JP2004121819A

JP2004121819A - 組織再生のための方法および組成物

Info

Publication number: JP2004121819A
Application number: JP2003157362A
Authority: JP
Inventors: Eric Rolland; エリク　ローランド; Thomas Hunziker; トーマス　ハンツィカー; Beatrice Mis; ビートリス　ミス; Christopher Rinsch; クリストファー　リンシュ
Original assignee: ISOTIS SA
Current assignee: ISOTIS SA
Priority date: 2002-09-06
Filing date: 2003-06-02
Publication date: 2004-04-22
Anticipated expiration: 2023-06-02
Also published as: US20030165482A1; EP2311469A2; CA2497193C; ATE535250T1; CA2497193A1; EP1545565A1; US7449333B2; US7700351B2; US20060121002A1; US8323638B2; DK1545565T3; AU2003273292A1; EP1545565A4; US20100068281A1; US20110083987A1; CA2904030A1; PT1545565E; AU2003273292B2; AU2009240818A1; EP2311469A3

Abstract

【課題】創傷の型にも患者集団の性質にも構わずに使用され得る、広範でありかつ／または治癒しにくい創傷の治癒を増強するための、安全で、効果的で、相互作用性手段が、必要とされている。
【解決手段】本発明は、組織再生のための細胞調製物を調製するためのキットであって、該キットは、１つ以上の容器に以下：ａ）細胞外マトリックスまたはマトリックス材料を含む第１成分；およびｂ）生物学的に活性な分子を分泌する１つ以上の細胞型を含む第２成分であって、該細胞型は、同種異系で、有糸分裂活性であるかまたは有糸分裂不活性であり、そして間質細胞、上皮／器官特異的細胞、および血液由来細胞からなる群から選択される第２成分を含む、キットを提供する。
【選択図】　なし

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本出願は、２００２年９月６日に出願された米国特許出願番号６０／４０８，５６５の恩恵を請求する。本出願は、２００１年８月３０日に出願された米国特許出願番号０９／９４３，１１４の一部継続出願である。この米国特許出願番号０９／９４３，１１４は、２０００年９月１日に出願された米国特許出願番号６０／２３０，２８６と、２００１年６月１８日に出願された米国特許出願番号６０／２９９，００３とに対する、優先権を主張する。これらの米国特許出願の各々は、その全体が本明細書中で参考として援用される。
【０００２】
（本発明の分野）
本発明は、一般的には、組織再生に関し、例えば、生物学的細胞外マトリックスもしくは合成細胞外マトリックスと混合され、そして／あるいは、創傷包帯もしくは固体の非分解性支持マトリックスに取り付けられるか、または創傷包帯もしくは固体の非分解性支持マトリックスに適用された、増殖因子分泌細胞、サイトカイン分泌細胞、または脈管形成因子分泌細胞を使用する創傷処置に、関する。
【０００３】
【従来の技術】
哺乳動物組織における創傷（すなわち、裂傷または開口部）は、組織の破壊、およびその創傷面での微小血管の凝固を生じ得る。このような組織の修復は、損傷に対する、順序正しく制御された細胞応答を示す。すべての軟部組織の創傷は、大きさに関わらず、類似した様式で治癒する。組織の増殖および修復の機構は、酸素勾配の存在下で細胞増殖および新脈管形成が生じる、生物学的系である。組織修復の間に生じる連続的な形態変化および構造変化は、大変詳細に特徴付けられており、そしていくつかの場合では、定量されている。例えば、非特許文献１を参照のこと。
【０００４】
種々の器官（例えば、皮膚または心臓）における組織再生は、結合組織に依存する。結合組織は、血液供給を回復し、そして残った器官特異的細胞（例えば、ケラチノサイトまたは筋細胞）が器官の完全性を再確立することを可能にする。従って、間葉細胞（すなわち、線維芽細胞、またはさらに、血管の内皮細胞）の関連する機能は、治癒プロセスを増強する因子（例えば、新規な血管の形成（新脈管形成）を促進する因子、またはケラチノサイトを増殖させそして移動させることにより再上皮形成を促進する因子）の分泌である。
【０００５】
創傷の細胞形態は、３つの異なる区域からなる。中心の無血管創傷領域は、酸素が欠乏し、アシドーシス性であり、かつ高炭酸ガス性であり、そして高い乳酸レベルを有する。この創傷領域に近接して、局所的虚血の勾配区域が存在し、この局所的虚血は、分裂する線維芽細胞により生成される。この先導領域の後ろに、成熟線維芽細胞と新たに形成された多数の血管（すなわち、新生血管形成）により特徴付けられる、活性コラーゲン合成領域が存在する。新規な血管増殖（新脈管形成）は、創傷組織の治癒に必要であるが、脈管形成因子は、一般的には、組織修復のさらなる生合成効果を提供するという、長らく感じられている必要性を満たすことができない。創傷（すなわち、重篤な火傷、外科的切開、裂傷、および他の外傷）をより迅速に治癒する必要性にも関わらず、現在まで、薬理学的因子を用いて創傷治癒を加速することには、限られた成功しか存在していない。
【０００６】
創傷処置における主要な目的は、創傷の閉鎖を達成することである。開放性皮膚創傷は、１つの主要な創傷カテゴリーである。このカテゴリーは、急性の外科的および外傷性の創傷、例えば、慢性潰瘍、火傷、ならびに慢性の創傷、例えば、神経障害性潰瘍、褥瘡、動脈および静脈（うっ血）の潰瘍または混合型の動静脈潰瘍、および糖尿病性潰瘍を包含する。開放性皮膚創傷は、慣用的には、以下の６つの主要な構成要素を含むプロセスによって治癒する：ｉ）炎症、ｉｉ）線維芽細胞増殖、ｉｉｉ）血管増殖、ｉｖ）結合組織合成、ｖ）上皮形成、およびｖｉ）創傷収縮。これらの構成要素が、個別にかまたは全体として、適切に機能しない場合、創傷治癒は、損なわれる。多数の要因が、創傷治癒に影響を与え得る。このような要因としては、栄養失調、感染、薬理学的因子（例えば、細胞傷害性薬物およびコルチコステロイド）、糖尿病、および高齢が、挙げられる。例えば、非特許文献２を参照のこと。
【０００７】
容易には治癒しない皮膚創傷は、患者に、かなりの身体的、感情的、および社会的な困難、ならびに多大な財務上の支出を引き起こす。例えば、非特許文献３を参照のこと。実際、最終的に適切に治癒しない創傷は、多少積極的な外科的処置（例えば、自己皮膚移植）を必要とし得る。多数の処置様式が、科学者による創傷の基本的理解として開発されており、そして創傷治癒機構は、進歩している。
【０００８】
皮膚創傷の治癒を補助するために最も一般的に使用されている従来の処置様式は、創傷包帯の使用を包含する。１９６０年代において、創傷医療における主要な躍進が生じた。この時、水分閉鎖包帯を用いる創傷治癒は、一般的に言うと、乾燥した非閉鎖包帯の使用よりも効果的であることが、発見された。例えば、非特許文献４を参照のこと。今日、多数の型の包帯が、慣用的に使用される。このような包帯としては、フィルム（例えば、ポリウレタンフィルム）、ヒドロコロイド（ポリウレタン発泡体に結合した親水性のコロイド状粒子）、ヒドロゲル（およそ少なくとも６０％の水を含む、架橋ポリマー）、発泡体（親水性発泡体または疎水性発泡体）、アルギン酸カルシウム（アルギン酸カルシウム由来の繊維の非織複合材）、およびセロハン（可塑剤を含むセルロース）が、挙げられる。例えば、非特許文献５および６を参照のこと。不幸なことに、特定の型の創傷（例えば、糖尿病性潰瘍、褥瘡）および特定の患者（例えば、外因性コルチコステロイドのレシピエント）の創傷は、このような包帯を用いる時宜を得た様式では（または全く）治癒しない。
【０００９】
いくつかの薬学的処置様式もまた、創傷治癒を改善する試みにおいて利用されてきた。例えば、硫酸亜鉛を含む処置レジメンが、何人かの開業医により利用されている。しかし、これらのレジメンの効力は、正常に満たない血清亜鉛レベルの効果（例えば、減少した宿主抵抗性および変化した細胞内殺菌活性）をこれらのレジメンが逆転することに、主に帰せられている。例えば、非特許文献７を参照のこと。他のビタミン欠乏およびミネラル欠乏（例えば、ビタミンＡ欠乏、ビタミンＣ欠乏、およびビタミンＤ欠乏；ならびにカルシウム欠乏、マグネシウム欠乏、銅欠乏、および鉄欠乏）もまた、創傷治癒の低下と関連付けられているが、これらの物質の血清レベルをこれらの物質の通常レベルよりも増加させることが実際に創傷治癒を増強するという、強力な証拠は存在しない。従って、非常に限定された環境を除いて、これらの因子を用いて創傷治癒を促進することは、ほとんど成功しない。
【００１０】
【非特許文献１】
Ｈｕｎｔ，Ｔ．Ｋ．ら、「Ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ　ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ　ａｎｄ　ｗｏｕｎｄ　ｈｅａｌｉｎｇ」、Ｔｈｅ　ｓｕｒｇｉｃａｌ　ｗｏｕｎｄ、Ｆ．ＤｉｎｅｅｎおよびＧ．Ｈｉｌｄｒｉｃｋ−Ｓｍｉｔｈ編、Ｌｅａ　＆Ｆｅｂｉｇｅｒ、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ、１９８１年、ｐ１〜１８、
【非特許文献２】
Ｈｕｎｔら、「Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｓｕｒｇｉｃａｌ　Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ　＆　Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ」、Ｗａｙ；Ａｐｐｌｅｔｏｎ　＆　Ｌａｎｇｅ、１９８８年、ｐ８６〜９８
【非特許文献３】
Ｒｉｃｋｅｙら、「Ａｎｎａｌｓ　ｏｆ　Ｐｌａｓｔｉｃ　Ｓｕｒｇｅｒｙ」１９８９年、２３（２）：ｐ１５９〜６５
【非特許文献４】
Ｗｉｎｔｅｒ、「Ｎａｔｕｒｅ」、１９６２年、１９３：ｐ２９３〜９４
【非特許文献５】
Ｋａｎｎｏｎら、「Ｄｅｒｍａｔｏｌ」、１９９５年、Ｓｕｒｇ．２１：ｐ５８３〜５９０
【非特許文献６】
Ｄａｖｉｅｓ、「Ｂｕｒｎｓ」１９８３年、１０：ｐ９４
【非特許文献７】
Ｒｉｌｅｙ、「Ａｍ．Ｆａｍ．Ｐｈｙｓｉｃｉａｎ」１９８１年、２４：ｐ１０７
【００１１】
【発明が解決しようとする課題】
必要とされるのは、創傷の型にも患者集団の性質にも構わずに使用され得る、広範でありかつ／または治癒しにくい創傷の治癒を増強するための、安全で、効果的で、相互作用性手段である。
【００１２】
【課題を解決するための手段】
一つの局面において、本願発明は、組織再生のための細胞調製物を調製するためのキットであって、上記キットは、１つ以上の容器に以下：
ａ）細胞外マトリックスまたはマトリックス材料を含む、第１成分；および
ｂ）生物学的に活性な分子を分泌する１つ以上の細胞型を含む第２成分であって、上記細胞型は、同種異系で、有糸分裂活性であるかまたは有糸分裂不活性であり、そして間質細胞、上皮／器官特異的細胞、および血液由来細胞からなる群から選択される、第２成分、
を含む、キットを提供する。
【００１３】
好ましい実施形態において、上記細胞型が、分化した線維芽細胞およびケラチノサイトであり得る。
【００１４】
好ましい実施形態において、上記細胞調製物が、ペーストの形態であり得る。
【００１５】
好ましい実施形態において、上記生物学的に活性な分子が、少なくとも１つの脈管形成因子、少なくとも１つの増殖／サイトカイン因子、または少なくとも１つの脈管形成因子と少なくとも１つの増殖／サイトカイン因子との組み合わせであり得る。
【００１６】
好ましい実施形態において、上記細胞外マトリックスまたはマトリックス材料が、フィブリン、フィブリングルー、フィブリノゲン、フィブリンビーズ、および他の合成ポリマー材料もしくは合成ポリマー骨格材料または創傷包帯材料からなる群から選択され得る。
【００１７】
好ましい実施形態において、上記細胞型が、マイトマイシンＣまたは他の化学物質ベースの有糸分裂インヒビターの投与、γ線の照射、Ｘ線の照射、またはＵＶ光の照射により、有糸分裂が不活性にされ得る。
【００１８】
好ましい実施形態において、上記細胞型が、アデノウイルスＥ１Ａ遺伝子の１２Ｓ産物および１３Ｓ産物、ｈＴＥＲＴ、ＳＶ４０スモールＴ抗原、ＳＶ４０ラージＴ抗原、パピローマウイルスＥ６およびＥ７、エプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）、エプスタイン−バー核抗原−２（ＥＢＮＡ２）、ヒトＴ細胞白血病ウイルス−１（ＨＴＬＶ−１）、ＨＴＬＶ−１類、Ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓ　ｓａｉｍｉｒｉ（ＨＶＳ）、変異体ｐ５３、ｍｙｃ、ｃ−ｊｕｎ、ｃ−ｒａｓ、ｃ−Ｈａ−ｒａｓ、ｈ−ｒａｓ、ｖ−ｓｒｃ、ｃ−ｆｇｒ、ｍｙｂ、ｃ−ｍｙｃ、ｎ−ｍｙｃ、ならびにＭｄｍ２からなる群から選択される、少なくとも１つの遺伝子／ポリペプチドを使用して不死化され得る。
【００１９】
好ましい実施形態において、上記細胞型が、１つ以上の生物学的に活性な分子を天然で分泌し得る。
【００２０】
好ましい実施形態において、上記細胞型が、外因性レベルの、少なくとも１つの脈管形成因子、少なくとも１つの増殖／サイトカイン因子、または少なくとも１つの脈管形成因子と少なくとも１つの増殖／サイトカイン因子との組み合わせを分泌するように遺伝子操作され得る。
【００２１】
好ましい実施形態において、上記少なくとも１つの脈管形成因子、少なくとも１つの増殖／サイトカイン因子、または少なくとも１つの脈管形成増殖因子と少なくとも１つの増殖／サイトカイン因子との組み合わせの分泌が、遺伝子スイッチによって制御され得る。
【００２２】
好ましい実施形態において、上記少なくとも１つの脈管形成因子、少なくとも１つの増殖／サイトカイン因子、または少なくとも１つの脈管形成増殖因子と少なくとも１つの増殖／サイトカイン因子との組み合わせが、構成的に分泌され得る。
【００２３】
好ましい実施形態において、上記第１成分が、フィブリノゲンを含み得る。
【００２４】
好ましい実施形態において、上記第２成分が、約１×１０^３細胞／μｌ〜約５０×１０^３細胞／μｌを含み得る。
【００２５】
好ましい実施形態において、上記第２成分が、トロンビンをさらに含み得る。
【００２６】
好ましい実施形態において、上記第２成分が、必要に応じて、凍結防止剤をさらに含み得る。
【００２７】
好ましい実施形態において、上記凍結防止剤が、グリセロールであり得る。
【００２８】
好ましい実施形態において、上記第１成分が、フィブリノゲンを含み、そして上記第２成分が、約１×１０^３細胞／μｌ〜約５０×１０^３細胞／μｌおよびトロンビンを含み得る。
【００２９】
好ましい実施形態において、上記第２成分が、必要に応じて、凍結防止剤をさらに含み得る。
【００３０】
好ましい実施形態において、上記凍結防止剤が、１０％のグリセロール溶液、１５％のグリセロール溶液、および１５％のグリセロールと５％のヒト血清アルブミンとの溶液からなる群から選択され得る。
【００３１】
一つの局面において、本願発明は、組織再生のための細胞調製物を調製するために請求項１に記載のキットを使用する方法であって、上記方法は、以下：
ａ）処置の必要な患者の創傷部位に上記第１成分を投与する工程；および
ｂ）上記創傷部位において上記第２成分を上記第１成分と合わせる工程であって、上記第１成分と上記第２成分とを合わせることにより、組織再生に適した細胞調製物を形成する工程、
を包含する、方法を提供する。
【００３２】
好ましい実施形態において、上記細胞型が、分化した線維芽細胞およびケラチノサイトであり得る。
【００３３】
好ましい実施形態において、上記細胞調製物が、ペーストの形態であり得る。
【００３４】
好ましい実施形態において、上記生物学的に活性な分子が、少なくとも１つの脈管形成因子、少なくとも１つの増殖／サイトカイン因子、または少なくとも１つの脈管形成因子と少なくとも１つの増殖／サイトカイン因子との組み合わせであり得る。
【００３５】
好ましい実施形態において、上記細胞外マトリックスまたはマトリックス材料が、フィブリン、フィブリングルー、フィブリノゲン、フィブリンビーズ、および他の合成ポリマー材料もしくは合成ポリマー骨格材料または創傷包帯材料からなる群から選択され得る。
【００３６】
好ましい実施形態において、上記細胞型が、マイトマイシンＣまたは他の化学物質ベースの有糸分裂インヒビターの投与、γ線の照射、Ｘ線の照射、またはＵＶ光の照射により、有糸分裂が不活性にされ得る。
【００３７】
好ましい実施形態において、上記細胞型が、アデノウイルスＥ１Ａ遺伝子の１２Ｓ産物および１３Ｓ産物、ｈＴＥＲＴ、ＳＶ４０スモールＴ抗原、ＳＶ４０ラージＴ抗原、パピローマウイルスＥ６およびＥ７、エプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）、エプスタイン−バー核抗原−２（ＥＢＮＡ２）、ヒトＴ細胞白血病ウイルス−１（ＨＴＬＶ−１）、ＨＴＬＶ−１類、Ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓ　ｓａｉｍｉｒｉ（ＨＶＳ）、変異体ｐ５３、ｍｙｃ、ｃ−ｊｕｎ、ｃ−ｒａｓ、ｃ−Ｈａ−ｒａｓ、ｈ−ｒａｓ、ｖ−ｓｒｃ、ｃ−ｆｇｒ、ｍｙｂ、ｃ−ｍｙｃ、ｎ−ｍｙｃ、ならびにＭｄｍ２からなる群から選択される、少なくとも１つの遺伝子／ポリペプチドを使用して不死化され得る。
【００３８】
好ましい実施形態において、上記細胞型が、１つ以上の生物学的に活性な分子を天然で分泌し得る。
【００３９】
好ましい実施形態において、上記細胞型が、外因性レベルの、少なくとも１つの脈管形成因子、少なくとも１つの増殖／サイトカイン因子、または少なくとも１つの脈管形成因子と少なくとも１つの増殖／サイトカイン因子との組み合わせを分泌するように遺伝子操作され得る。
【００４０】
好ましい実施形態において、上記少なくとも１つの脈管形成因子、少なくとも１つの増殖／サイトカイン因子、または少なくとも１つの脈管形成増殖因子と少なくとも１つの増殖／サイトカイン因子との組み合わせの分泌が、遺伝子スイッチによって制御され得る。
【００４１】
好ましい実施形態において、上記少なくとも１つの脈管形成因子、少なくとも１つの増殖／サイトカイン因子、または少なくとも１つの脈管形成増殖因子と少なくとも１つの増殖／サイトカイン因子との組み合わせが、構成的に分泌され得る。
【００４２】
好ましい実施形態において、上記第１成分が、フィブリノゲンを含み、そして上記第２成分が、約１×１０^３細胞／μｌ〜約５０×１０^３細胞／μｌおよびトロンビンを含み得る。
【００４３】
好ましい実施形態において、上記第２成分が、必要に応じて、凍結防止剤をさらに含み得る。
【００４４】
好ましい実施形態において、上記凍結防止剤が、１０％のグリセロール溶液、１５％のグリセロール溶液、および１５％のグリセロールと５％のヒト血清アルブミンとの溶液からなる群から選択され得る。
【００４５】
好ましい実施形態において、上記第１成分および上記第２成分が、上記患者の創傷部位に局所的に投与され得る。
【００４６】
好ましい実施形態において、上記第１成分および上記第２成分が、上記患者の創傷部位上にスプレーされ得る。
【００４７】
好ましい実施形態において、上記第１成分および上記第２成分が、上記創傷部位上で合わされ得る。
【００４８】
好ましい実施形態において、上記第１成分および上記第２成分が、上記創傷部位に到達される前に合わされ得る。
【００４９】
一つの局面において、本願発明は、組織再生のための細胞調製物を処置の必要な患者の創傷部位に投与する方法であって、上記方法は、以下：
ａ）フィブリノゲンを含む細胞外マトリックスまたはマトリックス材料を含む第１成分を提供する工程；
ｂ）約１×１０^３細胞／μｌ〜約５０×１０^３細胞／μｌおよびトロンビンを含む第２成分を提供する工程であって、上記細胞が、１つ以上の生物学的に活性な分子を分泌し、同種異系で有糸分裂不活性であり、そして間質細胞、上皮／器官特異的細胞、および血液由来細胞からなる群からなる群から選択される、工程；
ｃ）上記第１成分と上記第２成分とを合わせることにより、組織再生に適した細胞調製物を形成する工程；ならびに
ｄ）上記細胞調製物を上記創傷部位に投与する工程、
を包含する、方法を提供する。
【００５０】
好ましい実施形態において、上記第１成分および上記第２成分が、上記創傷部に局所的に投与され得る。
【００５１】
好ましい実施形態において、上記第２成分が上記創傷部位に適用される前に、上記第１成分が、上記創傷部に適用され得る。
【００５２】
好ましい実施形態において、上記第１成分が、上記創傷部位に適用される前に、上記第２成分が、上記創傷部に適用され得る。
【００５３】
好ましい実施形態において、上記細胞が、分化したまたは分化していない、線維芽細胞およびケラチノサイトであり得る。
【００５４】
好ましい実施形態において、上記細胞調製物が、ペーストの形態であり得る。
【００５５】
好ましい実施形態において、上記生物学的に活性な分子が、少なくとも１つの脈管形成因子、少なくとも１つの増殖／サイトカイン因子、または少なくとも１つの脈管形成因子と少なくとも１つの増殖／サイトカイン因子との組み合わせであり得る。
【００５６】
好ましい実施形態において、上記細胞外マトリックスまたはマトリックス材料が、フィブリン、フィブリングルー、フィブリノゲン、フィブリンビーズ、および他の合成ポリマー材料もしくは合成ポリマー骨格材料または創傷包帯材料からなる群から選択され得る。
【００５７】
好ましい実施形態において、上記細胞型が、マイトマイシンＣまたは他の化学物質ベースの有糸分裂インヒビターの投与、γ線の照射、Ｘ線の照射、またはＵＶ光の照射により、有糸分裂が不活性にされ得る。
【００５８】
好ましい実施形態において、上記細胞型が、アデノウイルスＥ１Ａ遺伝子の１２Ｓ産物および１３Ｓ産物、ｈＴＥＲＴ、ＳＶ４０スモールＴ抗原、ＳＶ４０ラージＴ抗原、パピローマウイルスＥ６およびＥ７、エプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）、エプスタイン−バー核抗原−２（ＥＢＮＡ２）、ヒトＴ細胞白血病ウイルス−１（ＨＴＬＶ−１）、ＨＴＬＶ−１類、Ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓ　ｓａｉｍｉｒｉ（ＨＶＳ）、変異体ｐ５３、ｍｙｃ、ｃ−ｊｕｎ、ｃ−ｒａｓ、ｃ−Ｈａ−ｒａｓ、ｈ−ｒａｓ、ｖ−ｓｒｃ、ｃ−ｆｇｒ、ｍｙｂ、ｃ−ｍｙｃ、ｎ−ｍｙｃ、ならびにＭｄｍ２からなる群から選択される、少なくとも１つの遺伝子／ポリペプチドを使用して不死化され得る。
【００５９】
好ましい実施形態において、上記細胞型が、１つ以上の生物学的に活性な分子を天然で分泌し得る。
【００６０】
好ましい実施形態において、上記細胞型が、外因性レベルの、少なくとも１つの脈管形成因子、少なくとも１つの増殖／サイトカイン因子、または少なくとも１つの脈管形成因子と少なくとも１つの増殖／サイトカイン因子との組み合わせを分泌するように遺伝子操作され得る。
【００６１】
好ましい実施形態において、上記少なくとも１つの脈管形成因子、少なくとも１つの増殖／サイトカイン因子、または少なくとも１つの脈管形成増殖因子と少なくとも１つの増殖／サイトカイン因子との組み合わせの分泌が、遺伝子スイッチによって制御され得る。
【００６２】
好ましい実施形態において、上記少なくとも１つの脈管形成因子、少なくとも１つの増殖／サイトカイン因子、または少なくとも１つの脈管形成増殖因子と少なくとも１つの増殖／サイトカイン因子との組み合わせが、構成的に分泌され得る。
【００６３】
好ましい実施形態において、上記第２成分が、必要に応じて、凍結防止剤をさらに含み得る。
【００６４】
好ましい実施形態において、上記凍結防止剤が、１０％のグリセロール溶液、１５％のグリセロール溶液、および１５％のグリセロールと５％のヒト血清アルブミンとの溶液からなる群から選択され得る。
【００６５】
好ましい実施形態において、上記第１成分および上記第２成分が、上記創傷部位上にスプレーされ得る。
【００６６】
好ましい実施形態において、上記第２成分が上記創傷部上にスプレーされる前に、上記第１成分が、上記創傷部位に適用され得る。
【００６７】
好ましい実施形態において、上記スプレーされた第１成分および第２成分が、上記創傷部位上で合わされ得る。
【００６８】
好ましい実施形態において、上記スプレーされた第１成分および第２成分が、上記創傷部位に到達される前に合わされ得る。
【００６９】
一つの局面において、本願発明は、組織再生のための細胞調製物であって、以下：
ａ）混合されたフィブリノゲンを含む細胞外マトリックスまたはマトリックス材料を含む第１成分；ならびに
ｂ）創傷部位への約１×１０^３細胞／μｌ〜約５０×１０^３細胞／μｌおよびトロンビンを含む第２成分であって、上記細胞が、１つ以上の生物学的に活性な分子を分泌し、同種異系で、有糸分裂活性であるかまたは有糸分裂不活性であり、
そして間質細胞、上皮／器官特異的細胞、および血液由来細胞からなる群からなる群から選択される、第２成分、
を含む、細胞調製物を提供する。
【００７０】
好ましい実施形態において、上記細胞型が、分化した線維芽細胞およびケラチノサイトであり得る。
【００７１】
好ましい実施形態において、上記細胞調製物が、ペーストの形態であり得る。
【００７２】
好ましい実施形態において、上記生物学的に活性な分子が、少なくとも１つの脈管形成因子、少なくとも１つの増殖／サイトカイン因子、または少なくとも１つの脈管形成因子と少なくとも１つの増殖／サイトカイン因子との組み合わせであり得る。
【００７３】
好ましい実施形態において、上記細胞型が、マイトマイシンＣまたは他の化学物質ベースの有糸分裂インヒビターの投与、γ線の照射、Ｘ線の照射、またはＵＶ光の照射により、有糸分裂が不活性にされ得る。
【００７４】
好ましい実施形態において、上記細胞型が、アデノウイルスＥ１Ａ遺伝子の１２Ｓ産物および１３Ｓ産物、ｈＴＥＲＴ、ＳＶ４０スモールＴ抗原、ＳＶ４０ラージＴ抗原、パピローマウイルスＥ６およびＥ７、エプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）、エプスタイン−バー核抗原−２（ＥＢＮＡ２）、ヒトＴ細胞白血病ウイルス−１（ＨＴＬＶ−１）、ＨＴＬＶ−１類、Ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓ　ｓａｉｍｉｒｉ（ＨＶＳ）、変異体ｐ５３、ｍｙｃ、ｃ−ｊｕｎ、ｃ−ｒａｓ、ｃ−Ｈａ−ｒａｓ、ｈ−ｒａｓ、ｖ−ｓｒｃ、ｃ−ｆｇｒ、ｍｙｂ、ｃ−ｍｙｃ、ｎ−ｍｙｃ、ならびにＭｄｍ２からなる群から選択される、少なくとも１つの遺伝子／ポリペプチドを使用して不死化され得る。
【００７５】
好ましい実施形態において、上記細胞型が、１つ以上の生物学的に活性な分子を天然で分泌し得る。
【００７６】
好ましい実施形態において、上記細胞型が、外因性レベルの、少なくとも１つの脈管形成因子、少なくとも１つの増殖／サイトカイン因子、または少なくとも１つの脈管形成因子と少なくとも１つの増殖／サイトカイン因子との組み合わせを分泌するように遺伝子操作され得る。
【００７７】
好ましい実施形態において、上記少なくとも１つの脈管形成因子、少なくとも１つの増殖／サイトカイン因子、または少なくとも１つの脈管形成増殖因子と少なくとも１つの増殖／サイトカイン因子との組み合わせの分泌が、遺伝子スイッチによって制御され得る。
【００７８】
好ましい実施形態において、上記少なくとも１つの脈管形成因子、少なくとも１つの増殖／サイトカイン因子、または少なくとも１つの脈管形成増殖因子と少なくとも１つの増殖／サイトカイン因子との組み合わせが、構成的に分泌され得る。
【００７９】
好ましい実施形態において、上記第２成分が、必要に応じて、凍結防止剤をさらに含み得る。
【００８０】
好ましい実施形態において、上記凍結防止剤が、１０％のグリセロール溶液、１５％のグリセロール溶液、および１５％のグリセロールと５％のヒト血清アルブミンとの溶液からなる群から選択され得る。
【００８１】
好ましい実施形態において、上記方法は、以下：
ａ）上記第１成分を提供する工程；
ｂ）上記第２成分を提供する工程；
ｃ）組織再生に適した細胞調製物を形成するために、上記第１成分と上記第２成分とを合わせる工程；および
ｄ）上記細胞調製物を創傷部位に投与する工程、
を包含し得る。
【００８２】
好ましい実施形態において、上記細胞型が、分化した線維芽細胞およびケラチノサイトであり得る。
【００８３】
好ましい実施形態において、上記細胞調製物が、ペーストの形態であり得る。
【００８４】
好ましい実施形態において、上記生物学的に活性な分子が、少なくとも１つの脈管形成因子、少なくとも１つの増殖／サイトカイン因子、または少なくとも１つの脈管形成因子と少なくとも１つの増殖／サイトカイン因子との組み合わせであり得る。
【００８５】
好ましい実施形態において、上記細胞型が、マイトマイシンＣまたは他の化学物質ベースの有糸分裂インヒビターの投与、γ線の照射、Ｘ線の照射、またはＵＶ光の照射により、有糸分裂が不活性にされ得る。
【００８６】
好ましい実施形態において、上記細胞型が、アデノウイルスＥ１Ａ遺伝子の１２Ｓ産物および１３Ｓ産物、ｈＴＥＲＴ、ＳＶ４０スモールＴ抗原、ＳＶ４０ラージＴ抗原、パピローマウイルスＥ６およびＥ７、エプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）、エプスタイン−バー核抗原−２（ＥＢＮＡ２）、ヒトＴ細胞白血病ウイルス−１（ＨＴＬＶ−１）、ＨＴＬＶ−１類、Ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓ　ｓａｉｍｉｒｉ（ＨＶＳ）、変異体ｐ５３、ｍｙｃ、ｃ−ｊｕｎ、ｃ−ｒａｓ、ｃ−Ｈａ−ｒａｓ、ｈ−ｒａｓ、ｖ−ｓｒｃ、ｃ−ｆｇｒ、ｍｙｂ、ｃ−ｍｙｃ、ｎ−ｍｙｃ、ならびにＭｄｍ２からなる群から選択される、少なくとも１つの遺伝子／ポリペプチドを使用して不死化され得る。
【００８７】
好ましい実施形態において、上記細胞型が、１つ以上の生物学的に活性な分子を天然で分泌し得る。
【００８８】
好ましい実施形態において、上記細胞型が、外因性レベルの、少なくとも１つの脈管形成因子、少なくとも１つの増殖／サイトカイン因子、または少なくとも１つの脈管形成因子と少なくとも１つの増殖／サイトカイン因子との組み合わせを分泌するように遺伝子操作され得る。
【００８９】
好ましい実施形態において、上記少なくとも１つの脈管形成因子、少なくとも１つの増殖／サイトカイン因子、または少なくとも１つの脈管形成増殖因子と少なくとも１つの増殖／サイトカイン因子との組み合わせの分泌が、遺伝子スイッチによって制御され得る。
【００９０】
好ましい実施形態において、上記少なくとも１つの脈管形成因子、少なくとも１つの増殖／サイトカイン因子、または少なくとも１つの脈管形成増殖因子と少なくとも１つの増殖／サイトカイン因子との組み合わせが、構成的に分泌され得る。
【００９１】
好ましい実施形態において、上記第２成分が、必要に応じて、凍結防止剤をさらに含み得る。
【００９２】
好ましい実施形態において、上記凍結防止剤が、１０％のグリセロール溶液、１５％のグリセロール溶液、および１５％のグリセロールと５％のヒト血清アルブミンとの溶液からなる群から選択され得る。
【００９３】
好ましい実施形態において、上記第１成分および上記第２成分が、上記患者の創傷部位に局所的に投与され得る。
【００９４】
好ましい実施形態において、上記第１成分および上記第２成分が、上記患者の創傷部位上にスプレーされ得る。
【００９５】
好ましい実施形態において、上記第１成分および上記第２成分が、上記創傷部位上で合わされ得る。
【００９６】
好ましい実施形態において、上記第１成分および上記第２成分が、上記創傷部位に到達される前に合わされ得る。
【００９７】
好ましい実施形態において、上記第１成分および上記第２成分が、出荷される前に凍結保存され、そして続いて使用前に解凍され得る。
【００９８】
好ましい実施形態において、上記第１成分および上記第２成分が、取り外し可能なねじ口を有する別個のバイアルに各々含まれ、上記バイアルは、滅菌されそして低温に耐える材料から作製され、そして取り外し可能な蓋は、スプレーポンプと交換され、続いて使用前に上記第１成分および第２成分が解凍され得る。
【００９９】
好ましい実施形態において、上記スプレーポンプが、１回のスプレーに付き約１３０μｌの容積を送達し得る。
【０１００】
好ましい実施形態において、上記低温に耐える材料が、ガラス、ポリプロピレン、ポリエチレン、およびエチレンビニルアセテート（ＥＶＡ）からなる群から選択され得る。
【０１０１】
好ましい実施形態において、上記バイアルが、凍結保存前にポーチまたは容器内に密封され、上記ポーチまたは容器は、−８０℃〜−１９６℃の範囲の温度に耐え得る材料から製造され、そして上記ポーチまたは容器は、凍結保存および続く解凍の間、上記第１成分および上記第２成分を汚染から保護し得る。
【０１０２】
好ましい実施形態において、上記ポーチまたは容器が、防水性であり、そして高バリア性能を有し得る。
【０１０３】
本発明は、皮膚または他の組織における創傷または欠損に一時的に適用されるべき（マトリックス材料または合成生体適合性物質と、混合されているかまたは組み合わされている）非カプセル化調製物においてヒト細胞により発現される脈管形成因子もしくは他の増殖因子またはサイトカインを、結合組織に供給する血液を回復して器官特異的細胞が器官の完全性を再確立しそして過度の瘢痕形成を阻害するのを可能にするために、使用することに関する。
【０１０４】
１つの局面において、本発明は、組織再生のために有用な、例えば、皮膚創傷処置における使用のための、細胞調製物を包含する。この細胞調製物は、１つ以上の生物学的活性物質を分泌する１つ以上の細胞型を含み、この１つ以上の細胞型は、細胞外マトリックスまたはマトリックス材料と混合されているかまたは細胞外マトリックスまたはマトリックス材料に適用されており、その結果この混合物が、粘凋性細胞調製物または凍結乾燥細胞調製物を形成するようになっている。本明細書中で使用される場合、用語「混合（された）」とは、当業者に公知である、任意の組合せ方法、混合（ｍｉｘｉｎｇ）方法、混和（ｂｌｅｎｄｉｎｇ）方法、結合（ｊｏｉｎｉｎｇ）方法などを包含する。本発明の細胞調製物において使用される細胞型は、同種異系であり、必要に応じて、有糸分裂が不活化されており、そして、間質細胞、上皮細胞、または器官特異的細胞、または血液由来細胞から選択される。例えば、その細胞型は、分化した線維芽細胞およびケラチノサイトであり得る。他の実施形態において、その細胞型は、線維芽細胞、ケラチノサイト（外毛根鞘細胞を含む）、メラノサイト、内皮細胞、周皮細胞、単球、リンパ球（形質細胞を含む）、血小板、マスト細胞、脂肪細胞、筋細胞、肝細胞、ニューロン、神経細胞、神経膠細胞、骨細胞、破骨細胞、角膜上皮細胞、軟骨細胞、および／または成体幹細胞、胚性幹細胞からなる群より選択され得る。
【０１０５】
結合組織の主要な細胞型は、線維芽細胞である。最近まで、線維芽細胞は、均質な分化していない細胞集団と同様に扱われてきた。しかし、種々の種（ヒトを含む）における線維芽細胞系は、その線維芽細胞が７つの段階（３つの段階は、有糸分裂細胞を含み、そして４つの段階は、有糸分裂後の細胞を含む）に沿って最終分化する、幹細胞系である。Ｂａｙｒｅｕｔｈｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８５：５１１２〜１６（１９８８）；Ｂａｙｒｅｕｔｈｅｒら、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｓｃｉ．Ｓｕｐｐｌ．１０：１１５〜３０（１９８８）を参照のこと。線維芽細胞の分化のインビトロでの誘導は、化学物質または生物学的物質（例えば、マイトマイシンＣ（Ｂｒｅｎｎｅｉｓｅｎら、Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ．Ｒｅｓ．２１１：２１９〜３０（１９９４））または増殖因子またはサイトカイン（Ｈａｋｅｎｊｏｓら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｒａｄｉａｔ．Ｂｉｏｌ．７６：５０３〜０９（２０００））（例えば、ＴＧＦβ１、ＩＬ−１、ＩＬ−６、インターフェロンα））Ｂｉｏｌ．７６ＳＡによって実施され得る。インビトロでの誘導はまた、例えば、γ線；Ｘ線（Ｂｕｍａｎｎら、Ｓｔｒａｈｌｅｎｔｈｅｒ．Ｏｎｋｏｌ．１７１：３５〜４１（１９９５））；ＵＶ光（Ｒｏｄｅｍａｎｎら、Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ．Ｒｅｓ．１８０：８４〜９３（１９８９））による照射によってか、または電磁場（Ｔｈｕｍｍら、Ｒａｄｉａｔ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．３８：１９５〜９９（１９９９））への物理的曝露によって、達成され得る。さらに、分化の誘導はまた、培養条件（例えば、血清飢餓、接触阻害、またはマイトマイシンＣの添加）によって達成され得る。Ｐａｌｋａら、Ｆｏｌｉａ　Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．Ｃｙｔｏｂｉｏｌ．３４：１２１〜２７（１９９６）を参照のこと。
【０１０６】
今日まで、分化した線維芽細胞の機能特性／生物学的特性は、不十分にしか研究されていない。しかし、ポリペプチドの発現および分泌のパターンは、有糸分裂期から有糸分裂後期までに変化する。個々のポリペプチドは、なお分析されている。例えば、Ｆｒａｎｃｚ、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．６０：３３７〜４５（１９９３）を参照のこと。
【０１０７】
いくつかの実施形態において、その生物学的に活性な分子は、少なくとも１つの脈管形成因子、少なくとも１つの増殖因子／サイトカイン因子、または少なくとも１つの脈管形成因子と少なくとも１つの増殖因子／サイトカイン因子との組合せである。適切な生物学的に活性な分子の例としては、上皮増殖因子−増殖因子ファミリー（ＥＧＦ）；トランスフォーミング増殖因子α（ＴＧＦα）；肝細胞増殖因子（ＨＧＦ／ＳＦ）；ヘパリン結合上皮増殖因子（ＥＧＦ）；塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）；酸性線維芽細胞増殖因子（ａＦＧＦ）；他の線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）；ケラチノサイト増殖因子（ＫＧＦ）；トランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）β１およびトランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）β２；トランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）β３；血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）；血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）；腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）；インターロイキン−１（ＩＬ−１）およびインターロイキン−６（ＩＬ−６）；他のインターロイキン／サイトカインファミリーのメンバー；インスリン様増殖因子Ｉ（ＩＧＦ−１）；コロニー刺激因子１（ＣＳＦ−１）；および顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）が挙げられるが、これらに限定されない。当業者は、本発明の方法および組成物において、さらなる生物学的に活性な分子もまた使用され得ることを、認識する。
【０１０８】
種々の実施形態において、使用される細胞外マトリックスまたはマトリックス材料は、コラーゲン、アルギン酸塩、アルギン酸塩ビーズ、アガロース、フィブリン、フィブリングルー、フィブリノゲン、血漿フィブリンビーズ、血漿全体もしくは血漿成分、ラミニン、フィブロネクチン、プロテオグリカン、ＨＳＰ、キトサン、ヘパリン、および／または、細胞を保持し得るかもしくは細胞に付着し得る、他の合成ポリマーもしくはポリマー骨格、ならびに固体支持材料（例えば、創傷包帯）。好ましい実施形態において、その細胞外マトリックスまたはマトリックス材料は、フィブリン、フィブリングルー、フィブリノゲン、フィブリンビーズ、および他の合成ポリマー、合成ポリマー骨格、創傷包帯材料からなる群より選択される。
【０１０９】
さらなる実施形態において、その細胞型は、有糸分裂が不活化されており、例えば、種々の分化段階に誘導されている。例えば、この有糸分裂不活化は、マイトマイシンＣまたは他の化学物質ベースの有糸分裂インヒビターの投与、γ線による照射、Ｘ線による照射、および／またはＵＶ光による照射によって、達成され得る。
【０１１０】
別の実施形態において、その細胞型は、少なくとも１つの遺伝子／ポリペプチドを使用して不死化され、この少なくとも１つの遺伝子／ポリペプチドは、アデノウイルスＥ１Ａ遺伝子の１２Ｓ産物および１３Ｓ産物、ｈＴＥＲＴ、ＳＶ４０スモールＴ抗原、ＳＶ４０ラージＴ抗原、パピローマウイルスＥ６およびＥ７、エプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）、エプスタイン−バー核抗原２（ＥＢＮＡ２）、ヒトＴ細胞白血病ウイルス１（ＨＴＬＶ−１）、ＨＴＬＶ−１　ｔａｘ、Ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓ　ｓａｉｍｉｒｉ（ＨＶＳ）、変異体ｐ５３、ｍｙｃ、ｃ−ｊｕｎ、ｃ−ｒａｓ、ｃ−Ｈａ−ｒａｓ、ｈ−ｒａｓ、ｖ−ｓｒｃ、ｃ−ｆｇｒ、ｍｙｂ、ｃ−ｍｙｃ、ｎ−ｍｙｃ、およびＭｄｍ２からなる群より選択される。
【０１１１】
なおさらなる実施形態において、その細胞型は、１つ以上の生物学的に活性な分子（例えば、少なくとも１つの脈管形成因子、少なくとも１つの増殖因子／サイトカイン因子、または少なくとも１つの脈管形成因子と少なくとも１つの増殖因子／サイトカイン因子との組合せを分泌するように、遺伝子操作される。この分泌は、構成的であってもよいし、またはこの分泌は、遺伝子スイッチにより制御されてもよい。
【０１１２】
種々の他の実施形態において、本発明はまた、創傷処置が必要な患者の創傷部位に、本発明に従う細胞調製物を投与することによって、組織の欠損または創傷を処置する方法を提供する。本発明の細胞調製物は、周囲の組織との生物学的相互作用によって組織の再生を一時的に誘導するように、患者の創傷部位に局所（すなわち、ペーストとして）投与され得る。あるいは、本発明の細胞調製物は、周囲の組織との生物学的相互作用によって組織の再生を一時的に誘導するように、患者の創傷部位上にその成分を噴霧することによって、投与され得る。この噴霧される細胞調製物は、その創傷部位上でマトリックスの形成をもたらし得る。
【０１１３】
別の局面において、本発明は、１つ以上の生物学的に活性な分子を分泌する１つ以上の細胞型を、トロンビンと混合されて含む、第１組成物を提供することによって、組織再生のための細胞調製物を製造する方法を包含し、ここで、この細胞型は、同種異系であり、必要に応じて、有糸分裂が不活化されており、そして、間質細胞、上皮特異的細胞／器官特異的細胞、および血液由来細胞からなる群より選択される。その後、この第１組成物は、フィブリノゲンを含む細胞外マトリックスまたはマトリックス材料を含む、第２組成物と組み合わされ、ここで、この第１組成物と第２組成物との組合せは、組織再生に適した粘凋性細胞ペーストを形成する。この細胞調製物において使用される細胞型は、上記の１つ以上の生物学的に活性な分子を天然で分泌し得るか、またはこの細胞型は、上記の１つ以上の生物学的に活性な分子を天然で分泌するように遺伝子操作され得る。
【０１１４】
種々の実施形態において、これらの細胞型は、分化した線維芽細胞およびケラチノサイトであり、この生物学的に活性な分子は、少なくとも１つの脈管形成因子、少なくとも１つの増殖因子／サイトカイン因子、または少なくとも１つの脈管形成因子と少なくとも１つの増殖因子／サイトカイン因子との組合せである。他の実施形態において、この細胞型は、マイトマイシンＣまたは他の化学物質ベースの有糸分裂インヒビターの投与、γ線による照射、Ｘ線による照射、またはＵＶ光による照射によって、有糸分裂が不活化され得る。
【０１１５】
他の実施形態において、その細胞型は、少なくとも１つの遺伝子／ポリペプチドを使用して不死化され、この少なくとも１つの遺伝子／ポリペプチドは、アデノウイルスＥ１Ａ遺伝子の１２Ｓ産物および１３Ｓ産物、ｈＴＥＲＴ、ＳＶ４０スモールＴ抗原、ＳＶ４０ラージＴ抗原、パピローマウイルスＥ６およびＥ７、エプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）、エプスタイン−バー核抗原２（ＥＢＮＡ２）、ヒトＴ細胞白血病ウイルス１（ＨＴＬＶ−１）、ＨＴＬＶ−１　ｔａｘ、Ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓ　ｓａｉｍｉｒｉ（ＨＶＳ）、変異体ｐ５３、ｍｙｃ、ｃ−ｊｕｎ、ｃ−ｒａｓ、ｃ−Ｈａ−ｒａｓ、ｈ−ｒａｓ、ｖ−ｓｒｃ、ｃ−ｆｇｒ、ｍｙｂ、ｃ−ｍｙｃ、ｎ−ｍｙｃ、およびＭｄｍ２からなる群より選択される。
【０１１６】
別の局面において、本発明は、組織再生のための細胞調製物の調製のためのキットを提供する。このキットは、細胞外マトリックスまたはマトリックス材料を含む、第１成分と、１つ以上の細胞型を含む第２成分と、を含み、この１つ以上の細胞型は、少なくとも１つの脈管形成因子、少なくとも１つの増殖因子／サイトカイン因子、または少なくとも１つの脈管形成因子と少なくとも１つの増殖因子／サイトカイン因子との組合せのような、生物学的に活性な分子を分泌する。これらの細胞型は、同種異系であり、有糸分裂活性であるかまたは有糸分裂が不活化されており、そして、間質細胞、上皮特異的細胞／器官特異的細胞、および血液由来細胞からなる群より選択される。例えば、これらの細胞型は、分化した線維芽細胞およびケラチノサイトであり得る。生じる細胞調製物は、ペーストの形態であり得る。種々の実施形態において、この細胞外マトリックスまたはマトリックス材料は、フィブリン、フィブリングルー、フィブリノゲン、フィブリンビーズ、および他の合成ポリマーもしくはポリマー骨格または創傷包帯材料であり得る。
【０１１７】
その細胞の有糸分裂不活化は、マイトマイシンＣまたは他の化学物質ベースの有糸分裂インヒビターの投与、γ線による照射、Ｘ線による照射、またはＵＶ光による照射によって、達成され得る。種々の局面において、その細胞型は、以下のうちの少なくとも１つを使用して不死化される：アデノウイルスＥ１Ａ遺伝子の１２Ｓ産物および１３Ｓ産物、ｈＴＥＲＴ、ＳＶ４０スモールＴ抗原、ＳＶ４０ラージＴ抗原、パピローマウイルスＥ６およびＥ７、エプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）、エプスタイン−バー核抗原２（ＥＢＮＡ２）、ヒトＴ細胞白血病ウイルス１（ＨＴＬＶ−１）、ＨＴＬＶ−１　ｔａｘ、Ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓ　ｓａｉｍｉｒｉ（ＨＶＳ）、変異体ｐ５３、ｍｙｃ、ｃ−ｊｕｎ、ｃ−ｒａｓ、ｃ−Ｈａ−ｒａｓ、ｈ−ｒａｓ、ｖ−ｓｒｃ、ｃ−ｆｇｒ、ｍｙｂ、ｃ−ｍｙｃ、ｎ−ｍｙｃ、およびＭｄｍ２。
【０１１８】
その細胞型は、上記の１つ以上の生物学的に活性な分子を天然で分泌し得るか、またはこの細胞型は、外因性レベルの、上記の１つ以上の生物学的に活性な分子を分泌するように遺伝子操作され得る。この分泌は、遺伝子スイッチにより制御されてもよいし、またはこの分泌は、構成的であってもよい。１つの実施形態において、その第１成分は、フィブリノゲンを含む。別の実施形態において、その第１成分は、フィブリノゲンを含み、そしてその第２成分は、約１×１０^３細胞／μｌ〜約５０×１０^３細胞／μｌを含む。この第２成分はまた、トロンビンを含み、そして必要に応じて、凍結防止剤（例えば、１０％グリセロール溶液、１５％グリセロール溶液、ならびに１５％グルセロールおよび５％ヒト血清アルブミン溶液）を含み得る。
【０１１９】
別の局面において、本発明は、組織再生のための細胞調製物を調製するために、本発明のキットを使用するための方法を提供する。この方法は、処置が必要な患者の創傷部位に、第１成分を投与する工程、およびその創傷部位上の第１成分と第２成分を組み合わせる工程を包含し、この第１成分と第２成分との組合せは、組織再生に適した細胞調製物を形成する。１つの実施形態において、この第１成分および第２成分は、患者の創傷部位に局所投与される。別の実施形態において、この第１成分および第２成分は、その創傷部位に噴霧される。これらの成分は、創傷上でそれらの成分が組み合わされるようにか、または創傷に達する前に空中でそれらの成分が組み合わされるように、噴霧され得る。
【０１２０】
なお別の局面において、本発明は、処置が必要な患者の創傷部位に、組織再生のための細胞調製物を投与する方法を提供する。この方法は、フィブリノゲンを含む細胞外マトリックスまたはマトリックス材料を含む、第１成分を提供する工程；約１×１０^３細胞／μｌ〜約５０×１０^３細胞／μｌとトロンビンとを含む、第２成分を提供する工程；組織再生に適した細胞調製物を形成するように、この第１成分と第２成分とを組み合わせる工程；およびこの細胞調製物を創傷部位に投与する工程を包含し、この細胞は、１つ以上の生物学的に活性な分子を分泌し、同種異系であり、有糸分裂活性であるかまたは有糸分裂が不活化されており、そして、間質細胞、上皮特異的細胞／器官特異的細胞、および血液由来細胞からなる群より選択される。
【０１２１】
１つの実施形態では、第１成分および第２成分は、創傷部位に局所塗布される。第１成分は、第２成分が適用される前または後に創傷部位に塗布される。別の実施形態では、第１成分および第２成分は、創傷部位に噴霧される。好ましくは、第１成分は、第２成分が創傷部位に噴霧される前に創傷部位に噴霧される。第１成分および第２成分は、創傷部位で組合わされ得るか、またはこれらは創傷部位に到達する前に組合わされ得る。
【０１２２】
これらの細胞型は、分化しているかまたは分化していない、線維芽細胞およびケラチノサイトであり得る。得られた細胞調製物は、パスタ剤の形態であり得る。種々の実施形態では、細胞外マトリクスまたはマトリクス材料は、フィブリン、フィブリングルー、フィブリノゲン、フィブリンビーズ、ならびに他の合成ポリマーもしくはポリマー足場または創傷包帯材料であり得る。細胞の有糸分裂不活化は、マイトマイシンＣもしくは他の化学物質ベースの有糸分裂インヒビターの投与、γ線照射、Ｘ線照射、またはＵＶ光照射によって、達成され得る。種々の実施形態では、細胞型は、以下のうちの少なくとも１つを用いて不死化される：アデノウイルスＥ１Ａ遺伝子の１２Ｓ産物および１３Ｓ産物、ｈＴＥＲＴ、ＳＶ４０スモールＴ抗原、ＳＶ４０ラージＴ抗原、パピローマウイルスのＥ６およびＥ７、エプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）、エプスタインバー核抗原−２（ＥＢＮＡ２）、ヒトＴ細胞白血病ウイルス−１（ＨＴＬＶ−１）、ＨＴＬＶ−１ｔａｘ、Ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓ　ｓａｉｍｉｒｉ（ＨＶＳ）、変異体ｐ５３、ｍｙｃ、ｃ−ｊｕｎ、ｃ−ｒａｓ、ｃ−Ｈａ−ｒａｓ、ｈ−ｒａｓ、ｖ−ｓｒｃ、ｃ−ｆｇｒ、ｍｙｂ、ｃ−ｍｙｃ、ｎ−ｍｙｃおよびＭｄｍ２。
【０１２３】
細胞型は、上記の１以上の生物学的に活性な分子を天然で分泌してもよく、またはこれらは遺伝子操作されて外因性レベルの上記の１以上の生物学的に活性な分子を分泌してもよい。分泌は、遺伝子スイッチによって制御されてもよく、または構成的であってもよい。１つの実施形態では、第２成分は、必要に応じて、凍結防止剤を含み得る。凍結防止剤としては、１０％グリセロール溶液、１５％グリセロール溶液ならびに１５％グリセロールおよび５％ヒト血清アルブミンの溶液が挙げられるがこれらに限定されない。
【０１２４】
別の局面では、本発明は、組織再生のための細胞調製物を含み、この細胞調製物は、細胞外マトリクスまたはマトリクス材料を含み、この細胞外マトリクスまたはマトリクス材料は、第２成分と混合されたフィブリノゲンを含み、この第２成分は、約１×１０^３細胞／μｌ〜約５０×１０^３細胞／μｌおよびトロンビンを含み、ここで、１以上の生物学的に活性な分子（例えば、少なくとも１つの脈管形成因子、少なくとも１つの増殖因子／サイトカイン因子、またはそれらの組み合わせ）を分泌する細胞は、同種異系であり、有糸分裂が不活化されており、そして間質細胞、上皮特異的細胞／器官特異的細胞および血液由来細胞からなる群より選択される。
【０１２５】
これらの細胞型は、分化した、線維芽細胞およびケラチノサイトであり得る。得られる細胞調製物は、パスタ剤の形態であり得る。種々の実施形態では、細胞外マトリクスまたはマトリクス材料は、フィブリン、フィブリングルー、フィブリノゲン、フィブリンビーズおよび他の合成ポリマーもしくはポリマー足場または創傷包帯材料であり得る。細胞の有糸分裂不活化は、マイトマイシンＣまたは他の化学物質ベースの有糸分裂インヒビターの投与、γ線照射、Ｘ線照射またはＵＶ光照射によって、達成され得る。種々の実施形態では、細胞型は、以下のうちの少なくとも１つを用いて不死化される：アデノウイルスＥ１Ａ遺伝子の１２Ｓ産物および１３Ｓ産物、ｈＴＥＲＴ、ＳＶ４０スモールＴ抗原、ＳＶ４０ラージＴ抗原、パピローマウイルスのＥ６およびＥ７、エプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）、エプスタインバー核抗原−２（ＥＢＮＡ２）、ヒトＴ細胞白血病ウイルス−１（ＨＴＬＶ−１）、ＨＴＬＶ−１　ｔａｘ、Ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓ　ｓａｉｍｉｒｉ（ＨＶＳ）、変異体ｐ５３、ｍｙｃ、ｃ−ｊｕｎ、ｃ−ｒａｓ、ｃ−Ｈａ−ｒａｓ、ｈ−ｒａｓ、ｖ−ｓｒｃ、ｃ−ｆｇｒ、ｍｙｂ、ｃ−ｍｙｃ、ｎ−ｍｙｃおよびＭｄｍ２。
【０１２６】
細胞型は、上記の１以上の生物学的に活性な分子を天然で分泌してもよく、またはこれらは遺伝子操作されて外因性レベルの上記の１以上の生物学的に活性な分子を分泌してもよい。分泌は、遺伝子スイッチによって制御されてもよく、または構成的であってもよい。１つの実施形態では、第２成分は、必要に応じて、凍結防止剤を含み得る。凍結防止剤としては、１０％グリセロール溶液、１５％グリセロール溶液ならびに１５％グリセロールおよび５％ヒト血清アルブミンの溶液が挙げられるがこれらに限定されない。
【０１２７】
本発明はまた、第１成分および第２成分を提供し、第１成分と第２成分とを組み合わせ、そして得られる細胞調製物を創傷部位に投与することによって、このような細胞調製物を用いる方法を提供する。種々の実施形態では、成分は、患者の創傷部位に局所投与されてもよく、またはこれらは創傷部位に噴霧されてもよい。噴霧投与される場合、第１成分および第２成分は、創傷部位で組合わされてもよく、またはこれらは創傷部位に到達する前に組合わされてもよい。
【０１２８】
別の局面では、本発明のキットの第１成分および第２成分は、輸送の前に低温保存され、続いて使用の前に解凍される。各成分は、取り外し可能なスクリューキャップを有する別々のバイアル中に含まれ得、ここで、このバイアルは無菌であり、そして低温に耐える材料から製造されており、そしてここで、この取り外し可能な蓋は、第１成分および第２成分の解凍後、使用前に、スプレーポンプで交換され得る。１つの実施形態では、スプレーポンプは、１回の噴霧あたり約１３０μｌという容積を送達する。低温に耐える適切な材料としては、ガラス、ポリプロピレン、ポリエチレンおよびエチレン−酢酸ビニル（ＥＶＡ）が挙げられるがこれらに限定されない。いくつかの実施形態では、各バイアルは、約０．８ｍｍ壁厚を有し得、そして約２ｍｌの第１成分および第２成分の作業容積を保持し得る。別の実施形態では、このバイアルは、低温保存の前にパウチまたは容器内にシールされ、ここで、このパウチまたは容器は、−８０℃〜−１６０℃の範囲にわたる温度に耐え得る材料から製造され、ここで、このパウチまたは容器は、第１成分および第２成分が低温保存、保存およびその後の解凍の間に夾雑するのを防ぐ。好ましくは、このパウチは防水性であり、そして高バリア性能を有する。
【０１２９】
他に定義しない限り、本明細書中で使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されている意味と同じ意味を有する。本明細書中に記載される方法および材料と類似しているかまたは等価な方法および材料は、本発明の実施または試験において用いられ得るが、適切な方法および材料は以下に記載される。本明細書中で言及される全ての刊行物、特許出願、特許および他の参考文献は、その全体が本明細書中に参考として援用される。矛盾する場合には、定義を含めた本明細書が支配する。さらに、材料、方法および例は、単なる例示であり、限定することは意図しない。
【０１３０】
本発明の他の特徴および利点は、以下の詳細な説明および特許請求の範囲から明らかである。
【０１３１】
【発明の実施の形態】
創傷治癒は、可溶性メディエーター、血球、細胞外マトリクスおよび実質細胞を含む複雑なプロセスである。創傷治癒は、以下の３つの期を有する：炎症期、組織形成期および組織再構築期。これらの期は、時間的に重複し得る。
【０１３２】
一般に、組織への損傷は、血管を破壊し、そして血液構成要素の血管外滲出をもたらす。血液凝固は、止血を再度確立するのを助け、そして創傷への細胞移動のための仮の細胞外マトリクスを提供する。創傷部位では、血小板（ｐｌａｔｅｌｅｔ）（ｔｈｒｏｍｂｏｃｙｔｅ）は、止血栓の形成を促進し、そしてまた、創傷治癒プロセスのいくつかのメディエーターを分泌する。これらのメディエーターとしては、例えば、単球および線維芽細胞を誘引して活性化する分子（例えば、血小板由来増殖因子）が挙げられる。
【０１３３】
損傷後すぐに、好中球は、創傷に浸潤し、そして創傷から外来粒子および細菌を除去する。次いで、好中球は、焼痂とともに排出されるかまたはマクロファージによって食作用を受ける。単球はまた、特異的化学誘引物質（例えば、細胞外マトリクスタンパク質のフラグメント、トランスフォーミング増殖因子β、単球化学誘引物質タンパク質１）に応じて創傷を浸潤し、続いて、活性化マクロファージとなる。これらの活性化マクロファージは、増殖因子（例えば、血小板由来増殖因子および血管内皮増殖因子）を放出し、この増殖因子は、肉芽組織の形成を開始する。マクロファージは、それらのインテグリンレセプターを介して、細胞外マトリクス中のタンパク質に結合する。この結合は、任意の微生物ならびに細胞外マトリクスのフラグメントのマクロファージ食作用を刺激する。
【０１３４】
細胞外マトリクスへの接着によって刺激された単球はまた、炎症マクロファージへと変形する。細胞外マトリクスへのこの接着は、単球およびマクロファージがコロニー刺激因子１、腫瘍壊死因子βおよび血小板由来増殖因子を発現することを誘導する。単球およびマクロファージによって発現される他の重要なサイトカインは、トランスフォーミング増殖因子α、インターロイキン−１、トランスフォーミング増殖因子β１〜３、およびインスリン様増殖因子１である。単球由来増殖因子およびマクロファージ由来増殖因子は、創傷における新たな組織形成の開始および増殖に必要であると考えられる。
【０１３５】
損傷後数時間以内に、創傷の再上皮化が始まる。創傷の縁部ならびに残りの皮膚付属器（例えば、毛包）由来のケラチノサイトは、表現型の顕著な変化（細胞内トノフィラメントの退縮、大部分の細胞間接着斑の解離、および末梢細胞質アクチンフィラメントの形成を含む）を生じる。さらに、ケラチノサイトと上皮基底膜との間の半接着斑結合は解離して、ケラチノサイトの移動を可能にする。
【０１３６】
損傷後数日以内に、創傷の縁部のケラチノサイトは、移動する細胞の後ろで増殖し始める。この再上皮化が生じるにつれ、基底膜タンパク質は、規則正しい順番で、創傷の縁部から外側へ再出現する。次いで、ケラチノサイトは、それらの正常な表現型に戻り、そしてこれら自体が、再確立された基底膜およびその下の真皮に結合する。
【０１３７】
損傷後約４日間以内に、新たな間質は、創傷を浸潤し始める。同時に、マクロファージ、線維芽細胞および血管もまた、創傷を浸潤する。マクロファージは、線維増殖および新脈管形成（ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ）を刺激する増殖因子の供給源を提供する。この線維芽細胞は、細胞の内増殖（ｉｎ−ｇｒｏｗｔｈ）を支持する新たな細胞外マトリクスを生成する。この新たな血管は、細胞を維持する酸素および栄養素を運搬する。
【０１３８】
増殖因子（特に、血小板由来増殖因子およびトランスフォーミング増殖因子β１）は、創傷の周囲の組織の線維芽細胞が増殖するのを刺激すると考えられる。実際、血小板由来増殖因子は、慢性褥瘡および糖尿病性潰瘍の治癒を加速することが示されている。塩基性線維芽細胞増殖因子はまた、慢性褥瘡を処置するためにいくらか成功して使用されている。
【０１３９】
しかし、異常な創傷治癒をもたらし得る多くの因子が存在する。１つの例は、糖尿病性潰瘍に伴って生じる。代表的に、糖尿病性潰瘍は、損なわれた治癒をもたらし得る、複数の生化学的病理を示す。これらの潰瘍は、いくつかの型の糖尿病性ニューロパシーに起因して、皮膚の圧力を知覚および軽減できない患者において生じる。頻繁に、糖尿病性潰瘍は、顆粒球の損なわれた機能および走化性に起因して、感染状態になる。糖尿病性潰瘍を有する患者はまた、炎症、損なわれた新生血管形成、減少したコラーゲン合成、増加したレベルのプロテイナーゼおよび欠損したマクロファージ機能を経験する。
【０１４０】
創傷治癒を加速するための、単離された（例えば、組換え体の）増殖因子および他のメディエーターを用いた全体的な臨床経験は、大きな成功はしていない。これはおそらく、創傷修復が、可溶性因子、形成された血液要素、細胞外マトリクスおよび細胞の間の相互作用の複雑なセットの結果であることによる。種々の増殖因子を、注意深く制御された間隔で組み合わせることによって、より有効な創傷治癒を促進し得る。
【０１４１】
本発明は、合成または天然のいずれかの細胞外マトリクス（「ＥＣＭ」）と混合されて、創傷治癒の間の組織肉芽化を改善するために用いられ得る細胞調製物を形成する、間質細胞、上皮細胞および血液由来細胞（線維芽細胞、ケラチノサイト（毛嚢外毛根鞘（ｆｏｌｌｉｃｕｌａｒ　ｏｕｔｅｒ　ｒｏｏｔ　ｓｈｅａｔｈ）細胞を含む）、内皮細胞、周皮細胞、単球、リンパ球（形質細胞を含む）、血小板、マスト細胞、脂肪細胞、筋細胞、肝細胞、神経細胞および神経膠細胞、骨細胞、骨芽細胞、角膜上皮細胞および軟骨細胞を含むがこれらに限定されない）を提供する。１つの実施形態では、細胞は、内因性脈管形成因子または他の増殖因子を送達し得る。別の実施形態では、細胞は、遺伝子操作されて外因性量の所望の因子を生成し得る。好ましくは、この細胞は、同種異系である。本発明の方法および調製物において用いられる細胞が、生細胞、有糸分裂が不活化された細胞、有糸分裂が活性化された細胞、代謝的に不活性な細胞、凍結された細胞および／または非生存細胞を含み得るがこれらに限定されないことを、当業者は、認識する。
【０１４２】
特に、線維芽細胞およびケラチノサイトは、皮膚の創傷治癒において重要な役割を果たすことが示されている。これらの役割としては、細胞の移動および増殖の刺激、細胞外マトリクス生成の刺激、増殖因子およびサイトカインの生成、新脈管形成の刺激、ならびに生存能力のない組織およびフィブリンバリアを溶解するプロテアーゼの放出が挙げられる。
【０１４３】
創傷治癒は、増殖因子および／または脈管形成因子の使用によって促進され得る。例えば、１つの適切な創傷治癒調製物は、２つの低温保存された成分（すなわち、フィブリノゲン、ならびにトロンビン中に懸濁した、増殖が休止した同種異系ヒト線維芽細胞およびケラチノサイト）からなる。解凍後、これらの成分は、創傷床に順次噴霧されて、生存しているが増殖していない、２つの型の皮膚由来細胞を含む薄いフィブリンマトリクスを形成し、これは、数日間にわたって、創傷治癒に関する増殖因子および脈管形成因子（例えば、ＶＥＧＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ｂＦＧＦ、ＫＧＦ）を相互作用的に生成する。
【０１４４】
細胞は、不死化されたかまたは初代かのいずれかの細胞培養物であり得る。細胞は、当業者に公知の任意の方法によって不死化され得る。細胞の寿命を延長する共通のアプローチは、１以上の不死化遺伝子を含むウイルスまたはプラスミドを移入することである。細胞の不死化は細胞の寿命を延長し、そして得られる細胞株は、元の細胞よりもさらに何回も多く継代され得る。不死化遺伝子は、当該分野で周知である。例えば、Ｋａｔａｋｕｒａら，Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌ．５７：６９−９１（１９９８）を参照のこと。不死化タンパク質または不死化ポリペプチドとしては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：アデノウイルスＥ１Ａ遺伝子の１２Ｓ産物および１３Ｓ産物、ＳＶ４０のスモールＴ抗原およびラージＴ抗原、パピローマウイルスのＥ６およびＥ７、エプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）、エプスタインバー核抗原−２（ＥＢＮＡ２）、ヒトＴ細胞白血病ウイルス−１（ＨＴＬＶ−１）、ＨＴＬＶ−１　ｔａｘ、Ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓ　Ｓａｉｍｉｒｉ（ＨＶＳ）、変異体ｐ５３および癌遺伝子（例えば、ｍｙｃ、ｃ−ｊｕｎ、ｃ−ｒａｓ、ｃ−Ｈａ−ｒａｓ、ｈ−ｒａｓ、ｖ−ｓｒｃ、ｃ−ｆｇｒ、ｍｙｂ、ｃ−ｍｙｃ、ｎ−ｍｙｃおよびＭｄｍ２）由来のタンパク質。さらに、細胞は、自然に不死になり得る。好ましい不死化ストラテジーは、テロメラーゼ逆転写酵素（ＴＥＲＴ）が安定または一時的のいずれかで発現され、それによって、テロメラーゼ活性の発現がもたらされるような、ＴＥＲＴをコードする遺伝子の、細胞への移入による。テロメラーゼ活性は、正常な体細胞において発現される場合、染色体先端または保護キャップ（テロメアと呼ばれる）の伸長をもたらし得、それによってテロメア発現細胞が、トランスフォームされることにはならずに不死化されることになる能力をもたらし得る（Ｊｉａｎｇら，Ｎａｔｕｒｅ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　２１：１１１−１４（１９９９）およびＭｏｒａｌｅｓら，Ｎａｔｕｒｅ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　２１：１１５−１８（１９９９）を参照のこと）。
【０１４５】
テロメアは、真核生物染色体の末端の特殊な構造であり、染色体の安定化、位置決定および複製において機能するようである。ＢｌａｃｋｂｕｒｎおよびＳｚｏｓｔａｋ、５３　Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１６３−１９４（１９８４）；Ｚａｋｉａｎ、２３　Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　５７９−６０４（１９８９）；Ｂｌａｃｋｂｕｒｎ，３５０　Ｎａｔｕｒｅ　５６９−５７３（１９９１）を参照のこと。全脊椎動物において、テロメアは、５’−ＴＴＡＧＧＧ−３’配列の数百〜数千個のタンデム反復および会合タンパク質からなる。Ｂｌａｃｋｂｕｒｎ，３５０　Ｎａｔｕｒｅ　５６９−５７３（１９９１）；Ｍｏｙｚｉｓら，８５　Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．６６２２−６６２６（１９８８）を参照のこと。染色体末端制限フラグメント（ＴＲＦ）のサザンブロット分析によって、細胞集団における全テロメアの複合物の長さ（ｃｏｍｐｏｓｉｔｅ　ｌｅｎｇｔｈ）が提供される。Ｈａｒｌｅｙら，３４４５　Ｎａｔｕｒｅ　４５８−４６０（１９９０）；Ａｌｌｓｏｐｐら，８９　Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　１０１１４−１０１１８（１９９２）；Ｖａｚｉｒｉら，５２　Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍａｎ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　６６１−６６７（１９９３）を参照のこと。現在までに調べられた全ての正常体細胞において、ＴＲＦ分析によって、染色体は、１細胞分裂あたりに約５０〜２００ヌクレオチドのテロメア配列を失うことが示され、このことは、ＤＮＡポリメラーゼが直鎖状ＤＮＡを末端まで複製し得ないということと一致する。Ｗａｔｓｏｎ，２３９　Ｎａｔｕｒｅ　Ｎｅｗ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　１９７−２０１（１９７２）を参照のこと。
【０１４６】
テロメアのこの短縮は、有糸分裂時計（これによって、細胞は、その分裂を計数する）であると提唱され（Ｈａｒｌｅｙ，２５６　Ｍｕｔ．Ｒｅｓ．２７１−２８２（１９９１）を参照のこと）、そして十分に短いテロメアは、正常細胞において複製の老化に対するシグナルであり得る。Ｈａｓｔｉｅら，３４６　Ｎａｔｕｒｅ　８６６−８６８（１９９０）；Ｌｉｎｄｓｅｙら，２５６　Ｍｕｔ．Ｒｅｓ．４５−４８（１９９１）；ＷｒｉｇｈｔおよびＳｈａｙ，８　Ｔｒｅｎｄｓ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　１９３−１９７（１９９２）を参照のこと。対照的に、現在までに調べられた不死細胞の大多数は、細胞分裂に伴うテロメア長の正味の損失もテロメア配列の正味の損失も示さず、このことは、テロメアの維持が、複製の老化から細胞を逃れさせ、そして細胞を無期限に増殖させるために必要であるということを示唆する。Ｃｏｕｎｔｅｒら，１１　ＥＭＢＯ　１９２１−１９２９（１９９２）；Ｃｏｕｎｔｅｒら，９１　Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　２９００−２９４０（１９９４）を参照のこと。
【０１４７】
テロメラーゼ（特有のリボ核タンパク質ＤＮＡポリメラーゼ）は、この酵素のＲＮＡ成分内に含まれる配列を鋳型として用いて染色体末端にてテロメアＤＮＡを合成することが知られている唯一の酵素である。ＧｒｅｉｄｅｒおよびＢｌａｃｋｂｕｒｎ，４３　Ｃｅｌｌ　４０５−４１３（１９８５）；ＧｒｅｉｄｅｒおよびＢｌａｃｋｂｕｒｎ，３３７　Ｎａｔｕｒｅ　３３１−３３７（１９８９）；Ｙｕら，３４４　Ｎａｔｕｒｅ　１２６−１３２（１９９０）；Ｂｌａｃｋｂｕｒｎ，６１　Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１１３−１２９（１９９２）を参照のこと。ヒト細胞およびヒト組織に関して、テロメラーゼ活性は、不死細胞株および卵巣癌腫中で同定されたが、寿命のある細胞株においても正常な非生殖系列組織においても検出されていない。Ｍｏｒｉｎ，５９　Ｃｅｌｌ　５２１−５２９，１９８９を参照のこと。ＴＲＦ分析と組み合わせると、これらの結果は、テロメラーゼ活性が、テロメア維持に直接関与することを示唆し、この酵素を細胞の不死化に結び付ける。
【０１４８】
ヒトテロメラーゼ触媒成分（ｈＴＥＲＴ）の発現が、近年、ヒト体細胞において研究された。Ｊｉａｎｇら，２１　Ｎａｔｕｒｅ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　１１１−１１４（１９９９）を参照のこと。正常体細胞におけるテロメラーゼ発現は、悪性の表現型（例えば、異常な増殖制御または腫瘍形成性のトランスフォーメーション）と関連する変化を誘導しないようであった。癌関連変化の非存在はまた、テロメラーゼを用いて不死化されたヒト線維芽細胞においても報告された。Ｍｏｒａｌｅｓら，２１　Ｎａｔｕｒｅ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　１１５−１１８（１９９９）を参照のこと。正常ヒト体細胞へのテロメラーゼの導入が増殖トランスフォーメーションを誘導せず、細胞周期誘導性のチェックポイント制御を回避せず、そしてこれらの細胞のゲノム不安定を誘導しないことが、実証された。テロメラーゼ活性を検出するための方法、ならびにテロメラーゼ活性を調節もしくはテロメラーゼ活性に影響を与える化合物またはポリペプチドを同定するための方法はまた、テロメア長およびテロメラーゼ活性を制御または測定することによる細胞の老化および不死化の治療または診断のための方法と一緒に記載されている（ＰＣＴ国際特許出願ＷＯ９３／２３５７２を参照のこと）。テロメラーゼ活性に影響を与える化合物の同定は、ヒト疾患を処置する際の努力に対して重要な利益を提供する。
【０１４９】
本発明に従う細胞はまた、この分子が、この細胞によって構成的に分泌されるように遺伝子操作されて、１つ以上の生物学的に活性な分子を生成し得る。「構成的に分泌される」とは、所望の生物学的に活性な分子が細胞によって連続的に発現されることか、または遺伝子が連続的に発現されることを意味する。あるいは、細胞は、その発現が遺伝子スイッチングによって制御されるように、遺伝子操作され得る。
【０１５０】
本明細書中に使用される場合、用語「遺伝子スイッチ」および「遺伝子スイッチング」は、遺伝子発現を調節する方法をいう。詳細には、遺伝子によってコードされるタンパク質の発現が、特定の調節タンパク質（ＤＮＡ結合タンパク質として知られる）と遺伝子の上流に位置する領域との相互作用によって制御される。プロモーター領域内において、これらのＤＮＡ結合タンパク質が特異的に結合する特定のオリゴヌクレオチド配列を含むいくつかのオペレーター領域が存在している。これらのタンパク質は、遺伝子発現の活性化または抑制のいずれかを導き得る。従って、これらは、調節された遺伝子発現を制御する。
【０１５１】
このレギュレータータンパク質は、染色体上のどこかに存在する調節遺伝子によってコードされる。レギュレーターとオペレーターとの相互作用は、特定の化学因子（インデューサー）の存在または非存在によって影響される。従って、通常の状況において、レギュレーターが発現され、それによってオペレーターに結合し、そして遺伝子によってコードされる特定のタンパク質の必要性が特定のインデューサー（これは、レギュレーターと相互作用してオペレーターへの結合を阻害し、ゆえに、遺伝子発現を可能にする）の環境下での出現によって示されるまで、遺伝子の発現を阻害する。
【０１５２】
例えば、糖分子に作用する酵素は、その糖が存在するまで必要とされず、従って、その糖の非存在下において、調節遺伝子は、レギュレータータンパク質を発現し、このレギュレータータンパク質は遺伝子オペレーターに結合して酵素の発現を阻害する。この糖自体がインデューサーとして機能し、次いで、これは、レギュレーターと相互作用して、オペレーターへのその結合を妨害し、ゆえに、その酵素の発現を可能にする。酵素による糖の消化によって、その環境から糖が除かれ、レギュレーターが通常の様式に戻ることが可能となり、そして酵素発現を不活性化するように正常に作用する。
【０１５３】
このような調節機構は、遺伝子発現を、その環境の化学内容物によって示されるように、オンおよびオフにスイッチを切りかえる、スイッチングアレンジメントと考えられ得る。記載された型の遺伝子スイッチング系は、細菌中で最もよく知られており、タンパク質およびその標的ＤＮＡ結合部位の多くが、かなり詳細に知られている。レギュレータータンパク質は、通常、ダイマーとしてオペレーターに結合し、これは、二回の対称を示す。レギュレーター／プロモーター相互作用の特異性は、レギュレーターの特定のアミノ酸とオペレーターＤＮＡとの配列特異的相互作用によって決定される。いくつかの系において、相互作用は、詳細な生化学分析ならびに高解像度Ｘ線結晶学に供されている。ＤＮＡ結合分子の最もよく特徴付けられたクラスは、ある程度のアミノ酸配列相同性と共に、共通のヘリックス−ターン−ヘリックスモチーフを示す。レギュレーターの重要なＤＮＡ結合ドメインがヘリックス−ターン−ヘリックス領域内に含まれることは明らかである。
【０１５４】
真核生物において、遺伝子発現の制御がまた、遺伝子のプロモーター領域付近のＤＮＡ配列に結合する特定のタンパク質因子の相互作用によって調節されることが示されている。多数の因子が、酵母および哺乳動物細胞から単離されており、そして、細菌系において観察された様式と類似の配列特異的様式にて特定の配列モチーフと相互作用することが示されている。これらの因子のうちのいくつかの特徴付けによって、タンパク質の配列特異的結合に関与し得る、新規「フィンガー」モチーフが明らかとなった。
【０１５５】
さらに、真核生物遺伝子発現が、真核生物細胞における細菌リプレッサー分子の使用を介して制御され得ることが実証されている。これらの実験において、細菌オペレーター配列は、哺乳動物遺伝子のプロモーター付近に挿入されている。細菌リプレッサーを発現する細胞株が、作製された。リプレッサー分子によるオペレーター挿入を有する標的真核生物遺伝子の発現の制御は、一過性発現アッセイを用いて実証されている。これらの実験において、ｌａｃリプレッサーによる遺伝子発現の抑制が実証されているだけでなく、ＩＰＴＧ（イソプロピルチオガラクトシド）を用いた遺伝子発現の誘導（すなわち、抑制の緩和）もまた、実証されている。
【０１５６】
従って、細菌タンパク質ＤＮＡ／相互作用の詳細な理解および操作を使用して、哺乳動物細胞培養物における発現を制御し得る。遺伝子スイッチング技術は、例えば、米国特許第６，０１０，８８７号（これは、本明細書中に参考として援用される）に記載される。当業者は、遺伝子スイッチ調節の他の方法もまた、本発明の方法および組成物に使用され得ることを認識する。
【０１５７】
１つの好ましい実施形態において、非遺伝子的に改変した細胞が、本発明に従って使用され得るが、単離された細胞は遺伝子操作される。細胞は、遺伝子操作されて、１つ以上の生物学的に活性な分子（１つ以上のサイトカイン、増殖因子、および／または脈管形成因子、またはこれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない）を分泌し得る。このような生物学的に活性な分子の例を、表１に提供する。
【０１５８】
（表１）
【０１５９】
【表１ａ】

【０１６０】
【表１ｂ】

表１の列１は、適切な生物学的に活性な分子を示す。列２は、特定の生物学的に活性な分子の主要な供給源を示す。最後に、列３は、標的細胞および／または所定の生物学的に活性な分子の主要な影響を示す。
【０１６１】
線維芽細胞およびケラチノサイトは、天然に、多数の増殖因子およびサイトカインを分泌する。種々のタンパク質の分泌の要約を表２に示す。
【０１６２】
（表２）
【０１６３】
【表２】

（Ｓｉｎｇｅｒ，Ａ．およびＣｌａｒｋ，Ｒ．（１９９９）「Ｃｕｔａｎｅｏｕｓ　Ｗｏｕｎｄ　Ｈｅａｌｉｎｇ」Ｔｈｅ　Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ　３４１：７３８：７４６を参照のこと）。
【０１６４】
分泌された生物学的に活性な分子の送達の制御は、当業者に公知の任意の方法によって達成され得る。例えば、複数の遺伝子産物の発現は、単一のプロモーター系によって制御され得る。あるいは、複数遺伝子産物の発現が、複数のプロモーター系によって制御され得、各プロモーター系は、構成的にか、または遺伝子スイッチングによってかのいずれかによって、または両方のいくらかの組み合わせによって、制御される。さらに、特定の生物学的に活性な分子の分泌に対する制御は、野生型遺伝子発現をアップレギュレートすることによって達成され得る。
【０１６５】
遺伝子材料を標的細胞に導入するための多数の周知のトランスフェクション方法が存在する。これらとしては、ＤＥＡＥ−デキストランのようなポリカチオンの使用（ＭｃＣｕｔｃｈａｎら，Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ　Ｉｎｓｔ．４１：３５１−５７（１９６８）およびＫａｗａｉら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．４：１１７２−７４（１９８４）を参照のこと）；カルシウムリン酸共沈（Ｇｒａｈａｍら，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　５２：４５６−６７（１９７３）を参照のこと）；エレクトロポレーション（Ｎｅｕｍａｎｎら，ＥＭＢＯ　Ｊ．７：８４１−４５（１９８２）を参照のこと）；リポフェクション（Ｆｅｌｇｎｅｒら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８４：７４１３−１７（１９８７）を参照のこと）；レトロウイルスベクター（Ｃｅｐｋｏら，Ｃｅｌｌ　３７：１０５３−６２（１９８４）を参照のこと）；およびマイクロインジェクション（Ｃａｐｅｃｃｈｉら，Ｃｅｌｌ　２２：４７９−８８（１９８０）を参照のこと）の使用が挙げられる。
【０１６６】
さらに、当業者は、外因性の生物学的に活性な分子を細胞型に送達するのに適切な任意の他の方法もまた、本発明に従って使用され得ることを、認識する。
【０１６７】
上記のトランスフェクション方法のいずれかを使用することによって、種々の生物学的に活性な分子の分泌に対する制御が、種々の生物学的に活性な分子を分泌する多数の細胞型を用いることによって、達成され得る。
【０１６８】
さらに、本発明の細胞型はまた、有糸分裂が活性であるかまたは有糸分裂が不活性であるかのいずれかであり得る。用語「有糸分裂が活性」とは、有糸分裂を活発にする細胞を記載するために使用される。逆に、「有糸分裂が不活性」とは、有糸分裂が活発に起きない細胞を記載するために使用される。有糸分裂が不活性な細胞は、当該分野で公知の任意の手段によって増殖を休止させられ得る。非限定的な例として、細胞は、化学手段（例えば、マイトマイシンＣの投与によって）増殖を休止させられ得る。さらに、細胞型は、ＵＶ光、Ｘ線、またはガンマ（γ）照射への曝露によって増殖を休止させられ得る。１つの好ましい実施形態において、細胞型は、ガンマ照射への曝露によって増殖を休止させられる。例えば、有糸分裂が不活化されたヒト線維芽細胞は、定期的に分化して、これによって、ポリペプチドの発現および分泌のパターンを変化することに留意することが重要である（Ｆｒａｎｃｚ，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．６０：３３７−４５（１９９３））。さらなる例として、ケラチノサイト分化は、通常、培養条件（例えば、培養培地の組成、Ｃａ^２＋濃度、および細胞が気体−液体界面にて培養されるか否かを含む）に依存するが、ケラチノサイトはまた、例えば、マイトマイシンＣによっても分化するように誘導され得る。
【０１６９】
本発明に従う細胞型は、自己由来であっても、同種異系であっても、異種であってもよい。最も好ましくは、本発明に使用される細胞型は、同種異系である。異種細胞が、例えば、目的の分子を発現するトランスジェニック動物から単離され得る。
【０１７０】
間質細胞（例えば、線維芽細胞を含む）は、当業者に公知の任意の方法によって単離され得る。例えば、線維芽細胞は、器官（例えば、皮膚、肝臓、および膵臓）から誘導され得る。これらの器官は、生検（適切である場合）によってか、または剖検の際に獲得され得る。詳細には、十分な量の線維芽細胞が、胸部整復、包皮、または任意の適切な死体の器官から、かなり好都合に獲得され得る。
【０１７１】
線維芽細胞は、適切な供給源の器官または組織を構成要素に分離することによって、容易に単離され得る。「供給源の器官または組織」とは、細胞が得られる器官または組織を意味する。構成要素の分離は、当業者に公知の技術を用いて容易に達成され得る。このような技術の例としては、構成要素の機械的分離ならびに／または消化酵素および／もしくはキレート剤（これらは、隣接細胞間の結合を弱くして、それによって、目にみえるほど相当の細胞破壊を伴わずに、組織を個々の細胞の懸濁物に分散させることを可能にする）を用いた処理が挙げられるが、これらに限定されない。詳細には、酵素的な解離は、組織を細かく刻み、そしてその刻んだ組織を任意の多数の消化酵素のいずれかを単独または組み合わせて用いて処理することによって、達成され得る。適切な酵素としては、トリプシン、キモトリプシン、コラゲナーゼ、エラスターゼ、ヒアルロニダーゼ、ＤＮａｓｅ、プロナーゼ、および／またはジスパーゼが挙げられるが、これらに限定されない。機械的破壊は、多数の方法（粉砕機、配合機、篩、ホモジナイザー、圧縮セル、インソネーター（ｉｎｓｏｎａｔｏｒ）、または摩砕の使用が挙げられるが、これらに限定されない）によって、達成され得る。Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ｃｕｌｔｕｒｅ　ｏｆ　Ａｎｉｍａｌ　Ｃｅｌｌｓ．Ａ　Ｍａｎｕａｌ　ｏｆ　Ｂａｓｉｃ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ，第２版，Ａ．Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ
Ｙｏｒｋ，１９８７，第９章，１０７−２６頁を参照のこと。
【０１７２】
一旦、組織供給源が、個々の細胞の懸濁液に変換されると、懸濁液は、線維芽細胞および／または他の間質細胞および／またはエレメントが回収され得る亜集団に分画されるべきである。分画は、特定の細胞形のクローニングおよび選択、所望でない細胞の選択的破壊（ネガティブ選択）、混合された集団における示差的な細胞の凝集力（ａｇｇｌｕｔｉｎａｂｉｌｉｔｙ）に基づく分離、凍結融解手順、混合された集団中の細胞の示差的な接着特性、ろ過、従来の遠心分離およびゾーン遠心分離、遠心分離溶離（ｅｌｕｔｒｉａｔｉｏｎ）（向流（ｃｏｕｎｔｅｒ−ｓｔｒｅａｍｉｎｇ）遠心分離）、単位重力分離、向流（ｃｏｕｎｔｅｒｃｕｒｒｅｎｔ）分配、電気泳動および蛍光活性化細胞選別を含むがこれらに限定されない、細胞分離のための標準的な技術を使用して達成され得る。Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ｃｕｌｔｕｒｅ　ｏｆ　Ａｎｉｍａｌ　Ｃｅｌｌｓ．Ａ　Ｍａｎｕａｌ　ｏｆ　Ｂａｓｉｃ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，第２版、Ａ．Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ，１９８７、第１１章および１２章、１３７〜６８頁を参照のこと。当業者は、他の適切な細胞分画技術もまた使用され得ることを理解する。
【０１７３】
好ましくは、線維芽細胞の単離は、ＳｌｙおよびＧｒｕｂｂの方法に従って皮膚片の外植によって達成される。Ｓｌｙら、Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ．５８：４４４−５０（１９７９）を参照のこと。
【０１７４】
異なる起源の器官または組織（例えば、皮膚、肝臓、および膵臓を含む）から得られる線維芽細胞は、本発明の方法および組成物において使用され得る。さらに、当業者は、任意のこのような線維芽細胞は、種々の量の生物学的に活性な分子を分泌するように遺伝子操作され得ることを認識する。
【０１７５】
本明細書中で使用される場合、用語「細胞調製物」は、１つ以上の生物学的に活性な分子を分泌する細胞の調製物および細胞外マトリクス材料または他のマトリクス材料の調製物の組み合わせから得られる混合物をいう。例えば、本発明に従う細胞調製物は、トロンビン／細胞調製物およびフィブリノゲン調製物の組み合わせから生じる。いくつかの実施形態において、得られた混合物は、重合を生じ、それにより、硬化されたマトリクスを生じる。あるいは、得られた組み合わせは、高度に粘稠性の非硬化マトリクスを生じ得る。得られた細胞調製物は、ペーストの形態であり得る。当業者は、本明細書中で使用される場合、用語「細胞調製物」は、粘稠性の、非硬化混合物（すなわち、ペースト）から重合した硬化されたマトリクスの範囲の一連の混合物を包含することを認識する。各調製物の濃度ならびに培養条件の差異は、得られる細胞調製物の粘稠性および／または重合の程度に影響し得る。例えば、本発明の１つの実施形態において、フィブリノゲンおよびトロンビン／細胞調製物の組み合わせは、不可逆的に重合した細胞マトリクスを形成するために創傷部位に噴霧投与される。しかし、当業者はまた、他の組み合わせが、粘稠性の、非硬化細胞マトリクスを生じ得ることを理解する。
【０１７６】
本発明に従う細胞調製物を作製するために、細胞型または遺伝子操作された細胞株は、好ましくは、支持する生物学的または合成の細胞外マトリクスまたは細胞外マトリクス材料（ＥＣＭ）と混合または組み合わされる。当業者は、用語「ＥＣＭ」は、多細胞生物の体中に分布する非細胞性材料をいうことを認識する。ＥＣＭは、糖タンパク質、プロテオグリカン、複合炭水化物、および他の分子のような多様な成分から構成される。ＥＣＭの主要な機能としては、構造の支持、抗張力、または緩衝作用を提供すること；細胞接着および細胞移動の基材および経路を提供すること；ならびに細胞分化および代謝機能を調節することが挙げられるが、これらに限定されない。ＥＣＭタンパク質としては、例えば、コラーゲン、エラスチン、フィブロネクチン、ラミニン、プロテオグリカン、ビトロネクチン、トロンボスポンジン、テネイシン（サイトアクチン）、エンタクチン（ニドジェン）、オステオネクチン（ＳＰＡＲＣ）、アンキリンＣＩＩ、コンドロネクチン、リンクタンパク質、オステオカルシン、骨シアロタンパク質、オステオポンチン、エピネクチン、ヒアルロネクチン、アミロイドＰ成分、フィブリリン、メロシン（ｍｅｒｏｓｉｎ）、ｓ−ラミニン、アンデュリン（ｕｎｄｕｌｉｎ）、エピリグリン（ｅｐｉｌｌｉｇｒｉｎ）およびカリニン（ｋａｌｉｎｉｎ）が挙げられる。本発明に従う使用のための好ましいＥＣＭタンパク質としては、コラーゲン、アルギナート、アガロース、フィブリン、フィブリングルー、フィブリノゲン、ラミニン、フィブロネクチン、ＨＳＰ、キトサン、ヘパリンおよび／または他の合成ポリマーもしくはポリマー骨格が挙げられる。
【０１７７】
細胞密度および細胞外マトリクスの濃度は、所望の臨床適用について変化し得る。例えば、特定の創傷は、より大きいかもしくはより小さい細胞密度および／または異なるコンシステンシーの調製物を必要とし得る。得られた細胞調製物は、細胞ペーストの形態または硬化されたマトリクスの形態であり得る。適切な細胞密度およびＥＣＭの濃度の決定は、当業者の慣例業務の範囲内である。細胞懸濁液は、１つの細胞型に由来し得るかまたは異なる細胞型の混合物から構成され得る。例えば、細胞混合物は、５０％のケラチノサイトおよび５０％の線維芽細胞を含み得る。しかし、ケラチノサイト対線維芽細胞の比は、細胞調製物の形成または機能を損なうことなく、変化し得る（例えば、１：１、１：４、１：９、１：２４など）。あるいは、細胞混合物は、ケラチノサイトのみまたは線維芽細胞のみを含み得る（すなわち、ケラチノサイト対線維芽細胞の比は、１：０または０：１であり得る）。さらに、懸濁液は、２種類より多くの異なる細胞型から構成され得る。細胞懸濁液における各細胞型の割合は、細胞調製物について意図される使用に依存して変化し得る。細胞型はまた、創傷に対する治癒応答を最適化するために、インビトロでプレ誘導または同時培養され得る。例えば、線維芽細胞は、創傷適用の１〜２１日前に、ＴＧＦ−β（培地の０．１〜３０ｎｇ／ｍｌ）と共にプレインキュベートされ得る。
【０１７８】
本発明の細胞調製物は、２つの成分から作製される。本明細書中で「成分番号１」といわれる、第１の成分は、フィブリノゲン成分である。本明細書中で「成分番号２」といわれる、第２の成分は、細胞＋トロンビン成分である。成分番号２は、必要に応じて、凍結防止剤を含み得る。本発明の細胞調製物は、トロンビンの存在下で血漿タンパク質（フィブリノゲンを含む）の凝固によって形成される。この凝固は、重合したフィブリン網様構造の形成に主に起因し、これは、血餅の形成を開始する。トロンビンは、酵素的切断によって、フィブリノゲンをフィブリンに変換する。カルシウムは、トロンビンのタンパク質分解活性を加速する。実際、フィブリノゲンおよびトロンビンの組み合わせは、「重合反応」を生じる。これらの材料を混合する際に、細胞は、得られる細胞調製物に捕捉され、これは、全ての成分の濃度、細胞数、培養条件などに依存して、ペーストまたは硬化されたマトリクスであり得る。さらに、本発明の細胞調製物のいずれかにおいて、成分のいずれかまたは全てはまた、さらなるタンパク質または化学薬品を含み得、これらは、細胞調製物（例えば、タンパク質（すなわち、アルブミン）、プロテアーゼインヒビター（すなわち、アプロチニン）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）および細胞調製物のための安定剤として代表的に使用される他の分子）の形成または機能に影響を与えない。本発明の他の実施形態において、細胞調製物の第１の成分は、トロンビンを含み得、そして第２の成分は、細胞＋フィブリノゲンを含み得る。当業者は、この実施形態において、成分番号１および成分番号２の組み合わせもまた、組織再生に有用な細胞調製物を生じ得ることを認識する。さらに、他の実施形態において、組織再生に適切な細胞調製物は、フィブリノゲンおよびトロンビンの相互作用後の重合からではなく、「合成重合」から生じ得る。この実施形態において、細胞は、創傷部位への適用前または適用後のいずれかに、重合剤と混合される。一旦、重合が生じると、組織再生に適切な細胞調製物が形成され得る。
【０１７９】
本明細書中に記載される組成物、細胞調製物、キット、および／または方法は、フィブリノゲンを含む第１の成分および細胞＋トロンビンを含む第２の成分の使用をいうが、他の成分もまた使用され得る。このような成分の例としては、トロンビン成分番号１および細胞＋フィブリノゲン成分番号２ならびに合成重合を生じる成分が挙げられ、これらは、上に詳細に考察される。当業者は、フィブリノゲン成分番号１および細胞＋トロンビン成分番号２を使用する、本明細書中に記載される組成物、細胞調製物、キット、および／または方法のいずれかがまた、組織再生のための細胞増殖を生じる成分の任意の他の組み合わせを使用し得ることを認識し、この組織再生において、細胞は、本発明の性質から逸脱することなく、得られるペーストまたはマトリクスに捕捉されるようになる。
【０１８０】
（投与方法）
１つの好ましい実施形態において、本発明は、創傷に接着する粘稠性細胞ペーストを形成するための、ＥＣＭ材料と混合した、ヒト同種異系線維芽細胞株およびケラチノサイト細胞株の組み合わせを包含する。この実施形態において、細胞株は、好ましくは、遺伝子操作されていない。これらの細胞株は、当業者に公知の任意の手段によって、有糸分裂的に不活化され得る。好ましくは、得られるペーストは、生分解性および生体適合性の両方である。ペーストは、必要な場合（例えば、１週間に１回）、創傷に適用され得る。この実施形態に従う細胞ペーストの適用は、肉芽組織の誘導および創傷の閉鎖の刺激を容易にする。
【０１８１】
前に記載されるように、不死化線維芽細胞およびケラチノサイト細胞株はまた、好ましい実施形態である。好ましい不死化方法は、ＴＥＲＴ遺伝子が構成的に発現されるように、原発性ヒトケラチノサイトおよび線維芽細胞中にＴＥＲＴの遺伝子を直接添加することを介する。さらに、ＴＥＲＴタンパク質に結合されたタンパク質ドメイン輸送配列（ＴＡＴ、ＶＰ２２、ＭＴＳなど）を使用する一過的な不死化は、この遺伝子が、不死化細胞に永久的に挿入されるのではなく、その代わりに、増殖培地に融合タンパク質として添加される点で、より好ましくあり得る。この様式で、細胞株は、新しい原発性細胞供給源の連続的な再確認の必要性なく、連続的に、拡大され得、積み重ねられ（ｂａｎｋｅｄ）得、そして安定な特性（増殖速度、因子分泌など）についてスクリーニングされ得る。この様式で不死化された細胞株は、ペースト、細胞調製物、生物学的マトリクス混合物としての創傷もしくは組織修復部位への適用の前に、または創傷包帯剤に接着されるかもしくは吸着される場合に、優先的に有糸分裂的に不活化される。
【０１８２】
本発明は、ヒト臨床適用および獣医学適用を有する。本発明の細胞調製物は、ヒトおよび非ヒト動物（非ヒト霊長類、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ブタ、ヒツジ、ウシ、またはウマを含む）を処置するために使用され得る。本発明に従う細胞調製物は、例えば、皮膚創傷処置または腹膜炎の処置におけるような、組織再生のために使用され得る。
【０１８３】
例えば、本発明の細胞調製物は、投与に適した他の薬学的組成物に組み込まれ得る。このような組成物は、細胞調製物およびさらなる受容可能なキャリアを含み得る。本明細書中で使用される場合、「生物学的に受容可能なキャリア」は、生物製剤投与と適合性の、任意および全ての溶媒、分散媒、コーティング剤、抗菌剤、および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤などを含むことが意図される。適切なキャリアは、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（この分野における標準的な参照テキスト）（これは、本明細書中に参考として援用される）の最新版に記載される。このようなキャリアまたは希釈剤の好ましい例としては、水；生理食塩水；デキストロース溶液；ヒト血清アルブミン；ＨＢＳＳおよび関連分野の当業者に公知の他の緩衝化溶液（Ｃａ^＋＋およびＭｇ^＋＋を含むかまたは含まない緩衝溶液）；ならびに基本媒体が挙げられるが、これらに限定されない。リポソームおよび不揮発性油のような非水溶性ビヒクルもまた使用され得る。薬学的に活性な物質のためのこのような媒体および薬剤の使用は、当該分野で周知である。任意の従来の媒体または薬剤が活性化合物と不適合である場合を除いて、組成物中のその使用が意図される。補助的な活性化合物もまた、組成物中に組み込まれ得る。
【０１８４】
薬学的組成物は、投与に関する指示書と共に、容器、包装、キット、またはディスペンサー中に含まれ得る。
【０１８５】
投薬レジメンは、種、年齢、体重、性別、および患者の医学状態；処置される状態の型および重篤度；投与経路；ならびに使用される特定の細胞を含む種々の因子に従って、選択される。当業者の医者または獣医は、状態の進行を予防、対抗、または停止するために必要な有効量を容易に決定および処方し得る。
【０１８６】
本発明の細胞調製物は、処置の必要な創傷に局所的に投与され得る。トロンビン＋細胞成分（成分番号２）は、創傷への適用の前、適用の間、または適用後にフィブリノゲン成分（成分番号１）と混合され得る。１つの実施形態において、成分は、単にピペッティングすることによって、またはチューブもしくはシリンジアプリケーターから成分を同時押し出しすることによって、創傷部位に適用される。各成分はまた、滅菌ガーゼ包帯と共に適用され得る。さらに、当業者は、成分の局所投与の順序が、変化し得る（例えば、フィブリノゲン成分に続いてトロンビン＋細胞成分、またはトロンビン＋細胞成分に続いてフィブリノゲン成分）ことを理解する。
【０１８７】
本発明の細胞調製物はまた、創傷領域上に調製物の成分を噴霧することによって、投与され得る。本発明の細胞調製物の投与の際の使用に適した噴霧ポンプは、経鼻投与および咽頭噴霧を含む、他の医学的適用のために使用され得る噴霧ポンプを含む。さらに、細胞調製物は、噴霧ポンプを使用するのではなく、圧縮不活性ガスによって生成される噴霧を使用して適用され得る。例えば、空気および／または窒素のような医学的等級の不活性ガスの小さいキャニスターが使用され得る。ガスの圧力を使用して、小さい開口部を通って流体を推進し、それにより、細かい霧噴霧を生成し得る。圧力は、流体に直接作用し得るか、または圧力低下は、流体を空気の流れに引き抜き得、これは、最終的に、噴霧となる。
【０１８８】
別の実施形態において、本発明の細胞調製物は、連続的な２工程プロセスで、慢性潰瘍に適用される２成分産物として噴霧投与され得る。この実施形態において、第１の成分は、ＨＢＳＳ（Ｃａ^＋＋およびＭｇ^＋＋を含まない）中のフィブリノゲンの懸濁液であり、そして第２の成分は、ＨＢＳＳ（Ｃａ^＋＋およびＭｇ^＋＋を含む）中の細胞（線維芽細胞およびケラチノサイトを含む）、トロンビンおよび凍結防止剤の混合物である。この実施形態において、細胞調製物の２つの成分は、標的創傷領域上で共に混合される。両方の成分は、噴霧ポンプのような噴霧アプリケーターを使用して慢性潰瘍または創傷に適用される。例えば、噴霧ポンプは、潰瘍または創傷の処置の間に正確な用量の両方の成分を送達するために使用され得る。使用される噴霧ポンプの実際の設計は、製造業者に依存して変化し得る。適切な噴霧ポンプの例としては、例えば、経鼻噴霧および咽頭噴霧が挙げられる。噴霧ポンプは、細胞調製物の成分のいずれかの混入を避けるために従来の技術を使用して滅菌され得る材料から製造される。
【０１８９】
噴霧用量は、１回の噴霧当り約５０μｌ〜約１５０μｌ、好ましくは１回の噴霧当り約１００μｌ〜約１５０μｌ、最も好ましくは１回の噴霧当り約１３０μｌの範囲であり得る。濃縮された適用および産物のより正確な送達を可能にするために、噴霧ポンプは、大きい直径の噴霧ではなく、狭い噴霧直径を生じる噴霧アクチュエータ機構を有するべきである。噴霧アクチュエータ機構は、開口部のサイズを介して噴霧を方向付けそして生成する「アーム」である。各噴霧によってカバーされた慢性潰瘍の領域または創傷表面領域は、標的からのアクチュエータの距離に直接的に依存する。例えば、噴霧アクチュエータ機構が標的領域に近ければ近いほど、１回の噴霧当りにカバーされる表面積は、より小さくなる。同様に、噴霧アクチュエータ機構が標的領域から離れれば離れるほど、１回の噴霧当りにカバーされる表面積は、より大きくなる。
【０１９０】
好ましくは、カバーされる表面積は、約１１ｃｍ^２〜約１４ｃｍ^２の範囲である。１つの好ましい実施形態において、噴霧ノズルと標的との間の距離は、約６ｃｍである。この距離において、狭い直径の噴霧アクチュエータ機構を使用して、１回の噴霧は、約１２．６ｃｍ^２の創傷表面領域をカバーする。
【０１９１】
患者の標的領域に着地する細胞の数（すなわち、患者のｃｍ^２当りの細胞数）は、各成分の濃度および成分番号２において使用されるケラチノサイト対線維芽細胞の比に依存して変化する。当業者は、細胞調製物の第２の成分中の細胞の濃度は、約１×１０^３細胞／μｌ〜約５０×１０^３細胞／μｌまで変化し得ることを理解する。例えば、いくつかの実施形態において、細胞調製物成分番号２の細胞／μｌの数は、約５×１０^３細胞／μｌ〜約２０×１０^３細胞／μｌの範囲であり得る。従って、約１３０μｌ／噴霧の２回の噴霧が、患者に投与される場合、約１．３×１０^６〜約５．２×１０^６細胞が、患者に投与される。
【０１９２】
代表的に、第１の成分（フィブリノゲン）が、標的への噴霧された後、第２の成分（トロンビン＋細胞）の噴霧が続く。成分の噴霧の順序は、逆転され得る。しかし、フィブリノゲン成分を最初に適用し、引き続き、トロンビン＋細胞成分を適用することが好ましく、これは、必要に応じて、凍結防止剤を含み得る。一旦、細胞＋トロンビン成分が、フィブリノゲン成分上に噴霧されると、２つの成分は、ほとんど即時にゲル化、硬化、または重合し始め、標的領域上の細胞の等しい分布を可能にする。細胞＋トロンビン成分が、最初に適用され、フィブリノゲン成分が続く場合、生じる遅延時間は、細胞が、重力の影響に起因して創傷部位上で移動することを可能にし、これは、細胞＋トロンビン成分が、適用される容量に依存して、適用後に「流れる（ｒｕｎ）」かまたは「したたる（ｄｒｉｐ）」原因となる。このことは、次は、フィブリノゲン成分の適用の際に細胞の不平等な分布を潜在的に導き得る。フィブリノゲン成分の引き続く適用は、重合を導くので、これは、一様でない細胞調製物の形成を生じ得る。
【０１９３】
別の実施形態において、細胞調製物成分は、標的領域に達する前に空気中で混合される噴霧として投与され得る。このような実施形態において、２つの別々の成分が、１つまたは２つの噴霧アクチュエータ機構を使用して、同時に噴霧され得る。次いで、各成分の噴霧の霧は、空気中で合わされ、それにより、細胞調製物が標的領域（すなわち、創傷部位）に達する前に重合を開始する。この実施形態は、細胞を適用しそしてフィブリン重合を開始するために単回噴霧を必要とするので、本発明の細胞調製物を適用することをより容易にする。
【０１９４】
（凍結保存）
いくつかの実施形態において、成分番号２細胞は、本発明の細胞調製物における使用の前に凍結保存され得る。このような実施形態において、成分番号２は、細胞＋トロンビン＋凍結防止剤を含む。当業者は、用語「凍結防止剤」および「凍結保存剤」が、本明細書中で交換可能に使用され、そして凍結保存を達成するための使用される薬剤をカバーすることを認識する。適切な凍結防止剤としては、例えば、グリセロール、エチレングリコール、およびジメチルスルホキシド（「ＤＭＳＯ」）が挙げられる。種々の実施形態において、凍結防止剤は、１０％グリセロール溶液、１５％グリセロール溶液、ならびに１５％グリセロールおよび５％ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）溶液を含み得るが、これらに限定されない。当業者は、当該分野で公知の任意の他の凍結防止剤および凍結防止剤濃縮物もまた使用され得ることを認識する。
【０１９５】
本発明において使用される凍結防止剤は、細胞調製物の成分番号２を含む緩衝液中に含まれ得る。このプロトコルにおいて、余剰のタンパク質が添加される必要はない。同様に、細胞は、生物学的媒体中で凍結されない。低い毒性または毒性のない凍結防止剤を選択することによって、使用の前に細胞から凍結防止剤を洗い流すかまたは取り除く必要はない。このことは、解凍後の細胞調製物の直接適用を可能にする。
【０１９６】
凍結保存は、本発明の細胞調製物の成分の輸送および長期保存を容易にする。凍結保存された細胞（成分＃２における）は、約−７０℃〜約−１９６℃（液体窒素が使用される場合）の範囲の温度で保存される。例えば、凍結保存された細胞は、−８０℃の冷蔵庫中または−１６０℃で液体窒素の蒸気相中で保存され得る。
【０１９７】
１つの好ましい凍結保存プロトコルにおいて、細胞＋トロンビン＋凍結防止剤混合物（成分＃２）を含むバイアルは、ネジ留め式の閉鎖で滅菌様式で閉鎖される。次いで、閉鎖されたバイアルは、−７０℃〜−１９６℃（これは、液体窒素蒸気相において見出される温度である）の範囲の温度に耐え得る材料から作製されるポーチの内側にパッケージされる（密封してシールされる）。−１２０℃と−１６０℃との間の他の保存温度は、液体窒素蒸気相において見出され得る。次いで、バイアルまたはバイアルを含むポーチを、制御速度冷蔵庫の内側に挿入されるように設計された特別なラック中で生物学的細胞および組織を凍結するために使用される制御速度冷蔵庫の内側に配置する。代表的には、バイアルまたはポーチは、直立して保存され、そして各列の間に空間があるように数列で整列される。この列は、サンプルを冷却するためのチャンバを通る液体窒素蒸気の流れに対して平行に整列される。このようなポーチの使用は、成分＃２の凍結および解凍の間に、成分の混入を妨げるのを助ける。
【０１９８】
サンプルをチャンバに充填した後に、凍結サイクルを、以下のように開始する：
１．室温または２０℃で開始し、チャンバを、４℃まで−２℃／分で冷却する。
【０１９９】
２．次いで、チャンバを、４℃で５２分間維持して、４℃で全てのサンプルを安定化させる。
【０２００】
３．次いで、チャンバを、−５℃まで−１℃／分で冷却する。
【０２０１】
４．次いで、チャンバを、−１２℃まで−３℃／分で冷却する。
【０２０２】
５．次いで、チャンバを、−２０℃まで−７．５℃／分で冷却する。
【０２０３】
６．次いで、チャンバを、−２０℃で１５分間維持する。
【０２０４】
７．次いで、チャンバを、−８０℃まで−１℃／分で冷却する。
【０２０５】
８．次いで、チャンバを、−８０℃まで６０分間維持する。
【０２０６】
次いで、このポーチを冷蔵庫から取り出し、そして使用のときまで、−１６０℃または−８０℃のいずれかで保存する。
【０２０７】
当業者は、冷却サイクルにおいて使用される実際の方法が、必要に応じて変更または改善され得ることを認識する。一般的に、細胞または組織が約−０．２℃／分〜約−５℃／分の範囲の速度で冷却されるべきであることが周知である。さらに、約−０．５℃／分〜約−２℃／分の冷却速度範囲が、大部分の場合について最適である。
【０２０８】
冷却速度は、温度が使用される凍結防止剤溶液の凝固点まで下げられる場合、特に重要である。本明細書中に記載される好ましい実施形態において、冷却は、その溶液の凝固点付近で加速する。このチャンバ温度における全体的な迅速な低下は、アイスシーディングを誘導する熱不安定性を発生させることによって、相変化を誘導することが意図される。全てのサンプルを同時に相転移させるために、相転移プロセスのシーディングを制御することが望ましい。相転移プロセスのシーディングは、以下を含むいくつかの方法によって制御され得る：（１）サンプルを液体窒素中で冷却した金属プローブと接触させること、または（２）サンプルに冷却液体（例えば、液体窒素）を排出すること、のいずれかによって、点熱不安定性（ｐｏｉｎｔ　ｔｈｅｒｍａｌ　ｉｎｓｔａｂｉｌｉｔｙ）を作製すること。（米国特許第６，３４７，５２５号；同第６，１６７，７１０号；および同第５，９８１，６１７号（これらのそれぞれは、本明細書中において参考として援用される）を参照のこと）。当業者は、相転移を制御する他の手段がまた使用され得ることを認識する。例えば、過冷却溶液に不安定性を作る任意の利用可能な技術（例えば、機械的刺激（例えば、パルス状の振動））が使用され得る。
【０２０９】
いくつかの実施形態において、本発明の細胞調製物は、低温に耐えるアルミニウム箔ラミネートポーチから作製される単一のパッケージ中に含まれるキットとして送達され得る。この外側ポーチの内側に、２つのより小さなポーチがあり、第１のポーチは、成分＃１（フィブリノゲン）を含むバイアルを有し、そして第２のポーチは、成分＃２（細胞＋トロンビン＋凍結防止剤）を含むバイアルを有する。あるいは、成分＃１および＃２についてのバイアルは、単一のポーチまたはケース内で一緒にパッケージされ得る。これらの内側ポーチはまた、温度耐性材料から作製される。これらのポーチのための適切な材料の例としては、限定しないが、アルミニウム箔ラミネートポーチ、コート紙、ＬＤＰＥ、Ｓｕｒｌｙｎ（登録商標）、およびＫａｐｔｏｎ^ＴＭラミネートポーチ（Ｓｔｅｒｉｐａｃｋ、Ｉｒｅｌａｎｄ）が挙げられる。当業者は、任意の他の適切な材料がまた、これらのポーチを作製するために使用され得ることを理解する。ポーチを製造するために使用される材料は、低いシール開始温度、高バリア性能、および良好な耐化学性を有するべきである。さらに、細胞調製物成分の混入を避けるために、照射滅菌に適するべきである。適切なポーチの組成および代表的な特性の例を、表３および４に提供する。
【０２１０】
【表３】

【０２１１】
【表４】

適切なポーチのためのシーリングパラメーターは、使用される特定のシーリング装置および第２基材のシーラント層とのその適合性に依存する。しかし、シーリングのための代表的なパラメーターとしては、以下が挙げられ得る：温度＝１００〜１４０℃；休止（ｄｗｅｌｌ）時間＝０．３０〜０．７５秒；および圧力＝６０〜８０ｐｓｉ。
【０２１２】
別の実施形態において、このバイアルは、−７０℃未満〜−１９６℃の低い温度に対して耐性のあるポリマーを使用することによって作製される、堅い透明容器中でシールされ得る。種々の異なる型のバイアルが、成分＃１および＃２を凍結させるために使用され得る。１つの好ましい実施形態において、新規なバイアル（５）（例えば、図６ａおよび図６ｂに示されるバイアル）が使用される。このバイアルは、本発明の細胞調製物の成分を凍結させるために使用される。解凍すると、バイアルを閉鎖するネジ式キャップ（４）を、スプレーポンプアプリケーターと置き換え得る。１つの実施形態において、ボトルは、ポリプロピレン（これは、凍結保存プロトコルにおいて利用される低温に対して耐性がある）から作製され得る。このバイアル（１）の壁の厚みは、壁を通る熱／冷の移動を容易にするために約０．８ｍｍであるべきである（これは、凍結プロセスおよび解凍プロセスの両方について重要である）。さらに、バイアルは、スプレーポンプがネジで押さえられた後に、直立して静地されるように設計され得、そしてバイアル（２）の底は、内容物を空にすることを容易にするために円錐形（３）である。
【０２１３】
この型のバイアルを用いて使用されるように設計された１つのスプレーポンプは、会社Ｖａｌｏｉｓによって製造される。各スプレーは、１３０μｌ容積の生成物を送達する。スプレーアクチュエーター（これは、オリフィスサイズによって、噴霧を方向付けそして生成する「アーム」である）は、この「アーム」が、ボトルを傾けることなく、水平面上にスプレー塗布し得ることによって、局所投与を助けるために、水平位置以外の方向に方向付けられ得るように改変され得る。別の実施形態において、他のスプレーポンプ設計は、ボトルが反転されるとき、スプレーが機能し得る他のスプレーポンプの設計を利用し得る。
【０２１４】
本発明の細胞調製物の凍結保存された成分は、以下のように、輸送、保存、および／または使用され得る。この成分は、約−７０℃〜約−８０℃の温度で、ドライアイスで凍結されたキットとして輸送され得る。ポンプは、室温で輸送され得る。到着すると、キットは、使用するまで、−８０℃の冷凍庫中または−１６０℃で保存されるべきである。使用するために、キットの外側ポーチが開けられ、そして成分＃１（フィブリノゲン）および＃２（細胞＋トロンビン＋凍結防止剤）を含む２つのより小さなポーチが取り出され、そして最大３７℃まで温められる水浴中で解凍する。ポーチが、水浴中の水が細胞調製物の成分を混入することを妨げるのに役立つことを当業者は認める。一旦、バイアルの内容物が解凍されると、ポーチは、水浴から取りだされ得、消毒され得（望ましい場合）、そして開かれ得る。次いで、各バイアルからのネジ式頂部を除き、そしてネジ式スプレーアプリケータと置き換え、次いで細胞調製物成分を、患者適用のために準備する。
【０２１５】
本発明は、以下の実施例において、さらに説明されるが、これらは、特許請求の範囲に記載される本発明の範囲を制限しない。
【０２１６】
【実施例】
（実施例１：ケラチノサイトおよび線維芽細胞の単離）
ケラチノサイトおよび線維芽細胞は、ジスパーゼ（ｄｉｓｐａｓｅ）またはサーモリシンのような酵素を用いて、真皮から表皮を分割した後に、単離し得る。単離された表皮は、ケラチノサイトの単一細胞懸濁液を得るためにトリプシンとともにインキュベートされ得、これは、次いで、培養ディッシュ上にプレートされ得、そして初代ケラチノサイトのバンクを作製するために増幅され得る。この単離された真皮を、コラゲナーゼのような解離酵素と共にインキュベートして、プレートされ、増幅される準備が整った線維芽細胞単一細胞懸濁物を得ることができるか、または切り刻んで（ｍｉｎｃｅｄ）、培養プレート上に移し（ｄｉｓｐａｔｃｈ）、そして線維芽細胞が組織から移動するまで培養し得る。次いで、これらの細胞を、トリプシン処理の後、収集し、そして線維芽細胞バンクを樹立するためにさらに増幅し得る。これらの様式で単離された初代ヒトケラチノサイトおよび線維芽細胞は、細胞およびフィブリンの混合物の調製のために使用され得る。
【０２１７】
線維芽細胞の単離はまた、以下のように実行され得る：新鮮な組織サンプルを徹底的に洗浄し、そしてハンクス平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ）中で切り刻んで、血清を除く。切り刻んだ組織を、１〜１２時間、トリプシンのような解離酵素の新鮮に調製された溶液中でインキュベートする。このようなインキュベーションの後に、解離した細胞を懸濁し、遠心分離によってペレット化し、そして培養ディッシュ上にプレート化する。他の細胞（従って、適切な間質細胞）が、選択的に単離および増殖され得る前に、全ての線維芽細胞が付着する。次いで、単離された線維芽細胞が、コンフルエンシーになるまで増殖され、そして連続的に、培養されるか、または液体窒素中で凍結保存され得る（Ｎａｕｇｈｔｏｎら、１９８７、Ｊ．Ｍｅｄ．１８（３＆４）：２１９−２５０を参照のこと）。線維芽細胞または線維芽細胞の亜集団（例えば、真皮乳頭細胞または筋線維芽細胞）は、外植片増殖培養物から単離され得る。一旦単離されると、間質細胞は、細胞外マトリクス（例えば、フィブリン）ペーストと混合のために準備される。
【０２１８】
（実施例２：本発明の細胞調製物の成分の組成）
成分＃１
この成分は、Ｔｉｓｓｅｅｌ　ＶＨ　Ｆｉｂｒｉｎ　Ｓｅａｌａｎｔ（Ｂａｘｔｅｒ）中のシーラータンパク質溶液の４倍希釈を実行することによって作製され得る。希釈後、シーラータンパク質溶液中の成分の濃度は、以下の通りであった：
フィブリノゲン：１８．７５ｍｇ／ｍｌ〜２８．７５ｍｇ／ｍｌ
フィブリン溶解インヒビター（アプロチニン）：７５０ＫＩＵ／ｍｌ
ポリソルベート：０．０５ｍｇ／ｍｌ〜０．１ｍｇ／ｍｌ
塩化ナトリウム：０．５ｍｇ／ｍｌ〜１．０ｍｇ／ｍｌ
クエン酸三ナトリウム：１．０ｍｇ／ｍｌ〜２．０ｍｇ／ｍｌ
グリシン：３．７５ｍｇ／ｍｌ〜８．７５ｍｇ／ｍｌ。
【０２１９】
シーラータンパク質溶液を、Ｃａ^２＋もＭｇ^２＋も含まない、ハンクス緩衝化生理食塩水溶液（ＨＢＳＳ）で希釈した。これら２つのイオンの存在は、凍結および解凍のプロセスの間に、沈殿の形成を誘導した。
【０２２０】
当業者は、組織シーラントが、類似の結果を達成するために、他の市販のフィブリノゲンおよびアプロチニン調製物を補充され得ることを認識する。さらに、フィブリノゲンはまた、重合特性を向上するために、投与の様式に依存して、他の濃度に希釈され得る。
【０２２１】
成分＃２
この凍結保護された成分は、以下を混合することによって作製され得る：
成分　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　最終濃度
トロンビン（Ｂａｘｔｅｒ　Ｔｉｓｓｅｅｌ）：１０容量％
グリセロール　　　　　　　　　　　　　　　　１５容量％
ヒト血清アルブミン　　　　　　　　　　　　　５容量％
ＨＢＳＳ（Ｃａ^２＋およびＭｇ^２＋を含む）　　　　これらの成分を再懸濁するために使用される。
【０２２２】
希釈に続いて、Ｂａｘｔｅｒから得られるトロンビン溶液は、凍結保護された溶液に以下を寄与する：
トロンビン：５０ＩＵ／ｍｌ
全タンパク質：４．５〜５．５ｍｇ／ｍｌ
塩化ナトリウム：０．８〜１．２ｍｇ／ｍｌ
グリシン：０．２４〜０．３６ｍｇ／ｍｌ
ＣａＣｌ_２：４μｍｏｌ。
【０２２３】
Ｃａ^２＋およびＭｇ^２＋を含むＨＢＳＳは、選択希釈であった。
【０２２４】
所望の細胞混合物（比）および濃度を、成分＃２を得るために、凍結保護された溶液中に再懸濁した。種々のケラチノサイト：線維芽細胞比（１：１、１：３、１：４、１：９、１：５０の高さを含む）を考慮した。さらに、考慮される成分＃２中の種々の最終細胞濃度は、１００万個、２５０万個、５００万個、１０００万個、２０００万個、および５０００万個の細胞／ｍｌ（最終濃度）であった。
【０２２５】
（実施例３：有効用量のマイトマイシンＣの試験）
以前の研究は、マウス３Ｔ３線維芽細胞の増殖停止に効果的な濃度のマイトマイシンＣ（ＭＭＣ）が２μｇ／ｍｌであること（ＲｈｅｉｎｗａｌｄおよびＧｒｅｅｎ、Ｃｅｌｌ　６：３３１−４３（１９７５））ならびにヒト真皮線維芽細胞の増殖停止に効果的な濃度のマイトマイシンＣ（ＭＭＣ）が８μｇ／ｍｌであること（Ｌｉｍａｔら、Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．９２：７５８−６２（１９８９））を示している。
【０２２６】
ラット線維芽細胞株（ＣＲＬ１２１３）、ＦＧＦ１トランスフェクトラット線維芽細胞株（１１７５／ＣＲＬ１２１３）、ヒトテロメラーゼ不死化線維芽細胞株（ＭＤＸ１２）、および初代ヒト線維芽細胞（ＥＤＸ１）を、以下の方法を使用して、それぞれ増殖停止させた。線維芽細胞を、Ｔ７５フラスコ中のＤＭＥＭ＋１０％ＦＣＳ、２５ｍＭ　Ｈｅｐｅｓ、１ｍＭピルベート、２ｍＭ　Ｌ−Ｇｌｎ、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン中で増殖させた。コンフルエンシーにおいて、細胞を引き離し、そして１０^５細胞／ｃｍ^２の密度でプレートし、さらに、４８時間インキュベートし、次いで、５時間、０μｇ／ｍｌ、２μｇ／ｍｌ、４μｇ／ｍｌ、８μｇ／ｍｌ、１２μｇ／ｍｌのマイトマイシンＣ（ＭＭＣ）で処理した。次いで、細胞を、ＰＢＳを用いてリンスし、そして０．０５％トリプシン／０．０２％ＥＤＴＡを用いて引き離した。残りの細胞を、それぞれ、Ｔ２５−フラスコ中、１００〜５０００細胞／ｃｍ^２の密度でプレートした（各密度について、１０フラスコ）。これらの細胞を、１週間に２回培地を変えて、３７℃でインキュベートした。
【０２２７】
細胞増殖停止の効率は、５０００細胞／ｃｍ^２の密度でプレートしたフラスコ中で培養される細胞を毎週計数する（血球計を使用する）こと、および１００細胞／ｃｍ^２の密度でプレートしたフラスコ中で見掛けのコロニーの目視によって測定した。細胞形態における変化もまた試験した。８μｇ／ｍｌ　ＭＭＣの濃度は、ヒト初代線維芽細胞（ＥＤＸ１）およびｈＴＥＲＴ不死化ヒト線維芽細胞株（ＭＤＸ１２）を増殖停止するのに十分であり、これは、以前のデータと一致する（Ｌｉｍａｔら、Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．９２：７５８−６２（１９８９））。ラット線維芽細胞株（ＣＲＬ１２１３）は、４μｇ／ｍｌより上のＭＭＣ濃度に対する毒性を示したが、一方、２μｇ／ｍｌ　ＭＭＣは、これらの細胞の増殖停止に最適であることが証明された。ＦＧＦ１遺伝子をトランスフェクトされたラット線維芽細胞株（１１７５／ＣＲＬ１２１３）は、１μｇ／ｍｌ　ＭＭＣの濃度で増殖停止した。１μｇ／ｍｌ未満の濃度は、有効ではなく、より高い濃度のＭＭＣが、次第に毒性であった。マイトマイシンＣ処理された線維芽細胞（適切なマイトマイシンＣ用量を有する）を、解凍することによって低温貯蔵保存から回収し、少なくとも５０％の細胞回収率を示した（Ｌｉｍａｔら、Ｉｎ　Ｖｉｔｒｏ　Ｃｅｌｌ　Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．２６：７０９−１２（１９９０）と一致する）。
【０２２８】
（実施例４：線維芽細胞およびケラチノサイトに対する有効線量のγ線照射の試験）
処理された線維芽細胞の有糸分裂活性に対するガンマ線（γ線）照射の効果を測定するために、９６ウェル形式（Ｏｎｃｏｇｅｎｅ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）において機能する、ＢｒｄＵ細胞増殖アッセイを使用した。非不死化ヒト初代線維芽細胞を、種々の線量（０グレイ、６０グレイ、７０グレイ、および８０グレイを含む）でγ線照射によって処理した。次いで、細胞を、９６ウェルディッシュ中、５，０００細胞／ウェルの密度でプレートした。照射コントロールおよび非照射コントロールを、続けて１５日間および３０日間、培養物中で維持した。これらの時点のそれぞれにおいて、有糸分裂活性を、ＢｒｄＵ組み込みアッセイ（ＤＮＡへのＢｒｄＵ組み込みが免疫化学的にアッセイされ、そして４５０ｎｍのその吸収によって測定される）を使用して測定した。
【０２２９】
図１において、ＢｒｄＵで処理された非照射細胞を、各実験において、ポジティブコントロールとして提供した。ＢｒｄＵで処理されていない非照射細胞を、バックグラウンド吸収として供給し、これは、各サンプル（０グレイ、６０グレイ、７０グレイ、および８０グレイ）についての４５０ｎｍの吸収から引き、そしてポジティブコントロールを１００％相対的ＢｒｄＵ組み込みに設定することによって、最終データを正規化した。図１において、６０グレイのレベルおよびそれより上のレベルでのγ線照射での処理が、初代線維芽細胞を有糸分裂後状態に誘導することが明かである。合計３つのサンプルを、各条件について考慮した。データは、平均±ＳＥＭとして示される。
【０２３０】
図２において、ガンマ線（γ線）照射処理後の細胞の生存度を、正常な細胞培養表面への細胞の接着を決定することによって評価した。１ウェル当たり９，５００細胞／ｃｍ^２または９５，０００細胞／ｃｍ^２の濃度で、６ウェルの培養ディッシュをプレートした。細胞をプレートした４時間後、培地を、５０μｇ／ｍｌのＮｅｕｔｒａｌ　Ｒｅｄを含む新鮮な培地と置き換え、そして細胞を３７℃および５％ＣＯ_２で２時間インキュベートした。次いで、ウェルをＮａＣｌ　０．９％で２回リンスし、そして一晩乾燥した。次の日、色素を、１：１酸性酸（２％）およびエタノール（９５％）の混合物を使用して溶解させた。各ウェルを、室温で１５分間、この溶液１ｍｌ中でインキュベートし、この後、２００μｌの混合物を、５４０ｎｍのその色素の含有量について測定した。処理された細胞の接着と非処理細胞の接着との間に有意な違いは観測されず、これは、ガンマ線（γ線）照射が、細胞生存度に影響せず、そして細胞が、ガンマ線（γ線）照射後に培養表面へ接着し得ることを示す。各データ点は、３つの別々の６ウェルの平均測定である。データは、平均±ＳＤとして示される。
【０２３１】
８０Ｇｙでのガンマ（γ）照射をまた、初代ヒトケラチノサイトの有糸分裂後状態への分化を誘導する能力について評価した。照射されたケラチノサイトを、成長停止線維芽細胞支持細胞（７０Ｇｙでガンマ（γ）照射した）の層の上にプレートした。支持細胞を、５，０００細胞／ｃｍ^２の密度でプレートし、ケラチノサイトを１２，５００細胞／ｃｍ^２の密度でプレートした。ケラチノサイトの増殖および表現型を、３週間追跡し、その後、倒立顕微鏡を用いて観測した。この期間の間、ケラチノサイトを観察して、サイズおよび結合領域が増加した細胞を用いて、分化した表現型を採用した。この方式において培養したケラチノサイトは、分裂し、培養物表面を覆うことができず、単離されたままかまたは小さなクラスター状態のままであり、これは照射によって、細胞が、有糸分裂後状態へと誘導されたことを示す。
【０２３２】
（実施例５：フィブリンペーストを用いる細胞密度の試験：フィブリンマトリックスにおける、ケラチノサイトおよび線維芽細胞の混合物による増殖因子およびサイトカインの分泌）
ヒト初代ケラチノサイトおよび線維芽細胞を、処方の前に８０Ｇｙでガンマ（γ）照射することによって成長を停止した。ヒト初代ケラチノサイトおよび線維芽細胞の新鮮な調製物を、１０％のトロンビン（Ｔｉｓｓｅｅｌ，Ｂａｘｔｅｒ）＋１５％グリセロール＋５％ヒト血清アルブミンを含む懸濁液中に、２５０万、５００万、１０００万、２０００万、および４０００万細胞／ｍｌを含む、１：９の最終濃度比で混合した。第２のバイアルに、２５％のフィブリノゲン（Ｔｉｓｓｅｅｌ，Ｂａｘｔｅｒ）溶液を調製した。細胞およびフィブリンの「ペースト」を、細胞のスプレー１回（１３０μｌ）＋フィブリノゲン懸濁液のトロンビン懸濁液のスプレー１回（１３０μｌ）を共にスプレーすることによって、２４ウェルプレートの個々のウェル中に調製した。これらの細胞による培地への種々の増殖因子およびサイトカインの分泌を、フィブリンマトリックス中に細胞を調製した後、２日間測定した。表５に示されるデータは、存在する各々の状態に関して、５つの個々のデータ点（サンプル）の平均を示す。
【０２３３】
【表５】

表５は、種々の異なる増殖因子が、フィブリンマトリックスに含まれる、ケラチノサイトおよび線維芽細胞から活発に分泌されることを例示する。これらの細胞によって産生されるｂＦＧＦが、このフィブリンマトリックスにおいて見出され得ることはまた、当該分野で公知である。産生される増殖因子の絶対レベルは、問題の増殖因子の特定の性質に依存すると観測された。生物学的な効力および半減期は、分子依存性であるので、非依存性増殖因子の正確なｐｇレベルは主な関心事ではない。むしろ、これらの細胞から分泌された分子のカクテルの生物学的作用により、多くの生物学的経路を同時に標的する独特な方法を共に提供すると考えられる。生理学的な量の増殖因子およびサイトカインが産生されることは、記載する価値がある。
【０２３４】
表５において、５種の異なる分子の分泌が、使用される細胞の濃度に従う用量依存性であるようである。このことは、細胞の濃度が２５０万〜１０００万個の細胞／ｍｌまで増加するにつれて適用される。ＫＧＦおよびＨＧＦを除くほとんどの因子について、さらに高度な分泌レベルが、２０００万個の細胞／ｍｌで見られる。しかし、一旦、細胞の数が、４０００万個の細胞／ｍｌまで増加したら、タンパク質産物中に滴が、ＩＬ−１βを除く全ての分子について観測される。このことは、最適の細胞濃度が存在するようであり、そしてそれぞれの細胞の濃度が、以下の表６において参照されるように、異なるタンパク質プロフィールの産生に導くことを示唆する。表６は、ＶＥＧＦ、ＫＧＦ、ＨＧＦ、およびＩＬ−１βの分泌をＧＭ−ＣＳＦの分泌に対して規格化することによって表される。このことは、異なる細胞濃度について、異なるタンパク質プロフィールが存在し、分子が、検討中の細胞の濃度に依存して異なる割合で産生されることを、示す。
【０２３５】
【表６】

（実施例６：Ａｌｌｏｘ段階Ｉ臨床試験Ｃ２００１）
（産物の説明）
調査の下、同種間細胞ベースの処置（Ａｌｌｏｘと呼ばれる）は、スプレー塗布器を用いて、慢性潰瘍に対して局所的に適用され得る２つの成分産物である。創傷部位上に、２つの成分をスプレーする際、適用した細胞を潰瘍部位で捕捉するフィブリンマトリックスを作製し、これらの細胞によって栄養性因子を局所放出し得る。
【０２３６】
２成分の内容は以下である：
成分＃１　フィブリノゲンの液体懸濁物；（スプレー１回＝５０μｌ）
成分＃２　トロンビンと混合したケラチノサイトおよび線維芽細胞の液体懸濁物（比１：１、１５×１０^６細胞／ｍｌ）；（スプレー１回＝５０μｌ）
（目的）
この試験の目的は、慢性潰瘍の創傷治癒に対するＡｌｌｏｘの効果を評価すること、患者の集団においてＡｌｌｏｘの安全性および耐用性を評価すること、および静脈機能不全または動静脈機能不全を有する患者における慢性脚潰瘍の完全な創傷閉鎖の頻度に関して、産物の効果を決定することであった。
【０２３７】
（方法論）
足首とひざの間の少なくとも１つの静脈潰瘍または複合（ｃｏｍｂｉｎｅｄ）動脈−静脈潰瘍を有する１８歳を超える患者で、プロトコルの適格基準にあう患者を、Ｃ２００１試験においてＡｌｌｏｘを受けるために補充した。試験日（ＳＤ）−１４で、患者が適格であることがわかり、Ａｌｌｏｘ処置を受けるために補充した。ＳＤ１で、患者は、試験処置の第１の適用を受け、８週間まで、または潰瘍が閉鎖するまでのどちらか早い時期まで、週に一度繰り返した。追跡検査を、４週間行い、その後、処置の最後の適用を行った。
【０２３８】
（患者数）
全１３人の患者を、最初に登録し、そのうちの１人は、後になってプロトコルに関して適格でないことが決定された。
【０２３９】
（診断および主な算入のための判断基準）
足首とひざの間に１つ以上の静脈潰瘍または複合動脈−静脈潰瘍を有する１８歳を超える患者で、病因が、ＡｎｋｌｅによるＡｎｋｌｅ　Ｂｒａｃｈｉａｌ　Ｐｒｅｓｓｕｒｅ　Ｉｎｄｅｘ、Ａｎｋｌｅおよび／またはＧｒｅａｔ　Ｔｏｅｐｒｅｓｓｕｒｅ、およびＤｕｐｌｅｘ　Ｕｌｔｒａｓｏｕｎｄによって確認されている患者は、この試験に関して適格であった。ＳＤ−１４で、患者は、１ｃｍ^２より大きな表面積を有して、１ヶ月より長い持続期間、潰瘍を有さなければならなかった。患者は、観測者および他のスタッフと情報交換して、協力し得ることが要求され、書面でのインフォームドコンセントを提供しなければならない。女性の患者は、閉経後であるか、または手術により不妊化されていなければならない。
【０２４０】
（試験処置および投与の様式）
溶液の連続スプレーによる適用を、２つのボトルキット中で提供した。全０．４ｍｌの産物を択一的に適用した：成分＃１（フィブリノゲン）スプレー２回の後、成分＃２（細胞＋トロンビン）スプレー２回。この手順を２回繰り返した。このような適用は、潰瘍領域１２ｃｍ^２をカバーし、処置した１ｃｍ^２ごとの創傷が、全部で０．２５×１０^６細胞を受けた。
【０２４１】
（処置の持続期間）
ＳＤ１で、患者は第１の適用を受け、８週間までか、あるいは潰瘍が閉鎖するまでのいずれか早い時期まで、週に１度繰り返した。追跡検査を４週間行った後、最後の適用を行った。試験持続期間は、１４週間であって、２週間のならし（ｒｕｎ−ｉｎ）期間、８週間の処置、４週間の追跡検査期間からなる。
【０２４２】
（評価の判断基準）
効力を、潰瘍の完全な閉鎖；ＳＤ１と比較したＷ８およびＷ１２での潰瘍表面積；周辺効果（ｅｄｇｅ　ｅｆｆｅｃｔ）；および潰瘍症状によって評価した。
【０２４３】
安全性を、１２週までの有害事象の頻度および重篤度に従ってモニターした。標準的な実験室試験、理学的検査およびバイタルサイン測定もまた記録した。
【０２４４】
（統計学的方法）
処置された患者の数が少数であったため、統計学的分析は行なわなかった。むしろ、結果は、本明細書中に記述形態において示した。
【０２４５】
（結果）
【０２４６】
【表７】

全閉鎖を、ＳＤ５７で１つの潰瘍に関して、および４週の追跡検査で２つの潰瘍に関して観察した。５人の患者に関して、表面積における３０％を超える減少として規定される改良を記載した。処置の失敗（試験期間の間に、潰瘍サイズの減少も増加もないものとして規定される）を、Ａｌｌｏｘを用いて処置した４人の患者において観測した。
【０２４７】
（臨床試験結論）
８週間にわたる週に１回のＡｌｌｏｘ処置が、慢性脚潰瘍を有する患者に対して安全で非毒性であることを決定した。潜在的な処置に関連する２つの潰瘍感染は、試験終了前によって回復した。中程度の潰瘍感染は、正しい衛生学に関わらない場合、比較的通常の場所である。
【０２４８】
５人の患者は、追跡検査期の最後に、面積が３０％を越えて減少し、２人の患者は、完全な潰瘍閉鎖を示した。この少人数の試験から、応答に対する傾向を、「より小さな（ｙｏｕｎｇｅｒ）」良性潰瘍（＜６ヶ月）において観察した。
【０２４９】
（実施例７：Ｔｉｓｓｅｌ　ＶＨ（フィブリングルー）の最適希釈および標準的なヒト血漿の試験）
フィブリンは、治療目的のために細胞混合物を懸濁し、捕捉するために使用され得る１つの潜在的な生物学的ポリマーである。ポリマー化されたフィブリンを、適切な濃度で、フィブリノゲンおよびトロンビンを混合することによって作製する。図３において示されるマトリックスにおいて、フィブリノゲン（Ｔｉｓｓｅｅｌ，Ｂａｘｔｅｒ）およびトロンビン（Ｔｉｓｓｅｅｌ，Ｂａｘｔｅｒ）の種々の希釈物を、重合プロセスにおける効果および最終生成物のフィブリンの生成における効果に関して試験した。もとのフィブリノゲンおよびトロンビン成分の１／４〜１／８０の範囲とみなされる希釈物を、ＴｉｓｓｕＣｏｌキット中で供給した。もとのＴｉｓｓｅｅｌキットにおいて、フィブリノゲンは、７５〜１１５ｍｇ／ｍｌの濃度を有しており、一方、トロンビンは、５００ＩＵ／ｍｌの濃度を有していた。この試験に関して、フィブリノゲンを、Ｃａ^２＋およびＭｇ^２＋が存在するＨＢＳＳ中で希釈し、トロンビンを、Ｃａ^２＋およびＭｇ^２＋が存在するＨＢＳＳ中で希釈した。
【０２５０】
考慮されるフィブリン特性は、重合時間（秒）、コンシステンシー、および機械強度を含んだ。フィブリンポリマーを、スプレー技術を用いて生成し、それによって、２４ウェル培養プレートの単一のウェル中で、フィブリンのスプレー１回を、トロンビンのスプレー１回と組み合わせた。条件を三連で繰り返した。使用したスプレーの体積は、スプレー１回あたり１３０μｌであった。
【０２５１】
全ての希釈物は、フィブリンポリマーを形成し得るとみなされるが、フィブリンポリマーの性質は、使用する希釈物に依存して広く変動した。フィブリンのコンシステンシーおよび機械強度を、スケール（−、＋、＋＋、＋＋＋）を用いて評価し、ここで、−は、不良とみなされ、＋＋＋は、優れているとみなした。＋＋または＋＋＋の評価については、治療適用のための細胞を懸濁するための潜在的な使用のために受容可能であるとみなした。フィブリノゲンの最大希釈のための条件は、１／２０フィブリノゲンおよび１／８トロンビンであり、一方、トロンビンの最大希釈のための条件は、１／４フィブリノゲンおよび１／４０トロンビンであった。
【０２５２】
さらに、正常な血漿はまた、生物学的接着剤の産生のためのマトリックス材料として使用されて、創傷の適用部位で細胞を捕捉し得る。正常な希釈されていないヒト血漿とトロンビンとを一緒に、フィブリンクロットまたはポリマーを形成し得る１／５０希釈で、ピペットによって混合物を作製した。このフィブリンポリマーは、市販のフィブリングルーと同様の取り扱い特性を示し、これは、ＢａｘｔｅｒのＴｉｓｓｅｅｌ　ＶＨまたはＴｉｓｓｕｃｏｌおよびＨａｅｍａｃｕｒｅのＡＰＲ濃縮フィブリンベースの産物の代替物として役立ち得ることを示唆した。
【０２５３】
（実施例８：スプレーされた細胞からの増殖因子放出　対　スプレーされていない細胞からの増殖因子放出の比較）
図４は、本発明の方法に従う、フィブリンマトリックスに捕捉された細胞からの増殖因子の分泌を示す。ＶＥＧＦおよびＧＭ−ＣＳＦの分泌は、フィブリン細胞マトリックスの生成後の２日の間に、２４時間馴化させた培地から評価した。ｂＦＧＦの分泌を、生成後４８時間の細胞マトリックスから得た抽出物において測定した。細胞の増殖を停止させるために、初代ヒト線維芽細胞およびケラチノサイトの両方を、５時間、８μｇ／ｍｌのマイトマイシンで処理した。細胞を、トリプシン処理の前に、Ｃａ^２＋およびＭｇ^２＋を含まないＨＢＳＳでリンスした。
【０２５４】
細胞を、スプレー１回当たり５０μｌのスプレーポンプ送達を使用して、適用した。
【０２５５】
（ケラチノサイト：線維芽細胞の比＝１：４）
スプレー２回（１．５×１０^６細胞）：１００μｌ（１５００万細胞／ｍｌ）（細胞＋トロンビン）成分＋１００μｌフィブリノゲン成分。
【０２５６】
スプレー４回（３×１０^６細胞）：２００μｌ（１５００万細胞／ｍｌ）（細胞＋トロンビン）成分＋２００μｌフィブリノゲン成分。
【０２５７】
スプレーされていない（１．５×１０^６細胞）：１００μｌ（１５００万細胞／ｍｌ）（細胞＋トロンビン）成分＋１００μｌフィブリノゲン成分。
【０２５８】
（ケラチノサイト：線維芽細胞の比＝１：１）
スプレーされていない（ピペットによる）（２×１０^６細胞）：２５０μｌ（８００万細胞／ｍｌ）（細胞＋トロンビン）成分＋２５０μｌフィブリノゲン成分。
【０２５９】
図４は、２４ウェルの培養皿の個々のウェルへの異なる細胞用量のスプレー後に、細胞およびフィブリン調製物によって生成される、分泌された増殖因子の量を比較する。この図はまた、細胞およびフィブリン調製物が単純なピペッティングによって作製される（スプレーされていない）場合の、増殖因子分泌量を示す。スプレーされた調製物　対　スプレーされていない調製物の比較は、測定されたＶＥＧＦ分泌の減少が存在するが、ＧＭ−ＣＳＦおよびｂＦＧＦの分泌レベルは匹敵することを示す。さらに、スプレー２回からスプレー４回への増加は、細胞によるより高い増殖因子分泌レベルを導き、これは、多くの細胞を変更することによる増殖因子投与の可能性を強調する。分泌されたＧＭ−ＳＣＦおよびＶＥＧＦを、培養培地中に投与し、一方、ｂＦＧＦをフィブリンマトリックス中に投与した。データを、平均±ＳＥＭで示す（ｎ＝４、スプレーされた；Ｎ＝３、スプレーされていない）。
【０２６０】
（実施例９：異なるケラチノサイト：線維芽細胞比によって生成される増殖因子の比較）
図５ａおよび図５ｂにおいて、比較を、フィブリンマトリックス中に捕捉された細胞から放出される増殖因子で行った。フィブリン細胞マトリックスを、１回もしくは２回のスプレーの成分番号１（フィブリノゲン）と共に、１回もしくは２回のスプレーの成分番号２（細胞＋トロンビン）のいずれかをスプレーすることによって形成する。成分番号２中の１５×１０^６細胞／ｍｌの濃度を使用し、そしてスプレーポンプを使用して、スプレー１回当たり７０μｌの容量を送達した。細胞増殖を停止させるために、初代ヒト線維芽細胞およびケラチノサイトの両方を、５時間、８μｇ／ｍｌのマイトマイシンで処理した。細胞を、トリプシン処理の前に、Ｃａ^２＋およびＭｇ^２＋を含まないＨＢＳＳでリンスした。
【０２６１】
図５ａにおいて、スプレー１回（１．０５×１０^６細胞）＝スプレー１回の細胞＋トロンビン（７０μｌ）およびスプレー１回のフィブリノゲン。図５ｂにおいて、スプレー２回（２．１×１０^６細胞）＝スプレー２回の細胞＋トロンビン（１４０μｌ）およびスプレー２回のフィブリノゲン（１４０μｌ）。
【０２６２】
図５ａおよび５ｂは、細胞の総数を維持しつつ、異なる比でのケラチノサイトと線維芽細胞の混合が、多様な増殖因子分泌特徴を生じることを実証する。ケラチノサイトが線維芽細胞に添加される場合、ＧＭ−ＣＳＦの分泌の増大が観察される。１：２４〜１：８のケラチノサイト：線維芽細胞比でのスプレー１回について、ＧＭ−ＣＳＦ生成について、プラトーに達する。本発明の細胞調製物の第２成分へのケラチノサイトのさらなる添加は、ＧＭ−ＣＳＦ分泌に関して、利点を提供するようにはみえない。
【０２６３】
１：４９〜１：１のケラチノサイト：線維芽細胞比でのスプレー２回の調製物を考慮すると、ＧＭ−ＣＳＦ分泌は、５０００ｐｇ／日を超える。ＧＭ−ＣＳＦの分泌は、１：４のケラチノサイト：線維芽細胞比で最高であるが、ＧＭ−ＣＳＦ分泌の最高の増大は、１：９９〜１：４９の比を超える場合に得られることが明らかである。
【０２６４】
さらに、ＶＥＧＦ生成が、成分番号２中のケラチノサイトと線維芽細胞の比に高度に依存することもまた明らかである。図５ａおよび５ｂに詳述される実験において、１：８のケラチノサイト：線維芽細胞比付近でのＶＥＧＦの分泌が最適であるようである。なぜなら、さらに増大するケラチノサイト数は、分泌されるＶＥＧＦの量の減少を生じるからである。
【０２６５】
異なる細胞比で、より多い数のスプレーの適用はまた、増殖因子分泌レベルの増大を生じる。データは、平均±ＳＥＭとして示される（ｎ＝４、スプレー１回；ｎ＝３、スプレー２回）。
【０２６６】
（実施例１０：１週間の−１６０℃での貯蔵　対　−８０℃での貯蔵の比較）
図７は、１週間の期間にわたって、−１６０℃　対　−８０℃で凍結保存された保存細胞による、増殖因子分泌の比較を示す。この実験において使用された凍結防止剤は、１０％トロンビン（Ｔｉｓｓｅｅｌ、Ｂａｘｔｅｒ）を含む１０％グリセロール溶液であり、そして使用されたケラチノサイト：線維芽細胞比は、１：１であった。凍結保存の前に、細胞を、トリプシンを用いて培養表面から剥離させ、続いて、８０Ｇｙのガンマ（γ）照射を用いて照射した。制御された速度の冷凍庫を使用して、細胞調製物を−８０℃に徐々に冷却した。１週間後に解凍した後、スプレー１回（１３０μｌ）の細胞調製物（１０００万細胞／ｍｌで１３０万細胞）を、２４ウェルのペトリ皿の単一ウェル中で、スプレー１回（１３０μｌ）のフィブリノゲンと共にスプレー混合した。結果は、同じ凍結防止剤を含有するコントロールの新鮮な（非凍結）サンプルと比較した、−１６０℃で１週間保存した３サンプルおよび−８０℃で１週間保存した４サンプルについての、２日間のＧＭ−ＣＳＦ、ＶＥＧＦおよびｂＦＧＦの分泌を示す。分泌されたＧＭ−ＣＳＦおよびＶＥＧＦを培養培地中に投与し、一方、ｂＦＧＦをフィブリンマトリックス中に投与した。分泌データは、−８０℃および−１６０℃の両方が保存に適切であるが、１０％グリセロール溶液を使用する場合、−１６０℃がより好ましくあり得ることを示す。データを、平均±ＳＥＭとして示す（ｎ＝４）。
【０２６７】
（実施例１１：１０％グリセロール中での−８０℃での１週間の保存後の分泌
対　１５％グリセロール中での１週間の保存後の分泌の比較）
図８は、１週間の期間にわたって１０％グリセロール　対　１５％グリセロール中で、−８０℃で凍結保存した細胞による、ＧＭ−ＣＳＦ、ＶＥＧＦおよびｂＦＧＦの分泌の比較を示す。この実験において使用されたケラチノサイト：線維芽細胞比は、１０％トロンビン（Ｔｉｓｓｅｅｌ、Ｂａｘｔｅｒ）および凍結防止剤と混合されて、１：１であった。凍結保存の前に、細胞を、トリプシンを用いて培養表面から剥離させ、続いて、８０Ｇｙのガンマ（γ）照射を用いて照射した。制御された速度の冷凍庫を使用して、細胞調製物を−８０℃に徐々に冷却した。１週間後に解凍した後、スプレー１回（１３０μｌ）の細胞調製物（１０００万細胞／ｍｌで１３０万細胞）を、２４ウェルのペトリ皿の単一ウェル中で、スプレー１回（１３０μｌ）のフィブリノゲンと共にスプレー混合した。
【０２６８】
結果は、同じ凍結防止剤濃度を含有するコントロールの新鮮な（非凍結）サンプルと比較した、１０％グリセロールを使用して−８０℃で１週間保存された４サンプルおよび１５％グリセロールを使用して−８０℃で１週間保存された４サンプルについての、２日目の間のＧＭ−ＣＳＦ、ＶＥＧＦおよびｂＦＧＦの分泌を示す。より高いタンパク質分泌の傾向は、１０％グリセロール中で維持されたサンプルに対して、１５％グリセロール中で保存されたサンプルにおいて観察された。分泌されたＧＭ−ＣＳＦおよびＶＥＧＦを、培養培地中に投与したが、ｂＦＧＦを、フィブリンマトリックス中に投与した。データを、平均±ＳＥＭとして示す（ｎ＝４）。
【０２６９】
（実施例１２：１５％グリセロール中での−８０℃での１週間の保存後の分泌対　１５％グリセロール＋５％ＨＳＡ中での−８０℃での１週間の保存後の分泌の比較）
図９は、１週間の期間にわたって、１５％グリセロール　対　１５％グリセロール＋５％ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）（Ｇｒｉｆｆｏｌｓ）中で−８０℃で凍結保存された細胞による、増殖因子分泌の比較を示す。この実験において使用されたケラチノサイト：線維芽細胞比は、１０％トロンビン（Ｔｉｓｓｅｅｌ、Ｂａｘｔｅｒ）および凍結防止剤と混合されて、１：３であった。凍結保存の前に、細胞を、トリプシンを用いて培養表面から剥離させ、続いて、８０Ｇｙのガンマ（γ）照射を用いて照射した。制御された速度の冷凍庫を使用して、細胞調製物を−８０℃に徐々に冷却した。１週間後に解凍した後、スプレー１回（１３０μｌ）の細胞調製物（１０００万細胞／ｍｌで１３０万細胞）を、２４ウェルのペトリ皿の単一ウェル中で、スプレー１回（１３０μｌ）のフィブリノゲンと共にスプレー混合した。結果は、同じ凍結防止剤濃度を含有するコントロールの新鮮な（非凍結）サンプルと比較した、１５％グリセロールを使用して−８０℃で１週間保存された３サンプルおよび１５％グリセロール＋５％ＨＳＡ（Ｇｒｉｆｆｏｌｓ）を使用して−８０℃で１週間保存された３サンプルについての、２日目の間のＧＭ−ＣＳＦ、ＶＥＧＦおよびｂＦＧＦの分泌を示す。分泌データは、ヒト血清アルブミンの添加が、より高いタンパク質分泌レベルを可能にすることによって、凍結産物処方を改善することを示す。データを、平均±ＳＥＭとして示す（ｎ＝４）。
【０２７０】
（実施例１３：−８０℃での長期保存後の、ケラチノサイトおよび線維芽細胞の混合物の生物活性）
図１０は、延長した期間にわたる−８０℃の温度での保存後の細胞調製物による、ヒトタンパク質ＧＭ−ＣＳＦおよびＶＥＧＦの分泌を詳述する。３つの別個の臨床的生成バッチからのデータを示す。１０×１０^６細胞／ｍｌの最終濃度で、１：１のケラチノサイトに対するヒト初代線維芽細胞の比を含有するバッチを、８０Ｇｙのガンマ（γ）照射を用いて照射し、そしてトロンビン、１５％グリセロールおよび５％ヒト血清アルブミンを含有する溶液中で凍結した。各々の生成バッチからのサンプルを、−８０℃での１、４、８および１２週間の保存後、解凍した。続いて、解凍したサンプルを、試験のために２４ウェルプレートにスプレーした。個々のウェルにおいて、細胞＋トロンビン＋凍結防止剤の単一スプレー（１３０μｌ）を、フィブリノゲンの単一スプレーと混合した。これら２つのスプレーの混合物は、生きた線維芽細胞およびケラチノサイトを含有するフィブリンポリマーマトリックスを作製した。このフィブリンマトリックス中に捕捉された細胞によるタンパク質分泌を、２日目の間（解凍の２４時間後から４８時間後まで続く期間）測定する。
【０２７１】
解凍された細胞調製物による培地中へのＧＭ−ＣＳＦおよびＶＥＧＦの分泌は、−８０℃での３ヶ月間続く保存期間を超えて、比較的安定なままである。ＧＭ−ＣＳＦの分泌における僅かな変化が、個々のバッチから観察されたが、バッチ内の分泌は、比較的安定であるようにみえた。分泌されたＶＥＧＦは、バッチからバッチを見て、および個々の生成バッチ内の両方で、平均して安定なようにみえる。このデータは、ＧＭ−ＣＳＦおよびＶＥＧＦの分泌に関して、この生成物が、少なくとも１２週間続く−８０℃での低温状態で安定であることを明らかにする。データを、平均±ＳＥＭとして示す。
【０２７２】
（実施例１４：異なるケラチノサイト：線維芽細胞比での−８０℃での１週間の保存後の分泌の比較）
図１１は、−８０℃での１週間の保存後の、凍結保存された細胞調製物処方物からの増殖因子の分泌を示す。このグラフは、種々のヒト初代ケラチノサイト：線維芽細胞比（１：０、１：１および１：９を含む）についての分泌の差異、ならびに５００万細胞／ｍｌ、１０００万細胞／ｍｌおよび２０００万細胞／ｍｌの総細胞濃度に関連する差異を示す。凍結保存の前に、細胞を、トリプシンを用いて培養表面から剥離させ、続いて、８０Ｇｙのガンマ（γ）照射を用いて照射した。制御された速度の冷凍庫を使用して、細胞調製物を−８０℃に徐々に冷却した。１週間後に解凍した後、スプレー１回（１３０μｌ）の細胞調製物（５００万細胞／ｍｌ、１０００万細胞／ｍｌおよび２０００万細胞／ｍｌ）を、２４ウェルのペトリ皿の単一ウェル中で、スプレー１回（１３０μｌ）のフィブリノゲンと共にスプレー混合した。
【０２７３】
１：０の比および１：１の比についての分泌データの比較は、ＧＭ−ＣＳＦおよびＶＥＧＦの生成に関して、ケラチノサイトに線維芽細胞を添加することの重要性を示した。全ての場合において、解凍後２日目の間の増殖因子の分泌との、細胞用量依存性の関連が存在した。データはまた、ケラチノサイトの数の減少（すなわち、ケラチノサイト：線維芽細胞比の１：９への減少）が、全体的な増殖因子分泌の減少を生じなかったことを実証した。これらの結果は、「新鮮な」（非凍結）細胞調製物について得られたデータ（実施例９、前出を参照のこと）に従い、そして、最小量のケラチノサイトのみが、ケラチノサイトと線維芽細胞とを一緒に混合することによって達成される相乗効果を生じるために必要であったことを示唆した。この研究はまた、線維芽細胞が細胞調製物によるＶＥＧＦの生成において重要な役割を果たすことを実証した。
【０２７４】
（実施例１５：新鮮なサンプルおよび−８０℃で凍結保存したサンプルにおける、増殖因子分泌の比較）
凍結保存の前に、細胞を、トリプシンを用いて培養表面から剥離させ、続いて、８０Ｇｙのガンマ（γ）照射を用いて照射した。試験した細胞濃度は、各々、１０％トロンビン（Ｔｉｓｓｅｅｌ、Ｂａｘｔｅｒ）および凍結防止剤と混合した、５００万細胞／ｍｌ、１０００万細胞／ｍｌおよび２０００細胞／ｍｌを含んだ（ケラチノサイト：線維芽細胞比＝１：１）。制御された速度の冷凍庫を使用して、細胞調製物を−８０℃に徐々に冷却した。１週間後に解凍した後、スプレー１回（１３０μｌ）の細胞調製物（５００万細胞／ｍｌ、１０００万細胞／ｍｌおよび２０００万細胞／ｍｌ）を、２４ウェルのペトリ皿の単一ウェル中で、スプレー１回（１３０μｌ）のフィブリノゲンと共にスプレー混合した。凍結（凍結保存）サンプルにおける生存率を評価するために、各条件について３個の別個のチューブを、−８０℃で１週間凍結保存した。解凍の際に、１チューブ当たり、５サンプルを作製した。表８に示したデータは、各条件について入手可能な１５サンプルの平均である。１条件当たり３つの凍結および解凍したチューブにおいて観察された、再現性のある分泌データは、凍結保存方法の質を証明する。新鮮な調製物について、３サンプルまたは４サンプルのいずれかを作製した。新たにトリプシン処理された細胞調製物および凍結細胞調製物の両方によるＧＭ−ＣＳＦおよびＶＥＧＦの分泌は、フィブリンマトリックス中の細胞密度が、２５０万〜５００万〜１０００万細胞／ｍｌ（元の凍結調製物中に見出される５００万細胞／ｍｌ、１０００万細胞／ｍｌおよび２０００万細胞／ｍｌに対応する）と増大するにつれて、増大することが観察された。このことは、細胞ベースの処置による用量治療効果の可能性をさらに示す。
【０２７５】
【表８】

（実施例１６：本発明の凍結細胞調製物の安全性の評価）
本発明の凍結創傷治癒細胞調製物の安全性は、多施設の、第Ｉ期公開研究において評価された。この細胞調製物は、２つの成分を備えるキットからなる。成分番号１は、フィブリノゲンの懸濁物であり、そして成分番号２は、トロンビンおよび凍結防止剤と混合されたケラチノサイトおよび線維芽細胞の懸濁物であった。細胞調製物を−８０℃で凍結し、診療場所へ−８０℃で出荷し、そして使用までその場所で−８０℃で保存した。使用の直前に、細胞調製物を加熱した水浴中で解凍した。解凍後、２つの成分（フィブリノゲン）および（細胞＋トロンビン＋凍結防止剤）を、創傷部位へ連続してスプレー適用し、生きたケラチノサイトおよび線維芽細胞を含有する薄いフィブリンマトリックスを形成した。包帯および少なくとも４週間（ランイン（ｒｕｎ−ｉｎ）期）の圧迫を用いる標準的な処置に応答しない、慢性の静脈性脚部潰瘍を有する１４人の患者は、Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ　ａｎｄ　Ｄｕｔｃｈ　Ａｎｔｉｌｌｅｓの５つのセンターに登録された。基準の潰瘍サイズは、０．３〜２０．４ｃｍ^２の範囲であった（平均５．８）。次いで、標準的な処置と付随して、細胞調製物を、１２週間までか、または潰瘍が完全に塞がるまで（どちらか最初に来た方）、毎週１回適用した。
【０２７６】
この細胞調製物に関して、深刻な有害事象は報告されなかった。４つの中程度に深刻な有害事象が、この細胞調製物に帰すると考えられた（潰瘍疼痛×３、増大した潰瘍サイズ×１）。さらに、創傷感染の臨床的徴候は存在しなかった。１２週での完全な塞がりは、１０人の患者で観察され、４週間以内が７人、そして処置の４週〜１２週内が３人であった。塞がりの平均時間は、５．４週であった。
【０２７７】
結果として、本発明の細胞調製物は、安全であり、かつ慢性の静脈性脚部潰瘍の処置について十分許容された。
【０２７８】
（実施例１７：生物学的に活性な創傷包帯としての、生きたケラチノサイトおよび線維芽細胞のスプレー適用）
皮膚に存在する初代線維芽細胞およびケラチノサイトは、天然には、皮膚障壁の遮断後の創傷治癒応答を刺激するように作用する、増殖因子およびサイトカインのカクテルを分泌する。この天然のプロセスを模倣するために、生きた細胞ベースの創傷包帯を、慢性の静脈性潰瘍の処置のために開発した。これは、以下の２つの成分からなる：１）フィブリノゲン溶液；ならびに２）トロンビンおよび凍結防止剤中のケラチノサイトおよび線維芽細胞の懸濁物。この製品は、使用まで−８０℃で凍結保存され、使用の時点で解凍され、これら２つの成分はスプレーアプリケータを使用して、創傷表面に連続的に適用される。この様式において、フィブリンの重合が創傷上で生じ、送達された細胞は、潰瘍部位でフィブリンの薄層中に捕捉される。
【０２７９】
同種の、増殖停止した初代ケラチノサイトおよび線維芽細胞の混合物は、使用される比に依存して、異なるレベルの治療的タンパク質（ＶＥＧＦ、ＨＧＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ｂＦＧＦおよびＫＧＦ）を分泌することが観察された。ＧＭ−ＣＳＦの分泌は、線維芽細胞およびケラチノサイトの相互の存在に由来する相乗効果に依存した。最終創傷包帯中の１．２５×１０^６細胞／ｍｌから５×１０^６細胞／ｍｌまでの細胞濃度の増大は、増殖因子およびサイトカインの分泌の上昇を導いた。予備実験は、−８０℃で保存した場合、少なくとも２ヶ月にわたって、細胞調製物が生物学的活性を維持することを示した。
【０２８０】
（他の実施形態）
本発明は、その詳細な説明と組み合わせて記載されてきたが、前記の説明が例示を意図するものであり、添付の特許請求の範囲によって規定される本発明の範囲を限定しないことが、理解されるべきである。他の局面、利点および改変は、前記の特許請求の範囲内である。
【０２８１】
本発明は、種々の型および種々の分化段階の、同種異系のヒト細胞株または系統の混合物によって発現される、脈管形成因子または他の増殖／サイトカイン因子の使用および組成物を提供する。血液の再補充のために皮膚または他の組織の創傷または欠損への一時的な適用の目的のために、非カプセル化調製物（細胞外マトリックス材料または生体適合性の合成物質と混合されるか、またはこれらに適用される）がまた提供され、この調製物は、器官特異的細胞が、器官完全性を再確立すること、および過剰な瘢痕形成を阻害することを可能にするために、結合組織を供給する。
【０２８２】
【発明の効果】
本発明により、創傷の型にも患者集団の性質にも構わずに使用され得る、広範でありかつ／または治癒しにくい創傷の治癒を増強するための、安全で、効果的で、相互作用性手段が提供される。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、γ線照射後、培養１５日後および３０日後のヒト初代線維芽細胞の、ＢｒｄＵ細胞の増殖分析の結果を示すヒストグラムである。
【図２】図２は、γ線照射処理後のペトリ皿へのヒト初代線維芽細胞の接着を示すヒストグラムである。
【図３】図３は、スプレーで塗布されたフィブリングルーマトリクスの形成のための、トロンビンおよびフィブリノゲンの最適な希釈についての試験の結果を示す表である。
【図４】図４は、異なる用量の細胞を２４ウェル培養皿の個々のウェルに噴霧した場合に、細胞マトリクスによって分泌された増殖因子の量を比較するヒストグラムである。この図はまた、細胞を含むフィブリンマトリクスが、フィブリノゲン＋細胞懸濁物およびトロンビン＋細胞懸濁物を一緒に単純にピペッティングすること（非噴霧投与）によって調製される場合の、増殖因子分泌量を示す。
【図５ａ】図５ａは、細胞の総数を一定に維持しながら、噴霧したケラチノサイトおよび線維芽細胞を異なる比で混合することによって、種々の増殖因子分泌特徴を生じることを実証するヒストグラムである。
【図５ｂ】図５ｂは、細胞の総数を一定に維持しながら、噴霧したケラチノサイトおよび線維芽細胞を異なる比で混合することによって、種々の増殖因子分泌特徴を生じることを実証するヒストグラムである。
【図６ａ】図６ａは、本発明の細胞調製物を送達および投与するために用いられる新規なバイアルの図である。図６ａは、バイアルの断面である。
【図６ｂ】図６ｂは、本発明の細胞調製物を送達および投与するために用いられる新規なバイアルの図である。図６ｂは、バイアルの外側の三次元図であり、これは、２ｍｌの成分という作業容積を保持するように設計される。
【図７】図７は、１０％グリセロール溶液を凍結防止剤として用いた場合、−１６０℃で１週間にわたって保存された細胞による増殖因子分泌を、−８０℃で１週間にわたって保存された細胞による増殖因子分泌に対して比較するヒストグラムである。
【図８】図８は、１０％グリセロール中で−８０℃で１週間にわたって保存された細胞による増殖因子分泌を、１５％グリセロール中で１週間にわたって保存された細胞による増殖因子分泌に対して比較するヒストグラムである。
【図９】図９は、１５％グリセロール中で−８０℃で１週間にわたって保存された細胞による増殖因子分泌を、１５％グリセロール＋５％　ＨＳＡ中で１週間にわたって保存された細胞による増殖因子分泌と比較するヒストグラムである。
【図１０】図１０は、ヒストグラムである。このヒストグラムは、−８０℃での１週間、４週間、８週間または１２週間のいずれかの保存の後に異なる生産で製造された細胞調製物による、増殖因子ＧＭ−ＣＳＦおよびＶＥＧＦの分泌を示す。この実験では、細胞調製物成分を、１５％グリセロール＋５％ヒト血清アルブミンを凍結防止剤として用いて凍結した。
【図１１】図１１は、−８０℃で１週間にわたって凍結保存した、凍結した細胞調製物による増殖因子分泌を示すヒストグラムである。種々のケラチノサイト：線維芽細胞比および細胞数についての結果を示す。

Claims

組織再生のための細胞調製物を調製するためのキットであって、該キットは、１つ以上の容器に以下：
ａ）細胞外マトリックスまたはマトリックス材料を含む、第１成分；および
ｂ）生物学的に活性な分子を分泌する１つ以上の細胞型を含む第２成分であって、該細胞型は、同種異系で、有糸分裂活性であるかまたは有糸分裂不活性であり、そして間質細胞、上皮／器官特異的細胞、および血液由来細胞からなる群から選択される、第２成分、
を含む、キット。
前記細胞型が、分化した線維芽細胞およびケラチノサイトである、請求項１に記載のキット。
前記細胞調製物が、ペーストの形態である、請求項１に記載のキット。
請求項１に記載のキットであって、前記生物学的に活性な分子が、少なくとも１つの脈管形成因子、少なくとも１つの増殖／サイトカイン因子、または少なくとも１つの脈管形成因子と少なくとも１つの増殖／サイトカイン因子との組み合わせである、キット。
請求項１に記載のキットであって、前記細胞外マトリックスまたはマトリックス材料が、フィブリン、フィブリングルー、フィブリノゲン、フィブリンビーズ、および他の合成ポリマー材料もしくは合成ポリマー骨格材料または創傷包帯材料からなる群から選択される、キット。
請求項１に記載のキットであって、前記細胞型が、マイトマイシンＣまたは他の化学物質ベースの有糸分裂インヒビターの投与、γ線の照射、Ｘ線の照射、またはＵＶ光の照射により、有糸分裂が不活性にされる、キット。
請求項１に記載のキットであって、前記細胞型が、アデノウイルスＥ１Ａ遺伝子の１２Ｓ産物および１３Ｓ産物、ｈＴＥＲＴ、ＳＶ４０スモールＴ抗原、ＳＶ４０ラージＴ抗原、パピローマウイルスＥ６およびＥ７、エプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）、エプスタイン−バー核抗原−２（ＥＢＮＡ２）、ヒトＴ細胞白血病ウイルス−１（ＨＴＬＶ−１）、ＨＴＬＶ−１類、Ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓ　ｓａｉｍｉｒｉ（ＨＶＳ）、変異体ｐ５３、ｍｙｃ、ｃ−ｊｕｎ、ｃ−ｒａｓ、ｃ−Ｈａ−ｒａｓ、ｈ−ｒａｓ、ｖ−ｓｒｃ、ｃ−ｆｇｒ、ｍｙｂ、ｃ−ｍｙｃ、ｎ−ｍｙｃ、ならびにＭｄｍ２からなる群から選択される、少なくとも１つの遺伝子／ポリペプチドを使用して不死化される、キット。
前記細胞型が、１つ以上の生物学的に活性な分子を天然で分泌する、請求項１に記載のキット。
請求項１に記載のキットであって、前記細胞型が、外因性レベルの、少なくとも１つの脈管形成因子、少なくとも１つの増殖／サイトカイン因子、または少なくとも１つの脈管形成因子と少なくとも１つの増殖／サイトカイン因子との組み合わせを分泌するように遺伝子操作される、キット。
請求項９に記載のキットであって、前記少なくとも１つの脈管形成因子、少なくとも１つの増殖／サイトカイン因子、または少なくとも１つの脈管形成増殖因子と少なくとも１つの増殖／サイトカイン因子との組み合わせの分泌が、遺伝子スイッチによって制御される、キット。
請求項９に記載のキットであって、前記少なくとも１つの脈管形成因子、少なくとも１つの増殖／サイトカイン因子、または少なくとも１つの脈管形成増殖因子と少なくとも１つの増殖／サイトカイン因子との組み合わせが、構成的に分泌される、キット。
前記第１成分が、フィブリノゲンを含む、請求項１に記載のキット。
前記第２成分が、約１×１０^３細胞／μｌ〜約５０×１０^３細胞／μｌを含む、請求項１２に記載のキット。
前記第２成分が、トロンビンをさらに含む、請求項１３に記載のキット。
前記第２成分が、必要に応じて、凍結防止剤をさらに含む、請求項１４に記載のキット。
前記凍結防止剤が、グリセロールである、請求項１５に記載のキット。
請求項１に記載のキットであって、前記第１成分が、フィブリノゲンを含み、そして前記第２成分が、約１×１０^３細胞／μｌ〜約５０×１０^３細胞／μｌおよびトロンビンを含む、キット。
前記第２成分が、必要に応じて、凍結防止剤をさらに含む、請求項１７に記載のキット。
請求項１８に記載のキットであって、前記凍結防止剤が、１０％のグリセロール溶液、１５％のグリセロール溶液、および１５％のグリセロールと５％のヒト血清アルブミンとの溶液からなる群から選択される、キット。
組織再生のための細胞調製物を調製するために請求項１に記載のキットを使用する方法であって、該方法は、以下：
ａ）処置の必要な患者の創傷部位に前記第１成分を投与する工程；および
ｂ）該創傷部位において前記第２成分を該第１成分と合わせる工程であって、該第１成分と該第２成分とを合わせることにより、組織再生に適した細胞調製物を形成する工程、
を包含する、方法。
前記細胞型が、分化した線維芽細胞およびケラチノサイトである、請求項２０に記載の方法。
前記細胞調製物が、ペーストの形態である、請求項２０に記載の方法。
請求項２０に記載の方法であって、前記生物学的に活性な分子が、少なくとも１つの脈管形成因子、少なくとも１つの増殖／サイトカイン因子、または少なくとも１つの脈管形成因子と少なくとも１つの増殖／サイトカイン因子との組み合わせである、方法。
請求項２０に記載の方法であって、前記細胞外マトリックスまたはマトリックス材料が、フィブリン、フィブリングルー、フィブリノゲン、フィブリンビーズ、および他の合成ポリマー材料もしくは合成ポリマー骨格材料または創傷包帯材料からなる群から選択される、方法。
請求項２０に記載の方法であって、前記細胞型が、マイトマイシンＣまたは他の化学物質ベースの有糸分裂インヒビターの投与、γ線の照射、Ｘ線の照射、またはＵＶ光の照射により、有糸分裂が不活性にされる、方法。
請求項２０に記載の方法であって、前記細胞型が、アデノウイルスＥ１Ａ遺伝子の１２Ｓ産物および１３Ｓ産物、ｈＴＥＲＴ、ＳＶ４０スモールＴ抗原、ＳＶ４０ラージＴ抗原、パピローマウイルスＥ６およびＥ７、エプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）、エプスタイン−バー核抗原−２（ＥＢＮＡ２）、ヒトＴ細胞白血病ウイルス−１（ＨＴＬＶ−１）、ＨＴＬＶ−１類、Ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓ　ｓａｉｍｉｒｉ（ＨＶＳ）、変異体ｐ５３、ｍｙｃ、ｃ−ｊｕｎ、ｃ−ｒａｓ、ｃ−Ｈａ−ｒａｓ、ｈ−ｒａｓ、ｖ−ｓｒｃ、ｃ−ｆｇｒ、ｍｙｂ、ｃ−ｍｙｃ、ｎ−ｍｙｃ、ならびにＭｄｍ２からなる群から選択される、少なくとも１つの遺伝子／ポリペプチドを使用して不死化される、方法。
前記細胞型が、１つ以上の生物学的に活性な分子を天然で分泌する、請求項２０に記載の方法。
請求項２０に記載の方法であって、前記細胞型が、外因性レベルの、少なくとも１つの脈管形成因子、少なくとも１つの増殖／サイトカイン因子、または少なくとも１つの脈管形成因子と少なくとも１つの増殖／サイトカイン因子との組み合わせを分泌するように遺伝子操作される、方法。
請求項２８に記載の方法であって、前記少なくとも１つの脈管形成因子、少なくとも１つの増殖／サイトカイン因子、または少なくとも１つの脈管形成増殖因子と少なくとも１つの増殖／サイトカイン因子との組み合わせの分泌が、遺伝子スイッチによって制御される、方法。
請求項２８に記載の方法であって、前記少なくとも１つの脈管形成因子、少なくとも１つの増殖／サイトカイン因子、または少なくとも１つの脈管形成増殖因子と少なくとも１つの増殖／サイトカイン因子との組み合わせが、構成的に分泌される、方法。
請求項２０に記載の方法であって、前記第１成分が、フィブリノゲンを含み、そして前記第２成分が、約１×１０^３細胞／μｌ〜約５０×１０^３細胞／μｌおよびトロンビンを含む、方法。
前記第２成分が、必要に応じて、凍結防止剤をさらに含む、請求項３１に記載の方法。
請求項３２に記載の方法であって、前記凍結防止剤が、１０％のグリセロール溶液、１５％のグリセロール溶液、および１５％のグリセロールと５％のヒト血清アルブミンとの溶液からなる群から選択される、方法。
前記第１成分および前記第２成分が、前記患者の創傷部位に局所的に投与される、請求項２０に記載の方法。
前記第１成分および前記第２成分が、前記患者の創傷部位上にスプレーされる、請求項２０に記載の方法。
前記第１成分および前記第２成分が、前記創傷部位上で合わされる、請求項３５に記載の方法。
前記第１成分および前記第２成分が、前記創傷部に到達される前に合わされる、請求項３５に記載の方法。
組織再生のための細胞調製物を処置の必要な患者の創傷部位に投与する方法であって、該方法は、以下：
ａ）フィブリノゲンを含む細胞外マトリックスまたはマトリックス材料を含む第１成分を提供する工程；
ｂ）約１×１０^３細胞／μｌ〜約５０×１０^３細胞／μｌおよびトロンビンを含む第２成分を提供する工程であって、該細胞が、１つ以上の生物学的に活性な分子を分泌し、同種異系で有糸分裂不活性であり、そして間質細胞、上皮／器官特異的細胞、および血液由来細胞からなる群からなる群から選択される、工程；
ｃ）該第１成分と該第２成分とを合わせることにより、組織再生に適した細胞調製物を形成する工程；ならびに
ｄ）該細胞調製物を該創傷部位に投与する工程、
を包含する、方法。
前記第１成分および前記第２成分が、前記創傷部に局所的に投与される、請求項３８に記載の方法。
前記第２成分が前記創傷部位に適用される前に、前記第１成分が、該創傷部に適用される、請求項３８に記載の方法。
前記第１成分が、前記創傷部位に適用される前に、前記第２成分が、該創傷部に適用される、請求項３８に記載の方法。
前記細胞が、分化したまたは分化していない、線維芽細胞およびケラチノサイトである、請求項３８に記載の方法。
前記細胞調製物が、ペーストの形態である、請求項３８に記載の方法。
請求項３８に記載の方法であって、前記生物学的に活性な分子が、少なくとも１つの脈管形成因子、少なくとも１つの増殖／サイトカイン因子、または少なくとも１つの脈管形成因子と少なくとも１つの増殖／サイトカイン因子との組み合わせである、方法。
請求項３８に記載の方法であって、前記細胞外マトリックスまたはマトリックス材料が、フィブリン、フィブリングルー、フィブリノゲン、フィブリンビーズ、および他の合成ポリマー材料もしくは合成ポリマー骨格材料または創傷包帯材料からなる群から選択される、方法。
請求項３８に記載の方法であって、前記細胞型が、マイトマイシンＣまたは他の化学物質ベースの有糸分裂インヒビターの投与、γ線の照射、Ｘ線の照射、またはＵＶ光の照射により、有糸分裂が不活性にされる、方法。
請求項３８に記載の方法であって、前記細胞型が、アデノウイルスＥ１Ａ遺伝子の１２Ｓ産物および１３Ｓ産物、ｈＴＥＲＴ、ＳＶ４０スモールＴ抗原、ＳＶ４０ラージＴ抗原、パピローマウイルスＥ６およびＥ７、エプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）、エプスタイン−バー核抗原−２（ＥＢＮＡ２）、ヒトＴ細胞白血病ウイルス−１（ＨＴＬＶ−１）、ＨＴＬＶ−１類、Ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓ　ｓａｉｍｉｒｉ（ＨＶＳ）、変異体ｐ５３、ｍｙｃ、ｃ−ｊｕｎ、ｃ−ｒａｓ、ｃ−Ｈａ−ｒａｓ、ｈ−ｒａｓ、ｖ−ｓｒｃ、ｃ−ｆｇｒ、ｍｙｂ、ｃ−ｍｙｃ、ｎ−ｍｙｃ、ならびにＭｄｍ２からなる群から選択される、少なくとも１つの遺伝子／ポリペプチドを使用して不死化される、方法。
前記細胞型が、１つ以上の生物学的に活性な分子を天然で分泌する、請求項３８に記載の方法。
請求項３８に記載の方法であって、前記細胞型が、外因性レベルの、少なくとも１つの脈管形成因子、少なくとも１つの増殖／サイトカイン因子、または少なくとも１つの脈管形成因子と少なくとも１つの増殖／サイトカイン因子との組み合わせを分泌するように遺伝子操作される、方法。
請求項４９に記載の方法であって、前記少なくとも１つの脈管形成因子、少なくとも１つの増殖／サイトカイン因子、または少なくとも１つの脈管形成増殖因子と少なくとも１つの増殖／サイトカイン因子との組み合わせの分泌が、遺伝子スイッチによって制御される、方法。
請求項４９に記載の方法であって、前記少なくとも１つの脈管形成因子、少なくとも１つの増殖／サイトカイン因子、または少なくとも１つの脈管形成増殖因子と少なくとも１つの増殖／サイトカイン因子との組み合わせが、構成的に分泌される、方法。
前記第２成分が、必要に応じて、凍結防止剤をさらに含む、請求項３８に記載の方法。
請求項５２に記載の方法であって、前記凍結防止剤が、１０％のグリセロール溶液、１５％のグリセロール溶液、および１５％のグリセロールと５％のヒト血清アルブミンとの溶液からなる群から選択される、方法。
前記第１成分および前記第２成分が、前記創傷部位上にスプレーされる、請求項３８に記載の方法。
前記第２成分が前記創傷部上にスプレーされる前に、前記第１成分が、該創傷部位に適用される、請求項５４に記載の方法。
前記スプレーされた第１成分および第２成分が、前記創傷部位上で合わされる、請求項５４に記載の方法。
前記スプレーされた第１成分および第２成分が、前記創傷部位に到達される前に合わされる、請求項５４に記載の方法。
組織再生のための細胞調製物であって、以下：
ａ）混合されたフィブリノゲンを含む細胞外マトリックスまたはマトリックス材料を含む第１成分；ならびに
ｂ）創傷部位への約１×１０^３細胞／μｌ〜約５０×１０^３細胞／μｌおよびトロンビンを含む第２成分であって、該細胞が、１つ以上の生物学的に活性な分子を分泌し、同種異系で、有糸分裂活性であるかまたは有糸分裂不活性であり、そして間質細胞、上皮／器官特異的細胞、および血液由来細胞からなる群からなる群から選択される、第２成分、
を含む、細胞調製物。
前記細胞型が、分化した線維芽細胞およびケラチノサイトである、請求項５８に記載の細胞調製物。
前記細胞調製物が、ペーストの形態である、請求項５８に記載の細胞調製物。
請求項５８に記載の細胞調製物であって、前記生物学的に活性な分子が、少なくとも１つの脈管形成因子、少なくとも１つの増殖／サイトカイン因子、または少なくとも１つの脈管形成因子と少なくとも１つの増殖／サイトカイン因子との組み合わせである、細胞調製物。
請求項５８に記載の細胞調製物であって、前記細胞型が、マイトマイシンＣまたは他の化学物質ベースの有糸分裂インヒビターの投与、γ線の照射、Ｘ線の照射、またはＵＶ光の照射により、有糸分裂が不活性にされる、細胞調製物。
請求項５８に記載の細胞調製物であって、前記細胞型が、アデノウイルスＥ１Ａ遺伝子の１２Ｓ産物および１３Ｓ産物、ｈＴＥＲＴ、ＳＶ４０スモールＴ抗原、ＳＶ４０ラージＴ抗原、パピローマウイルスＥ６およびＥ７、エプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）、エプスタイン−バー核抗原−２（ＥＢＮＡ２）、ヒトＴ細胞白血病ウイルス−１（ＨＴＬＶ−１）、ＨＴＬＶ−１類、Ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓ　ｓａｉｍｉｒｉ（ＨＶＳ）、変異体ｐ５３、ｍｙｃ、ｃ−ｊｕｎ、ｃ−ｒａｓ、ｃ−Ｈａ−ｒａｓ、ｈ−ｒａｓ、ｖ−ｓｒｃ、ｃ−ｆｇｒ、ｍｙｂ、ｃ−ｍｙｃ、ｎ−ｍｙｃ、ならびにＭｄｍ２からなる群から選択される、少なくとも１つの遺伝子／ポリペプチドを使用して不死化される、細胞調製物。
前記細胞型が、１つ以上の生物学的に活性な分子を天然で分泌する、請求項５８に記載の細胞調製物。
請求項５８に記載の細胞調製物であって、前記細胞型が、外因性レベルの、少なくとも１つの脈管形成因子、少なくとも１つの増殖／サイトカイン因子、または少なくとも１つの脈管形成因子と少なくとも１つの増殖／サイトカイン因子との組み合わせを分泌するように遺伝子操作される、細胞調製物。
請求項６５に記載の細胞調製物であって、前記少なくとも１つの脈管形成因子、少なくとも１つの増殖／サイトカイン因子、または少なくとも１つの脈管形成増殖因子と少なくとも１つの増殖／サイトカイン因子との組み合わせの分泌が、遺伝子スイッチによって制御される、細胞調製物。
請求項６５に記載の細胞調製物であって、前記少なくとも１つの脈管形成因子、少なくとも１つの増殖／サイトカイン因子、または少なくとも１つの脈管形成増殖因子と少なくとも１つの増殖／サイトカイン因子との組み合わせが、構成的に分泌される、細胞調製物。
前記第２成分が、必要に応じて、凍結防止剤をさらに含む、請求項５８に記載の細胞調製物。
請求項６８に記載の細胞調製物であって、前記凍結防止剤が、１０％のグリセロール溶液、１５％のグリセロール溶液、および１５％のグリセロールと５％のヒト血清アルブミンとの溶液からなる群から選択される、細胞調製物。
請求項５８に記載の細胞調製物を使用する方法であって、該方法は、以下：
ａ）前記第１成分を提供する工程；
ｂ）前記第２成分を提供する工程；
ｃ）組織再生に適した細胞調製物を形成するために、該第１成分と該第２成分とを合わせる工程；および
ｄ）該細胞調製物を創傷部位に投与する工程、
を包含する、方法。
前記細胞型が、分化した線維芽細胞およびケラチノサイトである、請求項７０に記載の方法。
前記細胞調製物が、ペーストの形態である、請求項７０に記載の方法。
請求項７０に記載の方法であって、前記生物学的に活性な分子が、少なくとも１つの脈管形成因子、少なくとも１つの増殖／サイトカイン因子、または少なくとも１つの脈管形成因子と少なくとも１つの増殖／サイトカイン因子との組み合わせである、方法。
請求項７０に記載の方法であって、前記細胞型が、マイトマイシンＣまたは他の化学物質ベースの有糸分裂インヒビターの投与、γ線の照射、Ｘ線の照射、またはＵＶ光の照射により、有糸分裂が不活性にされる、方法。
請求項７０に記載の方法であって、前記細胞型が、アデノウイルスＥ１Ａ遺伝子の１２Ｓ産物および１３Ｓ産物、ｈＴＥＲＴ、ＳＶ４０スモールＴ抗原、ＳＶ４０ラージＴ抗原、パピローマウイルスＥ６およびＥ７、エプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）、エプスタイン−バー核抗原−２（ＥＢＮＡ２）、ヒトＴ細胞白血病ウイルス−１（ＨＴＬＶ−１）、ＨＴＬＶ−１類、Ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓ　ｓａｉｍｉｒｉ（ＨＶＳ）、変異体ｐ５３、ｍｙｃ、ｃ−ｊｕｎ、ｃ−ｒａｓ、ｃ−Ｈａ−ｒａｓ、ｈ−ｒａｓ、ｖ−ｓｒｃ、ｃ−ｆｇｒ、ｍｙｂ、ｃ−ｍｙｃ、ｎ−ｍｙｃ、ならびにＭｄｍ２からなる群から選択される、少なくとも１つの遺伝子／ポリペプチドを使用して不死化される、方法。
前記細胞型が、１つ以上の生物学的に活性な分子を天然で分泌する、請求項７０に記載の方法。
請求項７０に記載の方法であって、前記細胞型が、外因性レベルの、少なくとも１つの脈管形成因子、少なくとも１つの増殖／サイトカイン因子、または少なくとも１つの脈管形成因子と少なくとも１つの増殖／サイトカイン因子との組み合わせを分泌するように遺伝子操作される、方法。
請求項７７に記載の方法であって、前記少なくとも１つの脈管形成因子、少なくとも１つの増殖／サイトカイン因子、または少なくとも１つの脈管形成増殖因子と少なくとも１つの増殖／サイトカイン因子との組み合わせの分泌が、遺伝子スイッチによって制御される、方法。
請求項７７に記載の方法であって、前記少なくとも１つの脈管形成因子、少なくとも１つの増殖／サイトカイン因子、または少なくとも１つの脈管形成増殖因子と少なくとも１つの増殖／サイトカイン因子との組み合わせが、構成的に分泌される、方法。
前記第２成分が、必要に応じて、凍結防止剤をさらに含む、請求項７０に記載の方法。
請求項８０に記載の方法であって、前記凍結防止剤が、１０％のグリセロール溶液、１５％のグリセロール溶液、および１５％のグリセロールと５％のヒト血清アルブミンとの溶液からなる群から選択される、方法。
前記第１成分および前記第２成分が、前記患者の創傷部位に局所的に投与される、請求項７０に記載の方法。
前記第１成分および前記第２成分が、前記患者の創傷部位上にスプレーされる、請求項７０に記載の方法。
前記第１成分および前記第２成分が、前記創傷部位上で合わされる、請求項８３に記載の方法。
前記第１成分および前記第２成分が、前記創傷部位に到達される前に合わされる、請求項８３に記載の方法。
前記第１成分および前記第２成分が、出荷される前に凍結保存され、そして続いて使用前に解凍される、請求項１に記載のキット。
請求項８６に記載のキットであって、前記第１成分および前記第２成分が、取り外し可能なねじ口を有する別個のバイアルに各々含まれ、該バイアルは、滅菌されそして低温に耐える材料から作製され、そして取り外し可能な蓋は、スプレーポンプと交換され、続いて使用前に該第１成分および第２成分が解凍され得る、
キット。
前記スプレーポンプが、１回のスプレーに付き約１３０μｌの容積を送達する、請求項８７に記載のキット。
前記低温に耐える材料が、ガラス、ポリプロピレン、ポリエチレン、およびエチレンビニルアセテート（ＥＶＡ）からなる群から選択される、請求項８６に記載のキット。
請求項８７に記載のキットであって、前記バイアルが、凍結保存前にポーチまたは容器内に密封され、該ポーチまたは容器は、−８０℃〜−１９６℃の範囲の温度に耐え得る材料から製造され、そして該ポーチまたは容器は、凍結保存および続く解凍の間、前記第１成分および前記第２成分を汚染から保護する、キット。
前記ポーチまたは容器が、防水性であり、そして高バリア性能を有する請求項９０に記載のキット。