EA028141B1 - Способ получения биодеградируемых биосовместимых тканеинженерных листов с использованием культивированных фибробластов - Google Patents

Abstract

Изобретение может быть использовано как самостоятельно, так и в комплексном хирургическом лечении больных с глубокими ожоговыми ранами, обширными посттравматическими раневыми дефектами кожного покрова и мягких тканей, с остеомиелитом различного генеза, сопровождающегося дефектом мягких тканей, а также длительно незаживающих трофических язв. Технической задачей изобретения является разработка способа получения тканеинженерных листов, представляющих собой двухслойную биоинженерную конструкцию, которая содержит подложку из биодеградируемого матрикса, состоящего из натуральных полисахаридов - хитозана и пектина с добавлением антиоксиданта дигидрокверцетина, и выполняющую механическую и поддерживающую функцию. Второй слой, сформированный из клеток кожи - фибробластов, является искусственным аналогом дермального слоя кожи и снижает риск формирования грубой рубцовой ткани. Клеточный материал, представляющий собой суспензию живых культивированных фибробластов в количестве 50×10клеток на 1 смв питательной среде без добавления ксеногенной сыворотки, наносится на поверхность подложки в виде суспензии и адгезируется на поверхности матрикса центрифугированием при 200G (1500 об/мин) в течение 5-8 мин, т.е. клетки не культивируются. В качестве аллогенного материала рекомендуется использование штамма диплоидных фибробластов человека ФЭЧ 2/09 (инновационный патент № 25091 от 15.12.2011), либо другой охарактеризованной культуры клеток кожи, либо аутологичных клеток, полученных от самого пациента. Конструктивные особенности исполнения трансплантата обеспечивают его наиболее благоприятное прилегание к зоне дефекта и исключают возможность травмирования под- и прилежащих тканей, а высокая сорбирующая способность и оптимальный срок рассасывания препятствуют формированию воспалительных инфильтратов и нагноению раны. Достоверность полученных результатов подтверждена клинически. Эффективность применения тканеинженерных листов с адгезированными фибробластами проявляется за счет неспецифической стимуляции репарации эпителия, в основном, за счет выделения клетками в раневую поверхность факторов роста, цитокинов и молекул межклеточного матрикса, ускоряющих заживление, и подложки, оказывающей иммуномодулирующее действие. Предложенный способ обеспечивает увеличение полноты приживления аутотрансплантатов, ускорение эпителизации ячеек перфорации и уменьшение сроков восстановления как основной, так и донорской раневых поверхностей.

Description

Изобретение относится к биотехнологии и медицине, а именно к биомедицинским клеточным технологиям и тканеинженерным конструкциям, и может быть использовано при лечении больных с глубокими ожоговыми ранами, обширными посттравматическими раневыми дефектами, сопровождающимися дефектом мягких тканей, больных с остеомиелитом различного генеза, а также больных с длительно незаживающими трофическими язвами.

Регенерация тканей является одной из актуальных задач современной медицины. Один из аспектов - это регенерация ожоговых травм. Ожоговый травматизм является важной медицинской и социальной проблемой. Из 18-20 тысяч пострадавших, госпитализируемых в лечебные учреждения РК, погибают ежегодно от 2,3 до 3,5%. При этом 85-90% - это люди трудоспособного возраста и дети (Основные показатели травматолого-ортопедической службы в Республике Казахстан в 2012 г.: статистический сборник.- Астана, 2013, с. 54).

Тяжесть течения и продолжительность лечения пострадавших от глубоких и обширных термических травм в современных техногенных условиях, когда аутотрансплантаты не могут использоваться для замены поврежденной кожи, зачастую приводят к увеличению риска летальности, длительному сроку пребывания в стационаре (от 1,5 до 6 месяцев) и увеличению расходов на выздоровление больного. Поэтому такие задачи, как разработка новых покрытий, заменяющих кожу, либо ускоряющих эпителизацию пересаженных лоскутов при аутотрансплантации являются весьма востребованными. В решении этой проблемы перспективным направлением является применение биоинженерных конструкций (тканеинженерных или 3-Ό конструкций) и культивируемых ίη νίΐτο клеток кожи, использование культивированных фибробластов и др. методы.

Тканевая инженерия предполагает реконструкцию жизнеспособной ткани с использованием аллогенных или аутологичных клеток мезенхимального происхождения, посаженных на носитель - биоматрикс. Основные требования к биосовместимой матрице - биодеградируемость, достаточная механическая прочность, отсутствие цитотоксичности, хорошая адгезия, способность поддерживать восстановление раны и пролиферацию клеток на ее поверхности, отсутствие местного воспалительного ответа на материал и иммунной реакции всего организма. Кроме того, биоматериал для восстановления кожи должен облегчать боль, снижать потерю влаги и тепла, и защищать рану от инфекции.

В настоящее время для восстановления дефектов кожи имеются биоинженерные графты с использованием кератиноцитов и фибробластов человека для лечения ожогов и трофических язв. Фибробласты вырабатывают различные факторы роста, компоненты внеклеточного матрикса: ламинин, тенасцин, нидоген, хондроитин-4-сульфат, протеогликан, коллаген 1, 2, 3 и 4 типов. Сочетание всех этих факторов ускоряет процесс регенерации, вызывая рост грануляционной ткани и появление краевой и островковой эпителизации, и способствует заживлению ран различной этиологии. Фибробласты с диплоидным набором хромосом имеют ограниченный срок жизни (40-55 пассажей), легко культивируются, сохраняя стабильные свойства, и частично утрачивая антигены гистосовместимости.

В настоящее время известны различные способы получения тканеинженерных заменителей для восстановления кожного покрова. Одна из первых таких конструкций была предложена в 1983 году и представляла собой желеобразный эквивалент кожи, состоящий из коллагеновой матрицы, плазмы и фибробластов кожи, на поверхности которого выращивали кератиноциты [Ве11 Е., 8кег 8., Ни11 В. с1 а1. Тке тесопкШийоп οί 1ίνίη§ 8кш//Т 1пуе8к ОегтаФк - 1983, νο1. 81, N 1. - зирр. - Р. 2-10]. Такой способ получения дермального эквивалента оказался недостаточно эффективным, так как в результате функционирования фибробластов его площадь значительно уменьшается, иногда в 5 раз из-за контракции геля, что не позволяет получать большие по площади клеточные трансплантаты, в связи с чем данный способ имеет ограниченное применение.

Другой препарат ТгащсуЮ® (США), синтезирующий биоактивные молекулы (коллаген I типа, фибронектин, гликозаминогликаны), выполняет барьерную функцию и защищает от вторичного инфицирования, снижает боль и относится к временным заменителям кожи, на основе этого препарата проведено большое количество различных исследований ЩоотбепЬоз 1, Эоге С, НапзЬгоидк 1. Р. 8аГе1у апб еГПсасу оГ ТгапсуЮ Гог 1ке 1геа1теп1 оГ рагПа1-11йскпе55 Ьигп8//1оигпа1 оГ Вит Саге апб РекаЪПкаОоп. -1999, νο1. 20. -Р. 245-281; 8тйк & №рке\у Ш-ТРАЖСУТЕ* Вю1ескпо1оду-1Шр://\уоипб.5пШк-перке\у.сот; Ьик18к ТР., Еюке1Ьегдег М.Р., №утап Κ.Ό. еΐ а1., 2001; 1окп§оп Р.А., Скауапи К.Е., №утап Κ.Ό., 2002; Китаг Р.Т, КттЬ1е Р.М., Вοοΐ8 Р., Редд 8.Р., 2004; Аташ Н., Ооидкейу А.Р., В1оте-ЕЬегуеш 8., 2006; Тепепкаиз М, Вкау^аг Ό., РеппекатрГГ Н., 2007; Ркат С, Огеепуооб 1., С1е1апб Н. еΐ а1., 2007). Препарат представляет собой двухслойную модель заменителя кожи и состоит из синтетической основы (внешний слой - силикон, внутренний слой - нейлон) и посаженных во внутреннем слое неонатальных фибробластов.

Другой способ получения биоинженерной конструкции вылился в коммерциализованный продукт ОегтадгаП®. который является криоконсервированным заменителем кожи, и состоит из аллогенных фибробластов человека, белков экстрацеллюлярного матрикса и биоабсорбируемой подложки (8тйк & №рке\у и8-ОЕРМАОРАРТ* О|аЪе1е5/Т|55не Епдк1ееппд-1Шр://\у\у\у.бегтадгаП.сот; Оеп1/ко\у О. Ό, 1уа8акг 8. Ό, Негзкоп К. 8. Изе оГ Пегтадгай, а сикигеб китап бегт® Ф 1геа1 б!аЪекс Ι^ΐ н1сег5//О|аЪе1е5

- 1 028141

Саге. -1996, νοί. 19, Ρ. 350-354).

В США ΡΏΆ лицензирован и разрешен к применению в клинической практике тканевой комплекс АрНдтаТ, состоящий из биодеградируемой коллагеновой матрицы, аллогенных донорских кератиноцитов и фибробластов (Вгет Н. апб Киъпег К. Ике оТ Огайзкт (АрНдгаТ®) ίη 1Не 1геа1теп1 оТ рге88иге и1еег8 апб асШе \уоипб8/ЛУоипб8. 2000, νοί. 12 (5§ирр1 А): 72А-77А).

Существенным недостатком этих комплексов является их высокая стоимость, а также необходимость соблюдения температурного режима при транспортировке на дальние расстояния (-70°С). Кроме того, недостаток Тгап8су1е - это синтетическая основа препарата, не пригодная для пролиферации и функциональной активности клеток; а ЭегтадгаП не может быть использован для хронических язв, с признаками клинических инфекций и свищевых ходов и на ранах, в которых проходят сухожилия, мышцы, суставные капсулы или кости.

Предложен способ получения биоинженерной конструкции, содержащей в качестве подложкиносителя желатин, коллагены различных типов и деминерализованный костный матрикс. Матрицаноситель применяется в виде геля, пленки и трехмерной конструкции, соответствующей дефекту соединительной ткани (Трансплантат для восстановления дефектов соединительной ткани и способ его получения (КИ 2330675). Конструкция может содержать мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки костного мозга или жировой ткани, либо фибробласты, которые получают при помощи липоаспирации или биопсии кожи и слизистой оболочки. Различные тканеинженерные конструкции, а также способы их получения и применения за последние несколько лет описаны, и в следующих патентах: И8 8114670, И8 8043614, КИ 2464987, КИ 2461622, КИ 2342164.

Слабой стороной данных способов является 2-3 этапная процедура получения (с 12-48 ч культивированием клеток) и удорожание из-за необходимости добавления матриксных белков и факторов роста, дорогостоящие основы для матриц и многократное нанесение на рану некоторых из них.

Известно, что хитин и хитозан являются биосовместимыми и биодеградируемыми натуральными полисахаридами, что позволяет использовать их в различных областях медицины (Хитин и хитозан. Получение, свойства и применение//Под ред. акад. РАСХН К.Г.Скрябина. - 2002, с. 365). Особенно широкое распространение получили способы получения и применения хитозановых материалов в виде пластичных пористых губок и гидрогелей для местного лечения ран и ожогов, в раневой хирургии (Никонов Б.А., Панов В.В., Парамонов Б.А., Вербицкая Н.Б., Антонов С.Ф., Золина Н.Н. Антибактериальные свойства губок на хитозан-коллагеновой основе. Современные перспективы в исследовании хитина и хитозана. Матер. VII международной коференции. - Спб: ВНИРО, 2003, с. 181-183; Панов В.В., Парамонов Б.А., Никонов Б.А., Золина Н.Н., Антонов С.Ф. Опыт применения хитозан-коллагеновых губок при лечении огнестрельных ран мягких тканей. Современные перспективы в исследовании хитина и хитозана. Матер. VII международной кон ференции. - Спб: ВНИРО, 2003, с. 185-186; Вегдег I., Ке181 М., Мауег Ι.Μ., Ре11 О., Оиту К. §1гис1иге апб БИегасОощ ш СЬИокап Нубгоде18 Рогтеб Бу Сотр1ехаОоп ог Аддгедайоп Тог Вютебюа1 Арр1юа1юп8.//Еиг. I. РНагт. ВюрНагт. - 2004, ν. 57, - р. 35-52).

Общими свойствами биосовместимых материалов из полисахаридов, в том числе хитозана, являются их гидрофильность, обеспечивающая высокую адсорбционную способность, хорошая адгезия к ране, отсутствие токсичности и раздражающего действия, а также гемостатические свойства. Выявлено, что их присутствие способствует более быстрому развитию грануляционной ткани и ускорению эпителизации и благоприятно сказывается на процессах регенерации на всех стадиях лечения ран и ожогов.

Известно, что покрытия из хитозана воздухо- и паропроницаемы, препятствуют инвазии микроорганизмов, создают оптимальный микроклимат в ране, способствуют пролиферации клеток в ране. Хитозан, помимо активации роста на ранних этапах раневого процесса, необходим на завершающей стадии заживления - перестройке рубца. Его присутствие в ране помогает избежать образования грубых рубцов [патент \УО 2012091636 А2]. Однако основной проблемой получения покрытий из природных полисахаридов является достижение хорошей механической прочности покрытия и устойчивости на ране. Разработка биодеградируемых покрытий с высокой сорбирующей способностью и различными сроками рассасывания является в настоящее время наиболее актуальным направлением в области создания эффективных биологических повязок для лечения ран.

Среди хитозан-содержащих комплексов можно назвать нетканые раневые (губчатые) покрытия на основе коллаген-хитозанового комплекса: Коллахит-Г, Коллахит-Ш, Коллахит-ФА (Россия) [Биологическая композиция для лечения ран Коллахит, КИ 2108114]. Композиция, описанная в патенте США (И8 6896902, 24.05.2005), применяется для лечения кожных ран, а также при профилактике и лечении маститов у животных после растворения в воде.

Основными недостатками этих комплексов являются: применение воды высокой степени очистки для получения готовой к использованию суспензии хитозана; вероятность ошибочной дозировки, поскольку препарат растворяется в воде непосредственно потребителем; неустойчивость композиции (в патенте США) к влаге и необходимость доведения рН получаемого раствора хитозана до нужных значений. Следовательно, предъявляются дополнительные требования к транспортировке и хранению препарата и наличию высококвалифицированного персонала.

Известен способ получения средства, содержащего клетки и биополимерный носитель в виде кол- 2 028141 лаген-хитозановой пленки, или крошки коллаген-хитозановой пленки, или в виде высокополимерного геля, состоящего из 5%-ного раствора макрогола-1500. В качестве клеток использованы клетки диплоидного штамма легкого человека ФЭЧ 16-1 или клетки диплоидного штамма кожно-мышечной ткани человека ФЭЧ 16-2 в концентрации 2,0-3,0х 10⁵ на 1 см² на носителе в виде пленки или крошки или 1,0х 10⁶ на 1 мл на носителе в виде 5%-ного раствора макрогола в форме высокополимерного геля (Средство для заместительной клеточной терапии, КИ 2342163). Недостатком данного способа является то, что полиэтиленгликоль (макрогол) может оказать аллергическое воздействие на организм человека.

Наиболее близкими аналогами предлагаемого изобретения является способ получения дермального раневого покрытия на основе нейтрализованной коллаген-хитозановой губки с посаженными на нее дермальными фибробластами человека, которые используют на первом пассаже (международная заявка № \УО 00/16817, МПК А61Ь 15/28, опубликована 30.03.2000) и клеточный имплантат для восстановления дефектов кожного покрова (изобретение № 106528, МПК7 А61Р2/10), выполненный в виде живого эквивалента кожи. Он состоит из подложки из биосовместимого биополимера, представляющего собой: либо коллагеновый гель, либо коллагеновую губку или коллаген-хитозановую губку, в структуру которого включена эмульсия перфторуглеродов. Внутри подложки биоматрикса распределяют аллогенные мезенхимальные клетки человека. Сверху подложка покрыта слоем эпидермальных кератиноцитов, выделенных из биоптатов кожи, полученных в результате косметологических операций.

К недостаткам данных покрытий можно отнести их губчатое строение. Губка (как и гель) имеет большую сорбционную емкость, и оставшаяся в ней сыворотка, используемая для культивирования клеток, несет угрозу инфицирования и аллергических реакций. Кроме того, для приготовления готовых форм используют нестандартный материал -первичную культуру дермальных фибробластов первого пассажа и эпидермальных кератиноцитов, которые не тестируются на генетическую, микробиологическую и онкогенную безопасность. К тому же, имеются данные о том, что коллаген из коллагенсодержащих подложек стимулирует усиление синтеза собственного коллагена организма при большой площади обнаженной дермы. В результате образуется гипертрофический келлоидный рубец.

Задача, на решение которой направлено заявленное техническое решение заключается в расширении арсенала средств для регенерации кожного покрова при обширных посттравматических раневых повреждениях, при остеомиелитах различного генеза, сопровождающихся дефектом мягких тканей, при длительно незаживающих трофических язвах, и получении тканеинженерных листов (конструктов) с использованием аллогенных фибробластов, протестированных ранее на биологическую безопасность, либо аутологичных фибробластов.

Данная задача достигается за счет того, что тканеинженерный лист содержит подложку биоматрикса, выполненную согласно способу создания композиции биоразлагаемых пленок, содержащих пектин, хитозан, воду, однонормальную соляную кислоту, пластификатор - глицерин и структурообразователь трехпроцентный раствор метилцеллюлозы (КИ 2458077) и введения в данный состав 1-5 μΜ/мл известного антиоксиданта дигидрокверцетина. На поверхности биоматрикса распределяют клетки кожи человека. В качестве клеточного человека используют дермальные фибробласты, с концентрацией клеток не менее чем 0,5х 10 /см подложки.

Техническим результатом, обеспечиваемым приведенной совокупностью признаков, является улучшенное качество лечения, ускорение заживления кожных дефектов, уменьшение сроков восстановления как основной, так и донорской раневых поверхностей, полноценное восстановление всех слоев кожи за счет пролиферации клеток и выработки ими различных факторов роста, цитокинов и компонентов внеклеточного матрикса.

Изобретение имеет следующие отличия от прототипа:

для получения подложки биоматрикса используется 0,2 Н уксусная кислота, что предоставляет возможность регулировать рН формовочного раствора на этапе изготовления пленки. Как известно, именно уровень рН покрытия позволяет достигнуть оптимальных физиологических условий для прикрепления клеток и процесса регенерации. Кроме того, в состав композиции добавляется 1-5 μΜ/мл дигидрокверцетина;

подложка после высыхания обрабатывается 0,05% раствором бикарбоната натрия для стабилизации рН и облучается ультрафиолетом для стерилизации;

используется культура клеток кожи человека. В качестве клеточного материала можно использовать, охарактеризованные на биологическую безопасность согласно требованиям ВОЗ и хранящиеся в условиях жидкого азота, аллогенные фибробласты либо аутологичные фибробласты самого пациента;

и основное отличие от всех других тканеинженерных конструкций - клетки не нужно культивировать в течение 3-5 суток. Клетки фиксируются на поверхности биодеградируемого хитозан-пектинового листа центрифугированием при 200 С в течение 5-8 мин. Благодаря этому возможна более быстрая подготовка тканеинженерного покрытия (биоматрикс может быть заготовлен заранее и храниться при комнатной температуре) с адгезированными на нем аллофибробластами, что весьма важно при обширных и глубоких повреждениях кожи и недостатке донорского материала для аутодермопластики.

Использование изобретения из тканеинженерного листа, содержащего клетки в стадии активного

- 3 028141 роста и обладающего длительным стимулирующим действием на миграцию и пролиферацию собственных клеток пациента, приводит к уменьшению площади раневой поверхности и сокращению сроков заживления.

Выделяемые аллофибробластами в раневую поверхность, факторы роста, цитокины и молекулы межклеточного матрикса стимулируют формирование грануляционной ткани и эпителизацию раневой поверхности. Бактерицидные свойства хитозана препятствуют повторному инфицированию поврежденных тканей, обеспечивая защиту от внешнего воздействия, а хорошая адгезия тканеинженерного листа на раневой поверхности обеспечивает оптимальную влажную микросреду для регенерации и предупреждает травмирование новообразованного эпителия. Еще одним достоинством является биодеградируемость конструкции, т.е. по мере заживления раны нет необходимости убирать подложку с клетками с поверхности кожи. Помимо всего вышеперечисленного, преимущество данного тканеинженерного листа - это неоспоримое удобство применения для хирургов как на разных площадях, так и на различного рельефа раневых поверхностях.

Все это позволит уменьшить потребность частоты проведения перевязок, сократить сроки лечения, повысить качество лечения кожных дефектов различной этиологии и тяжести, снизить риски осложнения за счет устранения нежелательных явлений инфицирования в поврежденных тканях и обеспечения оптимальной микросреды для регенерации.

Оценка скорости заживления раневого дефекта проводилась по следующим показателям: средняя скорость уменьшения раневой поверхности в см² за сутки (эпителизация) и уменьшение площади раны в процентах за сутки. Начиная с фазы воспаления, происходило ускорение репаративных процессов в ране за счет сокращения сроков ее очищения с последующим заполнением раневого дефекта грануляционной тканью, более ранним началом эпителизации краев в фазах регенерации и эпителизации, ведя к сокращению заживления ран и сроков полной эпителизации, в среднем в 2 раза.

Указанные отличительные признаки являются существенными и взаимосвязаны с образованием устойчивой совокупности существенных признаков, достаточной для получения требуемого технического результата.

Предлагаемое изобретение способно сохранять при использовании жизнеспособность в течение 24 ч заданную структуру (послойность), свойства и функции присущие каждому компоненту тканеинженерной конструкции.

Сравнение предлагаемого способа получения тканеинженерного листа для восстановления дефектов мягких тканей с другими тканеинженерными конструкциями, известными в области медицины, показало его соответствие критериям изобретение.

При анализе уровня техники заявителем не выявлены технические решения, относящиеся к тканеинженерным конструкциям для восстановления дефектов кожного покрова, которым присущи все существенные признаки заявленного изобретения, что свидетельствует о соответствии критерию новизна.

Изобретение подготавливают и используют следующим образом.

Пример 1.

Для получения биоразлагаемого подложки растворяли 10 мг яблочного пектина (81дта) в 2 мл дистиллированной воды. Затем 10 мг хитозана (фирма Зщша-ЛИпек) растворяли в 2 мл 0,2 Н уксусной кислоты. Для лучшего растворения растворы помещали в термостат (37-38°С). Далее сливали полученные растворы пектина и хитозана. Во время сливания раствора пектина с равным объемом раствора хитозана происходит образование сгустков на границе контакта двух жидкостей. Для того чтобы пленка была прочной и равномерно отделялась от подложки, после перемешивания сгустков в полученный раствор добавляли пластификатор (глицерин) и структурообразователь (3% раствора метилцеллюлозы). Затем вносили дигидрокверцетин в конечной концентрации 1-5 мкМ/мл. Пленку формировали (в чашке Петри) в течение 20-24 ч при температуре 20-25°С. После высыхания полученные пленки облучали ультрафиолетом по 30-50 мин с каждой стороны, затем выдерживали в 0,05% стерильном растворе бикарбоната натрия в течение 15-20 мин, после чего помещали в бессывороточную питательную среду.

Пример 2.

Для получения тканеинженерного листа клетки культивируют при температуре 37°С в атмосфере 5% СО₂ в питательной среде ДМЕМ (§1§та США) с добавлением 10% фетальной сыворотки крупного рогатого скота (Зщша США) в течение 3-4 суток. Из матрасов с выросшим монослоем (90-95% поверхности) удаляют питательную среду ДМЕМ, вносят в них подогретую до 37°С смесь раствора Версена (0,02%) и трипсина (0,25%) в соотношении 1:1 в количестве, необходимом чтобы покрыть весь клеточный монослой и помещают в термостат при 37°С на 3-5 мин. После округления клеток в результате действия трипсин-Версена их разбавляют необходимым количеством среды ДМЕМ и слегка пипетируют для перевода клеток в суспензию. Оптимальная плотность для посадки на подложку 4,0-5,0х10⁴ клеток/см² Клетки в асептических условиях наслаивают на поверхность подложки, находящейся в чашке Петри и затем проводят центрифугирование чашки Петри при 200 О в течение 5-8 мин, для того чтобы усилить адгезию клеток к поверхности подложки. Полученный тканеинженерный лист, с живыми прокультивированными ранее клетками, в одноразовой пластиковой чашке Петри упаковывают поштучно в стерильный индивидуальный пакет из полимерной пленки, запаивают. Пакет помещают в коробку с ука- 4 028141 занием Верх.

Пример 3.

Одним из известных способов подготавливают рану к имплантации: проводят санацию и туалет раны. Непосредственно перед имплантацией рану обрабатывают физиологическим раствором и осушают стерильными салфетками. Затем производят закрытие кожного дефекта путем нанесения перфорированного аутотрансплантата на раневую поверхность, поверх которого накладывают тканеинженерный лист клетками вниз к ране (вниз головой).

Сверху на имплантат накладывают стерильную марлевую салфетку с теплым физиологическим раствором и проводят бинтование (можно и не бинтовать). Поскольку тканеинженерный лист прозрачный, через него видна поверхность раны. Первую перевязку осуществляют на 4-5-е сутки после имплантации, при этом нет необходимости удалять биоматрикс, по мере образования неоэпителия, он постепенно растворяется в ране. Последующие перевязки при отсутствии признаков воспаления производят через каждые 4-5 суток. На небольших участках не проводили бинтование и поверхность оставалась только с тканеинженерным листом, через которую наблюдали за процессом заживления.

Пример 4 (клинический пример 1).

Больной И., 32 г., поступил в клинику с диагнозом: Последствия перенесенной травмы. Длительно незаживающая рана правой стопы и правого голеностопного сустава.

При поступлении в клинику имел последствия закрытого перелома лодыжки правой голени со смещением, ушибленно - рваные раны правой голени и стопы.

Микрофлора была представлена в виде ЗГсрИспшбй 3х10⁵ в монокультуре. При поступлении в стационар больному проводилась антибиотикотерапия, проведена химическая некрэктомия ран, после подготовки ран проведена свободная аутодермопластика расщепленными кожными аутотрансплантатами с применением суспензии аллофибробластов и тканеинженерного листа с префиксированными центрифугированием аллофибробластами.

Во время первой перевязки, через 1 сутки, отмечена краевая эпителизация, на поверхности ран видна нежная блестящая пленка, свидетельствующая об образовании неоэпителия, бинты не прилипают к ране, что весьма актуально при больших и глубоких ранах. На последующих перевязках отмечалась выраженная краевая эпителизация и прогрессивное уменьшение дефекта в размерах. На 11 сутки раны эпителизировались полностью и больной выписан из клиники.

Пример 5 (Клинический пример 2).

Больная М., 37 лет, поступила в клинику с диагнозом: Обширный некроз мягких тканей. Срастающийся перелом обеих костей левой голени (аппарат Илизарова). Хронический остеомиелит левой голени.

Травма получена в результате ДТП за 7 недель до поступления клинику, когда была произведена операция ЧДКО аппаратом Илизарова. В области спиц дистального кольца аппарата имелись признаки воспаления. При поступлении - по наружной поверхности левой голени очаг некроза 12,0x6,5 см, с о серозно-гнойным отделяемым. Микрофлора была представлена в виде антибиотикорезистентной бактерии 81арй. аигеик 10⁸ коЕ. На 12 сутки стационарного лечения, после перехода во 2 фазу раневого процесса произведена операция свободная аутодермопластика гранулирующей раны левой голени с применением суспензии аллофибробластов. Затем поверх пересаженных аутотрансплантатов были помещены тканеинженерные листы с аллогенными фибробластами, которые были подготовлены за 3 ч до операции. На 5 сутки после имплантации отмечается выраженная краевая эпителизация, значительное уменьшение количества отделяемого. На 6 сутки после операции произведен домонтаж аппарата Илизарова. На последующих перевязках отмечалась выраженная краевая эпителизация и прогрессивное уменьшение дефекта в размерах. Больная выписана на 12 сутки после полного приживления трансплантатов и эпителизации донорских ран.

Аналогичные положительные результаты получены при использовании тканеинженерных листов в лечении еще 7 больных с ожоговыми различной глубины и площади, рваными скальпированными и проникающими и длительно незаживающими ранами.

Полученные данные свидетельствуют о возможности и перспективности использования тканеинженерных конструктов с фибробластами кожи человека в качестве временных покрытий для дефектов кожи и мягких тканей различной этиологии и тяжести для повышения качества и скорости заживления ран, наряду с уменьшением продолжительности и степени выраженности воспалительных и инфекционных осложнений. Изобретение для восстановления раневой поверхности позволило добиться хороших косметических и функциональных результатов.

Claims (1)

1. Способ получения тканеинженерных листов, включающий получение биодеградируемой подложки и нанесение на ее поверхность живых клеток кожи - фибробластов в стадии активного роста, отличающийся тем, что для приготовления биодеградируемой подложки используют антиоксидант дигидрокверцетин совместно с натуральными полисахаридами - хитозаном и пектином, после высушивания подложку облучают ультрафиолетом для ее стерилизации, затем на ее поверхности адгезируют культивирован- 5 028141 ные фибробласты центрифугированием при 200 С в течение 5-8 мин.