JP4214434B2 - 培養皮膚、その製造方法及び用途 - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、医薬品、化粧品の代謝試験、特に薬物の皮膚透過性を評価する試験に適した培養皮膚、その製造方法ならびにその用途に関する。
【０００２】
【従来の技術】
近年、薬物療法の進歩と共にその投与形態の最適化ということが広く認識されるようになった。この流れに乗り、古来から局所おける薬物療法の為に用いられてきた経皮適用製剤も皮膚から薬物を吸収させることにより全身循環系へ薬物を伝達させる投与形態、すなわち経皮治療システムが見直されてきた。その為、経皮吸収作用あるいは経皮吸収促進作用を有する種々の薬剤が盛んに開発されている。
【０００３】
従来、このような経皮吸収作用を評価する方法、経皮吸収試験にはヒト皮膚やラット・ブタ・ヘビ等の実験動物の皮膚が用いられてきた。しかし、ヒト皮膚の使用には倫理的な問題があり、また実験動物については実験結果のヒトへの外挿や多くの動物を犠牲にしなければならないといった欠点を有している。このような問題を解決する方法として人工膜の使用が試みられているが、経皮吸収促進性を評価したり、低分子から高分子の薬剤に至るまで正確に予測したりすることが可能なまでには至っていない。
【０００４】
一方、細胞培養技術の進歩に伴い、培養細胞を用いてヒト皮膚と形態的・生化学的に近似した培養皮膚を作製することが可能になっている。例えば、繊維芽細胞をコラーゲンゲル内で培養し、ゲルが収縮した後に、そのゲルの上に表皮角化細胞を播種、培養したもの（米国特許明細書４４８５０９６号）、やナイロンメッシュに繊維芽細胞を播種、培養してメッシュ空孔が繊維芽細胞の分泌物により埋まった時点でその上に表皮角化細胞を播種、培養したもの（Slivka,S.R.et al. J.Invest.Dermatol. 第９６巻、第５４４Ａ項，１９９１）、あるいはコラーゲンスポンジに繊維芽細胞を播種、培養した後、フィルム状のコラーゲンスポンジを重ね、さらに表皮角化細胞を播種、培養したもの（特開平６−２９２５５６８号公報）などが報告されている。これらは、皮膚毒性評価や皮膚代謝試験の動物実験代替法として、あるいは移植材として使用されてきた。
【０００５】
上記のような培養皮膚は、形態的・生化学的にヒト皮膚に近似したものであるから、これを経皮吸収に使用すれば、種差の問題や人工膜での問題を解決することができるものと期待される。しかしながら、上記培養皮膚はいずれも皮膚バリア機能がヒト皮膚に比べ完全ではなく、経皮吸収試験に一般に使われるラット皮膚よりも水透過性が高い（Cut Ocular Toxcol. 第１２巻、第１８３項、１９９３；J.Invest.Dermatol. 第１００巻、第４０項、１９９３）。そのため、経皮吸収試験に使用する場合は問題がある。そこで、バリア機能を改善する為、種々培養条件の検討がなされたが、未だヒト皮膚の透過性を再現するに至っていない（J.Invest.Dermatol. 第１０９巻、第３４８項、１９９７）。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、かかる従来からの問題点を解消すべく皮膚透過性を改善した培養皮膚、その製造方法及び用途を提供することを課題とする。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、上記課題を解決するため鋭意検討を行った結果、血清、アスコルビン酸・ビタミン類・ホルモン類を含む培地、特にアスコルビン酸を含む培地で培養することにより、製造される培養皮膚が従来のものと比べてバリア機能が改善されることを見出し、本発明を完成するに至った。すなわち、本発明は、バリア機能が改善された培養皮膚、その製造方法及びその用途に関するものである。
【０００８】
本発明は、以下のような構成からなる。
（１）水透過係数が２０〜２５℃の条件下で１０×１０-3ｃｍ／ｈ以下である表皮角化細胞培養物を含むことを特徴とする培養皮膚。
（２）アスコルビン酸を含む培地中で培養することにより製造される（１）の培養皮膚。
（３）アスコルビン酸、血清、ビタミン類及びホルモン類を含む培地で培養することにより製造される（１）または（２）の培養皮膚。
（４）アスコルビン酸及び血清を含み、ビタミン類としてビオチン、コリン、パントテン酸、トコフェロール及びカルニチンを含み、ホルモン類としてグルココルチコイド、エストロジェン及びカテコールアミンを含む培地にて培養することにより製造される（１）〜（３）のいずれかの培養皮膚。
（５）アスコルビン酸及び血清を含み、ビタミン類としてビオチン、コリン、パントテン酸、トコフェロール及びカルニチンを含み、ホルモン類としてデキサメタゾン、プロゲステロン及びイソプロテレノールを含む培地で培養することにより製造される（１）〜（３）のいずれかの培養皮膚。
（６）アスコルビン酸及び血清を含み、ビタミン類としてビオチン、コリン、パントテン酸、トコフェロール及びカルニチンを含み、ホルモン類としてデキサメタゾン、プロゲステロン及びイソプロテレノールを含む培地で培養する工程を含む（１）の培養皮膚の製造方法。
（７）（１）〜（５）のいずれかの培養皮膚を用いることを特徴とする薬物の皮膚透過性を評価する方法。
【０００９】
【発明の実施の形態】
本発明における培養皮膚は、構成要素として表皮角化細胞培養物を含むものである。該表皮角化細胞としては、ヒト包皮表皮角化細胞、ヒト乳房表皮角化細胞、ヒト足裏表皮角化細胞等が例示される。このような培養皮膚は、動物の皮膚より分離培養した表皮角化細胞を適当な支持体に播種、培養し、多層化したシート状の表皮層を形成させることにより作製される。
【００１０】
表皮角化細胞を播種する該支持体としては、コラーゲンやコンドロイチン硫酸などの生体親和性高分子のゲルやスポンジ、あるいはそれらに繊維芽細胞を播種、内封したものなどが挙げられる。また、ベルらの開発した人工皮膚では支持体として、繊維芽細胞とコラーゲン溶液の混合液をゲル化させたものを用いているが（米国特許明細書第４４８５０９６号）、本発明においても、これを支持体として用いることにより、好適に培養皮膚を作製することができる。
【００１１】
本発明により作製された培養皮膚は１０×１０-3ｃｍ／ｈ以下、好ましくは５×１０-3〜１０×１０-3ｃｍ／ｈの水透過速度を有しており、これは経皮吸収試験において従来使用されていたラット皮とほぼ同等の値である。よって、本発明における培養皮膚をラット皮に替わって用いることにより、薬物の皮膚透過性を評価することができる。
【００１２】
例えば、２つの円筒形経皮吸収セルで培養皮膚を挟み、ドナー側に評価する薬物を加え、レセプター側にＰＢＳ（Phosphate Bufferred Saline）等の溶液を加える。一定時間後、レセプター側の溶液を採取し、溶液中の薬物濃度を液体クロマトグラフィー等で測定することにより、薬物の皮膚透過性を評価する。
【００１３】
本発明における水透過係数とは、単位濃度差における、単位時間、単位面積当たりの水透過量のことをいうものであり、「皮膚測定とその試験法（フレグランスジャーナル社、１９９３年）に記載されているように、円筒形の経皮吸収セルを用いることにより簡便に測定することができる。例えば、２つの円筒形経皮吸収セルで培養皮膚を挟み、ドナー側にトリチウム水を加え、レセプター側にＰＢＳ等の溶液を加える。一定時間後、レセプター側の溶液を採取し、放射能活性を測定することにより、培養皮膚の水透過性を測定することができる。ただし、測定時の条件として、２０〜２５℃で実施する必要がある。
【００１４】
本発明における培養皮膚の培養とは、例えば支持体上に播種、培養した表皮角化細胞を空気中で露出させた状態で培養するエアーリキッドインターフェイス培養法などが挙げられる。この場合、培地は支持体下に接触して培養物に供給される。この状態で一定期間培養後、多層化したシート状の表皮層を好適に形成することができる。
【００１５】
本発明において、培地とは、細胞の維持・増殖に必要な栄養源及び無機塩類を含んだもので、具体的にはＭＥＭ、ＤＭＥＭ、ＨａｍＦ−１２等の市販の動物細胞培養用培地が挙げられる。なかでも、ＤＭＥＭ／ＨａｍＦ−１２等量混合培地が好適に使用できる。更に、インシュリン（１〜１００μｇ／ｍｌ）、トランスフェリン（１〜１００μｇ／ｍｌ）、亜セレン酸（１〜１００ｎＭ）等をそれぞれの範囲で添加することがより好ましい。
【００１６】
本発明においては、培地中に好ましくはアスコルビン酸を含む。該アスコルビン酸は１〜１０００μｇ／ｍｌ、好ましくは１０〜５００μｇ／ｍｌの濃度で存在させる。
【００１７】
本発明においては、より好ましくは、培地中に血清・ビタミン類・ホルモン類を加える。該血清は市販の仔ウシ血清あるいはウシ新生児血清が好適に使用できる。血清は約０．１〜２０％、好ましくは０．５〜５％の範囲で培地中に存在させる。
【００１８】
本発明において用いられるビタミン類としては、ビオチン、コリン、パントテン酸、トコフェロール、カルニチン等が挙げられる。上記ビタミン類の添加濃度は、ビオチン０．０１〜５０μｇ／ｍｌ、コリン０．０１〜１００ｍＭ、パントテン酸０．１〜５００μＭ、トコフェロール０．０１〜１００μＭ、カルニチン０．１〜５００μＭで存在させるのが好ましく、ビオチン０．１〜５μｇ／ｍｌ、コリン０．１〜５ｍＭ、パントテン酸１〜５０μＭ、トコフェロール０．１〜５μＭ、カルニチン１〜５０μＭで存在させるのがより好ましい。
【００１９】
本発明に含まれるホルモン類とは、グルココルチコイド、エストロジェン、カテコールアミン等を包含する。特に、グルココルチコイドとしてはデキサメタゾン、エストロジェンとしてはプロゲステロン、カテコールアミンとしてはイソプロテレノールが好適に使用できる。上記ホルモンの添加濃度は、デキサメタゾン０．１〜５００ｎＭ、プロゲステロン１〜１０００ｎＭ、イソプロテレノール０．０１〜５０μＭで存在させるのが好ましく、デキサメタゾン１〜５０ｎＭ、プロゲステロン１０〜５００ｎＭ、イソプロテレノール０．１〜５μＭで存在させるのがより好ましい。
【００２０】
【実施例】
次に、本発明を実施例により具体的に説明する。なお、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００２１】
実施例１ 培養皮膚支持体コラーゲンゲルの作製
コラーゲンゲル作製方法はベルらの方法（Bell,E.et al.,Proc. Natl.Acad.Sci.USA. 第７６巻、第１２７４項、１９７９）に準じて行った。オルガノジェネシス社から購入したヒト繊維芽細胞を１０％牛血清含有ＤＭＥＭ培地にて培養し、サブコンフレントに達した後、同培地にて細胞を回収し、繊維芽細胞懸濁液を得た。４℃において、９容量のコラーゲン溶液（オルガノジェネシス社製）に１容量の１０倍濃度のＥＭＥＭ培地（ギブコ社製）を加え、重曹をｐＨが中性付近になるまで攪拌しながら加えた。さらに１０％量の牛血清を加えた後、上記繊維芽細胞懸濁液を最終細胞濃度が２．５×１０4 個／mlになるようゆっくり加え、良く攪拌した。
【００２２】
上記のようにして得られた混合溶液を６穴プレートに入ったトランスウェル（コースター社製）の内側に３ｍｌずつ加え、室温にて１５分間静置してゲル化させた。上記コラーゲンゲルに１０％牛血清含有ＤＭＥＭ培地を静かに添加して、３７℃、１０％ＣＯ2 条件下で５〜７日間培養し、繊維芽細胞の作用によってコラーゲンゲルを収縮させた後、培養皮膚の支持体に供した。
【００２３】
実施例２ 培養皮膚の作製
収縮したコラーゲンゲルの培地を抜き取った後、表皮角化細胞をゲル上に播種した。表皮角化細胞の播種、培養はベルらの方法（Parenteau,N.L.,et al., J.Cellular Biochem. 第４５巻、第２４５項、１９９１）に従い行った。すなわち、オルガノジェネシス社から購入したヒト表皮角化細胞をＣａ不含ＤＭＥＭ：ＨＡＭ Ｆ１２＝３：１を基礎とするEpidemalization 用培地（東洋紡績製）に懸濁し、支持体であるコラーゲンゲルの上に同細胞懸濁液を細胞が０．５×１０5 〜１×１０5 個／ｃｍ2 になるように添加した。次いで、同培地を静かに添加し、３７℃、１０％ＣＯ2 条件下で３〜５日間培養し、表皮角化細胞を充分伸展させた。次に、Ｃａ不含ＤＭＥＭ：ＨＡＭ Ｆ１２＝１：１を基礎とするMaintenance 用培地（東洋紡績製）を、真皮層が培養液下で、かつ表皮角化細胞が空気中に出るよう添加した。
【００２４】
この際、培地中に添加剤として、何も加えなかったコントロール培地（比較例１）、２５μｇ／ｍｌアスコルビン酸、２％ウシ新生児血清（ギブコ社製）を添加した培地（実施例１）、１００μｇ／ｍｌアスコルビン酸、２％ウシ新生児血清（ギブコ社製）、１μｇ／ｍｌビオチン、０．６４ｍＭコリン、１６．８μＭパントテン酸、１μＭトコフェロール、１０μＭカルニチン、１０ｎＭデキサメタゾン、１００ｎＭプロゲステロン、１μＭイソプロテレノールをそれぞれ添加した培地（実施例２）の３種類について検討を行った。培地は１日おきに交換した。
【００２５】
実施例３ 水透過係数の測定
水透過係数の測定は以下の方法により行った。培養皮膚の表皮シート側をドナー側として円筒形の経皮吸収セル（オルガノジェネシス社製）を接着させ１ｍｌトリチウム水を加え、支持体側をレセプター側としてＰＢＳを加えたシャーレ上に置き、２３℃にて６時間静置させた。レセプター側のＰＢＳ中に含まれるトリチウム水濃度を液体シンチレーションカウンターで測定し、水透過係数を算出した。
【００２６】
比較例１のコントロールの培地、実施例１及び実施例２の培地で１５日間培養した培養皮膚について水透過係数を測定した結果、比較例１では２１．３×１０-3ｃｍ／ｈであったのに対し、実施例１では７．９×１０-3ｃｍ／ｈ、実施例２では６．７×１０-3ｃｍ／ｈであった。また、ラット腹部摘出皮膚の水透過係数は５．６×１０-3ｃｍ／ｈであった。このように、実施例では培養皮膚の水透過性がラット皮膚並に改善された。
【００２７】
コントロール培地及び実施例２の培地にて培養した培養皮膚について経日的に水透過係数を測定した結果を図１に示す。その結果、コントロール培地で培養した培養皮膚の水透過係数は約２０〜１５×１０-3ｃｍ／ｈで推移するのに対し、実施例２で培養した培養皮膚の水透過係数は培養１４日目から１０×１０-3ｃｍ／ｈ以下となり約７．５×１０-3ｃｍ／ｈで推移した。
【００２８】
【発明の効果】
上述したように、本発明は、皮膚透過性を改善した培養皮膚を提供することを可能にしたものである。該培養皮膚を従来のラット皮膚と替えて経皮吸収試験に用いることにより、薬剤の皮膚透過性を評価することができる。したがって、使用する実験動物を減らすことができる為、より経済的で、更に種差の問題もなく、再現性の高いデータを得ることができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】コントロール培地及び実施例２の培地で培養した培養皮膚について、経日的に水透過係数を測定した結果を示すグラフである。
【発明の属する技術分野】
本発明は、医薬品、化粧品の代謝試験、特に薬物の皮膚透過性を評価する試験に適した培養皮膚、その製造方法ならびにその用途に関する。
【０００２】
【従来の技術】
近年、薬物療法の進歩と共にその投与形態の最適化ということが広く認識されるようになった。この流れに乗り、古来から局所おける薬物療法の為に用いられてきた経皮適用製剤も皮膚から薬物を吸収させることにより全身循環系へ薬物を伝達させる投与形態、すなわち経皮治療システムが見直されてきた。その為、経皮吸収作用あるいは経皮吸収促進作用を有する種々の薬剤が盛んに開発されている。
【０００３】
従来、このような経皮吸収作用を評価する方法、経皮吸収試験にはヒト皮膚やラット・ブタ・ヘビ等の実験動物の皮膚が用いられてきた。しかし、ヒト皮膚の使用には倫理的な問題があり、また実験動物については実験結果のヒトへの外挿や多くの動物を犠牲にしなければならないといった欠点を有している。このような問題を解決する方法として人工膜の使用が試みられているが、経皮吸収促進性を評価したり、低分子から高分子の薬剤に至るまで正確に予測したりすることが可能なまでには至っていない。
【０００４】
一方、細胞培養技術の進歩に伴い、培養細胞を用いてヒト皮膚と形態的・生化学的に近似した培養皮膚を作製することが可能になっている。例えば、繊維芽細胞をコラーゲンゲル内で培養し、ゲルが収縮した後に、そのゲルの上に表皮角化細胞を播種、培養したもの（米国特許明細書４４８５０９６号）、やナイロンメッシュに繊維芽細胞を播種、培養してメッシュ空孔が繊維芽細胞の分泌物により埋まった時点でその上に表皮角化細胞を播種、培養したもの（Slivka,S.R.et al. J.Invest.Dermatol. 第９６巻、第５４４Ａ項，１９９１）、あるいはコラーゲンスポンジに繊維芽細胞を播種、培養した後、フィルム状のコラーゲンスポンジを重ね、さらに表皮角化細胞を播種、培養したもの（特開平６−２９２５５６８号公報）などが報告されている。これらは、皮膚毒性評価や皮膚代謝試験の動物実験代替法として、あるいは移植材として使用されてきた。
【０００５】
上記のような培養皮膚は、形態的・生化学的にヒト皮膚に近似したものであるから、これを経皮吸収に使用すれば、種差の問題や人工膜での問題を解決することができるものと期待される。しかしながら、上記培養皮膚はいずれも皮膚バリア機能がヒト皮膚に比べ完全ではなく、経皮吸収試験に一般に使われるラット皮膚よりも水透過性が高い（Cut Ocular Toxcol. 第１２巻、第１８３項、１９９３；J.Invest.Dermatol. 第１００巻、第４０項、１９９３）。そのため、経皮吸収試験に使用する場合は問題がある。そこで、バリア機能を改善する為、種々培養条件の検討がなされたが、未だヒト皮膚の透過性を再現するに至っていない（J.Invest.Dermatol. 第１０９巻、第３４８項、１９９７）。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、かかる従来からの問題点を解消すべく皮膚透過性を改善した培養皮膚、その製造方法及び用途を提供することを課題とする。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、上記課題を解決するため鋭意検討を行った結果、血清、アスコルビン酸・ビタミン類・ホルモン類を含む培地、特にアスコルビン酸を含む培地で培養することにより、製造される培養皮膚が従来のものと比べてバリア機能が改善されることを見出し、本発明を完成するに至った。すなわち、本発明は、バリア機能が改善された培養皮膚、その製造方法及びその用途に関するものである。
【０００８】
本発明は、以下のような構成からなる。
（１）水透過係数が２０〜２５℃の条件下で１０×１０-3ｃｍ／ｈ以下である表皮角化細胞培養物を含むことを特徴とする培養皮膚。
（２）アスコルビン酸を含む培地中で培養することにより製造される（１）の培養皮膚。
（３）アスコルビン酸、血清、ビタミン類及びホルモン類を含む培地で培養することにより製造される（１）または（２）の培養皮膚。
（４）アスコルビン酸及び血清を含み、ビタミン類としてビオチン、コリン、パントテン酸、トコフェロール及びカルニチンを含み、ホルモン類としてグルココルチコイド、エストロジェン及びカテコールアミンを含む培地にて培養することにより製造される（１）〜（３）のいずれかの培養皮膚。
（５）アスコルビン酸及び血清を含み、ビタミン類としてビオチン、コリン、パントテン酸、トコフェロール及びカルニチンを含み、ホルモン類としてデキサメタゾン、プロゲステロン及びイソプロテレノールを含む培地で培養することにより製造される（１）〜（３）のいずれかの培養皮膚。
（６）アスコルビン酸及び血清を含み、ビタミン類としてビオチン、コリン、パントテン酸、トコフェロール及びカルニチンを含み、ホルモン類としてデキサメタゾン、プロゲステロン及びイソプロテレノールを含む培地で培養する工程を含む（１）の培養皮膚の製造方法。
（７）（１）〜（５）のいずれかの培養皮膚を用いることを特徴とする薬物の皮膚透過性を評価する方法。
【０００９】
【発明の実施の形態】
本発明における培養皮膚は、構成要素として表皮角化細胞培養物を含むものである。該表皮角化細胞としては、ヒト包皮表皮角化細胞、ヒト乳房表皮角化細胞、ヒト足裏表皮角化細胞等が例示される。このような培養皮膚は、動物の皮膚より分離培養した表皮角化細胞を適当な支持体に播種、培養し、多層化したシート状の表皮層を形成させることにより作製される。
【００１０】
表皮角化細胞を播種する該支持体としては、コラーゲンやコンドロイチン硫酸などの生体親和性高分子のゲルやスポンジ、あるいはそれらに繊維芽細胞を播種、内封したものなどが挙げられる。また、ベルらの開発した人工皮膚では支持体として、繊維芽細胞とコラーゲン溶液の混合液をゲル化させたものを用いているが（米国特許明細書第４４８５０９６号）、本発明においても、これを支持体として用いることにより、好適に培養皮膚を作製することができる。
【００１１】
本発明により作製された培養皮膚は１０×１０-3ｃｍ／ｈ以下、好ましくは５×１０-3〜１０×１０-3ｃｍ／ｈの水透過速度を有しており、これは経皮吸収試験において従来使用されていたラット皮とほぼ同等の値である。よって、本発明における培養皮膚をラット皮に替わって用いることにより、薬物の皮膚透過性を評価することができる。
【００１２】
例えば、２つの円筒形経皮吸収セルで培養皮膚を挟み、ドナー側に評価する薬物を加え、レセプター側にＰＢＳ（Phosphate Bufferred Saline）等の溶液を加える。一定時間後、レセプター側の溶液を採取し、溶液中の薬物濃度を液体クロマトグラフィー等で測定することにより、薬物の皮膚透過性を評価する。
【００１３】
本発明における水透過係数とは、単位濃度差における、単位時間、単位面積当たりの水透過量のことをいうものであり、「皮膚測定とその試験法（フレグランスジャーナル社、１９９３年）に記載されているように、円筒形の経皮吸収セルを用いることにより簡便に測定することができる。例えば、２つの円筒形経皮吸収セルで培養皮膚を挟み、ドナー側にトリチウム水を加え、レセプター側にＰＢＳ等の溶液を加える。一定時間後、レセプター側の溶液を採取し、放射能活性を測定することにより、培養皮膚の水透過性を測定することができる。ただし、測定時の条件として、２０〜２５℃で実施する必要がある。
【００１４】
本発明における培養皮膚の培養とは、例えば支持体上に播種、培養した表皮角化細胞を空気中で露出させた状態で培養するエアーリキッドインターフェイス培養法などが挙げられる。この場合、培地は支持体下に接触して培養物に供給される。この状態で一定期間培養後、多層化したシート状の表皮層を好適に形成することができる。
【００１５】
本発明において、培地とは、細胞の維持・増殖に必要な栄養源及び無機塩類を含んだもので、具体的にはＭＥＭ、ＤＭＥＭ、ＨａｍＦ−１２等の市販の動物細胞培養用培地が挙げられる。なかでも、ＤＭＥＭ／ＨａｍＦ−１２等量混合培地が好適に使用できる。更に、インシュリン（１〜１００μｇ／ｍｌ）、トランスフェリン（１〜１００μｇ／ｍｌ）、亜セレン酸（１〜１００ｎＭ）等をそれぞれの範囲で添加することがより好ましい。
【００１６】
本発明においては、培地中に好ましくはアスコルビン酸を含む。該アスコルビン酸は１〜１０００μｇ／ｍｌ、好ましくは１０〜５００μｇ／ｍｌの濃度で存在させる。
【００１７】
本発明においては、より好ましくは、培地中に血清・ビタミン類・ホルモン類を加える。該血清は市販の仔ウシ血清あるいはウシ新生児血清が好適に使用できる。血清は約０．１〜２０％、好ましくは０．５〜５％の範囲で培地中に存在させる。
【００１８】
本発明において用いられるビタミン類としては、ビオチン、コリン、パントテン酸、トコフェロール、カルニチン等が挙げられる。上記ビタミン類の添加濃度は、ビオチン０．０１〜５０μｇ／ｍｌ、コリン０．０１〜１００ｍＭ、パントテン酸０．１〜５００μＭ、トコフェロール０．０１〜１００μＭ、カルニチン０．１〜５００μＭで存在させるのが好ましく、ビオチン０．１〜５μｇ／ｍｌ、コリン０．１〜５ｍＭ、パントテン酸１〜５０μＭ、トコフェロール０．１〜５μＭ、カルニチン１〜５０μＭで存在させるのがより好ましい。
【００１９】
本発明に含まれるホルモン類とは、グルココルチコイド、エストロジェン、カテコールアミン等を包含する。特に、グルココルチコイドとしてはデキサメタゾン、エストロジェンとしてはプロゲステロン、カテコールアミンとしてはイソプロテレノールが好適に使用できる。上記ホルモンの添加濃度は、デキサメタゾン０．１〜５００ｎＭ、プロゲステロン１〜１０００ｎＭ、イソプロテレノール０．０１〜５０μＭで存在させるのが好ましく、デキサメタゾン１〜５０ｎＭ、プロゲステロン１０〜５００ｎＭ、イソプロテレノール０．１〜５μＭで存在させるのがより好ましい。
【００２０】
【実施例】
次に、本発明を実施例により具体的に説明する。なお、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００２１】
実施例１ 培養皮膚支持体コラーゲンゲルの作製
コラーゲンゲル作製方法はベルらの方法（Bell,E.et al.,Proc. Natl.Acad.Sci.USA. 第７６巻、第１２７４項、１９７９）に準じて行った。オルガノジェネシス社から購入したヒト繊維芽細胞を１０％牛血清含有ＤＭＥＭ培地にて培養し、サブコンフレントに達した後、同培地にて細胞を回収し、繊維芽細胞懸濁液を得た。４℃において、９容量のコラーゲン溶液（オルガノジェネシス社製）に１容量の１０倍濃度のＥＭＥＭ培地（ギブコ社製）を加え、重曹をｐＨが中性付近になるまで攪拌しながら加えた。さらに１０％量の牛血清を加えた後、上記繊維芽細胞懸濁液を最終細胞濃度が２．５×１０4 個／mlになるようゆっくり加え、良く攪拌した。
【００２２】
上記のようにして得られた混合溶液を６穴プレートに入ったトランスウェル（コースター社製）の内側に３ｍｌずつ加え、室温にて１５分間静置してゲル化させた。上記コラーゲンゲルに１０％牛血清含有ＤＭＥＭ培地を静かに添加して、３７℃、１０％ＣＯ2 条件下で５〜７日間培養し、繊維芽細胞の作用によってコラーゲンゲルを収縮させた後、培養皮膚の支持体に供した。
【００２３】
実施例２ 培養皮膚の作製
収縮したコラーゲンゲルの培地を抜き取った後、表皮角化細胞をゲル上に播種した。表皮角化細胞の播種、培養はベルらの方法（Parenteau,N.L.,et al., J.Cellular Biochem. 第４５巻、第２４５項、１９９１）に従い行った。すなわち、オルガノジェネシス社から購入したヒト表皮角化細胞をＣａ不含ＤＭＥＭ：ＨＡＭ Ｆ１２＝３：１を基礎とするEpidemalization 用培地（東洋紡績製）に懸濁し、支持体であるコラーゲンゲルの上に同細胞懸濁液を細胞が０．５×１０5 〜１×１０5 個／ｃｍ2 になるように添加した。次いで、同培地を静かに添加し、３７℃、１０％ＣＯ2 条件下で３〜５日間培養し、表皮角化細胞を充分伸展させた。次に、Ｃａ不含ＤＭＥＭ：ＨＡＭ Ｆ１２＝１：１を基礎とするMaintenance 用培地（東洋紡績製）を、真皮層が培養液下で、かつ表皮角化細胞が空気中に出るよう添加した。
【００２４】
この際、培地中に添加剤として、何も加えなかったコントロール培地（比較例１）、２５μｇ／ｍｌアスコルビン酸、２％ウシ新生児血清（ギブコ社製）を添加した培地（実施例１）、１００μｇ／ｍｌアスコルビン酸、２％ウシ新生児血清（ギブコ社製）、１μｇ／ｍｌビオチン、０．６４ｍＭコリン、１６．８μＭパントテン酸、１μＭトコフェロール、１０μＭカルニチン、１０ｎＭデキサメタゾン、１００ｎＭプロゲステロン、１μＭイソプロテレノールをそれぞれ添加した培地（実施例２）の３種類について検討を行った。培地は１日おきに交換した。
【００２５】
実施例３ 水透過係数の測定
水透過係数の測定は以下の方法により行った。培養皮膚の表皮シート側をドナー側として円筒形の経皮吸収セル（オルガノジェネシス社製）を接着させ１ｍｌトリチウム水を加え、支持体側をレセプター側としてＰＢＳを加えたシャーレ上に置き、２３℃にて６時間静置させた。レセプター側のＰＢＳ中に含まれるトリチウム水濃度を液体シンチレーションカウンターで測定し、水透過係数を算出した。
【００２６】
比較例１のコントロールの培地、実施例１及び実施例２の培地で１５日間培養した培養皮膚について水透過係数を測定した結果、比較例１では２１．３×１０-3ｃｍ／ｈであったのに対し、実施例１では７．９×１０-3ｃｍ／ｈ、実施例２では６．７×１０-3ｃｍ／ｈであった。また、ラット腹部摘出皮膚の水透過係数は５．６×１０-3ｃｍ／ｈであった。このように、実施例では培養皮膚の水透過性がラット皮膚並に改善された。
【００２７】
コントロール培地及び実施例２の培地にて培養した培養皮膚について経日的に水透過係数を測定した結果を図１に示す。その結果、コントロール培地で培養した培養皮膚の水透過係数は約２０〜１５×１０-3ｃｍ／ｈで推移するのに対し、実施例２で培養した培養皮膚の水透過係数は培養１４日目から１０×１０-3ｃｍ／ｈ以下となり約７．５×１０-3ｃｍ／ｈで推移した。
【００２８】
【発明の効果】
上述したように、本発明は、皮膚透過性を改善した培養皮膚を提供することを可能にしたものである。該培養皮膚を従来のラット皮膚と替えて経皮吸収試験に用いることにより、薬剤の皮膚透過性を評価することができる。したがって、使用する実験動物を減らすことができる為、より経済的で、更に種差の問題もなく、再現性の高いデータを得ることができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】コントロール培地及び実施例２の培地で培養した培養皮膚について、経日的に水透過係数を測定した結果を示すグラフである。
Claims (5)
- アスコルビン酸及び血清を含み、ビタミン類としてビオチン、コリン、パントテン酸、トコフェロール及びカルニチンを含み、ホルモン類としてグルココルチコイド、エストロジェン及びカテコールアミンを含む培地にて培養することにより製造される、水透過係数が２０〜２５℃の条件下で１０×１０−３ｃｍ／ｈ以下である表皮角化細胞培養物を含むことを特徴とする培養皮膚。
- アスコルビン酸及び血清を含み、ビタミン類としてビオチン、コリン、パントテン酸、トコフェロール及びカルニチンを含み、ホルモン類としてデキサメタゾン、プロゲステロン及びイソプロテレノールを含む培地で培養することにより製造される、水透過係数が２０〜２５℃の条件下で１０×１０ −３ ｃｍ／ｈ以下である表皮角化細胞培養物を含むことを特徴とする培養皮膚。
- アスコルビン酸及び血清を含み、ビタミン類としてビオチン、コリン、パントテン酸、トコフェロール及びカルニチンを含み、ホルモン類としてグルココルチコイド、エストロジェン及びカテコールアミンを含む培地で培養する工程を含む請求項１記載の培養皮膚の製造方法。
- アスコルビン酸及び血清を含み、ビタミン類としてビオチン、コリン、パントテン酸、トコフェロール及びカルニチンを含み、ホルモン類としてデキサメタゾン、プロゲステロン及びイソプロテレノールを含む培地で培養する工程を含む請求項２記載の培養皮膚の製造方法。
- 請求項１〜２のいずれかに記載の培養皮膚を用いることを特徴とする薬物の皮膚透過性を評価する方法。
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