CN105168251A - 一种干细胞制剂及其制备方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及干细胞领域，公开了一种干细胞制剂及其制备方法与应用。本发明所述干细胞制剂包括脂肪间充质干细胞，来源丰富、体外分化能力强，安全性高、治疗效果好。本发明所述干细胞制剂还包括高浓度血小板血浆提高脂肪间充质干细胞在制剂中的活率，同时促进脂肪间充质干细胞对股骨头坏死的治疗。本发明所述制备方法制备时间短，适合规模化生产。本发明所述干细胞制剂可促进成骨细胞活动，有利于新骨的生成，同时能够增强VEGF表达，加强坏死局部血管增生，形成较为完善的血管网，可用于制备治疗股骨头坏死的药物。

Description

一种干细胞制剂及其制备方法与应用

技术领域

本发明涉及干细胞领域，具体涉及一种干细胞制剂及其制备方法与应用。尤其涉及一种含脂肪干细胞的干细胞制剂及其制备方法与制备治疗股骨头坏死的药物中的应用。

背景技术

股骨头坏死，也叫做股骨头无菌性坏死，在骨关节疾病中挑战性及破坏性疾病，也是骨科领域常见且难治性疾病。股骨头坏死可发生于任何年龄但以31-60岁最多，无性别差异，开始多表现为髋关节或其周围关节的隐痛、钝痛，活动后加重，进一步发展可导致髋关节的功能障碍，股骨头坏死严重影响患者的生活质量和劳动能力，若治疗不及时，还可导致终身残疾。

股骨头坏死的治疗方法，由单一药物治疗，发展到髓新减压、旋转截骨、骨水泥填充术等保守、手术及组织工程技术治疗。非手术治疗包括介入治疗、高压氧治疗、物理疗法。目前治疗股骨头坏死的方法虽然很多，但尚无满意的治疗方案。手术创伤性大，技术要求高，有可能加重原有的创伤，增加患者的心理及经济负担。药物治疗股骨头坏死配方很多，但是治愈效果差、病人受折磨时间长，费用巨大。

目前治疗股骨头坏死的最为尖端的技术是干细胞治疗股骨头坏死，也是疗效中最好的一种手段。干细胞具有多向分化的能力和高度的可塑性，当干细胞被置于新的生存坏境下，他们的特性就会发生改变，具有很强的分化能力，它穿透毛细血管壁，特异性的分化为身体所需要的细胞并对于坏死的细胞进行修复和再生。干细胞能新生血管，恢复血管功能是治疗股骨头坏死的重要原因。干细胞能分化为成骨细胞，促进钙质沉着，修复被破坏的股骨头。同时，干细胞还有调节机体免疫功能，调节神经内分泌功能，对股骨头坏死的治疗有全面支持作用。

在股骨头坏死的干细胞治疗中，常用的种子细胞为骨髓间充质干细胞，但是由于获得自体骨髓数量极少，难以体外培养扩增到一定治疗量的细胞，且不利于维持其基因组稳定性。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于针对现有技术存在的问题，提供一种干细胞制剂及其制备方法。本发明所述干细胞制剂包括脂肪间充质干细胞，来源丰富、体外分化能力强，安全性高、治疗效果好。

为了实现本发明的目的，本发明采用如下技术方案：

一种干细胞制剂，包括脂肪间充质干细胞。

脂肪间充质干细胞(ADSC)是2002年zuk等人在脂肪组织中分离出来的，具有多向分化潜能的间充质干细胞，其来源丰富、取材方便、细胞获取量大，可称为组织工程理想的种子细胞来源之一。

在一些优选的实施方案中，本发明所述干细胞制剂中所述脂肪间充质干细胞的用量为每10mL所述干细胞制剂含1.0×10⁸个-5.0×10⁸个脂肪间充质干细胞。

在一些实施方案中，本发明所述的干细胞制剂，还包括高浓度血小板血浆。

在一些优选的实施方案中，本发明所述干细胞制剂中所述高浓度血小板血浆的用量为每10mL所述干细胞制剂含1mL-2mL所述高浓度血小板血浆。

在一些实施方案中，本发明所述的干细胞制剂，还包括白蛋白和生理盐水。

在一些优选的实施方案中，本发明所述干细胞制剂中所述白蛋白的用量为每10mL所述干细胞制剂含0.2g-0.4g白蛋白。

在一些实施例中，所述白蛋白为人血清白蛋白。优选为20％人血清白蛋白。所述20％人血清白蛋白的用量为每10mL所述干细胞制剂含1mL-2mL20％人血清白蛋白。

在一些优选的实施方案中，本发明所述干细胞制剂中所述生理盐水的用量为每10mL所述干细胞制剂含5mL-7mL生理盐水。

本发明还提供了所述的干细胞制剂的制备方法，将生理盐水与白蛋白混合后重悬脂肪间充质干细胞，然后与高浓度血小板血浆混匀。

在一些实施方案中，本发明所述的制备方法中所述脂肪间充质干细胞的制备方法为胶原酶I消化50min，加入完全培养基，二氧化碳培养箱中培养，48h后换液，待细胞汇合度达到80％-90％时，传代；取第三代至第五代的脂肪干细胞，胰蛋白酶消化2min，1500rpm离心5min收集细胞。

在一些实施方案中，本发明所述的制备方法中所述高浓度血小板血浆的制备方法为自体全血200g-400g离心5min-10min，取上层血浆1200g-1600g离心5min-10min，取1mL上层血浆，重悬沉淀。

体内钙磷大部分存在于骨中，而血中钙磷含量的高低直接影响骨的钙化与溶解，其乘积超过一定限度，则沉淀为骨盐。因此，钙磷乘积升高有利于钙盐的沉积，促进骨基质的生成，使成骨细胞数量增多，从而促进骨生成。在某一实施例中，本发明采用全自动生化分析仪进行钙磷的检测考察本发明所述干细胞制剂对钙磷代谢的影响。结果显示，本发明所述干细胞制剂钙磷乘积都比模型空白组高，且差异极显著。表明本发明所述干细胞制剂可促进成骨细胞活动，有利于新骨的生成。

血管内皮生长因子(vascularendothelialgrowthfactor，VEGF)，是血管内皮细胞特异性的肝素结合生长因子，可在体内诱导血管新生。在某一实施例中，本发明采用Western-blot对股骨头组织进行检测考察本发明所述干细胞制剂对VEGF表达的影响。结果显示，采用本发明所述干细胞制剂治疗后VEGF表达量有显著性提高，表明本发明所述干细胞制剂能够增强VEGF表达，加强坏死局部血管增生，形成较为完善的血管网，输送更多的成骨前体细胞，分泌更多相关的生长因子，加速坏死的修复。

因此，本发明还提供了所述的干细胞制剂在制备治疗股骨头坏死的药物中的应用。

本领域技术人员可将所述的干细胞制剂直接或间接加入制备不同剂型时所需的药学上可接受的各种常用辅料，以常规药物制剂方法，制成常用制剂如注射液、冻干粉、口服液等。

在一些实施方案中，本发明所述药物为注射液。

由上述技术方案可知，本发明提供了一种干细胞制剂及其制备方法与应用。本发明所述干细胞制剂包括脂肪间充质干细胞，来源丰富、体外分化能力强，安全性高、治疗效果好。本发明所述干细胞制剂还包括高浓度血小板血浆提高脂肪间充质干细胞在制剂中的活率，同时促进脂肪间充质干细胞对股骨头坏死的治疗。本发明所述制备方法制备时间短，适合规模化生产。本发明所述干细胞制剂可促进成骨细胞活动，有利于新骨的生成，同时能够增强VEGF表达，加强坏死局部血管增生，形成较为完善的血管网，可用于制备治疗股骨头坏死的药物。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1示实施例1制得的脂肪间充质干细胞P1代的细胞形态图，其中图a放大倍数为40倍，图b放大倍数为100倍；

图2示实施例2细胞活力检测图，其中图a为台盼蓝染色图；图b为细胞直径柱状图，横坐标为细胞直径，单位μm，纵坐标为细胞总数；

图3示实施例1制得的脂肪间充质干细胞P1代细胞表面标志物的表达结果图，其中图a-c为对照细胞组，图d-f为实施例1制得的脂肪间充质干细胞P1代细胞组；图a为FSC及SSC表达情况图，图b为HLA-DR及CD59表达情况图，图c为CD45及CD90表达情况图，图d为FSC及SSC表达情况图，图e为HLA-DR及CD59表达情况图，图f为CD45及CD90表达情况图；

图4示实施例9Western-blot检测VEGF蛋白的表达结果图，其中泳道1为正常组，泳道2为模型空白组，泳道3为对比例组，泳道4为实施例组。

图5示实施例9Western-blot检测VEGF蛋白的相对表达量对比图，横坐标为组别，从左到右依次为正常组、模型空白组、对比例组、实施例组；纵坐标为VEGF蛋白的表达量与β-actin表达量的比值。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

为了使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明。

实施例1、脂肪间充质干细胞获取

取50mL脂肪，用PBS清洗2次，加入0.3％-0.5％胶原酶I消化50min后用PBS清洗1次，加入完全培养基重悬细胞沉淀，接种至培养皿中后放于二氧化碳培养箱中培养；48h后进行换液处理；待细胞汇合度达到80％-90％时，进行传代处理；取第三代至第五代的脂肪干细胞，用PBS清洗两遍后，加入胰蛋白酶消化2min，用完全培养基终止消化，用移液枪反复吹打混匀，直至细胞脱落；把干细胞悬液转移至50mL离心管中，1500rpm离心5min；同时，细胞计数，保证细胞总量为1.0×10⁸-5.0×10⁸个；用生理盐水清洗2次后，用白蛋白的生理盐水重悬细胞，获得脂肪间充质干细胞细胞悬液；其中所述白蛋白的含量为每5mL-7mL的生理盐水含白蛋白0.2g-04g。

实施例2、脂肪间充质干细胞的质量评价

分别对实施例1制得的脂肪间充质干细胞的细胞形态、细胞活力及表面抗原进行检测，以不加任何抗体的细胞作为对照细胞组，结果见图1-3。

由图1结果可见，倒置显微镜下观察，本发明实施例1制得的干细胞制剂中细胞增殖能力较强，生长速度较快，形态、大小均一，细胞折光性强，呈放射状至梭形整齐排列生长，符合脂肪间充质干细胞特性。

由图2结果可见，脂肪干细胞用台盼蓝染色后，绝大部分仍然透亮，没有被染成蓝色，其活率为96％，细胞大小集中在16到22μm之间，符合脂肪间充质干细胞特性。

脂肪间充质干细胞公认的表面标记物为CD59⁺、HLA-DR^-、CD90⁺、CD45^-。由图3结果可见，实施例1制得的脂肪间充质干细胞的CD59⁺-HLA-DR^-表达率为99.4％；CD90⁺-CD45^-的表达率为99.8％，符合脂肪间充质干细胞特性。

间充质干细胞公认的表面标记物为CD59+、HLA-DR-、CD90+、CD45-。ADMSCs细胞的CD59+HLA-DR-表达率为99.4％；CD90+CD45-的表达率为99.8％，符合脂肪间充质干细胞特性。

实施例3、PRP制备

取10mL自体全血200g-400g离心5min-10min，去上层血浆，弃红细胞；上层血浆1200g-1600g离心5min-10min，保留1mL血浆，余下丢弃，重悬沉淀，获得PRP。

实施例4、本发明所述干细胞制剂的制备

通过三通管将实施例3制得的PRP和实施例1制得的脂肪干细胞细胞悬液充分混匀，其中每10mL所述干细胞制剂含1mL-2mLPRP，1.0×10⁸个-5.0×10⁸个脂肪间充质干细胞，1mL-2mL20％人血清白蛋白，余量为生理盐水。

实施例5、本发明所述干细胞制剂的质量评价

对实施例4制得的干细胞制剂的质量进行评价，分别对制剂中细菌、真菌、内毒素、支原体及病毒进行检测，结果见表1。

表1质量评价结果

检测项目	检测结果
		HIV	阴性
HBV	阴性
		HCV	阴性
梅毒	阴性
		细菌	阴性
真菌	阴性
		内毒素	阴性
支原体	阴性

由表1结果可见，实施例4制得的干细胞制剂细菌、真菌、内毒素、支原体及病毒检测均为阴性。

实施例6、骨髓间充质干细胞制剂的制备

用含有0.2g-0.4g白蛋白的10mL生理盐水重悬骨髓间充质干细胞，获得骨髓间充质干细胞制剂，其中每10mL所述干细胞制剂含1.0×10⁸个-5.0×10⁸个骨髓间充质干细胞。

实施例7、本发明所述干细胞制剂的安全性评价

动物类型：新西兰大白兔

动物模型：正常模型、股骨头坏死模型

动物数量：正常模型10只、股骨头坏死模型25只

动物分组：正常模型：5只注射生理盐水、5只注射实施例4制得的干细胞制剂；股骨头坏死模型：5只注射生理盐水(模型空白组)，10只注射实施例干细胞制剂(实施例组)，10只注射实施例6制得骨髓间充质干细胞制剂(对比例组)。

注射方式：股骨头髓心减压后，通过骨髓穿刺针将干细胞制剂注入股骨头内坏死病灶处

大体观察:包括注射前后实验动物饮食情况，活动状态、生命体征检测及过程中相关副作用记录等。

观察结果：正常模型组，实施例4制得的干细胞制剂组和注射生理盐水组相比较，其动物饮食情况、生命体征和活动状态无差异，说明实施例4制得的干细胞制剂无副作用。

实施例8、本发明所述干细胞制剂对钙磷代谢的影响：

在实施例7治疗后60天麻醉处死兔子，收集新鲜全血3mL，离心后取上清，采用全自动生化分析仪进行钙磷的检测，检测结果如表2。

表2钙磷的检测结果

组别	磷(mmol/l)	钙(mmol/l)	磷钙乘积
				模型空白组	2.05±0.03	2.45±0.06	5.02±0.04
实施例组	2.57±0.06**△△	2.90±0.08**△	7.45±0.08**△△
				对比例组	2.21±0.03**	2.53±0.07*	5.59±0.06**

注：与模型空白组比较，*P<0.05，**P<0.01；与对比例组比较，△P<0.05，△△P<0.01

体内钙磷大部分存在于骨中，而血中钙磷含量的高低直接影响骨的钙化与溶解，其乘积超过一定限度，则沉淀为骨盐。因此，钙磷乘积升高有利于钙盐的沉积，促进骨基质的生成，使成骨细胞数量增多，从而促进骨生成。表2结果显示，实施例组和对比例组的钙磷乘积都比模型空白组高，且对比例组与模型空白组的差异显著，实施例组与模型空白组的差异极显著。而实施例组与对比例组的钙磷乘积比较，实施例组钙磷乘积高于对比例组，且差异极显著。表明实施例组和对比例组的干细胞制剂均可促进成骨细胞活动，有利于新骨的生成，而实施例组又比对比例组的效果好。

实施例9、本发明所述干细胞制剂对VEGF蛋白表达的影响：

在实施例8收集新鲜全血后，在无菌条件下手术取完成股骨头，对股骨头组织进行Western-blot检测VEGF蛋白的表达，检测结果如图4和5所示。

结果显示，模型对照组与正常组相比，VEGF表达量有显著性差异，对比例组和模型空白组相比较，VEGF表达量有一定提高；实施例组和模型空白组相比较，VEGF表达量有显著性提高；而实施例组和对比例组相比较，实施例组VEGF表达量高于对比例组，且差异具有显著性。表明实施例组干细胞制剂更能够增强VEGF表达，加强坏死局部血管增生，形成较为完善的血管网，输送更多的成骨前体细胞，分泌更多相关的生长因子，加速坏死的修复。

Claims (10)

1.一种干细胞制剂，包括脂肪间充质干细胞。

2.根据权利要求1所述的干细胞制剂，所述脂肪间充质干细胞的用量为每10mL所述干细胞制剂含1.0×10⁸个-5.0×10⁸个脂肪间充质干细胞。

3.根据权利要求1或2所述的干细胞制剂，还包括高浓度血小板血浆。

4.根据权利要求1-3任意一项所述的干细胞制剂，所述高浓度血小板血浆的用量为每10mL所述干细胞制剂含1mL-2mL所述高浓度血小板血浆。

5.根据权利要求1-4任意一项所述的干细胞制剂，还包括白蛋白和生理盐水。

6.根据权利要求5所述的干细胞制剂，所述白蛋白的用量为每10mL所述干细胞制剂含0.2g-0.4g白蛋白；所述生理盐水的用量为每10mL所述干细胞制剂含5mL-7mL生理盐水。

7.权利要求1-6任意一项所述的干细胞制剂的制备方法，将生理盐水与白蛋白混合后重悬脂肪间充质干细胞，然后与高浓度血小板血浆混匀。

8.根据权利要求7所述的制备方法，所述脂肪间充质干细胞的制备方法为胶原酶I消化50min，加入完全培养基，二氧化碳培养箱中培养，48h后换液，待细胞汇合度达到80％-90％时，传代；取第三代至第五代的脂肪干细胞，胰蛋白酶消化2min，1500rpm离心5min收集细胞。

9.根据权利要求7所述的制备方法，所述高浓度血小板血浆的制备方法为自体全血200g-400g离心5min-10min，取上层血浆1200g-1600g离心5min-10min，取1mL上层血浆，重悬沉淀。

10.权利要求1-6任意一项所述的干细胞制剂在制备治疗股骨头坏死的药物中的应用。