ES2326873T3

ES2326873T3 - Dispositivo quirurgico para tratamiento o analisis de la piel.

Info

Publication number: ES2326873T3
Application number: ES03713880T
Authority: ES
Inventors: Steven T. Boyce
Original assignee: Shriners Hospitals for Children; University of Cincinnati
Current assignee: Shriners Hospitals for Children; University of Cincinnati
Priority date: 2002-03-06
Filing date: 2003-03-03
Publication date: 2009-10-21
Anticipated expiration: 2023-03-03
Also published as: EP2075330B1; WO2003076604A3; EP1483373B1; US8765468B2; EP2302035A3; AU2003217907A1; JP5689023B2; JP2005518910A; US9089417B2; US20130259919A1; JP2011172592A; US20030170892A1; WO2003076604A2; ATE431400T1; HK1156073A1; US7741116B2; JP5535446B2; EP2302035A2; US20100254955A1; CA2478107C

Abstract

Un dispositivo de piel cultivada que comprende células dérmicas y epidérmicas cultivadas soportadas en una matriz de ingeniería reticulada entrecruzada acelular biocomplatible, en la que la matriz está formada por un fluido que contiene colágeno fundido, congelado y deshidratado y tiene un espesor inicial de 0,1 mm a 1,0 mm antes de la inoculación con las células dérmicas y epidérmicas cultivadas, y en el que las células dérmicas cultivadas proporcionan una capa de laminación celular superficial continua soportada sobre la matriz y las células epidérmicas cultivadas proporcionan una capa superpuesta sobre la capa de laminación, y en el que el dispositivo tiene un espesor en el intervalo de 50 µm a 500 µm, y en el que las células dérmicas y epidérmicas no son células embrionarias humanas.

Description

Dispositivo quirúrgico para tratamiento o análisis de la piel.

Campo de la invención

La invención se refiere, en general, a un dispositivo quirúrgico para el tratamiento terapéutico de las heridas en la piel de un paciente y para el análisis de la anatomía o fisiología de la piel, y a un procedimiento para preparar el dispositivo.

Antecedentes

La piel es uno de los órganos más extensos del cuerpo y cubre sustancialmente la totalidad de la superficie externa del cuerpo. La piel está compuesta por dos capas principales: El epitelio superficial o epidermis, que contiene queratinocitos como un tipo de células epidérmicas, y la capa de tejido conjuntivo subyacente o dermis, que contiene fibroblastos como un tipo de células dérmicas. Las funciones de la piel incluyen proteger un organismo de lesiones y desecación sirviendo como una barrera contra las infecciones, percibiendo o detectando estímulos ambientales, excretando varias sustancias, regulando la temperatura del cuerpo y ayudando a mantener el equilibrio
hídrico.

Por su importancia cuantitativa y cualitativa, es importante que la piel esté sustancialmente intacta y sana, no solo para el bienestar de un organismo sino para su propia supervivencia.

La salud e integridad de la piel pueden verse comprometidas por afecciones congénitas o adquiridas, bien agudas o crónicas, para las que los procesos de regeneración y reparación de la piel pueden ser inadecuados. Estas afecciones incluyen quemaduras, heridas, úlceras, infecciones, enfermedades y/o anomalías congénitas. Los pacientes con quemaduras en una superficie grande a menudo requieren un reemplazo de la piel inmediato y extenso. Afecciones de la piel menos amenazantes para la vida pero crónicas, como el caso de la estasis venosa, las úlceras diabéticas o por decúbito como tres ejemplos, pueden progresar a afecciones más graves si no se tratan, particularmente porque los pacientes con estas afecciones presentan una patología subyacente. La reducción de la morbididad y la mortalidad en estos pacientes dependen de un restablecimiento oportuno y eficaz de la estructura y función de la piel.

Los sustitutos de la piel derivados ex vivo o in vitro pueden usarse para tratar estas u otras afecciones. Propiedades deseables de los sustitutos de la piel son fácil disponibilidad, un requisito mínimo para la piel donante, simplicidad relativa para producir y rentabilidad de fabricación y uso. Se han intentado varios abordajes de la fabricación de sustitutos de la piel que satisfagan algunos de estos requisitos, con varios grados de éxito. No obstante, todavía ningún sustituto ha regenerado todas las estructuras y funciones de la piel. En su lugar, todos son subconjuntos de piel no dañada. Sólo un transplante de piel de espesor completo restablece prácticamente todas las estructuras y funciones de la piel normal no dañada, lo que es más, cicatriza durante la curación.

Se han fabricado materiales para uso terapéutico en la reparación de la piel Estos materiales contienen diferentes componentes que sustituyen o reemplazan las estructuras y funciones de la dermis y/o la epidermis. Ejemplos de estos materiales incluyen EpiCel^{TM}, que carece de un componente dérmico y usa los propios queratinocitos cultivados del paciente; Integra^{TM}, que usa una matriz de glucosaminoglucano (GAG)-colágeno para proporcionar un componente dérmico acelular y usa un fino autoinjerto; AlloDerm^{TM} y un fino autoinjerto; DermaGraft^{TM}, que usa una matriz de ácido poliglicólico/ácido poliláctico (PGA/PLA) y fibroblastos humanos alogeneicos para la dermis; Hyaff/Laser-Skin^{TM}, que usa hialurano y fibroblastos para la dermis y hialurano y los propios queratinocitos del paciente para la epidermis; y PolyActive^{TM}, que usa óxido de polietileno/polibutiltalato (PEO/PBT) y puede usar los propios fibroblastos del paciente para la dermis y queratinocitos cultivados del paciente para la epidermis.

Entre los materiales para cubrir temporalmente heridas o para estimular los procesos de reparación permanente de la piel se incluyen ApliGraft^{TM}, que usa gel de colágeno y fibroblastos alogeneicos para la dermis, y queratinocitos alogeneicos cultivados para la epidermis; Comp Cult Skin^{TM} u Orcel^{TM}, que usa colágeno y fibroblastos alogeneicos para la dermis y queratinocitos alogeneicos cultivados para la epidermis; y TransCyte^{TM}, fibroblastos para la dermis y un material sintético, BioBrane^{TM}, para la epidermis.

Aunque los materiales anteriores son útiles en varios grados, cada uno tiene sus desventajas y limitaciones. Algunos de los materiales son frágiles en términos mecánicos, lo que dificulta realizar las manipulaciones requeridas y trasladar material en secciones grandes sin que se desgarre. En su lugar, los materiales deben usarse en forma de piezas más pequeñas, lo que hace que el cubrimiento de áreas de superficie grande sea laborioso para el médico e indeseable en términos cosméticos para el paciente debido a las cicatrices en las junturas de los injertos. Los materiales también son sensibles a la contaminación microbiana, lo que es inaceptable para pacientes que ya presentan un mayor riesgo de infección debido a sus afecciones comprometidas. Los materiales muestran varias velocidades de enganche del injerto y tiempos hasta la curación, ambas situaciones que deben considerarse a la hora de seleccionar las ventajas de un material concreto sobre otro para un paciente concreto. Por ejemplo, un material que sea aceptable pero que requiera más tiempo para injertarse y cicatrizar es menos deseable porque un recubrimiento con éxito incluye un retorno a la rutina normal lo más rápido posible.

El reemplazo compuesto de la piel anterior del propio inventor, desvelado en la patente de EE.UU. nº 976.878, había sido utilizado con éxito para tratamiento terapéutico de heridas en la piel. Se aplicó quirúrgicamente en un único procedimiento y contenía una capa de células epidérmicas cultivadas, un componente de la membrana dérmica polimérico y acelular, y una capa de laminación sustancialmente no porosa sobre una superficie del componente de la membrana dérmica. El componente de membrana dérmica estaba formado por colágeno o por colágeno y un compuesto mucopolisacárido, y estaba laminado con el mismo colágeno, colágeno y compuesto mucopolisacárido, que contiene solución con un crioprotector volátil. La cala de laminación sustancialmente no porosa puede estar localizada entre el componente dérmico y la capa de células epidérmicas cultivadas, lo que estimula la localización de células epidérmicas sobre la superficie del componente dérmico y el desplazamiento de los nutrientes a las células del componente epidérmico celular. Esta composición también se puede usar para administrar moléculas biológicamente activas en el sitio en el que se aplique.

Entre las características deseables del reemplazo de piel compuesto descrito en lo que antecede incluían una velocidad más rápida de vascularización del área cubierta por el material, menor contaminación microbiana, mayor suministro de nutrientes y mejo función de barrera epidérmica, en comparación con otros materiales. Las áreas cubiertas con el reemplazo de la piel compuesto requerían menos tiempo para injertarse y curar y el material era menos sensible a la contaminación microbiana de lo que se había comunicado para otros materiales. Otras características deseables son que este material era relativamente no frágil y fácil de manejar, y que podía generarse con relativa rapidez, por ejemplo dentro de un marco de tiempo en e que un paciente quemado requiere injertos de piel. No obstante, aunque ningún otro material ha curado heridas escindidas de espesor completo con mayor rapidez y con una incidencia de contaminación microbiana tan baja, siguen existiendo limitaciones. Por tanto, sigue habiendo la necesidad de un enfoque más próximo a las propiedades estructurales y funcionales de la piel normal no dañada.

El documento WO97/41208 desvela un equivalente multicapa de la piel que tiene una capa de entramado incorporada con células formadoras de dermis y una capa de queratinocitos.

Resumen de la invención

La presente invención proporciona un dispositivo de piel cultivada que comprende células dérmicas y epidérmicas cultivadas soportadas en una matriz de ingeniería reticulada acelular biocomplatible, en la que la matriz está formada por un fluido que contiene colágeno fundido, congelado y deshidratado y tiene un espesor inicial de 0,1 mm a 1,0 mm antes de la inoculación de las células dérmicas y epidérmicas cultivadas, y en la que las células dérmicas cultivadas proporcionan una capa de laminación celular superficial continua soportada sobre la matriz y las células epidérmicas cultivadas proporcionan una capa superpuesta sobre la capa de laminación, y en la que el dispositivo tiene un espesor en el intervalo de 50 \mum a 500 \mum, y en la que las células dérmicas y epidérmicas no son células embrionarias humanas.

La invención también proporciona un procedimiento para producir un dispositivo de piel cultivada, en el que el procedimiento comprende las etapas de:

(i) inocular una matriz de ingeniería, acelular, reticulada, entrecruzada y biocompatible, en la que la matriz está formada por un fluido que contiene colágeno fundido, congelado y deshidratado, y tiene un espesor inicial de 0,1 mm a 1,0 mm antes de la inoculación de células dérmicas cultivadas;

(ii) incubar la matriz inoculada en condiciones suficientes para formar una capa de laminación celular superficial continua de células dérmicas cultivadas soportadas sobre la matriz inoculada;

(iii) inocular células epidérmicas cultivadas sobre la capa de laminación celular superficial continua de células dérmicas cultivadas; e

(iv) incubar en condiciones suficientes para formar una capa superpuesta de células epidérmicas cultivadas sobre la capa de laminación celular superficial continua de células dérmicas cultivadas,

en el que el dispositivo tiene un espesor en el intervalo de 50 \mum a 500 \mum, y en el que las células dérmicas y epidérmicas no son células embrionarias humanas.

La invención está dirigida a un dispositivo para injerto quirúrgico de heridas de la piel o para un modelo de piel in vitro y en animales. El dispositivo tiene una matriz que contiene colágeno acelular, biocompatible, reticulado, para proporcionar un sustrato de fijación para uno o más capas o poblaciones de células dérmicas y/o epidérmicas cultivadas. En varias formas de realización, las células usadas para poblar la matriz pueden ser del receptor (antólogas), de otro ser humano (alogeneicas), de otra especie (xenogeneicas) y de múltiples fuentes (quiméricas). Las células epidérmicas incluyen queratinocitos, melanocitos, inmunocitos y/o células madre. Las células dérmicas incluyen fibroblastos, células endoteliales, inmunocitos, células nerviosas, miocitos y/o células madre. Cualquiera o los dos tipos de células, epidérmicas y dérmicas, pueden modificarse genéticamente.

La invención también está dirigida a un procedimiento para preparar un dispositivo para injerto quirúrgico de heridas de la piel o para un modelo de piel in vitro y en animales. A una matriz en sustrato absorbente se proporciona una suspensión celular para administrar células a la matriz para fijación. La matriz inoculada se incuba en condiciones suficientes para tener como resultado un dispositivo celular.

El dispositivo también puede usarse en una superficie no herida, una superficie mínimamente herida o en una superficie preparada quirúrgicamente que no requiera injerto de piel pero en la que se pueda realizar bioingeniería de las células del sustituto de piel para proporcionar un factor fisiológico del que carezca el receptor, tal factor puede ser una proteína, por ejemplo insulina o factor de coagulación VIII, y puede proporcionarse a un diabético o a un paciente hemofílico, respectivamente, que tengan deficiencia de dicha proteína.

Además de su uso como sustituto de la piel, el dispositivo de la invención también se puede usar como sustrato vivo sobre el que realizar pruebas toxicológicas o de otro tipo con varios compuestos aplicados tópicamente, tales como fármacos, cosméticos, hidratantes, lociones, toxinas ambientales, sustancias químicas industriales, etc. El dispositivo, que contiene células de un individuo concreto, puede mostrar una respuesta individualizada a una variedad de compuestos. Tal enfoque puede ser útil para analizar la toxicidad de compuestos en contacto con la piel. El dispositivo también puede ser útil como herramienta diagnóstica médica para analizar alergias en individuos, o en aquéllos que exhiban reacciones químicas a componentes que se encuentran en productos farmacéuticos o de libre dispensación. En esta forma de realización, el dispositivo reducirá o eliminará las pruebas de toxicidad in vivo.

Estas y otras características de la invención se apreciarán con referencia a la siguiente descripción detallada.

\vskip1.000000\baselineskip

Descripción detallada

El dispositivo de aplicación quirúrgica de la invención para el tratamiento de heridas de la piel es una matriz que soporta células dérmicas y/o células epidérmicas. Más particularmente, una matriz acelular, reticulada y biocompatible se usa como soporte o entramado en el que se aplican, fijan y proliferan las células cultivadas. Una matriz de colágeno reticulado soporta una capa continua o población de células dérmicas cultivadas y una capa superpuesta o población de células epidérmicas cultivadas. Después de incubar la matriz inoculada en condiciones que facilitan el crecimiento celular, el dispositivo se transplanta quirúrgicamente al paciente. En una forma de realización, el trasplante puede realizarse en un día (aproximadamente 16 horas a aproximadamente 24 horas) tras la inoculación de células epidérmicas en la matriz. En otra forma de realización, el trasplante puede realizarse en un mes después de la inoculación de células epidérmicas en la matriz. Dentro de estos tiempos, el dispositivo desarrolla propiedades preferidas para un material para injerto de piel terapéutico.

El uso de células cultivadas para formar el material, en contraste con el tejido obtenido mediante el cosechado convencional de piel con menor espesor con un dermatomo, proporciona la ventaja de obtener un número mucho mayor de células epidérmicas y dérmicas que con el cosechado convencional, y, de este modo, se reduce considerablemente el requisito de que la piel del donante de cierre completo de heridas de piel grandes y de espesor completo.

Una vez que el dispositivo se ha injertado en el paciente, la matriz biodegradable es absorbida por el cuerpo. Las células se organizan para formar tejido cutáneo funcional, denominado sustituto de piel cultivado injertado. El dispositivo tiene muchas de las propiedades y estructuras que se encuentran en la piel normal no dañada y funciona como lo hace la piel normal no dañada para proteger al individuo de la pérdida de fluidos y de la infección microbiana. Por ejemplo, el dispositivo funciona como barrera epidérmica, que es definitoria de la función de la piel normal como saben los expertos en la técnica. El dispositivo establece una membrana basal y mantiene la misma configuración anatómica de las capas o poblaciones celulares como en la piel normal no dañada. El dispositivo produce y libera factores angiogénicos y mediadores del proceso inflamatorio, como lo hace la piel normal no dañada. El dispositivo está vascularizado con eficacia en menos de una semana y esta parcialmente vascularizado en un plazo de dos días desde el transplante.

En otra forma de realización de la invención, el dispositivo se usa como sustituto temporal de la piel. En esta forma de realización, la matriz puede estar poblada por células que tienen genotipos no antólogos. Por ejemplo, las células epidérmicas y/o dérmicas cultivadas pueden ser autólogas, es decir, obtenidas del individuo que va a ser el receptor del dispositivo y que puede usarse en un dispositivo injertado de forma permanente. En otras formas de realización, las células epidérmicas y/o dérmicas pueden ser alogeneicas, obtenidas de un ser humano distinto al receptor. En todavía otras formas de realización, las células epidérmicas y/o dérmicas pueden ser xenogeneicas, obtenidas de un animal no humano, tal como células epidérmicas y/o dérmicas porcinas, para aprovechar las similitudes de los rasgos y características de la piel de cerdo en comparación con la piel humana. Las células xenogeneicas también pueden obtenerse de plantas o microbios. El uso de diferentes fuentes para epidérmicas y/o dérmicas tiene como resultado un dispositivo quimérico en términos genéticos. Con independencia de la fuente de las células epidérmicas y/o dérmicas, una o más células pueden modificarse genéticamente. Varios factores pueden afectar a la selección de composiciones genotípicas concretas de las células. Por ejemplo, el uso de células alogeneicas o xenogeneicas puede acortar el tiempo de preparación del dispositivo o puede reducir más el requisito de piel del donante del paciente. Dependiendo de la afección concreta del receptor, estos factores pueden ser un determinante importante.

Si se usan células de piel el paciente que se va a tratar con el dispositivo de la invención, se obtienen de una biopsia de un área sana de la piel del paciente usando técnicas conocidas para un experto en la técnica, incluida la biopsia por punción, la biopsia SAHVE y la escisión de piel de espesor completo con cierre con sutura. Los componentes celulares dérmicos y epidérmicos se separan y aíslan en células dérmicas y epidérmicas, tal y como describen Boyce y Ham en J. Tissue Culture Methods 1985;9:83, y capítulo 13 en In Vitro Models for Cancer Research, Vol. 3, p. 245, Webber y Sekely, Eds. CRC Press, Boca Raton Florida (1986). Las células dérmicas y epidérmicas se cultivan individualmente, como describen Boyce y Ham in J. Invest. Dermatol. 1983;81:335, y en el capítulo 28 en Methods in Molecular Medicine, Vol. 18, p. 365, Morgan & Yarmush, Eds., Humana Press, Totowa NJ (1998).

Varias células en la epidermis, por ejemplo queratinocitos, melanocitos, inmunocitos, células madre u otras, y varias células en la dermis, por ejemplo fibroblastos, células endoteliales, inmunocitos, células nerviosas, miocitos, células madre u otras, se pueden cultivar bien individualmente o colectivamente. Después de obtener un número adecuado, o de que se exprese una fisiología celular específica, las poblaciones celulares se recogen para su posterior población de la matriz. En varias formas de realización, la proporción entre las células epidérmicas y dérmicas usadas para inocu-
lar la matriz están en el intervalo de aproximadamente 2:1 o 1:1, pero también se incluyen otras proporciones celulares.

Dependiendo de la aplicación para la que se prepara el dispositivo, se pueden incluir o excluir tipos seleccionados de células epidérmicas y/o células dérmicas. Como un ejemplo, un dispositivo puede incluir melanocitos para restablecer la pigmentación en el punto del transplante. La restauración de la pigmentación de la piel se define como cualquier incremento de la función anatómica o fisiológica del color de la piel del injerto, aunque la extensión del color puede ser mayor o menor que en la piel no dañada. Como otro ejemplo, una composición de piel cultivada puede incluir células endoteliales para estimular la formación de vasos sanguíneos.

Al preparar el dispositivo se usa un material biocompatible que es permisivo como sustrato para cultivo y transplante de células cultivadas. Una forma de realización usa esponja liofilizada de colágeno, sola o en combinación con un hidrato de carbono (un mucopolisacárido, tal como un glucosaminoglucano (GAG), particularmente condroitín-6-sulfato). El colágeno puede ser colágeno de piel bovina, colágeno de tendón bovino, colágeno de otras fuentes tisulares (p. ej., hueso, músculo), otras fuentes xenogeneicas (p. ej., cerdo, oveja, cabra, etc.), fuentes de ingeniería genética, fuentes humanas o una combinación de cualquiera de los anteriores.

En una forma de realización de preparar la matriz, un coprecipitado de colágeno-GAG se funde, congela y deshidrata para formar una matriz reticulada. Posteriormente, esta matriz se esteriliza, rehidrata y lamina mediante inoculación con células epidérmicas y dérmicas cultivadas. La inoculación se realiza a temperatura ambiente (aire de la estancia) y la matriz inoculada se incuba en una atmósfera con humedad saturada o reducida. La matriz se incuba después, bien sumergida en un medio o con la matriz en contacto con una atmósfera gaseosa. En la última forma de realización, las células inoculadas están en la superficie atmosférica de la matriz. Cada una de estas etapas se describe a continuación con más detalle.

Fluido que contiene proteína formadora de la matriz

Una dispersión de colágeno se prepara mediante pre-solubilización de colágeno (6,43 mg/ml), ácido acético (0,01 M a 1,0 M), normalmente durante hasta dieciséis horas, tras las cuales la dispersión se almacena a 4ºC. Después, si se ha de añadir un hidrato de carbono se puede preparar un co-precipitado con un glucosaminoglucano (GAG), tal como condroitín-6-sulfato. El condroitín-6-sulfato (3,45 mg/ml) se añade al ácido acético (0,01 M a 3,0 M).

La dispersión de colágeno preparada previamente se vuelve a dispersar durante al menos cinco minutos y se transfiere a un batidor aislado de acero inoxidable con una camisa refrigerada recirculante. La solución de GAG se añade a la solución proteica por cualquier medio que produzca una agitación y cizalladura adecuadas para formar un co-precipitado. Esto se puede realizar transfiriendo la solución GAG a una botella con cuentagotas y añadiendo el GAG al colágeno usando un cuentagotas al que se le ha fijado una aguja de calibre 22 lo que permite que la solución de GAG gotee en 750 ml de la dispersión de colágeno y se mezcle a una velocidad de 5.000 revoluciones por minuto (rpm) y se mantenga a 4ºC, a una velocidad de una gota cada diez segundos. Después de que haya goteado todo el volumen de GAG en el colágeno, el coprecipitado de colágeno-GAG se transfiere a frascos y se centrifugan para eliminar todas las burbujas de aire atrapadas. La espuma que se recoge en la parte superior se elimina mediante aspiración y después se recoge en coprecipitado de colágeno-GAG.

Preparación de la matriz reticulada

El fluido que contiene proteína, con o sin hidrato de carbono, se prepara para formar la matriz. Como etapas preliminares, un aparato liofilizador (para liofilización) se pre-enfría hasta aproximadamente -35ºC a aproximadamente -50ºC. En una forma de realización se prepara un baño de congelación en un envase de poilipolietileno de alta densidad (HDPE) que contiene etanol 95% que se ha pre-enfriado a aproximadamente -45ºC durante al menos cuatro horas. No obstante, se puede usar cualquier tipo de aparato o configuración que elimine el calor a una velocidad controlada de modo que se produzca un descenso de la temperatura suficiente para congelar la matriz dentro de un marco de tiempo de hasta aproximadamente cuatro horas. Por ejemplo, el tiempo y la temperatura se pueden regular para producir un descenso de la temperatura de aproximadamente 4ºC a aproximadamente -40ºC en un plazo de aproximadamente dos horas, o un descenso de la temperatura de aproximadamente 4ºC a aproximadamente -75ºC en aproximadamente cuatro horas.

La solución proteica se introduce en un aparato, que se describe más completamente en la solicitud de patente de EE.UU. en tramitación nº de serie 10/091,849, titulada "Apparatus for Preparing a Biocompatible Matrix", presentada en la misma fecha que el presente documento, que se incorpora expresamente en su totalidad por referencia en la presente memoria descriptiva. El resultado es una matriz con una composición, estructura y propiedades que soportan las células dérmicas y epidérmicas cultivadas para estimular la formación del dispositivo.

Brevemente, una solución formadora de matriz está contenida entre dos placas de un material conductor térmico, con una junta que forma los laterales restantes de una cámara sellada. El espesor de la junta, en el intervalo de aproximadamente 0,1 mm a aproximadamente 10 mm, regula el espesor de la matriz resultante. La solución proteica se introduce en la cámara. Cuando se ha añadido todo el volumen de la solución, la cámara se sella de forma reversible mediante, por ejemplo, pinzamiento. A continuación, la cámara se expone a temperaturas y/o condiciones suficientes para eliminar el calor a la velocidad controlada previamente descrita para solidificar la matriz.

Una vez que la matriz ha solidificado, las placas se separan para exponer la matriz congelada. Una placa que contiene la matriz se transfiere a un estante refrigerado (-45ºC) de un liofilizador. Después se aplica vacío y cuando la presión es inferior a 60 mT, también se aplica calor (30ºC). La liofilización se produce durante la noche hasta un volumen final inferior a 15 mT, La matriz liofilizada se suelta de forma espontánea y después se transfiere a una lámina de soporte.

La matriz se reticula en ausencia de un agente de reticulación químico. Es deseable que esto elimine cualquier toxicidad asociada con los agentes químicos de reticulación residuales, que pueden no eliminarse completamente incluso después de repetidos lavados. En una forma de realización de la invención se usa la reticulación térmica. Esto se consigue mediante deshidratación térmica en un horno de vacío (Lab-Line 3628) a aproximadamente -100 kPa a aproximadamente 105ºC durante aproximadamente 24 horas. Una vez que se ha producido la reticulación, la matriz se almacena después en un desecador a temperatura ambiente, bien en una hoja de papel de aluminio o bien en otro material de soporte, durante hasta aproximadamente tres meses.

La matriz reticulada tiene un espesor en el intervalo de aproximadamente 0,1 mm a aproximadamente 1,0 mm. Una matriz que tiene un espesor en el intervalo de aproximadamente 0,1 mm a aproximadamente 1,0 mm, cuando se inocula con células como se ha descrito, tiene como resultado un dispositivo que tiene un espesor en el intervalo de aproximadamente 50 \mum a aproximadamente 500 \mum. Cuando dicho dispositivo se usa para tratar heridas de la piel, es deseable que este espesor estimule la rápida vascularización, administración de nutrientes, población del dispositivo con células y eliminación de residuos, y deseablemente facilita la degradación de la matriz tras el transplante, dejando únicamente los componentes celulares de la composición.

A continuación, la matriz reticulada se corta en los tamaños y/o formas deseados. En una forma de realización, se corta en cuadrados (por ejemplo, de 9 cm x 9 cm, 11 cm x 11 cm, o de aproximadamente 19 cm por 19 cm) usando un borde liso y tijeras. La matriz se empaqueta en una bolsa de esterilización (por ejemplo, Self-Seal^{TM}), y se almacena a temperatura ambiente en un desecador durante hasta aproximadamente tres meses.

La matriz se esteriliza antes de la inoculación, por ejemplo mediante irradiación gamma a una dosis de al menos aproximadamente 2,5 MRad (por ejemplo, SteriGenics, Westerville OH). Una vez esterilizada, la bolsa de esterilización con la matriz se almacena a temperatura ambiente en un desecador durante hasta aproximadamente un año.

Inoculación celular de la matriz

Todas las soluciones se filtran en esterilidad con un filtro de 0,22 \mum y todos los procedimientos se realizan usando técnicas asépticas, como conoce el experto en la técnica.

La matriz se transfiere a un envase de cualquier forma que tiene una capacidad de volumen de aproximadamente 250 \mul/cm^{2} de matriz/incubación. La matriz se aclara tres veces durante treinta minutos cada aclarado, con solución salina tamponada con Hepes (HBS) y dos veces, treinta minutos cada vez, con medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) u otra solución adecuada, como conoce el experto en la técnica.

Después del aclarado final, se aspira el medio del envase y se coloca un marco de inoculación sobre la superficie de la matriz. El marco de inoculación es un marco cuadrado o rectangular hecho de un material químicamente no reactivo (p. ej., acero inoxidable, Teflon^{TM}) en condiciones fisiológicas (es decir, 37ºC, humedad saturada, pH neutro, soluciones isotónicas). El marco es lo suficientemente grande (p. ej., varias onzas) como para generar un sello del movimiento de las células que se inoculan dentro de su perímetro. El sello puede incrementarse mediante la adición de un bisel en el lado que contacta con la matriz para incrementar la proporción masa/área, pero con una cantidad suficiente de superficie plana o redondeada en contacto con la matriz para evitar que la matriz se corte. En el marco se colocarán aproximadamente 10-12 ml de DMEM suplementado, tal y como se describirá. La matriz y el marco, que contiene DMEM suplementado, se dejan equilibrar a 37ºC/5% de CO_{2} durante al menos quince minutos antes de inocular la matriz con las células.

Las células se pueden inocular sumergidas o emergidas en la matriz rehidratada. En una forma de realización, denominada "inoculación sumergida", las células se inoculan en una matriz sumergida en medio. El medio de cultivo sin células se añade al vaso de cultivo fuera del marco de inoculación para garantizar un sello seguro, que se pone de manifiesto por la ausencia de fugas de medio desde fuera a dentro del marco. Tras la preparación de una suspensión celular mediante tripsinización de células de los cultivos selectivos, las células dérmicas se inoculan a una densidad en el intervalo de aproximadamente 0,05-1,0 x 10^{6} células/cm^{2}. Posteriormente, después de la fijación de las células dérmicas, se inoculan las células epidérmicas en forma de suspensiones y se deja que se fijen a la capa o población de células dérmicas. Como alternativa se pueden inocular simultáneamente combinaciones de células dérmicas y epidérmicas. La proporción entre células dérmicas y células epidérmicas puede estar en el intervalo de aproximadamente 2:1 a aproximadamente 1:1, pero se pueden usar otras proporciones. En otras formas de realización se pueden inocular células dérmicas solas o células epidérmicas solas.

El marco de inoculación permanece en su lugar durante aproximadamente 12-48 horas tras la inoculación de las últimas células en la matriz. El marco de inoculación se elimina después, se escinden los bordes de la matriz sin células y la superficie inoculada de la matriz se expone al aire para estimular la organización de las células epidérmicas y la formación de una barrera epidérmica. Antes de eliminar el marco de inoculación se usa medio de Eagle modificado con Dulbecco con suplementos permitidos. Después de eliminar el marco y de exponer la matriz al aire, el medio se suplementa con progesterona y factor de crecimiento epidérmico.

En otra forma de realización, denominada "inoculación alzada", las células se inoculan en una matriz emergida del medio de cultivo. En esta forma de realización, la matriz se rehidrata y se coloca en un sustrato absorbente, con la superficie superior en contacto con la atmósfera. La suspensión de células dérmicas se inocula sobre la matriz y el drenaje del medio libera las células a la superficie de la matriz, tras lo cual se fijan. Simultáneamente, o después de hasta una semana, se inocula una suspensión de células epidérmicas sobre la matriz.

Más específicamente, se coloca una membrana porosa estéril, no adherente (p. ej., mala calidad médica (N-Terface®, Winfield Laboratories, Inc., Dallas TX); Teflon^{TM}, filtros Millipore o Whatman de poliétersulfona, fluoruro de polivinilideno, éster de celulosa mixta, etc., en lo sucesivo denominada membrana porosa) en una placa de cultivo tisular estéril con HBS y la matriz estéril se coloca en la parte superior de la membrana porosa y se rehidrata. Un material absorbente estéril (p. ej., Merocel^{TM} con un espesor de 9 mm y una densidad intermedia (CF 100); algodón, gasa etc., en lo sucesivo denominado material absorbente) se coloca en una segunda placa estéril a la que se añade DMEM en exceso. La placa se devuelve al incubador para equilibrar.

En preparación a la inoculación de células dérmicas, la matriz se centra sobre la membrana porosa y se aspira el medio. La membrana porosa/matriz se coloca sobre el material absorbente. El área de la matriz se mide en los 0,5 cm más cercanos y la placa se vuelve a incubar. Las células dérmicas se recogen y se cuentan. La densidad se ajusta a 3 x 10^{6} células/ml con DMEM suplementado y se inoculan aproximadamente 5 x 10^{5} células dérmicas/cm^{2} sobre la matriz. Se añade DMEM suplementado y la placa se devuelve al incubador.

Al día siguiente, la unidad se transfiere a una placa estéril de 150 mm que contiene 25 ml de DMEM suplementado que contiene progesterona y factor de crecimiento epidérmico, en lo sucesivo denominado UCMC 160. El medio se aspira y se añaden 25 ml adicionales de medio UCMC 160 fresco. El procedimiento se repite diariamente hasta la inoculación de las células epidérmicas. En preparación a la inoculación de células epidérmicas, el material absorbente estéril se coloca sobre una placa estéril saturada con medio UCMC 160 y se incuba. El proceso se repite diariamente hasta la inoculación de las células epidermales. Antes de la inoculación, la unidad de membrana porosa/matriz/célula inoculada se coloca en la parte superior del material absorbente. El área de la matriz se mide en los 0,5 cm más cercanos y la placa se vuelve a incubar. Las células epidérmicas se recogen y se cuentan. La densidad se ajusta hasta 1,2 x 10^{7} células/ml de medio UCMC 160 y la matriz se inocula con 1 x 10^{6} células/cm^{2}, usando la punta de la pipeta para romper la tensión superficial del inóculo y hacer una capa continua de células epidérmicas sobre la matriz inoculada. Tras 30-60 minutos de incubación se añade medio UCMC 160 a la parte externa del material absorbente. La matriz inoculada se incuba (día 0).

El día 1, se aspira el medio alrededor del material absorbente y antes de la reincubación se añade medio fresco. El día 2, se coloca un marco de alzada estéril, compuesto por malla de alambre y algodón, en una placa estéril nueva y se añade el volumen adecuado de medio UCMC 160 para poner el medio en contacto con la malla de alambre y el algodón. La matriz inoculada se pasa al marco de alzada y algodón saturado y se reincuba. El procedimiento se repite el día 3. A partir del día 4, el procedimiento se repite usando medio UCMC 161 suplementado.

El medio UCMC 161 suplementado se usa para la matriz inoculada. A una base de DMEM con rojo fenol reducido se añaden los siguientes suplementos (todos disponibles en Sigma, St. Louis MO) para alcanzar una concentración final dentro de los intervalos indicados: Cloruro de estroncio (0,01 mM a 100 mM); ácido linoleico/BSA (0,02 \mug/ml a 200 \mug/ml); insulina (0,05 \mug/ml a 500 \mug/ml), triyodotironina (0,2 pM a 2000 pM); hidrocortisona (0,005 \mug/ml a 50 \mug/ml); una combinación de penicilina (100 U/ml), estreptomicina (100 \mug/ml), anfotericina (0,25 \mug/ml); y ácido ascórbico-2-fosfato (0,001 mM a 10 mM).

Para preparar el medio UCMC 160, al medio UCMC 161 se añaden progesterona (0,1 nM a 1000 nM) y factor de crecimiento epidérmico (0,01 ng/ml a 100 ng/ml) para estimular la proliferación transitoria de los queratinocitos.

Sin pretender quedar ligado a una teoría o mecanismo específico, es probable que se produzcan los siguientes acontecimientos. Tras la inoculación, es probable que los fibroblastos formen una unión fisiológica con la matriz de colágeno a través de su unión a receptores específicos de colágeno. Dado que la matriz está reticulada y, por tanto, contiene múltiples superficies continuas, frente a cuando está perforada con canales o aberturas directas desde una superficie superior a una superficie inferior, los fibroblastos u otras células dérmicas que se inoculan no tienen que llenar estos canales o aberturas de la matriz antes de que se puedan añadir las células epidérmicas. En su lugar, tras la inoculación, las células dérmicas se fijan a las reticulaciones y, por tanto, son capaces de proporcionar una laminación de la superficie continua para la inoculación posterior de células epidérmicas en un periodo de tiempo más corto de lo que es posible usando una matriz perforada.

Tras la inoculación, el dispositivo se incuba en condiciones que facilitan el crecimiento, mantenimiento y división celular en cualquier momento de menos de un día (en un plazo de aproximadamente 16 horas a aproximadamente 24 horas) hasta aproximadamente seis semanas. Las células forman una monocapa sustancialmente continua o superficie multicapa. El dispositivo puede después transplantarse a un paciente o puede retenerse bajo estas condiciones hasta el transplante. Durante este periodo, deseablemente la matriz se degrada, las células proliferan y se deposita nuevo colágeno y biopolímeros humanos, todos los cuales estimulan la vascularización y el injerto del dispositivo.

Injerto del dispositivo

En preparación del transplante quirúrgico del dispositivo, la herida se prepara mediante minimización de la contaminación microbiana y maximización del suministro vascular. Normalmente, estas condiciones se consiguen mediante escisión tangencial precoz (es decir, menos de una semana después de la quemadura) de la escara de la quemadura hasta una base viable y la protección temporal de la herida sometida a escisión con aloinjerto de piel de cadáver o con un sustituto dérmico (es decir, Integra Artificial Skin^{TM}).

En el momento del transplante, el componente temporal del aloinjerto o el sustituto dérmico se elimina para generar un lecho de injerto altamente viable con baja contaminación microbiana. Se consigue la hemostasia y se transplantan uno o más de los dispositivos de piel cultivada y se fijan con grapas quirúrgicas. El dispositivo se venda con un vendaje no adherente (p. ej., N-Terface®), gasa de algodón de malla fina y gasa de algodón en masa, con catéteres perforados para la irrigación del dispositivo con, por ejemplo, una solución que agentes antimicrobianos no citotóxicos. Los cambios de vendaje y las exploraciones se realizan a los 2 y 5 días de la operación, tiempo tras el cual normalmente los vendajes húmedos se retiran y se aplica una pomada antimicrobiana adecuada (por ejemplo partes iguales de neomicina: Bactoban:Nistatina). La pomada se aplica a zonas no curadas hasta que la cicatrización sea completa. Una vez realizado el injerto, se pueden aplicar tópicamente al dispositivo varios agentes que pueden facilitar el proceso y/o minimizar las posibles complicaciones- Por ejemplo, una solución de nutrientes, como un medio de cultivo celular modificado, puede suministrar nutrientes a la herida durante la vascularización y/o una solución antimicrobiana no citotóxico puede reducir o controlar la contaminación microbiana.

El dispositivo de la invención también se puede usar para los análisis in vitro. Por ejemplo, el dispositivo puede usarse para la evaluación de compuestos destinados para su aplicación a la piel, tales como cosméticos y/o agentes terapéuticos o preventivos, o puede usarse para la evaluación de compuestos que puedan entrar en contacto con la piel de forma inadvertida, tal como productos químicos industriales y/o toxinas ambientales. La información derivada usando el dispositivo de la invención para cualquiera de estos agentes será beneficiosa en una diversidad de aplicaciones. Como un ejemplo, puede permitir la determinación de los parámetros de absorción, distribución, biotransformación y eliminación de un único agente, o de una combinación de agentes. Como otro ejemplo, puede permitir la determinación de la toxicidad de un único agente, o de una combinación de agentes para uno o más tipos celulares de la piel. Como otro ejemplo más, puede permitir la evaluación cualitativa y cuantitativa de la captación en la piel de un único agente, o de una combinación de agentes, para estudios de formulación, permeabilidad y dosimetría. Como otro ejemplo más, puede permitir la evaluación de una función de barrera tras una agresión mediante un único agente, o de una combinación de agentes. Otros ejemplos de aplicaciones serán apreciados por un experto en la técnica. Dichos procedimientos poseen una diversidad de beneficios: reducen o eliminan la necesidad de realizar estudios in vivo, permiten comparaciones de detección selectiva más controladas y, por tanto, proporcionan datos más reproducibles, permiten la administración de productos químicos tóxicos y/o de agentes radiomarcados etc.

Además, las evaluaciones descritas en lo que antecede y similares se pueden personalizar usando células de un individuo concreto, por ejemplo un individuo propenso a sufrir reacciones alérgicas.

Generalmente, los procedimientos para usar el dispositivo para análisis in vitro implican preparar el dispositivo o usar un dispositivo preparado y aplicar el agente al dispositivo. El agente puede aplicarse, directa o indirectamente, en cualquier superficie del dispositivo, y/o puede añadirse al medio en el que se incuba el dispositivo, y/o puede añadirse dentro de un entorno que rodee al dispositivo, etc. El agente también puede inocularse en el dispositivo.

Por tanto, se describe un dispositivo de piel cultivada y un procedimiento para preparar el dispositivo. El dispositivo y el procedimiento de la invención proporcionan tratamiento de heridas de la piel y poseen características estructurales y funcionales de la piel normal no dañada. En una forma de realización, el dispositivo contiene células del paciente al que se le aplica, lo que reduce o elimina el problema de la compatibilidad del donante. Otras variaciones o formas de realización de la invención también serán evidentes para un experto en la técnica a la luz de la descripción anterior. Como un ejemplo, se pueden usar células de animales no humanos para producir un dispositivo para aplicaciones veterinarias. Como otros ejemplos más, las células epidérmicas pueden ser sólo melanocitos o las células dérmicas pueden ser sólo células endoteliales.

Claims

1. Un dispositivo de piel cultivada que comprende células dérmicas y epidérmicas cultivadas soportadas en una matriz de ingeniería reticulada entrecruzada acelular biocomplatible, en la que la matriz está formada por un fluido que contiene colágeno fundido, congelado y deshidratado y tiene un espesor inicial de 0,1 mm a 1,0 mm antes de la inoculación con las células dérmicas y epidérmicas cultivadas, y en el que las células dérmicas cultivadas proporcionan una capa de laminación celular superficial continua soportada sobre la matriz y las células epidérmicas cultivadas proporcionan una capa superpuesta sobre la capa de laminación, y en el que el dispositivo tiene un espesor en el intervalo de 50 \mum a 500 \mum, y en el que las células dérmicas y epidérmicas no son células embrionarias humanas.

2. El dispositivo de la reivindicación 1, en el que las células epidérmicas se seleccionan del grupo constituido por queratinocitos, melanocitos, inmunocitos, células madre y sus combinaciones, con la condición de que las células madre no sean células embrionarias humanas.

3. El dispositivo de la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en el que las células dérmicas se seleccionan del grupo constituido por fibroblastos, células endoteliales, inmunecitos dérmicos, células nerviosas, miocitos, células madre dérmicas, y sus combinaciones, con la condición de que las células madre no sean células embrionarias humanas.

4. El dispositivo de cualquiera de las reivindicaciones precedentes para el tratamiento en un paciente con una quemadura, una cicatriz de quemadura, una úlcera de piel crónica, una lesión de piel congénita, una enfermedad metabólica, un defecto de proteína, una deficiencia de proteína, y sus combinaciones.

5. El dispositivo de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la matriz está constituido esencialmente por colágeno.

6. El dispositivo de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que las células se seleccionan del grupo constituido por autólogas, alogénicas, xenogeneicas y sus combinaciones.

7. El dispositivo de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que al menos una célula está modificada genéticamente.

8. El dispositivo de cualquiera de las reivindicaciones precedentes capaz de injertarse para proporcionar al menos una característica seleccionada del grupo constituido por una barrera epidérmica, membrana basal, angiogénesis y pigmentación.

9. El dispositivo de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el fluido que contiene colágeno comprende un co-precipitado de colágeno e hidrato de carbono.

10. Un procedimiento para producir un dispositivo de piel cultivada, en el que el procedimiento comprende las etapas de:

(i): inocular una matriz de ingeniería, acelular, reticulada, entrecruzada y biocompatible, en la que la matriz está formada por un fluido que contiene colágeno fundido, congelado y deshidratado, y tiene un espesor inicial de 0,1 mm a 1,0 mm antes de la inoculación con células dérmicas cultivadas;

(ii): incubar la matriz inoculada en condiciones suficientes para formar una capa de laminación celular superficial continua de células dérmicas cultivadas soportadas sobre la matriz inoculada;

(iii): inocular células epidérmicas cultivadas sobre la capa de laminación celular superficial continua de células dérmicas cultivadas; e

(iv): incubar en condiciones suficientes para formar una capa superpuesta de células epidérmicas cultivadas sobre la capa de laminación celular superficial continua de células dérmicas cultivadas,

11. El procedimiento de la reivindicación 10, en el que las condiciones comprenden incubar en un medio que contiene un componente seleccionado del grupo constituido por insulina, al menos un ácido graso esencial, vitamina C, y sus combinaciones.

12. El procedimiento de la reivindicación 11, en el que la insulina está a una concentración en el intervalo de aproximadamente 0,05 \mug/ml a aproximadamente 500 \mug/ml.

13. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 12, en el que la matriz consiste esencialmente en colágeno.

14. El procedimiento de la reivindicación 10, en el que las células epidérmicas comprenden melanocitos y la composición de piel cultivada restablece la pigmentación de la piel.

15. El procedimiento de la reivindicación 10, en el que las células dérmicas comprenden células endoteliales y la composición de piel cultivada estimula la formación de vasos sanguíneos.

16. El procedimiento de la reivindicación 10, en el que las células dérmicas y epidérmicas se aíslan de la piel, se cultivan y después se inoculan mediante un procedimiento seleccionado del grupo constituido por inoculación sumergida, inoculación alzada y sus combinaciones.

17. El procedimiento de la reivindicación 16, en el que las células proceden de un receptor del dispositivo de piel.

18. El procedimiento de la reivindicación 16, en el que las células se seleccionan del grupo constituido por alogeneicas, autólogas y xenogeneicas.

19. El procedimiento de la reivindicación 16, en el que el dispositivo de piel cultivada es de genotipo quimérico.

20. El procedimiento de la reivindicación 10, en el que las células se proporcionan para inoculación mediante aislamiento de al menos un tipo de célula dérmica y al menos un tipo de célula epidérmica de un área no dañada de la piel de un paciente quemado y las células dérmicas y epidérmicas aisladas se cultivan por separado, y en el que la matriz inoculada se incuba en condiciones tales para formar un dispositivo de piel cultivada en el plazo de un mes después de la inoculación de las células.

21. El procedimiento de la reivindicación 20, en el que las células dérmicas se seleccionan del grupo constituido por fibroblastos, células endoteliales, inmunocitos dérmicos, células nerviosas, miocitos, células madre dérmicas y sus combinaciones, y las células epidérmicas se seleccionan del grupo constituido por queratinocitos, melanocitos, inmunocitos epidérmicos, células madre epidérmicas y sus combinaciones, con la condición de que las células madre no sean células embrionarias humanas.

22. El procedimiento de la reivindicación 10, en el que dicha matriz se deshidrata para formar una matriz reticulada antes de la inoculación de las células dérmicas cultivadas.

23. Un dispositivo de piel cultivado preparado mediante el procedimiento de la reivindicación 10, en el que el procedimiento además comprende aislar al menos un tipo de célula dérmica y al menos un tipo de célula epidérmica de la piel, cultivar por separado las células dérmicas y epidérmicas aisladas, proporcionar las células dérmicas cultivadas a la matriz de ingeniería acelular, reticulada entrecruzada y biocompatible e incubar en medio Eagle modificado de Dulbecco que contiene cloruro de estroncio (0,01 mM a 100 mM); ácido linoleico/BSA (0,02 \mug/ml a 200 \mug/ml); insulina (0,5 \mug/ml a 500 \mug/ml), triyodotironina (0,2 pM a 2000 pM); hidrocortisona (0,005 \mug/ml a 50 \mug/ml); una combinación de penicilina (100 U/ml), estreptomicina (100 \mug/ml), anfotericina (0,25 \mug/ml); y ácido ascórbico-2-fosfato (0,001 mM a 10 mM), progesterona (0,1 nM a 1000 nM) y factor de crecimiento epidérmico (0,01 ng/ml a 100 ng/ml) durante aproximadamente 24 horas, y, después, proporcionar las células epidérmicas cultivadas sobre la capa de laminación de células dérmicas cultivadas para formar el dispositivo de piel cultivada.

24. El procedimiento de la reivindicación 10, en el que el fluido que contiene colágeno comprende un co-precipitado de colágeno e hidrato de carbono.