CN106563160A - 制备组织工程骨的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了制备组织工程骨的方法。所述方法包括：(1)将待诱导间充质干细胞进行预诱导处理，得到预诱导细胞；以及(2)将所述预诱导细胞与间充质干细胞进行混合，以便得到所述组织工程骨。利用本发明的方法所得到的组织工程骨具有较强的分化为骨细胞的能力，且骨细胞得率较高，能够为骨损伤部位提供组织修复所必需的细胞，使骨损伤部位快速、有效地修复及愈合，且方便获得、安全可靠。

Description

制备组织工程骨的方法
技术领域
本发明涉及医药领域。具体地，本发明涉及制备组织工程骨的方法。
背景技术
骨损伤往往发生于外伤时骨折块穿出肢体或发生于开放性骨折清创时失活骨被清除，主要包括骨缺损和缺损修复两大部分。骨损伤是临床上的常见病，也是骨科治疗的难题之一。
然而，目前适用于骨损伤疾病的药物仍有待开发。
发明内容
本发明旨在至少在一定程度上解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出了制备组织工程骨的方法。
需要说明的是，本发明是基于发明人的下列发现而完成的：
目前，临床上常用的治疗方法主要有自体骨移植、同种异体骨移植、异种骨移植和人工骨移植等，其中自体骨移植被认为是修复骨缺损的金标准。但是由于自体骨移植属于挖东墙补西墙，不仅提供的骨量十分有限，而且可能导致供区的创伤、畸形、疼痛及感染等问题，更重要的是造成了新的骨质缺损；异体骨来源有限，具有发生排斥反应及感染病毒性肝炎、艾滋病等传染病的风险；单纯人工骨移植由于缺少组织修复所必需的细胞，其成骨效能非常低。而且，对骨延迟愈合、骨不连的患者而言，上述方法往往效果不佳，手术后仍存在骨不连、骨延迟愈合的情况。
发明人在对骨损伤疾病的治疗方法的研究中发现，基于干细胞具有高度自我更新能力、高度增殖和多向分化潜能、可植入性和重建能力等特性，可以在体外培养干细胞扩增后，输入骨损伤部位处，能够有效地治疗骨损伤疾病。
发明人进行深入研究发现，通过对具有分化为骨细胞能力的间充质干细胞进行预诱导，能够得到具有较强的分化为骨细胞能力的预诱导细胞。进一步地，发明人发现，将间充质干细胞与预诱导细胞共同作用于骨损伤部位，骨损伤部位的修复及愈合效率明显高于预诱导细胞单独作用。由此，包含间充质干细胞及预诱导细胞的组织工程骨具有较强的增殖、分化为骨细胞的能力，能够使骨损伤部位快速、有效地修复及愈合。
为此，本发明提出了一种制备组织工程骨的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：(1)将待诱导间充质干细胞进行预诱导，得到预诱导细胞；以及(2)将所述预诱导细胞与间充质干细胞进行混合，以便得到所述组织工程骨。
发明人发现，间充质干细胞具有分化为骨细胞的能力，但是分化方向不可控。进而，通过对其进行预诱导，得到具有较强分化为骨细胞能力的预诱导细胞，由此，预诱导细胞能够有效地分化为骨细胞，骨细胞得率较高。发明人意外地发现，将预诱导细胞和间充质干细胞共同作用时，骨细胞得率高于预诱导细胞单独作用。经深入研究发现，间充质干细胞不仅能够分化为骨细胞，提高骨细胞的数量，而且间充质干细胞分化过程中会产生一些促进因子，从而能够促进预诱导细胞的增殖和分化，整体上提高了骨细胞得率。由此，根据本发明实施例的方法所得到的组织工程骨具有较强的分化为骨细胞的能力，且骨细胞得率较高，能够为骨损伤部位提供组织修复所必需的细胞，使骨损伤部位快速、有效地修复及愈合，且方便获得、安全可靠。
根据本发明的实施例，上述制备组织工程骨的方法还可以具有下列附加技术特征：
根据本发明的实施例，所述间充质干细胞的含量为1×107～1×108个/mL，所述预诱导细胞的含量为1×107～1×108个/mL。由此，所得到的组织工程骨具有较强的分化为骨细胞的能力，且骨细胞得率较高，能够为骨损伤部位提供组织修复所必需的细胞，使骨损伤部位快速、有效地修复及愈合，且方便获得、安全可靠。
根据本发明的实施例，所述间充质干细胞与预诱导细胞的数量比为1:1～4，优选1:2。发明人经过大量实验得到上述比例关系，由此，所得到的组织工程骨具有较强的分化为骨细胞的能力，且骨细胞得率较高，能够为骨损伤部位提供组织修复所必需的细胞，使骨损伤部位快速、有效地修复及愈合，且方便获得、安全可靠。若间充质干细胞过多，将导致分化成的骨细胞得率偏低；若间充质干细胞过少，分化成的骨细胞得率同样偏低。
根据本发明的实施例，所述间充质干细胞和所述待诱导间充质干细胞分别独立地为骨髓间充质干细胞、脐带间充质干细胞、羊水干细胞或牙髓干细胞，优选脐带间充质干细胞。脐带间充质干细胞容易获得。由此，根据本发明实施例的组织工程骨具有较强的分化为骨细胞的能力，且骨细胞得率较高，能够为骨损伤部位提供组织修复所必需的细胞，使骨损伤部位快速、有效地修复及愈合。此外，组织工程骨呈液态，便于操作，且方便获得、安全可靠。
本领域技术人员能够理解的是，脐带间充质干细胞是由脐带来源的细胞分离培养并纯化而来的，可通过市售获得。同理地，对骨髓间充质干细胞、羊水干细胞或牙髓干细胞的来源不再赘述。
根据本发明的实施例，所述预诱导时间为6～8天，优选7天。发明人发现，诱导培养6～8天，诱导所需的细胞适合移植，若时间过长，细胞过度分化甚至死亡。
根据本发明的实施例，步骤(2)进一步包括：将富血小板血浆、水凝胶以及三(2-二甲氨基乙基)胺的至少一种、所述间充质干细胞及所述预诱导细胞进行混合，并将所得到的混合细胞重悬于生理盐水中，以便得到所述组织工程骨。富血小板血浆中有多种生长因子，各生长因子的比例与人体内正常比例相符，使生长因子之间有最佳的协同作用，并且富血小板血浆中含有大量纤维蛋白，为修复细胞提供良好的支架。水凝胶的添加能够促进损伤细胞的粘附，加快愈合。三(2-二甲氨基乙基)胺可以加快细胞成骨分化。由此，根据本发明实施例的方法所得到的组织工程骨具有较强的分化为骨细胞的能力，且骨细胞得率较高，能够为骨损伤部位提供组织修复所必需的细胞，使骨损伤部位快速、有效地修复及愈合。此外，组织工程骨呈液态，便于操作，且方便获得、安全可靠。
根据本发明的实施例，富血小板血浆浓度为2×1010个/mL；水凝胶浓度为1％w/v；三(2-二甲氨基乙基)胺浓度为100μM。发明人经过大量实验得到上述最优浓度，在此条件下所得到的组织工程骨具有较强的分化为骨细胞的能力，且骨细胞得率较高，能够为骨损伤部位提供组织修复所必需的细胞，使骨损伤部位快速、有效地修复及愈合。此外，组织工程骨呈液态，便于操作，且方便获得、安全可靠。
根据本发明的实施例，所述预诱导包括：将所述待预诱导间充质干细胞与扩增培养基接触，进行扩增培养，以便得到扩增培养产物；以及将所述扩增培养产物与预诱导培养基接触，进行预诱导培养，以便得到所述预诱导细胞。由此，根据本发明实施例的方法所得到的组织工程骨具有较强的分化为骨细胞的能力，且骨细胞得率较高，能够为骨损伤部位提供组织修复所必需的细胞，使骨损伤部位快速、有效地修复及愈合。此外，组织工程骨呈液态，便于操作，且方便获得、安全可靠。
根据本发明的实施例，将所述扩增培养产物与预诱导培养基接触是将所述扩增培养产物按照3×103～8×103个/cm2，优选5×103个/cm2的接种量接种于所述预诱导培养基中。发明人经过大量实验得到上述最优接种量，在此条件下能够满足细胞增殖需求。
根据本发明的实施例，所述扩增培养基包括：含10体积％胎牛血清的α-MEM培养液。发明人发现，利用包括含10体积％胎牛血清的α-MEM培养液的培养基进行培养，能够有效地使间充质干细胞增殖，便于后续的预诱导处理。
需要说明的是，“α-MEM培养液”是本领域技术人员所公知的，对获得方式不作严格限定，例如自行配制、市售获得。根据本发明的实施例，α-MEM培养液购自Gibco，型号为12561-056。
根据本发明的实施例，所述预诱导培养基包括：基础培养基，所述基础培养基包括：含10体积％胎牛血清的DMEM培养液；50μM抗坏血酸；10mMβ-甘油磷酸钠；以及0.1mM地塞米松。发明人经过大量实验得到上述最优诱导培养基，在此培养基中，能够有效地诱导形成预诱导细胞，且诱导效率高。
根据本发明的实施例，所述间充质干细胞及所述待预诱导间充质干细胞分别独立地预先经过筛选，以获得表达表面标志蛋白CD51的间充质干细胞。发明人发现，表达表面标志蛋白CD51的间充质干细胞分化为骨细胞的能力较强，由此，通过筛选(例如流式细胞仪筛选)，以获得具有较强的分化为骨细胞能力的间充质干细胞，再将其进行预诱导，并将得到的预诱导细胞与表达表面标志蛋白CD51的间充质干细胞共同作用，以得到较高收率的骨细胞。
需要说明的是，对于待预诱导间充质干细胞与组成组织工程骨的间充质干细胞的来源不做严格限定，可以为相同来源，即将间充质干细胞分为两部分，一部分经预诱导形成预诱导细胞，另一部分与预诱导细胞组成组织工程骨；也可以为不同来源，例如属于不同批次、不同厂家等。
另外，本发明将详细描述上述制备组织工程骨所得到的组织工程骨在制备药物中的用途。
根据本发明的实施例，所述药物用于治疗骨损伤疾病。组织工程骨具有较强的分化为骨细胞的能力，且骨细胞得率较高，能够作用于骨损伤部分，提供组织修复所必需的细胞，使骨损伤部位快速、有效地修复及愈合。此外，组织工程骨呈液态，便于操作，且方便获得、安全可靠。
根据本发明的实施例，所述药物的给药方式为注射。
本发明的药物的给药频率和剂量可以通过多个相关因素被确定，该因素包括要被治疗的疾病类型、给药途径、病人年龄、性别、体重和疾病的严重程度以及作为活性成分的药物类型。根据本发明的一些实施例，日剂量可分为适宜形式的1剂、2剂或多剂，以在整个时间段内以1次、2次或多次给药，只要达到治疗有效量即可。
术语“治疗”用于指获得期望的药理学和/或生理学效果。所述效果就完全或部分预防疾病或其症状而言可以是预防性的，和/或就部分或完全治愈疾病和/或疾病导致的不良作用而言可以是治疗性的。本文使用的“治疗”涵盖哺乳动物、特别是人的疾病，包括：(a)在容易患病但是尚未确诊得病的个体中预防疾病(例如预防骨损伤)或病症发生；(b)抑制疾病，例如阻滞疾病发展；或(c)缓解疾病，例如减轻与疾病相关的症状。本文使用的“治疗”涵盖将药物或化合物给予个体以治疗、治愈、缓解、改善、减轻或抑制个体的疾病的任何用药，包括但不限于将含本文所述组织工程骨给予有需要的个体。
根据本发明的实施例，本发明的药物可与常规治疗方法和/或疗法相结合使用，或者可与常规治疗方法和/或疗法分开使用。当本发明的药物在采用与其它药物的联合疗法中给药时，它们可序贯地或同时地给予个体。或者，本发明的药物可包含本发明的组织工程骨、药学上可接受的载体或药学上可接受的赋形剂以及本领域已知的其它治疗药或预防药的组合。
本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
附图说明
本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和强理解，其中：
图1显示了根据本发明一个实施例的间充质干细胞形态图；
图2显示了根据本发明一个实施例的间充质干细胞表面标志蛋白表达分析图；以及
图3显示了根据本发明一个实施例的成骨分化效率分析图。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例。下面描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1流式细胞术鉴定间充质干细胞的表面标志
(1)将间充质干细胞(细胞形态如图1所示)培养于含无血清培养基(购自三有利公司，中国)的10cm细胞培养皿中。待细胞生长并达到90％以上汇合度时，吸弃培养基后用PBS缓冲液润洗细胞一次，加入TrypLe Express酶消化细胞，待细胞变圆并从培养板上脱落时及时用含10％胎牛血清的αMEM培养基终止消化，收集细胞悬液至15ml离心管中，1200rpm离心5分钟。吸弃上清后用新鲜无血清培养基重悬细胞，传代培养3代，取培养第三代的细胞，用胰蛋白酶消化。
(2)将消化后的间充质干细胞细胞放入1.5mL EP管中，分别加入1μl流式抗体(CD73、CD90、CD34、CD19、CD14、HLA-DR)，4℃避光孵育30分钟。
(3)用PBS缓冲液洗涤细胞两次，然后用流式细胞仪检测间充质干细胞表面标志的表达，结果如表1和图2所示，可以看出，细胞表型均一，细胞表达间质细胞标记CD73、CD90，不表达造血细胞标记CD34、CD14、CD19，且不表达人白细胞抗原HLA-DR，完全符合“国际细胞治疗协会”关于间充质干细胞表面标志物规定的标准。
表1流式细胞术鉴定
细胞表型 检测值 正常参考值
CD73 95.92％ >95％
CD90 99.99％ >95％
CD34 0.11％ <2％
CD19 0.00％ <2％
CD14 0.00％ <2％
HLA-DR 0.00％ <2％
实施例2筛选表达CD51的间充质干细胞
(1)将间充质干细胞培养于含无血清培养基的10cm细胞培养皿中。待细胞生长并达到90％以上汇合度时，吸弃培养基后用PBS缓冲液润洗细胞一次，加入TrypLe Express酶消化细胞，待细胞变圆并从培养板上脱落时及时用含10％胎牛血清的αMEM培养基终止消化，收集细胞悬液至15ml离心管中，1200rpm离心5分钟。吸弃上清后用新鲜无血清培养基重悬细胞，传代培养3代，取培养第三代的细胞，用胰蛋白酶消化。
(2)将消化后的间充质干细胞细胞放入1.5mL EP管中，加入10μl CD51流式抗体，4℃避光孵育30分钟。
(3)用PBS缓冲液洗涤细胞两次，然后用流式细胞仪分选出表达CD51的间充质干细胞，经检测，间充质干细胞中CD51的表达量为4％左右。
(4)收集细胞，接种于10cm细胞培养皿中，然后放入37℃、5％CO2培养箱中培养。
实施例3间充质干细胞+预诱导细胞与间充质干细胞成骨分化的比较
(1)待实施例2筛选得到的间充质干细胞培养至80～90％融合时将细胞用胰蛋白酶消化后计数，然后按照8000个细胞/cm2接种至6孔板(含10体积％胎牛血清的α-MEM培养液)中，然后将细胞放入37℃，5％CO2培养箱中培养。
(2)第二天，更换成骨诱导培养基，培养基成分为DMEM、10％胎牛血清、0.1mM地塞米松、10mMβ-甘油磷酸钠以及50μM抗坏血酸。
(3)隔两天换液一次，诱导7天，所获得的细胞为预诱导细胞。
(4)7天后，吸弃培养基，用PBS缓冲液润洗细胞一次，加入TrypLe Express酶消化细胞，待细胞变圆并从培养板上脱落时及时用含10％胎牛血清的αMEM培养基终止消化，收集细胞悬液至15ml离心管中，1200rpm离心5分钟。将收集的预诱导细胞6×107个/mL、实施例2筛选得到的间充质干细胞3×107个/mL、2×1010个/mL富血小板血浆；1％w/v水凝胶；以及100μM三(2-二甲氨基乙基)胺混合，接种于6孔板中。同时设置仅有实施例2筛选得到的间充质干细胞作为对照实验组。
(5)第二天，更换成骨诱导培养基，培养基成分为DMEM、10％胎牛血清、0.1mM地塞米松、10mMβ-甘油磷酸钠及50μM抗坏血酸，隔两天换液一次，诱导20天后，钙结节形成，进行茜素红染色，并在显微镜下观察，结果如图3所示，其中A为对照实验组，仅含间充质干细胞；B为实验组，含有间充质干细胞和预诱导细胞。可以看出，间充质干细胞与预诱导细胞组所形成的钙结节数明显多于仅含间充质干细胞组，说明间充质干细胞与预诱导细胞共同作用，所得到的成骨细胞得率较高。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

Claims (10)

1.一种制备组织工程骨的方法，其特征在于，包括：
(1)将待诱导间充质干细胞进行预诱导，得到预诱导细胞；以及
(2)将所述预诱导细胞与间充质干细胞进行混合，以便得到所述组织工程骨。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，
所述间充质干细胞的含量为1×107～1×108个/mL，
所述预诱导细胞的含量为1×107～1×108个/mL。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述间充质干细胞与预诱导细胞的数量比为1:1～4，优选1:2。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述间充质干细胞和所述待诱导间充质干细胞分别独立地为骨髓间充质干细胞、脐带间充质干细胞、羊水干细胞或牙髓干细胞，优选脐带间充质干细胞。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述预诱导时间为6～8天，优选7天。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)进一步包括：
将富血小板血浆、水凝胶以及三(2-二甲氨基乙基)胺的至少一种、所述间充质干细胞及所述预诱导细胞进行混合，并将所得到的混合细胞重悬于生理盐水中，以便得到所述组织工程骨。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，
富血小板血浆浓度为2×1010个/mL；
水凝胶浓度为1％w/v；
三(2-二甲氨基乙基)胺浓度为100μM。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述预诱导包括：
将所述待预诱导间充质干细胞与扩增培养基接触，进行扩增培养，以便得到扩增培养产物；以及
将所述扩增培养产物与预诱导培养基接触，进行预诱导培养，以便得到所述预诱导细胞，
优选地，将所述扩增培养产物与预诱导培养基接触是将所述扩增培养产物按照3×103～8×103个/cm2，优选5×103个/cm2的接种量接种于所述预诱导培养基中。
9.根据权利要求8述的方法，其特征在于，
所述扩增培养基包括：含10体积％胎牛血清的α-MEM培养液，
所述预诱导培养基包括：
基础培养基，所述基础培养基包括：含10体积％胎牛血清的DMEM培养液；
50μM抗坏血酸；
10mMβ-甘油磷酸钠；以及
0.1mM地塞米松。
10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述间充质干细胞及所述待预诱导间充质干细胞分别独立地预先经过筛选，以获得表达表面标志蛋白CD51的间充质干细胞。
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