CN106540246B - 成纤维细胞疫苗及其制备方法和用途 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及成纤维细胞疫苗及其制备方法和用途。本发明要解决的技术问题是为治疗器官纤维化提供一种新选择。本发明的技术方案是灭活的成纤维细胞疫苗，其主要活性成分为碱性成纤维生长因子(bFGF)激活的成纤维细胞。本发明还提供了所述成纤维细胞疫苗的制备方法，包括如下步骤：1)原代成纤维细胞的获取；2)bFGF刺激成纤维细胞；3)辐照灭活，冻存。前述所有操作均在无菌条件下完成。本发明的成纤维细胞疫苗具有免疫活性强、临床安全性高等优点，是一种优秀的针对器官纤维化的细胞疫苗。

Description

成纤维细胞疫苗及其制备方法和用途

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及成纤维细胞疫苗及其制备方法和用途。

背景技术

虽然不同的器官纤维化的发生机制有差别，但具有很多共性。总的来说是以各种原因引起的实质细胞损伤为起点，实质细胞变性坏死，激活相应的巨噬细胞(前炎症细胞)，释放多种细胞因子和生长因子，后者激活静息状态的细胞外基质产生细胞，使之转化为成纤维细胞合成大量的胶原等细胞外基质成分，同时细胞外基质降解减少，导致器官组织内大量细胞外基质沉积，引起器官纤维化。

在纤维化过程中，成纤维细胞是最主要的细胞外基质产生细胞。(如肝星状细胞、肾间质成纤维细胞、肺成纤维细胞、心脏成纤维细胞等都是相应器官纤维化的细胞外基质主要来源细胞)。正常是细胞外基质产生细胞处于静息状态，其代谢和功能不活跃。但在纤维化的情况下，成纤维细胞活化，表现为细胞形态发生改变，明显增殖、分泌细胞因子、合成大量细胞外基质和产生蛋白降解酶等功能。活化是纤维化形成的关键步骤和核心环节。

碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)作为一种细胞丝裂原和促血管生长因子，在许多肿瘤的生长中及与异常新生血管相关的疾病，包括牛皮癣、黄斑变性等起重要的作用。在超过90％的上皮来源肿瘤中的成纤维细胞，被证明高表达bFGF。

一般认为，晚期的实质器官纤维化是不可逆的，临床的治疗手段及治疗效果有限。以肺纤维化为例，临床多采用激素或免疫抑制剂的抗炎治疗，但效果非常有限，副作用较大。阻断纤维化过程中重要的活化的成纤维细胞的生长及增殖的细胞疫苗将给器官纤维化的治疗带来一个全新的治疗方式，它侧重于病情发生发展的根本，而不仅仅控制发病的症状，是一种极具发展潜力的治疗方式。

发明内容

本发明要解决的技术问题是为治疗器官纤维化提供一种新选择。

本发明的技术方案是成纤维细胞疫苗，其主要活性成分为灭活的碱性成纤维生长因子激活的成纤维细胞。

具体的，所述的疫苗中成纤维细胞的剂量为1～10×10⁵个细胞。

本发明还提供了所述成纤维细胞疫苗的制备方法，包括如下步骤：1)获取原代成纤维细胞；2)在含有bFGF的培养基中刺激培养成纤维细胞；3)辐照灭活，保存。前述3个步骤的操作均在无菌条件下完成。所述保存可采用冻存的方式。

其中，步骤1)的具体步骤如下：取小鼠背部及腹部的皮肤，PBS漂洗，Ⅰ型胶原酶消化，收集成纤维细胞。

具体的，步骤1)的操作如下：切取小鼠背部及腹部的皮肤，置于含有100μg/ml庆大霉素和25μg/ml二性霉素B的PBS中，反复经过PBS漂洗后，剪弃脂肪和结缔组织；将皮肤剪成1mm³左右的小块，加入含有1mg/mlⅠ型胶原酶的DMEM中，37℃孵育2～3小时，800g离心3min收集成纤维细胞。

其中，步骤2)中含人bFGF的培养基中bFGF的浓度为50～500ng/ml。

其中，步骤2)的具体步骤如下：用含有15％胎牛血清的DMEM调定成纤维细胞密度为2～4×10⁵/毫升，37℃、5％CO₂、90％湿度条件下培养，当培养的成纤维细胞长成单层以1/2～4的比例传代，并加入重组人bFGF，置于37℃、5％CO₂、90％湿度条件下培养，传代3次后，消化细胞，离心，弃上清后，将细胞浓度调制6×10⁶/ml；每次传代时都加入重组人bFGF。

具体的，步骤2)的具体操作如下：用含有15％胎牛血清的DMEM调定成纤维细胞密度以每毫升2～4×10⁵细胞接种于75cm²培养瓶，37℃、5％CO₂、90％湿度条件下培养；当培养的成纤维细胞长成单层后，用无钙镁离子的PBS漂洗1次，加入含有0.25％胰酶和0.02％EDTA的PBS消化液消化2～3min；加入含有15％胎牛血清的DMEM培养基吹打终止消化，以1/2～4的比例传代，并加入50～500ng/ml的重组人bFGF，置于37C、5％CO₂、90％湿度条件下培养；当传代3次后的成纤维细胞生长至培养瓶70～80％，单层，即按上述步骤消化细胞，离心，弃上清后，将细胞浓度调制6×10⁶/ml，备用。

其中，步骤3)所述的灭活采用辐照方式。

具体的，所述的辐照即对制备成纤维细胞疫苗胞使用10～100Gy的X射线辐照。

本发明还提供了所述的成纤维细胞疫苗在制备抗器官纤维化药物中的用途。

所述的成纤维细胞疫苗在制备抗肝纤维化、肺纤维化或肾纤维化药物中的用途。

本发明还提供了所述成纤维细胞疫苗的制备方法在制备抗器官纤维化药物中的用途。

本发明中的灭活，是指使成纤维细胞失去增殖的能力，但是可以保持生存状态。

本发明中的激活，是指使成纤维细胞经人bFGF刺激后，提高表达成纤维细胞激活蛋白FAP和α平滑肌肌动蛋白alpha-SMA的能力。

本发明中，为了构建好的成纤维细胞疫苗，检测了多个bFGF刺激的浓度，结果发现，50～500ng/ml的bFGF可以有效地激活成纤维细胞，使成纤维细胞表达成纤维细胞激活蛋白FAP和α平滑肌肌动蛋白alpha-SMA。本发明又对不同剂量的X射线进行了筛选，发现使用10～100Gy的X射线辐照能使成纤维细胞失去增殖的能力，并保持生存状态。

本领域技术人员容易理解，上述步骤2)中所述的培养是指含有满足正常成纤维细胞生长所需物质的培养基如DMEM培养基等常规的细胞培养基)对细胞进行培养。加入bFGF共同培养时间根据细胞具体的生长情况和需要使用的具体数量确定即可。培养基只要是适合细胞生长，并不只限于本发明实施例所涉及的培养基种类。

本发明的有益效果：本发明中，在前期使用小鼠的成纤维细胞做为疫苗治疗纤维化时发现，成纤维细胞疫苗能够有效地抑制小鼠肝纤维化和肺纤维化的发展，该疫苗能够有效地诱导针对纤维化形成的免疫反应。这种疫苗具有很多优点，首先它取材方便，来源广泛，从小鼠身体上取下1平方厘米的皮肤即可培养供30到50只小鼠使用的成纤维细胞疫苗；其次，它来自于受体本身，具有很好的安全性，不会存在严重的不良反应；最后，这种疫苗制备简单，成本低廉，使用方便，具有很好的可推广性。本发明的成纤维细胞疫苗的制备方法是在大量的筛选的基础上得到的，具有免疫活性强、临床安全性高等优点，是一种优秀的针对纤维化的成纤维细胞疫苗。本发明的成纤维细胞疫苗具有很好的免疫效果和抗炎症效果，为疫苗的开发和应用提供了新的选择。本发明技术简单易行，可行性强，具有广阔的应用前景。

附图说明

图1、本发明疫苗对肝纤维化的免疫效果；上两张图为CCl4模型组和治疗组(MF免疫组，即鼠成纤维细胞疫苗免疫组，以下相同)肝组织的HE染色，下两张分别为同时间点各组肝组织Masson染色照相。分别反映检测各组小鼠肝脏病理损伤及纤维化程度。与成纤维细胞免疫组小鼠的肝组织比较，CCl4模型组小鼠鼠的肝脏体积均不规则缩小，表面不光滑，边缘呈波浪状，可见小结节状增生。HE染色镜下观察发现模型组小鼠肝脏组织内肝小叶结构破坏明显，肝细胞颗粒变性，有点状坏死，失去肝索的正常排序，肝内血管扩张，间质内可见大量淋巴细胞浸润，汇管区纤维增生，肝内有纤维间隔形成并分割包绕排列紊乱的肝细胞，即假小叶(图1)。经成纤维细胞疫苗组治疗组的小鼠的肝脏均小叶结构基本完整，肝细胞排列整齐，无明显变性坏死，肝组织淋巴细胞浸润较少。该研究结果说明成纤维细胞免疫能能减少CCl4引起的肝组织内淋巴细胞浸润及肝组织结构的破坏，降低肝组织的脂肪变性和肝小叶中心坏死的程度，减轻了反复注射CCl4引起的肝纤维化的形成与发展。

图2、本发明疫苗对化疗药物所致肺纤维化的治疗；上两图为模型组(照射组)和治疗组(MF免疫组)肺组织的HE染色，下两张分别为同时间点各组肝组织Masson染色照相。分别反映检测各组小鼠肺病理损伤及纤维化程度。HE染色显示：模型组小鼠的肺组织以渗出及纤维化为主要病变,表现为肺间质及肺泡壁毛细血管扩张充血,间质水肿致肺泡壁轻度增厚,伴有炎症细胞的浸润。与之相比，MF组(治疗组)小鼠肺组织部分仍保持肺泡壁纤细,毛细血管完整,无渗出和出血，结构清晰。

图3、本发明疫苗对射线所致肺纤维化的治疗；上两张图为模型组(照射组)和治疗组(MF免疫组)肺组织的HE染色，下两张分别为同时间点各组肺组织Masson染色照相。分别反映检测各组小鼠肺病理损伤及纤维化程度。照射后8周小鼠肺泡壁中度-重度增厚,肺泡腔变小或者消失,壁内成纤维细胞、巨噬细胞和毛细血管数目增多。伴有肺间质内成纤维细胞增多。与之相比，MF组(治疗组)组小鼠肺组织结构基本接近正常,肺泡壁薄,有少部分肺泡壁有增厚，毛细血管壁完整,偶有炎细胞渗出,肺泡腔内有少许渗出，基本未见出血。Masson染色显示，模型组(照射组)小鼠在8周时肺间质胶原胶原纤维增多明显,多位于小支气管外膜、血管外膜等部位。可见大片的亮蓝色区域,为大量胶原纤维增生的纤维化病灶。MF组小鼠肺组织Masson染色无明显变化；镜下可见较少的亮蓝染色胶原,且分布正常(气道及血管外膜)。与之对应，肺泡间隔比值提示，MF组显示了较模型组低的比值，提示肺泡间隔增厚减轻。

具体实施方式

实施例1制备成纤维细胞疫苗：

1、成纤维细胞的制备

1)所需物品的准备

①实验的前一天准备好一个手术包、高压消毒、烘干备用；

②用分析纯的无水乙醇配制75％的乙醇；

③胶原酶消化液的准备：称取80mg I型胶原酶(sigma)至50ml BD管内(2个BD管，每管装I型胶原酶40mg)，用双无的DMEM(HyClone)培养液溶解(I型胶原酶的终浓度为1mg/ml)，颠倒BD管使胶原酶充分溶解后，用孔径为0.22um的滤器(Millipore)过滤至已高压灭菌的500ml的瓶子内(配细胞培养液所用的瓶子)；

④取2个无菌的细胞培养皿，用孔径为0.22μm的滤器(过滤适量的生理盐水至培养皿内(每个培养皿30-40ml)备用。

2)成纤维细胞的分离

①取2-3周龄的BABL/C一只(北京华阜康生物科技股份有限公司)，用眼科剪尽量剪去鼠毛，断颈处死，用75％的乙醇浸泡5-10分钟后，转移至无菌的细胞培养皿的盖子内，用眼科剪及小镊子轻轻的将小鼠背部及腹部的皮肤剥离，将剥离的皮肤转移至一装有生理盐水的培养皿内，尽量用剪刀及镊子除尽小鼠皮肤表面的脂肪、筋膜等，然后将处理好的皮肤转移至另一个装生理盐水的培养皿内，进一步洗涤去除乙醇、鼠毛等；

②将处理好的小鼠皮肤转移至无菌的培养皿中，加入3-5ml的消化液，用剪刀将皮肤组织剪碎，剪的越碎越好(在剪的过程中，应使皮肤组织始终处于消化液中)；

③将剪好的组织样品转移至装消化液的瓶子内，用移液枪轻轻的将样品吹打散，将瓶子放在细胞培养箱内进行消化2h，在消化的过程中，每隔30min用移液枪轻轻的吹打样品几次[注：移液枪应伸至液面下进行吹打，吹打的过程应避免吹打起泡]；

④待消化至1.5h后，取适量消化样品至培养皿内，在显微镜下观察样品的消化情况，如观察到皮肤组织块蓬松、有细胞从其表面脱离、或见一串一串的细胞，则可终止消化或最多再消化10-15min；

⑤将消化好的样品转移至BD管内，离心：1000rpm，5min或1500rpm,3min，用双无的DMEM培养液轻轻的吹打、洗涤离心好的样品，重复洗涤两次；

⑥加适量DMEM培养液至处理好的样品中，轻轻的吹打混匀，转移至一次性培养瓶内培养，每个培养瓶所加培养液为20ml；

⑦待培养48-72h后换液；

⑧细胞长满后进行传代，必要时换液。

⑨100ng/ml人重组bFGF(美国R&D公司)刺激培养分离后的成纤维细胞。

⑩刺激后的成纤维细胞使用20～100Gy的X射线辐照。

2、成纤维细胞的质量控制

①对规模生产的细胞按照国家药物检验检测标准进行如下方面的检测：

②微生物污染控制标准：细菌、霉菌、支原体污染控制；热源检测：类毒素。

③细胞数量标准：细胞总数量以及各种表型组分细胞的数量。

实施例2用成纤维细胞疫苗预防性治疗肝纤维化

1、分组：

模型组，使用四氯化碳建立小鼠肝纤维化模型；

成纤维细胞疫苗治疗组，成纤维细胞疫苗治疗四氯化碳建立的小鼠肝纤维化模型；

2、实验过程：

首先使用成纤维细胞免疫小鼠，待细胞处理好及培养至所需量时收细胞；计数，离心：1500rpm、3min；用双无的DMEM轻轻的吹打洗涤细胞两次，最后加入适量双无的DMEM，将细胞轻轻的吹打混匀

注射剂量：每只小鼠每次免疫成纤维细胞数量为1×10⁶。

免疫时间：0、2、4周。

免疫部位：小鼠背部、靠上肢处皮下，分两个点进行免疫。

最后一次免疫后的第7天进行建模，按照建模方法配置好建模使用的四氯化碳。四氯化碳按1ml/kg腹腔注射，每周两次，持续四周，建立肝纤维化模型。所有小鼠在四氯化碳注射末次一周后处死，取肝脏以备疗效评价。

检测结果，病理检测各组小鼠的肺脏纤维化程度。和成纤维细胞免疫组小鼠的肝组织比较，CCl4模型组小鼠鼠的肝脏体积均不规则缩小，表面不光滑，边缘呈波浪状，可见小结节状增生。HE染色镜下观察发现模型组小鼠肝脏组织内肝小叶结构破坏明显，肝细胞颗粒变性，有点状坏死，失去肝索的正常排序，肝内血管扩张，间质内可见大量淋巴细胞浸润，汇管区纤维增生，肝内有纤维间隔形成并分割包绕排列紊乱的肝细胞，即假小叶(图1)。经成纤维细胞疫苗组治疗组的小鼠的肝脏均小叶结构基本完整，肝细胞排列整齐，无明显变性坏死，肝组织淋巴细胞浸润较少。该研究结果说明成纤维细胞免疫能能减少CCl4引起的肝组织内淋巴细胞浸润及肝组织结构的破坏，降低肝组织的脂肪变性和肝小叶中心坏死的程度，减轻了反复注射CCl4引起的肝纤维化的形成与发展。

结果表明，本发明的成纤维细胞疫苗能够有效的防治肝纤维化的发生。

实施例3使用成纤维细胞疫苗治疗化疗致肺纤维化

1、分组：

模型组，使用博来霉素建立小鼠肺纤维化模型；

成纤维细胞疫苗治疗组，成纤维细胞治疗博来霉素建立的小鼠肺纤维化模型；

2、处理：

首先使用成纤维细胞免疫小鼠，待细胞处理好及培养至所需量时收细胞；计数，离心：1500rpm、3min；用双无的DMEM轻轻的吹打洗涤细胞两次，最后加入适量双无的DMEM，将细胞轻轻的吹打混匀

注射剂量：每只小鼠每次免疫成纤维细胞数量为1×10⁶。

免疫时间：0、2、4周。

免疫部位：小鼠背部、靠上肢处皮下，分两个点进行免疫。

最后一次免疫后的第7天进行建模，按照建模方法配置好建模使用的博来霉素。博来霉素按10mg/ml溶于无菌生理盐水，将小鼠以氯胺酮100mg/kg腹腔注射麻醉后，切开颈部皮肤，钝性分离颈部肌肉，暴露气管，以博来霉素25mg/kg经气管一次性注入，然后将小鼠直立并旋转，使药液在肺内分布均匀，建立肺纤维化模型。建立模型后一周处死小鼠，取肺脏评价疗效。

检测结果，病理检测各组小鼠的肺脏纤维化程度。结果见图2，(注：MF，鼠成纤维细胞免疫组。以下相同。)HE染色显示：模型组小鼠的肺组织以渗出及纤维化为主要病变,表现为肺间质及肺泡壁毛细血管扩张充血，间质水肿致肺泡壁轻度增厚,伴有炎症细胞的浸润。与之相比，MF组(治疗组)小鼠肺组织部分仍保持肺泡壁纤细，毛细血管完整，无渗出和出血，结构清晰。结果表明，本发明的成纤维细胞疫苗能够有效的防治肺纤维化的发生。

实施例4使用成纤维细胞疫苗治疗射线致肺纤维化

1、分组：

模型组，使用射线建立小鼠肺纤维化模型；

成纤维细胞疫苗治疗组，成纤维细胞治疗放射诱导的小鼠肺纤维化模型；

2、处理：

首先使用成纤维细胞免疫小鼠，待细胞处理好及培养至所需量时收细胞；计数，离心：1500rpm、3min；用双无的DMEM轻轻的吹打洗涤细胞两次，最后加入适量双无的DMEM，将细胞轻轻的吹打混匀。注射剂量：每只小鼠每次免疫成纤维细胞数量为1×10⁶。免疫时间：零周，二周，四周。免疫部位：小鼠背部、靠上肢处皮下，分两个点进行免疫。最后一次免疫后的第7天进行建模。

3、放射性肺炎小鼠模型建立：C57小鼠，用直线加速器进行右侧肺照射，厚铅砖屏蔽小鼠其余部分，照射距离为源皮距98cm，照射剂量为20Gy。

4、建立模型后8周处死小鼠，取肺脏评价疗效评价指标包括：肺组织染色镜检；肺Massson染色镜检，以及肺病理图像分析肺间质面积所占比例，400倍光镜下,每张切片随机选取5个视野,去除肺大泡、大血管、气管的面积,比较肺泡间隔面积占有效视野面积的比例(图像软件分析)。

5、如图3和表1所示：照射后8周小鼠肺泡壁中度-重度增厚，肺泡腔变小或者消失，壁内成纤维细胞、巨噬细胞和毛细血管数目增多。伴有肺间质内成纤维细胞增多。与之相比，MF组(治疗组)组小鼠肺组织结构基本接近正常，肺泡壁薄，有少部分肺泡壁有增厚，毛细血管壁完整，偶有炎细胞渗出，肺泡腔内有少许渗出，基本未见出血。Masson染色显示，模型组(照射组)小鼠在8周时肺间质胶原胶原纤维增多明显，多位于小支气管外膜、血管外膜等部位。可见大片的亮蓝色区域，为大量胶原纤维增生的纤维化病灶。MF组小鼠肺组织Masson染色无明显变化；镜下可见较少的亮蓝染色胶原，且分布正常(气道及血管外膜)。与之对应，肺泡间隔比值提示，MF组显示了较模型组低的比值，提示肺泡间隔增厚减轻。

表1各组肺泡间隔比例

时间	正常	模型	MF免疫
				4w	66.3	80.7	70.7

8w

63.4

81.9

71.5

上述实例表明，使用本发明的成纤维细胞疫苗的免疫效果和抑制炎症的效果较好，并且安全性更好，可作为一种新型的抗炎症纤维化疫苗。本发明技术简单易行，可行性强，具有广阔的应用前景。

Claims (2)

1.成纤维细胞疫苗在制备抗器官纤维化药物中的用途，其特征在于：其主要活性成分为灭活的由人碱性成纤维生长因子(bFGF)激活的成纤维细胞；所述的灭活是指使成纤维细胞失去增殖的能力，但保持生存状态；所述的抗器官纤维化为抗肝纤维化或肺纤维化；

所述的疫苗由包括如下步骤的方法制备而成：

1）获取原代成纤维细胞：切取小鼠背部及腹部的皮肤，置于含有100 U/ml氨苄青霉素和100 mg/ml硫酸链霉素的PBS 中，反复经过PBS漂洗后，剪弃脂肪和结缔组织；将皮肤剪成1mm³的小块，加入含有1mg/mlⅠ型胶原酶的DMEM中，37℃孵育2~3小时，800g离心3min，收集成纤维细胞；

2）在含有bFGF的培养基中刺激培养成纤维细胞：用含有15%胎牛血清的DMEM 调定成纤维细胞密度以每毫升2~4×10⁵细胞接种于75cm²培养瓶，37℃、5% CO₂、90%湿度条件下培养；当培养的成纤维细胞长成单层后，用无钙镁离子的PBS漂洗1次，加入含有0.25%胰酶和0.02% EDTA的PBS消化液消化2 ~ 3min；加入含有15%胎牛血清的DMEM培养基吹打终止消化，以1/2~4的比例传代，并加入50~500ng/ml的重组人bFGF，置于37C、5% CO₂、90%湿度条件下培养；当传代3次后的成纤维细胞生长至培养瓶70~80%，单层，即按上述步骤消化细胞，离心，弃上清后，将细胞浓度调制6×10⁶/ml；每次传代时都加入重组人bFGF；

3）辐照灭活：采用20~100Gy的X射线辐照灭活，分装保存；所述步骤1）、2）在无菌条件下完成。

2.如权利要求1所述的用途，其特征在于：所述的疫苗中成纤维细胞的剂量为1~10×10⁵个细胞。