JP2005525153A - 皮膚障害の治療のための、未分化胎児細胞を含む組成物 - Google Patents

Abstract

本発明は、皮膚の病気、障害または疾患に罹患した被験体を処置するために設計された、方法および組成物を包含する。これらの組成物は、コラーゲンマトリックスに組み込まれるか、またはキャリアに組みこまれたかのいずれかの未分化胎児皮膚細胞を含む。本発明の構築物は、あらゆる方向において適用し得、それらを様々な適用に有用にする。いくつかの実施態様において、その構築物の未分化胎児細胞は、適切な培養条件下で真皮線維芽細胞または表皮ケラチン生成細胞に分化し得るもののような、胎児皮膚細胞であり得る。様々な実施態様において、未分化胎児細胞のコラーゲンとの組み込みは、混合、化合、ピペッティング、播種、プレーティング、または細胞をコラーゲンと共に配置することによって起こり得る。１つの好ましい実施態様において、構築物のコラーゲンマトリックスは、ウマコラーゲンマトリックスである。

Description

（発明の分野）
本発明は、一般的に皮膚の病気、障害または疾患に罹患した被験体を治療するために設計された、方法および組成物に関連する。その組成物は、コラーゲンマトリックスに組み込まれるか、またはキャリアと組み合せた未分化胎児皮膚細胞を含む。

（本発明の背景）
創傷（すなわち、裂傷、開口部、または潰瘍）は、急性または慢性のいずれかであり得る。急性創傷は、典型的にはほとんど組織の喪失を伴わない皮膚への鋭利な損傷である。ほとんどの急性創傷は、創傷の端を合わせることによって閉鎖および治癒する。慢性創傷は、完全に治癒しない、または治癒するのが遅い創傷である。慢性創傷の例は、床ずれ（褥瘡性潰瘍）、糖尿病性皮膚潰瘍、静脈うっ血性潰瘍、熱傷損傷、および腫瘍の摘出後に起こる欠損を含む。

創傷の細胞形態学は、３つの区別できる領域を含む：中央創傷区域、局所虚血の勾配領域（ｇｒａｄｉｅｎｔ ｚｏｎｅ）、および活発なコラーゲン合成の領域。創傷（すなわち、重度の熱傷、外科的切開、裂傷および他の外傷）のより迅速な治癒の必要性にもかかわらず、現在まで医薬品による創傷治癒の加速においては、限られた成功しか存在しなかった。

創傷治療の主要な目的は、創傷の閉鎖を達成することである。開放皮膚創傷は、創傷の１つの主なカテゴリーを代表し、それは急性外科的および外傷創傷、例えば慢性潰瘍、熱傷創傷、およびニューロパシー潰瘍、床ずれ、動脈および静脈（うっ血性）または混合動脈−静脈潰瘍、および糖尿病性潰瘍のような慢性創傷を含む。典型的には、これらの創傷は以下の過程によって治癒する：ｉ）炎症、ｉｉ）線維芽細胞の増殖、ｉｉｉ）血管の増殖、ｉｖ）結合組織の合成、ｖ）上皮化、およびｖｉ）創傷の収縮。創傷の治癒は、これらの構成要素が、個々にまたは全体としてのいずれかで、適切に機能しない場合に損なわれる。創傷治癒に影響を与え得る因子は、栄養不足、感染、医薬品（例えば細胞毒性薬剤およびコルチコステロイド）、糖尿病、および高齢を含む。Ｈｕｎｔら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｓｕｒｇｉｃａｌ Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ＆ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ（Ｗａｙ；Ａｐｐｌｅｔｏｎ ＆ Ｌａｎｇｅ）、８６−９８頁（１９８８）を参照のこと。

慢性創傷を治療するために、多くの異なる製品およびプロトコールが利用可能である。例えば、Ｊｏｎｅｓら、Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｌａｓｔｉｃ Ｓｕｒｇｅｒｙ ５５：１８５−１９３、２００２を参照のこと。これはその全体が本明細書中に参考として援用される。これらは、単純な包帯（特に圧迫包帯）、フォームおよびフィルム、ゲルおよびコロイド、および増殖因子のような医薬製品を含む。典型的には、乾燥した非閉鎖包帯の使用よりも、湿った閉鎖包帯による創傷治癒が使用される。Ｗｉｎｔｅｒ、Ｎａｔｕｒｅ １９３：２９３−９４（１９６２）を参照のこと。今日では、多くの型の包帯が創傷治癒において日常的に使用される。これらは、フィルム（例えばポリウレタンフィルム）、親水コロイド（ポリウレタンフォームに結合した親水性コロイド粒子）、ヒドロゲル（少なくとも約６０％の水を含む架橋ポリマー）、フォーム（親水性または疎水性）、アルギン酸カルシウム（アルギン酸カルシウム由来の線維の不織布合成物）、およびセロファン（可塑剤を含むセルロース）を含む。Ｋａｎｎｏｎら、Ｄｅｒｍａｔｏｌ．Ｓｕｒｇ．２１：５８３−５９０（１９９５）；Ｄａｖｉｅｓ、Ｂｕｒｎｓ １０：９４（１９８３）を参照のこと。ある型の創傷（例えば、糖尿病性潰瘍、床ずれ）およびある患者（例えば外来性コルチコステロイドを受けている人）の創傷は、これらの創傷包帯の使用によって、時宜を得た方式で（または全く）治癒しない。

研究は、適切なレベルの持続する段階的圧迫の適用によって、大部分の潰瘍を治癒するよう誘導し得ることを示した。静脈疾患を有する患者に関しては、段階的な外部圧迫の適用が、間隙空間からの液体を血管およびリンパ区画へ戻すことにより、静脈系の遮断または損傷による皮膚および血管の変化を最小限にする、または逆転させるのを助け得る。通常使用される３つの型の包帯が存在する：
Ｉ型：軽量順応伸縮性包帯：
これらの包帯は、単純な包帯保持機能を有する製品を含み、そしてそれらは運動を制限することなく手足または関節に順応するべきである。
ＩＩ型：軽度支持包帯：
これらの包帯は、浮腫の形成を防止するために、および軽度の捻挫（ｓｐｒａｉｎｓまたはｓｔｒａｉｎｓ）の管理において支持を与えるために使用される製品を含む。
ＩＩＩ型：圧迫包帯：
これらの包帯は、圧迫の適用に依存する製品を含む。それらは、下肢の静脈障害の治療において、浮腫を調節し、そして腫れを抑制するために、もっともよく採用される。圧迫包帯は、前もって決定されたレベルの圧迫を産生するそれらの能力によって、４つのグループに分けられた。

ＩＩＩａ型：軽度圧迫包帯は、平均的な寸法の足首に２０ｍｍＨｇまでの低レベルの圧迫を提供および維持することができる。この型の製品の臨床的適応は、表面的または初期の静脈瘤、および妊娠中に形成される静脈瘤症の管理を含む。一般的に、それらは存在する浮腫を制御または抑制するために、または非常に大きな手足に一様な低レベルの圧迫を適用するために適切ではない。

ＩＩＩｂ型：中程度の圧迫包帯は、平均的な寸法の足首に３０ｍｍＨｇの程度で圧迫を適用するために使用される。それらは、妊娠中の静脈瘤症、中程度の重症度の静脈瘤の治療、潰瘍の予防および治療、および軽度の浮腫の調節のために指示される。

ＩＩＩｃ型：高度の圧迫包帯は、平均的な寸法の足首に４０ｍｍＨｇの程度で高レベルの圧迫を適用するために使用し得る。これらの包帯の適応症は、重症の静脈瘤、血栓症後の静脈不全の治療、および足潰瘍および平均的な周囲の手足における重度の浮腫の管理を含む。このカテゴリーの製品は、浮腫の存在によってさらに肥大した非常に大きな手足に対してこれらのレベルの圧迫を達成し得る必要はない。

ＩＩＩｄ型：超高性能圧迫包帯は、５０ｍｍＨｇを越える圧迫を適用することができる。これらの包帯の力は、最も大きなおよび最も浮腫的な手足に対してさえ、長期間にわたってこれらの圧迫を適用および維持することが予測できるほどである。

さらに、いくつかの医薬品様相（例えば、硫酸亜鉛、ビタミンＡ、ＣおよびＤ、カルシウム、マグネシウム、銅および鉄の投与）も、創傷治癒を改善する試みにおいて利用された。しかし、非常に限られた状況を除いて、これらの薬剤による創傷治癒の促進は、ほとんど成功しなかった。

１９８０年代の中頃、Ｄｒ．Ｈｏｗａｒｄ Ｇｒｅｅｎは、ケラチン生成細胞のようなヒト皮膚細胞を増殖させる方法を考えた。Ｇｒｅｅｎら（１９７９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃｅｄ．Ｓｃｉ．７６：５６６５を参照のこと。これらの方法に基づく製品であるＥｐｉｃｅｌ^ＴＭは、重度の熱傷によって起こるもののような、移植（皮膚置換）を必要とする深い創傷を治療するために使用される。しかし、Ｅｐｉｃｅｌ^ＴＭは、失われた表皮層を置換するのみであるので、それは皮膚の真皮層を修復するものと組み合せて最も有効である。実際、Ｅｐｉｃｅｌ^ＴＭは、人工皮膚ではなく、むしろ研究室において患者の熱傷を負っていない領域から外科的に取られた皮膚細胞から、新規表皮層を「注文に応じて増殖させる」方法である。従って、Ｅｐｉｃｅｌ^ＴＭは、自己由来移植片として機能する。米国特許第４，０１６，０３６および４，３０４，８６６号を参照のこと。

無傷の皮膚がほとんど残っていない、または全く残っていない非常に重度の熱傷患者において、人工皮膚は非常に有用な材料であり、それは創傷領域を覆い、そして保護するだけでなく、瘢痕組織ではなく自然な皮膚の再増殖を促進する。

多くの新規人工皮膚は、最初関連するドナー（同様の遺伝的マーカーを有する家族メンバーのような）からの皮膚を使用した。しかし、それは移植片が拒絶されないように、患者の免疫系を抑制するために強力な免疫抑制剤の同時投与を必要とした。この方法で患者の免疫系を無能にすることは、患者にとってさらなる深刻な問題を引き起こし得る。代わりに、患者自身の熱傷を負っていない皮膚（多くの場合ほとんど熱傷を負わない頭皮由来）が、移植片材料の供給源として通常使用される。

しかし、そのような皮膚移植片（または死体から取った皮膚でさえ）の使用は、問題を永久に解決しない。皮膚を回復させるある型の人工的手段の必要性も存在する。合成製品の使用も、そのような材料は疾患を伝染させ得るウイルス、細菌および他の病原体を含まないという利点を提供する。

例えば、Ｊｏｈｎｓｏｎ＆Ｊｏｈｎｓｏｎの会社であるＥｔｈｉｃｏｎ Ｉｎｃ．は、生きた構成要素を含まない、そして実際はそれ自体は置換皮膚として設計されていない製品である、Ｉｎｔｅｇｒａ（登録商標）の独占的マーケティングおよび販売権を得た。むしろ、それは保護的カバーおよび患者自身の皮膚細胞が、熱傷によって破壊された皮膚の下部、真皮層を「再生」し得る柔軟な足場を提供する。米国特許第５，４８９，３０４号を参照のこと。生きた皮膚が構築されているように、Ｉｎｔｅｇｒａ（登録商標）は２つの層から成る。本物の皮膚の下部、真皮層を「再生」するよう設計された下部層は、真皮の繊維状パターンを模倣するウシコラーゲンおよびグリコサミノグリカンを織り合わせたマトリックスからなる。このマトリックスを、次いで一時的な上部層、皮膚の表皮、または表面層を模倣する、臨床グレードの、柔軟なシリコンシートに添付する。Ｉｎｔｅｇｒａ（登録商標）で創傷領域を覆い、そして２から４週間そこに維持し、その間に、患者自身の細胞がマトリックス中に進み、そして新規真皮を産生する。Ｉｎｔｅｇｒａ（登録商標）の上部層を次いで除去し、そして患者自身の上皮細胞の非常に薄いシートを次いで適用する。時間と共に、表皮層がこれらの細胞から再構築される。

市場の別の製品であるＡｌｌｏＤｅｒｍ^ＴＭは、Ｔｈｅ ＷｏｏｄＬａｎｄｓ、ＴｅｘａｓのＬｉｆｅＣｅｌｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎによって販売および製造されている。それは、死体皮膚から、熱傷患者の免疫系があらゆる他の人からの移植片を拒絶する原因となる全ての細胞構成成分を除去することによって産生される。この過程の重要な特徴は、真皮の「自然な」３次元構造の、可能な限りの保存である。この足場に適切に近づけることが、本物の真皮（ＡｌｌｏＤｅｒｍ^ＴＭにおけるような）または人工真皮（Ｉｎｔｅｇｒａ（登録商標）におけるような）由来にかかわらず、患者の残った細胞がそれら自身を新規の機能する皮膚へ再生する能力に非常に重要である。

Ｄｅｒｍａｇｒａｆｔ（Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｔｉｓｓｕｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）は、足場として知られる、生体適合性、化学的基盤にまいた、ヒト間質細胞（例えば新生児組織由来の線維芽細胞）から研究室条件下で増殖させた製品である。米国特許第５，４６０，９３９号を参照のこと。典型的には、そのような足場はポリグリコール酸から作成され、それは外科的縫糸および外科的糊のような、多くの「再吸収」医学的材料の基礎である。体に適用されると、足場はグリコール酸および乳酸に分解し、それは血流によって運び去られ、そして二酸化炭素、酸素および水に代謝される。

別の組織工学的皮膚、Ｏｒｇａｎｏｇｅｎｅｓｉｓによって製造されるＡｐｌｉｇｒａｆ（登録商標）は、皮膚の表皮および真皮層を模倣する、生きた２層の皮膚代替物である。Ａｐｌｉｇｒａｆ（登録商標）は、生きた２つの型のヒト皮膚細胞、表皮ケラチン生成細胞および真皮線維芽細胞で作られる。さらに、Ａｐｌｉｇｒａｆ（登録商標）は、真皮層単独によって提供されない、さらなるサイトカインおよび増殖因子を伝達する。米国特許第４，８３７，３７９号を参照のこと。

上記で記載された現在の技術および適用は、全てある重要な特徴を欠く。従って、１つまたはそれ以上の前述の問題を克服する、３次元皮膚組織同種移植片構築物を提供することが、本発明の目的である。

必要とされるのは、安全および有効な、創傷の型または患者集団の性質に関わらず使用し得る、創傷の治癒を増強する手段である。

（発明の要旨）
１つの実施態様において、本発明は、コラーゲンマトリックスに組み込まれた未分化胎児細胞を含む、３次元皮膚組織同種移植片構築物を開示する。本発明の構築物は、あらゆる方向において適用し得、それらを様々な適用に有用にする。いくつかの実施態様において、その構築物の未分化胎児細胞は、適切な培養条件下で真皮線維芽細胞または表皮ケラチン生成細胞に分化し得るもののような、胎児皮膚細胞であり得る。様々な実施態様において、未分化胎児細胞のコラーゲンとの組み込みは、混合、化合、ピペッティング、播種、プレーティング、または細胞をコラーゲンと共に配置することによって起こり得る。当業者は、組み込みのあらゆる手段を採用し得ることを認識する。１つの好ましい実施態様において、構築物のコラーゲンマトリックスは、ウマコラーゲンマトリックスである。

別の局面において、本発明は、ドナー胎児組織から生検材料を回収する；その胎児組織から細胞系統を発達させる；胎児組織を増殖および未分化胎児細胞を高濃度に増殖させて移植片を取る細胞バンクを産生する；および移植片をコラーゲンマトリックスに組み込むことによって、３次元皮膚組織同種移植片構築物を調製する方法を提供する。

さらに別の局面において、本発明は、未分化胎児細胞を得る；未分化胎児細胞を増殖させる；および未分化胎児細胞をコラーゲンマトリックスに組み込むことによって、３次元皮膚組織同種移植片構築物を調製する方法を提供する。

それに加えて、本発明はまた、本発明の構築物を、そのような処置が必要な被験体に適用することによって、皮膚の病気、障害または疾患に罹患した被験体を処置する方法を提供する。例えば、その被験体を、ヒト、非ヒト霊長類、野生動物、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ブタ、ヒツジ、ウサギ、ラット、およびマウスからなる群から選択し得る。１つの好ましい実施態様において、被験体はウマである。別の好ましい実施態様において、被験体はヒトである。

皮膚の病気、障害または疾患の例としては、創傷および皮膚の欠損が挙げられるが、これらに限定されない。１つの実施態様において、創傷は、軽度の切り傷、熱傷、乾燥した皮膚、皮膚の裂け目、皮膚裂傷、外科的創傷、事故外傷、および肥厚した瘢痕からなる群から選択される、急性創傷であり得る。別の実施態様において、創傷は、静脈潰瘍、圧迫潰瘍、糖尿病性潰瘍、動脈潰瘍および熱傷からなる群から選択される、慢性創傷であり得る。さらに別の実施態様において、皮膚の欠損は、湿疹、乾癬、放射線皮膚炎、皮膚癌、蕁麻疹、皮斑様血管炎、重度の乾燥、および白色萎縮からなる群から選択され得る。

本発明の１つの利点は、細胞バンクの作成であり、構築物に使用される細胞が常に入手可能であるので、それは必要な時いつでもおよびどこでも即時の移植を可能にする。１つの局面において、ドナー胎児組織から生検材料を回収する；胎児組織を増殖および未分化胎児細胞を適切な培養条件下で高濃度に増殖させる；できた培養の組織および細胞をトリプシン処理してその懸濁液を可能にする；懸濁細胞をプールして、培養から一般的に均一な細胞の懸濁液を作成する；凍結防止剤と静かに混合する；アンプルに細胞懸濁液のアリコートを密封する；およびアリコートを凍結し、それによって未分化胎児細胞バンクを調製する方法によって、未分化胎児細胞バンクを得るまたは作成することができる。１つの実施態様において、未分化胎児細胞は、胎児皮膚細胞である。細胞バンク中の胎児皮膚細胞は、ｐ６３^＋であり得る。いくつかの実施態様において、アリコートの凍結は、−８０℃の温度に達するまで１℃／分ずつ温度を下げていき、そして次いで約２４時間後に−１６０℃に移動させることによって達成される。

さらに別の局面において、ドナー胎児組織から生検材料を回収する；胎児組織を増殖および未分化胎児細胞を適切な培養条件下で高濃度に増殖させる；できた培養の組織および細胞をトリプシン処理してその懸濁液を可能にする；懸濁細胞をプールして、培養から一般的に均一な細胞の懸濁液を作成する；凍結防止剤と静かに混合する；アンプルに細胞懸濁液のアリコートを密封する；およびアリコートを凍結し、それによって未分化胎児細胞バンクを調製することによって、未分化胎児細胞バンクを調製し得る。１つの実施態様において、未分化胎児細胞は、胎児皮膚細胞である。細胞バンク中の胎児皮膚細胞は、ｐ６３^＋であり得る。別の実施態様において、アリコートの凍結は、−８０℃の温度に達するまで１℃／分ずつ温度を下げていき、そして次いで約２４時間後に−１６０℃に移動させることによって達成される。

本発明はまた、キャリアおよび１つまたはそれ以上の未分化胎児細胞を単独で、または１つまたはそれ以上の胎児タンパク質と組み合せて含む組成物を提供する。様々な実施態様において、キャリアは、軟膏、ローション、クリーム、エマルション、マイクロエマルション、ゲルおよび溶液からなるグ群から選択され得る。１つの好ましい実施態様において、キャリアはクリームである。例えば、そのクリームは、水中油型混合物、または油中水型混合物であり得る。別の実施態様において、キャリアは、疎水性アジュバントおよび親水性アジュバントを含む。あるいは、本発明の組成物は、キャリアおよび１つまたはそれ以上の胎児タンパク質を単独で、または１つまたはそれ以上の未分化胎児細胞と組み合せて含み得る。当業者は、本発明の組成物へのあらゆる言及は、キャリアと組み合せた、１つまたはそれ以上の未分化胎児細胞および／または１つまたはそれ以上の安定化胎児タンパク質を含むあらゆる組成物を含むことを認識する。

この組成物を、ドナー胎児組織から生検材料を回収する；胎児組織から細胞系統を発達させる；胎児組織を増殖および未分化胎児細胞を高濃度に増殖させて細胞バンクを作製する；必要に応じて細胞バンク中の胎児タンパク質を安定化する；および当該胎児細胞をキャリアに組み込むことによって調製され得る。それに加えて、組成物を、未分化胎児細胞を得る；未分化胎児細胞を増殖させる；必要に応じて胎児細胞中の胎児タンパク質を安定化させる；および胎児細胞をキャリアに組み込むことによって調製し得る。

本発明はまた、治療的に有効な量の本発明の組成物を、被験体の皮膚の影響されやすいか、または影響された領域へ投与することによって、皮膚の病気、障害または疾患を予防または治療する方法を提供する。

治療または予防される皮膚の病気、障害または疾患は、にきび、しみ、瘢痕、熱傷、挫傷、母斑、入れ墨、色素過剰、アトピー性皮膚炎、潰瘍周辺（ｐｅｒｉ−ｕｌｃｅｒ）、湿疹、放射線皮膚炎、潰瘍、蕁麻疹、重度の乾燥、および白色萎縮が挙げられるがこれに限らない、炎症性の皮膚の病気であり得る。１つの好ましい実施態様において、炎症性の皮膚の病気は潰瘍周囲である。別の好ましい実施態様において、炎症性の皮膚の病気は白色萎縮である。さらに別の好ましい実施態様において、炎症性の皮膚の病気は色素過剰である。

被験体を、ヒト、非ヒト霊長類、野生動物、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ブタ、ヒツジ、ウサギ、ラットおよびマウスからなるグループから選択し得る。１つの好ましい実施態様において、被験体はウマである。さらに別の好ましい実施態様において、被験体はヒトである。

本発明はまた、皮膚の病気、障害または疾患が時間につれて治癒するように、コラーゲンマトリックスに組み込まれた未分化胎児皮膚細胞を含む、３次元皮膚組織同種移植片を投与することによって、およびキャリアおよび１つまたはそれ以上の未分化胎児細胞を単独でまたは１つまたはそれ以上の胎児タンパク質と組み合せて含む組成物を投与することによって、皮膚の病気、障害または疾患に罹患した被験体を治療する方法を提供する。

１つの実施態様において、本発明の同種移植片および組成物を連続的に投与する、そして別の実施態様において、同種移植片および組成物を同時に投与する。被験体を、ヒト、非ヒト霊長類、野生動物、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ブタ、ヒツジ、ウサギ、ラットおよびマウスからなるグループから選択し得る。１つの好ましい実施態様において、被験体はウマである。さらに別の好ましい実施態様において、被験体はヒトである。

皮膚の病気、障害または疾患を、軽度の切り傷、熱傷、乾燥皮膚、皮膚の裂け目、皮膚裂傷、外科的創傷、事故外傷、肥厚性瘢痕、静脈潰瘍、圧迫潰瘍、糖尿病性潰瘍、動脈潰瘍、湿疹、乾癬、放射線皮膚炎、皮膚癌、蕁麻疹、皮斑様血管炎、白色萎縮、にきび、しみ、瘢痕、挫傷、母斑、入れ墨、色素過剰、アトピー性皮膚炎、潰瘍周囲、湿疹、放射線皮膚炎、潰瘍および蕁麻疹からなるグループから選択し得る。

１つの実施態様において、未分化胎児細胞は、適切な培養条件下で真皮線維芽細胞または表皮ケラチン生成細胞に分化し得る胎児皮膚細胞のような、胎児皮膚細胞である。１つの好ましい実施態様において、コラーゲンマトリックスはウマコラーゲンで作られる。同様に、キャリアを、軟膏、ローション、クリーム、エマルション、マイクロエマルション、ゲルおよび溶液からなるグループから選択し得る。

（本発明の詳細な説明）
組織工学および材料科学の分野は、注目すべき生物学的機能を有する新規生体材料を迅速に生産している。これらの新規材料の機械的性質を、特定の適用のために調整し得、そしてそれらを構成する細胞は、機能の維持、回復、または改善のための実際の組織を形成し得る。従って、細胞の起源およびそれらの生体材料との相互作用が、最終的な治療的使用のために非常に重要である。

胎児皮膚および成人皮膚と胎児皮膚創傷環境および成人皮膚創傷環境との間の基本的な違いが、瘢痕を有さない組織修復を誘導するために重要であり得る。妊娠の初期、真皮は薄く、比較的無細胞性であり、そして少ない細胞外マトリックスが存在する。さらなる発達の間に、真皮コラーゲンが沈着し、そして硫酸化グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）が、他の非硫酸化ＧＡＧの中からヒアルロン酸（ＨＡ）を置換する。非常に迅速な増殖およびゆるい細胞外マトリックスが、瘢痕のない胎児皮膚修復の伝導性領域（ｃｏｎｄｕｃｔｉｖｅ ｔｅｒｒｉｔｏｒｙ）を提供する。

研究は、子宮内環境が瘢痕のない胎児修復のために重要でも十分でもないようであるので、胎児皮膚細胞自体は、瘢痕のない組織修復を担うことを示唆する。オポッサムモデルにおいて示されたように、温かい、滅菌された、増殖因子の豊富な羊膜環境の外側の胎児皮膚は、瘢痕のない迅速な治癒に非常に有効であることが示された。この有袋動物は、生理学的および解剖学的の両方において胎児様に生まれ、そして４−５週間母親の乳首に付いたままである（Ａｒｍｓｔｒｏｎｇら、Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．１６９：２４２−２６０、１９９５）。その子宮外位置にもかかわらず、初期の袋の子における創傷は、非常に迅速に再上皮化し、コラーゲンを合成し、そして瘢痕なく治癒する。対照的に、より年上の袋の子における創傷は、より遅く治癒し、そして瘢痕の形成を示す。

同様に、免疫非応答性マウスの皮下に移植されたヒト胎児皮膚は、その発達の特徴を保持し、そして毛包および網様コラーゲン配置の回復と共に瘢痕なく治癒する（Ｌｏｒｅｎｚら、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １１４：２５３−２５９、１９９２）。ヒト胎児皮膚の再生能力は、成人子宮外創傷環境によって、または成体マウス血液との接触によって阻害されなかったので、瘢痕なしの能力は、胎児組織自体に固有のようである。

治療的理由のために胎児細胞を使用する重要な利点は、胎児組織がプレ免疫応答性（ｐｒｅｉｍｍｕｎｏｉｎｃｏｍｐｅｔｅｎｔ）であり、そのような細胞のレシピエントにおいて免疫学的反応を誘発する能力の低下と関連することである。この低下した免疫応答性は、妊娠１４週より前の、後胸腺Ｔリンパ球の欠如と関連する（Ｃｒｏｍｂｌｅｈｏｌｍｅら、Ａｍ Ｊ Ｏｂｓｔｅｔ Ｇｙｎｅｃｏｌ １６４：２１８−２３０、１９９１；Ｇａｂｂｉａｎｅｌｌｉら、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４４：３３５４−３３６０、１９９０）。

胎児組織工学は、哺乳類において皮膚の病気、障害または疾患の治療に関して高い可能性を有する。ある培養条件下での、およびある関連する生体工学的マトリックス内での胎児皮膚の増殖の可能性を利用することによって、多数の皮膚細胞を治療的使用のために凍結し得、そして何百万人もの患者を、単一の臓器提供から治療し得る。

本発明の構築物および組成物は、皮膚の病気、障害または疾患の症状を修復、治療、および／または予防するのに理想的である。自己移植と異なり、本発明の方法および組成物は、ドナー部位の生検を必要とせず、それは剥離する皮膚組織をあまり有さない小さい子供または熱傷患者のために重要である。さらに、産生するために３または４週間までかかり得る自己移植手順と異なり、その構築物および組成物は即座に利用可能である。さらに、これらの構築物および組成物を、即座におよび無制限の量で送達し得る。

細胞培養とともに胎児組織を増殖すること、およびマトリックスまたは膜への結合に関して、ほとんど研究されなかった。本明細書中で記載された方法を用いて、ストリンジェントに調節された胎児皮膚細胞を有すること、およびそれらを非常に大きな細胞バンクに拡大することが可能である（例えば、４ｃｍ^２の１つの臓器提供が、移植片あたり約１０ｃｍ^２の約２，４００，０００の皮膚移植片を産生し得る）。胎児皮膚細胞を使用する利点は、１）成人細胞と比較して、紫外線Ａ（ＵＶＡ）照射に対して３倍まで、そして過酸化水素処理に対して２倍までより抵抗性である能力；２）瘢痕なしの組織修復を誘導する能力（発達の異なる年齢におけるタンパク質組成に関連するようである、胎児組織自体に固有の性質（Ｌｏｒｅｎｚら、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １１４：２５３−２５９、１９９２））；および３）それらはプレ免疫応答性（ｐｒｅ−ｉｍｍｕｎｏｃｏｍｐｅｔｅｎｔ）であり、そしてそのような細胞のレシピエントにおいて免疫学的反応を誘発する低下した能力と関連するという事実、を含むがこれに限らない。胎児細胞株は、以前に組織工学的目的のために使用も開発もされいない。

本発明は、一般的に皮膚の病気、障害または疾患の治療のための、未分化胎児細胞およびコラーゲンを含む３次元皮膚組織同種移植片構築物に関連する。さらに、本発明は、１つまたはそれ以上の未分化胎児細胞ならびに／または１つまたはそれ以上の胎児タンパク質およびキャリアを含む組成物に関する。本発明はまた、そのような組成物および構築物を作製する方法、過程およびその使用方法を提供する。

本明細書中で使用される用語は、特定の実施態様を説明する目的のためのみであり、そして本発明の範囲を限定することを意図しないことが理解される。

本明細書中および特許請求の範囲において使用される場合、単数形「ａ」および「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、その文脈が明らかに他に規定しなければ、複数の指示対象を含む。

「未分化」という用語は、本明細書中で、未成熟または原始的な細胞を説明するために使用される。例えば、未分化胎児皮膚細胞は、真皮線維芽細胞および表皮ケラチン生成細胞に分化し得るものを含む。

「組み込まれた」または「に組み込まれた」という用語は、混合のあらゆる手段、特に細胞をマトリックスに加えることに関連するものを説明するために使用される。その用語は、混合、化合、ピペッティング、播種、プレーティングまたは配置を含むがこれに限らない。

「適切な培養条件」という用語は、増殖を促進する栄養素を含む、細胞を培養するための培地である。栄養培地は、以下のもののいずれかを、適切な組み合せおよび適切な濃度で含み得る：等張生理食塩水、緩衝液、アミノ酸、血清または血清代替物、および他の外来性の添加された因子。当業者は、あらゆる通常採用される培養条件を使用し得ることを認識する。

「コラーゲン」という用語は、親水性であり、細胞外酵素による分解に供される、ポリペプチド化合物を指す。この物質はよく研究されているので、多くの重要なパラメーターを制御し得る。コラーゲンは弱い抗原であり、それによって最低限の拒絶反応の可能性を引き起こす。本発明の構築物、方法および組成物で使用される好ましいコラーゲンは、ウマコラーゲンである。

「細胞株」という用語は、適切な新しい培地および十分な空間があれば、無期限に増殖する、永久的に確立された細胞培養を指す。

「細胞バンク」という用語は、ドナー胎児組織から生検を回収すること；胎児組織を増殖および未分化胎児細胞を適切な培養条件下で高濃度に増殖させること；得られた培養物の組織および細胞をトリプシン処理してそれらを懸濁すること；懸濁細胞をプールして、培養物から全体的に均一な細胞の懸濁液を作製すること；凍結防止剤と穏やかに混合すること；アンプルに細胞懸濁液のアリコートを密封すること；およびアリコートを凍結すること（例えばアンプルの温度を１℃／分ずつ−８０℃まで下げ、そして次いで約２４時間後に−１６０℃に移すことによって）を指す。この超低温バンクは、加齢が停止し、それによってそれらが回収された日にそれらが有していた機能および活性を保持することが可能であるように細胞を保存する。

「治療」（「皮膚の病気、障害または疾患を治療する」におけるような）という用語は、（１）病気を予防すること（すなわち、病気のあらゆる臨床的症状を回避する）、（２）病気を阻害すること（すなわち、臨床的症状の発達または進行を停止させる）、および／または（３）病気を軽減する、修復する、または逆転させる（すなわち、臨床的症状を退行させる）ことを含む。

「病気」、「障害」および「疾患」という用語は、本明細書中で、本明細書中で記載されたような活性薬剤の投与によって予防または治療され得る生理学的状態を指して交換可能に使用される。皮膚の病気、障害および疾患の例は、軽度の切り傷、熱傷、乾燥皮膚、皮膚の裂け目、皮膚裂傷、外科的創傷、事故外傷、肥厚性瘢痕、静脈潰瘍、圧迫潰瘍、糖尿病性潰瘍、動脈潰瘍、湿疹、乾癬、放射線皮膚炎、皮膚癌、蕁麻疹、皮斑様血管炎、白色萎縮、にきび、しみ、瘢痕、挫傷、母斑、入れ墨、色素過剰、アトピー性皮膚炎、潰瘍周囲、湿疹、放射線皮膚炎、潰瘍および蕁麻疹を含むがこれに限らない。

「創傷」という用語は、様々な方法（例えば長期のベッド療養による床ずれ、外傷、切り傷、潰瘍、熱傷等によって誘発された創傷）のいずれか１つにおいて開始され、そして様々な特徴を有する皮膚および皮下組織への損傷を広く指す。創傷は、典型的には創傷の深さによって、４つのグレードの１つに分類される：（ｉ）グレードＩ：上皮に限定された創傷；（ｉｉ）グレードＩＩ：真皮に広がる創傷；（ｉｉｉ）グレードＩＩＩ：皮下組織に広がる創傷；および（ｉｖ）グレードＩＶ（または全層創傷）：骨が露出する創傷（例えば大転子または仙骨のような骨圧点）。

「急性創傷」という用語は、組織の喪失、重症の症状を伴わず、そして短い経過を有する、皮膚への鋭利な傷害または損傷を指す。急性創傷の例は、軽度の切り傷、熱傷、乾燥皮膚、皮膚の裂け目、皮膚裂傷、外科的創傷、事故外傷および肥厚性瘢痕を含むがこれに限らない。

「慢性創傷」という用語は、約３０日以内に治癒しなかった創傷を指す。慢性創傷の例は、静脈潰瘍、圧迫潰瘍、糖尿病性潰瘍、動脈潰瘍および熱傷を含むがこれに限らない。

創傷に関して「治癒」という用語は、瘢痕形成によるような、創傷を修復する過程を指す。

「皮膚創傷の治癒過程を誘導または加速する」という語句は、創傷収縮の肉芽組織の形成の誘導および／または上皮化（すなわち、上皮における新しい細胞の産生）の誘導のいずれかを指す。創傷治癒は、創傷領域の減少によって簡便に測定される。

「被験体」（「被験体」の処置におけるような）という用語は、病気、障害または疾患（本明細書中で明細に述べたような）に苦しむ、傾向がある、または罹患した哺乳類個体を指すよう意図される。この用語は、ヒトおよび動物をどちらも含む。例えば、被験体は、例えばヒト、非ヒト霊長類、野生動物、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ブタ、ヒツジ、ウサギ、ラットまたはマウスであり得る。本明細書中で使用される場合、野生動物という用語は、家畜化されていないあらゆる哺乳類、鳥類または魚類を含む。そのような野生動物の例は、アナグマ、ビーバー、ライオン、トラ、クマ、タカ、およびシカを含むがこれに限らない。

本明細書中で使用される場合、本発明の「組成物」は、伝統的な薬剤、生理学的に適切なキャリアおよび賦形剤を含むがこれに限らない他の化学的構成成分と共に、１つまたはそれ以上の未分化胎児細胞を含み得る。あるいは、本発明の「組成物」は、伝統的な薬剤、生理学的に適切なキャリアおよび賦形剤を含むがこれに限らない他の化学的構成成分と共に、１つまたはそれ以上の未分化胎児細胞および／または１つまたはそれ以上の安定化された胎児タンパク質を含み得る。そのような構成成分は、被験体に対するタンパク質および／または細胞の投与を促進するのを助ける。本発明の組成物を、当該分野で周知の処理によって、例えば伝統的な混合、溶解、顆粒化、糖剤作製、すりつぶし、乳化、カプセル封入、封入、または凍結乾燥処理によって製造し得る。

活性成分の処方物および投与の技術は、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ： Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ」 Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．、第２０版において見出し得、それは本明細書中で参考文献に組み込まれる。

活性成分の様々な投与経路が可能であるが、本発明の目的のために、局所経路が好ましく、そして局所的キャリアによって補助される。局所的キャリアは、一般的に局所的活性成分投与に適切なものであり、そして当該分野で公知のあらゆるそのような材料を含む。局所的キャリアは、組成物に、例えば液体または非液体キャリア、ローション、クリーム、ペースト、ゲル、粉末、軟膏、溶媒、液体希釈剤、点滴剤などのような、望ましい形式を提供するように選択され、そして天然に存在するまたは合成的起源の材料から成り得る。選択されたキャリアは、局所的処方物の活性薬剤または他の構成成分に不都合な影響を与えるべきではなく、それは局所的処方物の全ての構成成分に関して安定である。本明細書中で使用するために適切な局所的キャリアの例は、水、アルコールおよび他の非毒性有機溶媒、グリセリン、鉱油、シリコーン、ワセリン、ラノリン、脂肪酸、植物油、パラベン、ワックスなどを含む。

軟膏は、典型的にはワセリンまたは他の石油誘導体に基づく半固体調製物である。当業者によって認識されるような、使用される特定の軟膏基剤は、最適な薬剤伝達を提供し、そして好ましくは他の望ましい特徴、例えば皮膚軟化なども提供するものである。他のキャリアまたは媒体と同様に、軟膏基剤は不活性、安定、非刺激性および非感作性であるべきである。Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎにおいて説明されるように、軟膏基剤は、４つの種類にグループ分けし得る：油性基剤；乳化可能な基剤；エマルション基剤；および水溶性基剤。油性軟膏基剤は、例えば植物油、動物から得られた脂肪、および石油から得られた半固体炭化水素を含む。吸収軟膏基剤としても知られる、乳化可能な基剤は、水をほとんどまたは全く含まず、そして例えばヒドロキシステアリン硫酸エステル、無水ラノリン、および親水性ワセリンを含む。エマルション軟膏基剤は、油中水型（Ｗ／Ｏ）エマルションまたは水中油型（Ｏ／Ｗ）エマルションのいずれかであり、そして例えばセチルアルコール、グリセリルモノステアレート、ラノリンおよびステアリン酸を含む。好ましい水溶性軟膏基剤は、様々な分子量のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）から調製される。Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ、前出を参照のこと。

ローションは、摩擦なしに皮膚表面に適用される調製物であり、そして典型的には活性薬剤を含む固体粒子が水またはアルコール基剤中に存在する、液体または半液体調製物である。ローションは、通常固体の懸濁液であり、そして好ましくは水中油型の液体油性エマルションを含む。ローションは、より流動性の組成物を適用する簡単さのために、本明細書中において大きな体の領域を処置するために好ましい処方物である。一般的に、ローション中の不溶性物質を微細に分割することが必要である。ローションは、典型的にはよりよい分散を引き起こすために懸濁化剤を、および活性薬剤を皮膚と接触させて局在化および保持するために有用な化合物、例えばメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウムなどを含む。本発明と組み合せて使用するために特に好ましいローション処方物は、Ｂｅｉｅｒｓｄｏｒｆ，Ｉｎｃ．（Ｎｏｒｗａｌｋ、Ｃｏｎｎ．）から入手可能な、Ａｑｕａｐｈｏｒ（登録商標）の商標で得ることができるもののような、親水性ワセリンと混合したプロピレングリコールを含む。

当該分野で公知であるように、活性薬剤を含むクリームは、粘性の液体または水中油型または油中水型いずれかの半固体エマルションである。クリーム基剤は、水洗可能であり、そして油相、乳化剤および水相を含む。油相は、一般的にワセリンおよびセチルアルコールまたはステアリルアルコールのような脂肪アルコールから成る。水相は通常、体積で油相を上回るがその必要はなく、そして一般的に湿潤剤を含む。Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ、前出において記載されたような、クリーム処方物における乳化剤は、一般的に非イオン性、陰イオン性、陽イオン性、または両性の界面活性剤である。

マイクロエマルションは、界面活性剤分子の界面膜によって安定化された、油および水のような、２つの混合できない液体の、熱力学的に安定な、等方性に透明な分散である（Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ、２００２）；第２版）。マイクロエマルションの調製のために、界面活性剤（乳化剤）、共界面活性剤（ｃｏ−ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ）（共乳化剤（ｃｏ−ｅｍｕｌｓｉｆｉｅｒ））、油相および水相が必要である。適切な界面活性剤は、エマルションの調製に有用なあらゆる界面活性剤、例えばクリームの調製に典型的に使用される乳化剤を含む。共界面活性剤（または「共乳化剤」）は、一般的にポリグリセロール誘導体、グリセロール誘導体および脂肪アルコールのグループから選択される。好ましい乳化剤／共乳化剤の組み合せは、一般的にモノステアリン酸グリセリルおよびステアリン酸ポリオキシエチレン；ポリエチレングリコールおよびパルミトステアリン酸エチレングリコール；およびカプリル（ｃａｐｒｉｌｉｃ）トリグリセリドおよびカプリントリグリセリドならびにオレイル（ｏｌｅｏｙｌ）マクロゴールグリセリドからなるグループから選択されるが、その必要はない。水相は、水だけでなく、典型的には緩衝液、グルコース、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、好ましくはより低い分子量のポリエチレングリコール（例えばＰＥＧ３００およびＰＥＧ４００）、および／またはグリセロールなども含み得る。油相は、一般的に例えば脂肪酸エステル、修飾植物油、シリコーン油、モノ−、ジ−、およびトリグリセリドの混合物、ＰＥＧのモノ−およびジ−エステル（例えばオレイルマクロゴールグリセリド）などを含む。

ゲル処方物は、小さい無機粒子からなる懸濁液（２相系）、またはキャリア液体中に実質的に均一に分布した大きな有機分子（単相系）のいずれかからなる半固体系である。単相ゲルを、例えば活性薬剤、キャリア液体およびトラガカント（２から５％で）、アルギン酸ナトリウム（２−１０％で）、ゼラチン（２−１５％で）、メチルセルロース（３−５％で）、カルボキシメチルセルロースナトリウム（２−５％で）、カルボマー（０．３−５％で）、またはポリビニルアルコール（１０−２０％で）のような適切なゲル化剤を共に組み合せて、そして特徴的な半固体産物が産生されるまで混合することによって産生し得る。他の適切なゲル化剤は、メチルヒドロキシセルロース、ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン、ヒドロキシエチルセルロースおよびゼラチンを含む。ゲルは通常水性キャリア液体を採用するが、アルコールおよび油も、キャリア液体として使用し得る。

当業者に公知の様々な添加物も、本発明の組成物に含み得る。そのような添加物の例は、可溶化剤、皮膚透過増強剤、乳白剤、保存剤（例えば抗酸化剤）、ゲル化剤、緩衝化剤、界面活性剤（特に非イオン性および両性界面活性剤）、乳化剤、皮膚軟化薬、濃化剤、安定化剤、湿潤剤、着色料、香料などを含むがこれに限らない。乳化剤、皮膚軟化薬および保存剤と共に、可溶化剤および／または皮膚透過増強剤を含むことが、特に好ましい。適切な可溶化剤の例は、以下のものを含むがこれにかぎらない：ジエチレングリコールモノエチルエーテル（エトキシジグリコール、Ｔｒａｎｓｃｕｔｏｌ（登録商標）として市販で入手可能）およびジエチレングリコールモノエチルエーテルオレイン酸エステル（Ｓｏｆｔｃｕｔｏｌ（登録商標）として市販で入手可能）のような親水性エーテル；ポリオキシ３５ひまし油、ポリオキシ４０硬化ひまし油などのようなポリエチレンひまし油誘導体；ポリエチレングリコール、特にＰＥＧ３００およびＰＥＧ４００のような低分子量ポリエチレングリコール、およびＰＥＧ−８カプリル／カプリングリセリド（Ｌａｂｒａｓｏｌ（登録商標）として市販で入手可能）のようなポリエチレングリコール誘導体；ＤＭＳＯのようなアルキルメチルスルホキシド；２−ピロリドンおよびＮ−メチル−２−ピロリドンのようなピロリドン、およびＤＭＡ。多くの可溶化剤はまた、吸収増強剤として作用し得る。単一の可溶化剤を処方物に組み込み得るか、または可溶化剤の混合物をその中に組み込み得る。適切な乳化剤および共乳化剤は、限定されないが、マイクロエマルション処方物に関して記載された乳化剤および共乳化剤を含む。皮膚軟化薬は、例えばプロピレングリコール、グリセロール、ミリスチン酸イソプロピル、ポリプロピレングリコール−２（ＰＰＧ−２）ミリスチルエーテルプロピオン酸エステルなどを含む。

他の活性薬剤、例えば抗炎症薬剤、鎮痛薬、抗菌薬、抗真菌薬、抗生物質、ビタミン、抗酸化剤、およびアントラニル酸エステル、ベンゾフェノン（特にベンゾフェノン−３）、樟脳誘導体、桂皮酸エステル（例えばメトキシ桂皮酸オクチル）、ジベンゾイルメタン（例えばブチルメトキシジベンゾイルメタン）、ｐ−アミノ安息香酸（ＰＡＢＡ）およびその誘導体、およびサリチル酸エステル（例えばサリチル酸オクチル）を含むがこれに限らない、日焼け止め剤処方物によく見出される日焼け止め剤も、処方物中に含み得る。

「有効な」または「治療的に有効な」量の組成物という用語によって、あらゆる医学的処置に伴う妥当な利益／危険性比で望ましい効果を提供する非毒性であるが十分な量を意味する。望ましい効果は、疾患の徴候、症状または原因の軽減または予防、または生物学的系のあらゆる他の望ましい変化であり得る。

当業者は、本発明の３次元皮膚組織同種移植片および組成物を作製するために使用される未分化胎児細胞は、皮膚移植片に関しては胎児皮膚細胞、および筋肉移植片に関しては胎児筋肉細胞、および骨移植片に関しては胎児骨細胞を含み得ることを認識する。

１つの局面において、本発明は、コラーゲンマトリックス（例えばウマコラーゲン）に組み込まれた未分化胎児細胞を含む、３次元皮膚組織同種移植片構築物を提供する。例えば、未分化胎児細胞は、適切な培養条件下で真皮線維芽細胞および表皮ケラチン生成細胞に分化し得るもののような、胎児皮膚細胞であり得る。組み込みは、混合、化合、ピペッティング、播種、プレーティング、または配置を含むがこれに限らない、当業者に公知のあらゆる手段によって達成し得る。この構築物を、次いで皮膚の病気、障害または疾患に罹患した被験体を処置するために使用し得る。

培養された未分化胎児細胞の細胞バンクを作製するために、胎児組織からの生検材料を、ＣＨＵＶの倫理委員会の手順および方針に従って、妊娠中絶の直後に得る。回収したドナー組織は、妊娠１２−１６週である。胎児組織を、複数の１０ｃｍ^２組織培養プレートで小さい断片に分割し、そしてグルタミンを含むダルベッコＭＥＭ（ＤＭＥＭ）組織培養培地中で増殖させる。次いで胎児血清をプレートに加える。細胞の増殖が進行したら、例えば約１週間後、組織および細胞をトリプシン処理する。いくつかのプレートを次いで、例えば液体窒素中で個々のユニットに凍結する。次いで細胞を遠心し、そして再懸濁して培養からほぼ均一な細胞の懸濁液を産生する。

次に、細胞を凍結防止剤（例えば、ＤＭＥＭ、５ｍｌ＋胎児ウシ血清、４ｍｌ＋ジメチルスルホキシド、１ｍｌ（ＤＭＳＯ））と静かに混合する。細胞懸濁液を次いでアリコートに密封し、そして例えば液体窒素中で凍結する。１つの好ましい実施態様において、アリコートを−８０℃の温度に達するまで１℃／分の速度で凍結し、そして次いで約２４時間後に−１６０℃に移動させる。均一なバンク細胞のアリコートを、次いで本発明の３次元皮膚組織同種移植片構築物および／または組成物の産生のような、あらゆる望ましい目的のために、または皮膚の病気、障害または疾患を処置するための薬剤を製造するのに使用するために、細胞バンクのアンプルを開封し、内容物を解凍し、そして通常の細胞培養培地へ移すことによって使用し得る。

本発明の３次元皮膚組織同種移植片を、以下のように産生し得る：移植日の３から５日前に、滅菌した小口径のピペットチップでマトリックスに小さな切り込みを入れることによって、ウマコラーゲンの９×１２ｃｍのシートに、細胞バンクからの胎児皮膚細胞を、例えば約１×１０^５細胞／ｃｍ^２で播種する（継代０から３の細胞を使用）。次いでしばらく（例えば約１時間）後に、培養プレートに培地を加える。培地も、２日に１回のように、定期的に交換する。

産生される構築物は、未分化表皮ケラチン生成細胞（約１０％から約１３．５％）および未分化真皮線維芽細胞（約９０％から約８６．５％）を含む。この移植片の３次元構造のために、患者または被験体に任意の方向で移植片を適用することが非常に容易であり、多くの皮膚の病気、障害または疾患は、典型的には当業者によって現在使用されている移植片で覆うのが困難な体の領域に存在するので、それは有利である。

任意の特定のメカニズムに制限されることなく、同種移植片構築物の細胞は、胎児細胞において利用可能な増殖因子の分泌によって、存在する細胞の接着、増殖および移動に対する促進効果を発揮し得るようである。修復された創傷は、残る瘢痕なしに治癒する傾向があり、そして皮膚はより萎縮性でないように見える。この技術の実用的な利点は、この技術が非侵襲性であり、従って、外科的設備を必要としないという事実を含む。これらの処置方法は、外来様式（ｍｏｎｏｒ）において容易に適用され、そして細胞は、伝統的な自己移植技術におけるような４−６週間ではなく、即座に入手可能である。最後に、これらの構築物を最も抵抗性の潰瘍でさえ非常に高い成功率で治療するために使用し得るので、この技術は皮膚を「完全な状態」に修復するための急性創傷の処置に有用である。

本発明はまた、未分化胎児細胞および／またはタンパク質およびキャリアを含む組成物を提供する。この組成物を、にきび、しみ、瘢痕、熱傷、挫傷、母斑、入れ墨、色素沈着の問題、潰瘍（ｐｅｒｉ−ｕｌｃｅｒ）、湿疹、放射線皮膚炎、潰瘍（ｕｌｃｅｒ）、蕁麻疹、重度の乾燥、および白色萎縮を含むがこれらに限らない、多くの皮膚欠損を処置するために使用し得る。

組成物を作製するために、胎児ドナー組織からの生検材料を得ることができ、そして細胞系統を上記のように発達させる。例えば、胎児組織を、外科用メスで作った格子状の切り込みによって準備した、複数の１０ｃｍ^２組織培養プレートにおいて小さな断片に分割し得る。グルタミンおよび１０％胎児血清を含むＤＭＥＭ組織培養培地をプレートに加える。胎児細胞は未分化状態に留まり、そして高濃度に増殖して細胞バンクを作り出し、そこから胎児皮膚移植片が得られる。次いで、細胞を、ＤＭＳＯ、ＤＭＥＭおよび胎児血清の混合物中で、必要になるまで凍結する。

継代５−１０の細胞を、約５．３×１０^３細胞／ｍｌの濃度で調製する。この濃度は、皮膚欠損の型、および患者が成人かまたは子供かに依存して変化し得る。例えば、細胞の濃度は、約５．３×１０^２細胞／ｍｌから約５．３×１０^４細胞／ｍｌの範囲であり得る。次いで、胎児タンパク質を安定化させ、そして単独でまたは胎児細胞と組み合せてのいずれかで、キャリアに組み込む。

上記の組成物を、治療的に有効な量の組成物を、被験体の皮膚の影響を受けやすいまたは影響を受けた領域に投与することによって、皮膚の病気、障害または疾患を予防または処置するために使用し得る。例えば、皮膚の病気、障害または疾患は、炎症性の皮膚の病気を含むがこれに限らない。例としては、にきび、しみ、瘢痕、熱傷、挫傷、母斑、入れ墨、色素過剰、アトピー性皮膚炎、潰瘍周辺（ｐｅｒｉ−ｕｌｃｅｒ）、湿疹、放射線皮膚炎、潰瘍（ｕｌｃｅｒ）、蕁麻疹、重度の乾燥および白色萎縮を含むがこれに限らない。被験体は、ヒトおよび動物の両方を含む。例えば、被験体は、例えばヒト、非ヒト霊長類、野生動物、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ブタ、ヒツジ、ウサギ、ラットまたはマウスであり得る。

当業者は、あらゆる適切なキャリアおよび／または安定化剤を、本発明の組成物と共に使用し得ることを認識する。例えば、好ましい実施形態において、キャリアは局所的クリームである。

本発明の３次元皮膚組織同種移植片構築物を、単独でまたは本発明の組成物と組み合せて使用し得る。例えば、同種移植片構築物および組成物を、同時にまたは連続的に投与し得る。

表１は、本発明の胎児細胞療法を用いて処置し得る多くの病気を列挙する。この表はまた、処置された各病気を有する患者の数および観察された結果を詳述する。

以下の実施例を、本発明の好ましい実施形態をより完全に説明するために提示する。これらの実施例は、添付の特許請求の範囲によって規定されるような、本発明の範囲を制限することを決して意図しない。

（実施例）
（実施例１：胎児皮膚の回収）
ＣＨＵＶの倫理委員会の方針および手順に従って、妊娠中絶の直後に胎児皮膚のドナー組織から生検材料を得た。ドナー組織は、妊娠１２−１６週である。

（実施例２：胎児皮膚細胞バンクの合成）
実施例１で記載された、もとの生検材料から、５００個の１０ｃｍプレートに、プレートあたり約１０個（＜０．５ｍｍ^３）の組織断片全体をまいた。これらの断片を、１０％の胎児ウシ血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ）のみを添加したＤＭＥＭ中で増殖させた。細胞増殖が約１週間後まで進行した時、組織および細胞の皿をトリプシン処理した（０．２５％のトリプシン−０．１％のエチレンジアミン四酢酸［ＥＤＴＡ］）。この時点で、４９０個のプレートを、液体窒素中で各ユニットに凍結した。細胞を２０００ｇで１５分間遠心し、そしてＤＭＥＭ（５ｍｌ）＋ＦＣＳ（４ｍｌ）＋ＤＭＳＯ（１ｍｌ、Ｆｌｕｋａ）の凍結溶液中に再懸濁し、そして−１℃／分の冷却および凍結曲線の速度を達成する、Ｎａｌｇｅｎｅ^ＴＭ Ｃｒｙｏ １℃ Ｆｒｅｅｚｉｎｇ Ｃｏｎｔａｉｎｅｒ’ｓ（Ｎａｌｇｅｎｅ）中で−８０℃において、１ｍｌのアリコート（〜３百万の細胞）で凍結した。２４時間後、細胞を、より長期の保存のために、液体窒素中に移した。この方式で保存した細胞は、少なくとも１０年間保存し得る。１０個のプレートを、２００個のプレートに増幅し、そしてさらに凍結ストックのために２０００ユニットまで増幅した。細胞培養を、９５％空気／５％ＣＯ_２の加湿雰囲気で、３７℃で増殖させた（図１を参照のこと）。

１−４ｃｍ^２の胎児皮膚の、１つの臓器提供によって、治療的使用のために最低２，４００，０００の皮膚移植片（９×１２ｃｍ）を産生し得る皮膚細胞バンクを発展させることが可能である。胎児皮膚細胞を、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａおよび全ての細菌および真菌感染に関して日常的に試験する。もとの組織提供に関しては、患者を表２に列挙した抗体を用いて０および３−６ヶ月に試験した：

胎児組織をまた、あらゆる遺伝的および／または病理的異常に関して、病理学実験室において試験した。

（実施例３：照射光源、曝露条件、および化学的処理）
胎児および成人皮膚細胞の、物理的および酸化ストレスに対する抵抗性を決定するために、ストレスの供給源としてＵＶＡ照射および過酸化水素処理を見る一連の実験を行なった。

ＵＶＡＳＵＮ３０００ランプ（Ｍｕｔｚｈａｓ、Ｍｕｎｉｃｈ、Ｇｅｒｍａｎｙ）は、簡便な照射位置で、３００Ｗ／ｍ^２の線量率で３３０から４５０ｎｍの間の波長を放射する。ランプの出力スペクトルを、較正したＯｐｔｒｏｎｉｃモデル７４２分光放射計（Ｏｐｔｒｏｎｉｃｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｐｅｎｎ．、ＵＳＡ）を用いて分析し、そして３６０および４１０ｎｍの間にブロードなピークを示した。ＵＶＡＳＵＮ３０００ランプは、赤外線フィルターおよび３３５ｎｍより短い全ての波長を明確にカットするフィルターを装備している。それに加えて、細胞は、ＵＶＢまたはＵＶＣ照射の通過を許さないプラスチックの組織培養蓋をつけて照射された。照射の用量は、分光放射計に対して較正した、ＵＶＡ検出器ヘッドを有するＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｌｉｇｈｔ Ｒａｄｉｏｍｅｔｅｒ、ＩＬ１７００によってモニターした。

胎児皮膚生検材料を、ＣＨＵＶの倫理委員会の手順および方針に従って、妊娠中絶の直後にドナーから得た。ドナー組織は、妊娠約１２−１６週であった。

成人ドナー（ＳＷ２、２４歳男性；ＳＷ１２、３９歳女性；ＧＴ、２７歳男性）からの皮膚試料を、インフォームドコンセントおよび医学部倫理委員会からの許可を得て、太陽に曝露されない皮膚部位から、Ｌａｕｓａｎｎｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｈｏｓｐｉｔａｌの皮膚病学部において得た。

（表皮ケラチン生成細胞の培養：）
皮膚試料を、ペニシリン（１００Ｕ／ｍｌ）およびストレプトマイシン（１００μｇ／ｍｌ）を含むＰＢＳ中で３回、それぞれ１０分間洗浄した。組織を、トリプシン／ＥＤＴＡで〜１５分間処理し、そして表皮細胞層を、解剖顕微鏡の補助を用いて真皮組織から静かに削り取った。表皮組織を断片化し、そして２０００ｇで１５分間遠心した。次いでペレットを、γ−照射（２５００ｒａｄ）Ｓｗｉｓｓマウス３Ｔ３細胞を７０％のコンフルエンスで、および以下のようなケラチン生成細胞完全培地を含む小さい組織培養フラスコに移した：３：１に希釈したダルベッコの最少必須培地：Ｈａｍｓ（Ｆｌｏｗ）；１０％のＦＣＳ；１％のグルタミン；０．４μｇ／ｍｌのヒドロコルチゾン；１０−１０Ｍのコレラ毒素；５．０ｍｇ／ｍｌのインスリン；１．２ｍｇ／ｍｌのアデニン；２．５ｍｇ／ｍｌのトランスフェリン；０．１４ｍｇ／ｍｌのトリヨードチロニン；１０μｇ／ｍｌの表皮増殖因子。ケラチン生成細胞を、９０％の空気（ａｉｔ）／１０％のＣＯ_２の加湿雰囲気で、３７℃で増殖させた。ヒト皮膚移植に使用する細胞を、血清を含まない培地（Ｇｉｂｃｏ、ケラチン生成細胞ＳＦＭ）中で増殖させ、そして最初の１２時間は、５％のＦＣＳを、より高い細胞接着を保証するために加えた。

（真皮線維芽細胞の培養：）
真皮組織を、＜０．５ｍｍ^３の断片に分割し、そして１０％のＦＣＳおよびグルタミンを添加したＤＭＥＭ中で増殖させ、そして細胞を継代０および３の間に実験に使用した。それらを、分割する前にコンフルエンスになるまで増殖させ、そしてＰＢＳで２回すすぎ、そして計測した。

細胞を、直径６０または１００ｍｍのＦａｌｃｏｎ培養皿にプレートし、そして７５％コンフルエンスまで増殖させた。細胞の照射または化学的処理の直前に、増殖培地を除去し、そして細胞の単層をリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ、０．１４ＭのＮａＣｌ；２．７ｍＭのＫＣＬ；８．１ｍＭのＮａ_２ＨＰＯ_４、１．５ｍＭのＫＨ_２ＰＯ_４）で２回すすいだ。ＵＶＡ照射に関しては、細胞をＰＢＳで覆い、そして２５℃で照射した。照射時間は、平均で約１３から最大５５分であった。過酸化水素処理に関しては、細胞を、適切な濃度のＨ_２Ｏ_２（０．１−２．４ｍＭ）を含むＰＢＳで覆い、そして５％ＣＯ_２インキュベーター中で、３７℃で３０分間処理した。

（生存分析：）
過酸化水素またはＵＶＡ照射処理のいずれかを受けた細胞の皿（６０ｍｍ、〜７５％コンフルエント）を、トリプシン処理、希釈、および皿あたり２００−５０００細胞でプレートした（６０ｍｍ、処理あたり３枚の皿）。皿を、３７℃で１２から１４日間インキュベートし、その後それらをメチレンブルーで染色し、そしてコロニー（＞２０細胞）を解剖顕微鏡の補助を用いて計測した。全ての実験を、層流フード照明システムおよび室内蛍光灯を消して行なった。

（細胞増殖の特徴および安定性：）
細胞増殖曲線を、胎児および成人ヒト皮膚線維芽細胞に関して確立した。７５％コンフルエンスにおけるフラスコからの細胞を、トリプシン処理し、計数した。１０００細胞のプレートを、３組確立し、そして５から２０日の間の種々の時点で計測した。

細胞（胎児および成人皮膚線維芽細胞）をまた、いくつかの条件下で、細胞ペレットとして−２０℃、−８０℃で、および液体窒素を用いて、および異なる濃度のＤＭＳＯと共に凍結した。細胞の安定性をまた、ペレット中で、またはコラーゲンマトリックスと共にのいずれかで細胞を冷蔵することによって決定した。

（免疫組織化学：）
５μｍの厚さの固定した組織切片を、免疫組織化学のために使用した。全てのインキュベーションを、他に指定しなければ、加湿室内で、暗所で行なった。

ｐ６３の検出のために、５％の胎児ウシ血清（ＦＣＳ）、７％の正常ヤギ血清（ＮＧＳ）および０．１％のＴｒｉｔｏｎＸ１００を含むＰＢＳの溶液と、２５℃で２時間インキュベートすることによって、非特異的結合を阻害した。次いで、組織切片を、５％のＦＣＳ、５％のＮＧＳおよび０．１％のＴｒｉｔｏｎＸ１００を含むＰＢＳ中１：２０００希釈におけるｐ６３特異的抗体（ｐ６３［３ｑ２７−２９におけるｐ５３ホモログ］Ａｂ−１、クローン４Ａ４）と、３０分間インキュベートした（Ｎｅｏｍａｒｋｅｒｓ、Ｆｒｅｍｏｎｔ、Ｃａｌｉｆ．、ＵＳＡ）。このインキュベーション（ｐ５３）の直後、組織切片をＰＢＳ中でそれぞれ１０分間３回洗浄し、そして切片を、５％のＦＣＳ、１％のＮＧＳおよび０．１％のＴｒｉｔｏｎＸ１００を含むＰＢＳの溶液中１：２０００のビオチン化ヤギ抗ウサギ抗体で、２５℃で３時間処理した。組織切片を、ＰＢＳ中でそれぞれ５分間４回洗浄し、そして次いでＶｅｃｔａｓｔａｉｎ ＡＢＣ（登録商標）（Ｖｅｃｔｏｒ、Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ、ＣＡ）を用いて、その会社によって指示されるように、２５℃で３時間処理した。このインキュベーションの後、組織切片をＰＢＳ中でそれぞれ１０分間３回洗浄し、そして１−２分間のインキュベーションの直前に加えた０．３２μｌの３０％Ｈ_２Ｏ_２を含む０．５ｍｇ／ｍｌの３，３’−ジアミノベンジジンで処理した。全ての試料を、同時に処理した。ｐ６３の抗体染色は、茶色の着色によって示される。試料を流水で５分間洗浄した。それらを、Ｐａｐａｎｉｃｏｌａｏｕ（Ｈａｒｒｉｓ’ Ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ溶液）で対比染色し、脱水およびＭｅｒｃｋｏｇｌａｓ（登録商標）（Ｍｅｒｃｋ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）に載せた。

（結果：）
（大量に得られた細胞集団：）
皮膚は、多くの他の組織と同様に、幹細胞によって産生される新しい細胞で常に補充される。上皮幹細胞の維持に極めて重要な皮膚細胞における遺伝子の１つは、ｐ６３であり、それは皮膚の表皮層においてこれらの細胞の位置決定をするのに優れたマーカーを提供する。少なくともマウスモデルにおいて、ｐ６３の非存在下で、四肢、頭蓋および顔面、および上皮の発達のための再生的増殖は効率的でないことが示された（Ｙａｎｇら、Ｎａｔｕｒｅ ３９８：７１４−７１８、１９９９）。胎児皮膚において、表皮は、妊娠１２−１４週においてわずか１−２層の厚さ、そして約１６週において〜２−４細胞層の厚さである。発達中のすべての皮膚層において、全ての表皮細胞および発達中の毛包において強力なｐ６３核マーキングを検出することが可能である。これらの細胞（幹細胞、ｐ６３^＋表皮ケラチン細胞）は、異なる細胞型を産生するその能力のために多くの注意を引いたが、ｐ６３が上皮幹細胞集団の維持に役割を果たしているようであるが、それらがどのように機能するのか、およびなぜそれらは常に増殖し得るのかはほとんど知られていない。真皮組織は、個々のｐ６３^＋細胞を含まず、そして迅速に再生し得る真皮線維芽細胞を特徴付けるマーカーはまだ同定されていない。

表皮ケラチン生成細胞および真皮線維芽細胞をどちらも、胎児皮膚から別々に培養した。表皮細胞は全てｐ６３^＋であり（図２ａ）、そして純粋な細胞培養を、上皮（図２ｂ）および真皮組織（図２ｃ）から得た。ケラチン生成細胞は、下にある真皮線維芽細胞と比較した場合、酸化ストレスに対してはるかにより抵抗性である（Ａｐｐｌｅｇａｔｅら、Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｙ ７：２１５−２１９、１９９７；Ａｐｐｌｅｇａｔｅら、Ｌａｎｄｍａｒｋｓ ｉｎ Ｐｈｏｔｏｂｉｏｌｏｇｙ、２５９−２６３頁、１９９８；およびＡｐｐｌｅｇａｔｅら、ＪＩＤ １１１：１５９−１６３、１９９８）。これは胎児細胞に関しても観察されたので、胎児皮膚および古い皮膚由来の線維芽細胞を、物理的および酸化型ストレスに対する抵抗性における違いを特徴付けるために使用した。

（胎児対成人皮膚線維芽細胞の細胞増殖および安定性：）
胎児皮膚線維芽細胞の細胞増殖は、成人ドナーの皮膚線維芽細胞よりも非常に高いことが示された。胎児皮膚断片が培養皿に置かれた１日目から、線維芽細胞がより早く成長するのを識別し得る、図３、胎児皮膚断片を参照のこと（黒丸（ＦＳ１）、黒四角（ＦＳ２）、および黒三角（ＦＳ３）によって示される）。同じことが、同じ条件下で処理した成人皮膚断片に関して、通常５−６日後に観察される、図３、成人皮膚断片を参照のこと（白丸（ＧＴ／２９）、白四角（ＳＷ２／２４）および白三角（ＳＷ１２／３９）によって示される）。培養が確立されたら、胎児細胞は、成人由来の細胞より非常に速い速度で増殖を続ける（図３を参照のこと）。少数の細胞（１００または１０００）から始めた場合、培養における日数の関数として細胞数を単純に分析することによって、培養の１２日目において明確な違いが存在する。これは、おそらくクローニングの効率の違いによるものであり、それは胎児細胞に関して約８３−９１％、そして成人細胞に関して１０−２２％である。

同じ様式において、単純な細胞ペレットとして３ヶ月間まで−２０℃で凍結した胎児細胞でさえ、液体窒素におけるＤＭＳＯによる通常の凍結条件下の場合と類似の成長を示し得る。成人皮膚線維芽細胞（３つの細胞系統のうち２つ）は、保存剤としてＤＭＳＯを用いた−８０℃凍結条件において、制限された量の細胞増殖を示し得るが、−２０℃では示さない。胎児皮膚線維芽細胞は、２週間の冷蔵後でさえ、かなりの細胞増殖を示し得た。

ＵＶＡ照射後の、胎児対成人皮膚線維芽細胞の細胞生存：
包皮組織由来の新生児線維芽細胞は、酸化ストレスに対してより抵抗性である（Ａｐｐｌｅｇａｔｅら、ＪＩＤ １０２：７６２−７６７、１９９４）。異なる妊娠齢由来の細胞がどのように酸化ストレスにも反応するかを見ること、およびその抵抗性を成人皮膚細胞と比較することは興味深かった。酸化ストレスとしてのＵＶＡ照射に対するその抵抗性に関して、胎児細胞および成人細胞の間に大きな違いが存在するが、妊娠１２−１６週齢の間では違いは見られなかった。ＵＶＡ照射用量の関数として生存の割合を見ることによって、同じ継代の成人皮膚細胞系統（白丸（ＧＴ／２９）、白四角（ＳＷ２／２４）および白三角（ＳＷ１２／３９）によって示される）と比較した場合に、初期の継代数において試験した３つの胎児皮膚細胞系統（黒丸（ＦＳ１）、黒四角（ＦＳ２）および黒三角（ＦＳ３）によって示される）において、非常な抵抗性が示された（図４を参照のこと）。最も高用量のＵＶＡ照射（約５０分かかる）後でさえ、約２０％の胎児細胞しか死ななかった。対照的に、３０−５０ＫＪ／ｍ^２の用量（ヒト皮膚に知覚できる紅斑を与える用量）が、５０％の成人皮膚細胞を殺すことができた。

Ｈ_２Ｏ_２処理後の、胎児対成人皮膚線維芽細胞の細胞生存：
成人皮膚線維芽細胞の不活性化曲線は、２相性の性質であり、それは酸化剤として過酸化水素の使用に特徴的である。しかし、これは、胎児皮膚細胞（黒丸（ＦＳ１）、黒四角（ＦＳ２）および黒三角（ＦＳ３）によって示される）に関しては見られず、そして過酸化水素の濃度の増加と共に細胞生存が徐々に減少する。胎児皮膚細胞は、成人皮膚細胞（白丸（ＧＴ／２９）、白四角（ＳＷ２／２４）および白三角（ＳＷ１２／３９）によって示される）と同じ培養条件下および継代で比較した場合に、この型の酸化ストレスに対して１．５倍より抵抗性である（図５を参照のこと）。

胎児細胞は、物理的および酸化型ストレスに対して抵抗性であることが証明され、それがこれらの細胞に高い安定性を可能にするようである。なぜ胎児細胞が酸化ストレスに対して非常により抵抗性であるのかは未知である。いかなる特定のメカニズムに制限されることなく、それらは、潜在的に損傷を与えるフリーラジカル中間体を取り除くのにより効率的であり得る、またはおそらくそれらは、重要な細胞標的に対する酸化的損傷を処理および修復するのにより効率的である可能性がある。興味深いことに、低いおよび高い継代の胎児細胞において、２Ｄゲル分析によってタンパク質を見る予備的な研究において、劇的に変化し、そして酸化ストレス機能に関係するいくつかのタンパク質が同定された。

実施例４：３次元皮膚組織同種移植片構築物による獣医学的適用
ウマは、そのスポーツにおける使用のために、特に皮膚損傷にさらされる。ウマにおける皮膚創傷治癒は、特に治療するのに長くそして困難であり、そしていくつかの興味深い局面を有する。物質の喪失および平行する組織の損傷を考慮して、外傷創傷はめったに縫合され得ない。それに加えて、ウマは過剰な組織肉芽形成の素因があり、それは組織修復過程を阻害する。特に、上皮形成の阻害およびケロイド形成の促進が存在する。この過剰な組織肉芽形成の傾向は、美学的な質に過酷な結果を有し得、そして動物の長期間の固定を引き起こし得る。これらの因子が、動物およびその利用の金銭的価値の減少に寄与し得る。従って、けがをした競走馬に関して、４から６ヶ月の固定が必要であることもまれではなく、それが今度は直接的な競争的損失を引き起こす。従って、非常に短期間で、ウマにおける創傷部位において真皮の再生を刺激し得る、組織修復産物の必要性が存在する。

ウマの腱から作成されたコラーゲンスポンジに、胎児ウマ細胞（未分化線維芽細胞／ケラチン生成細胞）をまき、そしてウマ血清の存在下で、組織培養培地中で培養した。皮膚同種移植片構築物を産生する過程を、実施例２で開示したように行なったが、胎児ヒト細胞のかわりに胎児ウマ細胞を使用する。２つの皮膚欠損を、本方法によって調製した３次元皮膚組織同種移植片構築物を用いて試験した。

患者１は、顎の深い膿瘍を有するウマであった。歯−膿瘍が口の内側から外側表面に貫通し、潰瘍を形成していた。ウマを手術のために準備し、そして創傷をＮａＣｌで洗浄した。同種移植片構築物を調製し、そして図６ａに示すように膿瘍に配置した。次いで同種移植片構築物を包帯で覆い、そして図６ｂに示すようにその場所に縫いつけた。最初の手術から１週間後、完全な閉鎖および膿瘍の除去が存在した（図６ｃを参照のこと）。

患者２は、皮膚、筋肉から、そして骨まで達する膝の深い創傷を有するウマであった（図７ａを参照のこと）。ウマを手術のために準備し、そして創傷を洗浄した。この創傷を治療するために、２層の移植片を使用した。１つの層が筋肉を覆い（そして未分化胎児筋肉細胞を含んでいた）そして１つの層が皮膚を覆った（そして未分化胎児皮膚細胞を含んでいた）。同種移植片構築物を、創傷部位に配置し（図７ｂ）、そして次いで包帯で覆って、そしてその場所にステープルした（図７ｃ）。手術の２日後、創傷は、表面の困難な状況を残すのみで、骨および筋肉層両方において治癒しているようであった（図７ｄ）。

実施例５：３次元皮膚組織同種移植片構築物によるヒト適用
実施例２、前出において概略を述べた技術を用いて、細胞系統を作成した。患者に対する移植日の約３から５日前に、９×１２ｃｍのウマコラーゲンシートに、滅菌した、小さな口径のピペットチップでマトリックスに小さな切込みを作ることによって、１×１０^５細胞／ｃｍ^２をまいた（継代０から３の細胞を使用した）。次いで培地を１時間後に培養プレートに加え、そして２日ごとに交換した。産生された３次元皮膚組織同種移植片は、未分化表皮ケラチン生成細胞（１０−１３．５％）および未分化真皮線維芽細胞（９０−８６．５％）を含んでいた。

この研究において治療された患者は、他の伝統的な治療（コンテンション（ｃｏｎｔｅｎｔｉｏｎ）包帯、自己移植等）を用いて閉鎖しない慢性の足潰瘍を有する病歴に基づいて選択された。各患者の評価は、Ｄｏｐｐｌｅｒおよび動脈症病理（ａｒｔｅｒｉｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ）の非存在下で行なわれた。ついで慢性潰瘍を、生理学的食塩水によって洗浄し、そしてキューレットによる機械的調製を行なった。胎児細胞同種移植片構築物を適用して創傷表面全体を覆い、続いてワセリンガーゼおよび標準的なガーゼ包帯の層を適用した。同種移植片構築物を、１週間に一度適用し、４日後に包帯を交換した。次いで包帯を２日ごとに交換した。

全部で１１人の患者を、２１ヶ所の潰瘍に関して、胎児細胞療法で治療した。これらのうち、１５ヶ所の潰瘍が完全に閉鎖し、３ヶ所は大きさの有意な改善を示し（しかし完全な閉鎖ではない）、そして３ヶ所は患者が実質的な改善が存在したと判断したのでフォローアップができなかった。２人の患者の詳細を、本明細書中で示す。表３は、胎児細胞療法で治療した全ての患者をまとめる。

患者１は、慢性関節リウマチを有する女性であった。２×４．５ｃｍの大きさである、抵抗性の動脈および静脈潰瘍が足首関節に存在し、それは１８ヶ月間存在していた。Ａｐｌｉｇｒａｆｔ（登録商標）による２回の移植片適用は、成功しなかった。患者は複数のアレルギーの病歴ならびに潰瘍病変およびその周囲において重度の疼痛を示した。十分なカバーを見つけるかなりの困難さ（全ての型の包帯に対するアレルギーのため）および数ヶ月の創傷調製に対する不服従の後、患者は最終的に、続く胎児移植片の適用が有効に起こり得るように、創傷におけるフィブリンバリアの除去に同意した。患者を、全部で３１の同種移植片構築物で治療した。創傷床の調製の直後、疼痛の減少および潰瘍の大きさの継続的な減少が存在した。治療の最後における、使用したガーゼの型の小さな変化が（病院における在庫の断裂のため）、周囲の皮膚を刺激するのに十分であった。これらの結果を図８に示す。

患者２は、下部左足に４ヶ所の潰瘍を有する女性であった。潰瘍は、４×２．５ｃｍ（全部で１０個の同種移植片構築物を受けた）；３×２ｃｍ（全部で１２個の同種移植片構築物を受けた）；３×２ｃｍ（全部で２４個の同種移植片構築物を受けた）；および２．５×２ｃｍ（全部で２４個の同種移植片構築物を受けた）の大きさであった。潰瘍は２年間存在しており、そして患者は貧血、脱水、および非常に痩せていた。４つの自己移植および４つのＡｐｌｉｇｒａｆｔ（登録商標）投与による以前の治療は、不成功であった。本発明の胎児細胞療法による１回の治療後に、足のうっ血および疼痛の即座の改善が観察された。２つの潰瘍において進行性および迅速な改善が見られ、それらは数週の期間で閉鎖した。残る２つの潰瘍も改善を示したが、完全な閉鎖は可能でなかった。残った２つの潰瘍に対して、続いて自己移植が試みられたが、成功しなかった。これらの結果を、図９に示す。

実施例６：クリーム組成物によるヒト適用
未分化胎児皮膚細胞およびキャリアを含む局所組成物を、クリームの形式で調製した。この組成物は、以下の成分を含んでいた：

上記の実施例２で概略を述べた技術を用いて、細胞系統を作成した。継代５−１０からの細胞を、５．３×１０^３細胞／ｍｌの最終濃度に調製し、そして胎児タンパク質を、１時間に１℃ずつ−８０℃の最終温度まで徐々に凍結することによって安定化した。クリーム組成物、水中油型混合物を、胎児タンパク質を組み込むために徐々に温めた。

患者１は、白色萎縮と診断された女性であった。患者は持続性の足潰瘍を有していた。本発明のクリーム組成物による２週間の治療後、図１１に示すように、潰瘍は完全に閉鎖したようであった。

実施例７：コンビネーション療法によるヒト適用−３次元皮膚組織同種移植片およびクリーム組成物
患者１は、両方の下部足領域における白色萎縮と診断された女性であった。右下部足の潰瘍は、２０ヶ月間存在し、そして非常に繊維性の性質であった。下部足の皮膚が全て萎縮性であったので、３次元皮膚組織同種移植片構築物を、本発明のクリーム組成物と組み合せて適用して、潰瘍周囲の領域全体を覆った。

この胎児細胞療法後、うっ血および掻痒は即座に除去され、そしてもとの潰瘍は徐々に閉鎖した。もとの潰瘍は閉鎖した場合でさえ、皮膚の不安定性のために、新しい平行する潰瘍が形成された。よりよい創傷準備のために、自己移植を適用するつもりで、この患者はバキュームアシスティッドクロージャ（ｖａｃｕｕｍ ａｓｓｉｓｔｅｄ ｃｌｏｓｕｒｅ）（ＶＡＣ）を１週間適用された。驚くべきことに、潰瘍および関連する軽度の潰瘍化は、ＶＡＣ後に閉鎖した。以前に、数百人の患者がＶＡＣのみで１週間治療され、そして創傷の閉鎖は観察されなかった。１年後のフォローアップにおいて、患者の白色萎縮は安定であり、そして新しい潰瘍化は観察されなかった。これらの結果を図１２に示す。

患者２は、同じ足潰瘍の病歴を１０年間有する女性であった。以前の自己移植および異なる包帯療法は不成功であった。最初の胎児細胞同種移植片構築物およびクリームの適用直後に、うっ血、疼痛、およびフィブリン産生の除去が明らかであった。この大きい、深い、そして痛みを伴う潰瘍に関して、迅速な、前進性の閉鎖が観察された。クリームが末梢の皮膚を安定化し、そして新しい潰瘍を予防した。１年後のフォローアップにおいて、皮膚は依然として萎縮性であったが、瘢痕組織は存在しなかった。これらの結果を図１０に示す。

他の実施態様
本発明の特定の実施態様の、前述の詳細な説明から、独特の方法および組成物が記載されたことが明らかであるべきである。本明細書中において特定の実施態様が詳細に開示されたが、これは、説明の目的のためだけに例としてなされ、そして続く添付した請求の範囲の範囲に関して制限することを意図しない。特に、請求によって規定される本発明の意図および範囲から逸脱することなく、様々な置換、変更、および改変が、本発明に対してなされ得ることが、発明者によって企図される。

図１は、胎児細胞バンクの合成を示す概略図である。 図２ａは、真皮線維芽細胞と共に、培養における細胞のｐ６３^＋表皮ケラチン生成細胞集団を示す、ｐ６３抗体で染色した胎児皮膚の免疫組織化学的分析の結果を示す顕微鏡写真である（バーは５０μｍに相当する）。図２ｂは、胎児上皮層の免疫組織化学的分析の結果を示す顕微鏡写真である。図２ｃは、胎児真皮層の免疫組織化学的分析の結果を示す顕微鏡写真である。 図３は、各試料に関して１０００細胞から始まる、３つの個々の胎児皮膚細胞株（黒い印）および３つの成人皮膚細胞株（白い印）の、時間の関数として真皮皮膚線維芽細胞（細胞数）の細胞増殖を示すグラフである。 図４は、３つの個々の胎児皮膚細胞株（黒い印）および３つの成人皮膚細胞株（白い印）の、ＵＶＡ照射への曝露の関数として真皮皮膚線維芽細胞の生存パーセントを示すグラフである。各データポイントは、３つの培養プレートからの平均クローン数を示す。 図５は、３つの個々の胎児皮膚細胞株（黒い印）および３つの成人皮膚細胞株（白い印）の、過酸化水素による処理の関数として真皮皮膚線維芽細胞の生存パーセントを示すグラフである。各データポイントは、３つの培養プレートからの平均クローン数を示す。 図６ａは、潰瘍を生成する口の内側から外側表面へ貫通する歯−膿瘍の除去を伴う、ウマの顎における深い膿瘍を示す写真である。図６ｂは、ウマにおける創傷部位に配置した３次元皮膚組織同種移植片を示す写真である。図６ｃは、３次元皮膚組織同種移植片を配置した１週間後、ウマにおける創傷領域を示す写真である。この図は、膿瘍（潰瘍）の完全な閉鎖および除去を示す。 図７ａは、皮膚および筋肉から骨まで貫通する、ウマの膝における深い創傷を示す写真である。図７ｂは、ウマにおける筋肉胎児細胞を含む筋肉内（内部）、および胎児皮膚細胞を含む皮膚（外部）の２層３次元同種移植片を示す写真である。 図７ｃは、ウマにおける創傷部位に配置した２層３次元同種移植片を示す写真である。図７ｄは、ウマに対する２層３次元同種移植片の配置から２日後の創傷領域を示す写真である。この図は、表面の状態の悪い部分のみが残っていることを示す。 図８は、足首の関節において抵抗性の混合潰瘍を有する、ポリオ関節炎を有するヒト患者を示す写真である。 図９は、下部左足に２年間存在する、４つの潰瘍を有するヒト患者を示す写真である。本発明の３次元皮膚組織同種移植片による治療後、治療約７ヶ月以内に２つの潰瘍の完全な閉鎖が見られる。 図１０は、１０年間同じ足潰瘍の病歴を有するヒト患者を示す写真である。最初の３次元皮膚組織同種移植の直後、うっ血、疼痛およびフィブリン産生の除去が明らかであった。１年後のフォローアップにおいて、皮膚は依然として萎縮性であるが、瘢痕組織は存在しない。 図１１は、足首に潰瘍を有するヒト患者を示す写真である。本発明の組成物による約２週間の治療後、結果は潰瘍の閉鎖を示す。 図１２は、両方の下部足領域に白色萎縮を有するヒト患者を示す写真である。クリーム形態の３次元皮膚組織同種移植片および組成物を適用した。結果は潰瘍の閉鎖を示す。

Claims (52)

1. コラーゲンマトリックスに組み込まれた未分化胎児細胞を含む、３次元皮膚組織同種移植片構築物。
2. 請求項１に記載の構築物であって、前記未分化胎児細胞が、胎児皮膚細胞を含む、構築物。
3. 請求項２に記載の構築物であって、前記胎児皮膚細胞が、適切な培養条件下で真皮線維芽細胞または表皮ケラチン生成細胞に分化する、構築物。
4. 請求項１に記載の構築物であって、前記組み込みが、混合、化合、ピペッティング、播種、プレーティング、または配置することによって起こる、構築物。
5. 請求項１に記載の構築物であって、前記コラーゲンマトリックスが、ウマコラーゲンを含む、構築物。
6. 請求項１に記載の３次元皮膚組織同種移植片構築物を調製するための方法であって、以下：
   ａ）ドナー胎児組織から生検材料を回収する工程；
   ｂ）該胎児組織から細胞系統を発達させる工程；
   ｃ）該胎児組織を増殖させ、そして未分化胎児細胞を高濃度に増殖させて移植片を取る細胞バンクを産生する工程；および
   ｄ）該移植片をコラーゲンマトリックスに組み込む工程、
   を包含する、方法。
7. 請求項１に記載の３次元皮膚組織同種移植片構築物を調製するための方法であって、以下：
   ａ）未分化胎児細胞を得る工程；
   ｂ）該未分化胎児細胞を増殖させる工程；および
   ｃ）該未分化胎児細胞をコラーゲンマトリックスに組み込む工程、
   を包含する、方法。
8. 皮膚の病気、障害または疾患に罹患した被験体を処置する方法であって、該方法が、請求項１に記載の構築物を、このような処置を必要とする被験体に適用する工程を包含する、方法。
9. 請求項８に記載の方法であって、前記被験体が、ヒト、非ヒト霊長類、野生動物、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ブタ、ヒツジ、ウサギ、ラット、およびマウスからなる群より選択される、方法。
10. 請求項９に記載の方法であって、前記被験体が、ウマである、方法。
11. 請求項９に記載の方法であって、前記被験体が、ヒトである、方法。
12. 請求項８に記載の方法であって、前記皮膚の病気、障害または疾患が、創傷および皮膚の欠損からなる群より選択される、方法。
13. 請求項１２に記載の方法であって、前記創傷が、急性創傷である、方法。
14. 請求項１３に記載の方法であって、前記急性創傷が、軽度の切り傷、熱傷、乾燥した皮膚、皮膚の裂け目、皮膚裂傷、外科的創傷、事故外傷、および肥厚した瘢痕からなる群より選択される、方法。
15. 請求項１２に記載の方法であって、前記創傷が、慢性創傷である、方法。
16. 請求項１５に記載の方法であって、前記慢性創傷が、静脈潰瘍、圧迫潰瘍、糖尿病性潰瘍、動脈潰瘍および熱傷からなる群より選択される、方法。
17. 請求項１２に記載の方法であって、前記皮膚の欠損が、湿疹、乾癬、放射線皮膚炎、皮膚癌、蕁麻疹、皮斑様血管炎、重度の乾燥、および白色萎縮からなる群より選択される、方法。
18. 未分化胎児細胞バンクであって、以下：
    ａ）ドナー胎児組織から生検材料を回収する工程；
    ｂ）該胎児組織を増殖させ、そして未分化胎児細胞を適切な培養条件下で高濃度に増殖させる工程；
    ｃ）得られた培養物の組織および細胞をトリプシン処理してその懸濁を可能にする工程；
    ｄ）該懸濁細胞をプールして、該培養物からほぼ均一な細胞の懸濁液を作製する工程；
    ｅ）凍結防止剤と静かに混合する工程；
    ｆ）アンプルに該細胞懸濁液のアリコートを密封する工程；および
    ｇ）該アリコートを凍結する工程、
    これらによって未分化胎児細胞バンクを調製する方法によって得られ得る、未分化胎児細胞バンク。
19. 請求項１８に記載の未分化胎児細胞バンクであって、該未分化胎児細胞が、胎児皮膚細胞である、未分化胎児細胞バンク。
20. 請求項１９に記載の未分化胎児細胞バンクであって、前記未分化胎児皮膚細胞が、ｐ６３^＋である、未分化胎児細胞バンク。
21. 請求項１８に記載の未分化胎児細胞バンクであって、前記アリコートの凍結が、−８０℃の温度に達するまで１℃／分ずつ温度を下げることによって達成される、未分化胎児細胞バンク。
22. 未分化胎児細胞バンクを調製する方法であって、該方法が、以下：
    ａ）ドナー胎児組織から生検材料を回収する工程；
    ｂ）該胎児組織を増殖させ、そして未分化胎児細胞を適切な培養条件下で高濃度に増殖させる工程；
    ｃ）得られた培養物の組織および細胞をトリプシン処理してその懸濁を可能にする工程；
    ｄ）該懸濁細胞をプールして、該培養物からほぼ均一な細胞の懸濁液を作製する工程；
    ｅ）凍結防止剤と静かに混合する工程；
    ｆ）アンプルに該細胞懸濁液のアリコートを密封する工程；および
    ｇ）該アリコートを凍結する工程、
    これらによって未分化胎児細胞バンクを調製する工程、
    を包含する、方法。
23. 請求項２２に記載の方法であって、前記アリコートの凍結が、−８０℃の温度に達するまで１℃／分ずつ温度を下げることによって、達成される、方法。
24. キャリアおよび１つまたはそれ以上の未分化胎児細胞を単独で、または１つまたはそれ以上の胎児タンパク質と組み合せて含む、組成物。
25. 請求項２４に記載の組成物であって、前記キャリアが、軟膏、ローション、クリーム、エマルジョン、マイクロエマルション、ゲルおよび溶液からなる群より選択される、組成物。
26. 請求項２５に記載の組成物であって、前記キャリアが、クリームである、組成物。
27. 請求項２６に記載の組成物であって、前記クリームが、Ｏ／Ｗ混合物を含む、組成物。
28. 請求項２４に記載の組成物であって、前記キャリアが、疎水性アジュバントおよび親水性アジュバントを含む、組成物。
29. 請求項２４に記載の組成物を調製するための方法であって、以下：
    ａ）ドナー胎児組織から生検材料を回収する工程；
    ｂ）該胎児組織から細胞系統を発達させる工程；
    ｃ）該胎児組織を増殖させ、そして未分化胎児細胞を高濃度に増殖させて細胞バンクを作製する工程；
    ｄ）該細胞バンク中の胎児タンパク質を安定化する工程；および
    ｅ）該胎児細胞をキャリアに組み込む工程、
    を包含する、方法。
30. 請求項２４に記載の組成物を調製するための方法であって、以下：
    ａ）未分化胎児細胞を得る工程；
    ｂ）該未分化胎児細胞を増殖させる工程；
    ｃ）該胎児細胞中の胎児タンパク質を安定化させる工程；および
    ｄ）該胎児細胞をキャリアに組み込む工程、
    を包含する、方法。
31. 請求項２４に記載の組成物を調製するための方法であって、以下：
    ａ）ドナー胎児組織から生検材料を回収する工程；
    ｂ）該胎児組織から細胞系統を発達させる工程；
    ｃ）該胎児組織を増殖させ、そして未分化胎児細胞を高濃度に増殖させて細胞バンクを作製する工程；および
    ｄ）該胎児細胞をキャリアに組み込む工程、
    を包含する、方法。
32. 請求項２４に記載の組成物を調製するための方法であって、以下：
    ａ）未分化胎児細胞を得る工程；
    ｂ）該未分化胎児細胞を増殖させる工程；および
    ｃ）該胎児細胞をキャリアに組み込む工程、
    を包含する、方法。
33. 皮膚の病気、障害または疾患を予防または処置するための方法であって、治療的に有効な量の請求項２４に記載の組成物を、被験体の皮膚の感受性の領域、または冒された領域へ投与する工程を包含する、方法。
34. 請求項３３に記載の方法であって、前記皮膚の病気、障害または疾患が、炎症性の皮膚の病気である、方法。
35. 請求項３４に記載の方法であって、前記炎症性の皮膚の病気が、にきび、しみ、瘢痕、熱傷、挫傷、母斑、入れ墨、色素過剰、アトピー性皮膚炎、潰瘍周辺、湿疹、放射線皮膚炎、潰瘍、蕁麻疹、重度の乾燥、および白色萎縮からなる群より選択される、方法。
36. 請求項３５に記載の方法であって、前記炎症性の皮膚の病気が、潰瘍周辺である、方法。
37. 請求項３５に記載の方法であって、前記炎症性の皮膚の病気が、白色萎縮である、方法。
38. 請求項３５に記載の方法であって、前記炎症性の皮膚の病気が、色素過剰である、方法。
39. 請求項３３に記載の方法であって、前記被験体が、ヒト、非ヒト霊長類、野生動物、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ブタ、ヒツジ、ウサギ、ラットおよびマウスからなる群より選択される、方法。
40. 請求項３９に記載の方法であって、前記被験体が、ウマである、方法。
41. 請求項３９に記載の方法であって、前記被験体が、ヒトである、方法。
42. 皮膚の病気、障害または疾患に罹患した被験体を処置する方法であって、該方法が、コラーゲンマトリックスに組み込まれた未分化胎児皮膚細胞を含む、３次元皮膚組織同種移植片を投与する工程、ならびにキャリアおよび１つまたはそれ以上の未分化胎児細胞を単独でまたは１つまたはそれ以上の胎児タンパク質と組み合せて含む組成物を投与する工程を包含し、その結果、該皮膚の病気、障害または疾患が、時間につれて治癒する、方法。
43. 請求項４２に記載の方法であって、前記同種移植片および前記組成物が、連続的に投与される、方法。
44. 請求項４２に記載の方法であって、前記同種移植片および前記組成物が、同時に投与される、方法。
45. 請求項４２に記載の方法であって、前記被験体が、ヒト、非ヒト霊長類、野生動物、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ブタ、ヒツジ、ウサギ、ラットおよびマウスからなる群より選択される、方法。
46. 請求項４５に記載の方法であって、前記被験体が、ウマである、方法。
47. 請求項４５に記載の方法であって、前記被験体が、ヒトである、方法。
48. 請求項４２に記載の方法であって、前記皮膚の病気、障害または疾患が、軽度の切り傷、熱傷、乾燥皮膚、皮膚の裂け目、皮膚裂傷、外科的創傷、事故外傷、肥厚性瘢痕、静脈潰瘍、圧迫潰瘍、糖尿病性潰瘍、動脈潰瘍、湿疹、乾癬、放射線皮膚炎、皮膚癌、蕁麻疹、皮斑様血管炎、白色萎縮、にきび、しみ、瘢痕、挫傷、母斑、入れ墨、色素過剰、アトピー性皮膚炎、潰瘍周辺、湿疹、放射線皮膚炎、潰瘍および蕁麻疹からなる群より選択される、方法。
49. 請求項４２に記載の方法であって、前記未分化胎児細胞が、胎児皮膚細胞である、方法。
50. 請求項４９に記載の方法であって、前記胎児皮膚細胞が、適切な培養条件下で真皮線維芽細胞または表皮ケラチン生成細胞に分化する、方法。
51. 請求項４２に記載の方法であって、前記コラーゲンマトリックスが、ウマコラーゲンを含む、方法。
52. 請求項４２に記載の方法であって、前記キャリアが、軟膏、ローション、クリーム、エマルション、マイクロエマルション、ゲルおよび溶液からなる群より選択される、方法。

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