CN110684714B - 一种屏障功能弱化模型的构建方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种屏障功能弱化模型的构建方法，包括如下步骤:步骤一、细胞的准备；步骤二、屏障功能弱化模型的液下接种培养；步骤三、屏障功能弱化模型的气液面增殖分化培养；步骤四、屏障功能弱化模型的气液面分化抑制培养；该屏障功能弱化模型能够很好地替代动物模型，成为体外测试的核心工具，应用于婴儿护肤品及具有人体皮肤屏障修复功效的化妆品等产品的安全性及功效性体外检测。

Description

一种屏障功能弱化模型的构建方法
技术领域
本发明属于组织工程学生物材料技术领域，具体涉及一种屏障功能弱化模型的构建方法。
背景技术
皮肤屏障在皮肤抵御外环境，维持内环境稳态，防止皮肤水分散失等功能方面发挥主要作用。皮肤屏障的结构基础是角质层的“砖-灰”结构。“砖”结构主要由角质层细胞及胞内蛋白膜套构成，“灰”结构主要由脂质胞封构成，“砖-灰”结构的本质是角质层蛋白膜套与脂质膜套的交联，它是角质层发挥屏障作用的基础。其发挥屏障主要由三部分组成：①角质细胞的跨膜蛋白及膜内蛋白（兜甲蛋白Loricrin，丝聚蛋白Filaggrin等）在转谷氨酰胺酶作用下互相交联形成蛋白膜套。②细胞外三大脂质（神经酰胺，胆固醇，脂肪酸）相互之间通过酯化反应交联形成脂质胞封。③蛋白膜套与胞外脂质胞封通过酯化反应进一步交联，形成高度密封的砖墙结构，共同抵御外环境，发挥屏障作用。
“砖-灰”结构组成物质的异常表达会导致角质层屏障异常，在皮肤层面表现出皮肤薄，对外部环境敏感等现象；重度的屏障功能异常是引起牛皮癣、银屑病等疾病的根源。因此，皮肤屏障的结构基础指标检测是评价化妆品原料、成品及半成品在改善或提升皮肤屏障功效方面的重要依据。
此外，当细胞从颗粒层到达角质层后，Profilaggrin被Caspase-14（CASP14）迅速去磷酸化成为Filaggrin（FLG），进而水解成天然保湿因子（PCA，UCA），在锁水保湿方面，发挥重要作用。
细胞之间的连接装置在维持机体结构与生理功能方面发挥重要作用。目前已知的连接装置有四种，紧密连接、黏附连接、桥粒连接和缝隙连接。在这些连接装置中，紧密连接对于维持表皮细胞的选择渗透性屏障功能是非常关键的。紧密连接的主要功能是：（1）紧密连接能够将上皮细胞紧密连接，使细胞不易受到破坏，因而是皮肤屏障功能的重要组成部分。（2）紧密连接结构和（或）紧密连接蛋白质能够控制分子的细胞旁通路，对分子大小、离子类型、细胞渗透性有选择性（屏障功能）。（3）它们能够分离细胞膜基底部分的脂质到胞膜顶部从而形成两个不同的膜功能区，从而阻止两个不同功能区之间的相互弥散，以保持细胞每个表面的专有功能，维持细胞的极性（分离作用）。在哺乳动物表皮中，紧密连接蛋白包括：Claudin家族蛋白、闭合蛋白Occludin、连接黏附分子家族蛋白以及紧密连接斑块蛋白，如MAGUK蛋白家族的ZO-1、ZO-2、ZO-3、扣带蛋白（Cingulin）和Symplekin蛋白以及属于细胞极性复杂蛋白质家族的aPKC， Par3和Par6。不同的紧密连接蛋白在表皮中的表达量及表达部位各不相同，如闭合蛋白和扣带蛋白仅限于颗粒层；ZO-1和Cldn-4分布与基底层；Cldn-1和MUPP-1可见于表皮的各层。
在许多的人类皮肤疾病中，紧密连接蛋白的表达都发生了不同程度的改变。正常皮肤中仅局限于表皮上层的紧密连接蛋白在寻常性银屑病、寻常性鱼鳞病、扁平苔藓表达部位增多，如Cldn-4、闭合蛋白和ZO-1。正常情况下表达部位局限的紧密连接蛋白在银屑病和其他皮肤病中表达范围增多，而正常时表达于表皮各层的Cldn-1蛋白在银屑病表皮中则表达下降，特别是在表皮下部。银屑病患者皮损附近的皮肤中紧密连接表达高于正常部位，治愈的银屑病斑块区除Cldn-4蛋白外其它紧密连接蛋白重新表达。在人类受伤皮肤区，即角质层缺失的边缘部分和再生的表皮处，紧密连接蛋白表达范围亦增多。在正常人类的表皮中闭合蛋白、ZO-1、Cldn-1和Cldn-4都强表达于发生角化的肿瘤细胞上，如癌珠。在未角化的肿瘤细胞上，Cldn-1有不同程度地表达，而ZO-1和Cldn-4则表达下降或不表达。在Bowen病中，闭合蛋白、ZO-l、Cldn-1和Cldn-4在细胞与细胞连接处也有异常的表达。
Loricrin是角质胞封的主要成分，主要存在于表皮颗粒层。Loricrin蛋白大约占角质胞封蛋白总量的70%。Loricrin的功能主要有以下三方面：（1）加固角质胞封，增强屏障；（2）Loricrin与中间纤维丝相互作用，增加角质胞封结构的灵活性。有研究表明，衰老皮肤中 Loricrin蛋白的含量出现显著下调，这与老年人皮肤屏障能力下降直接相关。此外，也有研究发现，在糖尿病或者衰老的人及动物皮肤中可以检测到Loricrin的衍生多肽类物质，但是在健康的年轻人群中很难检测到，说明随着年龄的增加，Loricrin蛋白的降解速率也会增加。
综上所述，婴儿护肤品及具有皮肤屏障修复功效的化妆品具有广泛的前景，针对这类产品及原料的安全性及功效性检测具有重要意义。开发一种可用于婴儿护肤品及具有皮肤屏障修复功效的化妆品的安全性及功效性检测的屏障功能弱化模型是必然趋势。
发明内容
本发明的目的是为了提供一种可用于婴儿护肤品及具有皮肤屏障修复功效的化妆品的安全性及功效性检测的屏障功能弱化模型的构建方法。
为此，本发明提供了一种屏障功能弱化的模型的构建方法,包括如下步骤:
步骤一、细胞的准备；
步骤二、屏障功能弱化模型的液下接种培养；
步骤三、屏障功能弱化模型的气液面增殖分化培养；
步骤四、屏障功能弱化模型的气液面分化抑制培养。
所述步骤一、细胞的准备的具体方法为：取原代表皮细胞，复苏扩增后，使用P4～P20代细胞，以胰酶消化制成单细胞悬液，调整细胞密度为5.0×105个/mL～5.0×106个/mL，接种于培养瓶中，加FAD培养液，轻轻晃动培养瓶，使细胞分散均匀后，置于37℃、5%CO2条件下培养。
所述FAD培养液，为F12与培养液DMEM的体积比为1：3混合配制。
所述步骤二、屏障功能弱化模型的液下接种培养的具体方法为：取对数生长期细胞，以培养液Ⅰ制成单细胞悬液，调整细胞密度为5×105个/mL～5.0×106个/mL，以200μL/室的体积，接种于小室内，将小室置于模型培养皿内，每皿添加60～80mL培养液Ⅰ，置于37℃、5%CO2条件下培养0.5～2小时；后转入液下培养，培养时间为1～2天，每天换液；
所述培养液Ⅰ，是以FAD为基础培养液，添加牛脑垂体浸提物BPE为10.0～100.0μg/mL、表皮生长因子1～10ng/mL、腺嘌呤 10～50μg/mL、转铁蛋白5～12ng/mL、角质形成细胞生长因子1～10ng/mL、氢化可的松0.1～5.0 μg/mL配置。
所述步骤三、屏障功能弱化模型的气液面增殖分化培养的具体方法为：将步骤二中的小室内的培养液弃掉，更换模型培养皿内的培养液为培养液Ⅱ，添加量为50～70mL，使液面与小室内细胞上表面位于同一水平线，进行气液面培养，培养时间为1～5天，每天换液。
所述培养液Ⅱ，为在培养液Ⅰ中，增加氢化可的松5.0～10.0 μg/mL，并添加维生素E为20.0～80.0 μg/mL、谷胱甘肽10.0～80.0 μg/mL、氯化钙0.03～0.2mM配置。
所述步骤四、屏障功能弱化模型的气液面分化抑制培养的具体方法为：将步骤三中的小室内的培养液弃掉，更换模型培养皿内的培养液为培养液Ⅲ，添加量为50～70mL，使液面与小室内细胞上表面位于同一水平线，进行气液面培养，培养时间为1～5天，每天换液，培养结束。
所述培养液Ⅲ，为在培养液Ⅰ中，降低氢化可的松浓度至0.1～2.0 μg/mL，并添加蛋白激酶C抑制剂GF109203X为1～20ng/mL。
本发明的有益效果：本发明提供这种屏障功能弱化的模型的构建方法, 具有以下优点：一、体外构建重复性佳，可实现产业化制备；二、使用无血清培养体系，添加的牛脑垂体浸提物BPE、转铁蛋白、角质形成细胞生长因子等补充了含血清培养体系中胎牛血清提供的营养物质，调节细胞的增殖及分化，模拟细胞生长所需的体内微环境，使细胞在无支架及滋养层时，能够更好的增殖分化，形成组织结构。三、模型气液面构建早期，氢化可的松、氯化钙、维生素E、谷胱甘肽的添加，一方面促进细胞的增殖分化，一方面抑制自由基的形成与释放，保证了模型早期的增殖、分化，形成正常的基底层、棘层、颗粒层，并形成较薄的角质层；四、模型气液面构建后期，氢化可的松的降低及氯化钙的去除、蛋白激酶C抑制剂GF109203X的添加，保证了模型构建后期细胞的分化抑制，在形成正常的基底层、棘层、颗粒层基础上，维持较薄的角质层；五、气液面培养时间的缩短，在保证模型复层化结构形成的同时，缩短的模型分化时间，是模型形成并维持较薄的角质层，同时，缩短了构建时间、降低生产成本；六、使用构建的屏障功能弱化模型对婴儿护肤品等产品进行安全性检测，其结果与动物实验及临床结果一致，因此，屏障功能弱化模型能够筛选适用于屏障功能较弱皮肤的化妆品；七、使用构建的屏障功能弱化模型对具有屏障修护功能的产品进行功效性检测，其结果与动物实验及临床结果一致，能够有效筛选出具有屏障修护功能的产品，因此，屏障功能弱化模型能够很好的替代动物模型，成为体外测试的核心工具，应用于婴儿护肤品及具有人体皮肤屏障修复功效的化妆品等产品的安全性及功效性体外检测。
以下将结合附图对本发明做进一步详细说明。
附图说明
图1为体外构建的屏障功能弱化模型的组织学切片HE染色示意图。
图2为利用屏障功能弱化模型的液下培养结束后组织活性与1.0% Triton X-100作用时间的曲线图。
图3为利用屏障功能弱化模型的气液面培养结束后组织活性与1.0% Triton X-100作用时间的曲线图。
图4为利用屏障功能弱化模型进行婴儿护肤品安全性检测结果图。
图5为利用屏障功能弱化模型进行具有人体皮肤屏障修复功效的化妆品的功效性检测结果图。
具体实施方式
为进一步阐述本发明达成预定目的所采取的技术手段及功效，以下结合附图及实施例对本发明的具体实施方式、结构特征及其功效，详细说明如下。
实施例1
为了提供一种用于婴儿护肤品及具有皮肤屏障修复功效的化妆品的安全性及功效性检测的方法；本发明提供一种屏障功能弱化的模型的构建方法，包括以下方法步骤：
步骤一、细胞的准备
取原代表皮细胞，复苏扩增后，使用P4～P20代细胞，以胰酶消化制成单细胞悬液，调整细胞密度5.0×105个/mL～5.0×106个/mL，接种于培养瓶中，加FAD培养液，轻轻晃动培养瓶，使细胞分散均匀后，置于37℃、5%CO2条件下培养；
所述FAD培养液，为F12与培养液DMEM的体积比为1:3混合配制。
步骤二、屏障功能弱化模型的液下接种培养
取对数生长期细胞，以培养液Ⅰ制成单细胞悬液，调整细胞密度为5×105个/mL～5.0×106个/mL，以200μL/室的体积，接种于小室内，将小室置于模型培养皿内，每皿添加60～80mL培养液Ⅰ，置于37℃、5%CO2条件下培养0.5～2小时；后转入液下培养，培养时间为1～2天，每天换液；
所述培养液Ⅰ，是以FAD为基础培养液，添加牛脑垂体浸提物BPE为10.0～100.0μg/mL、表皮生长因子1～10ng/mL、腺嘌呤 10～50μg/mL、转铁蛋白5～12ng/mL、角质形成细胞生长因子1～10ng/mL、氢化可的松0.1～5.0 μg/mL；
上述步骤中采用的培养液Ⅰ，未添加胎牛血清，因为血清中一些成分也会对上皮细胞的分化产生一定的抑制作用，因此在该培养体系中不添加胎牛血清；但胎牛血清中含有各种血浆蛋白、多肽、脂肪、碳水化合物、生长因子、激素、无机物等，能够提供人工合成培养液中所缺少的生物因子及物理因素，形成与体内微环境相似的细胞生长场所，使细胞生长或抑制达到生理平衡；因此，该培养体系在培养液Ⅰ中添加了各种因子，补充胎牛血清中营养物质，调节细胞的增殖及分化，模拟细胞生长所需的体内微环境，使细胞在无支架及滋养层时，能够更好的增殖分化，形成组织结构。其中，牛脑垂体浸提物BPE含有多种生长因子（如碱性成纤维细胞生长因子FGF）、脂肪酸、激素、磷酸乙醇胺等物质，具有较强的致有丝分裂活性；研究发现BPE对上皮细胞的原代培养、冻存和复苏至关重要，并且适当浓度的BPE能够促进上皮细胞的生长增殖，并抑制其分化，浓度过高或过低都不利于其生长；在细胞的传代培养中，若无血清培养基不含牛脑垂体提取物，传代培养的上皮细胞将停止增殖分化，最终脱落。角质形成细胞生长因子能特异性作用于上皮细胞，通过其特异性受体在刺激上皮细胞生长，其对新生或老化的上皮细胞均有刺激生长分裂作用。转铁蛋白能结合铁离子，减少其毒性和被细胞利用。氢化可的松可能兼有促细胞贴附和增殖作用，细胞密度高时可诱导细胞发生分化。上述因子的添加，补充了含血清培养体系中胎牛血清提供的营养物质，调节细胞的增殖及分化，模拟细胞生长所需的体内微环境，使细胞在无支架及滋养层时，能够更好的增殖分化，形成组织结构。
针对传统培养所使用的单一培养基（例如单纯使用DMEM培养基）只能够提供氨基酸、维生素、无机盐、有机化合物、微量元素的缺陷，上述因子的添加，保证了细胞的营养需求，促进了细胞的生长。
步骤三、屏障功能弱化模型的气液面增殖分化培养
将上述小室内的培养液弃掉，更换模型培养皿内的培养液为培养液Ⅱ，添加量为50～70mL，使液面与小室内细胞上表面位于同一水平线，进行气液面培养，培养时间为1～5天，每天换液；
所述培养液Ⅱ，为在培养液Ⅰ中，增加氢化可的松5.0～10.0 μg/mL，并添加维生素E为20.0～80.0 μg/mL、谷胱甘肽10.0～80.0 μg/mL、氯化钙0.03～0.2mM。
上述步骤中采用气液面分段培养的方法，使其形成正常的基底层、棘层、颗粒层，并形成较薄的角质层。该气液面培养阶段使用的培养液Ⅱ，与培养液Ⅰ的区别在于，增加了培养液Ⅰ中氢化可的松的浓度，并添加了维生素E，谷胱甘肽。维生素E是最主要的抗氧化剂之一，保护细胞免受自由基的毒害，抑制细胞凋亡；并能降低细胞需要氧量，维持细胞活性；并参与细胞DNA的合成。谷胱甘肽与维生素E一起，发挥抗氧化作用，抑制细胞的凋亡。氢化可的松浓度的适量增加，能够在细胞密度增加的情况下，发挥了诱导细胞分化的作用，保证了模型的复层化。Ca2+的加入，能够促进表皮细胞的分化。上述条件共同作用，保证了模型早期的增殖、分化，形成正常的基底层、棘层、颗粒层，并形成较薄的角质层。
步骤四、屏障功能弱化模型的气液面分化抑制培养
将上述小室内的培养液弃掉，更换模型培养皿内的培养液为培养液Ⅲ，添加量为50～70mL，使液面与小室内细胞上表面位于同一水平线，进行气液面培养，培养时间为1～5天，每天换液，培养结束，屏障功能弱化模型的体外构建结束；
所述培养液Ⅲ，为在培养液Ⅰ中，降低氢化可的松浓度至0.1～2.0 μg/mL，并添加蛋白激酶C抑制剂GF109203X为1～20ng/mL；
上述步骤中采用气液面分段培养的方法，抑制模型的分化，形成屏障功能弱化模型。该气液面培养阶段使用的培养液Ⅲ，与培养液Ⅰ的区别在于，降低了培养液Ⅰ中氢化可的松的浓度，并添加了蛋白激酶C抑制剂GF109203X。氢化可的松的降低及氯化钙的去除，能够抑制表皮细胞的分化。蛋白激酶C抑制剂GF109203X是一个高选择性的PKC抑制剂，其与PKCα、PKCβ1、PKCβ2及PKCγ结合后，竞争性抑制ATP与PKC的结合，从而高度抑制PKC的活性，导致PKC功能显著降低，从而抑制表皮细胞分化。上述条件共同作用，保证了模型后期的分化抑制，在形成正常的基底层、棘层、颗粒层基础上，维持较薄的角质层。
进一步地，该模型构建时间为3～12天，与屏障功能健全的表皮模型相比，构建所需时间短。
进一步地，构建体系能够提供表皮细胞增殖分化所需营养及微环境，不需要滋养层。
进一步地，模型结构与正常人表皮结构相比，具有基底层、棘层、颗粒层，但角质层较薄。
进一步地，使用ET50法（1.0% Triton X-100使模型内半数细胞死亡所需的时间）检测其屏障功能，在液下培养结束后，其ET50为0.5～1h。
进一步地，使用ET50法检测其屏障功能，在气液面培养结束后，其ET50为1～2h。
进一步地，该模型应用于婴儿护肤品及具有人体皮肤屏障修复功效的化妆品等产品的安全性及功效性体外检测。
实施例2
本实施例着重介绍利用原代表皮细胞体外构建的屏障功能弱化模型的体外构建方法步骤：
步骤一、细胞的准备
取原代表皮细胞，复苏扩增后，使用P7代细胞，以胰酶消化制成单细胞悬液，调整细胞密度5.0×105个/mL，接种于培养瓶中，加FAD培养液，轻轻晃动培养瓶，使细胞分散均匀后，置于37℃、5%CO2条件下培养；
所述FAD培养液，为F12与培养液DMEM的体积比为1:3混合配制。
步骤二、屏障功能弱化模型的液下接种培养
取对数生长期细胞，以培养液Ⅰ制成单细胞悬液，调整细胞密度为5×105个/mL，以200μL/室的体积，接种于小室内，将小室置于模型培养皿内，每皿添加80mL培养液Ⅰ，置于37℃、5%CO2条件下培养0.5小时；后转入液下培养，培养时间为2天，每天换液；
所述培养液Ⅰ，是以FAD为基础培养液，添加牛脑垂体浸提物BPE为20.0μg/mL、表皮生长因子2ng/mL、腺嘌呤 10μg/mL、转铁蛋白5ng/mL、角质形成细胞生长因子5ng/mL、氢化可的松1.0 μg/mL。
步骤三、屏障功能弱化模型的气液面增殖分化培养
将上述小室内的培养液弃掉，更换模型培养皿内的培养液为培养液Ⅱ，添加量为60mL，使液面与小室内细胞上表面位于同一水平线，进行气液面培养，培养时间为3天，每天换液；
所述培养液Ⅱ，为在培养液Ⅰ中，增加氢化可的松5.0μg/mL，并添加维生素E为50.0μg/mL、谷胱甘肽50.0 μg/mL、氯化钙0.2mM。
步骤四、屏障功能弱化模型的气液面分化抑制培养
将上述小室内的培养液弃掉，更换模型培养皿内的培养液为培养液Ⅲ，添加量为60mL，使液面与小室内细胞上表面位于同一水平线，进行气液面培养，培养时间为4天，每天换液，培养结束，屏障功能弱化模型的体外构建结束；
所述培养液Ⅲ，为在培养液Ⅰ中，降低氢化可的松浓度至0.5μg/mL，并添加蛋白激酶C抑制剂GF109203X为10ng/mL。
利用原代表皮细胞体外构建的屏障功能弱化模型的组织学切片HE染色结果见图1，说明利用原代表皮细胞体外构建的屏障功能弱化模型复层化结构完整，角质层薄。
实施例3
本实施例着重介绍利用原代表皮细胞体外构建的屏障功能弱化模型进行ET50检测的步骤：
1）将模型放入6孔板，在孔板内添加0.9 mL的培养液。
2）吸取80 μL 1.0% Triton X-100，缓慢滴加于组织表面，确保试剂能够尽量覆盖在组织表面。
3）给药时间分别为0、1、2h。
4）最后一块组织给药后，将所有的6孔板转移到恒温培养箱中（37±1℃、5±1%CO2、95%相对湿度）。
5）在组织孵育结束前30min，预备1 mg/mL MTT溶液，并向24孔板每孔加入300 μL的MTT溶液。
6）给药结束后开始洗涤程序，采用装有无菌DPBS的洗瓶清洗组织，清洗10次以后，采用DPBS浸洗组织培养小室里、外各一次。
7）将清洗好并且干燥的组织，转移至加有MTT测试溶液的24孔板中，恒温培养箱中（37±1℃、5±1% CO2、95%相对湿度），孵育3 h。
8）MTT孵育完成后，从孔板中轻柔的吸去MTT溶液，给孔板中加入DPBS溶液进行清洗过程。
9）洗涤完毕后，将组织底面用吸水纸擦干，转移到新的24孔板中，在培养小室中加入2 mL异丙醇，它能够溶解MTT产生的结晶。采用封口膜密封24孔板间隙避免异丙醇挥发影响终体积。4℃静置过夜溶解。
10）溶解完成后，对于每个组织，吸取2份200 μL的紫色甲瓒溶液到同一96孔板中。重复处理平行的组织，并依据孔板的设计转移液体，采用异丙醇作为空白对照。分光光度计570 nm波长读取吸光度，不采用滤光镜。
11）屏障功能弱化模型的液下培养结束后组织活性与1.0% Triton X-100作用时间的曲线图见图2，可计算得出ET50值为0.8h。屏障功能弱化模型的气液面培养结束后组织活性与1.0% Triton X-100作用时间的曲线图见图3，可计算得出ET50值为1.7h。
实施例4
本实施例着重介绍利用原代表皮细胞体外构建的屏障功能弱化模型进行婴儿护肤品安全性检测的步骤：
1）准备样品
进行实验分组，样本组为2种液体状的婴儿护肤品，阴性对照组（NC）为超纯水，阳性对照组（PC）为1%SDS。
2）测试安全性
（1）每种测试物预备1个六孔板，共准备4个6孔板。在第一排各孔中添加0.9ml的培养液，每孔放置一个体外重组屏障功能弱化模型。
（2） 测试物给药。在超净工作台中进行所有的给药操作：每隔1min给药一个模型，确保给药后，留有充分的浸洗时间间隔。在组织表面分别进行给药，给药量为50μL，给药后，轻摇细胞小室促进测试物在组织表面的铺展，恒温培养箱中（37±1℃、5±1% CO2、95%相对湿度），孵育30min。
（4）至第一个给药的组织的给药时间结束，取出模型，准备三个无菌24孔板，用于细胞活力检测。
（5）开始洗涤程序。控制每个培养小室洗涤1min，用杜氏酸盐缓冲溶液洗模型15次，用无菌纱布或无菌棉棒擦拭。
（6）清洗结束后，在36～37℃、5%CO2、95%相对湿度培养条件下，使用新鲜的养基培养组织24h。
（7）MTT测试将表面干燥的模型转移到含有1mg/mL 噻唑蓝溶液的24孔板中，每孔0.3mL，在36～37℃、5% CO2、95％湿度的细胞培养箱中避光孵育3小时。
（8）用移液器吸除噻唑蓝溶液，将模型完全浸没至每孔含2mL异丙醇的24孔板，用封口膜密封，在4℃静置提取12～16小时，得到异丙醇的浸提物。
（9）采用200μL移液器枪尖刺穿培养小室底部，使模型的异丙醇浸提物流到培养孔中。吸取200 μL到异丙醇浸提物到96孔板中。
（10）测量吸光度：用96孔板分光光度计检测在波长为550～570nm的吸光度OD值。
（11）判定安全性：以阴性对照去离子水的吸光度值为分母，分别以测试样的吸光度值为分子，比值的百分数作为各自的相对细胞活力。结果见图4，样品1（S1）的相对细胞活力为63.7%，相对细胞活力高于50%，属于无刺激性样品。样品2（S2）的相对细胞活力为74.9%，相对细胞活力高于50%，属于无刺激性样品。（相对细胞活力高于50%，被检测的样品无刺激性，相对细胞活力低于60%，被检测的样品具有刺激性。）
实施例5
本实施例着重介绍利用原代表皮细胞体外构建的屏障功能弱化模型进行具有人体皮肤屏障修复功效的化妆品的功效性检测的步骤：
1）准备样品
进行实验分组，实验组（S1）为1种液体状的化妆品，对照组（NC）为超纯水。
2）功效性检测
（1）每组准备9个模型，将模型放入6孔板，在孔板内添加0.9 mL的培养液。
（2）分别吸取80 μL 样品或超纯水，缓慢滴加于组织表面，确保试剂能够尽量覆盖在组织表面。
（3）给药时间分别为0、6、24h。
（4）最后一块组织给药后，将所有的6孔板置于恒温培养箱（37±1℃、5±1% CO2、95%相对湿度）。
（5）在组织孵育结束前30min，预备1 mg/mL MTT溶液，并向24孔板每孔加入300 μL的MTT溶液。
（6）给药结束后开始洗涤程序，采用装有无菌DPBS的洗瓶清洗组织，清洗10次以后，采用DPBS浸洗组织培养小室里、外各一次。
（7）将清洗好并且干燥的组织，转移至加有MTT测试溶液的24孔板中，恒温培养箱中（37±1℃、5±1% CO2、95%相对湿度），孵育3 h。
（8）MTT孵育完成后，从孔板中轻柔的吸去MTT溶液，给孔板中加入DPBS溶液进行清洗过程。
（9）洗涤完毕后，将组织底面用吸水纸擦干，转移到新的24孔板中，在培养小室中加入2 mL异丙醇，它能够溶解MTT产生的结晶。采用封口膜密封24孔板间隙避免异丙醇挥发影响终体积。4℃静置过夜溶解。
（10）溶解完成后，对于每个组织，吸取2份200 μL的紫色甲瓒溶液到同一96孔板中。重复处理平行的组织，并依据孔板的设计转移液体，采用异丙醇作为空白对照。分光光度计570 nm波长读取吸光度，不采用滤光镜。
（11）判定功效性：以孵育0小时的吸光度值所对应的模型组织活力为100%，按公式计算实验组和对照组孵育6小时、24小时的相对细胞活力，细胞相对活力计算公式为：相对细胞活力% =实验组OD值/对照组OD值。绘制实验组和对照组不同时间的细胞活力曲线，孵育时间为横坐标，模型的细胞活力为纵坐标，实验组孵育6小时、24小时的细胞活力高于对照组，见图5，该试验化妆品具有皮肤屏障修复功效。
以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。

Claims (2)

1.一种屏障功能弱化模型的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤一、细胞的准备；
步骤二、屏障功能弱化模型的液下接种培养；
步骤三、屏障功能弱化模型的气液面增殖分化培养；
步骤四、屏障功能弱化模型的气液面分化抑制培养，
其中，所述步骤一、细胞的准备的具体方法为：取原代表皮细胞，复苏扩增后，使用P4~P20代细胞，以胰酶消化制成单细胞悬液，调整细胞密度为5.0×105个/mL~5.0×106个/mL，接种于培养瓶中，加FAD培养液，轻轻晃动培养瓶，使细胞分散均匀后，置于37℃、5%CO2条件下培养，
其中，所述FAD培养液，为F12与培养液DMEM按体积比为1:3混合配制，
其中，所述步骤二、屏障功能弱化模型的液下接种培养的具体方法为：取对数生长期细胞，以培养液I制成单细胞悬液，调整细胞密度为5×105个/mL~5.0×106个/mL，以200μL/室的体积，接种于小室内，将小室置于模型培养皿内，每皿添加60~80mL培养液I，置于37℃、5%CO2条件下培养0.5~2小时；后转入液下培养，培养时间为1~2天，每天换液，
其中，所述步骤三、屏障功能弱化模型的气液面增殖分化培养的具体方法为：将步骤二中的小室内的培养液弃掉，更换模型培养皿内的培养液为培养液II，添加量为50~70mL，使液面与小室内细胞上表面位于同一水平线，进行气液面培养，培养时间为1~5天，每天换液，
其中，所述培养液II，为在培养液I中，增加氢化可的松5.0~10.0μg/mL，并添加维生素E为20.0~80.0μg/mL、谷胱甘肽10.0~80.0μg/mL、氯化钙0.03~0.2mM配制，
其中，步骤四中屏障功能弱化模型的气液面分化抑制培养的培养液为培养液III，其中，所述培养液III，为在培养液I中，降低氢化可的松浓度至0.1~2.0μg/mL，并添加蛋白激酶C抑制剂GF109203X为1~20ng/mL，
其中，所述培养液I，是以FAD为基础培养液，添加牛脑垂体浸提物BPE为10.0~100.0μg/mL、表皮生长因子1~10ng/mL、腺嘌呤10~50μg/mL、转铁蛋白5~12ng/mL、角质形成细胞生长因子1~10ng/mL、氢化可的松0.1~5.0μg/mL配制。
2.如权利要求1所述的屏障功能弱化模型的构建方法，其特征在于，所述步骤四、屏障功能弱化模型的气液面分化抑制培养的具体方法为：将步骤三中的小室内的培养液弃掉，更换模型培养皿内的培养液为培养液III，添加量为50~70mL，使液面与小室内细胞上表面位于同一水平线，进行气液面培养，培养时间为1~5天，每天换液，培养结束。
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