CN104758923A - 一种治疗神经损伤的干细胞制剂及其制备方法 - Google Patents

Abstract

一种治疗神经损伤的干细胞制剂及其制备方法，涉及一种干细胞制剂及其制备方法。本发明提供一种治疗神经损伤的干细胞制剂及其制备方法。该制剂包括间充质干细胞、海藻糖溶液、表皮生长因子和碱性成纤维生长因子。方法：一、对间充质干细胞进行分离纯化，传代培养，取P3代～P5代间充质干细胞；二、对P3代～P5代间充质干细胞进行病毒、无菌、免疫表型、细胞活率、分化功能的检测；三、收集并纯化间充质干细胞，重悬于海藻糖溶液内，添加表皮生长因子和碱性成纤维生长因子，即得干细胞制剂。本发明使用的间充质干细胞来源广泛，对供着没有任何损伤。本发明用于治疗神经损伤。

Description

一种治疗神经损伤的干细胞制剂及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种干细胞制剂及其制备方法。

背景技术

神经损伤是一种临床多发病，多见于神经内科，若临床治疗方法不当常会引起神经功能受损，引发不可逆的损害。对于神经损伤的临床治疗方法众多，本发明一种通过间充质干细胞治疗患者神经损伤的方法，疗效显著。

干细胞是一类具有自我更新、高度增殖和多向分化潜能的特殊细胞，根据其来源不同可分为胚胎干细胞和成体干细胞两大类。成体干细胞的移植已经在神经系统、造血系统等许多人类疾病的治疗中发挥了重要的作用，成体干细胞具有以下优势：获取相对容易；源于患者自身的成体干细胞在应用时不存在组织相容性的问题，避免了移植排斥反应和使用免疫抑制剂；成体干细胞致瘤风险很低，而且所受伦理学争议较少；成体干细胞还具有多向分化潜能。干细胞移植主要集中在：胚胎干细胞、神经干细胞、骨髓间充质干细胞和脐带血干细胞。干细胞移植修复神经损伤的目的在于：①可以诱导分化为神经元或神经胶质细胞，替代死去的细胞，进而恢复脊髓功能；②可以在体内表达多种神经营养因子，改善细胞外微环境，促进轴突再生，阻止细胞凋亡；③提供新的神经细胞作为再神经化的源头及上下级神经元信号传递的中转站；④填充于损伤区从而抑制胶质细胞的过度增生。干细胞是具有自我更新和多向分化潜能的细胞群体，可发育为某一器官或组织的特性为其在中枢神经系统疾病的保护与修复中的研究及应用奠定了基础。

间充质干细胞是细胞生物学中干细胞家族中的重要组成成员，其来源于发育早期的胚胎的中胚层和外胚层，其最初在人群的骨髓中发现，主要临床特征为具有自我更新、多向分化、造血支持、免疫调控等特点，其临床使用越来越引起人群的重视。在体内或体外一定的诱导条件下可分化为脂肪、肌肉、心肌、肌腱、韧带、肝、骨、软骨、内皮等多种人体组织细胞，采用连续传代培养以及冷冻保存的方法可依然具有多向分化的潜能，临床常作为理想组织器官损伤修复，尤其是神经损伤，临床研究证实，采用间充质干细胞还可以治疗多种血液系统疾病、心血管疾病。神经损伤包括脑外伤、脑血管硬化、脑溢血、脑血栓、后遗症、脑炎与脑膜炎后遗症、脱髓鞘疾病等脑血管病后遗症，采用间充质干细胞治疗神经损伤取得了良好的临床效果，应加强临床推广。

海藻糖是一种由葡萄糖的1,1-糖苷键产生的二糖，由于海藻糖给予甜味并且具有高度保水能力，因而广泛应用于多种食品和化妆品的生产中，此外，由于海藻糖具有稳定细胞膜并且抑制细胞损伤的功能，因而在临床上将其作为器官保护液体的活性组分，用于器官移植。

既往研究显示，在发育脑和成年脑内，神经元和星形胶质细胞均可表达表皮生长因子，且在发育较晚期，表皮生长因子参与神经前体细胞增殖分化及细胞的生存和迁移，同时其作为具有神经营养活性的因子，在神经损伤后可以保护相应的背根神经节感觉神经元，表皮生长因子还是一种脑肠肽神经递质，碱性成纤维生长因子广泛存在于中枢及外周神经系统中，对神经元有维持生存和促进生长及受损神经元的修复与再生作用，且碱性成纤维生长因子能够与其它生长因子协同共同修复神经损伤，表皮生长因子是有丝分裂的促进因子，对细胞分裂具有促进作用，可诱导神经干细胞向星形胶质细胞分化，并促进轴突的生长和维持其存活；碱性成纤维细胞生长因子能维持由表皮生长因子激发的神经干细胞的存活及增殖，同样对神经干细胞具有定向诱导分化作用，并能维持神经元和星形胶质细胞的存活，具有丝裂原样作用，表皮生长因子和碱性成纤维生长因子具有协同作用，促进神经干细胞的分化。

发明内容

本发明提供一种治疗神经损伤的干细胞制剂及其制备方法。

本发明治疗神经损伤的干细胞制剂包括间充质干细胞、海藻糖溶液、表皮生长因子和碱性成纤维生长因子，所述间充干细胞为脐带间充质干细胞、胎盘间充质干细胞或脂肪间充质干细胞为P3代～P5代的间充质干细胞。

所述表皮生长因子和碱性成纤维生长因子均购买自Sigma公司。

上述治疗神经损伤的干细胞制剂的制备方法，按以下步骤进行：

一、对间充质干细胞进行分离纯化，传代培养，取P3代～P5代间充质干细胞；

二、对P3代～P5代间充质干细胞进行病毒、无菌、免疫表型、细胞活率、分化功能的检测，各项指标合格后用于干细胞制剂的制备；

三、收集并纯化间充质干细胞，重悬于海藻糖溶液内，海藻糖溶液浓度为50～90mg/mL，海藻糖溶液中含间充质干细胞10⁶～10⁹个/mL，添加表皮生长因子和碱性成纤维生长因子，即可得到干细胞制剂；所述间充质干细胞为脐带间充质干细胞、胎盘间充质干细胞或脂肪间充质干细胞。

由于间充质干细胞能够表达一系列的神经营养因子，如BDNF、GDNF、VEGF、LIF、NGF和NT-3，说明间充质干细胞具有很好的神经元保护作用，向神经元细胞分化和治疗神经衰退性疾病的潜能。釆用RT-PCR检测P3代间充质干细胞发现，间充质干细胞能够在mRNA水平上表达Nestin、NSE、NF、GFAP、S100B等神经营养因子，特别是多巴胺神经元转录因子，同时采用Western blotting检测也同样发现间充质干细胞能够在蛋白水平上表达NSE、GFAP、Nurrl、Wnt-1和En-l，这说明间充质干细胞具有自发向神经细胞分化的倾向。间充质干细胞在表皮生长因子和碱性成纤维生长因子能够联合诱导下能够促进MSC的转分化为神经样细胞，本发明提供了一种应用于治疗神经损伤的干细胞制剂的制备方法及间充质干细胞的制备方法，以治疗，控制或减轻神经系统疾病。本发明中使用的间充质干细胞来源于脐带华通式胶，脂肪组织和胎盘绒毛层组织。

本发明的有益效果：

本发明在制备间充质干细胞制剂的过程中，添加表皮生长因子、成纤维细胞生长因子，能够促进间充质干细胞分化为神经细胞，达到治疗或修复神经损伤的目的；

本发明的干细胞制剂中含有海藻糖组分，海藻糖能够保护细胞膜受损，维持细胞内外的渗透压，从而保证了细胞的活性。

本发明的间充质干细胞制剂包含脐带间充质干细胞，脂肪间充质干细胞或胎盘间充质干细胞，间充质干细胞的来源比较广泛，可扩增复制若干代，细胞数量及活性能够满足患者的治疗剂量，同时间充质干细胞还可应用于构建间充质干细胞库。

本研究应用无血清培养液培养和扩增MSCs，这样可以维持其低分化状态，并保持多向分化能力，避免增殖过程中的成熟分化，细胞周期检测显示超过90％的细胞处于静止期，表明获得的细胞大多处于早期的未分化阶段，提示本研究获取的MSCs可以在体外大量扩增和长期培养，并且可以长时间保持其未分化状态。

本发明使用的间充质干细胞即可来源于新生儿出生后的胎盘或脐带，也可来源于成年人的脂肪组织，组织来源广泛，可应用较广泛，对供着没有任何损伤，可作为间充质干细胞的来源。

本发明的间充质干细胞制剂没有细胞数量上的限制，可多次扩增细胞和使用。

附图说明

图1为实施例1中P3代脂肪间充质干细胞的生长状态；图2为实施例1中P3代脂肪间充质干细胞的生长曲线；图3为脑组织中GFAP表达检测结果；图4为脑组织中Nestin表达检测结果；图5为脑组织中NSE表达检测结果。

具体实施方式

本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式，还包括各具体实施方式间的任意组合。

具体实施方式一：本实施方式治疗神经损伤的干细胞制剂包括间充质干细胞、海藻糖溶液、表皮生长因子和碱性成纤维生长因子，所述间充干细胞为脐带间充质干细胞、胎盘间充质干细胞或脂肪间充质干细胞为P3代～P5代的间充质干细胞。

具体实施方式二：本实施方式与具体实施方式一不同的是：所述海藻糖溶液的浓度为50～90mg/mL。其它与具体实施方式一相同。

具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式一或二不同的是：干细胞制剂中间充质干细胞的浓度为10⁶～10⁹个细胞/mL。其它与具体实施方式一或二相同。

具体实施方式四：本实施方式与具体实施方式一至三之一不同的是：干细胞制剂中表皮生长因子的浓度为10～15ng/mL。其它与具体实施方式一至三之一相同。

具体实施方式五：本实施方式与具体实施方式一至四之一不同的是：干细胞制剂中碱性成纤维生长因子的浓度为15～20ng/mL。其它与具体实施方式一至四之一相同。

具体实施方式六：本实施方式治疗神经损伤的干细胞制剂的制备方法，按以下步骤进行：

一、对间充质干细胞进行分离纯化，传代培养，取P3代～P5代间充质干细胞；

二、对P3代～P5代间充质干细胞进行病毒、无菌、免疫表型、细胞活率、分化功能的检测，各项指标合格后用于干细胞制剂的制备；

三、收集并纯化间充质干细胞，重悬于海藻糖溶液内，海藻糖溶液浓度为50～90mg/mL，海藻糖溶液中含间充质干细胞10⁶～10⁹个/mL，添加表皮生长因子和碱性成纤维生长因子，即可得到干细胞制剂；所述间充质干细胞为脐带间充质干细胞、胎盘间充质干细胞或脂肪间充质干细胞。

所述脐带间充质干细胞的制备方法：在无菌工作台内，将脐带通过75％的酒精消毒处理，然后用生理盐水清洗2次，将清洗后的脐带剪成长度为2～3cm的段，然后放在平皿内，剥离华通式胶，将华通式胶置于洁净的离心管内，用手术剪剪碎至1～2mm³的块状，按照1g/T75瓶接种，采用无血清培养基进行培养，5d后进行换液，待细胞融合度达到70％以上后，通过体积百分浓度为0.125％的胰酶进行消化，获取单个细胞，按照1×10⁶个细胞/T175瓶接种，采用无血清培养基进行培养，放置于二氧化碳培养箱，待细胞融合度达到90％以上后进行传代，最终获取脐带间充质干细胞P3代细胞，通过脐带MSCs的免疫标记检测，发现它们均表达典型的MSCs表面抗原CD13、CD29、CD44、CD54、CD73、CD105，不表达造血干细胞表面抗原CD3、CD14、CD34、CD45和内皮细胞表面抗原CD31，符合干细胞的特性。

所述胎盘间充质干细胞的制备方法：在无菌工作台内，75％的酒精消毒处理胎盘采集袋，用生理盐水清洗胎盘2遍，将清洗后的胎盘剥离羊膜，取绒毛层组织，加生理盐水清洗血渍，清洗后将绒毛层组织置于50mL洁净离心管内，剪成1～1.5mm³大小组织块，加入3倍组织块体积的I型胶原酶，37℃摇床内消化30min，加入10mL无血清培养基终止消化，过滤于50mL洁净离心管内，1300r/min离心6分钟，弃上清，取沉淀，按照3×10⁶个细胞/T175瓶接种，采用无血清培养基进行培养，放置于二氧化碳培养箱，待细胞融合度达到90％以上后进行传代，最终获取胎盘间充质干细胞P3代细胞，通过对胎盘MSCs的免疫标记检测，发现它们均表达典型的MSCs表面抗原CD13、CD29、CD44、CD54、CD73、CD105，不表达造血干细胞表面抗原CD3、CD14、CD34、CD45和内皮细胞表面抗原CD31，符合干细胞的特性。

所述脂肪间充质干细胞的制备方法：在无菌工作台内，75％的酒精消毒处理脂肪采集瓶，用生理盐水清洗脂肪2～3遍，吸取脂肪组织置于50mL洁净离心管内，加入3倍组织块体积的I型胶原酶，37℃摇床内消化40min，加入15mL无血清培养基终止消化，过滤于50mL洁净离心管内，1300r/min离心6分钟，弃上清，取沉淀，按照3×10⁶～3.5×10⁶个细胞/T175瓶接种，采用无血清培养基进行培养，放置于二氧化碳培养箱，待细胞融合度达到90％以上后进行传代，最终获取脂肪间充质干细胞P3代细胞，通过对脂肪MSCs的免疫标记检测，发现它们均表达典型的MSCs表面抗原CD13、CD29、CD44、CD54、CD73、CD105，不表达造血干细胞表面抗原CD3、CD14、CD34、CD45和内皮细胞表面抗原CD31，符合干细胞的特性。

具体实施方式七：本实施方式与具体实施方式六不同的是：步骤二所述各项指标合格是指：病毒和无菌检测均为阴性，免疫表型的阳性表达率大于95％，阴性表率达小于2％，细胞活率达到95％以上，具有分化功能。其它与具体实施方式六相同。

具体实施方式八：本实施方式与具体实施方式六或七不同的是：步骤三中海藻糖溶液浓度为60～80mg/mL。其它与具体实施方式六或七相同。

具体实施方式九：本实施方式与具体实施方式六至八之一不同的是：步骤三干细胞制剂中表皮生长因子的浓度为10～15ng/mL。其它与具体实施方式六至八之一相同。

具体实施方式十：本实施方式与具体实施方式六至九之一不同的是：步骤三干细胞制剂中碱性成纤维生长因子的浓度为15～20ng/mL。其它与具体实施方式六至九之一相同。

为验证本发明的有益效果，进行以下实验：

实施例1：

本实施例治疗神经损伤的干细胞制剂的制备方法，按以下步骤进行：

一、对脂肪间充质干细胞进行分离纯化，传代培养，取P3代脂肪间充质干细胞；

二、对P3代脂肪间充质干细胞进行病毒、无菌、免疫表型、细胞活率、分化功能的检测，各项指标合格后用于干细胞制剂的制备；

所述各项指标合格是指：病毒和无菌检测均为阴性，免疫表型的阳性表达率大于95％，阴性表率达小于2％，细胞活率达到95％以上，具有较强的分化功能

三、收集并纯化脂肪间充质干细胞，重悬于海藻糖溶液内，海藻糖溶液浓度为70mg/mL，海藻糖溶液中含脂肪间充质干细胞10⁸个/mL，添加表皮生长因子和碱性成纤维生长因子，即可得到干细胞制剂；干细胞制剂中表皮生长因子的浓度为10～15ng/mL，干细胞制剂中碱性成纤维生长因子的浓度为15～20ng/mL。

步骤一中脂肪间充质干细胞的制备方法：在无菌工作台内，75％的酒精消毒处理脂肪采集瓶，用生理盐水清洗脂肪2～3遍，吸取脂肪组织置于50mL洁净离心管内，加入3倍组织块体积的I型胶原酶，37℃摇床内消化40min，加入15mL无血清培养基终止消化，过滤于50mL洁净离心管内，1300r/min离心6分钟，弃上清，取沉淀，按照3×10⁶～3.5×10⁶个细胞/T175瓶接种，采用无血清培养基进行培养，放置于二氧化碳培养箱，待细胞融合度达到90％以上后进行传代，最终获取脂肪间充质干细胞P3代细胞，通过对脂肪MSCs的免疫标记检测，发现它们均表达典型的MSCs表面抗原CD13、CD29、CD44、CD54、CD73、CD105，不表达造血干细胞表面抗原CD3、CD14、CD34、CD45和内皮细胞表面抗原CD31，符合干细胞的特性。

获得的P3代脂肪间充质干细胞状态如图1所示，P3代脂肪间充质干细胞的生长曲线如图2所示。可以看出脂肪间充质干细胞的生长状态良好。

在脑组织中，神经干细胞可以分泌多种神经营养因子，促进损伤细胞的修复，还可以增强神经突触之间的联系，建立新的神经环路。所以，作为星形胶质细胞的特异标识蛋白—GFAP和作为神经干细胞的特异性标识蛋白—Nestin，以及作为神经元细胞损伤的特异标识蛋白—NSE，这三种蛋白在脑组织中的阳性表达对大脑正常功能的发挥起着重要作用。脂肪间充质干细胞，脐带间充质干细胞，胎盘间充质干细胞移植后，通过归巢作用都可以迁移到大脑病变部位，分化成合适的细胞类型，替代神经损伤病程中丢失的细胞，从而对患者有一定的疗效。

为证明间充质干细胞制剂能够治疗神经损伤性疾病的疗效，分别将制备后的含有干细胞，海藻糖，表皮生长因子及成纤维生长因子的干细胞制剂，含有干细胞，表皮生长因子和成纤维生长因子的干细胞制剂，含有海藻糖和干细胞的制剂，及只含有等量的干细胞的制剂分别通过尾静脉注入患有脑损伤的小鼠模型内(本研究采用SD大鼠，雌雄各半，体重250g左右，随机分为对照组，正常组和治疗组，通过自由落体打击建立脑损伤小鼠模型，随机将治疗组分为A，B，C，D，隔离相同环境饲养观察)，静脉注射含有2*10⁶个细胞的间充质干细胞混合液，对照组注入等体积的盐水，1次/周，1个疗程为4周，治疗过程中应辅助地塞米松进行蛛网膜下腔注射治疗，与正常组小鼠隔离在相同环境下饲养，4周后分别检测GFAP，Nestin，以及NSE这三种蛋白在脑组织中的阳性表达情况：

治疗组A：(制剂中含有脂肪间充质干细胞，海藻糖，表皮生长因子、成纤维细胞生长因子)；

治疗组B：(制剂中含有脂肪间充质干细胞，表皮生长因子，成纤维生长因子)；

治疗组C：(制剂中含有脂肪间充质干细胞和海藻糖)；

治疗组D：(制剂中含有脂肪间充质干细胞)；

1、脑组织中GFAP表达检测结果如表1和图3所示。

表1GFAP各组小鼠脑组织中的阳性表达面积测定结果(x士s，％)

组别	n	GFAP(％)
			正常组	9	8.15±0.11
对照组	9	1.52±0.1
			治疗组A	9	7.33±0.09
治疗组B	9	7.21±0.06
			治疗组C	9	6.89±0.06
治疗组D	9	6.42±0.06

2、脑组织中Nestin表达检测结果如表2和图4所示。

表2Nestin在各组小鼠脑组织中的阳性表达面积测定结果(x士s，％)

组别	n	Nestin(％)
			正常组	9	2.69±0.07
对照组	9	2.02±0.05
			治疗组A	9	2.35±0.05
治疗组B	9	2.21±0.07
			治疗组C	9	2.09±0.03

治疗组D

9

1.69±0.05

3、脑组织中NSE表达检测结果如表3和图5所示。

表3NSE在各组小鼠脑组织中的阳性表达面积测定结果(x士s，％)

组别	n	NSE(％)
			正常组	9	0.86±0.07
对照组	9	0.22±0.03
			治疗组A	9	0.69±0.04
治疗组B	9	0.58±0.06
			治疗组C	9	0.49±0.09
治疗组D	9	0.46±0.08

上述间充质干细胞制剂通过尾静脉注入体内，通过干细胞的归巢功能选择性到达脑组织后，在体内环境下，干细胞通过不同的途径分化、增殖、恢复、重建新的神经联系，减轻受损区神经元的损伤程度，从而对神经损伤引起的疾病起到治疗的作用，其中治疗组A(制剂含有干细胞，海藻糖，表皮生长因子、成纤维细胞生长因子)修复功能显著高于其它治疗组的修复功能，该制剂可应用到神经损伤修复的治疗过程。

Claims (10)

1.一种治疗神经损伤的干细胞制剂，其特征在于该制剂包括间充质干细胞、海藻糖溶液、表皮生长因子和碱性成纤维生长因子，所述间充干细胞为脐带间充质干细胞、胎盘间充质干细胞或脂肪间充质干细胞为P3代～P5代的间充质干细胞。

2.根据权利要求1所述的一种治疗神经损伤的干细胞制剂，其特征在于所述海藻糖溶液的浓度为50～90mg/mL。

3.根据权利要求1所述的一种治疗神经损伤的干细胞制剂，其特征在于干细胞制剂中间充质干细胞的浓度为10⁶～10⁹个细胞/mL。

4.根据权利要求1所述的一种治疗神经损伤的干细胞制剂，其特征在于干细胞制剂中表皮生长因子的浓度为10～15ng/mL。

5.根据权利要求1所述的一种治疗神经损伤的干细胞制剂，其特征在于干细胞制剂中碱性成纤维生长因子的浓度为15～20ng/mL。

6.如权利要求1所述治疗神经损伤的干细胞制剂的制备方法，其特征在于该方法按以下步骤进行：

一、对间充质干细胞进行分离纯化，传代培养，取P3代～P5代间充质干细胞；

二、对P3代～P5代间充质干细胞进行病毒、无菌、免疫表型、细胞活率、分化功能的检测，各项指标合格后用于干细胞制剂的制备；

三、收集并纯化间充质干细胞，重悬于海藻糖溶液内，海藻糖溶液浓度为50～90mg/mL，海藻糖溶液中含间充质干细胞10⁶～10⁹个/mL，添加表皮生长因子和碱性成纤维生长因子，即可得到干细胞制剂；所述间充质干细胞为脐带间充质干细胞、胎盘间充质干细胞或脂肪间充质干细胞。

7.根据权利要求6所述的治疗神经损伤的干细胞制剂的制备方法，其特征在于步骤二所述各项指标合格是指：病毒和无菌检测均为阴性，免疫表型的阳性表达率大于95％，阴性表率达小于2％，细胞活率达到95％以上，具有分化功能。

8.根据权利要求6所述的治疗神经损伤的干细胞制剂的制备方法，其特征在于步骤三中海藻糖溶液浓度为60～80mg/mL。

9.根据权利要求6所述的治疗神经损伤的干细胞制剂的制备方法，其特征在于步骤三干细胞制剂中表皮生长因子的浓度为10～15ng/mL。

10.根据权利要求6所述的治疗神经损伤的干细胞制剂的制备方法，其特征在于步骤三干细胞制剂中碱性成纤维生长因子的浓度为15～20ng/mL。