ITPD20120390A1 - Dispositivo comprendente una matrice biocompatibile e cellule endoteliali impiegabile nel trattamento di lesioni cutanee - Google Patents

Description

Dispositivo comprendente una matrice biocompatibile e cellule endoteliali impiegabile nel trattamento di lesioni cutanee

Campo dell’invenzione

L’invenzione à ̈ relativa ad un dispositivo comprendente cellule endoteliali adulte umane od animali e una matrice tridimensionale biocompatibile ed acellulare in cui le cellule possono essere incluse per il loro impianto in un soggetto per il trattamento di lesioni cutanee. L’invenzione à ̈, inoltre, relativa al suo uso per il trattamento di lesioni cutanee ed al kit per la preparazione del dispositivo al momento dell’impianto.

Stato della tecnica

I pazienti affetti da ferite cutanee di difficile cura rappresentano un problema alquanto complesso, costituendo un impegno ed una sfida costante sia per gli operatori sanitari che per la ricerca medico-scientifica.

Non esiste ancora una definizione precisa e universalmente accettata di ferita difficile, ma tale concetto può essere equiparato al concetto di ulcere croniche, intendendo in prima istanza con ferita difficile una lesione che non ha tendenza alla guarigione, in quanto non progredisce attraverso le normali fasi della riparazione tessutale nell’arco dei 30 giorni.

La varietà dei quadri clinici con cui ci si confronta à ̈ estremamente variegata e sono ad esempio ulcere su base vascolare (arteriose, venose e miste), ulcere diabetiche e neuropatiche, ulcere da pressione, ulcere traumatiche e da ustione, ulcere su base neoplastica ed ulcere vasculitiche.

La prevalenza delle ulcere degli arti inferiori, sia su base vascolare che diabetica, à ̈ di circa l’1% circa negli adulti (3,6% al di sopra dei 65 anni), mentre per il piede diabetico si aggira attorno al 12% della popolazione dei pazienti affetti da questa patologia (circa 250mila ulcere nel 2005, 30% se la neuropatia diabetica à ̈ presente da più di 10 anni). Considerando anche le ulcere da pressione (8% dei pazienti ospedalizzati, 15 – 25% degli anziani), possiamo dedurre, in linea generale, che la popolazione più colpita à ̈ rappresentata dagli ultrasettantenni, sempre più numerosi in Italia e nel mondo occidentale.

Nel corso degli ultimi 50 anni non vi à ̈ stata una concreta evoluzione della conoscenza dei processi di guarigione e delle soluzioni utili per il trattamento delle ulcere in pazienti anche non complicati, così come spesso non vi à ̈ stato un approccio tale da prevenire l’insorgenza di lesioni talvolta drammatiche.

La diagnosi per anni à ̈ stata di “ulcera cronica non guaribile†, per cui il paziente veniva sottoposto ad intervento chirurgico di copertura con l’insorgenza di ulcere croniche recidive, situazione ben peggiore della situazione di partenza.

Pertanto, l’interesse a trovare una soluzione al problema ha dato impulso alla ricerca su medicazioni tecnologicamente avanzate.

Le metodologie e gli approcci a disposizione per la gestione ed il trattamento delle ferite difficili sono ad oggi molteplici, anche se non esistono ancora mezzi e materiali che garantiscano un trattamento definitivo di tutte le forme di lesioni cutanee.

Le medicazioni che vengono impiegate nel trattamento delle ferite difficili vengono sommariamente classificate come tradizionali e avanzate. Rientrano nella prima categoria le garze, gli antisettici, gli agenti essicanti, le pomate ed unguenti contenenti antibiotici o altre sostanze medicamentose. Mentre le medicazioni avanzate vengono classificate fondamentalmente in base alla loro composizione ed alle loro proprietà intrinseche e solo secondariamente in base alla loro funzione. Esistono diverse medicazioni classificabili in base alla loro composizione. Alginati, schiume, idrocolloidi, idrogel, idrofibre, pomate ad alto contenuto enzimatico, sono l’espressione dei componenti di gran parte delle medicazioni avanzate; ognuno di questi caratterizza una categoria di medicazioni, diverse per potere assorbente, antibatterico, di pulizia chirurgica della ferita con rimozione del materiale non vitale (debridement), emostatico, analgesico. Di conseguenza ogni medicazione ha un’efficacia diversa sui diversi tipi di ulcera da trattare, in base alle caratteristiche della stessa.

La validità delle medicazioni avanzate à ̈ indiscussa, sia in termini di efficacia che in termini di costi, non per niente la ricerca in questo settore della medicina sta investendo notevoli risorse umane ed ingenti quantità di denaro. Nell’Europa Occidentale si pensa che oltre 7 milioni di pazienti/anno siano affetti da lesioni croniche le cui cure richiedono costi sociali elevatissimi. Tutti gli studi portati a termine negli ultimi 3 anni hanno dimostrato che possono essere ridotti solo grazie all'introduzione di materiali e/o farmaci innovativi.

E’ ormai assodato che quando si deve trattare una ferita difficile non si può quasi mai prescindere dal debridement chirurgico, cioà ̈ da una pulizia meccanica del fondo dell’ulcera che mira a rimuovere il materiale necrotico/fibrinoso e a ridurre la carica batterica sempre presente nelle ulcere croniche. In questo caso la chirurgia non può essere considerata un trattamento “adiuvante†, ma una tappa obbligata nel processo di guarigione delle ferite difficili che apre poi la strada alle medicazioni avanzate.

In linea generale l’approccio chirurgico prevede poi l’impiego di innesti cutanei e di lembi per lo più autologhi per ovviare a problemi di rigetto dell’innesto. Gli innesti cutanei sono perfetti per la riparazione di lesioni superficiali anche estese, in zone di scarico, in pazienti anziani e defedati; una controindicazione assoluta à ̈ l’infezione, in quanto compromette l’integrazione dell’innesto sul sito ricevente. In alternativa agli innesti cutanei trovano sempre maggior impiego tessuti bioingegnerizzati ottenuti con cellule isolate di origine sia epidermica che dermica coltivate in vitro in matrici biocompatibili tridimensionali. I tessuti bioingegnerizzati noti ed in uso, infatti, sono costituiti in via principale da cheratinociti (i.e. cellule epidermiche) e/o fibroblasti (i.e. cellule dermiche). L’impiego in prima istanza di questo tipo di cellule à ̈ giustificato dal fatto che la cute à ̈ composta da due strati: una superficie epiteliale (l’epidermide) formata principalmente da cheratinociti ed uno strato contiguo connettivale (il derma) formato principalmente da fibroblasti e che presenta nello strato più profondo anche cellule endoteliali del plesso vascolare.

Per lo più queste cellule epidermiche (cheratinociti) e dermiche (fibroblasti), singolarmente prese o associate tra di loro sono combinate con materiali biocompatibili adatti alla copertura delle lesioni. Questo tipo di dispositivi hanno lo scopo sostanziale di reintegrare la funzione propria della pelle di organo di copertura, favorendo la ricostruzione dello strato dermico connettivale e dello strato epidermico.

Generalmente tali tessuti bioingegnerizzati sono costituiti da una matrice tridimensionale nella quale vengono inoculati cellule dermiche che formano un primo strato su cui vengono inoculate cellule epidermiche per formare un secondo strato in modo da mimare in vitro “l’organo cute†e fornire un sostituto dermico. Tale approccio al trattamento di lesioni cutanee à ̈ descritto, ad esempio, nella domanda di brevetto WO 03/076604. In particolare, nella domanda sono descritte co-colture di cellule dermiche e cellule epidermiche in una matrice reticolata biocompatibile e biodegradabile consistente in collagene disidratato. Le cellule possono essere di origine autologa ed anche modificate geneticamente per produrre fattori, quali fattori angiogenetici, in grado di favorire l’innesto e la riparazione tissutale.

Mancano invece, o non sono previste come essenziali, cellule adatte a formare in prima istanza un plesso vascolare in proprio. Ciò comporta un periodo di tempo piuttosto lungo per il processo di neo-vascolarizzazione, che deriva dalle anastomosi dei vasi presenti nella ferita, portando alla carenza dei fattori nutrizionali e aumentando il rischio di una contaminazione microbica ed aumentando la probabilità di fallimento dell’innesto del sostituto dermico. È infatti di vitale importanza che il sostituto dermico impiantato sia adeguatamente vascolarizzato.

Un primo approccio per migliorare la formazione del plesso vascolare nei tessuti bioingegnerizzati à ̈ stata la transfezione delle cellule (e.g. cheratinociti o fibroblasti) con un vettore per la produzione del VEGF (Supp DM et al. J. Invest. Dermatol., 2000, 114, 5-13), tuttavia gli svantaggi della terapia genica sono numerosi e quindi ne limitano l’ utilizzo nella pratica clinica.

Un altro approccio per accelerare il processo angiogenetico nel tessuto bioingegnerizzato potrebbe essere l’introduzione di cellule endoteliali nello stesso tessuto, prima di innestarlo. In tal modo con l’aggiunta della componente endoteliale si potrebbe permettere una più veloce rivascolarizzazione dell’innesto, favorendo sia le anastomosi che la neo-vascolarizzazione, come accade negli innesti di lembi cutenei autologhi.

La capacità di cellule endoteliali di formare microvasi in vitro à ̈ nota e colture di cellule endoteliali sono usate per studiare i processi di angiogenesi anche in tessuti bioingegnerizzati (Stanton CA et al. Int. J. Exp. Path., 2004, 85, 233-248; Sahota PS et al. Wound repair and regeneration, 2004, 12, 635-642).

Ciononostante dispositivi comprendenti sia cellule endoteliali e epidermiche e/o dermiche non necessariamente possono promuovere in prima istanza processi angiogenetici utili per favorire i processi di riparazione cutanea e dermica, poiché i processi di replicazione cellulare delle cellule epidermiche/dermiche possono essere dal punto di vista della cinetica prevalenti rispetto ai processi di angiogenesi più lenti. Potrebbe in altre parole verificarsi che l’intero e complesso processo di riparazione tissutale sia compromesso da una inadeguata rivascolarizzazione del letto della lesione con un conseguente fallimento dell’impianto del tessuto bioingegnerizzato.

Da ciò deriva la necessità di disporre di strumenti più idonei per promuovere il processo di guarigione, riducendo la fase di cicatrizzazione che comporta una perdita della funzionalità della zona tissutale lesa favorendo invece il ripristino più fisiologico possibile.

È quindi uno scopo della presente invenzione di mettere a punto un dispositivo impiegabile per trattare lesioni cutanee che favorisca in prima istanza la rivascolarizzazione della zona e conseguentemente la neo-angiogenesi dell’impianto successivo dell’innesto o del tessuto bioingegnerizzato.

Sommario

Lo scopo della presente invenzione à ̈ raggiunto con un dispositivo comprendente cellule endoteliali adulte in associazione con matrici acellulari consistenti in materiali biocompatibili.

Per lo scopo della presente invenzione le cellule endoteliali adulte sono cellule del microcircolo dermico e la matrici acellulari impiegabili possono essere matrici a singolo strato scelte tra derma decellularizzato o matrici comprendenti componenti della matrice extracellulare.

Pertanto, in un primo aspetto la presente invenzione concerne un dispositivo comprendente cellule endoteliali ed una matrice tridimensionale, in cui le cellule sono adulte, e preferibilmente autologhe, e vengono combinate con una matrice tridimensionale acellulare biocompatibile scelta tra derma decellularizzato e matrici comprendenti componenti della matrice extracellulare.

In un secondo aspetto l’invenzione concerne l’uso del dispositivo comprendente cellule endoteliali ed una matrice tridimensionale in cui le cellule sono adulte, e preferibilmente autologhe, coltivate su una matrice tridimensionale acellulare biocompatibile scelta tra derma decellularizzato e matrici comprendenti componenti della matrice extracellulare.

In un altro aspetto l’invenzione à ̈ relativa al kit per la preparazione del dispositivo oggetto dell’invenzione anche in situ al momento della sua applicazione.

Il dispositivo à ̈ impiegabile sia in campo umano che veterinario per il trattamento di lesioni cutanee mediante la rivascolarizzazione del fondo della lesione.

Questi aspetti ed i vantaggi del dispositivo comprendente cellule endoteliali ed una matrice tridimensionale biocompatibile acellulare secondo l’invenzione saranno meglio compresi dalla descrizione dettagliata che segue.

Breve descrizione delle figure

Figura 1. La figura mostra la morfologia delle cellule endoteliali adulte del microcircolo cutaneo in coltura.

Figura 2. La figura mostra la caratterizzazione delle cellule endoteliali adulte del microcircolo cutaneo mediante immunofluorescenza. Le cellule fatte crescere fino a confluenza su vetrini da 8 pozzetti, sono state fissate e permeabilizzate e incubate con anticorpi monoclonali primari anti-vimentina, anti-VE caderina e anti-Von Willebrand Factor, seguiti da anticorpi secondari coniugati con fluoresceina. Le immagini sonno state effettuate al microscopio a fluorescenza.

Figura 3. La figura mostra l’analisi della presenza di marcatori cellulari mediante citofluorimentria. Le cellule endoteliali adulte del microcircolo cutaneo sono state incubate in sospensione con la lectina di Ulex Europaeus I o con gli anticorpi monoclonali primari anti-CD31, anti-CD105 o con anticorpo non correlato si controllo seguiti sa anticorpi secondari marcati con fluoresceina.

Figura 4. La figura mostra la valutazione della cinetica di attecchimento delle cellule endoteliali adulte del microcircolo cutaneo alla matrice tridimensionale Integra<®>. 500.000 cellule sono state incubate sulla matrice per 5 minuti, 2 ore, 7 giorni e 14 giorni e la loro presenza valutata mediate saggio MTT. Le immagini sono state acquisite al microscopio invertito.

Figura 5. La figura mostra lo studio della dose-risposta di attecchimento delle cellule endoteliali adulte del microcircolo cutaneo alla matrice tridimensionale Integra<®>. Le cellule nelle quantità di 50.000, 100.000 e 200.000 sono state incubate con la matrice per 5 minuti o 14 giorni e la loro presenza valutata con saggio MTT. Le immagini sono state acquisite al microscopio invertito.

Figura 6. La figura mostra la valutazione della componente cellulare residua dopo trattamento decellularizzante del derma. Indagine mediante colorazione con ematosillina-eosina.

Figura 7. La figura mostra la valutazione dell’attecchimento delle cellule endoteliali adulte del microcircolo cutaneo su derma decellularizzato dopo 7 giorni. Colorazione con ematosillina-eosina e immunofluorescenza.

Figura 8. La figura mostra la valutazione dell’attecchimento delle cellule endoteliali adulte del microcircolo cutaneo su derma decellularizzato dopo 14 giorni. Colorazione con ematosillina-eosina e immunofluorescenza.

Figura 9. La figura mostra la valutazione dell’attecchimento delle cellule endoteliali adulte del microcircolo cutaneo su derma decellularizzato dopo 21 giorni. Colorazione con ematosillina-eosina e immunofluorescenza.

Figura 10. . La figura mostra il contributo in vivo delle cellule endoteliali adulte autologhe del microcircolo cutaneo al processo di neoangiogenesi. Le cellule endoteliali sono state isolate da una biopsia cutanea prelevata da un ratto Wistar ed espanse in vitro e successivamente inoculate su ferite prodotte sul dorso dello stesso ratto, mediante punch biopsy. (3 biopsie trattate con cellule, 3 biopsie di controllo trattate con il solo terreno di coltura, n=3). Dopo 7 e 14 giorni il tessuto à ̈ stato prelevato e fatta l’analisi istologica mediante colorazione con ematosillinaeosina per evidenziare i vasi nel tessuto.

Descrizione dettagliata dell’invenzione

L’invenzione concerne un dispositivo chirurgico impiegabile per il trattamento di lesioni cutanee, come ulcere o ustioni, che necessitano di interventi di ricostruzione cutanea in un’area con alterazione della normale vascolarizzazione. Il dispositivo secondo l’invenzione comprende preferibilmente cellule endoteliali adulte del microcircolo cutaneo, qui definite anche con l’acronimo ADMEC (Adult Dermal Microvasculatur Endothelial Cells) e matrici biocompatibili acellulari scelte tra derma decellularizzato o matrici comprendenti componenti della matrice extracellulare singolarmente presi o in miscela tra di loro.

Le cellule endoteliali preferite per gli scopi dell’invenzione sono autologhe e sono perciò preparate da campioni cutanei prelevati dal paziente stesso secondo tecniche note ad un esperto del settore.

La matrice tridimensionale ha la funzione di supporto tridimensionale delle cellule e deve avere la capacità di far crescere al suo interno le cellule. Può essere eterologa ed essere costituita da derma decellularizzato o almeno da un singolo strato di componenti della matrice extracellulare scelti tra collagene, glicosamminoglicani, elastina, loro derivati e combinazioni degli stessi. I glicosaminoglicani preferiti sono scelti tra acido ialuronico e suoi derivati esterei, dermatan solfato, condroitina-6-solfato, mentre le combinazioni tra componenti della matrice cellulare e derivati degli stessi preferite sono collageneglicosaminoglicani e derivati degli stessi o collagene-elastina e derivati della stessa.

Tali componenti biologici possono essere depositati in singolo strato su uno strato flessibile, semimpermeabile e poroso formato da composti organici sintetici, quali ad esempio composti siliconici, usati nella pratica clinica come materiali di copertura di lesioni cutanee.

Tali matrici possono svolgere, infatti, sia la funzione di veicolare le cellule al sito della lesione da trattare mantenendole vitali e promuovendone la replicazione sia di copertura della stessa.

La composizione e lo spessore delle matrici possono variare a seconda dell'indicazione clinica del dispositivo e dipenderanno dalla sede e dalle dimensioni della lesione, dalla ricostruzione da eseguire nello stesso tempo o in un secondo tempo e dalla tipologia di ricostruzione con colture cellulari, innesti e/o lembi. In ogni caso la matrice deve avere uno spessore di almeno 0,3 mm e preferibilmente tra 0,5 e 4 mm.

Per gli scopi dell’invenzione possono essere usate matrici biocompatibili commerciali, quali ad esempio Integra<®>, Matriderm<®>, Hyalomatrix<®>, Hyalofill<®>, ed altre in uso e note ad un esperto nel campo.

In breve di seguito viene descritto il metodo di preparazione del dispositivo che può essere preparato prima o al momento della sua applicazione al paziente.

Campioni di cute prelevati in precedenza dal paziente sono incubati per un tempo tra 8 e 12 ore a 4°C in tampone fosfato (qui di seguito indicato anche come PBS) e tripsina (2ml di PBS e 400µL di tripsina per campioni di cute di 5mm<2>circa). Al termine dell’incubazione i campioni vengono lavati con PBS e trattati con una soluzione di blocco della tripsina, come ad esempio medium RPMI 1640 con 10% siero bovino. L’epidermide viene rimossa e le cellule distaccate per effetto della tripsina sono raccolte e filtrate con un filtro da 100µm. Le cellule sono quindi sottoposte a blanda centrifugazione (tipicamente 5-10 minuti a 250g) e risospese in fisiologica. La popolazione mista così ottenuta à ̈ sottoposta a selezione secondo tecniche note ad un esperto, ad esempio selezione immunomagnetica con biglie antiCD31.

Dal pool di cellule endoteliali selezionate ottenute in condizioni di sterilità assoluta à ̈ prelevato un campione per il controllo della vitalità cellulare mediante tripan blue, mentre le rimanenti sono seminate sulla matrice tridimensionale acellulare scelta alla densità di almeno 10<5>x1cm<2>e preferibilmente compresa tra 1x10<5>x1cm<2>e 5x10<4>x1cm<2>. Il dispositivo così preparato à ̈ lasciato a riposo per favorire l’attecchimento delle cellule alla matrice per un tempo di almeno 5 min e preferibilmente tra 5 e 20 min nel caso dell’utilizzo immediato del dispositivo, e di almeno 24 ore e preferibilmente tra 24 e 48 ore nel caso dell’utilizzo del dispositivo già assemblato.

Il dispositivo comprendente le cellule endoteliali adulte e la matrice acellulare secondo l’invenzione può quindi essere applicato sulla lesione da trattare dopo che questa à ̈ stata sottoposta ad un adeguato debridement chirurgico, ad esempio con ultrasuoni o radiofrequenza. Successivamente all’impianto del dispositivo il sito trattato può essere ulteriormente occluso con una medicazione non aderente ed adsorbente, con ad esempio garze vasellinate e una schiuma di poliuretano. Dopo un tempo adeguato dall’applicazione del dispositivo il letto dell’ulcera o della ferita à ̈ pronto per la ricostruzione finale essendo stata ripristinata la vascolarizzazione precedentemente insufficiente della zona con ciò favorendo il buon esito della ricostruzione altrimenti compromessa.

Per la preparazione del dispositivo oggetto dell’invenzione può essere fornito un kit comprendente una matrice biocompatibile acellulare, strumenti e reagenti per la preparazione delle cellule endoteliali ed un foglietto di istruzioni.

In una possibile realizzazione il kit comprende:

- uno o più contenitori nella forma di buste sigillate contenenti una o più matrici acellulari;

- uno o più contenitori contenenti tripsina in soluzione acquosa al 2,5% p/p;

- uno o più contenitori contenenti tampone fosfato;

- uno o più contenitori contenenti la soluzione fisiologica;

- uno o più contenitori nella forma di busta sigillate contenenti una o più pinze;

- uno più contenitori nella forma di buste sigillate contenente uno o più bisturi;

- uno più contenitori nella forma di buste sigillate contenenti una o più piastre su cui viene posta la matrice per la successiva semina delle cellule endoteliali;

- uno più contenitori nella forma di buste sigillate contenenti uno o più tubi; e

- uno più contenitori nella forma di buste sigillate contenenti una o più pipette.

I singoli componenti del kit o il kit nel suo complesso deve essere sottoposto a sterilizzazione.

I vantaggi del dispositivo oggetto dell’invenzione sono molteplici e possono essere riassunti come di seguito riportato.

Le cellule endoteliali utilizzate per il dispositivo secondo l’invenzione, essendo autologhe, non presentano problemi di rigetto e di istocompatibilità, di trasmissione di patologie infettive. Inoltre, essendo adulte non hanno potenziali rischi di produzione o stimolo di proliferazione di cellule tumorali come ad esempio le cellule staminali.

Inoltre, l’impiego di queste cellule endoteliali adulte autologhe al posto di cheratinociti e/o fibroblasti su una matrice tridimensionale biocompatibile permette il miglioramento della vascolarizzazione delle aree trattate.

Questo à ̈ di sicura rilevanza sotto il profilo del trattamento di lesioni difficili da trattare, quali ad esempio patologie ulcerative di notevole impatto come il piede diabetico e le ulcere degli arti inferiori che possono portare anche ad amputazioni maggiori degli arti, poiché sino ad oggi non ci sono strumenti terapeutici che possono migliorare la vascolarizzazione di distretti periferici compromessi da arteriopatie. Va infatti tenuto conto che quando in situazioni di devascolarizzazione si crea un’ulcera cutanea questa diventa il tramite per infezioni che peggiorano il quadro clinico e diventa l’inizio di una compromissione crescente della situazione locale sino alla possibilità di amputazione dell’arto interessato. Il miglioramento della vascolarizzazione porterebbe ad una ripresa della guarigione e ad aumentate probabilità di riuscita della ricostruzione con un migliore attecchimento di colture cellulari di fibroblasti e/o cheratinociti.

Allo scopo di verificare la possibilità di realizzare un dispositivo secondo l’invenzione, à ̈ stato inizialmente necessario svolgere una ricerca approfondita delle conoscenze di base sulle cellule ADMEC. Sono state messe a punto le metodiche di estrazione, coltura, e caratterizzazione cellulare ed à ̈ stata inoltre testata la capacità delle cellule di crescere e proliferare in matrici di diversa natura. È stato inoltre osservato il loro comportamento al loro interno di matrici acellulari. Dai risultati di seguito riportati in dettaglio risulta quindi che il dispositivo oggetto dell’invenzione può essere utilmente impiegabile nella rivascolarizzazione di lesioni cutanee.

PARTE SPERIMENTALE

Esempio 1 Isolamento e coltura in vitro di cellule adulte endoteliali del microcircolo dermico e loro caratterizzazione immunologica e funzionale.

A. Isolamento e coltura in vitro

Le cellule endoteliali sono state isolate a partire da un campione di cute delle dimensioni di 1cm<2>prelevato chirurgicamente durante un’operazione chirurgica (addominoplastica, mammoplastica o blefaroplastica) da un soggetto con il suo consenso informato. Il campione di cute à ̈ stato trasportato in soluzione fisiologica in laboratorio e dopo aver subito due lavaggi in tampone fosfato (PBS), à ̈ stato tagliato in piccoli pezzi di circa 5mm<2>e incubato per tutta la notte a 4°C in una soluzione di PBS contenente tripsina allo 0,5%.

Successivamente à ̈ stata tolta l’epidermide, il derma così esposto à ̈ stato immerso in una soluzione di RPMI 1640 con 10% di siero bovino per favorire il distacco delle cellule endoteliali agendo meccanicamente. La soluzione contenente le cellule à ̈ stata raccolta, filtrata attraverso una membrana di nylon con pori di 100µm di diametro e centrifugata a 1160 RPM per 7 minuti; le cellule sono state risospese nell’apposito terreno di coltura e seminate su piastre precedentemente ricoperte da fibronectina. Quando la popolazione cellulare ha raggiunto la confluenza à ̈ stata effettuata la selezione.

La selezione delle cellule endoteliali à ̈ stata eseguita servendosi di uno specifico protocollo che prevede l’uso di biglie magnetiche Dynabeads coniugate con mAb anti-CD31 ed à ̈ stata operata dopo aver staccato la popolazione mista cellulare a confluenza dalla piastra di coltura. Le cellule selezionate positivamente sono state risospese in terreno di coltura e seminate su piastre precedentemente ricoperte da fibronectina.

B. caratterizzazione immunologica delle cellule isolate

La caratterizzazione immunologica delle cellule isolate da microcircolo cutaneo à ̈ stata eseguita su vetrini da 8 pozzetti mediante citometria a flusso usando il pannello di markers fenotipici di seguito riportati in tabella:

Anticorpo Classe Diluizione Produzione αCD31-FITC topo 1:25 Immunotools αCD9-FITC topo 1:25 Immunotools αCD13-FITC topo 1:25 Immunotools αCD105-FITC topo 1:25 Immunotools IgG2a-FITC topo 1:25 Immunotools ULEX-FITC lectina 1:25 Sigma

αvWF topo 1:40 Dako

αVIM topo 1:50 Sigma

αVE-caderina topo 1:100 Dejana

αNG2 coniglio 1:100 Chemicon αalfaSMA topo 1:100 Chemicon

Immunofluorescenza

Il vetrino da 8 pozzetti precedentemente trattato prima con Poly-L-Lysine e successivamente ricoperto con fibronectina à ̈ stato ricoperto dalle ADMEC coltivate nell’apposito terreno di coltura. Per l’analisi le cellule sono state fissate con paraformaldeide 1%, e quelle che prevedevano una marcatura con Ab che riconosce Ag intracellulari sono state permeabilizzate con una soluzione contenete HEPES 20mM, Saccarosio 300mM, NaCl 50mM, MgCl23mM, pH 7,4, Triton 0,5%. Le cellule sono state poi incubate per due ore a temperatura ambiente con gli anticorpi primari e in seguito a lavaggi effettuati con la pompa peristaltica si à ̈ proceduto con l’incubazione per un’ora a temperatura ambiente con gli anticorpi secondari marcati con fluoresceina.

Citometria a flusso

Le cellule endoteliali sono state fatte crescere fino a raggiungere la confluenza, quindi staccate tramite una soluzione di EDTA 5mM in ghiaccio e contate in modo da avere 5x10<5>cellule per prova.

Per antigeni di superficie

Le cellule sono state incubate con gli anticorpi primari indicati nella tabella soprastante, utilizzati ad una concentrazione finale di 10µg/ml, per un’ora a 37°C in agitazione e se necessario il legame dell’anticorpo primario à ̈ stato rivelato mediante l’utilizzo di un anticorpo secondario marcato con fluoresceina per 30 minuti in ghiaccio. L’anticorpo non legato à ̈ stato lavato via e le cellule sono state risospese in 500 µl di paraformaldeide diluita all’ 1%. Le successive letture sono state fatte allo strumento (FACSCalibur, Becton Dickinson).

Per antigeni intracellulari:

Le cellule sono state fissate e permeabilizzate usando un kit di fissazione e permeabilizzazione (Caltag) e successivamente incubate con gli anticorpi come sopra descritto.

Saggio ELISA

Le ADMEC sono state fatte crescere fino a confluenza in piastre da 96 pozzetti, precedentemente ricoperti da fibronectina. Le cellule, incubate o meno con gli stimoli (lipopolisaccaride 0,5µg/ml), sono state lavate delicatamente con PBS contenente il 2% di BSA, CaCl2e MgCl2, ed incubate con gli anticorpi primari anti-VCAM1, anti-Eselettina, anti-ICAM1. Dopo 3 lavaggi, il legame dell’anticorpo primario à ̈ stato rilevato mediante un anticorpo policlonale anti mouse IgG coniugato con la fosfatasi alcalina, incubato 30 minuti a 37°C. Quindi dopo 3 lavaggi, l’enzima à ̈ stato fatto reagire con il substrato paranitrofenilfosfato (PNPP) (1mg/ml) e l’analisi colorimetrica à ̈ stata effettuata con un lettore ELISA Titertek Multiskan (Flow Laboratories, Milano, Italia) alla lunghezza d’onda di 405 nm.

Saggio di permeabilità endoteliale

Sono state seminate 20.000 ADMEC su un filtro di policarbonato del sistema a doppia camera Transwell (Corning), precedentemente ricoperto da fibronectina. I filtri così preparati sono stati usati 5-6 giorni dopo la semina (Bossi et al., J Immunol. 2004, Dec 1;173(11):6921-7; Bossi F et al., J Allergy Clin Immunol.2009 Dec;124(6):1303-10; Bossi F et al., Allergy. 2011 Dec;66(12):1538-45). La formazione di un monostrato perfettamente confluente ed intatto à ̈ stata monitorata aggiungendo nella camera superiore albumina bovina coniugata con fluoresceina, in concentrazione pari a 1mg/ml, e misurando, dopo 7 minuti di incubazione a 37°C, la quantità di albumina passata nella camera inferiore del sistema, utilizzando il lettore di fluorescenza Infinite200 (Tecan).

Ai filtri che sono risultati integri sono addizionati nella camera superiore gli stimoli (la bradichinina o il Platelect Activating Factor) alla concentrazione di 10<-6>M e la permeabilità à ̈ stata valutata dopo 15 minuti.

Risultati

Caratterizzazione immunologica

Per accertare la purezza delle ADMEC isolate si à ̈ ricercata la presenza dei marcatori specifici per le cellule endoteliali: sono state analizzate molecole quali il von Willebrand Factor (vWF), la vimentina, la VE-caderina.

A tal fine le cellule sono state coltivate su vetrini da 8 pozzetti fino al raggiungimento della confluenza, come dimostrato dalla Figura 1, e sono state incubate con anticorpi primari o già marcati con fluoresceina o con anticorpi secondari coniugati con lo stesso fluorocromo. Alcuni campioni sono stati permeabilizzati per permettere così il riconoscimento dell’antigene a localizzazione intracellulare. Dai dati ottenuti si à ̈ potuto confermare che le ADMEC esprimono i tipici marcatori fenotipici endoteliali.

Come si può apprezzare dalle immagini rappresentate in Figura 2 il pattern di espressione del vWF si presenta granulare, poiché tale molecola à ̈ localizzata all’interno dei corpi di Weibel-Palade, granuli secretori specificamente presenti in cellule endoteliali e piastrine.

La Vimentina à ̈ una proteina dei filamenti intermedi, per questo motivo ci appare come una rete filamentosa distribuita uniformemente in tutta la cellula.

La VE-caderina (CD144) à ̈ una proteina di membrana concentrata maggiormente nei punti di giunzione intercellulare che permette a cellule adiacenti di connettersi tra loro mediante formazioni di giunzioni aderenti; l’immmunofluorescenza ha messo in evidenza questa sua disposizione perimetrale che delinea il profilo delle cellule.

I dati ottenuti con l’immunofluorescenza sono stati confermati anche mediante citofluorimetria (Figura 3). Con tale tecnica abbiamo inoltre analizzato la presenza di altri marcatori quali il CD31, il CD105 e il legame della lectina Ulex Europaeus I. Funzionalità cellulare

Per verificare le capacita fisiologiche delle ADMEC isolate di rispondere agli stimoli proinfiammotori sono stati utilizzati 2 diversi approcci: l’espressione delle molecole di adesione mediante saggio ELISA su cellule e l’aumento della permeabilità endoteliale utilizzando un modello transwell.

Nel primo modello à ̈ stata valutata l’espressione delle molecole di adesione che normalmente vengono esposte sulla membrana cellulare in seguito a stimolazione con citochine o molecole pro-flogogene quali il TNF-α o il LPS. Nel secondo caso à ̈ stata analizzata la risposta in termini di aumento del passaggio della albumina marcata con fluoresceina attraverso il monostrato endoteliale a seguito della stimolazione con noti fattori vaso-attivi come il platelet activating factors (PAF) o la bradichinina (BK). Come mostrato dai valori (O.D. 405nm) in Tabella 1 le ADMEC stimolate sia con TNF-α che con LPS sono capaci di esporre sulla membrana alti livelli di E-selectin, ICAM-1 e anche VCAM-1. La Tabella 2 mostra invece l’abilità delle ADMEC di rispondere in modo molto efficiente sia al PAF che alla BK (valori espressi come Unita di Fluorescenza dell’ albumina passata attraverso il monostrato endoteliale). Questi dati indicano quindi che le ADMEC isolate e mantenute in coltura mantengono le loro capacità responsive normali, non sono attivate in condizioni basali e rispondono ottimamente agli stimoli.

Tabella 1

Valori

controllo TNF-α LPS (O.D.405 nm)

E-selectin 0,35±0,07 1,12±0,28 * 1,75±0,35 *

ICAM-1 0,7±0,1 1,72±0,27 * 1,7±0,26 *

VCAM-1 0,1±0,02 0,95±0,1 * 0,8±0,11 *

Tabella 2

Valori

untreated PAF BK (Unità di Fluorescenza)

BSA-leakage 500±80 1450±200 * 1750±300 *

Esempio 2. Studio in vitro delle capacità delle cellule endoteliale del microcircolo dermico a formare strutture capillari su una matrice 3D di collagene bovino commerciale

Per analizzare la capacità delle cellule a formare capillare quando seminate su una matrice acellulare biocompatibile sono state effettuati saggi di proliferazione e dose-risposta su una matrice 3D usualmente impiegata in clinica come sostituto dermica. Si tratta di una matrice commerciale a doppio strato, in cui la porzione biologica à ̈ costituita da collagene bovino e glicosamminoglicani combinata con uno stato semi-impermeabile e poroso costituito da polisilossani (Integra<®>). La cute artificiale Integra<®>à ̈ un sistema costituito da una membrana a doppio strato adatto alla sostituzione cutanea. Lo strato per la sostituzione del derma à ̈ formato da una matrice porosa di fibre di collagene reticolato di tendine bovino e dal GAG condroitina-6-solfato. Questa porzione soggetta a biodegradazione, durante il processo di guarigione, viene sostituita da collagene prodotto e depositato dai fibroblasti dell’ospite che l’hanno infiltrata. Lo strato per la sostituzione dell’epidermide à ̈ invece costituito da un sottile film di polisilossano (silicone) diretto a controllare la perdita di umidità della ferita e limitare le infezioni.

La matrice à ̈ stata tagliata in quadrati di circa 1cm<2>e posizionata all’interno dei pozzetti di una piastra da 24. Quindi à ̈ stato aggiunto goccia a goccia il terreno di coltura contenente i quantitativi cellulari previsti per le varie prove. Sono stati effettuati saggi di proliferazione dove si sono utilizzate 5x10<5>cellule per le tempistiche di 5 minuti, 2 ore, 7 e 14 giorni; e saggi dose risposta dove si sono utilizzate 5x10<4>, 10<5>, 2x10<4>cellule ciascuna per le tempistiche di 5 minuti, 7 e 14 giorni. Le piastre sono state poi posizionate nell’incubatore a 37°C in atmosfera con il 5% di CO2. Ogni 2 giorni à ̈ stato effettuato il cambio di terreno.

Al termine di ogni tempo, sono stati effettuati tre lavaggi del campione in PBS incubati successivamente con 60 µL di MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5 diphenyl tetrazolium bromide) diluiti in 600µL di terreno di coltura fresco per verificare la vitalità delle cellule e la densità cellulare all’interno delle matrici. Come noto, infatti, si tratta di saggio colorimetrico standard per la misurazione dell'attività dell’ enzima mitocondriale succinato deidrogenasi che, attivo soltanto nelle cellule vive, agisce riducendo l'MTT a formazano (tagliando l'anello di tetrazolio), conferendo alla sostanza un colore blu/violaceo. I campioni vengono lasciati a 37°C in atmosfera al 5% di CO2per 18 ore. Successivamente, dopo aver aspirato il terreno ed effettuato due lavaggi con dPBS, sono stati eseguite valutazioni fotografiche. Sono stati poi vengono aggiunti 800 µL di DMSO (dimetilsolfossido) e la piastra à ̈ stata posizionata su un agitatore a temperatura ambiente per quattro ore, affinché il sale intracellulare insolubile formato venga reso solubile e rilasciato dalla cellula. Quindi à ̈ stata effettua la lettura allo spettrofotometro alla lunghezza d’onda di 570nm.

Risultati

Saggio di proliferazione

Per valutare la capacità delle ADMEC di ancorarsi e crescere su una matrice 3D di collagene bovino, un quantitativo fisso di 500.000 cellule per prova à ̈ stato seminato e monitorato fino al quattordicesimo giorno.

Le immagini riportate di seguito (Figura 4) sono state scattate al microscopio invertito per ciascuna tempistica allo scadere dell’incubazione con il MTT. Dalla colorazione violacea si à ̈ osservato che, anche solo dopo 5 minuti dalla semina le cellule endoteliali isolate sono in grado di ancorarsi alla matrice. L’analisi della sopravvivenza cellulare e della capacità proliferativa delle cellule all’interno di questa matrice à ̈ stata valutata in tempi più lunghi. In particolare la presenza e il metabolismo cellulare sono stati valutati mediante MTT dopo 2 ore, 7 e 14 giorni di coltura. L’intensità del colore presente nella matrice, che deriva dal deposito dei Sali di formazano (Figura 4), dimostra la capacità delle ADMEC di proliferare al suo interno. Le immagini risultanti dalle analisi del tempo 2 ore a confronto con quelle dei 7 e 14 giorni dimostrano che già dopo una settimana le cellule hanno proliferato e la matrice à ̈ stata completamente colonizzata. Come controllo negativo à ̈ stata usata la matrice trattata esclusivamente con il terreno di crescita e infatti in questo caso non si evidenzia alcun deposito colorato.

A conferma delle immagini, si à ̈ effettuata la lettura allo spettrofotometro (Tabella 3) mettendo in evidenza quanto sopra descritto. Un maggiore O.D. à ̈ associato a un maggior quantitativo di cellule vive all’interno della matrice che provoca quindi un maggiore metabolismo del MTT da parte dell’enzima mitocondriale.

Tabella 3

Tempo controllo 5 minuti 2 ore 7 giorni 14 giorni Valori

0,2 2 2,25 3,18 3,8 (O.D.570nm)

Saggio dose risposta

Il saggio in esame à ̈ stato utile per capire quali fossero le potenzialità di crescita delle cellule all’interno della matrice in rapporto al loro numero di partenza al momento della semina. In questo modo à ̈ possibile, ottimizzare i tempi di crescita e i quantitativi di cellule da utilizzare.

Dalla Tabella 4 sottostante (valori O.D. 570nm) si evince che, indipendentemente dalla concentrazione iniziale di cellule inoculate, le ADMEC raggiungono un “plateau di crescita†, colonizzando totalmente la matrice, in un tempo pari a 14 giorni.

Tabella 4

5 minuti 7 giorni 14 giorni

Controllo 0,2 0,25 0,21 50.000 cells 0,25 1,6 2,6

100.000 cells 0,4 1,7 2,4

200.000 cells 0,75 2,25 2,55

Per quanto riguarda la tempistica dei 5 minuti si nota come al variare della concentrazione di ADMEC si ottiene una diversa intensità di colorazione proprio a testimoniare il differente quantitativo di cellule seminate (Figura 5). Dopo 14 giorni invece, la matrice risulta essere pienamente colonizzata e la colorazione à ̈ pressoché identica tra in campione che inizialmente conteneva solo 50.000 cellule rispetto a quella che partiva con un quantitativo quattro volte maggiore (Figura 5). I dati mostrano che una matrice 3D di collagene rappresenta un ottimo scaffold per l’attecchimento e la proliferazione delle ADMEC. Il dato più importante sicuramente ai fini terapeutici à ̈ l’adesione che si osserva in tempi brevi (5 minuti). Esempio 3. Studio in vitro delle capacità delle cellule endoteliale del microcircolo dermico a formare strutture capillari su una matrice 3D consistente Derma De-Cellularizzato (DED)

Il derma de-cellularizzato à ̈ stato ottenuto a partire da una biopsia cutanea in soluzione fisiologica. La biopsia à ̈ stata quindi tagliata in campioni da 1cm<2>e lasciata macerare in PBS per 3-5 giorni a 37°C, permettendo così la rimozione dell’epidermide.

Il tessuto à ̈ stato sottoposto a 5 cicli di congelamento-scongelamento in azoto liquido. Tutti i pezzi sono stati immersi per 20’ in una soluzione allo 0,1% di Sodio Dodecil Solfato (SDS) diluito in PBS per dissolvere la componente cellulare. Successivamente sono stati eseguiti due lavaggi in PBS per 5’ per rimuovere le cellule lisate ed i residui di SDS; i campioni sono stati poi lasciati 10’ in etanolo al 70% per sterilizzarli e infine sono stati eseguiti due lavaggi per la rimozione dell’etanolo. I pezzi così trattati vengono lasciati in PBS prima di essere trattati con le cellule endoteliali isolate da microcircolo dermico. Quindi, su ciascun campione di DED sono state seminate 100.000 cellule (1x10<5>) risospese in 100µL di terreno di coltura secondo lo schema riportato di seguito. Le cellule sono state inoculate nella parte dermo-papillare del DED dopo decellularizzazione. Come controllo negativo à ̈ stato usato un campione di DED non trattato con le cellule endoteliali. I campioni allo scadere dei 5 minuti, 7 giorni, 14 giorni e 21 giorni sono stati inclusi in Killik-Matrice di inclusione per taglio al criostato (Bio Optica, Milano) e congelati in azoto liquido.

Il processo di neo-angiogenesi à ̈ stato studiato sulle sezioni congelate mediante analisi istologica e di immunofluorescenza.

Le sezioni di 9µm sono state colorate con ematossilina/eosina e marcate utilizzando come anticorpo primario il mAb vWF e come anticorpo secondario l’anticorpo anti-mouse-Cy2. Le sezioni sono poi state esaminate al microscopio a fluorescenza e fotografati.

Risultati

L’esame istologico effettuato sulle sezioni congelate del controllo negativo mediante colorazione con ematossilina/eosina ha dimostrato solo la presenza di fibre di collagene frammentato, e l’assenza di cellule (Figura 6). Tale dato à ̈ stato anche confermato mediante marcatura con anticorpo anti-vWF.

Sulle sezioni à ̈ stata eseguita un’analisi di immunofluorescenza e le cellule endoteliali presenti nel DED sono state messe in evidenza grazie alla marcatura con l’anticorpo anti-vWF.

Nei primi campioni dove le cellule erano state lasciate sulla matrice per soli 5 minuti si à ̈ individuata la loro presenza ma la loro organizzazione era casuale per cui il campione non à ̈ stato fotografato.

Dopo una settimana si à ̈ osservato nella parte centrale del DED la formazione di strutture tubulari piuttosto irregolari (Figura 7).

Al giorno 14 si osservano delle strutture vascolari di maggiori dimensioni e con la superficie vascolare meglio delineata (Figura 8).

Al 21esimo giorno si à ̈ notato che il numero di vasi formati à ̈ aumentato e che le ADMEC si distribuiscono nella zona corrispondente a quella del plesso papillare, suggerendo che il numero di cellule nel DED à ̈ aumentato favorendo la colonizzazione che si à ̈ diffusa a più livelli del derma (Figura 9).

Esempio 4. Studio in vivo su ratti

Una biopsia cutanea di 1cm<2>à ̈ stata prelevata dal dorso di un ratto Wistar maschio (9 mesi, 850-950g) per l’isolamento delle cellule microvascolari cutanee (REC). Successivamente, dopo che le REC sono state espanse in vitro fino al raggiungimento di un numero sufficiente per il saggio sperimentale, lo stesso animale à ̈ stato usato per il trattamento autologo. Durante l’esperimento i ratti (n=3) sono stati stabulati in gabbia singola e in condizioni ambientali controllate (ciclo buio/luce di 12 ore, temperatura di 23°C). Dopo anestesia generale con 3-Bromethanol (1,5ml/100gr) e anestesia locale con Lidocaina, il pelo à ̈ stato rasato e la cute disinfettata. Vengono effettuate sul dorso del ratto 6 biopsie a tutto spessore (8 mm di diametro). Tre ulcere così prodotte vengono trattate con una sospensione cellulare (500.000 cell./200µl) usando una siringa e tre ulcere vengono trattate con solo il terreno di coltura come controllo. Dopo 7 e 14 giorni sono state effettuate delle biopsie della cute trattata e non con le REC e il prelievo à ̈ stato incluso in OCT e congelato in azoto liquido per effettuare successivamente l’indagine istologica. Le sezioni di tessuto congelato sono state fissate in acetone e quindi usate per colorazione con ematossilina/eosina, colorazione di PAS e immunofluorescenza.

Risultati

I parametri usati per la valutazione dell’efficacia del trattamento sono: le formazione del tessuto di granulazione, l’induzione della neoangiogenesi in termini di numero e morfologia dei vasi formati. L’esame ha evidenziato delle differenze di modesta entità tra le ulcere trattate rispetto a quelle non trattate con le cellule dopo 7 giorni, eccetto per un moderato aumento del tessuto di granulazione, ricco in fibroblasti e cellule infiammatorie distribuite uniformemente tra le fibre di collagene. Per quanto riguarda il processo di neoangiogenesi, numerosi vasi capillari sono stati osservati nel tessuto di granulazione, con una certa predominanza nelle ulcere trattate con la sospensione cellulare. Dopo 14 giorni, si notano molto evidenti differenze tra le ulcere trattate con le cellule endoteliali rispetto a quelle di controllo. Il numero di vasi ben strutturati e di grosso calibro (indicati dalle frecce) localizzati nello strato dermico più profondo e lungo il pannicolo carnoso sono molto più numerosi nelle ulcere trattate (Figura 10).

Claims (10)

1. Rivendicazioni 1. Un dispositivo comprendente cellule endoteliali ed una matrice tridimensionale biocompatibile, in cui le cellule endoteliali sono adulte e la matrice tridimensionale à ̈ una matrice acellulare scelta tra derma decellularizzato e matrici comprendenti componenti della matrice extracellulare.
2. 2. Il dispositivo comprendente cellule endoteliali ed una matrice tridimensionale biocompatibile secondo la rivendicazione 1, in cui le cellule endoteliali sono cellule del microcircolo dermico ed autologhe.
3. 3. Il dispositivo comprendente cellule endoteliali ed una matrice tridimensionale biocompatibile secondo la rivendicazione 1, in cui la matrice à ̈ costituita da almeno un singolo strato di componenti della matrice extracellulare scelti tra collagene, glicosaminoglicani, elastina e loro derivati e combinazioni tra di loro.
4. 4. Il dispositivo comprendente cellule endoteliali ed una matrice tridimensionale biocompatibile secondo la rivendicazione 3, in cui le combinazioni sono collagene-glicosaminoglicani e derivati degli stessi o collagene-elastina e derivati della stessa.
5. 5. Il dispositivo comprendente cellule endoteliali ed una matrice tridimensionale biocompatibile secondo la rivendicazione 1, in cui le cellule endoteliali sono selezionate e seminate sulla matrice alla densità di almeno 10<5>x1cm<2>.
6. 6. Il dispositivo comprendente cellule endoteliali ed una matrice tridimensionale biocompatibile secondo la rivendicazione 5, in cui le cellule endoteliali selezionate sono seminate sulla matrice ad una densità compresa tra 1x10<5>x1cm<2>e 5x10<4>x1cm<2>.
7. 7. Il dispositivo comprendente cellule endoteliali ed una matrice tridimensionale biocompatibile secondo la rivendicazione 1, in cui la matrice ha uno spessore di almeno 0,3 mm.
8. 8. Il dispositivo comprendente cellule endoteliali ed una matrice tridimensionale biocompatibile secondo la rivendicazione 7, in cui la matrice ha uno spessore compreso tra 0,5 e 4 mm.
9. 9. Il dispositivo comprendente cellule endoteliali ed una matrice tridimensionale biocompatibile secondo una delle rivendicazioni da 1 a 8 per uso nel trattamento di lesioni cutanee.
10. 10. Un kit per la preparazione di un dispositivo secondo una delle rivendicazioni da 1 a 8 comprendente una matrice biocompatibile acellulare, strumenti e reagenti per la preparazione delle cellule endoteliali ed un foglietto di istruzioni per uso nel trattamento di lesioni cutanee.