso después de la dosis más alta de radiación UVA (que duró aproximadamente 50 minutos), solo murió aproximadamente el 20 % de las células fetales. Por el contrario, una

30 dosis de 30-50 KJ/m2 (una dosis que provoca un eritema perceptible en la piel humana) fue capaz de matar el 50 % de las células de piel de adulto.

Supervivencia celular de fibroblastos de la piel fetal frente a los de piel de adulto tras el tratamiento con H2O2:

35 Las curvas de inactivación para los fibroblastos de piel de adulto son de naturaleza bifásica, algo característico del uso de peróxido de hidrógeno como agente oxidante. Sin embargo, esto no se observa para las células cutáneas fetales (representadas por círculos cerrados (FS1), cuadrados cerrados (FS2) y triángulos cerrados (FS3)) y hay una disminución gradual de la supervivencia de las células al aumentar la concentración de peróxido de hidrógeno. Las células de piel fetal son 1,5 veces más resistentes a este tipo de estrés oxidativo que las células de piel de adulto

40 (representadas por círculos abiertos (GT/29), cuadrados abiertos (SW2/24) y triángulos abiertos (SW12/39) en las mismas condiciones de cultivo y los mismos pasos. (Véase la Fig. 5).

Las células fetales han demostrado ser resistentes a estreses de tipo físico y oxidativo, lo que parece proporcionar una gran estabilidad a dichas células. Se desconoce por qué las células fetales son mucho más resistentes al estrés 45 oxidativo. Sin quedar limitados a ningún mecanismo en particular, es posible que puedan ser más eficaces en la eliminación de los radicales libres intermedios potencialmente dañinos o que tal vez sean más eficaces en el procesamiento y la reparación del daño oxidativo provocado en dianas celulares de importancia fundamental. Es interesante señalar que, en los estudios preliminares en busca de proteínas mediante el análisis en gel dimensional en células fetales en pasos bajos y altos, se han identificado varias proteínas que cambian drásticamente y que

50 están implicadas en las funciones del estrés oxidativo.

Ejemplo 4: Aplicaciones veterinarias de las construcciones de aloinjerto de tejido cutáneo tridimensional

El caballo, debido a su utilización deportiva, está particularmente expuesto a la lesión cutánea. La cicatrización de

55 las heridas cutáneas en los caballos es especialmente prolongada y difícil de tratar, y tiene varios aspectos interesantes. Teniendo en cuenta la pérdida de masa y el daño tisular producido en paralelo, las heridas traumáticas rara vez pueden ser suturadas. Además, el caballo está predispuesto a sufrir una granulación tisular excesiva, que inhibe los procesos de reparación tisular. En concreto, hay una inhibición de la formación epitelial y una potenciación de la formación de queloides. Dicha tendencia a la granulación tisular excesiva puede tener graves consecuencias

60 para la calidad estética y puede conducir a largos períodos de inmovilización para el animal. Estos factores pueden contribuir a una reducción del valor económico del animal y de su utilización. Por consiguiente, para un caballo de carreras que se ha lesionado, no es raro que sea necesaria una inmovilización de 4 a 6 meses que, a su vez, conduzca a una pérdida directa de competitividad. Por lo tanto, existe la necesidad de un producto de reparación tisular que sea capaz de estimular la renovación epidérmica en las heridas de los equinos en períodos de tiempo

65 muy cortos.

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Se sembró una esponja de colágeno fabricada a partir de tendón equino con células fetales equinas (fibroblastos/queratinocitos no diferenciados) y se cultivaron en medio de cultivo tisular en presencia de suero equino. El proceso de producción de la construcción de aloinjerto cutáneo se realizó como se desvela en el Ejemplo

2. Sin embargo, se usaron células fetales equinas en lugar de células fetales humanas. Se ensayaron dos defectos 5 cutáneos usando la construcción de aloinjerto de tejido cutáneo tridimensional preparada según dicho método.

El paciente 1 era un equino que tenía un absceso profundo en la mandíbula. El absceso dental penetraba desde el interior de la boca hasta la superficie exterior, generando una úlcera. Se preparó al caballo para la cirugía, y se limpió la herida con NaCl. Se preparó la construcción de aloinjerto y se colocó en el absceso como se muestra en la

10 Fig. 6a. A continuación, se cubrió la construcción de aloinjerto con un vendaje y se suturó como se muestra en la Fig. 6b. Una semana después de la cirugía inicial, se había producido el cierre completo y la eliminación del absceso. (Véase la Fig. 6c).

El paciente 2 era un equino que tenía una herida profunda en la rodilla que atravesaba la piel y el músculo, llegando

15 hasta el hueso. (Véase la Fig. 7a). Se preparó al caballo para la cirugía, y se limpió la herida. Se usó un injerto de doble capa para tratar dicha herida. Una capa cubría el músculo (e incluía células de músculo fetal no diferenciadas) y una capa cubría la piel (e incluía células cutáneas fetales no diferenciadas). Se colocó la construcción de aloinjerto en la zona de la herida (Fig. 7b), y luego se cubrió con vendajes y se fijó con grapas (Fig. 7c). Dos días después de la cirugía, la herida parecía estar curándose tanto en la capa ósea como en la muscular (Fig. 7d) quedando tan solo

20 afectada la superficie.

Ejemplo 5: Aplicaciones en seres humanos de las construcciones de aloinjerto de tejido cutáneo tridimensional

25 Se crearon líneas celulares usando las técnicas descritas en el Ejemplo 2, supra. Aproximadamente de tres a cinco días antes de la fecha del injerto en el paciente, se sembraron láminas de 9 x 12 cm de colágeno equino con 1 x 105 células/cm2 (células usadas desde los pasos 0 a 3) haciendo pequeñas incisiones en la matriz con puntas de pipetas estériles de bajo calibre. A continuación, se añadió medio a la placa de cultivo una hora más tarde y se cambió cada dos días. El aloinjerto de tejido cutáneo tridimensional producido contenía queratinocitos epidérmicos no

30 diferenciadas (10-13,5 %) y fibroblastos dérmicos no diferenciados (90-86,5 %).

Los pacientes tratados en dicho estudio se seleccionaron basándose en sus antecedentes de úlceras crónicas en la pierna que no se habían cerrado usando otras terapias tradicionales (vendaje de contención, autoinjertos, etc.). Se evaluó cada paciente por Doppler y en ausencia de arteriopatología. A continuación, se limpiaron las úlceras

35 crónicas con solución salina fisiológica y la preparación mecánica con una cureta. Se aplicaron las construcciones de aloinjertos de células fetales cubriendo toda la superficie de la herida, seguidas de una capa de gasa con vaselina y vendajes de gasa convencionales. Las construcciones de aloinjerto se aplicaron una vez a la semana seguidas de 4 días hasta el cambio del vendaje. Luego, los vendajes se cambiaron cada dos días.

40 Se trató un total de 11 pacientes con la terapia de células fetales en relación con 21 úlceras. Entre ellas, 15 úlceras se cerraron por completo, 3 presentaron una mejoría significativa en el tamaño (pero no el cierre total) y 3 dejaron de recibir seguimiento debido a que los pacientes estimaron que se había producido una mejoría sustancial. En el presente documento, se presentan los datos de 2 pacientes. La Tabla 3 resume todos los pacientes tratados con la terapia de células fetales. El paciente 1 era una mujer que tenía artritis reumatoide. Presentaba una úlcera arterial y

45 venosa resistente, que medía 2 x 4,5 cm, en la articulación del tobillo que se había producido hacía 18 meses. Se emplearon sin éxito dos aplicaciones de injerto con Apligraft®. La paciente presentaba antecedentes de múltiples alergias y dolor intenso en y alrededor de la lesión ulcerosa. Después de muchas dificultades para encontrar una cobertura suficiente (debido a una alergia a todo tipo de vendajes) y varios meses de incumplimiento en cuanto a la preparación de la herida, la paciente aceptó finalmente ser sometida a la eliminación de la barrera de fibrina de la

50 herida para que la posterior aplicación de injertos fetales pudiera tener lugar de manera eficaz. Se trató a la paciente con un total de 31 construcciones de aloinjerto. Inmediatamente después de la preparación del lecho de la herida, hubo una reducción del dolor y una reducción continua del tamaño de la úlcera. Un pequeño cambio en el tipo de gasa utilizada al final del tratamiento (debido a una falta de existencias en el hospital) bastó para irritar la piel circundante. Estos resultados se presentan en la Fig. 8. El paciente 2 era una mujer con cuatro úlceras en la pierna

55 izquierda. Las úlceras medían 4 x 2,5 cm (se recibieron 10 construcciones de aloinjerto en total); 3 x 2 cm (se recibieron 12 construcciones de aloinjerto en total); 3 x 2 cm (se recibieron 24 construcciones de aloinjerto en total); y 2,5 x 2 cm (se recibieron 24 construcciones de aloinjerto en total). Las úlceras se habían iniciado hacía dos años, y la paciente se encontraba anémica, deshidratada y muy delgada. El tratamiento previo con 4 autoinjertos y 4 administraciones de Apligraft® no tuvo éxito. Se observó una mejoría inmediata de la congestión de la pierna y del

60 dolor tras un tratamiento con la terapia de células fetales de la invención. Se observó la mejoría progresiva y rápida en dos de las úlceras, que se cerraron en un período de varias semanas. Las dos úlceras restantes también mostraron una mejoría, pero no fue posible el cierre completo. Posteriormente, se intentó cerrar las dos úlceras restantes con autoinjertos, pero no hubo éxito. Estos resultados se presentan en la Fig. 9.

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Tabla 3. Evolución de los pacientes tratados con terapia de células fetales

Sexo: Tipo de úlcera Número de construcciones de aloinjerto Resultados de la terapia con células fetales Resultados de otros tratamientos

F: 19 Evolución progresiva, pero sin cierre. Hospitalizada para autoinjerto sin éxito, seguido de 3 semanas con la bota de Unna. Todavía en tratamiento

F: Venosa, pierna izquierda 1,13 x 4 cm; Profundidad de 2, 4 x 2 cm 17 5 Úlcera completamente curada. Úlcera completamente curada.

F: Venosa, pierna izquierda; profundidad de 5 x 4 cm 19 Úlcera completamente curada.

F: Atrofia blanca profunda 14 Evolución progresiva, pero sin cierre. Hospitalizada para autoinjerto. Milagrosamente cerrada con VAC preparatoria.

F: Venosa, pierna izquierda 1. 4 x 2,5 cm 2. 3 x 2 cm 3. 3 x 2 cm 4. 2,5 x 2 cm 10 12 24 24 Úlcera completamente curada. Úlcera completamente curada. Evolución progresiva, pero sin cierre. Evolución progresiva, pero sin cierre. Hospitalizada para autoinjerto sin éxito, todavía en tratamiento.

F: Poliartritis LL 2 x 4,5 cm 31 Úlcera completamente curada.

F: Venosa, pierna derecha 4 x 2 cm 7 Úlcera completamente curada.

M: 4 Buena evolución progresiva. El paciente interrumpe los tratamientos clínicos.

F: Atrofia blanca 3 Úlcera completamente curada.

F: Arterial, Pierna izquierda 1, 4 x 2 cm 2, 2 x 2 cm 3 3 Evolución progresiva, pero sin cierre. Evolución progresiva, pero sin cierre.

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Ejemplo 6: Aplicaciones en seres humanos de la composición en crema

Se preparó una composición tópica que contenía células cutáneas fetales no diferenciadas y un vehículo en forma de crema. Esta composición contenía los siguientes ingredientes:

Agua purificada-68,51 %: Aceite vegetal hidrogenado -10,0 %

Glicerina -5,0 %: Propilenglicol -4,9 %

Octanoato de cetearilo -2,0 %: Alcohol cetearílico-1,35 %

Glicosaminoglicanos hidrolizados 0,7 %: - Éster C12-18 de PEG-8 -0,7 %

Alcohol cetílico -0,7 %: Palmitato de cetilo -0,7 %

Actina hidrolizada -0,7 %: Fibronectina hidrolizada -0,6 %

Glicerilestearato -0,6 %: Queratina hidrolizada -0,5 %

Perfume -0,5 %: PPG-25-Laureth-25 -0,5 %

Pentaeritritiléter de PEG-5-0,4 %: Ricinoleth-40 -0,32 %

Hidroxietilcelulosa -0,3 %: Glucosa -0,2 %

Cloruro de sodio -0,2 %: Metilparabeno -0,14 %

Simeticona -< 0,1 %: Palmitato de ascorbilo -0,08 %

Acetato de tocoferilo -0,08 %: Imidazolidinilurea -0,08 %

Propilparabeno -0,05 %: Cloruro de potasio -0,05 %

Cloruro de magnesio -0,04 %

Se crearon las líneas celulares usando las técnicas descritas en el Ejemplo 2 anterior. Se prepararon las células de los pasos 5-10 para una concentración final de 5,3 x 103 células/ml, y se estabilizaron las proteínas fetales mediante la congelación progresiva a 1 grado por hora hasta una temperatura final de -80 ºC. Se calentó gradualmente la

10 composición en crema, una mezcla de aceite en agua, para la incorporación de las proteínas fetales. El paciente 1 era una mujer con diagnóstico de atrofia blanca. La paciente tenía una úlcera persistente en la pierna. Tras dos semanas de tratamiento con la composición en crema de la invención, la úlcera parecía estar completamente cerrada, como se muestra en la Fig. 11.

15 Ejemplo 7: Aplicaciones en seres humanos de la terapia de combinación: aloinjerto de tejido cutáneo tridimensional y composición en crema

El paciente 1 era una mujer con diagnóstico de atrofia blanca en ambas regiones inferiores de la pierna. La úlcera de la región inferior derecha de la pierna se había iniciado hacía 20 meses, y tenía una naturaleza extremadamente 20 fibrosa. Como toda la piel inferior de la pierna era atrófica, se aplicó la construcción de aloinjerto de tejido cutáneo tridimensional junto con la composición en crema de la invención para cubrir toda la región de alrededor de la úlcera.

Tras dicha terapia de células fetales, se eliminaron la congestión y el picor de inmediato, y la úlcera original se fue cerrando gradualmente. A pesar del cierre de la úlcera original, se formó una nueva ulceración en paralelo debido a 25 la inestabilidad de la piel. Para una mejor preparación de la herida, esta paciente fue sometida a un cierre asistido por vacío (VCA) aplicado durante una semana con la intención de aplicar un autoinjerto. Sorprendentemente, tras el VAC, la úlcera y las ulceraciones leves asociadas se cerraron. Anteriormente, varios cientos de pacientes habían sido tratados solo con VAC durante una semana, y no se había observado el cierre de la herida. En el año de seguimiento, la atrofia blanca de la paciente se estabilizó y no se observó ninguna nueva ulceración. Estos

30 resultados se presentan en la Fig. 12. El paciente 2 era una mujer con antecedentes de una misma úlcera en la pierna durante 10 años. Los autoinjertos anteriores y las diferentes terapias con vendajes no habían tenido éxito. Inmediatamente después de la aplicación de la primera construcción de aloinjerto de células fetales y la crema, se hizo evidente la eliminación de la congestión, del dolor y la producción de fibrina. Se observó el cierre progresivo y rápido de dicha gran úlcera, profunda y

35 dolorosa. La crema estabilizó la piel periférica y evitó la formación de nuevas úlceras. En el año de seguimiento, la piel seguía atrófica, pero no había presencia de tejido cicatricial. Estos resultados se presentan en la Fig. 10.

Claims

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REIVINDICACIONES

1. Uso de células cutáneas fetales no diferenciadas de tejido de donante de 12-16 semanas de gestación en la preparación de un medicamento para la prevención o el tratamiento de una afección, un trastorno o una enfermedad

5 de la piel en un sujeto sin la formación de cicatriz mediante la administración tópica, en el que el medicamento comprende una construcción de aloinjerto de tejido cutáneo tridimensional que contiene dichas células cutáneas fetales no diferenciadas integradas con una matriz de colágeno o en el que dicho medicamento comprende dichas células cutáneas fetales no diferencias combinadas con un vehículo.

10 2. Células cutáneas fetales no diferenciadas para su uso en la prevención o el tratamiento de una afección, un trastorno o una enfermedad de la piel en un sujeto sin la formación de cicatriz mediante la administración tópica, estando dichas células contenidas en una construcción de aloinjerto de tejido cutáneo tridimensional e integradas con una matriz de colágeno, o estando dichas células contenidas en una composición y combinadas con un vehículo, y en el que dichas células cutáneas fetales no diferenciadas proceden de un tejido de donante de 12-16

15 semanas de gestación.
3. Uso según la reivindicación 1 o las células para el uso de la reivindicación 2, en el que el sujeto es un ser humano

o un caballo.

20 4. Uso según la reivindicación 1 o las células para el uso de la reivindicación 2, en el que la afección, el trastorno o la enfermedad de la piel se selecciona del grupo que consiste en heridas y defectos cutáneos.
5. Uso según la reivindicación 4 o las células para el uso de la reivindicación 4, en el que la herida es una herida

aguda. 25
6. Uso según la reivindicación 5 o las células para el uso de la reivindicación 5, en el que la herida aguda se selecciona del grupo que consiste en pequeños cortes, quemaduras, piel seca, desgarros cutáneos, laceraciones de la piel, heridas quirúrgicas, traumatismo accidental y cicatrices hipertróficas.

30 7. Uso según la reivindicación 4, o las células para el uso de la reivindicación 4, en el que la herida es una herida crónica.
8. Uso según la reivindicación 7 o las células para el uso de la reivindicación 7, en el que la herida crónica se

selecciona del grupo que consiste en úlceras venosas, úlceras por presión, úlceras diabéticas, úlceras arteriales, 35 quemaduras y periúlceras.
9. Uso según la reivindicación 4 o las células para el uso de la reivindicación 4, en el que el defecto cutáneo se selecciona del grupo que consiste en eczema, soriasis, radiodermititis, cáncer de piel, urticaria, vasculitis livedoide, sequedad severa, atrofia blanca, vestibulitis, cicatrices, contusiones, hiperpigmentación, dermatitis atrófica, manos

40 gravemente agrietadas, queloides y cicatrices hipertróficas.
10. Uso según la reivindicación 4 o las células para el uso de la reivindicación 4, en el que la afección de la piel es una afección inflamatoria de la piel.

45 11. Uso según la reivindicación 10 o las células para el uso de la reivindicación 10, en el que la afección inflamatoria de la piel se selecciona del grupo que consiste en cicatrices, quemaduras, contusiones, hiperpigmentación, dermatitis atópica, periúlceras, eczema, radiodermatitis, úlceras, urticaria, sequedad severa, atrofia blanca, soriasis y vestibulitis.

50 12. Uso según la reivindicación 11 o las células para el uso de la reivindicación 11, en el que la afección inflamatoria de la piel es una periúlcera.
13. Uso según la reivindicación 11 o las células para el uso de la reivindicación 11, en el que la afección inflamatoria

de la piel es atrofia blanca. 55
14. Uso según la reivindicación 11 o las células para el uso de la reivindicación 11, en el que la afección inflamatoria de la piel es hiperpigmentación.
15. Uso según la reivindicación 11 o las células para el uso de la reivindicación 11, en el que la afección inflamatoria 60 de la piel es vestibulitis.
16. Uso según la reivindicación 1 o las células para el uso de la reivindicación 2, en el que las células cutáneas fetales comprenden del 10 % al 13,5 % de queratinocitos epidérmicos no diferenciados y del 86,5 % al 90 % de fibroblastos dérmicos no diferenciados.

65

imagen2
17.

Uso según la reivindicación 1 o las células para el uso de la reivindicación 2, en el que la matriz de colágeno es una matriz de colágeno equino.
18.

Uso según la reivindicación 1 o las células para el uso de la reivindicación 2, en el que dicho vehículo formulado

5 para la administración tópica es un vehículo líquido o no líquido, una loción, una crema, una pasta, un gel, un polvo, una pomada, un disolvente, un diluyente líquido o gotas.
19. Uso o células para el uso según la reivindicación 18, en el que dicha crema comprende una mezcla de aceite en

agua. 10
20. Uso o células para el uso según la reivindicación 18, en el que dicha crema comprende una mezcla de agua en aceite.
21. Uso o células para el uso según la reivindicación 1, en el que dicho vehículo formulado para la administración 15 tópica comprende un adyuvante hidrófobo y un adyuvante hidrófilo.
22. Uso o células para el uso según la reivindicación 1, en el que la composición comprende además uno o más agentes antiiflamatorios, analgésicos, agentes antimicrobianos, agente antifúngicos, antibióticos, vitaminas, antioxidantes o agentes bloqueadores de la radiación solar.

20
23. Un método no terapéutico de prevención o tratamiento de una afección cutánea seleccionada del grupo que consiste en imperfecciones, manchas por la edad, cicatrices, marcas de nacimiento, tatuajes, hiperpigmentación y piel seca en un sujeto mediante la administración tópica de una construcción de aloinjerto de tejido cutáneo tridimensional que contiene células cutáneas fetales no diferenciadas integradas con una matriz de colágeno o una

25 composición que comprende células cutáneas fetales no diferenciadas, en el que las células cutáneas fetales no diferenciadas proceden de tejido de donante de 12-16 semanas de gestación.
24. Células fetales no diferenciadas para su uso en la prevención o el tratamiento de una afección, un trastorno o una enfermedad de la piel en un sujeto, en las que dichas células están combinadas con un vehículo en forma de 30 una crema, 68,51 % (en peso) de agua, 10,0 % (en peso) de aceite vegetal hidrogenado, 5,0 % (en peso) de glicerina, 4,9 % (en peso) de propilenglicol, 2,0 % (en peso) de octanoato de cetearilo, 1,35 % (en peso) de alcohol cetearílico, 0,7 % (en peso) de glicosaminoglicanos hidrolizados, 0,7 % (en peso) de éster C12-18 de PEG-8, 0,7 % (en peso) de alcohol cetílico, 0,7 % (en peso) de palmitato de cetilo, 0,7 % (en peso) de actina hidrolizada, 0,6 % (en peso) de fibronectina hidrolizada, 0,6 % (en peso) de estearato de glicerilo, 0,5 % (en peso) de queratina hidrolizada, 35 0,5 % (en peso) de perfume, 0,5 % (en peso) de PPG-25-Laureth-25, 0,4 % (en peso) de pentaeritritiléter de PEG-5, 0,32 % (en peso) de Ricinoleth-40, 0,3 % (en peso) de hidroxietilcelulosa, 0,2 % (en peso) de glucosa, 0,2 % (en peso) de cloruro de sodio, 0,14 % (en peso) de metilparabeno, menos del 0,1 % (en peso) de simeticona, 0,08 % (en peso) de palmitato de ascorbilo, 0,08 % (en peso) de acetato de tocoferilo, 0,08 % (en peso) de imidazolidinilurea, 0,05 % (en peso) de propilparabeno, 0,05 % (en peso) de cloruro de potasio and 0,04 % (en peso) de cloruro de

40 magnesio.