CN113041192A - 通过3d婴儿皮肤评估模型测定具有提升婴儿皮肤屏障功能的化妆品组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种通过3D婴儿皮肤评估模型测定具有提升婴儿皮肤屏障功能的化妆品组合物及其制备方法。该化妆品组合物包含：1.0‑30.0％的婴儿促屏障功效成分、5.0‑40.0％的润肤剂、0.5‑30.0％的乳化剂、0.5‑20.0％的填充剂、0.1‑10.0％的增稠剂、0.3‑5.0％的防腐剂、0.05‑0.5％的EDTA‑2NA、0.01‑1.0％的日用香精及去离子水余量。该婴儿促屏障功效成分包含玫瑰花提取物、白鸢尾根提取物、百合花油、草棉提取物。本发明通过3D婴儿皮肤评估模型测定，可以帮助验证和筛选出对婴儿皮肤有强化屏障功能，保湿，修复功效的活性成分。

Description

通过3D婴儿皮肤评估模型测定具有提升婴儿皮肤屏障功能的 化妆品组合物
技术领域
本发明涉及一种化妆品组合物，属于日用化学品技术领域，更具体地是涉及一种通过3D婴儿皮肤评估模型测定具有提升婴儿皮肤屏障功能的化妆品组合物及其制备方法。
背景技术
婴儿的皮肤在结构、功能和组成上与成人皮肤不同，使婴儿的皮肤比成人皮肤更细腻和脆弱。婴儿皮肤的阻隔功能以及水保持和运输特性已经证明与成人不同，并且一直贯穿于生命的生长过程中。经研究发现婴儿皮肤在休息时含水量较高，透水率较高，吸收更多水分，并比成人皮肤更快地吸收多余的水。随着婴儿皮肤在生命的最初几年不断变化，需要用适当的护肤品解决其动态特性。
丝聚合蛋白对于皮肤屏障是至关重要的，它可以保护身体免受外来环境物质的入侵，而外来环境物质可能会引发异常的免疫反应。丝聚合蛋白是角质层的主要结构蛋白,这是表示在终末分化角质化细胞最外层的表皮和透明角质颗粒的主要成分在颗粒层。中间丝相关蛋白的关键作用在表皮功能是常见的皮肤致病基因的重要性和过敏性疾病。它被认为是终末表皮分化的共同标志。
肌肤紧密连接和claudin-1对皮肤屏障功能很重要。在Mikio Furuse的研究中，claudin-1缺陷小鼠出生时表皮屏障受损，皮肤起皱，出生后1天内死亡。先前的研究也表明，小鼠的claudin-1缺失导致经皮失水(TEWL)增强。
Caspase-14属于一个特异性的门冬氨酸特异性蛋白酶家族。它的表达几乎只局限于表皮下层和毛囊。此外，caspase-14的蛋白水解激活与角质层的形成有关，表明caspase-14参与角质形成细胞的终末分化和角化。研究表明，caspase-14缺乏的表皮的特征是皮肤水合水平降低，水分流失增加。
总之，如何采用婴儿皮肤模型去反应人类婴儿皮肤的关键特征，并结合活性成分进行治疗，改善皮肤水化反应，是当前所属领域技术人员急需解决的技术难题。
发明内容
本发明的目的是提供一种通过3D婴儿皮肤评估模型测定具有提升婴儿皮肤屏障功能的化妆品组合物，通过3D婴儿皮肤评估模型测定，可以帮助验证和筛选出对婴儿皮肤有强化屏障功能，保湿，修复功效的活性成分。
本发明的另一目的是提供一种上述具有通过3D婴儿皮肤评估模型测定具有提升婴儿皮肤屏障功能的化妆品组合物的制备方法。
本发明是通过以下的技术方案来实现的。
一种通过3D婴儿皮肤评估模型测定具有提升婴儿皮肤屏障功能的化妆品组合物，按重量百分比计，所述化妆品组合物是由以下的原料组成：
1.0-30.0％的婴儿促屏障功效成分，所述婴儿皮肤屏障功效修复成分，按组合物的总重计，包含：玫瑰(ROSA RUGOSA)花提取物0.25-20％；白鸢尾(IRIS PALLIDA)根提取物0.25-20％；百合(LILIUM BROWNII)花油0.25-30％；草棉(GOSSYPIUM HERBACEUM)提取物0.25-30％；
Figure BDA0002989839760000021
上述具有提升婴儿皮肤屏障功能的化妆品组合物，按组合物的总重量计，该化妆品组合物是由以下组分组成：
提升婴儿皮肤屏障功能10.0-30.0％，所述提升婴儿皮肤屏障功能包含：按组合物的总重计，包含：玫瑰(ROSA RUGOSA)花提取物2.5-10％；白鸢尾(IRIS PALLIDA)根提取物2.5-10％；百合(LILIUM BROWNII)花油2.5-20％；草棉(GOSSYPIUM HERBACEUM)提取物2.5-20％；
Figure BDA0002989839760000022
Figure BDA0002989839760000031
上述具有提升婴儿皮肤屏障功能的化妆品组合物，按组合物的总重量计，所述提升婴儿皮肤屏障功能包含以下原料组分：
i)玫瑰(ROSA RUGOSA)花提取物5-10％；
j)白鸢尾(IRIS PALLIDA)根提取物5-10％；
k)百合(LILIUM BROWNII)花油5-20％；
l)草棉(GOSSYPIUM HERBACEUM)提取物5-20％
上述具有提升婴儿皮肤屏障功能的化妆品组合物，按组合物的总重量计，所述提升婴儿皮肤屏障功能包含以下原料组分：
m)玫瑰(ROSA RUGOSA)花提取物0.5-5％；
n)白鸢尾(IRIS PALLIDA)根提取物0.5-5％；
o)百合(LILIUM BROWNII)花油0.5-10％；
p)草棉(GOSSYPIUM HERBACEUM)提取物0.5-10％。
上述具有提升婴儿皮肤屏障功能的化妆品组合物，所述润肤剂选自辛酸癸酸甘油三酯，角鲨烷，鳄梨油，乳木果油，霍霍巴油，甘油，丁二醇，己二醇，戊二醇，聚二甲基硅氧烷，聚二甲基硅氧烷醇，PEG-11甲醚聚二甲基硅氧烷，植物甾醇，植物甾醇/辛基十二烷基月桂酰谷氨酸，氢化聚异丁烯，菜籽油，聚癸烯，大豆油，橄榄油，异十二烷，异十六烷，硬脂醇，山嵛醇中的至少一种。
所述乳化剂选自橄榄油PEG-7酯类、PEG-8辛酸/癸酸甘油酯类、山梨坦橄榄油酸酯、聚山梨醇酯-20、月桂醇聚醚-23、PEG-40硬脂酸酯、硬脂醇聚醚-21、棕榈醇和PEG-75硬脂酸酯和甘油硬脂酸酯和硬脂醇聚醚-20的混合物、聚山梨醇酯-80、大豆卵磷脂PC60、硬脂酸甘油酯和PEG-75硬脂酸酯的混合物、泊洛沙姆407、PEG-30二聚羟基硬脂酸酯、鲸蜡硬脂醇聚醚-25中的至少一种。
所述填充剂选自二氧化钛、云母、氮化硼、聚甲基硅倍半氧烷、硅藻土、高岭土、乙酸纤维素、淀粉辛基琥铂酸铝、滑石粉、硫酸钡、火山灰中的至少一种。
所述增稠剂选自羟乙基纤维素，黄原胶，卡波姆，丙烯酸(酯)类/共聚物，聚合物EMT-10,聚丙烯酸酯交联聚合物-6，丙烯酸钠/丙烯酰二甲基牛磺酸钠共聚物，丙烯酸(酯)类/C10-30烷醇丙烯酸酯交联聚合物，丙烯酰二甲基牛磺酸胺/VP共聚物，丙烯酸(酯)类/C10-30烷醇丙烯酸酯交联聚合物，聚乙烯，阿拉伯树胶中的至少一种。
所述防腐剂选自苯氧乙醇，乙基己基甘油，戊二醇，己二醇，馨酰酮，苯甲酸钠，三氯生，氯苯甘醚中的至少一种。
另外，本发明还公开了一种上述具有提升婴儿皮肤屏障功能的化妆品组合物的制备方法，包括以下工艺步骤：
1)将增稠剂在水中润湿分散完全，得混合液；
2)向步骤1)中的混合液加入提升婴儿皮肤屏障功能、润肤剂、填充剂、防腐剂和EDTA-2NA，加热至65℃，3000r/min均质3分钟使其分散完全；
3)向步骤2)中加入乳化剂和日用香精，3000r/min均质3分钟使其乳化完全，加热至65℃，得到具有婴儿促屏障功效的化妆品组合物。
另外，本发明还公开了一种婴儿促屏障功效的化妆品，其是通过3D婴儿皮肤模型验证据有婴儿促屏障修护功效。
本发明的化妆品组合物通过3D婴儿皮肤评估模型测定，3D婴儿皮肤等效模型，通过从接受整形手术的婴儿捐赠者(2岁以下)获得的健康皮肤活组织，建立了正常人真皮成纤维细胞(NHDF)和表皮角质形成细胞(NHEK)的原代培养模型。具有自然婴儿皮肤特点，可以作为3D全层婴儿皮肤功效测评模型。
用0.005％活性成分混合处理的婴儿3D皮肤模型显著增加了丝聚合蛋白、克劳丁-1(claudin-1)、半胱氨酸蛋白酶-14(caspase-14)的表达，分别增加了9.0％、41.3％和38.2％。考察活性物组分治疗对婴儿皮肤模型中IL-6浓度的没有明显变化，表明活性物有没有炎症刺激。可以帮助验证和筛选出对婴儿皮肤有强化屏障功能，保湿，修复功效的活性成分。
另外，本发明还进一步公开了一种3D婴儿皮肤等效模型检测方法，具有自然婴儿皮肤特点，可以作为婴儿皮肤功效测评模型。
对婴儿皮肤模型中的下列指标，丝聚合蛋白、克劳丁-1(claudin-1)、半胱氨酸蛋白酶-14(caspase-14)和透明质酸进行了组织学和免疫病理学分析。考察活性物组分治疗对婴儿皮肤模型中IL-6浓度的影响，表明活性物有没有炎症刺激。可以帮助验证和筛选出对婴儿皮肤有强化屏障功能，保湿，修复功效的活性成分。
上述3D婴儿皮肤等效模型检测方法，具体包括如下步骤：
步骤1：细胞分离，根据法国法规(DC No.2014-2281)包含向研究部申报，通过从接受整形手术的婴儿捐赠者(2岁以下)获得的健康皮肤活组织，建立了正常人真皮成纤维细胞(NHDF)和表皮角质形成细胞(NHEK)的原代培养。
步骤2：细胞毒性研究，正常人真皮成纤维细胞(NHDF)被试种并播种到96孔板，密度为10，000个细胞/孔，并培养成皮肤基质。表皮角质形成细胞(NHEK)被试种并播种到48孔板，密度为20，000个细胞/孔，并培养成皮肤基质。然后应用活性成分组合，并进行细胞存活率分析(MTT)测定(与0.5mg/ml MTT接触3小时，然后用100μl二甲基亚砜(DMSO)稀释甲瓒晶体持续搅拌30分钟。对于每种情况，每个细胞类型至少处理8个孔。测试550nm的吸光度后，计算每种条件下相对于代表100％存活率的未处理对照的存活率百分比。
步骤3：体外婴儿皮肤模型培养，在第0天将婴儿皮肤中的NHDF接种到真皮基质中。然后将真皮等效物浸泡培养21天。第21天，将婴儿皮肤中的NHEK接种在真皮顶部。这些皮肤等效物在浸泡中生长一周，然后被提升到空气/液体界面，使表皮分化。
从第7天到第42天，在2种浓度的细胞培养基中溶解的护肤成分存在下培养重建皮肤样品。这项研究是在没有活性成分的正常培养基中生长的重建皮肤进行比较。在第42天进行样本采集。样品固定于4％福尔马林缓冲液中，石蜡包埋或冷冻包埋于OCT复合物中。
步骤4：组织学分析，石蜡包埋福尔马林固定标本切成5μm切片。脱蜡和复水后，切片用Hematoxylin-Phloxin-Safran染色进行常规组织学检查。每种情况取3个样品。
固定在福尔马林和
Figure BDA0002989839760000051
(OCT)中进行组织学和免疫组化，以评估表皮组织及其与真皮的锚定。
步骤5：石蜡包埋福尔马林固定的5μm标本进行免疫组化染色，脱蜡和抗原暴露后，切片与含4％BSA的PBS孵育以阻断非特异性抗原键。然后将切片与一级抗体兔抗caspase-14一起孵育。将与Alexa-568(分子探针，Invitrogen)结合的二级兔抗体在室温下培养1小时。利用美国马萨诸塞州赛默飞世尔科学公司的Hoechst系统地进行了细胞核复染。
对于透明质酸，在5μm厚的石蜡切片上进行染色。非特异性位点饱和含4％BSA的PBS。切片用生物素化透明质酸结合蛋白溶液培养过夜。在用生物素化碱性磷酸酶溶液与亲和素(
Figure BDA0002989839760000052
ABC-AP试剂盒，载体实验室)结合后，用蓝色碱性磷酸酶底物(载体蓝色，载体实验室)显示抗原。然后用Biebrich红溶液对切片进行反着色。
步骤6：荧光免疫检验法在风干的5μm冰冻切片上进行标记。用冰丙酮固定10分钟后，切片与含有4％BSA的PBS孵育，以阻断非特异性结合。然后将切片与一级抗体丝聚合蛋白(filaggrin)小鼠单克隆抗体、小鼠(Novocastra)和claudin-1小鼠单克隆抗体(ThermoFisher Scientific)一起孵育次级Alexa-568结合抗小鼠抗体(分子探针，Invitrogen)在室温下培养1小时。常规使用Hoechst(美国马萨诸塞州赛默飞世尔科学公司)进行核复染。
步骤7：IL-6免疫测定，使用现成的商业化人IL-6Elisa试剂盒(英国R&D系统公司)进行检测，并在第42天收集的上清液上进行检测。在1:100稀释上清液上遵循制造商的说明测试。
步骤8：使用ImageJ软件进行图像处理和分析(Rasband，W.S.，ImageJ，美国马里兰州贝塞斯达美国国立卫生研究院，http://imagej.nih.gov/ij/,1997-2016).每种情况下每个样本分析6张图像。
对于丝聚糖蛋白、Caspase-14和Claudin-1的定量，计算表皮中的红色像素，并根据每种情况下的表皮总面积进行归一化。每一张照片上的表皮都被分隔开来，每个区域都被单独自动测量。
步骤9：数据呈现和统计分析所有数据均以平均值±标准差表示。数据的统计显著性通过学生t检验进行评估。每组数据都与对照组和未处理对照组的比较有关。统计显著性差异用星号表示如下：*P<0.05、**P<0.01和***P<0.001。
上述婴儿促屏障功效的化妆品组合物，所述化妆品是溶剂分散或者悬浮的方式，或是乳化颗粒的形式，亦或是聚合物包裹的形式。
上述婴儿促屏障功效的的化妆品组合物，该化妆品为护肤霜、护肤乳液、护肤凝胶、护肤精华、护肤水、眼霜、身体乳、凝胶或防晒乳。
借由上述技术方案，本发明具有如下优点和有益技术效果：
1)本发明创新的婴儿皮肤屏障功效修复成分，应用到婴儿化妆品组合物中，据有帮助婴儿强化皮肤屏障功能。
2)本发明的提升婴儿皮肤屏障功能化妆品组合物，选自玫瑰(ROSA RUGOSA)花提取物；白鸢尾(IRIS PALLIDA)根提取物；百合(LILIUM BROWNII)花油；草棉(GOSSYPIUMHERBACEUM)提取物，化妆品可接受的载体的复合，通过优选组合以及功效测试，发现最优选组合物比例，婴儿促屏障功效。
3)本发明新的全厚度3D婴儿皮肤模型反映了人类婴儿皮肤的关键特征，不同于成人皮肤模型。最后，结合活性成分进行治疗，强化了婴儿表皮的体外屏障效应，改善了皮肤水化，并没有引起炎症作用。
附图说明
图1A为全厚婴儿皮肤模型的组织学分析中的成人和婴儿重建皮肤的组织学染色图；
图1B为HPS染色后(Hematoxylin-Phloxin-Safran)后用BSCI治疗或不处理重建婴儿皮肤的组织学分析图。
图2A为填充蛋白免疫荧光在重建的皮肤在第42天时，治疗对婴儿皮肤模型中菲拉格林表达的影响图，细胞核被染成蓝色，比例线：50μm；
图2B为使用"ImageJ"软件在成人和婴儿皮肤模型表皮中自动定量菲拉格林表达的影响图。统计分析：t检验。***p<0.0001；值±SEM。
图3A为治疗对婴儿皮肤模型中Claudin-1表达的影响；第42天重建皮肤的克劳丁-1免疫荧光，细胞核被染成蓝色，比例线：50μm；
图3B为使用"ImageJ"软件在成人和婴儿皮肤模型表皮中自动定量Claudin-1表达。统计分析：t检验。***p<0.0001。Values是±的。
图4A为治疗对婴儿皮肤模型中的Caspase-14表达的影响图；Caspase-14在第42天重建的皮肤中的免疫荧光，细胞核被染成蓝色，比例线：50μm；
图4B为使用"ImageJ"软件在成人和婴儿皮肤模型表皮中自动定量菲拉格林表达的影响图；统计分析：t检验；*p<0.05**p<0.01***p<0.001；Values是±的。
图5A为治疗对婴儿皮肤模型中透明质酸表达的影响；
图5B为在第42天处理或未使用活性成分治疗的成人与婴儿皮肤等量皮肤中，总透明质酸合成的图像分析，Values是±的。
图6为治疗对婴儿皮肤模型中IL-6浓度的影响；与未经治疗的婴儿组相比，第42天所有疾病(以pg/mL)的IL-6分泌平均值。统计分析：t检验。*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001。值±SEM。
具体实施方式
本发明公开了一种通过3D婴儿皮肤评估模型测定具有提升婴儿皮肤屏障功能的化妆品组合物及其制备方法。该化妆品组合物包含玫瑰(ROSA RUGOSA)花提取物0.01-20％；白鸢尾(IRIS PALLIDA)根提取物0.01-20％；百合(LILIUM BROWNII)花油0.01-30％；草棉(GOSSYPIUM HERBACEUM)提取物0.01-30％。
本发明配方中的玫瑰(ROSA RUGOSA)花提取物，深层洁净法国玫瑰(PAR)作用于造成肌肤不平衡的三个主要因素：促进细胞更新，平衡细胞增殖和分化水平，恢复肌肤健康。促进和改善细胞呼吸，加速排放积累已久的皮肤毒素。最后，抑制炎症介质的表达，帮助肌肤恢复健康的生理平衡。
本发明配方中的白花百合(LILIUM CANDIDUM)花提取物，白百合萃取物及盐酸盐葡萄糖胺成分，在抑制肝素硫酸盐分解同时促进肝素硫酸盐产生从而增加基底中肝素硫酸盐含量。榉芽萃取物成分，促进基底膜蛋白质生成，修复基底膜基础，让肝素硫酸盐发挥功能。美白，帮助预防和减少黑斑，抑制肤色的改变，营造更均匀的肤色。再生，促进细胞更新，抗衰老。
本发明配方中的白鸢尾(IRIS PALLIDA)根提取物，活性植物细胞，研发用于最大限度地保留原活性分子的数量，为了令肌肤更紧致、富有弹性、减少皱纹和增强抵抗力，有必要保持皮肤纤维的良好生成。由高新技术研发成功的自然成分，研发用于保护和改善天然产品的特性和活性。全面抗衰老效果，增强纤维合成和促进细胞再生，抑制皱纹等老化迹象。紧致：紧致皮肤，帮助改善和修复皮肤真皮层功能和皮肤耐受性。再生：增强表皮细胞再生性和强化肌肤保护屏障。抗皱：减少成熟肌等肌肤类型的皱纹和脸部细纹，特别是鱼尾纹。柔肤：恢复皮肤原有的柔软度。香根鸢尾作用于真皮和上表皮连接层的自然老化。在真皮层，活性物会促进细胞外基质胶原，葡萄糖胺聚糖，弹性蛋白和蛋白聚糖成分的合成，同时限制酶作用将其破坏。其次，又通过促进表皮细胞的增殖和分化，有助于以良好平衡的方式，使表皮再生，从而减缓老化过程。
本发明配方中的草棉(GOSSYPIUM HERBACEUM)提取物，外界因素侵袭会导致角质细胞生成分泌炎症介质-最后导致皮肤不耐受，造成皮肤刺激；通过抑制炎症介质的释放。达到舒缓皮肤刺激感、提高皮肤耐受性的目的。炎症是皮肤组织对外界入侵的一种应激反应：所有防御机制都会被启动用来识别、破坏和清除外界入侵物质。不同的细胞会参与到不同的防御机制中去。
Naolys选择研究表皮层的角质细胞，并决定研究3种炎症介质：IL-1α、IL-6、PGE2。IL-1α是一种在细胞内的信使细胞因子，被合成后以无活性前体的状态储存在细胞内。IL-1α具有许多局部与全身的生物学功能(基因表达、细胞增殖、神经系统等)。IL-6是一种促炎性细胞因子，用于激活淋巴细胞、调节淋巴细胞的生长、分化。IL-6属于直接分泌抗体对抗细胞外病原体的蛋白质类型。PGE2是类花生酸的一种，源自于细胞磷脂膜。PGE2作用于血管平滑肌纤维：导致血管舒张、渗透率提高、水肿。当FC测试浓度分别为0.5％，1％和2.5％时，IL-1α的释放量分别下降17％、31％和37％；IL-6的释放量分别下降20％、27％和39％，PGE2的释放量分别下降16％、24％和33％。说明草棉提取物据有很好的抗炎功效。
本发明可以用0.005％活性成分混合处理的婴儿3D皮肤模型显著增加了丝聚合蛋白、克劳丁-1(claudin-1)、半胱氨酸蛋白酶-14(caspase-14)的表达，分别增加了9.0％、41.3％和38.2％。考察活性物组分治疗对婴儿皮肤模型中IL-6浓度的没有明显变化，表明活性物有没有炎症刺激。所以该化妆品组合物对婴儿皮肤有强化屏障功能，保湿，修复功效的活性成分。
本发明使用独特的3D全厚度重建婴儿皮肤模型，调查了活性成分组合对屏障功能特性和含水量的影响。为了研究活性成分治疗对婴儿皮肤模型保湿和阻隔功能的影响，对丝聚合蛋白、克劳丁-1(claudin-1)、半胱氨酸蛋白酶-14(caspase-14)和透明质酸进行了组织学和免疫病理学分析。
总之，这种新的全厚度3D婴儿皮肤模型反映了人类婴儿皮肤的关键特征，不同于成人皮肤模型。最后，结合活性成分进行治疗，强化了婴儿表皮的体外屏障效应，改善了皮肤水化，并没有引起炎症作用。
下面列举一部分具体实施例对本发明进行说明，这些实例只用于对本发明作进一步的说明，并不用来限定本发明，不代表对本发明保护范围的限制。其他人根据本发明作出的一些非本质的修改和调整仍属于本发明的保护范围。
如无特别说明，以下的百分比(％)均为质量百分含量。
实施例1
一种具有婴儿促屏障功效的化妆品组合物，制成婴儿保湿修护面霜，其原料组分配比、对照例原料组分配比的含量，如下表1所示。
表1实施例1与对照例1的原料组分配比(单位：质量％)
Figure BDA0002989839760000091
Figure BDA0002989839760000101
本发明实施例的婴儿保湿修护面霜的制备工艺流程如下所示：
1)向主罐依次投入A相各原料，搅拌分散完全；
2)缓慢加入B相各油脂原料，均质3000转/分钟3分钟，确认分散完全；
3)依次投入C相各，搅拌至分散完全；
4)依次投入D相原料，进行乳化，均质3000转/分钟3分钟；
5)调节pH至6.0附近；
6)100目过滤出料。
实施例2
一种具有婴儿促屏障功效的化妆品组合物，制成婴儿精华乳，其原料组分配比、对照例原料组分配比的含量，如下表2所示。
表2实施例2与对照例2的原料组分配比(单位：质量％)
Figure BDA0002989839760000102
Figure BDA0002989839760000111
本发明实施例的婴儿精华乳的制备工艺流程如下所示：
1)向主罐依次投入A相各原料，搅拌分散完全；
2)缓慢加入B相各粉体，均质3000转/分钟3分钟，确认分散完全；
3)依次投入C相各油脂，搅拌至分散完全；
4)依次投入D相原料，进行乳化，均质3000转/分钟3分钟；
5)依次投入E相，调节pH至6.0附近；
6)100目过滤出料。
实施例3
一种具有婴儿促屏障功效的化妆品组合物，制成婴儿精华液，其原料组分配比、对照例原料组分配比的含量，如下表3所示。
表3实施例3与对照例3的原料组分配比(单位：质量％)
Figure BDA0002989839760000112
本发明实施例的婴儿精华液的制备工艺流程如下所示：
1)向主罐依次投入A相各原料，搅拌分散完全；
2)缓慢加入B相各粉体，均质3000转/分钟3分钟，确认分散完全；
3)依次投入C相各油脂，搅拌至分散完全；
4)依次投入D相原料，进行乳化，均质3000转/分钟3分钟；
5)依次投入E相，调节pH至6.0附近；
6)100目过滤出料。
以下为效果验证试验例部分的内容。
1.3D婴儿皮肤模型
图1A和1B为婴儿重建皮肤(2岁以内)的结构与成人重建的皮肤(来自19岁捐赠者的成纤维细胞和角蛋白细胞)进行比较。图1A为全厚婴儿皮肤模型的组织学分析中的成人和婴儿重建皮肤的组织学染色图；
图1B为HPS染色后(Hematoxylin-Phloxin-Safran)后用BSCI治疗或不处理重建婴儿皮肤的组织学分析图。
成人和婴儿重建皮肤样本的结果表明，成纤维细胞已经在基质上移植成功并分泌自己的细胞外基质。表皮是多层的，区别于从基底层到地层角。然而，成人表皮和层角膜比婴儿表皮厚。此外，角细胞似乎比婴儿表皮的要大。这些结果表明，本方法培养的婴儿皮肤模型呈现的组织特征接近于真正的婴儿皮肤。
2.Filaggrin表达测试
3D婴儿皮肤模型，考察活性物组分治疗对婴儿皮肤模型中丝聚合蛋白表达的影响。丝聚合蛋白对于皮肤屏障是至关重要的，它可以保护身体免受外来环境物质的入侵，而外来环境物质可能会引发异常的免疫反应。丝聚合蛋白是角质层的主要结构蛋白,这是表示在终末分化角质化细胞最外层的表皮和透明角质颗粒的主要成分在颗粒层。中间丝相关蛋白的关键作用在表皮功能是常见的皮肤致病基因的重要性和过敏性疾病。它被认为是终末表皮分化的共同标志。
图2A为填充蛋白免疫荧光在重建的皮肤在第42天时，治疗对婴儿皮肤模型中菲拉格林表达的影响图，细胞核被染成蓝色，比例线：50μm；
图2B为使用"ImageJ"软件在成人和婴儿皮肤模型表皮中自动定量菲拉格林表达的影响图。统计分析：t检验。***p<0.0001；值±SEM。
第42天，与未处理的婴儿皮肤相比，用0.005％BSCI处理的重建皮肤显示出更厚的表皮和角质层增加了9.0％。相反，用0.0025％的成分处理过的再造皮肤的组织学显示，表皮比未经处理的婴儿对照组发育不良。丝聚合蛋白指标可以评测皮肤屏障的增厚和增强。
3.Claudin-1表达测试
图3A为治疗对婴儿皮肤模型中Claudin-1表达的影响；第42天重建皮肤的克劳丁-1免疫荧光，细胞核被染成蓝色，比例线：50μm；
图3B为使用"ImageJ"软件在成人和婴儿皮肤模型表皮中自动定量Claudin-1表达。统计分析：t检验。***p<0.0001。Values是±的。
考察活性物组分治疗对婴儿皮肤模型中Claudin-1表达的影响。claudin-1是控制上皮的渗透性并参与形成不渗透屏障的紧密结复合体的主要成分。claudin-1正表面积百分比在成人和婴儿重建皮肤的表皮之间没有差异。
此外，与0.0025％的混合物相比，与未处理的婴儿对照相比，0.0025％的混合物相比，对表面的表达促进41.3％的表达。这些结果表明，0.005％混合的治疗加强了表皮的屏障作用。claudin-1指标主要表征测评的婴儿皮肤的渗透性。
4.Caspase-14测试表达
图4A为治疗对婴儿皮肤模型中的Caspase-14表达的影响图；Caspase-14在第42天重建的皮肤中的免疫荧光，细胞核被染成蓝色，比例线：50μm；
图4B为使用"ImageJ"软件在成人和婴儿皮肤模型表皮中自动定量菲拉格林表达的影响图；统计分析：t检验；*p<0.05**p<0.01***p<0.001；Values是±的。
Caspase-14主要在表皮的上层表达。由于婴儿皮肤的差别较小，与成人皮肤相比，其表达能力降低(减少41.2％)。与未经治疗的婴儿皮肤相比，0.005％混合的治疗显著增加了38.2％的合成，而0.0025％的治疗不影响合成(图4B)。
这些结果与从丝聚合蛋白和克劳丁-1免疫区获得的结果一致，并建议在0.005％的治疗加强婴儿表皮的屏障作用。Caspase-14表征主要评测皮肤保水和水分流失水平。
5.透明质酸测试表达
考察活性物组分治疗对婴儿皮肤模型中透明质酸表达的影响。在皮肤和结缔组织中发现最多的透明质酸。它的主要功能是保持水润，以保持组织良好的润滑和潮湿。
图5A为治疗对婴儿皮肤模型中透明质酸表达的影响；
图5B为在第42天处理或未使用活性成分治疗的成人与婴儿皮肤等量皮肤中，总透明质酸合成的图像分析，Values是±的。
婴儿皮肤上的表皮和真皮比成人皮肤保留更多的水，因此含有更多的透明质酸(婴儿皮肤总当量增加37.6％)(图5B)。
与未经治疗的对照相比，用0.0025％治疗的表皮透明质酸增加14.8％，具有统计学上显著差异。透明质酸指标主要测评婴儿皮肤组织的保水能力。
6.白细胞介素-6(IL-6)表达
考察活性物组分治疗对婴儿皮肤模型中IL-6浓度的影响，表明活性物没有炎症刺激。白细胞介素-6(IL-6)是炎症急性期与IL-1β和肿瘤坏死因子(TNF)相关的细胞因子。在培养的最后一天，收集不同条件(处理与否)的上清液，用Elisa法测定白细胞介素-6。
图6为治疗对婴儿皮肤模型中IL-6浓度的影响；与未经治疗的婴儿组相比，第42天所有疾病(以pg/mL)的IL-6分泌平均值。统计分析：t检验。*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001。值±SEM。
图6显示，无论混合物的浓度(0.005％或0.0025％)如何，皮肤处理都不会改变这些皮肤的分泌曲线。IL-6浓度指标主要测评皮肤炎症水平。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，故凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰,均仍属于本发明技术方案的范围内。

Claims (10)

1.一种通过3D婴儿皮肤评估模型测定具有提升婴儿皮肤屏障功能的化妆品组合物，其特征在于：按重量百分比计，所述化妆品组合物是由以下的原料组成：
1.0-30.0％的婴儿皮肤屏障功效修复成分，包含：玫瑰花提取物0.25-20％；白鸢尾根提取物0.25-20％；百合花油0.25-30％；草棉提取物0.25-30％；
润肤剂 5.0-40.0％；
乳化剂 0.5-30.0％；
填充剂 0.5-20.0％；
增稠剂 0.1-10.0％；
防腐剂 0.3-5.0％；
EDTA-2NA 0.05-0.5％；
日用香精 0.01-1.0％；
去离子水余量加至100.0％。
2.如权利要求1所述的具有提升婴儿皮肤屏障功能的化妆品组合物，其特征在于：按组合物的总重量计，该化妆品组合物是由以下组分组成：
10.0-30.0％的婴儿皮肤屏障功效修复成分，包含：按组合物的总重计，包含：玫瑰花提取物2.5-10％；白鸢尾根提取物2.5-10％；百合花油2.5-20％；草棉提取物2.5-20％；
润肤剂 15.0-35.0％；
乳化剂 5-25.0％；
填充剂 5-20.0％；
增稠剂 0.5-8.0％；
防腐剂 0.3-1.0％；
EDTA-2NA 0.1-0.5％；
日用香精 0.01-0.05％；
去离子水余量加至100.0％。
3.如权利要求1或2所述的具有提升婴儿皮肤屏障功能的化妆品组合物，其特征在于：按组合物的总重量计，所述婴儿皮肤屏障功效修复成分包含以下原料组分：
a)玫瑰(ROSA RUGOSA)花提取物5-10％；
b)白鸢尾(IRIS PALLIDA)根提取物5-10％；
c)百合(LILIUM BROWNII)花油5-20％；
d)草棉(GOSSYPIUM HERBACEUM)提取物5-20％
4.如权利要求1所述的具有提升婴儿皮肤屏障功能的化妆品组合物，其特征在于：按组合物的总重量计，所述婴儿皮肤屏障功效修复成分包含以下原料组分：
e)玫瑰(ROSA RUGOSA)花提取物0.5-5％；
f)白鸢尾(IRIS PALLIDA)根提取物0.5-5％；
g)百合(LILIUM BROWNII)花油0.5-10％；
h)草棉(GOSSYPIUM HERBACEUM)提取物0.5-10％。
5.如权利要求1所述的具有提升婴儿皮肤屏障功能的化妆品，其特征在于：
所述润肤剂选自辛酸癸酸甘油三酯、角鲨烷、鳄梨油、乳木果油、霍霍巴油、甘油、丁二醇、己二醇、戊二醇、聚二甲基硅氧烷、聚二甲基硅氧烷醇、PEG-11甲醚聚二甲基硅氧烷、植物甾醇、植物甾醇/辛基十二烷基月桂酰谷氨酸、氢化聚异丁烯、菜籽油、聚癸烯、大豆油、橄榄油、异十二烷、异十六烷、硬脂醇、山嵛醇中的至少一种；
所述乳化剂选自橄榄油PEG-7酯类、PEG-8辛酸/癸酸甘油酯类、山梨坦橄榄油酸酯、聚山梨醇酯-20、月桂醇聚醚-23、PEG-40硬脂酸酯、硬脂醇聚醚-21、棕榈醇和PEG-75硬脂酸酯和甘油硬脂酸酯和硬脂醇聚醚-20的混合物、聚山梨醇酯-80、大豆卵磷脂PC60、硬脂酸甘油酯和PEG-75硬脂酸酯的混合物、泊洛沙姆407、PEG-30二聚羟基硬脂酸酯、鲸蜡硬脂醇聚醚-25中的至少一种；
所述填充剂选自二氧化钛、云母、氮化硼、聚甲基硅倍半氧烷、硅藻土、高岭土、乙酸纤维素、淀粉辛基琥铂酸铝、滑石粉、硫酸钡、火山灰中的至少一种；
所述增稠剂选自羟乙基纤维素、黄原胶、卡波姆，丙烯酸(酯)类/共聚物、聚合物EMT-10,聚丙烯酸酯交联聚合物-6、丙烯酸钠/丙烯酰二甲基牛磺酸钠共聚物、丙烯酸(酯)类/C10-30烷醇丙烯酸酯交联聚合物、丙烯酰二甲基牛磺酸胺/VP共聚物、丙烯酸(酯)类/C10-30烷醇丙烯酸酯交联聚合物、聚乙烯、阿拉伯树胶中的至少一种；
所述防腐剂选自苯氧乙醇、乙基己基甘油、戊二醇、己二醇、馨酰酮、苯甲酸钠、三氯生、氯苯甘醚中的至少一种。
6.权利要求1-5中任一项所述的具有提升婴儿皮肤屏障功能的化妆品组合物的制备方法，其特征在于，包括以下工艺步骤：
1)将增稠剂在水中润湿分散完全，得混合液；
2)向步骤1)中的混合液加入婴儿皮肤屏障功效修复成分、润肤剂、填充剂、防腐剂和EDTA-2NA，加热至65℃，3000r/min均质3分钟使其分散完全；
3)向步骤2)中加入乳化剂和日用香精，3000r/min均质3分钟使其乳化完全，加热至65℃，得到具有婴儿促屏障功效的化妆品组合物。
7.一种化妆品，其特征在于：其包含权利要求6所述的制备方法所制得的化妆品组合物，通过3D婴儿皮肤模型验证具有婴儿促屏障修护功效；
通过3D婴儿皮肤评估模型的测定、3D婴儿皮肤等效模型的检测，通过从接受整形手术的婴儿捐赠者(2岁以下)获得的健康皮肤活组织，建立了正常人真皮成纤维细胞(NHDF)和表皮角质形成细胞(NHEK)的原代培养模型；
具有自然婴儿皮肤特点，作为3D全层婴儿皮肤功效测评模型，具体为：
用0.005％活性成分混合处理的婴儿3D皮肤模型显著增加了丝聚合蛋白、克劳丁-1(claudin-1)、半胱氨酸蛋白酶-14(caspase-14)的表达，分别增加了9.0％、41.3％和38.2％。
8.如权利要求7所述的化妆品，其特征在于：所述3D婴儿皮肤等效模型的检测方法，具体包括如下步骤：
步骤1：细胞分离，通过从接受整形手术的2岁以下婴儿捐赠者获得的健康皮肤活组织，建立了正常人真皮成纤维细胞和表皮角质形成细胞的原代培养；
步骤2：细胞毒性研究，正常人真皮成纤维细胞被试种并播种到96孔板，密度为10，000个细胞/孔，并培养成皮肤基质；表皮角质形成细胞被试种并播种到48孔板，密度为20，000个细胞/孔，并培养成皮肤基质；然后应用活性成分组合，并进行细胞存活率分析测定；
步骤3：体外婴儿皮肤模型培养，在第0天将婴儿皮肤中的NHDF接种到真皮基质中。然后将真皮等效物浸泡培养21天；第21天，将婴儿皮肤中的NHEK接种在真皮顶部；这些皮肤等效物在浸泡中生长一周，然后被提升到空气/液体界面，使表皮分化；
从第7天到第42天，在2种浓度的细胞培养基中溶解的护肤成分存在下培养重建皮肤样品；在第42天进行样本采集。
步骤4：组织学分析，石蜡包埋福尔马林固定标本切成5μm切片，脱蜡和复水后，切片用Hematoxylin-Phloxin-Safran染色进行常规组织学检查，每种情况取3个样品；
固定在福尔马林和
Figure FDA0002989839750000031
(OCT)中进行组织学和免疫组化，以评估表皮组织及其与真皮的锚定；
步骤5：石蜡包埋福尔马林固定的5μm标本进行免疫组化染色，脱蜡和抗原暴露后，切片与含4％BSA的PBS孵育以阻断非特异性抗原键；然后将切片与一级抗体兔抗caspase-14一起孵育；将与Alexa-568分子探针结合的二级兔抗体在室温下培养1小时；利用美国马萨诸塞州赛默飞世尔科学公司的Hoechst系统地进行了细胞核复染；
步骤6：荧光免疫检验法在风干的5μm冰冻切片上进行标记；
用冰丙酮固定10分钟后，切片与含有4％BSA的PBS孵育，以阻断非特异性结合；然后将切片与一级抗体丝聚合蛋白小鼠单克隆抗体、小鼠和claudin-1小鼠单克隆抗体一起孵育次级Alexa-568结合抗小鼠抗体在室温下培养1小时；
步骤7：IL-6免疫测定；
步骤8：使用ImageJ软件进行图像处理和分析；
步骤9：数据呈现和统计分析所有数据均以平均值±标准差表示；数据的统计显著性通过学生t检验进行评估。
9.如权利要求7所述的化妆品，其特征在于：所述化妆品是溶剂分散或者悬浮的方式，或是乳化颗粒的形式，亦或是聚合物包裹的形式。
10.如权利要求7所述的化妆品，其特征在于：该化妆品为护肤霜、护肤乳液、护肤凝胶、护肤精华、护肤水、眼霜、身体乳、凝胶或防晒乳剂型。
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