CN114107429A - 一种化妆品原料体外3d皮肤模型屏障修复功效的筛选方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种化妆品原料体外3D皮肤模型屏障修复功效的筛选方法，结合正常3D皮肤模型、SDS损伤3D皮肤模型和SDS持续损伤3D皮肤模型，对目标原料的屏障修复活性进行筛选，包含免疫学、分子生物学、毒理学三种维度的检测，构建化妆品原料的屏障修复功效评价方法，属于系统型评估方法，具有快速、高效、全面的优势；为皮肤护理产品屏障修复活性原料的前期验证及筛选提供快捷可靠的评价方法，为屏障修复原料的复配方案提供参考依据，也为护肤品行业动物替代实验、皮肤护理产品开发和功效验证的进一步研究提供有效依据。
Description
技术领域
本发明涉及一种化妆品原料体外3D皮肤模型屏障修复功效的筛选方法，属于化妆品原料性能测试技术领域。
背景技术
屏障修复类功效性护肤品的开发中，其活性原料的屏障修复功效评估是配方设计前期的重要步骤之一。传统活性原料屏障修复功效评价手段主要依赖小鼠的伤口愈合实验，通常实验周期长，成本高，对于高通量原料筛选非常不方便。随着3R原则的循环经济理念推出，3R原则已经成为生物医药科学研究及相关法规管理普遍遵守的准则，欧洲化妆品法规也颁布了关于动物实验在化妆产品中的禁令，这些法规的变化促进了体外替代验证方法的开发及应用。构建体外替代功效验证方法有助于更为经济高效地实现屏障修复类化妆品原料的开发和筛选。
皮肤屏障受损通常伴随表皮层渗透性变强，参与皮肤屏障的角化套膜蛋白FLG、LOR等表达下调，参与到屏障的紧密连接蛋白ZO-1、Claudin-1等，角蛋白CK10、CK14等表达下调。3D皮肤模型拥有与人正常皮肤相似的生理和结构，并且市售3D皮肤为统一化生产，结构特征较为稳定，利用3D皮肤模型进行屏障修复活性物的检测，可以用正常皮肤模型模拟正常皮肤屏障的状态；可以从化学诱导方法促使皮肤角质层变薄，构建SDS损伤模型，模拟真实皮肤的屏障受损状态，；可以从化学诱导方法促使皮肤屏障持续受损，构建SDS持续损伤模型，模拟真实皮肤的持续屏障受损状态，同时评估化妆品原料的屏障修复功效。人体皮肤有屏障受损和正常屏障状态，通过三种模型进行评估，在转录组学水平、蛋白组学水平和毒理学水平，目前三种模型+三种评估维度结合，综合评估化妆品原料屏障修复功效的体外方法还未见相关专利和文献报道。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术的缺陷，提供一种化妆品原料体外3D皮肤模型屏障修复功效的筛选方法，包含三种维度的三种模型，使得化妆品原料作用对象涵盖了正常皮肤表皮层和屏障受损皮肤表皮层，构建化妆品原料的屏障修复功效评价方法，属于系统型评估方法，具有快速、高效的优势。
实现上述目的的技术方案是：一种化妆品原料体外3D皮肤模型屏障修复功效的筛选方法，包括结合正常3D皮肤模型、SDS损伤3D皮肤模型和SDS持续损伤模型检测结果，对目标原料的屏障修复活性进行筛选，具体包括以下步骤：
S1，评估原料样品的溶解性，确定溶解方案；
S2，3D皮肤培养；
S3，3D皮肤活性检测确定原料样品检测浓度，包括以下工序：
S31，取步骤S2中生长状态稳定3D皮肤，加入实验样品，所述实验样品包含若干个不同浓度梯度原料样品，对照样品为不添加任何样品的缓冲液，培养24h～48h，用MTT检测3D皮肤组织存活率；
S32，步骤S32筛选得到CV90时对应的原料样品3D皮肤模型给药浓度，所述CV90代表3D皮肤组织存活率为90％；
S4，正常3D皮肤模型的基因表达检测及免疫荧光检测步骤，包括以下工序：
S41，取步骤S2中生长状态稳定的3D皮肤，设置诱导对照组及样品组，所述诱导对照组加入缓冲液，所述样品组加入步骤S32中CV90对应给药浓度的原料样品，将诱导对照组及样品组分别培养16h～72h，；
S42，步骤S41中培养完成的正常3D皮肤模型进行收集，分别实施正常3D皮肤模型中FLG、LOR和CK10的基因表达检测；
S43，步骤S41中培养完成的正常3D皮肤模型进行收集，通过石蜡包埋和切片，分别实施正常3D皮肤模型中FLG、LOR和CK10的免疫荧光表达检测；
S5，SDS损伤3D皮肤模型的基因表达检测及免疫荧光检测步骤，包括以下工序：
S51，取步骤S2中生长状态稳定的3D皮肤，经SDS处理5min～30min后，设置诱导对照组及样品组，所述诱导对照组加入缓冲液，所述样品组加入步骤S32中CV90对应给药浓度的原料样品，将诱导对照组及样品组分别培养16h～72h；
S52，步骤S51中培养完成的SDS损伤3D皮肤模型进行收集，分别实施SDS损伤3D皮肤模型中FLG、LOR和CK10的基因表达检测；
S53，步骤S51中培养完成的SDS损伤3D皮肤模型进行收集，通过石蜡包埋和切片，分别实施SDS损伤3D皮肤模型中FLG、LOR和CK10的免疫荧光表达检测；
S6，SDS持续损伤模型ET50值检测步骤：取步骤S2中生长状态稳定的3D皮肤，设置诱导对照组及样品组，诱导对照组加入SDS和缓冲液，样品组加入SDS和步骤S32中CV90对应给药浓度的原料样品，培养12h～48h，经过缓冲液的冲洗后，诱导对照组及样品组加入TritonX-100，设置培养时间5min-5h，检测时间点5min、20min、1h、2h、3h、4h、5h下的皮肤模型的MTT值，计算组织活性，通过SPSS计算ET50值；
S7，评价步骤，具体包括以下内容：
S71，基因相对表达量评价步骤：汇总步骤S42和S52中基因表达检测结果，计算检测原料样品组基因表达与诱导组基因表达比值，得到基因的相对表达量，应用GraphPadPrism作图，结果表示为Mean±SD；各组间比较采用Two-way ANOVA统计分析；所有的统计分析均为双尾；
p<0.05认为具有显著差异，用“*”表示，说明该受试物具有一定修复作用，评分为0.3；
p<0.01认为具有非常显著差异，用“**”表示，说明该受试物具有显著修复作用，评分为0.5；
p<0.001认为具有极显著差异，用“***”表示，说明该受试物具有极其显著修复作用，评分为0.7；
p<0.0001认为具有极其显著差异，用“****”表示，说明该受试物具有极其显著修复作用，评分为1.0；
S72，免疫荧光表达评价步骤：汇总步骤S43和S53中免疫荧光表达检测结果，应用Image J计算荧光强度，结果表示为Mean±SD；按照荧光强度进行排序，数值越高，说明受试物的修复作用越强，依次进行排序，低于诱导对照组评分为0；高于诱导对照组评分依次按照数值的高低排序；
S73，SDS持续损伤模型ET50值评价步骤：汇总步骤S6中的ET50值，进行ET50值的比较，数值越高，则受试物的修复作用越强，依次进行排序，低于诱导对照组评分为0；高于诱导对照组评分依次按照数值的高低排序给分，高于诱导对照组评分为0.1；
S8，根据步骤S7的评分标准汇总所有检测指标评分，由此筛选出具有最佳屏障修复功效的原料。
上述的一种化妆品原料体外3D皮肤模型屏障修复功效的筛选方法，其中，正常3D皮肤模型和SDS损伤3D皮肤模型两种模型中，所实施的FLG、LOR、CK10的基因表达检测中至少一种基因表达检测构成转录组学水平评价指标，所实施的FLG、LOR、CK10的免疫荧光表达检测中至少一种免疫荧光表达检测构成蛋白组学水平评价指标；SDS持续损伤3D皮肤模型所检测的ET50值构成毒理学水平评价指标。
上述的一种化妆品原料体外3D皮肤模型屏障修复功效的筛选方法，步骤S1中，水中溶解度≥1000μg/mL的原料样品直接溶于培养基进行后续实验；
水中溶解度＜1000μg/mL的原料样品用二甲基亚砜溶剂溶解后进行后续实验。
上述的一种化妆品原料体外3D皮肤模型屏障修复功效的筛选方法，其中，使用二甲基亚砜作为溶剂时，溶剂的体积百分比浓度不得超过总体积的5％，且对照样品和实验样品中溶剂的体积比例相同。
上述的一种化妆品原料体外3D皮肤模型屏障修复功效的筛选方法，步骤S2中，3D皮肤采购配套专用培养基进行气液两相培养，所有培养条件均为37±0.5℃，(5±1)％CO2浓度，饱和湿度。
上述的一种化妆品原料体外3D皮肤模型屏障修复功效的筛选方法，步骤S31中，每种待测原料样品配置CV90对应的给药浓度，每个浓度设2个及以上复孔。
上述的一种化妆品原料体外3D皮肤模型屏障修复功效的筛选方法，步骤S51中，SDS处理浓度为0.1％～1.0％，所述缓冲液为DPBS缓冲液。
上述的一种化妆品原料体外3D皮肤模型屏障修复功效的筛选方法，步骤S6中，所述TritonX-100处理浓度为0.1％～5.0％，所述缓冲液为DPBS缓冲液。
上述的一种化妆品原料体外3D皮肤模型屏障修复功效的筛选方法，步骤S42和步骤S52中，FLG、LOR和CK10的基因表达检测采用定量RT-PCR法。
上述的一种化妆品原料体外3D皮肤模型屏障修复功效的筛选方法，步骤S43和步骤S53中，FLG、LOR和CK10的免疫荧光表达是对相应的皮肤模型进行免疫荧光检测得到免疫荧光定位和表达量。
本发明的化妆品原料体外3D皮肤模型屏障修复功效的筛选方法，包含三种维度的两种模型，使得化妆品原料作用对象涵盖了正常皮肤表皮层和屏障受损皮肤表皮层，构建化妆品原料的屏障修复功效评价方法，属于系统型评估方法，具有快速、高效的优势；为皮肤护理产品屏障修复活性原料的前期验证及筛选提供快捷可靠的评价方法，为屏障修复原料的复配方案提供参考依据，也为护肤品行业动物替代实验、皮肤护理产品开发和功效验证的进一步研究提供有效依据。
附图说明
图1为受试物1～4的Episkin3D表皮组织存活率；
图2a为Episkin3D表皮模型基因FLG的相对表达量；
图2b为Episkin3D表皮模型基因LOR的相对表达量；
图2c为Episkin3D表皮模型基因CK10的相对表达量；
图3a为Episkin3D表皮模型蛋白FLG的免疫荧光和imageJ蛋白相对表达；
图3b为Episkin3D表皮模型蛋白LOR的免疫荧光和imageJ蛋白相对表达；
图3c为Episkin3D表皮模型蛋白CK10的免疫荧光和imageJ蛋白相对表达；
图4a为SDS损伤Episkin3D表皮模型基因FLG的相对表达量；
图4b为SDS损伤Episkin3D表皮模型基因LOR的相对表达量；
图4c为SDS损伤Episkin3D表皮模型基因CK10的相对表达量；
图5a为SDS损伤Episkin3D表皮模型蛋白FLG的免疫荧光和image J蛋白相对表达；
图5b为SDS损伤Episkin3D表皮模型蛋白LOR的免疫荧光和image J蛋白相对表达；
图5c为SDS损伤Episkin3D表皮模型蛋白CK10的免疫荧光和image J蛋白相对表达；
图6为受试物1～4的ET50值；
图7为本发明的化妆品原料体外3D皮肤模型屏障修复功效的筛选方法的流程图。
具体实施方式
为了使本技术领域的技术人员能更好地理解本发明的技术方案，下面结合附图对其具体实施方式进行详细地说明：
实施例中所用试剂和材料如无特殊说明均可从市场常规购得。
一、实验材料
1.实验材料及仪器
1.1 3D皮肤
3D皮肤来源于市售功能稳定的人重组3D表皮模型。本实施例中，EpiSkin 3D皮肤模型购自上海斯安肤诺生物科技有限公司。
1.2主要试剂
(1)3D皮肤培养相关试剂：EpiSkin维持培养基、EpiSkin检测培养基均购自上海斯安肤诺生物科技有限公司，DPBS购自美国Gibco公司；
(2)化学试剂、十二烷基磺酸钠(SDS)、噻唑蓝(MTT)、聚氧乙烯醚(TritonX100)、(牛血清蛋白)BSA均购自美国Sigma公司；DMSO、盐酸、异丙醇、PBS、乙醇、二甲苯、石蜡、柠檬酸、柠檬酸钠均购自国药集团化学试剂有限公司；DAPI染液购自上海碧云天生物技术有限公司。
(4)定量RT-PCR检测：PRC引物合成自上海生工生物科技有限公司、SYBR购自Roche罗氏试剂、GeneJET RNA Purification Kit试剂盒购自Thermo，反转录试剂盒PrimeScriptTMRT reagent Kit(Perfect Real Time)购自TaKaRa。
(5)免疫荧光检测：FLG、LOR、CK10的抗体分别购自Abcam。
1.3溶液配置
(1)噻唑蓝(MTT)溶液：称取MTT粉末100mg，加PBS20mL，涡旋振荡溶解，经0.22μm滤膜过滤除菌，-20℃避光保存，使用时4℃解冻；
(2)3D皮肤MTT检测液：MTT溶液在EpiSkin检测培养基中稀释至0.3mg/mL；
(3)3D皮肤酸化异丙醇萃取液：盐酸溶于异丙醇，终浓度为0.04mol/mL。
(4)柠檬酸钠：10mM柠檬酸钠(PH6.0)
(5)封闭液：0.025％TritonX100+1.5％BSA
1.4仪器
CO2培养箱(Thermo，美国)，正置显微镜(ZESS，德国)，生物安全柜(Thermo，美国)，高速低温离心机(Thermo，美国)，石蜡切片机(leica，德国)，包埋机(leica，德国)，摊片机(leica，德国)，Nanodrop(Thermo，美国)，实时荧光定量PCR
96(Roche，瑞士)
2.待测原料样品
原料样品即受试物的名称如表1所示：
| 编号 | 样品名称 |
| 1 | 活性物A |
| 2 | 活性物B |
| 3 | 活性物C |
| 4 | 活性物D |
表1
二、正常3D皮肤模型评估原料屏障修复活性
3D表皮模型经过运输后，放入12孔板内进行稳定培养，每孔2ml维持培养基，培养条件为37℃、5％CO2及饱和湿度，稳定培养12h后使用。
2.受试物3D皮肤毒性MTT检测
2.1 3D皮肤MTT检测
每种原料样品(受试物)用PBS稀释3个浓度，质量浓度分别为10％，5％和1％，每孔添加200μL于3D表皮模型上，于37℃、5％CO2及饱和湿度条件下培养36h，用DPBS缓冲液彻底冲洗以去除表皮模型表面的样品和阴性对照，用棉签将每个表皮模型表面残留液体轻轻吸干，进行后续MTT检测。
在12孔板中加入0.3mg/ml的MTT工作液，将表皮模型转移至孔内，确认没有气泡。将载有MTT溶液和表皮模型的培养板放在37℃，5％CO2，饱和湿度的CO2培养箱培养3h。使用打孔器取下表皮模型样块，用镊子轻柔的将表皮模型从胶原托上分离并翻转，将表皮与胶原托一并移入2ml离心管中，加入500μl酸化异丙醇，在涡旋振荡仪上混匀，室温避光过夜或4℃放置72h，萃取甲瓒。转移200μl酸化异丙醇萃取液，至96孔板，在570nm读取吸光度(OD值)，每一块表皮模型在96孔板上测试两个平行。
2.2 3D皮肤细胞活力分析
请参阅图1，细胞活力计算公式如下：
细胞存活率＝[(As-Ab)/(Ac-Ab)]x100％
式中：As为实验孔(含有3D皮肤的培养基、MTT、待受试物)OD值；
Ac为对照孔(含有3D皮肤的培养基、MTT、不含受试物)OD值；
Ab为空白孔(不含3D皮肤和受试物的培养基、MTT)OD值；
3D皮肤细胞90％活率(CV90)的计算公式为：
式中：a为细胞活率超过90％的最小值；c为细胞活率低于90％的最大值；b和d一一对应地表示a和c细胞活性对应的浓度；
根据公式计算表1中受试物1～4的细胞活力，选取CV90对应的浓度作为屏障修复验证给药浓度，图1为受试物1～4的Episkin3D表皮组织存活率。
3.正常3D皮肤模型定量RT-PCR基因表达检测
请参阅图2a、图2b和图2c，受试物选择CV90的浓度，每孔添加200μL于3D表皮模型上，于37℃、5％CO2及饱和湿度条件下培养16h-72h，用DPBS缓冲液彻底冲洗以去除表皮模型表面的样品和阴性对照，用棉签将每个表皮模型表面残留液体轻轻吸干,使用打孔器取下表皮模型样块，使用试剂盒GeneJET RNA Purification Kit对皮肤模型的RNA进行提取，参照试剂盒说明书。RNA浓度检测使用Nanodrop分光光度计，使用说明参照说明书。反转录使用PrimeScriptTMRT reagent Kit(Perfect Real Time)试剂盒，使用说明参照说明书。使用针对表2中的基因的引物序列，用
96(Roche)进行实时PCR。
| β-Acting正向引物 | GCAAAGACCTGTACGCCAAC |
| β-Acting反向引物 | GATCTTCATTGTGCTGGGTGC |
| FLG正向引物 | GAGGGCACTGAAAGGCAAAA |
| FLG反向引物 | CTTCCGTGCTGAGAGTGTCT |
| LOR正向引物 | CCAGACCCAGCAGAAGCAG |
| LOR反向引物 | TGCCCCTGGAAAACACCTC |
| CK10正向引物 | TTTTAGCCGTGGGAGCTCTG |
| CK10反向引物 | GAAACTGCCCCCTCCAAAGA |
表2
由
96 SW1.1计算的循环阈值(Ct值)对各样品的Acting mRNA归一化，计算得出受试物1～4在正常3D皮肤模型上的FLG、LOR和CK10的基因相对表达量。图2a显示了Episkin3D表皮模型基因FLG的相对表达量，图2b显示了Episkin3D表皮模型基因LOR的相对表达量；图2c显示了Episkin3D表皮模型基因CK10的相对表达量。
4.正常3D皮肤模型FLG/LOR/CK10免疫荧光检测
请参阅图3a、图3b和图3c，正常3D皮肤模型FLG/LOR/CK10免疫荧光检测流程如下：
用打孔器将皮肤模型材料切下，放置在4％组织固定液中固定，PBS清洗。梯度乙醇脱水。纯二甲苯浸泡，最后将皮肤材料浸泡在液体石蜡放入石蜡包埋系统中过夜。根据需要调整厚度计，以5-12μm厚度为宜。皮肤材料贴片后，100％二甲苯脱蜡2次，梯度复水，蒸馏水浸泡。10mM柠檬酸钠溶液(PH6.0)中，97℃抗原修复。用0.025％TritonX-100+1.5％BSA的PBS封闭液封闭1-2h。将抗体按照说明书及文献要求的比例进行稀释。封闭结束后，在载玻片上加100-200μl(封闭液+抗体)，用PARAFILM封口膜封。4℃杂一抗过夜。用PBS洗3次。用PBS作为稀释液，按照二抗的说明书对抗体进行稀释，稀释后，在载玻片上加100-200μl(封闭液+抗体)，用PARAFILM封口膜封，避光室温孵育1-2h。用PBS洗3次。用DAPI染液进行复染细胞核。用PBS洗3次。选择说明书推荐的荧光通道FITC和DAPI(385nm)荧光通过分别进行荧光观察，利用imageJ计算荧光强度。图3a为Episkin3D表皮模型蛋白FLG的免疫荧光和imageJ蛋白相对表达；图3b为Episkin3D表皮模型蛋白LOR的免疫荧光和imageJ蛋白相对表达；图3c为Episkin3D表皮模型蛋白CK10的免疫荧光和imageJ蛋白相对表达。
三、SDS损伤Episkin3D皮肤模型评估原料屏障修复活性
1.3D皮肤培养
3D表皮模型经过运输后，放入12孔板内进行稳定培养，每孔2ml维持培养基，培养条件为37℃、5％CO2及饱和湿度，稳定培养12h后使用。
2.受试物3D皮肤毒性MTT检测
2.1 3D皮肤MTT检测
每种原料样品(受试物)用PBS稀释3个浓度，质量浓度分别为5％，2％和1％，每孔添加200μL于3D表皮模型上，于37℃、5％CO2及饱和湿度条件下培养36h，用DPBS缓冲液彻底冲洗以去除表皮模型表面的样品和阴性对照，用棉签将每个表皮模型表面残留液体轻轻吸干，进行后续MTT检测。
在12孔板中加入0.3mg/ml的MTT工作液，将表皮模型转移至孔内，确认没有气泡。将载有MTT溶液和表皮模型的培养板放在37℃，5％CO2，饱和湿度的CO2培养箱培养3h。使用打孔器取下表皮模型样块，用镊子轻柔的将表皮模型从胶原托上分离并翻转，将表皮与胶原托一并移入2ml离心管中，加入500μl酸化异丙醇，在涡旋振荡仪上混匀，室温避光过夜或4℃放置72h，萃取甲瓒。转移200μl酸化异丙醇萃取液，至96孔板，在570nm读取吸光度(OD值)，每一块表皮模型在96孔板上测试两个平行。
2.2 3D皮肤细胞活力分析
细胞活力计算公式如下：
细胞存活率＝[(As-Ab)/(Ac-Ab)]x100％
式中：As为实验孔(含有3D皮肤的培养基、MTT、待受试物)OD值；
Ac为对照孔(含有3D皮肤的培养基、MTT、不含受试物)OD值；
Ab为空白孔(不含3D皮肤和受试物的培养基、MTT)OD值；
3D皮肤细胞90％活率(CV90)的计算：
式中：a为细胞活率超过90％的最小值；c为细胞活率低于90％的最大值；b和d一一对应地表示a和c细胞活性对应的浓度。
根据上述公式计算受试物的细胞活力，选取CV90对应的浓度作为抗炎验证给药浓度。
3.SDS损伤Episkin3D皮肤模型定量RT-PCR基因表达检测
请参阅4a、图4b和图4c，取生长状态稳定的3D皮肤，经SDS处理5min～30min后，设置诱导对照组及样品组，诱导对照组加入缓冲液，样品组加入CV90对应给药浓度的原料样品，每孔添加200μL于3D表皮模型上，于37℃、5％CO2及饱和湿度条件下培养16h～72h，用DPBS缓冲液彻底冲洗以去除表皮模型表面的样品和阴性对照，用棉签将每个表皮模型表面残留液体轻轻吸干,使用打孔器取下表皮模型样块，使用试剂盒GeneJET RNAPurification Kit对皮肤模型的RNA进行提取，参照试剂盒说明书。RNA浓度检测使用Nanodrop分光光度计，使用说明参照说明书。反转录使用PrimeScriptTMRT reagent Kit(Perfect Real Time)试剂盒，使用说明参照说明书。使用针对表2的基因的引物序列，用
96(Roche)进行实时PCR。由
96SW1.1计算的循环阈值(Ct值)对各样品的Acting mRNA归一化，计算得到受试物1～4在正常3D皮肤模型上的FLG、LOR和CK10的基因相对表达量。图4a显示了SDS损伤Episkin3D表皮模型基因FLG的相对表达量；图4b显示了SDS损伤Episkin3D表皮模型基因LOR的相对表达量；图4c显示了SDS损伤Episkin3D表皮模型基因CK10的相对表达量。
4.SDS损伤Episkin3D皮肤模型FLG/LOR/CK10免疫荧光检测
请参阅图5a、图5b和图5c，SDS损伤3D皮肤模型FLG/LOR/CK10免疫荧光检测流程如下：
用打孔器将皮肤模型材料切下，放置在4％组织固定液中固定，PBS清洗。梯度乙醇脱水。纯二甲苯浸泡，最后将皮肤材料浸泡在液体石蜡放入石蜡包埋系统中过夜。根据需要调整厚度计，以5-12μm厚度为宜。皮肤材料贴片后，100％二甲苯脱蜡2次，梯度复水，蒸馏水浸泡。10mM柠檬酸钠溶液(PH6.0)中，97℃抗原修复。用0.025％TritonX-100+1.5％BSA的PBS封闭液封闭1-2h。将抗体按照说明书及文献要求的比例进行稀释。封闭结束后，在载玻片上加100-200μl(封闭液+抗体)，用PARAFILM封口膜封。4℃杂一抗过夜。用PBS洗3次。用PBS作为稀释液，按照二抗的说明书对抗体进行稀释，稀释后，在载玻片上加100-200μl(封闭液+抗体)，用PARAFILM封口膜封，避光室温孵育1-2h。用PBS洗3次。用DAPI染液进行复染细胞核。用PBS洗3次。选择说明书推荐的荧光通道和DAPI(385nm)荧光通过分别进行荧光观察，利用imageJ计算荧光强度。图5a显示了SDS损伤Episkin3D表皮模型蛋白FLG的免疫荧光和image J蛋白相对表达；图5b显示了SDS损伤Episkin3D表皮模型蛋白LOR的免疫荧光和image J蛋白相对表达；图5c显示了SDS损伤Episkin3D表皮模型蛋白CK10的免疫荧光和image J蛋白相对表达。
四、3D皮肤模型ET50值原料屏障修复活性
生长状态稳定的3D皮肤，设置诱导对照组及样品组，诱导对照组加入SDS和缓冲液，样品组加入SDS和CV90对应给药浓度的原料样品，培养12h～48h，经过缓冲液的冲洗后，诱导对照组及样品组加入TritonX-100，设置培养时间5min-5h，检测时间点5min、20min、1h、2h、3h、4h、5h下的皮肤模型的MTT值，计算组织活性，通过SPSS计算ET50值。
五、结果分析
应用GraphPad Prism作图，结果表示为Mean±SD。各组间比较采用Two-way ANOVA统计分析。所有的统计分析均为双尾。p<0.05认为具有显著差异，用“*”表示，p<0.01认为具有非常显著差异，用“**”表示，p<0.001认为具有极显著差异，用“***”表示。
5.1正常3D皮肤模型评估原料屏障修复活性检测结果
5.1.1受试物3D皮肤毒性检测
受试物(原料样品)1～4的细胞存活率MTT检测结果如图1所示，根据所得结果按照公式计算CV90，待测样品在3D皮肤模型上的CV90对应浓度如表3所示，后续给药按照该浓度进行孵育。
| 编号 | CV90 |
| 1 | 5％ |
| 2 | 10％ |
| 3 | 2％ |
| 4 | 2％ |
表3
5.1.2 Episkin3D表皮模型基因FLG、LOR、CK10的相对表达量
收集3D皮肤组织，GeneJET RNA Purification Kit对皮肤模型的RNA进行提取，参照试剂盒说明书。RNA浓度检测使用Nanodrop分光光度计，使用说明参照说明书。反转录使用PrimeScriptTMRT reagent Kit(Perfect Real Time)试剂盒，使用说明参照说明书。使用针对下述基因的引物对，用
96(Roche)进行实时PCR。由
96SW1.1计算的循环阈值(Ct值)对各样品的Acting mRNA归一化，并计算以PBS诱导组为对照的相对表达量。FLG基因相对表达量如图2a所示，LOR及CK10基因相对表达量如图2b和2c所示，*P<0.05,**P<0.01，***P<0.001，****P<0.0001为样品组与PBS诱导对照组对比。
5.1.3 Episkin3D表皮模型蛋白FLG、LOR和CK10的免疫荧光和imageJ蛋白相对表达
收集3D皮肤组织，进行免疫荧光染色实验。将抗体按照说明书及文献要求的比例进行稀释，分别进行抗体杂交。利用荧光显微镜进行拍照，利用imageJ计算荧光强度，并计算以PBS诱导组为对照的蛋白相对表达量。FLG基因相对表达量如图3a所示，LOR及CK10基因相对表达量如图3b和3c所示，*P<0.05,**P<0.01，***P<0.001，****P<0.0001为样品组与PBS诱导对照组对比。
5.2 SDS损伤Episkin3D皮肤模型评估原料屏障修复活性检测结果
5.1.1受试物3D皮肤毒性检测
受试物(原料样品)1～4的细胞存活率MTT检测结果如图1所示，根据所得结果按照公式计算CV90，待测样品在3D皮肤模型上的CV90对应浓度如表2所示，后续给药按照该浓度进行孵育。
5.1.2 SDS损伤Episkin3D表皮模型基因FLG、LOR、CK10的相对表达量
收集3D皮肤组织，GeneJET RNA Purification Kit对皮肤模型的RNA进行提取，参照试剂盒说明书。RNA浓度检测使用Nanodrop分光光度计，使用说明参照说明书。反转录使用PrimeScriptTMRT reagent Kit(Perfect Real Time)试剂盒，使用说明参照说明书。使用针对下述基因的引物对，用
96(Roche)进行实时PCR。由
96 SW1.1计算的循环阈值(Ct值)对各样品的Acting mRNA归一化，并计算以PBS诱导组为对照的相对表达量。FLG基因相对表达量如图4a所示，LOR及CK10基因相对表达量如图4b和4c所示，*P<0.05,**P<0.01，***P<0.001，****P<0.0001为样品组与SDS诱导对照组对比。
5.1.3 SDS损伤Episkin3D表皮模型蛋白FLG、LOR和CK10的免疫荧光和image J蛋白相对表达
收集3D皮肤组织，进行免疫荧光染色实验。将抗体按照说明书及文献要求的比例进行稀释，分别进行抗体杂交。利用荧光显微镜进行拍照，利用image J计算荧光强度，并计算以SDS诱导组为对照的蛋白相对表达量。FLG基因相对表达量如图5a所示，LOR及CK10基因相对表达量如图5b和5c所示，*P<0.05,**P<0.01，***P<0.001，****P<0.0001为样品组与SDS诱导对照组对比。
5.3 3D皮肤模型ET50值评价
请参阅图6，样品组加入SDS和CV90对应给药浓度的原料样品，培养12h～48h，经过缓冲液的冲洗后，诱导对照组及样品组加入TritonX-100，设置培养时间5min-5h，检测时间点5min、20min、1h、2h、3h、4h、5h下的皮肤模型的MTT值，计算组织活性，通过SPSS计算ET50值(见图6)。依次进行排序，低于诱导对照组评分为0；高于诱导对照组评分依次按照数值的高低排序，高于诱导对照组评分为0.1。
5.4综合评估结果及分析
所有受试物按照图7所示流程进行评估，本实施例中检测的4个受试物在正常3D皮肤、SDS损伤3D皮肤水平的实验显著性差异结果汇总一一对应地如表4和表5所示，3D皮肤模型ET50值的结果汇总如表6，依据表7的评分标准进行评估及打分，受试物屏障修复功效评估结果如表8所示，根据汇总得分结果进行排序，本批受试物均具有屏障修复功效，功效强度排序为受试物1>受试物3>受试物2>受试物4，筛选得到最佳屏障修复功效原料为活性物A。
表4
表5
| 编号 | ET50值(min) | 得分 |
| 1 | 18.175 | 0.1 |
| 2 | 19.647 | 0.1 |
| 3 | 22.363 | 0.1 |
| 4 | 20.823 | 0.1 |
| 对照组 | 14.142 | 0 |
表6
表7
表8
请参阅图7，本发明的化妆品原料体外3D皮肤模型屏障修复功效的筛选方法，包括以下步骤：
S1，评估原料样品的溶解性，确定溶解方案：水中溶解度≥1000μg/mL的原料样品直接溶于培养基进行后续实验；
水中溶解度＜1000μg/mL的原料样品用二甲基亚砜或乙醇溶剂溶解后进行后续实验；使用二甲基亚砜或乙醇作为溶剂时，溶剂的体积百分比浓度不得超过总体积的1％，且对照样品和实验样品中溶剂的体积比例相同；
S2，3D皮肤培养：3D皮肤采购配套专用培养基进行气液两相培养，所有培养条件均为37±0.5℃，(5±1)％CO2浓度，饱和湿度；
S3，3D皮肤活性检测确定原料样品检测浓度，包括以下工序：
S31，取步骤S2中生长状态稳定3D皮肤，加入实验样品，所述实验样品包含若干个不同浓度梯度原料样品，对照样品为不添加任何样品的缓冲液，培养24h～48h，用MTT检测3D皮肤组织存活率；种待测原料样品配置CV90对应的给药浓度，每个浓度设2个及以上复孔；
S32，步骤S32筛选得到CV90时对应的原料样品3D皮肤模型给药浓度，所述CV90代表3D皮肤组织存活率为90％；
S4，正常3D皮肤模型的基因表达检测及免疫荧光检测步骤，包括以下工序：
S41，取步骤S2中生长状态稳定的3D皮肤，设置诱导对照组及样品组，所述诱导对照组加入缓冲液，所述样品组加入步骤S32中CV90对应给药浓度的原料样品，将诱导对照组及样品组分别培养16h～72h，；
S42，步骤S41中培养完成的正常3D皮肤模型进行收集，分别实施正常3D皮肤模型中FLG、LOR和CK10的基因表达检测；
S43，步骤S41中培养完成的正常3D皮肤模型进行收集，通过石蜡包埋和切片，分别实施正常3D皮肤模型中FLG、LOR和CK10的免疫荧光表达检测；
S5，SDS损伤3D皮肤模型的基因表达检测及免疫荧光检测步骤，包括以下工序：
S51，取步骤S2中生长状态稳定的3D皮肤，SDS处理浓度为0.1％～1.0％，经SDS处理5min～30min后，设置诱导对照组及样品组，所述诱导对照组加入DPB缓冲液，所述样品组加入步骤S32中CV90对应给药浓度的原料样品，将诱导对照组及样品组分别培养16h～72h；
S52，步骤S51中培养完成的SDS损伤3D皮肤模型进行收集，分别实施SDS损伤3D皮肤模型中FLG、LOR和CK10的基因表达检测；
S53，步骤S51中培养完成的SDS损伤3D皮肤模型进行收集，通过石蜡包埋和切片，分别实施SDS损伤3D皮肤模型中FLG、LOR和CK10的免疫荧光表达检测；
S6，SDS持续损伤模型ET50值检测步骤：取步骤S2中生长状态稳定的3D皮肤，设置诱导对照组及样品组，诱导对照组加入SDS和DPBS缓冲液，样品组加入SDS和步骤S32中CV90对应给药浓度的原料样品，培养12h～48h，经过DPBS缓冲液的冲洗后，诱导对照组及样品组加入TritonX-100，设置培养时间5min-5h，检测时间点5min、20min、1h、2h、3h、4h、5h下的皮肤模型的MTT值，计算组织活性，通过SPSS计算ET50值；TritonX-100处理浓度为0.1％～5.0％；
S7，评价步骤，具体包括以下内容：
S71，基因相对表达量评价步骤：汇总步骤S42和S52中基因表达检测结果，计算检测原料样品组基因表达与诱导组基因表达比值，得到基因的相对表达量，应用GraphPadPrism作图，结果表示为Mean±SD；各组间比较采用Two-way ANOVA统计分析；所有的统计分析均为双尾；
p<0.05认为具有显著差异，用“*”表示，说明该受试物具有一定修复作用，评分为0.3；
p<0.01认为具有非常显著差异，用“**”表示，说明该受试物具有显著修复作用，评分为0.5；
p<0.001认为具有极显著差异，用“***”表示，说明该受试物具有极其显著修复作用，评分为0.7；
p<0.0001认为具有极其显著差异，用“****”表示，说明该受试物具有极其显著修复作用，评分为1.0；
S72，免疫荧光表达评价步骤：汇总步骤S43和S53中免疫荧光表达检测结果，应用Image J计算荧光强度，结果表示为Mean±SD；按照荧光强度进行排序，数值越高，说明受试物的修复作用越强，依次进行排序，低于诱导对照组评分为0；高于诱导对照组评分依次按照数值的高低排序；
S73，SDS持续损伤模型ET50值评价步骤：汇总步骤S6中的ET50值，进行ET50值的比较，数值越高，则受试物的修复作用越强，依次进行排序，低于诱导对照组评分为0；高于诱导对照组评分依次按照数值的高低排序给分，高于诱导对照组评分为0.1；
S8，根据步骤S7的评分标准汇总所有检测指标评分，由此筛选出具有最佳屏障修复功效的原料。
正常3D皮肤模型和SDS损伤3D皮肤模型两种模型中，所检测的FLG、LOR、CK10的基因表达检测中至少一种基因表达检测构成转录组学水平评价指标，所检测的FLG、LOR、CK10的免疫荧光表达检测中至少一种免疫荧光表达检测构成蛋白组学水平评价指标；SDS持续损伤3D皮肤模型所检测的ET50值构成毒理学水平评价指标。
综上所述，本发明的化妆品原料体外3D皮肤模型屏障修复功效的筛选方法，包含三种维度的两种模型，使得化妆品原料作用对象涵盖了正常皮肤表皮层和屏障受损皮肤表皮层，构建化妆品原料的屏障修复功效评价方法，属于系统型评估方法，具有快速、高效的优势；为皮肤护理产品屏障修复活性原料的前期验证及筛选提供快捷可靠的评价方法，为屏障修复原料的复配方案提供参考依据，也为护肤品行业动物替代实验、皮肤护理产品开发和功效验证的进一步研究提供有效依据。
本技术领域中的普通技术人员应当认识到，以上的实施例仅是用来说明本发明，而并非用作为对本发明的限定，只要在本发明的实质精神范围内，对以上所述实施例的变化、变型都将落在本发明的权利要求书范围内。
Claims (10)
1.一种化妆品原料体外3D皮肤模型屏障修复功效的筛选方法，其特征在于，结合正常3D皮肤模型、SDS损伤3D皮肤模型和SDS持续损伤模型检测结果，对目标原料的屏障修复活性进行筛选，具体包括以下步骤：
S1，评估原料样品的溶解性，确定溶解方案；
S2，3D皮肤培养；
S3，3D皮肤活性检测确定原料样品检测浓度，包括以下工序：
S31，取步骤S2中生长状态稳定3D皮肤，加入实验样品，所述实验样品包含若干个不同浓度梯度原料样品，对照样品为不添加任何样品的缓冲液，培养24h～48h，用MTT检测3D皮肤组织存活率；
S32，步骤S32筛选得到CV90时对应的原料样品3D皮肤模型给药浓度，所述CV90代表3D皮肤组织存活率为90％；
S4，正常3D皮肤模型的基因表达检测及免疫荧光检测步骤，包括以下工序：
S41，取步骤S2中生长状态稳定的3D皮肤，设置诱导对照组及样品组，所述诱导对照组加入缓冲液，所述样品组加入步骤S32中CV90对应给药浓度的原料样品，将诱导对照组及样品组分别培养16h～72h，；
S42，步骤S41中培养完成的正常3D皮肤模型进行收集，分别实施正常3D皮肤模型中FLG、LOR和CK10的基因表达检测；
S43，步骤S41中培养完成的正常3D皮肤模型进行收集，通过石蜡包埋和切片，分别实施正常3D皮肤模型中FLG、LOR和CK10的免疫荧光表达检测；
S5，SDS损伤3D皮肤模型的基因表达检测及免疫荧光检测步骤，包括以下工序：
S51，取步骤S2中生长状态稳定的3D皮肤，经SDS处理5min～30min后，设置诱导对照组及样品组，所述诱导对照组加入缓冲液，所述样品组加入步骤S32中CV90对应给药浓度的原料样品，将诱导对照组及样品组分别培养16h～72h；
S52，步骤S51中培养完成的SDS损伤3D皮肤模型进行收集，分别实施SDS损伤3D皮肤模型中FLG、LOR和CK10的基因表达检测；
S53，步骤S51中培养完成的SDS损伤3D皮肤模型进行收集，通过石蜡包埋和切片，分别实施SDS损伤3D皮肤模型中FLG、LOR和CK10的免疫荧光表达检测；
S6，SDS持续损伤模型ET50值检测步骤：取步骤S2中生长状态稳定的3D皮肤，设置诱导对照组及样品组，诱导对照组加入SDS和缓冲液，样品组加入SDS和步骤S32中CV90对应给药浓度的原料样品，培养12h～48h，经过缓冲液的冲洗后，诱导对照组及样品组加入TritonX-100，设置培养时间5min-5h，检测时间点5min、20min、1h、2h、3h、4h、5h下的皮肤模型的MTT值，计算组织活性，通过SPSS计算ET50值；
S7，评价步骤，具体包括以下内容：
S71，基因相对表达量评价步骤：汇总步骤S42和S52中基因表达检测结果，计算检测原料样品组基因表达与诱导组基因表达比值，得到基因的相对表达量，应用GraphPad Prism作图，结果表示为Mean±SD；各组间比较采用Two-way ANOVA统计分析；所有的统计分析均为双尾；
p<0.05认为具有显著差异，用“*”表示，说明该受试物具有一定修复作用，评分为0.3；
p<0.01认为具有非常显著差异，用“**”表示，说明该受试物具有显著修复作用，评分为0.5；
p<0.001认为具有极显著差异，用“***”表示，说明该受试物具有极其显著修复作用，评分为0.7；
p<0.0001认为具有极其显著差异，用“****”表示，说明该受试物具有极其显著修复作用，评分为1.0；
S72，免疫荧光表达评价步骤：汇总步骤S43和S53中免疫荧光表达检测结果，应用ImageJ计算荧光强度，结果表示为Mean±SD；按照荧光强度进行排序，数值越高，说明受试物的修复作用越强，依次进行排序，低于诱导对照组评分为0；高于诱导对照组评分依次按照数值的高低排序；
S73，SDS持续损伤模型ET50值评价步骤：汇总步骤S6中的ET50值，进行ET50值的比较，数值越高，则受试物的修复作用越强，依次进行排序，低于诱导对照组评分为0；高于诱导对照组评分依次按照数值的高低排序给分，高于诱导对照组评分为0.1；
S8，根据步骤S7的评分标准汇总所有检测指标评分，由此筛选出具有最佳屏障修复功效的原料。
2.根据权利要求1所述的一种化妆品原料体外3D皮肤模型屏障修复功效的筛选方法，其特征在于，正常3D皮肤模型和SDS损伤3D皮肤模型两种模型中，所实施的FLG、LOR、CK10的基因表达检测中至少一种基因表达检测构成转录组学水平评价指标，所实施的FLG、LOR、CK10的免疫荧光表达检测中至少一种免疫荧光表达检测构成蛋白组学水平评价指标；SDS持续损伤3D皮肤模型所检测的ET50值构成毒理学水平评价指标。
3.根据权利要求1所述的一种化妆品原料体外3D皮肤模型屏障修复功效的筛选方法，其特征在于，步骤S1中，水中溶解度≥1000μg/mL的原料样品直接溶于培养基进行后续实验；
水中溶解度＜1000μg/mL的原料样品用二甲基亚砜溶剂溶解后进行后续实验。
4.根据权利要求3所述的一种化妆品原料体外3D皮肤模型屏障修复功效的筛选方法，其特征在于，使用二甲基亚砜作为溶剂时，溶剂的体积百分比浓度不得超过总体积的5％，且对照样品和实验样品中溶剂的体积比例相同。
5.根据权利要求1所述的一种化妆品原料体外3D皮肤模型屏障修复功效的筛选方法，其特征在于，步骤S2中，3D皮肤采购配套专用培养基进行气液两相培养，所有培养条件均为37±0.5℃，(5±1)％CO2浓度，饱和湿度。
6.根据权利要求1所述的一种化妆品原料体外3D皮肤模型屏障修复功效的筛选方法，其特征在于，步骤S31中，每种待测原料样品配置CV90对应的给药浓度，每个浓度设2个及以上复孔。
7.根据权利要求1所述的一种化妆品原料体外3D皮肤模型屏障修复功效的筛选方法，其特征在于，步骤S51中，SDS处理浓度为0.1％～1.0％，所述缓冲液为DPBS缓冲液。
8.根据权利要求1所述的一种化妆品原料体外3D皮肤模型屏障修复功效的筛选方法，其特征在于，步骤S6中，所述TritonX-100处理浓度为0.1％～5.0％，所述缓冲液为DPBS缓冲液。
9.根据权利要求1所述的一种化妆品原料体外3D皮肤模型屏障修复功效的筛选方法，其特征在于，步骤S42和步骤S52中，FLG、LOR和CK10的基因表达检测采用定量RT-PCR法。
10.根据权利要求1所述的一种化妆品原料体外3D皮肤模型屏障修复功效的筛选方法，其特征在于，步骤S43和步骤S53中，FLG、LOR和CK10的免疫荧光表达是对相应的皮肤模型进行免疫荧光检测得到免疫荧光定位和表达量。
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Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20180252715A1 (en) * | 2015-11-12 | 2018-09-06 | Korea Institute Of Science And Technology | Three-dimensional fibroblast aggregate and in vitro 3d skin dermis model comprising same |
| CN110684714A (zh) * | 2018-07-05 | 2020-01-14 | 广东博溪生物科技有限公司 | 一种屏障功能弱化模型的构建方法 |
| CN110940813A (zh) * | 2019-10-31 | 2020-03-31 | 广州市华代生物科技有限公司 | 一种采用重建正常人体三维皮肤模型评价修复功能的体外方法 |
| CN113041192A (zh) * | 2021-03-24 | 2021-06-29 | 湖北省麦诗特生物科技有限公司 | 通过3d婴儿皮肤评估模型测定具有提升婴儿皮肤屏障功能的化妆品组合物 |
| CN113549670A (zh) * | 2021-07-20 | 2021-10-26 | 云南贝泰妮生物科技集团股份有限公司 | 一种体外细胞与3d表皮模型共培养的化妆品致敏评价方法 |
| CN113652392A (zh) * | 2021-08-17 | 2021-11-16 | 云南贝泰妮生物科技集团股份有限公司 | 一种基于体外巨噬细胞与3d皮肤模型共培养的化妆品抗炎功效评估方法 |
-
2021
- 2021-12-02 CN CN202111458250.6A patent/CN114107429A/zh active Pending
Patent Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20180252715A1 (en) * | 2015-11-12 | 2018-09-06 | Korea Institute Of Science And Technology | Three-dimensional fibroblast aggregate and in vitro 3d skin dermis model comprising same |
| CN110684714A (zh) * | 2018-07-05 | 2020-01-14 | 广东博溪生物科技有限公司 | 一种屏障功能弱化模型的构建方法 |
| CN110940813A (zh) * | 2019-10-31 | 2020-03-31 | 广州市华代生物科技有限公司 | 一种采用重建正常人体三维皮肤模型评价修复功能的体外方法 |
| CN113041192A (zh) * | 2021-03-24 | 2021-06-29 | 湖北省麦诗特生物科技有限公司 | 通过3d婴儿皮肤评估模型测定具有提升婴儿皮肤屏障功能的化妆品组合物 |
| CN113549670A (zh) * | 2021-07-20 | 2021-10-26 | 云南贝泰妮生物科技集团股份有限公司 | 一种体外细胞与3d表皮模型共培养的化妆品致敏评价方法 |
| CN113652392A (zh) * | 2021-08-17 | 2021-11-16 | 云南贝泰妮生物科技集团股份有限公司 | 一种基于体外巨噬细胞与3d皮肤模型共培养的化妆品抗炎功效评估方法 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| GERTRUDE-EMILIA COSTIN ET AL.: "In vitro safety testing strategy for skin irritation using the 3D reconstructed human epidermis", ROM. J. BIOCHEM, vol. 46, no. 2, 31 December 2009 (2009-12-31), pages 165 - 186 * |
| 张艳云 等: "三维表皮模型Epikutis® 参考品的研制", 药物分析杂志, vol. 39, no. 12, 31 December 2019 (2019-12-31), pages 2117 * |
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