JP2016504313A - 胎児線維芽細胞及びケラチノサイトを含有する包帯 - Google Patents
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Abstract
Description
一方では、純粋に実用面での観点で、この組成物は分化した表皮又は真皮表皮接合部を必要としないことから、要望があってから48〜72時間以内に患者が利用できるようになる。その他にも、本組成物の各成分(ケラチノサイト又は線維芽細胞)は、好ましくは窒素蒸気中の容器内の凍結したアンプル中で、長距離でも容易に輸送できる。
で増幅させ、凍結して、本発明の組成物での使用に適した対象の胎児ケラチノサイト細胞の臨床バッチ(又は「細胞バンク」)を構成する。
a)胎児ヒトケラチノサイト細胞を得る工程、及び
b)胎児ヒト線維芽細胞を得る工程
を含む。
a)胎児ヒトケラチノサイト細胞のバンクを得る工程、及び
b)胎児ヒト線維芽細胞のバンクを得る工程
を含む。
I.1.胎児の皮膚のサンプルの調製
ドナーの選択作業は、ナントのCHUの産婦人科が請け負う。この作業は、医療的な妊娠中絶中に採取された12から22週の間の在胎期間の胎児を使用することからなる。これらの胎児は、ウイルス関連の異常又は染色体異常を有していてはならない。母親の血清学的特徴は、C型肝炎、AgHB、Ac HBc、HIV1及び2、Ag p24、HTLV1及び2、CMVに関して陰性でなければならない。
最初のトリプシン処理により線維芽細胞を産生する。そのために、ピペットを使用して6-ウェルプレートから培養培地を切り離す。次いでウェルを2mlのDPBSで濯ぐ。
トリプシン処理後に線維芽細胞を回収したら、6-ウェルプレートを2mL/ウェルのDPBSで濯ぎ、ケラチノサイトの増殖に有利になるように最初の培養培地をCnT-07/PS培地(1%)で交換する。プレートを37℃/5%CO2で3〜7日間インキュベートする。
上記で得られた胎児タイプ又は成人細胞の培養物由来のケラチノサイト、線維芽細胞又は異なる比率の両細胞タイプの混合物の培養上清を、48時間培養した後に凍結し、それらのVEGF-A、PDGF-AA、IL1β、GM-CSF、IL-1α、IL-8及びHGF含量をELISA測定で分析した。
上述したようにして得られた線維芽細胞及び胎児ケラチノサイトに放射線照射し、次いでフィトヘマグルチニン-L(PHA-L)及びインターロイキン2(IL-2)によって刺激されたPBMCの存在中に入れた。異なる比率の胎児細胞/PBMCを試験して(1/4;1/20;1/100;1/200)、リンパ球増殖に対する胎児細胞用量のあらゆる作用を観察した。5日間培養した後にチミジン取り込みの量を測定することによって増殖を評価した。
線維芽細胞及び胎児ケラチノサイトの免疫調節能力に対するIDOの役割を評価するために、リンパ球増殖に対する胎児細胞の阻害作用のあらゆる逆転が観察されるように、リンパ球増殖期中にIDOの特異的阻害剤である1-MT(1-メチルトリプトファン)を200μM、20μM及び2μMの濃度で添加したという違いを除いては、段落I.5で記載したのと同じタイプの実験を行った。
本明細書で上述されたプロトコールに従って得られた線維芽細胞及びケラチノサイトによりこの試験を行った。この試験の目的は、最適な治癒を達成するための各細胞タイプの比率を決定することであった。密集状態に近い密度(12-ウェルプレートのウェル1つあたり100,000個の細胞)で細胞をCnT-07培地に植え付けた。追加で24時間培養した後、針を使用して細胞マットを「スクラッチ」した(「スクラッチ」の測定幅は、300〜500μmの規模である、図8を参照)。細胞をPBSで洗浄し、次いで何も補充されていない新しい培地を各ウェルに添加した。すぐにプレートを23時間にわたりタイムラプスで分析した(細胞のリアルタイム分析)。
1- 線維芽細胞単独(100/0の線維芽細胞/ケラチノサイト比)
2- 75%線維芽細胞+25%ケラチノサイト(75/25の線維芽細胞/ケラチノサイト比)
3- 50%線維芽細胞+50%ケラチノサイト(50/50の線維芽細胞/ケラチノサイト比)
4- ケラチノサイト単独(0/100の線維芽細胞/ケラチノサイト比)。
II.1.線維芽細胞及び胎児ケラチノサイト単独又は混合物(1:1の比率)によるサイトカインの分泌
図1に結果を示す。
図2に結果を示す。
本発明者らは、線維芽細胞及び胎児ケラチノサイト単独は、GM-CSFを分泌しないことを観察した。しかしながら、これらの細胞が1:1の比率で共培養されると、培養上清中でGM-CSFが強く過剰発現される(562pg/ml)。
本発明者らは、試験された細胞サンプルに関わりなく極めて類似したIL-1αの分泌プロファイルを観察した。この方式において、線維芽細胞は、単一培養ではIL-1αを分泌しないが、それに対してケラチノサイトは分泌するようである(胎児タイプの細胞の場合、最大157pg/ml)。
IL-8の分泌プロファイルも極めて類似している。したがって、線維芽細胞及び胎児ケラチノサイトは単一培養では分泌を行わないようである。PA05(腹壁形成術)及びPC01(大腿部の外科手術)サンプルに由来する成人ケラチノサイト単独は極めて低いレベルで分泌を行う(それぞれ870及び1000pg/ml)。
単一培養では、線維芽細胞も胎児ケラチノサイトもHGFを分泌しない。しかしながら、共培養では、HGF濃度の顕著な上昇が観察される(39.5pg/ml)。共培養における胎児及び成人細胞の比較から、胎児細胞は、成人細胞より強くHGF因子を分泌する(23pg/mlに対して39.5pg/ml)ことが示される。また、線維芽細胞及び胎児ケラチノサイトの連携は、実質的にHGF分泌を増強するが、それに対して成人細胞では逆の作用も観察されるようである。
本発明者らは、胎児線維芽細胞は、成人ドナーの線維芽細胞より2倍多くVEGF-Aを分泌する(1323pg/mlに対して2770pg/ml)ことを観察した。しかしながら、成人ケラチノサイトによるVEGF-A分泌は、胎児ケラチノサイトの場合よりも高い(1404pg/mlに対して1875pg/ml)。
この方式において、本発明者らは、線維芽細胞及び胎児ケラチノサイトの共培養は、単一培養ではこれらの細胞によって自然には分泌されないGM-CSF、IL-8及びHGF因子の分泌に必須であることを実証した。またこの共培養は、それほど強くなくともVEGF-A分泌にも良い影響を与える。
サイトカイン産生に対する線維芽細胞及び胎児ケラチノサイトの比率の影響を研究するために、本発明者らは、これらの細胞の異なる比率に対する異なるサイトカイン濃度を研究した。
本発明者らは、線維芽細胞及び胎児ケラチノサイトの連携が、前記細胞でのGM-CSF発現を可能にすることを観察した。したがって、これらの結果から、これらの2つの細胞タイプ間の相互作用が、GM-CSFの分泌に必要であることが確認される。
ポイントII.2の結果のように、胎児ケラチノサイトだけがIL-1αを分泌することは明らかである。しかしながら、GM-CSFとは対照的に、線維芽細胞及び胎児ケラチノサイトの共培養は、IL-1α分泌に影響しないようである。したがって、90%線維芽細胞/10%ケラチノサイトの比率ではIL-1α分泌は極めて低く、逆の比率(10%線維芽細胞/90%ケラチノサイト)になるに従って次第に増加し、ケラチノサイトの単一培養で得られたレベルをわずかに超えるレベルに達する(157pg/mlに対して188pg/ml)。各細胞タイプが50%の比率は、ケラチノサイトの単一培養で得られたレベルの半分に達する。
GM-CSFに関して、本発明者らは、線維芽細胞及び胎児ケラチノサイトの連携がIL-8発現を引き起こすことを観察した。この方式において、これらの結果から、これらの2つの細胞タイプ間の相互作用が、このサイトカインの分泌に必要であることが確認される。
GM-CSF及びIL-8に関して、線維芽細胞及び胎児ケラチノサイトの連携が、前記細胞でのHGF分泌を可能にする。したがってこれらの結果から、これらの2つの細胞タイプ間の相互作用が、HGFの発現に必要であることが確認される。
ポイントII.2で観察されたように、VEGF-Aは、単一培養における線維芽細胞及び胎児ケラチノサイトで発現された唯一のサイトカインである。
これらの結果から、線維芽細胞及び胎児ケラチノサイトを組み合わせることにより、数種の増殖因子及びサイトカイン、特に、単一培養ではこれらの細胞によって自然には発現されるものではなく、治癒過程において密接な関係にあることがわかっているGM-CSF、HGF及びIL8の過剰発現が可能になることが確認される。
図4に結果を示す。
図5に結果を示す。
図5Bのa、b及びcのグラフに結果を示す。
図6のグラフに結果を示す。
1- 線維芽細胞50%/ケラチノサイト50%の条件での発生から極めて迅速にスクラッチが閉鎖されること。次いで15時間で安定化し、次いで再度スクラッチ領域の被覆率が強く加速されること。
2- 100%線維芽細胞の条件において、初期の閉鎖は極めて遅く、次いで5時間後に増加するが、スクラッチ閉鎖は比較的穏やかなままであり、20時間で17%にしか達しない。
3- 100%ケラチノサイト及び75%線維芽細胞/25%ケラチノサイトの条件の場合、スクラッチ閉鎖は、発生から20時間まで直線的に起こり、捕捉の完了時には約35%の閉鎖が達成される。
図7A及び7Bに結果を示す。この他の代表的な結果から、捕捉の最も早い時間及び完了時における異なる条件間のケラチノサイト/線維芽細胞の比率の重要性が解明される。
III.1 本発明に係るTissucolをベースとした皮膚代用品の調製
上記で記載したプロトコールに従って液体窒素中で保存された線維芽細胞及び胎児ケラチノサイト細胞を融解させ、75cm2の培養フラスコに植え付け、5%CO2を含む湿潤した雰囲気中で37℃で48時間にわたりインキュベートした。線維芽細胞及びケラチノサイト細胞を、培養フラスコから完全に層間剥離するまでトリプシン/EDTA 1×中で別々に処置した。10%SVFが補充されたDMEM培地を添加して、トリプシンの作用を阻害する。ケラチノサイト及び線維芽細胞を遠心分離し、次いでカウントした(常に別々に)。等しい数の線維芽細胞及びケラチノサイト細胞(ケラチノサイト:線維芽細胞=1:1の比率)、すなわち0.2×106から10×106個の細胞、好ましくは2×106個の細胞を同じ15mlチューブ中で徹底的に混合した。このチューブを遠心分離し、体積1mLのTissucolキットの第二の成分(ヒトトロンビン+塩化カルシウム)中にPRBCを溶解させた。第一のTissucol(登録商標)の成分(ヒトフィブリノゲン+ヒト第III凝固因子+ヒトフィブロネクチン+ヒトプラスミノゲン+ウシアプロチニン)を、1mLのTissucolキットの使用により、等しい体積で生体用接着剤の第二の成分と混合した。2種の混合された接着剤成分を、創傷、やけど又は潰瘍上に置いてもよい。
III.2.a)上記で記載したプロトコールに従って液体窒素中で保存された線維芽細胞及び胎児ケラチノサイト細胞を融解させ、75cm2の培養フラスコに植え付け、5%CO2を含む湿潤した雰囲気中で37℃で48時間にわたりインキュベートした。次いで線維芽細胞及びケラチノサイト細胞を、培養フラスコから完全に層間剥離するまでトリプシン/EDTA 1×中で別々に処置した。10%SVFが補充されたDMEM培地を添加して、トリプシンの作用を阻害する。次いでケラチノサイト及び線維芽細胞を遠心分離し、次いでカウントした(常に別々に)。次いで等しい数の線維芽細胞及びケラチノサイト細胞(ケラチノサイト:線維芽細胞=1:1の比率)を15mlのチューブに移し、遠心分離し、10%SVFが補充されたDMEM培養培地中に溶解させた。1:1の比率で混合された線維芽細胞及びケラチノサイト細胞を、マトリックス1cm3あたり0.1から5×106個の細胞の密度でI型ウシコラーゲンのスポンジ状マトリックスに植え付けた。マトリックス上に植え付けられた細胞を、5%CO2を含む湿潤した雰囲気中で、37℃でインキュベートした。48時間後、細胞状になった(cellularised)マトリックスは、創傷、やけど又は潰瘍に適用できる。
(i)業者による介入の数が限られており、皮膚代用品の調製が簡易化され;
(ii)皮膚代用品の調製時間が全体で24時間であり、患者にとってより迅速に皮膚代用品の利用が可能になる
ために、上記のポイントIII.2.a)で開示されたものと比べて数々の利点を有する。
Claims (14)
- 胎児ヒトケラチノサイト細胞及び胎児ヒト線維芽細胞の混合物を含む組成物であって、前記ケラチノサイト及び前記線維芽細胞の比率が0.75から2.5の範囲である組成物。
- 前記比率が、1:1又は7:3である、請求項1に記載の組成物。
- 前記細胞の混合物が、非免疫原性細胞外マトリックスに統合される、請求項1又は2に記載の組成物。
- マトリックス1mL又は1cm3あたり0.1から5.106個の間の細胞を含有することを特徴とする、請求項3に記載の組成物。
- 前記マトリックスが、コラーゲン、フィブロネクチン、フィブリン、及びエラスチン、並びにそれらの混合物からなる群より選択される少なくとも1種の化合物を含有することを特徴とする、請求項3又は4に記載の組成物。
- 前記マトリックスが、ヒトフィブリノゲン、ヒト第XIII因子、ヒトフィブロネクチン、プラスミノゲン、ウシアプロチニン及びヒトトロンビンで構成される、請求項3又は4に記載の組成物。
- 請求項1から6のいずれか一項に記載の組成物を含有する包帯。
- 滅菌されて、微生物を通さない容器中にパッケージングされることを特徴とする、請求項7に記載の包帯。
- 薬物として使用するための、請求項1から6のいずれか一項に記載の組成物。
- 皮膚欠陥、例えば創傷、やけど又は潰瘍の処置に使用するための、請求項1から6のいずれか一項に記載の組成物。
- 0.75から2.5の範囲の比率で、胎児ヒトケラチノサイト細胞及び胎児ヒト線維芽細胞を、非免疫原性細胞外マトリックスと混合する工程を含む、請求項1から6のいずれか一項に記載の組成物の製造方法。
- 前記比率が、1:1又は7:3であることを特徴とする、請求項11に記載の製造方法。
- 前記混合する工程の前に、以下の2つの工程:
a)胎児ヒトケラチノサイト細胞を得る工程、及び
b)胎児ヒト線維芽細胞を得る工程
を含むことを特徴とする、請求項11又は12に記載の製造方法。 - 前記混合する工程の前に、以下の2つの工程:
a)胎児ヒトケラチノサイト細胞のバンクを得る工程、及び
b)胎児ヒト線維芽細胞のバンクを得る工程
を含むことを特徴とする、請求項11又は12に記載の製造方法。
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