CN111511900A - 用于骨再生的干细胞和装置 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及包括至少一种干细胞、至少一个支架的骨再生产品，和至少一种干细胞。适合于本发明的干细胞可以包括适合于密质骨再生的干细胞、适合于松质骨再生的干细胞或其组合。所述骨再生产品可以进一步包括生长因子。本发明还涉及具有临界尺寸缺损的任何骨的骨再生方法和治疗。本发明还涉及支架。本发明还涉及包括羟磷灰石(HA)和磷酸三钙(TCP)的3D打印支架。本发明还涉及包括聚合物的支架。本发明的聚合物可以通过使用光固化聚合物和/或单体来制备。本发明的支架可以包括生长因子和小分子。所述小分子可以是Smurf1抑制剂。

Description

用于骨再生的干细胞和装置
相关申请的交叉引用
本申请要求2017年11月9日提交的代理人案卷号为064693-0420的题为“用于骨再生的干细胞和装置(Stem Cells and Devices For Bone Regeneration)”的美国临时专利申请62/584,052的权益，所述临时专利申请的全部内容通过引用并入本文。
技术领域
本发明涉及包括至少一种干细胞和至少一个支架的骨再生产品。本发明还涉及包括至少一种干细胞和至少一个支架的骨再生产品；其中所述支架包括适合于携带所述至少一种干细胞的任何支架。本发明还涉及包括至少一种干细胞和至少一个支架的骨再生产品；其中所述支架包括适合于携带所述至少一种干细胞的任何3D打印支架。本发明涉及包括干细胞制剂的骨再生产品。适合于本发明的干细胞可以包括适合于密质骨再生的干细胞、适合于松质骨再生的干细胞或其组合。所述骨再生产品可以进一步包含生长因子。本发明还涉及骨再生方法。本发明还涉及具有临界尺寸缺损的任何骨的治疗。本发明还涉及支架。本发明还涉及3D打印支架。本发明还涉及包括羟磷灰石(HA)和磷酸三钙(TCP)的支架。本发明还涉及包括羟磷灰石(HA)、磷酸三钙(TCP)和聚合物的支架。本发明还涉及包括聚合物的支架。本发明的聚合物可以通过使用光固化聚合物和/或单体来制备。本发明的支架可以包括生长因子。本发明的支架可以包括生长因子和小分子。所述小分子可以是Smurf1抑制剂。
背景技术
由外伤、疾病或肿瘤切除事件造成的骨骼中的临界尺寸缺损(critical-sizedefect，CSD)是临床上的重大挑战。Ziran和Smith,手术中的患者安全(Patient Safety inSurgery)2014,8:40中示出了具有CSD的患者的实例。该文件的全部内容通过引用并入本文。长骨中具有CSD的患者遭受恢复期漫长和生活质量受损的问题。在正常的骨再生过程中，愈合以精心协调的一系列重叠阶段进行，包括炎症、增殖和重塑，最终用新骨填充损伤部位并恢复骨组织的功能。在临界尺寸骨缺损中，缺乏血管分布和骨诱导因子是导致愈合失败的主要原因(Stevenson,1998)。
目前，针对临界尺寸缺损的金标准治疗策略利用血管化的骨移植物，该骨移植物提供充足的血液供应，包括有助于重塑能力的各种类型的细胞，例如间充质干细胞、成骨细胞和破骨细胞(Soucacos等,2011)。
然而，与上肢中腓骨移植物的高接合率相比，下肢中移植物的骨折率在15％至超过40％的范围内，这主要是由于机械应力过大或未对准所致(de Boer等,1990；Lee等,2004；Minami等,2000)。腓骨移植后供体部位的发病率和感染也是常见问题(Arai等,2002)。由于当前治疗方式的这些问题和其它缺点，需要替代的再生策略来改善愈合结果并减少并发症。
成体干细胞的再生能力众所周知(Qin等,2014；Sponer等,2014)。最近，许多不同种类的间充质干细胞已用于骨再生，例如骨髓间充质干细胞(BMMSC)以及脂肪、牙髓和颅神经嵴细胞(CNCC)来源的MSC(Chung等,2009；Du等,2018；Li等,2016；Liu等,2011)。
脊椎动物神经嵴是来源于神经板的侧脊的多能细胞群。这种多能性通过生长因子信号转导通路及其下游转录因子进行修饰，从而使颅神经嵴来源的间充质干细胞(CNCC)最终成为多种不同细胞类型之一。CNCC的衍生物包括感觉神经元、自主神经元、神经胶质、黑素细胞、肾上腺髓质细胞和平滑肌细胞。在颅面发育过程中，CNCC随着它们填充鳃弓而向腹侧迁移。CNCC从中脑和后脑前部向第一鳃弓的迁移开始于约4体节阶段。最终，除了神经组织外，那些CNCC还产生了间充质结构如骨骼、软骨和牙齿。
其中各个迁移前或迁移的CNCC用染料标记、然后追踪其后代命运的先前研究表明，CNCC可以从单个祖细胞产生多种类型的衍生物。克隆分析证实了这一发现，并证实这些细胞自我更新并共有干细胞的一些独特特征。然而，一些个别CNCC仅产生一种类型的衍生物。因此，已经提出即使在迁移开始时，神经嵴也由具有不同增殖和分化潜能的异质细胞群体组成。有趣的是，在迁移后CNCC所在的成年动物中也鉴定到多能CNCC。这意味着一些迁移前CNCC维持了其多能分化能力，并在迁移后经历自我更新或变得静止。然而，迁移后CNCC维持干细胞特征的程度尚不清楚。
并行地，间充质干细胞(MSC)首先在骨髓中被鉴定为是一组具有成骨、成软骨和成脂潜能的集落形成细胞(Friedenstein等,1968)。随后，已鉴定到来自各种组织的MSC，包括骨骼肌(Dellavalle等,2011)，脂肪组织(Tang等,2008；Zuk等,2002)，胎盘(Covas等,2008)，子宫内膜(Schwab和Gargett,2007)，乳牙(Miura等,2003)和骨骼(Pittenger等,1999)。已经提出了MSC与血管周细胞之间的相似性(Covas等,2008；Schwab和Gargett,2007)。MSC最重要的特性包括其多潜能分化的能力及其免疫调节能力。MSC能够分化为不同的组织，包括成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞或甚至神经元(Keating,2012)。尽管已经对MSC进行了广泛的研究，但它们的体内特性、生理功能和支持生境尚不清楚。MSC的定义是基于一组宽松的标准，包括三系分化能力和各种MSC表面标志物的表达(Bianco等,2013；Dominici等,2006；Keating,2012)。已显示，骨髓MSC促进损伤后的骨再生。这些文件中的每一个的全部内容通过引用并入本文。
长骨组织由围绕柔软的高血管骨髓的皮质骨(主要是骨基质)组成。骨基质为身体提供结构支撑，而骨髓则有助于供应血液和相关的营养物质。先前的研究表明，CNCC在植入颅顶损伤部位时具有更强的增殖能力并产生更多的皮质骨，而BMMSC则产生更多的骨髓，这表明这些组分的组织化和相对量将影响组织工程产生的新骨质量(Chung等,2009；Leucht等,2008)。
颅面骨与长骨的区别在于其膜内相对于软骨内的骨化，并且它们的骨髓隙显著少于长骨。由于长骨的质量，与长骨的海绵状、小梁状质量相比，面部和头骨的骨骼是致密皮质骨。颅面骨的密度对于保护包括大脑和感觉器官在内的重要结构至关重要。因此，颅面骨保护我们与世界的界面。这些骨骼的损伤不仅有害于这些结构的功能，而且有害于患者的身份，因为它可以毫不夸张地改变呈现给世界的面容。
由于需要进行减压颅骨切除术来使神经创伤事件如开放性头骨外伤、中风和蛛网膜下腔出血的总体存活率增加，因此现在每年在美国进行的颅骨成形术数量超过5,000例(Ng和Nawaz,J Craniofac Surg,2014)。头部外伤、先天性缺损、疾病和甚至肿瘤切除的事件常常使患者具有较大或全层颅顶缺损，其无法自愈。
这些临界尺寸缺损(CSD)目前由外科医生使用金属或塑料植入物进行治疗，这对患者造成不便，并且在结构上不如天然骨。可吸收板的抗张强度仅持续3-4周，并且通常需要超过一年的时间才能吸收，从而减少了形成更自然界面的机会。此外，在丧失骨缝(suture)结构的情况下，植入物和板的使用阻止了骨缝的再生(Mardas等,J CraniofacSurg,2002)。
骨缝在损伤的情况下意义重大，因为它贡献了间充质干细胞(MSC)，这些干细胞主要负责颅顶骨的损伤修复(Zhao等,Nature Cell Biology,2015)。对于由骨缝MSC支持的脑部与天然颅顶持续协调成长的小儿患者，颅顶缺损中的骨缝再生尤为重要。只有生物材料才能够参与这种生长和反馈过程。
骨移植是外科医生提供的另一种解决方案。对于临界尺寸的损伤，身体其它地方适合移植的自体骨供应不足。骨移植通常导致组织排斥，或者特别是在小儿患者中，导致吸收(Lam等,Craniomaxillofacial Trauma Reconstruction,2015)。骨移植还对身体造成额外的创伤，如果可能的话，应该避免。
因此，目前对于临界尺寸的颅面缺损的解决方案并不令人满意。显著需要改进临界尺寸颅顶缺损的治疗。
在过去的十年中，MSC由于能够分化为成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、肌细胞和神经元样细胞而在损伤修复研究中变得越来越流行(Jiang等,Nature,2002)。干细胞通过响应于受损组织进行增殖而微妙地协调动态平衡(Biteau等,Cell Stem Cell,2011)。理想地，可使用能够适当调节皮质骨动态平衡的干细胞群体来愈合颅骨缺损。
人们正在探索生物打印的最新进展以克服CSD治疗的这些不足，并为生物医学工程师提供了根据需求设计支架形状的机会(Nyberg等)。存在几种用于制造3D支架的固体自由成型制造(solid free-form fabrication，SFF)方法。基于挤出的打印工艺是使用热聚合物如PLG和PLA来制造支架的常见生物打印方法之一。
由于打印能力，基于挤出的方法难以制造具有复杂的3D微观尺度结构的支架。例如，基于PCL/TCP和PCL/HA的复合材料支架是通过熔融沉积建模(FDM)来制造的，其纤维直径大于200μm(Nyberg等)。为了实现高百分比的HA/TCP，开发了混合工艺。在这样的工艺中，首先使用3D打印方法将具有粘合剂的HA或TCP粉末成型为3D形状(“生坯”)，然后通过后处理如高温烧结和/或化学溶解来除去内部粘合剂(Leukers等，Zeng等，Witek,Diogo等，He等，Castilho等，Zhang等，Trombetta等)。在后处理之后，仅在HA/TCP粒子之间产生亚微米孔。因此，有必要构建具有微观尺度孔洞的支架以促进营养运输和细胞附着。然而，通过上述打印工艺仅制造了具有数百微米孔洞的宏观尺度支架。
由于打印能力的限制，特征尺寸小于100μm的微观尺度结构难以使用基于挤出的3D打印方法进行打印(Diogo等，He等，Castilho等，Zhang等，Trombetta等，Nadeem等)。此外，打印支架的几何形状相对简单，就像网格基质一样，因为挤出的复合材料细丝只能堆叠简单的结构以避免支撑和变形(Diogo等，He等，Castilho等，Zhang等，Trombetta等，Nadeem等)。
对于骨再生，需要具有复杂几何形状和在数百微米至小于一微米范围内的分级多孔结构的支架(Nadeem等，DiLuca等)。开发3D打印工艺非常重要，该工艺可以制造具有仿生分级多孔结构的复合材料支架，以进一步研究新骨再生(Yang,Y等，Holmes等，Salerno等，Yang,J.Z.等)。
关于组织再生产品的详细讨论，例如参见：Sherwood等,“用于组织再生的复合材料及其制造方法(Composites for tissue regeneration and methods of manufacturethereof)”美国专利第6,454,811号；Teoh等,“用于组织工程应用的三维生物可吸收支架(Three-dimensional bioresorbable scaffolds for tissue engineeringapplications)”美国专利7,968,026；Lin等,“用于椎间盘修复和再生以及用于关节修复和再生的工程支架(Engineered scaffolds for intervertebral disc repair andregeneration and for articulating joint repair and regeneration)”美国专利第8,275,594号；Xuenong等,“用于支持组织生长的整形外科植入物以及形成植入物和组织的方法(Orthopaedic implant for supporting tissue growth and methods of formingthe implant and tissue)”美国专利第8,895,046号；Roeder等,“具有骨骼生长因子的组织支架(Tissue scaffolds having bone growth factors)”美国专利第9,550,012号；Xuenong等,“通过离体干细胞向三维小梁金属中长出来进行骨组织工程(Bone tissueengineering by ex vivo stem cells ongrowth into three-dimensional trabecularmetal)”美国专利申请公开第2005/0272153号；Pasini等,“具有机械生物相容性细胞材料的骨替代植入物(Bone replacement implants with mechanically biocompatiblecellular material)”美国专利申请公开第2014/0363481号；Biris“使用可生物降解的聚合物纳米复合材料的骨再生及其应用(Bone regeneration using biodegradablepolymeric nanocomposite materials and applications of the same)”美国专利申请公开第2015/0039097号；Zhang等,“制造组织工程骨的多步骤方法(Multi-step methodfor fabricating tissue engineering bone)”美国专利申请公开第2016/0058911号；Grayson,“使用基质血管级分、富含血小板衍生生长因子的水凝胶、三维打印的聚ε-己内酯支架进行骨再生(Bone regeneration using stromal vascular fraction,platelet-derived growth factor-rich hydrogel,three-dimensional printed poly-epsilon-caprolactone scaffolds)”美国专利申请公开第2016/0095958号；和Cox等,“基于可交联的3d打印生物材料的植入物及其制造方法(Crosslinkable 3d printed biomaterial-based implants and methods of manufacture thereof)”美国专利申请公开第2016/0184480号。这些文件中的每一个的全部内容通过引用并入本文。
天然骨组织由蜂窝状的分级多孔结构组成，该结构支持细胞的生长，提供营养运输的空间并承受不同类型的环境载荷(Basu等)。传统上，用于处理临界骨缺损的医学治疗是植入生物相容性骨移植物，该移植物由坚韧但轻质的材料制成，包括金属、复合材料或生物陶瓷(Wang等，Petit等)。然而，这些插入的植入物不能完全起到人类天然骨骼的作用(Basu等，Wang等)。为了愈合骨临界缺损，一种潜在的解决方案是通过利用与患者的细胞一起培养的三维(3D)支架来再生骨组织(Wang等)。在支架降解期间，通过培养具有足够营养供应的生物活性细胞，新的骨组织可以逐渐长回以愈合缺损(参见图36(a))。对于3D支架，多孔结构为细胞附着提供了足够的空间，并且十字形的内部孔网络使血管能够轻松地将营养递送到支架内的任何位置(Wang等)。此外，支架的材料也对骨组织的再生有影响，并且要求其具有生物相容性、生物无毒性和生物降解性。总体而言，支架的材料和结构两者在骨缺损的愈合中都起着关键的作用(Bose等，Rengier等)。
羟磷灰石(HA)纳米粉末在组织应用中显示出有前途的特性，因为它能够通过并入可生物降解的聚合物复合材料中(Kim等)或沉积在生物相容性基质上(Sato等)来促进成骨细胞的粘附和增殖。磷酸三钙(TCP)是天然人骨的一种主要成分，它是一种可生物降解的生物陶瓷，被广泛用于制造用于骨骼治疗和整形外科的骨移植替代物(Wang等，Petit等，Ho等，Shao等)。
已经开发出许多不同的技术如溶剂浇铸、颗粒浸出、相分离、熔融成型、高压压制和锻造来制造基于HA/TCP的3D支架(Macchetta等，Miao等)。然而，通过这些方法制造的HA/TCP支架的几何结构经常是简单的，为细胞培养支架和骨组织再生的研究设置了限制(Wang等，Ho等)。
生物打印的最新进展可能显示出克服这些不足的可能性，并揭示了生物医学工程师根据手术需求来设计定制支架的潜力(Ho等，Kim等)。开发了几种3D打印方法来制造具有特殊设计的几何结构的HA/TCP支架(Shao等，Nyberg等，Leukers等，Leukers等，Zeng等，Cox等，Wu等，Kon等，Kim等，Witek等)。例如，基于PCL/TCP和PCL/HA的复合材料支架是通过熔融沉积建模(FDM)制造的，其中纤维直径大于200μm(Nyberg等)。
开发了一种混合工艺来实现高百分比的HA/TCP浓度。具体而言，在3D打印工艺中使用混合有粘合剂的HA或TCP粉末来形成3D对象(称为生坯)，然后通过后处理如高温烧结或化学溶解来除去内部粘合剂(Leukers等，Leukers等，Zeng等，Witek等，Diogo等，He等，Castilho等，Zhang等)。例如，由β-TCP粉末和PVA溶液组成的β-TCP糊剂首先使用基于注射的打印方法积聚到3D网格基质中，并在1100摄氏度下烧结后获得最终的网格状裸露的β-TCP支架(Wu等)。
类似地，HA/TCP支架是通过基于挤出的打印工艺制造的，并且内部的聚合物添加剂在加热超过625摄氏度后被烧尽(Witek等)。后处理后，在HA/TCP粒子之间仅产生亚微米孔(Zeng等，Witek等，Diogo等，He等，Castilho等，Zhang等，Trombetta等，Castilho等)，并且这种内部结构过于致密以致于无法在细胞生长期间为细胞提供必要的空间来交换营养和代谢。因此，有必要构建具有在数百微米至亚微米级范围内的分级多孔结构的HA/TCP支架，以维持稳定化的营养运输和细胞代谢。
然而，大多数3D打印工艺只能制造具有数百微米级孔洞的宏观尺度HA/TCP支架。由于打印分辨率的限制，尺寸小于100μm的微观尺度特征很难用它们制造(Kim等，Witek等，Diogo等，He等，Castilho等，Zhang等，Trombetta等，Castilho等，Nadeem等)。此外，由于HA/TCP浆料细丝只能逐层堆叠以避免扭曲和支持增材，因此通过基于挤出的3D打印工艺制造的HA/TCP支架存在几何形状限制(Kim等，Witek等，Diogo等，He等，Castilho等，Zhang等，Trombetta等)。
为了解决具有复杂几何形状和分级孔隙率的HA/TCP支架用于研究骨组织再生的日益增长的需求(Nadeem等，Di Luca等)，开发一种可以制造具有仿生分级多孔结构的HA/TCP支架的3D打印工艺对于进一步研究骨组织再生问题非常重要(Yang,Y.等，Holmes等，Salerno等，Yang,J.Z.等，Yang,Y.等)。
与大多数其它3D打印方法相比，基于掩模图像投影的立体光刻术(MIP-SL)能够制造具有相对复杂内部结构的自由形式表面模型(Li等，Yang,Y.等，Zhou,C.等，Li等，Zhou等)。使用宏观尺度MIP-SL工艺，与生物陶瓷混合的光敏聚合物可以首先通过高分辨率的光投射固化，并且稍后在高温烧结工艺之后将光固化聚合物完全烧尽(Zeng等，Song等(2015)，Son等(2017))。然而，宏观尺度MIP-SL的加工分辨率不能满足微观尺度特征制造的要求。
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上述每个出版物的全部内容通过引用并入本文。
发明内容
本发明涉及包括至少一种干细胞和至少一个支架的骨再生产品。本发明还涉及包括至少一种干细胞和至少一个支架的骨再生产品；其中所述支架包括适合于携带至少一种干细胞的任何支架。本发明还涉及包括至少一种干细胞和至少一个支架的骨再生产品；其中所述支架包括适合于携带所述至少一种干细胞的任何3D打印支架。本发明涉及包括干细胞制剂的骨再生产品。适合于本发明的干细胞可以包括适合于密质骨再生的干细胞、适合于松质骨再生的干细胞或其组合。所述骨再生产品可以进一步包括生长因子。本发明还涉及骨再生方法。本发明还涉及具有临界尺寸缺损的任何骨的治疗。本发明还涉及支架。本发明还涉及3D打印支架。本发明还涉及包括羟磷灰石(HA)和磷酸三钙(TCP)的支架。本发明还涉及包括羟磷灰石(HA)、磷酸三钙(TCP)和聚合物的支架。本发明还涉及包括聚合物的支架。本发明的聚合物可以通过使用光固化聚合物和/或单体来制备。本发明的支架可以包括生长因子。本发明的支架可以包括生长因子和小分子。所述小分子可以是Smurf 1抑制剂。
本公开的骨再生产品和方法可以包括支架；支架和生长因子；支架、生长因子和Smurf 1抑制剂；干细胞；或干细胞和支架；或干细胞、支架和生长因子；或干细胞、支架、生长因子和Smurf 1抑制剂。本公开的支架可以适合容纳这些细胞和/或生长因子和/或Smurf1抑制剂。
在本公开中，所述骨再生产品可以包括间充质干细胞(MSC)制剂和支架。所述MSC制剂可以包括干细胞混合物。所述干细胞混合物可以包括密质骨再生干细胞(DBR-SC)、松质骨再生干细胞(SBR-SC)或其混合物。
在本公开中，所述DBR-SC可以包括牙髓干细胞、牙髓组织来源的神经嵴细胞、来自人脱落乳牙的干细胞、牙周膜干细胞、牙囊干细胞、牙胚祖细胞、来自根尖牙乳头的干细胞、口腔上皮祖细胞/干细胞、牙龈来源的间充质干细胞、骨缝干细胞或其混合物。所述DBR-SC可以包括颅神经嵴来源的间充质干细胞(CNCC)、牙髓来源的干细胞(DPSC)或其混合物。所述SBR-SC可以包括骨髓来源的间充质干细胞(BMMSC)、脂肪组织来源的间充质干细胞(AMSC)或其混合物。所述SBR-SC可以包括骨髓来源的间充质干细胞(BMMSC)。
在本公开中，所述干细胞混合物可以包含DBR-SC和SBR-SC。所述DBR-SC可以包括牙髓干细胞、来自人脱落乳牙的干细胞、牙周膜干细胞、牙囊干细胞、牙胚祖细胞、来自根尖牙乳头的干细胞、口腔上皮祖细胞/干细胞、牙龈来源的间充质干细胞、骨缝干细胞或其混合物；并且SBR-SC包括骨髓来源的间充质干细胞(BMMSC)、脂肪组织来源的间充质干细胞(AMSC)或其混合物。MSC制剂可以包含DBR-SC和SBR-SC。所述DBR-SC可以包括DPSC、CNCC或其混合物；并且所述SBR-SC可以包括BMMSC。
在本公开中，干细胞混合物中的DBR-SC浓度可以在50％至100％的范围内(即，SBR-SC可以在0％至50％的范围内)，或在51％至100％的范围内，或在60％至100％的范围内，或在70％至100％的范围内，或在80％至100％的范围内，或在85％至95％的范围内，或为90％。与可以包括例如DBR-SC:SBR-SC比率小于1的干细胞混合物的骨再生产品相比，包含这种干细胞比率(即干细胞浓度)的这种骨再生产品可以特别适合于产生更多的骨基质(即，更密质骨)。
在本公开中，干细胞混合物中的SBR-SC浓度可以在50％至100％的范围内(即，DBR-SC可以在0％至50％的范围内)，或在51％至100％的范围内，或在60％至100％的范围内，或在70％至100％的范围内，或在80％至100％的范围内，或在85％至95％的范围内，或为90％。与可以包括例如DBR-SC:SBR-SC比率大于1的干细胞混合物的骨再生产品相比，包含这种干细胞比率(即比率)的这种骨再生产品可以特别适合于产生密度较小的骨基质(即松质骨)。
在本公开中，所述骨再生产品可以进一步包括生长因子。在本公开中，所述干细胞制剂可以进一步包括生长因子。在本公开中，所述支架可以进一步包括生长因子。在本公开中，所述骨再生产品可以进一步包括生长因子和Smurf 1抑制剂。在本公开中，所述干细胞制剂可以进一步包括生长因子和Smurf 1抑制剂。在本公开中，所述支架可以进一步包括生长因子和Smurf 1抑制剂。
在本公开中，所述生长因子可以包括骨形态发生蛋白(BMP)、印度刺猬因子(Indian hedgehog)(IHH)、转化生长因子β(TGFβ)；骨形态发生蛋白(BMP)；成纤维细胞生长因子(FGF)；Wnt配体和β-连环蛋白；胰岛素生长因子(IGF)；胶原蛋白-1；Runx2；骨桥蛋白；osterix；血管内皮生长因子(VEGF)；血小板衍生生长因子(PDGF)；骨保护素(OPG)；NEL样蛋白1(NELL-1)；或其混合物。在本公开中，所述生长因子可以包括BMP、IHH或其混合物。
在本公开中，所述Smurf 1抑制剂可以包括A01、A02、A03、A04、A05、A06、A07、A08、A09、A10、A11、A14、A15、A17、A18、A25、A54、A63、A75、非那米尔(phenamil)等，或其组合。在本公开中，所述Smurf 1抑制剂可以包括A01、A17、非那米尔或其组合。在本公开中，所述Smurf 1抑制剂可以包括非那米尔。
在本公开中，所述支架可以包括由包含聚己内酯(PCL)、聚己内酯二甲基丙烯酸酯(PCLDA)、磷酸钙、羟磷灰石(HA)、磷酸三钙(TCP)、聚乙二醇二丙烯酸酯(PEGDA)、甲基丙烯酰化明胶(GelMA)或其混合物的制剂生产的制品。
在本公开中，所述支架可以包括由包含通过使用光固化单体、光固化聚合物制备的聚合物、羟磷灰石(HA)、磷酸三钙(TCP)或其混合物的制剂生产的制品。在本公开中，所述支架可以包括聚己内酯(PCL)、聚己内酯二甲基丙烯酸酯(PCLDA)或其混合物。
在本公开中，所述支架可以包括至少一个第一腔室和至少一个第二腔室。所述至少一个第一腔室可以容纳包含干细胞混合物的间充质干细胞制剂，其中所述干细胞混合物中的DBR-SC的浓度在50％至100％的范围内，或在51％至100％的范围内，或在60％至100％的范围内，或在70％至100％的范围内，或在80％至100％的范围内，或在85％至95％的范围内，或为90％。所述至少一个第二腔室可以容纳包含干细胞混合物的间充质干细胞制剂，其中所述干细胞混合物中的SBR-SC的浓度在50％至100％的范围内，或在51％至100％的范围内，或在60％至100％的范围内，或在70％至100％的范围内，或在80％至100％的范围内，或在85％至95％的范围内，或为90％。
在本公开中，所述支架可以至少包括至少一个外部腔室和至少一个内部腔室。所述至少一个外部腔室可以容纳包括包含干细胞混合物的间充质干细胞制剂的骨再生产品，其中所述干细胞混合物中DBR-SC的浓度在50％至100％的范围内，或在51％至100％的范围内，或在60％至100％的范围内，或在70％至100％的范围内，或在80％至100％的范围内，或在85％至95％的范围内，或为90％。所述至少一个内部腔室可以容纳包括包含干细胞混合物的间充质干细胞制剂的骨再生产品，其中所述干细胞混合物中SBR-SC的浓度在50％至100％的范围内，或在51％至100％的范围内，或在60％至100％的范围内，或在70％至100％的范围内，或在80％至100％的范围内，或在85％至95％的范围内，或为90％。所述外部腔室可以部分地或基本上围绕所述内部腔室。所述外部腔室和所述内部腔室可以各自在其壁上包括孔。所述孔具有特征性长度。所述孔的特征性长度可以小于特定尺寸，使得每个干细胞可以保持限制在内部和/或外部腔室中。
在本公开中，所述支架可以包括羟磷灰石和磷酸三钙。羟磷灰石浓度可以在5重量％至30重量％的范围内并且磷酸三钙浓度可以在5重量％至30重量％的范围内。在本公开中，羟磷灰石浓度可以在10重量％至20重量％的范围内并且磷酸三钙浓度在10重量％至20重量％的范围内。在本公开中，羟磷灰石浓度可以在15重量％至20重量％的范围内并且磷酸三钙浓度可以在15重量％至20重量％的范围内。在本公开中，羟磷灰石浓度可以为15重量％并且磷酸三钙浓度可以为15重量％，或者羟磷灰石浓度可以为20重量％并且磷酸三钙浓度可以为20重量％。
在本公开中，所述支架的抗压强度在0.1MPa至10MPa的范围内；或在1MPa至8MPa的范围内；或在5MPa至7MPa的范围内。
在本公开中，所述支架的孔隙率在1％至40％的范围内；或在3％至30％的范围内；或在3％至20％的范围内；或在3％至10％的范围内。
上述骨再生产品、其特征、其制备方法和/或其在治疗具有缺损的骨骼中的用途的任何组合都在本公开的范围内。
根据以下对说明性实施方式、附图和权利要求的详细说明的评述，这些以及其它组分、步骤、特征、目的、益处和优点现在将变得显而易见。
附图说明
附图是说明性实施方式。它们未示出所有实施方式。可以附加地或替代地使用其它实施方式。为了节省空间或为了更有效地说明，可以省略可能显而易见或不必要的细节。一些实施方式可以在附加的组分或步骤和/或没有图示的所有组分或步骤的情况下实践。当相同的附图标记出现在不同的附图中时，它表示相同或相似的组分或步骤。
该专利或申请文件包含至少一个彩色附图。在提出请求并支付必要的费用后，将由专利局提供带有彩色附图的本专利或专利申请公开的副本。
图1.不同比率的CNCC和BMMSC产生的骨具有不同的骨基质和骨髓隙。在免疫受损小鼠的皮肤下以9:1和1:9的比率(2×106个总细胞)植入CNCC和BMMSC后三个月，产生了骨骼的Gomori三色染色。
图2.皮下植入物中产生的骨基质和骨髓的定量。使用ImageJ进行定量。*，p<0.05。
图3.PCLDA支架的生物相容性和降解测试。(A)PCLDA/HA/TCP支架的摄影图像，(B)(A)中所示的PCLDA/HA/TCP支架的放大的摄影图像，(C)用PCL支架体外培养72小时后的活NIH3T3细胞的定量。(D)通过在皮下植入30或60天后测量其干重而获得的PCL支架的降解概况。*，p<0.05；**，p<。
图4.小鼠CSD模型。(A-I)活裸鼠的股骨节段缺损手术程序。(J、K)手术后的X射线图像显示，股骨中的2mm缺损为整个股骨长度的约10％。
图5.植入小鼠CSD模型中的基于PCLDA的支架。(A)植入股骨缺损中以测试生物降解性的打印支架。(B-F)手术后2天到12周(12W)的缺损图像，表明仅支架植入不足以使CSD中的骨再生。
图6.IHH治疗后，DPSC的成骨作用增加。DPSC的茜素红染色单独培养(对照；ctrl)或与刺猬因子抑制剂GDC0449或IHH一起培养。进行ANOVA。*表示与对照相比有统计学显著差异，并示出P值。每组n＝4个样品。
图7.IHH加速股骨中CSD的愈合。在股骨CSD中植入单独的支架(对照)或含有DPSC、DPSC和GDC0449抑制剂、或DPSC和IHH的HA/TCP后2周(w)、4周和8周拍摄的X射线图像。
图8.多剂量的IHH和BMP加速了股骨中CSD的愈合。在股骨CSD中施用单剂量或多剂量的BMP2或IHH激动剂后2周、4周和8周拍摄的X射线图像。
图9.IHH从浸渍有生长因子的支架中稳定释放。在1-12天后从单独的支架、浸渍有生长因子的支架或单独的生长因子释放在培养基中的生长因子(GF)浓度的ELISA定量。
图10.用IHH和BMP浸渍的支架加速了股骨中CSD的愈合。在产生股骨CSD和植入支架后4周拍摄X射线图像。
图11.在小鼠CSD中BMP2和非那米尔治疗后实现了皮质骨接合。在股骨CSD后2周(W)、4周和12周拍摄X射线图像。在手术后12周收获样品后拍摄MicroCT图像。
图12.用于测试重建骨的抗张强度的三点弯曲机。
图13.猪颅顶损伤后8周的3cm缺损，其填充有：(A)热灭活的DPNCC+HA/TCP纳米粒子；(B)仅HA/TCP纳米粒子；(C)成纤维细胞+HA/TCP纳米粒子。
图14.未处理(A)或载有HA/TCP纳米粒子和DPNCC的全层3cm临界尺寸缺损。
图15.猪颅顶损伤后8周的3cm缺损，其填充有：(A)HA/TCP 3D打印的支架+DPNCC；(B)仅HA/TCP支架；(C)DPNCC+HA/TCP纳米粒子；(D)仅HA/TCP纳米粒子(无细胞)。
图16.牙髓神经嵴间充质干细胞的单细胞集落。
图17.加载到猪颅顶中的3cm临界尺寸缺损中的3D打印的HA/TCP支架(无细胞)。
图18.使用3D打印支架进行骨组织再生的示意图。(a)使用3D打印支架进行长骨临界缺损的愈合；(b)使用3D打印支架进行的颅骨缺损再生图。
图19.用于颅骨缺损再生的支架的设计程序。
图20.长骨再生的支架设计。CNCC和BMMSC产生不同类型的骨。取决于要修复的部位，致密的皮质骨(颅面，CNCC)或具有更多骨髓隙的骨(长骨，BMMSC)。(A)长骨，(B)骨再生：2周、5周和12周后，1.5mm缺损愈合，但2mm缺损未愈合，(C)支架的实例包括两个腔室，用于骨髓生长的内部腔室(“骨髓支架”)和用于皮质骨生长的外部腔室(“皮质骨支架”)。(D)长骨治疗的实例。
图21.具有不同几何结构的支架的计算机辅助设计。(A)网格、(B)微晶格结构和(C)仿生骨支架。
图22.基于PCL-DA的生物材料制备图。
图23.使用基于旋转MIP的立体光刻术制造宏观尺度颅骨缺损支架。
图24.基于宏观尺度旋转MIP的立体光刻术中的光校准和曝光时间设置。
图25.基于宏观尺度旋转MIP的立体光刻术中的HA/TCP支架的制造工艺规划。
图26.脱脂和烧结温度设定曲线。
图27.HA/TCP支架的补偿设计。
图28.每个工艺后HA/TCP支架的制造结果。(A)生坯、(B)棕坯、(C)完成件。
图29.具有不同结构的HA/TCP支架的收缩率。
图30.使用基于MIP的光刻术的生物打印设置。
图31.基于PCL-DA的可生物降解的光固化材料的固化深度控制。
图32.具有不同百分比的生长因子(rh/m/Rbmp-2和rh/mlhh(c28II)-N)的生长因子释放研究。
图33.通过不同的曝光时间，具有不同交联密度的生长因子释放研究。
图34.用于长骨再生的微观尺度支架制造结果。
图35.用于长骨再生的微观尺度支架制造结果。
图36.用于长骨临界缺损的具有分级多孔结构的3D打印HA/TCP支架的示意图。(a)利用3D打印HA/TCP支架进行长骨愈合的示意图；(b)已开发的HA/TCP悬浮液3D打印工艺的示意图；(c)利用基于流延成型的浆料进料的基于微观尺度投影的立体光刻术的草图；(d)2D图案化固化光束；(e)将为小鼠的长骨设计的仿生支架模型分割成一系列投影图像；(f)仿生HA/TCP支架的打印生坯的显微图像；以及(g)具有分级孔的烧结工艺之后的最终仿生HA/TCP支架的显微镜和SEM图像。
图37.在脱脂和烧结工艺之前和之后，对30％HA/TCP支架进行X射线衍射测试。
图38.使用基于浆料的μMIP-SL制造HA/TCP支架。(a)基于浆料的μMIP-SL系统中的光学系统；(b)圆周运动过程的硬件设计；(c)用于制备高粘度HA/TCP悬浮液的浆料进料工艺；(d)具有不同浓度的HA/TCP粒子的HA/TCP悬浮液的粘度；(e)具有不同浓度的光吸收剂的HA/TCP悬浮液的曝光时间；以及(f)具有不同浓度的光吸收剂的HA/TCP悬浮液的固化深度。
图39.在不同条件下烧结的HA/TCP支架的孔隙率和机械性能。(a)30重量％HA/TCP支架在不同温度下进行后处理后的光学显微镜和SEM图像；(b)在不同条件下制造的HA/TCP支架的抗压强度；(c)在不同条件下制造的HA/TCP支架的孔隙率；以及(d)在1250℃下烧结的30重量％HA/TCP支架的光学显微镜和SEM图像。
图40.烧结后HA/TCP支架的收缩。(a)具有30重量％HA/TCP和不同微孔洞设计的3D打印支架；(b)具有30重量％HA/TCP和不同微孔洞的烧结支架；(c)在后处理之前和之后的HA/TCP支架的显微镜图像；(d)在不同的烧结条件下在Z和XY方向上30重量％HA/TCP支架的收缩率；以及(e)具有不同浓度的HA/TCP粒子的HA/TCP支架的收缩率。
图41.具有分级多孔结构的HA/TCP支架的制造结果。(a)已开发的基于浆料的μMIP-SL在XY方向上的打印能力；(b)已开发的基于浆料的μMIP-SL在Z方向上的打印能力；(c)用于收缩补偿的HA/TCP支架的偏移操作；(d)补偿之前和之后的HA/TCP支架的打印结果；(e)和(f)分别具有微晶格结构和仿生骨结构的HA/TCP支架的CAD模型和制造结果。
图42.在不同条件下打印的HA/TCP支架的体外性能。(a)HA/TCP支架的细胞活力；和(b)在补充有用不同浓度打印的HA/TCP支架的培养基中培养的细胞的增殖。
图43.用我们开发的方法打印的分级多孔HA/TCP支架进行裸鼠的长骨临界缺损愈合。(a)活裸鼠的长骨；(b)活裸鼠的2mm缺损模型；(c)在活裸鼠的2mm缺损处植入具有BMMSC的HA/TCP支架；以及(d)在不具有CNCC和BMMSC，具有CNCC和BMMSC，具有CNCC、BMMSC和HA/TCP支架的情况下2mm缺损的长骨愈合结果的CT图像。
图44.通过使用本发明的骨再生产品治疗小鼠CSD后实现了皮质骨接合，其中所述骨再生产品包括BMP2和非那米尔。(A)在股骨CSD后2周、4周和8周拍摄X射线图像。(B)在手术后12周收获样品后拍摄MicroCT图像。
具体实施方式
现在描述说明性实施方式。可以附加地或替代地使用其它实施方式。为了节省空间或为了更有效的呈现，可以省略可能显而易见或不必要的细节。一些实施方式可以用附加的组分或步骤和/或在不存在所描述的所有组分或步骤下实践。
在本公开中使用以下首字母缩写词。
3D：三维
AA：丙烯酸
AM：增材制造
AMSC：脂肪组织来源的间充质干细胞
BJ：粘合剂喷射
BMMSC：骨髓组织来源的间充质干细胞
BMP：骨形态发生蛋白
BMP2：骨形态发生蛋白2
CNCC：颅组织来源的神经嵴细胞
CAD：计算机辅助设计
CT-MSC：颅面组织来源的间充质干细胞
CSD：临界尺寸缺损
CT扫描：计算机断层扫描
DBR-SC：密质骨再生干细胞
DLP：数字光处理
DMD：数字微镜装置
DPBS：杜尔贝科(Dulbecco)磷酸盐缓冲盐水
DPNCC：牙髓组织来源的神经嵴细胞
DPSC：牙髓干细胞
DFSC：牙囊干细胞
EBM：电子束熔化
FDM：熔融沉积建模
FGF：成纤维细胞生长因子
GelMA或GELMA：甲基丙烯酰化明胶
GMSC：牙龈来源的间充质干细胞
HA/TCP：羟磷灰石/磷酸三钙
HA：羟磷灰石
HMBS：2-羟基-4-甲氧基-二苯甲酮-5-磺酸
IGF：胰岛素生长因子
IHH：印度刺猬因子
LOM：层压物体制造
MA：丙烯酸甲酯
min：分钟
mins：分钟
MJ：材料喷射
mm：毫米
MSC：间充质干细胞
MIP-SL：基于掩模-图像-投影的立体光刻术
NELL-1：NEL样蛋白1
OESC：口腔上皮祖细胞/干细胞
OPG：骨保护素
PBS：磷酸盐缓冲盐水
PCL：聚己内酯
PCLDA或PCL-DA：聚己内酯二甲基丙烯酸酯
PEGDA：聚乙二醇二丙烯酸酯
PEDGE：聚(乙二醇)二丙烯酸酯
PDGF：血小板衍生生长因子
PDLSC：牙周膜干细胞
非那米尔：非那米尔甲磺酸盐
PSC：骨膜来源的干细胞
s：秒
SBR-SC：松质骨再生干细胞
SCAP：来自根尖牙乳头的干细胞
SGSC：唾液腺来源的干细胞
SHED：来自人脱落乳牙的干细胞
SLS：选择性激光烧结
SMSC：从骨缝间充质分离的Gli1+细胞(骨缝来源的干细胞)
Smurf1：Smad泛素化调节因子-1
SLA：立体光刻术
TCP：磷酸三钙
TEMPO：2,2,6,6-四甲基哌啶1-氧基
TGFβ：转化生长因子β
TGPC：牙胚祖细胞
VEGF：血管内皮生长因子
WC：蜡铸
Wt％：重量％或重量百分比
μm：微米
本发明涉及包括至少一种干细胞和至少一个支架的骨再生产品。本发明还涉及包括至少一种干细胞和至少一个支架的骨再生产品；其中所述支架包括适合于携带所述至少一种干细胞的任何支架。本发明还涉及包括至少一种干细胞和至少一个支架的骨再生产品；其中所述支架包括适合于携带所述至少一种干细胞的任何3D打印支架。本发明涉及包括干细胞制剂的骨再生产品。适合于本发明的干细胞可以包括适合于密质骨再生的干细胞、适合于松质骨再生的干细胞或其组合。所述骨再生产品可以进一步包括生长因子。本发明还涉及骨再生方法。本发明还涉及具有临界尺寸缺损的任何骨的治疗。本发明还涉及支架。本发明还涉及3D打印支架。本发明还涉及包括羟磷灰石(HA)和磷酸三钙(TCP)的支架。本发明还涉及包括羟磷灰石(HA)、磷酸三钙(TCP)和聚合物的支架。本发明还涉及包括聚合物的支架。本发明的聚合物可以通过使用光固化聚合物和/或单体来制备。本发明的支架可以包括生长因子。本发明的支架可以包括生长因子和小分子。所述小分子可以是Smurf1抑制剂。
本发明涉及包括至少一种干细胞的骨再生产品。所述至少一种干细胞可以是任何干细胞。干细胞的实例可以是胚胎干细胞、胎儿干细胞、成体干细胞、羊膜干细胞、脐带血干细胞、诱导多能干细胞、颅神经嵴细胞或其任何组合。
在本公开中，可以通过多种已知方法制备干细胞。所有这些干细胞都在本公开的范围内。例如，在制备的不同阶段获得的干细胞，例如从含有它们的组织获得的干细胞，到它们从组织中分离的干细胞，再到它们从其分离形式扩增的干细胞，都可以被并入到骨再生产品中。例如，本公开的干细胞可以从组织中分离(分离的干细胞)，或者可以首先分离并且然后扩增形成组织(扩增的干细胞)，或者可以不经任何分离/或扩增而存在于所使用的组织中，或者可以是这些类型的干细胞的任何组合。根据其制备阶段，干细胞的纯度可以大于0.1％，或者纯度大于1％，或者纯度大于10％，或者纯度大于20％，或者纯度大于30％，或者纯度大于40％，或者纯度大于50％，或者纯度大于60％，或者纯度大于70％，或者纯度大于80％，或者纯度大于90％，或者纯度大于95％，或基本上纯的。所有这些类型的干细胞都在本公开的范围内，并且在本文中统称为“干细胞”。
例如，干细胞可以包括间充质干细胞(MSC)。间充质干细胞的实例可以包括骨髓来源的间充质细胞(BMMSC)，脂肪组织来源的干细胞(AMSC)，牙髓干细胞(DPSC)，来自人脱落乳牙的干细胞(SHED)，牙周膜干细胞(PDLSC)，牙囊干细胞(DFSC)，牙胚祖细胞(TGPC)，来自根尖牙乳头的干细胞(SCAP)，口腔上皮祖细胞/干细胞(OESC)，牙龈来源的间充质干细胞(GMSC)，骨膜来源的干细胞(PSC)，唾液腺来源的干细胞(SGSC)，从骨缝间充质分离的Gli1+细胞(骨缝来源的间充质细胞，SMSC)，诱导的多能干细胞及其组合。
关于这些干细胞、适合于其收获的组织、从这些组织中分离的方法、其扩增以及为了治疗而施用这些干细胞的方法的详细公开内容，参见例如Egusa等,“牙科干细胞-第I部分：干细胞来源(Stem Cells in Dentistry-Part I:Stem Cell Sources)”J.Prosthodontic Res.(212)第56卷,第151-165页；Shi等,“具有高表达Fas配体的干细胞组合物(A composition of stem cells having highly expressed Fas ligand)”,WO2015038665A1；Atsuta等,“间充质干细胞经由Fas/Fas配体通路抑制多发性骨髓瘤细胞(Mesenchymal stem cells inhibit multiple myeloma cells via the Fas/Fas ligandpathway)”Stem Cell Research&Therapy,2013,4:111；Le等,“牙龈来源的干细胞及其在免疫调节和重建中的应用(Gingiva Derived Stem Cell and Its Application inImmunomodulation and Reconstruction)”,U.S.2012/0128636A1；Shi等,“间充质干细胞的组合物(A Composition of Mesenchymal Stem Cells)”,WO2014210037；Shi等,“间充质干细胞诱导的免疫调节的组合物和治疗方法(Compositions and Treatment Methods forMesenchymal Stem Cell-Induced Immunoregulation)”,US20150104428A1；Shi等,“高端粒酶活性的骨髓间充质干细胞，其制备方法以及基于其的药物和治疗方法(HighTelomerase Activity Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells,Methods of Producingthe Same and Pharmaceuticals and Treatment Methods Based Thereon)”,US20130330300 A1；Shi等,“通过抑制干扰素-γ和肿瘤坏死因子-α改善组织再生的方法和组合物(Methods and Compositions for Improved Tissue Regeneration bySuppression of Interferon-Gamma and Tumor Necrosis Factor-Alpha)”,US20140154220A1；Gronthos等,“体外和体内的产后人牙髓干细胞(DPSC)(Postnatalhuman dental pulp stem cells(DPSCs)in vitro and in vivo)”(2000)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97:13625-13630；Miura等,“SHED：来自人脱落乳牙的干细胞(SHED:stem cells from human exfoliated deciduous teeth)”(2003)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 100:5807-5812；Yamaza等,“来自人脱落乳牙的干细胞的免疫调节特性(Immunomodulatory properties of stem cells from human exfoliateddeciduous teeth)”(2011)Stem Cell Res.Ther.1:5-14；Seo等,“来自人牙周膜的多能产后干细胞的研究(Investigation of multipotent postnatal stem cells from humanperiodontal ligament)”(2004)Lancet 364:149-155；以及Morsczeck等,“从人智齿牙囊中分离前体细胞(PC)(Isolation of precursor cells(PCs)from human dentalfollicle of wisdom teeth)”(2005)Matrix Biol.24:155-65；Chung等,“迁移后颅神经嵴细胞的干细胞特性及其在牙槽骨再生和牙齿发育中的效用(Stem Cell Property ofPostmigratory Cranial Neural Crest Cells and Their Utility in Alveolar BoneRegeneration and Tooth Development)”Stem Cells.2009年4月；27(4):第866-877页；以及Zhao等,“骨缝为颅面骨的间充质干细胞提供生境(The suture provides a niche formesenchymal stem cells of craniofacial bones)”Nature Cell Biology,第17卷,第4期,2015年4月,第386-396页，以及Zhao出版物的补充信息、方法和任何其它相关参考文献。这些出版物中的每一个的全部内容通过引用并入本文。
颅神经嵴细胞(CNCC)可能会产生神经元、神经胶质细胞、成骨细胞和其它细胞类型，忠实地模拟了体内迁移后CNCC的分化过程。与例如骨髓组织来源的间充质干细胞(BMMSC)和脂肪组织来源的间充质干细胞(AMSC)相比，CNCC可能更适合支持密质(即致密或皮质)骨形成。
类似地，来自颅面组织的间充质干细胞(MSC)也可能更适合于支持密质骨形成。因而，颅面组织来源的间充质干细胞(CT-MSC)是DBR-SC的其它实例。CT-MSC的实例可以包括牙髓干细胞(DPSC)，来自人脱落乳牙的干细胞(SHED)，牙周膜干细胞(PDLSC)，牙囊干细胞(DFSC)，牙胚祖细胞(TGPC)，来自根尖牙乳头的干细胞(SCAP)，口腔上皮祖细胞/干细胞(OESC)，牙龈来源的间充质干细胞(GMSC)，骨膜来源的干细胞(PSC)，唾液腺来源的干细胞(SGSC)，来自骨缝间充质的Gli1+细胞(骨缝来源的间充质细胞，SMSC)，及其组合。
可以支持这种密质骨再生的干细胞在本文中称为“密质骨再生干细胞(DBR-SC)”。
与例如CNCC和CT-MSC相比，BMMSC、AMSC或其组合可能更适合在新形成的骨中以广泛的骨髓隙支持骨再生。这样的骨具有较不致密的骨结构并且包括更多的骨髓。它们是松质(即海绵状或小梁)骨。
可以支持这种松质骨再生的干细胞在本文中称为“松质骨再生干细胞(SBR-SC)”。
在一个实例中，骨再生产品可以包括间充质干细胞制剂。所述间充质干细胞制剂可以包括密质骨再生干细胞(DBR-SC)、松质骨再生干细胞(SBR-SC)或其混合物。所述DBR-SC可以包括至少一种颅神经嵴来源的间充质干细胞(CNCC)。所述SBR-SC可以包括至少一种非CNCC的间充质干细胞。
DBR-SC可以包括源自颅面组织的干细胞。例如，DBR-SC可以包括牙髓干细胞、来自人脱落乳牙的干细胞、牙周膜干细胞、牙囊干细胞、牙胚祖细胞、来自根尖牙乳头的干细胞、口腔上皮祖细胞/干细胞、牙龈来源的间充质干细胞、骨缝干细胞或其混合物。例如，DBR-SC可以包括牙髓来源的干细胞(DPSC)。
SBR-SC可以包括骨髓来源的间充质干细胞(BMMSC)、脂肪组织来源的间充质干细胞(AMSC)或其混合物。例如，SBR-SC可以包括骨髓来源的间充质干细胞(BMMSC)。
间充质干细胞制剂可以包括干细胞混合物。所述干细胞混合物可以包括密质骨再生干细胞(DBR-SC)、松质骨再生干细胞(SBR-SC)或其混合物。
在本公开中，干细胞比率、干细胞百分比和/或干细胞量是基于干细胞的数目。例如，DBR-SC:SBR-SC的比率是DBR-SC的数目与SBR:SC的数目的比率。例如，当干细胞混合物中DBR-SC:SBR-SC的比率为9:1时，干细胞混合物由以干细胞数目计90％的DBR-SC和以干细胞数目计10％的SBR-SC形成。或者，例如，当干细胞混合物中DBR-SC:SBR-SC的比率为9:1时，干细胞混合物由90％的DBR-SC和10％的SBR-SC形成。
在干细胞混合物中，DBR-SC与SBR-SC的比率(DBR-SC:SBR-SC)可以等于或大于1。例如，在这样的DBR-SC:SBR-SC比率中，干细胞混合物中的DBR-SC浓度可以在50％至100％的范围内(即SBR-SC可以在0％至50％的范围内)，或在51％至100％的范围内，或在60％至100％的范围内，或在70％至100％的范围内，或在80％至100％的范围内，或在85％至95％的范围内，或为90％。与可以包括例如DBR-SC:SBR-SC比率小于1的干细胞混合物的骨再生产品相比，包含这种干细胞比率(即干细胞浓度)的这种骨再生产品可以特别适合于产生更多的骨基质(即，更致密的骨)。
在干细胞混合物中，DBR-SC与SBR-SC的比率(DBR-SC:SBR-SC)可以等于或小于1。例如，在这样的DBR-SC:SBR-SC比率中，干细胞混合物中的SBR-SC浓度可以在50％至100％的范围内(即DBR-SC可以在0％至50％的范围内)，或在51％至100％的范围内，或在60％至100％的范围内，或在70％至100％的范围内，或在80％至100％的范围内，或在85％至95％的范围内，或为90％。与可以包含例如DBR-SC:SBR-SC比率大于1的干细胞混合物的骨再生产品相比，包含这种干细胞比率(即比率)的这种骨再生产品可以特别适合于产生密度较小的骨基质(即松质骨)。
DBR-SC可以包括CNCC。SBR-SC可以包括BMMSC。
在本公开中，骨再生产品可以进一步包括生长因子。干细胞混合物可以进一步包括生长因子。支架可以进一步包括生长因子。
在本公开中，生长因子可以是任何生长因子。生长因子的实例是骨形态发生蛋白(BMP)；印度刺猬因子(IHH)；转化生长因子β(TGFβ)；骨形态发生蛋白(BMP)，例如BMP-2、4、6和9；成纤维细胞生长因子(FGF)，如FGF-1和2；上皮细胞生长因子(EGF)；Wnt配体和β-连环蛋白；胰岛素生长因子(IGF)，如IGF-1和IGF-2；胶原蛋白-1；Runx2；骨桥蛋白；Osterix；血管内皮生长因子(VEGF)；血小板衍生生长因子(PDGF)；骨保护素(OPG)；NEL样蛋白1(NELL-1)；或其任何组合。关于此类生长因子的详细公开内容，参见例如Devescovi,V.等,“骨修复中的生长因子(Growth factors in bone repair)”Chir Organi Mov 92,161,2008；JamesA.W.“控制MSC成骨和成脂分化的信号转导通路的综述(Review of Signaling PathwaysGoverning MSC Osteogenic and Adipogenic Differentiation)”Scientifica(Cairo)2013；2013:684736；Carofino B.C.等,“基因疗法在骨折愈合中的应用(Gene therapyapplications for fracture healing)”J Bone Joint Surg Am,90(增刊1)(2008),第99-110页；Javed A.等,“骨形成的遗传和转录控制(Genetic and transcriptional controlof bone formation)”Oral Maxillofac Surg Clin North Am.2010；22:283-93；Chen G.等人,“成骨细胞分化和骨形成中的TGF-β和BMP信号转导(TGF-βand BMP signaling inosteoblast differentiation and bone formation)”Int.J.Biol.Sci.2012；8:272-288.doi:10.7150/ijbs.2929；Ornitz,D.M.等,“软骨内和膜内骨发育和人类遗传疾病中的FGF信号转导通路(FGF signaling pathways in endochondral and intramembranousbone development and human genetic disease)”.Genes Dev.16,1446-1465(2002)；Krishnan V.等,“通过Wnt信号转导调节骨量(Regulation of bone mass by Wntsignaling)”J.Clin.Invest.116 1202-1209(2006)；以及Boyce B.F.等,RANKL/RANK/OPG在骨建模和重塑中的功能(Functions of RANKL/RANK/OPG in bone modeling andremodeling)”Arch Biochem Biophys.473(2):139-146(2008)。这些出版物中的每一个的全部内容通过引用并入本文。
骨再生产品可以进一步包括Smad泛素化调节因子-1(Smurf1)抑制剂，其可以进一步改善CSD的愈合。可以通过防止用于降解的某些信号成分的泛素化来正向调节骨形态发生蛋白(BMP)通路，从而达到愈合的这种改善。因而，可以正向调节骨形态发生蛋白(BMP)通路的任何抑制剂都在本公开的范围内。
Smurf1抑制剂的实例可以是A01、A02、A03、A04、A05、A06、A07、A08、A09、A10、A11、A14、A15、A17、A18、A25、A54、A63、A75、非那米尔等，或其组合。Smurf1的实例也可以是A01、A17、非那米尔或其组合。
关于A01、A02、A03、A04、A05、A06、A07、A08、A09、A10、A11、A14、A15、A17、A18、A25、A54、A63、A75、其化学结构和其生物活性的更多信息，参见Cao等“选择性小分子化合物通过抑制Smurf1介导的Smad1/5降解来提高BMP-2响应性(Selective Small MoleculeCompounds Increase BMP-2Responsiveness by Inhibiting Smurf1-mediated Smad1/5Degradation)”Nature,Scientific Reports,4:4965|DOI:10.1038/srep04965,2014年5月14日。该出版物的全部内容及其补充信息整体并入本文。
Smurf1抑制剂的实例可以是非那米尔(非那米尔甲磺酸盐，或3,5-二氨基-6-氯-N-[亚氨基(苯基氨基)甲基]吡嗪甲酰胺甲磺酸盐)。这种小分子非那米尔可以与BMP合作地起作用以诱导BMP靶基因的表达并进一步促进骨再生。
骨再生产品可以进一步包括支架。或者，骨再生产品可以包括支架。包括支架的骨再生产品可以用于治疗而无需任何干细胞。
支架可以是任何支架。支架可以包括相互连接的空隙空间的多孔三维(3D)网络。支架可以是适合将本发明中公开的干细胞和/或生长因子并入到其结构中的任何支架。支架可以是可以将本发明中公开的干细胞和/或生长因子并入到其结构中以帮助形成这些干细胞和/或生长因子与组织(例如骨骼)的直接接触和/或间接接触以再生该组织(例如骨骼)的任何支架。支架可以以任何形式将本发明中公开的干细胞和/或生长因子并入到其结构中，例如，通过携带，通过支撑，通过吸附，通过吸收，通过包封，通过容纳和/或通过粘附到本发明中公开的干细胞和/或生长因子。
支架可以具有任何形状或几何结构。支架可以具有任何孔径。支架可以具有任何孔隙率(即空隙体积)。支架可以具有任何形式。支架可以具有任何机械强度。
骨缺损可能会在动物或人体的不同部位形成。这些缺损可以具有任何形状和尺寸。适合于治疗此类缺损的支架可以具有例如可以适合或类似于缺损形状和尺寸的形状、体积和尺寸。这样的支架还可以具有类似于骨骼的孔体积、孔径和/或孔形状，包括此类支架的骨再生产品是针对所述骨骼设计的以用于其治疗。这样的支架也可以具有孔，所述孔的孔径足够小，使得这些支架可以在其多孔结构内包含本公开的干细胞，并允许植入骨再生产品并且可以成功地进行治疗。本公开的骨再生产品还需要具有足以应对其植入体内的承载条件的机械强度。它们还需要具有足以应对骨骼在运动(例如步行)和/或身体重量期间的承载条件的机械强度。
如以下实施例所示，可以将支架的孔隙率、孔径、孔形状、机械强度、体积和形状控制在所需水平内。
支架可以包括任何材料。例如，支架可以包括不可吸收的材料、可吸收的材料或其混合物。所述可吸收的材料可以被患者的身体吸收，并最终被健康组织所替代。“可吸收的”材料可以包括例如生物相容性、可生物吸收的、可生物降解的聚合物，任何类似的材料或其混合物。
生物相容性材料是可以被患者的身体接受并起作用而不会引起显著的异物反应(例如，免疫、炎性、血栓形成或类似反应)的材料，和/或是可在临床上不禁忌用于施用于组织或器官的材料。
可生物降解的材料可以包括当在体内和/或在体外条件下施用时可吸收或可降解的材料。生物降解可通过生物剂的作用直接或间接发生。
支架可以包括固体、液体或其混合物。例如，支架可以是糊剂。例如，支架可以包括包含羟磷灰石和磷酸三钙的混合物(HA/TCP)的糊剂。该支架例如可以通过将羟磷灰石(HA)和磷酸三钙(TCP)与包含液体的制剂混合以制备糊剂来制备。例如，间充质干细胞制剂可以包含液体；并且将这种间充质干细胞制剂与羟磷灰石(HA)和磷酸三钙(TCP)混合可以形成糊剂。这种类型的支架在本文中被称为HA/TCP支架。
在本公开中，除非另有说明，否则包含HA和TCP的混合物(HA/TCP)可以由等重量的HA和TCP，例如50重量％的HA和50重量％的TCP形成。然而，包含HA和TCP的混合物可以具有任何组成，例如，在0重量％HA至100重量％TCP的范围内变化。例如，高于10重量％、高于20重量％、高于30重量％、高于40重量％、高于50重量％、高于60重量％、高于70重量％、高于80重量％或高于90重量％的HA浓度在本公开的范围内。
例如，本公开的支架可以包括任何可生物降解的聚合物。例如，支架可以包括合成聚合物、天然存在的聚合物或其混合物。合适的可生物降解的聚合物的实例可以是聚丙交酯(PLA)、聚乙交酯(PGA)、聚(丙交酯-共-乙交酯)(PLGA)、聚-E-己内酯、聚二
Figure BDA0002552473210000371
烷酮三亚甲基碳酸酯、聚氢氧烷酸酯(例如聚(羟基丁酸酯))、聚(谷氨酸乙酯)、聚(DTH亚氨基碳酸(双酚A亚氨基碳酸酯)、聚(原酸酯)、聚氰基丙烯酸酯、纤维蛋白、酪蛋白、血清白蛋白、胶原蛋白、明胶、卵磷脂、壳聚糖、藻酸盐、聚氨基酸(例如聚赖氨酸)及其混合物。
支架可以进一步包括本公开的生长因子。在骨再生产品被植入骨缺损部位后，该生长因子可以连续释放到周围(骨)组织中。生长因子的释放速率可以通过支架的化学组成和/或孔结构来控制。
该支架可以通过任何技术来制造。例如，可以通过手工和/或通过使用机器来制造支架。例如，可以通过增材制造和/或制造来制造支架。例如，可以使用超过一种的这样的制造技术的组合来制造支架。
例如，可以通过三维(3D)打印技术来制造支架。任何3D打印技术都可以用于制造本发明的支架。3D打印技术或增材制造(AM)可以是通常通过铺设许多连续的薄材料层，根据三维数字模型制作物理对象的工艺。这些薄材料层可以在计算机控制下形成。3D打印技术的实例可以是立体光刻术(SLA)、数字光处理(DLP)、熔融沉积建模(FDM)、选择性激光烧结(SLS)、选择性激光熔化(SLM)、电子束熔化(EBM)、层压物体制造(LOM)、粘合剂喷射(BJ)、材料喷射(MJ)或蜡铸(WC)或其组合。
支架(例如包括3D打印支架)可以通过使用包含聚己内酯二甲基丙烯酸酯(PCLDA)、磷酸钙、羟磷灰石(HA)、磷酸三钙(TCP)、聚乙二醇二丙烯酸酯(PEGDA)、甲基丙烯酰化明胶(GelMA)或其混合物的制剂来制造。
支架可以包括至少两个腔室。该支架的至少一个腔室可以并入包含等于或大于1的DBR-SC与SBR-SC比率(DBR-SC:SBR-SC)的间充质干细胞制剂。例如，在这些DBR-SC:SBR-SC比率中，干细胞混合物中的DBR-SC浓度可以在50％至100％的范围内(即SBR-SC可以在0％至50％的范围内)，或在51％至100％的范围内，或在60％至100％的范围内，或在70％至100％的范围内，或在80％至100％的范围内，或在85％至95％的范围内，或为90％。与可以包含例如DBR-SC:SBR-SC比率小于1的干细胞混合物的骨再生产品相比，包含这种干细胞比率(即干细胞浓度)的这种骨再生产品可以特别适合于产生更多的骨基质(即，更致密的骨)。
该支架的至少一个腔室可以并入包含等于或小于1的DBR-SC与SBR-SC比率(DBR-SC:SBR-SC)的间充质干细胞制剂。例如，在这样的DBR-SC:SBR-SC比率中，干细胞混合物中的DBR-SC浓度可以在50％至100％的范围内(即SBR-SC可以在0％至50％的范围内)，或在51％至100％的范围内，或在60％至100％的范围内，或在70％至100％的范围内，或在80％至100％的范围内，或在85％至95％的范围内，或为90％。与可以包含例如DBR-SC:SBR-SC比率小于1的干细胞混合物的骨再生产品相比，包含这种干细胞比率(即干细胞浓度)的这种骨再生产品可以特别适合于产生更多的骨基质(即，更致密的骨)。
本发明还涉及骨再生方法，以及本文所述的用于再生骨的支架。该骨再生方法可以包括将本文公开的骨再生产品植入到骨缺损中或整个骨缺损。该骨缺损可以是任何骨缺损。例如，骨缺损可以是长骨的骨缺损。该骨缺损的尺寸可以是任何尺寸。例如，该骨缺损的尺寸可以是临界尺寸。例如，骨缺损可能是由于先天性骨畸形而形成的。先天性骨缺损例如可以是与唇裂和/或腭裂有关的缺损。骨缺损例如可以由于手术、事故和/或疾病而形成。例如，该骨缺损可能是由于进行了治疗颅缝早闭的手术而形成的。
本公开涉及使用MSC和/或3D打印的骨诱导支架(“支架”)可以填充长骨CSD的骨组织的再生。使用这种创新性方法，我们希望为帮助患者成功愈合长骨缺损奠定基础，使他们能够恢复日常生活。
如实施例中所公开，仅支架可能不足以使CSD中的骨再生。生长因子IHH加速了股骨CSD的愈合，突显了支架中不同细胞和生长因子的组合对于实现长骨缺损的理想愈合结果可能是必要的。
实施例
实施例1.小鼠CNCC和BMMSC培养
根据USC IACUC批准的程序对四周龄的小鼠实施安乐死，并且分离其下颌骨，切碎并用含2mg/ml I型胶原酶和4mg/ml分散酶II的PBS溶液于37℃消化1小时。将长骨骨髓从股骨和胫骨中冲洗出来，快速离心并重悬。通过使细胞穿过70μm过滤器来获得单细胞悬浮液，并将其接种在含有补充有20％FBS、2mM L-谷氨酰胺、55μM 2-巯基乙醇、100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素的α-MEM的10cm平板培养皿中。在初始温育48小时后更换培养基。
实施例2.皮下细胞植入
CNCC和BMMSC以9:1、5:5和1:9的比率混合。然后将总共2×106个细胞植入免疫受损小鼠的皮肤下。将小鼠安乐死，并且在植入后三个月收获细胞，在4％PFA中固定，脱钙并切片以进行组织学检查。
实施例3.支架降解和细胞毒性
将基于聚己内酯(PCL)的3D打印支架经皮下植入免疫受损的小鼠中，并在不同时间点收集以通过测量其干重来测试降解概况。
为了测试PCL支架的潜在细胞毒性，将NIH3T3细胞以1×104个细胞/孔的密度接种在96孔板中。温育24小时以允许细胞附着后，将PCL支架在具有10％FBS的DMEM培养基中共培养72小时。按照制造商的说明书(Abcam)进行MTT细胞测定以测试细胞活力。
实施例4.长骨临界尺寸缺损模型
将小鼠置于腹卧位，左后肢伸展。使用前外侧入路来暴露股骨的前表面。简而言之，沿着从髋关节延伸至膝关节的股骨进行外侧纵向皮肤切口后，切开阔筋膜以暴露股骨的全长，从而保留尾端的坐骨神经和远端的关节囊。将前聚醚醚酮(PEEK)微锁定板(MouseFix板；RISystem AG,Davos,Switzerland)应用在股骨前侧。接下来，使用0.3mm的钻头(钻头0.30mm；RISystem AG,Davos,Switzerland)钻四个孔洞，并且将四个自攻锁定螺钉(MouseFix螺钉2mm；RISystem AG,Davos,Switzerland)插入穿过板的最近端和最远端的孔洞并锁定以固定板。然后插入Gigli锯(0.22mm；RISystem AG,Davos,Switzerland)，在夹具(钻和锯导板；RISystem AG,Davos,Switzerland)的两个狭槽中各插入一个，随后进行2mm长的中骨干股骨切除术。将缺损留空，或用PCL支架和所示细胞的不同组合填充，以测试长骨再生能力。
实施例5.射线照相分析、样品收集和组织学
每两周进行射线照相以评估骨接合过程，直到手术后3个月。在手术后3个月安乐死后，立即切除所有左股骨。小心地除去所有覆盖的肌肉组织。将股骨在4％多聚甲醛(pH7.4)中固定过夜。除去板和螺钉，然后将样品在10％EDTA(pH 7.4)中脱钙4周。使样品通过系列浓度的乙醇以包埋在石蜡中，并使用切片机(Leica)以7μm切片。使用普通形态学的标准程序，用苏木精和曙红对脱石蜡的切片进行染色。
实施例6.成骨分化分析
从出生后一个月龄的小鼠的下颌切牙的牙髓间充质的顶端区域收获牙髓间充质干细胞(DPSC)。经过两次传代后，将DPSC单独培养或与刺猬因子抑制剂(GDC0449)或印度刺猬因子(IHH)重组蛋白一起培养，接着进行茜素红染色以检查成骨分化。
实施例7.浸有IHH生长因子的支架的释放概况
将具有或不具有IHH生长因子的基于PCL的支架浸入50μl细胞培养基中，并在37℃下温育。每天收集并更换培养基。根据制造商的说明书(LifeSpan BioScience)，使用酶联免疫吸附测定(ELISA)来定量在培养基中释放的生长因子。
实施例8.统计分析
除非另有说明，否则每个实验条件均在至少三个样品上进行。将ANOVA(单因素)用于统计分析。P<0.05被认为具有统计学显著性。
实施例9.用于骨再生的CNCC:BMMSC比率和支架材料
为了实现长骨再生并增强皮质骨基质形成，我们测试了免疫受损小鼠中皮下植入的不同比率的颅神经嵴来源的干细胞(CNCC)和骨髓来源的干细胞(BMMSC)，并分析了新形成骨中的骨基质与骨髓的比率(图1)。我们的结果表明，具有90％CNCC(即CNCC:BMMSC比率为9)的移植物产生约68％的骨基质和11.4％的骨髓，而具有90％的BMMSC(即BMMSC:CNCC比率为9)的移植物产生57.3％的骨基质和20％的骨髓(图2)。因此，与BMMSC相比，CNCC促进了更致密的骨基质形成。
实施例10.用于骨再生的支架材料的测试
用于骨再生的支架材料的选择具有挑战性，尤其是对于临界尺寸缺损。许多因素可能影响支架材料的选择，包括生物相容性、生物降解性、微观结构和机械承载能力。与传统成型相比，3D打印在支架制造中具有巨大优势，例如设计精度，生成复杂微结构的能力以及时间效率。
聚己内酯(PCL)是一种可生物降解的聚酯，其已广泛用于包括骨组织再生在内的许多生物医学应用中。PCL已被美国食品和药品管理局批准应用于人体中作为药物递送装置、缝合材料(以商标名Monocryl或通用名称销售)或粘连屏障。从PCL成功打印3D支架后，我们首先在体外测试了支架的生物相容性。将支架与NIH3T3细胞温育72小时后，对照组和治疗组中的活细胞数量没有区别(图3C)。接下来，我们测试了在免疫缺陷小鼠中皮下植入支架时支架的降解概况。植入60天后，支架降解了约40重量％(图3D)。
实施例11.修复长骨中的CSD的骨再生
许多动物模型已用于研究CSD中的骨再生，包括小鼠、大鼠、兔子、狗、绵羊和猪。与其它动物相比，小鼠具有若干优势，例如合理的实验时间，免疫受损(裸)小鼠的可用性以及利用转基因小鼠研究骨形成过程中特定基因功能的能力。
小鼠颅顶骨已广泛用于骨相关研究，但是许多其它因素可能会影响这些骨的再生和动态平衡，例如骨膜、硬膜和骨缝。因此，股骨是更理想的模型，特别是对于与承载骨中的骨折愈合有关的研究。小鼠后肢的缺损尺寸、承载特性和骨化方式与人类下肢非常相似。然而，小鼠的体型小，使得股骨手术困难。最近，我们开发了一种在活裸鼠中产生非接合的股骨缺损的手术技术(图4)。这些小鼠在初始手术后可以支持三到四个月的骨再生，因此可以用作干细胞介导的骨再生的模型。
我们制造了具有良好弹性和韧性的基于PCL的支架。最初，我们将该支架植入股骨缺损中以测试生物降解性(图5)。手术后三个月，小鼠能够良好行走。在对照组中，单独的基于PCL的支架不支持骨再生，并且在植入单独的支架后我们未检测到骨再生。
另外，我们进行了研究以研究生长因子在骨再生期间的作用。我们发现印度刺猬因子(IHH)不仅可以加速DPSC的体外成骨活性(图6)，而且还可以帮助股骨CSD体内愈合(图7)。为了促进股骨CSD的愈合，我们在手术当天用一剂IHH处理小鼠。与未接受IHH的对照组相比，我们观察到治疗组的骨再生增强。手术后四周，用IHH处理的小鼠在前后(AP)方向上明显长出了新骨(图7)。但是，在8周后，用IHH处理的小鼠的CSD尚未完全愈合，因为在初始4周后新骨形成变慢了。我们推断这可能是由于单剂量的IHH，其可能不足以支持长时间的持续骨再生。因此，我们测试了多剂量的各种生长因子的作用。在手术后的前两周，每3天将生长因子注入缺损部位。与单剂量处理相比，多剂量在8周时期内确实改善了骨再生(图8)。在用多剂量的BMP处理的组中，在放射学上可检测到缺损部位的皮质骨的接合。BMP比IHH激动剂具有更强的骨再生能力；然而，我们确实注意到损伤部位周围有一些异位骨形成。这可能是由于生长因子注入中的不准确性。
为了改善生长因子的递送，从而潜在地使异位骨形成最小化并简化治疗过程，我们在3D打印过程中将生长因子并入到基于PCL的支架中。随着支架的降解，生长因子不断地释放到缺损部位，导致生长因子的持续递送。我们首先测试了支架在体外的释放概况，并且我们发现可以最早在第4天检测到生长因子，然后其稳定释放11天；当直接将其单独引入培养基中时，生长因子在4天后完全降解(图9)。接下来，我们在小鼠CSD模型中测试了支架。4周后，与支架中不具有任何生长因子的对照组相比，治疗组中的骨形成显著加快(图10)。然而，在12周后，未观察到骨接合。
为了进一步改善CSD的愈合，我们添加了非那米尔以及BMP2，非那米尔是一种与BMP合作地起作用以诱导BMP靶基因的表达并促进骨再生的小分子。4周后，我们在缺损部位检测到愈伤组织形成，并且在AP方向上的骨长出显著改善。手术后八周，实现了皮质骨接合(图11)。
愈合过程的速度和完成度并不是衡量长骨CSD修复的唯一重要结果。评估的另一个重要标准是新骨的弹性。太硬的骨很容易骨折，但是太软的骨将无法支撑身体。适当的弹性可以帮助恢复四肢的运动功能。因此，我们也想使用三点弯曲法(图12)测试弹性。
实施例12.用于颅顶骨再生的动物模型。
使用7-8周龄(体重15-20kg)的约克夏农场猪来研究干细胞介导的颅顶骨再生。所有动物程序均按照联邦法规执行，并获得南加州大学机构动物护理和使用委员会(IACUC)的批准。
实施例13.收获猪牙髓细胞。
每头猪都由兽医人员麻醉并且肚子朝下放置。在拔牙前依次用杀菌剂和乙醇擦拭其口腔内部以帮助防止感染。拔除右切牙并用不连续的可吸收缝线封闭残余裂隙。从切牙收获DPNCC并在细胞培养中扩增。在猪愈合的同时将DPNCC培养14天。
实施例14.猪牙髓细胞的培养
拔除切牙后，将牙齿的外部漂白以清除口腔微生物。将牙齿切开并移出牙髓。然后将牙髓细细切碎，用分散酶II在37℃下消化1.5小时，并使用70μm细胞过滤器过滤单个细胞。最初以每15cm培养皿1×106接种细胞。将细胞在37℃和5％CO2下温育。
一旦细胞达到约70％的亚汇合后，用TryplE将其从平板上分离下来并传代。每次传代，将1×106个细胞铺板到15cm培养皿中。在移植到颅顶缺损中之前，该过程在14天内重复2-3次。
使用BioRad TC20自动化细胞计数器对细胞进行计数。将10uL的悬浮细胞装入药筒中。对于每只动物，经由HA/TCP粒子或3D打印支架将3-4×106个细胞移植到缺损部位中。
在其余细胞不用于移植的情况下，验证了DPNCC分化为脂肪细胞、软骨细胞和成骨细胞的能力。DPNCC集落在成脂、成软骨和成骨培养基中生长。使用针对脂质滴的油红O染色来评估成脂分化。使用针对软骨形成的阿尔新蓝(Alcian blue)染色来评估成软骨分化。使用针对骨形成的茜素红染色来评估成骨分化。
实施例15.用于移植的牙髓细胞的制备
用PBS洗涤细胞，并从培养皿中解离。离心并除去上清液后，将细胞沉淀重悬于3mL培养基中并立即置于冰上。在手术期间，将3mL细胞悬浮液移植到位于临界尺寸缺损内的3D打印支架中。无菌的HA/TCP纳米粒子获自Sigma-Aldrich。对于使用装载于CSD中的3D打印支架进行的手术，将细胞重悬于0.5-1mL培养基中。
实施例16.猪的骨髓收集
在由兽医人员麻醉后，将动物置于侧卧位。依次用杀菌磨砂膏和70％乙醇将胫骨剃刮并清洁三次。在胫骨近端的内侧使用骨打孔器，其中该骨没有被肌肉覆盖。通过触诊该区域证实了这一点。一旦针头刺入骨皮质后，使用针筒收集4mL骨髓并且立即置于冰上。将来自该收集的骨髓细胞直接放入3D打印HA/TCP支架中，以填充颅顶临界尺寸缺损。
实施例17.在猪中产生临界尺寸缺损
每头猪都由兽医人员麻醉并且肚子朝下放置。将颅骨表面剃刮，然后依次用Betadine和70％乙醇清洁。使用解剖刀在皮肤上切开7-8cm的切口，距离中线左侧约1cm。使用骨膜提升器从颅顶骨提升骨膜。一旦暴露出下面的骨骼并且周围的皮肤和骨膜缩回，就测量直径为3-4cm的临界尺寸缺损并标记在骨骼上。使用摆动锯切开骨骼。当接近骨骼的最近端部分时，使用锤子和凿子产生全层缺损，以免破坏下方的硬脑膜或大脑。一旦产生临界尺寸缺损，就将HA/TCP纳米粒子与细胞混合并加载到缺损部位中。对于使用3D打印支架的实验组，首先将支架加载到CSD中，然后使用针筒将细胞注入支架的孔洞中。对照动物CSD未填充HA/TCP或细胞。然后将切口分层闭合，其中首先将骨膜闭合并且其次将皮肤缝合。使所述缺损愈合超过8周。
实施例18.猪颅顶的收集和组织学。
首先将动物麻醉，然后通过过量的戊巴比妥实施安乐死。然后将每只动物斩首。用解剖刀沿颅顶中线在皮肤上做一个切口，并使用骨膜提升器暴露出下面的在缺损区域上方的骨骼。使用带木头切割刀片的无绳往复锯解剖颅顶。将样品在10％福尔马林中固定7天，然后放入DPBS中进行MicroCT成像。成像后，将样品在55℃下于20％EDTA中脱钙6周或直至可弯。将脱钙的样品脱水并包埋在石蜡中进行切片。
实施例19.牙髓神经嵴细胞和HA/TCP纳米粒子在全层颅顶CSD中使骨再生。
我们先前的研究证实了在存在HA/TCP的情况下MSC使颅顶骨再生的潜力，其促进干细胞分化为成骨细胞。我们最初在裸鼠中通过在远离矢状缝的小鼠颅顶中产生CSD而测试了这一点。在损伤后6周后，缺损已完全愈合。
在猪中，“临界尺寸”颅顶缺损的定义在文献中尚未完全确立。更一般而言，如果不采取任何干预措施，CSD是在动物的整个生命周期内或者更保守地说在所讨论的研究的时程内无法完全愈合的损伤(Park等,Stem Cells and Development,2016)。据报道，小型猪长骨中2x 4cm2的缺损满足该标准，因此我们决定相应地在农场猪颅顶中产生直径3cm(面积为7cm2或更大)的圆形缺损(Li等,Journal of Orthopaedic Translation,2015)。在不具有细胞或HA/TCP的对照猪中，直径为3cm的缺损在8周的研究过程中未能愈合(n＝3)。因此，我们可以将猪颅顶CSD定义为直径至少3cm的缺损，其通常在8周内无法愈合。
为了测试用HA/TCP递送的MSC在猪颅顶中的细胞介导的骨再生中的潜力，我们用DPNCC和HA/TCP处理了猪中3cm的颅顶CSD，并在8周后将它们与对照组(无细胞或HA/TCP)进行比较。我们观察到对照猪(无HA/TCP或DPNCC，n＝3)与接受HA/TCP和DPNCC的猪(n＝3)之间的骨再生有显著差异。与天然颅顶骨相比，用HA/TCP和DPNCC治疗的CSD显示了完全的颅顶骨再生、骨缝形成和正常密度(n＝3，成功率为100％)。我们还评估了在CSD中从牙龈中分离出的成纤维细胞以及热灭活的DPNCC的再生能力。用HA/TCP纳米粒子移植的成纤维细胞和热灭活细胞都不足以愈合CSD，因为任一组均无新的颅顶骨再生(每组n＝3)。为了证实骨传导性HA/TCP并非仅负责DPNCC+HA/TCP组中观察到的再生，我们测试了缺损中的单独的HA/TCP。单独的HA/TCP不足以支持骨再生。总而言之，这一系列实验表明，活的干细胞对于DPNCC+HA/TCP组中观察到的颅顶骨再生至关重要。尽管我们确定DPNCC和HA/TCP粒子足以用于骨再生，但仍有可能改善再生颅顶骨的密度和美观性。因此，我们寻求开发一种骨诱导性3D打印支架，该支架将有助于干细胞在缺损中的均匀分布，从而产生更光滑的表面。
实施例20.3D打印的骨传导性支架的优化。
我们基于成年猪颅顶CSD的CT扫描生成了3D打印的可生物降解支架。该支架具有圆顶形状。顶面是一个直径为3.8cm的圆形并且底面是另一个直径为3.5cm的圆形。底部是凹形的，并且与头骨内表面的曲率紧密匹配，而顶部是平坦的并且设计成经由2mm孔洞填充恢复性材料(DPNCC和HA/TCP)。我们已经测试了使用PEGDA-GelMA双网络制造的支架，并证实了其生物相容性。测试聚己内酯二甲基丙烯酸酯(PCLDA)表明，PCLDA可能对培养的细胞无毒且可生物降解。
用于3D打印的光固化工艺不容易允许使用单独的HA/TCP纳米粒子，因此我们决定将HA/TCP与FDA批准的可生物降解聚合物组合，所述聚合物在整个愈合过程中会降解。这使得支架在整个8周内缓慢地被骨骼替代。
实施例21.使用HA/TCP 3D打印的骨传导性支架代替纳米粒子愈合CSD改善了再生骨的质量。
使用具有DPNCC的HA/TCP粒子进行的骨再生没有产生对于临床应用最佳的结果。在这些动物中，颅顶表面有凹痕。由于尽管具有这些表面特征，但仍然实现了骨再生，因此我们推断移植细胞的结构组织化将有助于它们以更理想的模式形成骨。在将具有DPNCC的HA/TCP 3D打印支架移植到颅顶CSD中之后，再生骨与周围的天然骨更加相似(n＝6)。所有其它参数保持相同：全层缺损尺寸的直径为3cm，并且移植了3-4x 106个自体DPNCC。使用该支架的一个警告是，HA/TCP在8周的过程中并未完全降解。我们目前正在测试致密的HA/TCP在体内生物降解的时间范围。此外，我们正在优化支架孔的尺寸，以允许更有效的生物降解。
实施例22.长骨骨髓干细胞在全层颅顶CSD中使骨再生。
可能存在这样的情况：对于人类患者来说，包括拔牙在内的DPNCC收获程序可能不可行或不可接受；以这种方式获得的细胞数量也很少，因此需要培养扩增。该扩增期很长，这是头骨缺损较大的患者的重要考虑因素。为了克服这些缺点，我们测试了来自另一种来源即骨髓的MSC的再生潜力。先前的研究表明，将长骨骨髓MSC移植到骨缺损中会导致再生骨中形成骨髓隙。该小梁骨比颅顶的皮质骨密度低得多。然而，对于人类患者而言，收集骨髓可能比收集牙齿样品更可接受，这将允许获得更大数量的细胞，并将减少必要的麻醉事件的数量。将骨髓MSC直接移植到CSD中还将消除由于细胞培养物的扩增而引起的任何潜在污染或干性损失。
实施例23.颅顶骨再生。
再生的颅顶骨必须与现有骨骼整合，参与动态平衡，并且在儿童的情况下，适应未来的大脑生长。当前的颅骨成形术涉及植入金属或塑料板或自体骨移植物以保护大脑，所有这些都具有显著的缺点。在这项研究中，我们使用用HA/TCP或骨传导性3D打印支架递送的来自牙髓的颅神经嵴MSC来填充CSD以使颅顶骨再生。我们已经开发了猪模型，其头部尺寸和头骨厚度与人类相似，并且已经产生了广泛的初步数据，这与大多数着重于啮齿动物模型的颅顶CSD研究不同。为研究干细胞介导的颅顶修复奠定基础，我们确定了猪颅顶中直径3cm的缺损在8周过程内不会愈合，因此代表了该动物的合适CSD模型。
我们的新颖的骨传导性3D打印支架支撑MSC，为它们提供了合适的成骨环境并在骨再生过程中将其保持在适当的位置。结果是，MSC在8周的过程中经历了分化为成骨细胞并使骨再生，从而填充了CSD。这种颅顶CSD修复方法优于目前的临床解决方案。板、植入物和移植物不能支持正常组织动态平衡或持续生长，因为它们不提供使受损组织再生或形成骨生长的骨缝的细胞。需要进行进一步的研究以确定再生组织中的动态平衡是否正常，并确保长时间内不会导致肿瘤发生或其它不良影响。
我们已经证实，单独的HA/TCP、热灭活的MSC和成纤维细胞不足以愈合我们的猪模型中的CSD；在我们的研究时期内，活的MSC对于完全愈合似乎是必需的。其它内源性细胞也可能起作用。例如，硬脑膜和骨膜在损伤中促成了成纤维细胞并在伤口修复中起到很大作用，并且这些成纤维细胞可能通过组织成为成骨细胞的干细胞祖细胞而在修复中起间接作用。需要进一步的研究来分析CSD损伤修复模型中的细胞-细胞相互作用。
总之，我们建立了一种新颖的头骨再生方法，其将3D打印的支架与干细胞介导的修复相组合。与目前的黄金标准相比，我们的方法将为患者提供安全且有效的生物学治疗，以恢复具有颅顶CSD的患者的颅顶骨/骨缝功能。
实施例24.用于骨缝和长骨再生的支架设计
临界颅骨缺损再生。
通过设计猪支架的晶格结构，我们可以研究表面(例如表面积)可以如何有益于细胞生长以及生长因子的释放速率。与网格结构不同，晶格结构需要复杂得多的设计方法。我们的方法使用单位晶胞重复执行Boolean并形成周期性结构。然后，我们将其与所需形状相交以产生最终的晶格结构。然而，当前方法在设计中未考虑可制造性。一些特征在边界表面上作为单位晶胞的一部分出现，这可能会给整个结构的性能带来不稳定性。当我们制造骨骼状结构时，也可能发生相同的情况。我们开发了一套用于支架构建的新工具，以便于研究并针对各种情况(包括长骨和头骨挫伤再生)设计最佳解决方案。对于颅骨缺损骨支架，我们提出了如图19所示的设计。支架被设计成具有微观尺度的多孔结构，使得骨细胞在整个挫伤过程中都能生长。为了研究支架的形状可以如何影响骨生长，设计了具有三个不同种类的微观结构的支架。
长骨再生
我们根据从CT扫描中提取的实际形状和结构设计了长骨支架。所述结构中存在两个腔室：用9:1比率的CNCC/BMMSC的混合物培养的支架可使细胞生长，其中营养来自所设计的孔洞(即孔)。第二部分是皮质骨支架。所述结构支撑包含1:9比率的CNCC/BMMSC的混合物的干细胞组合物。更大量的BMMSC可能会增强新骨生长，从而为支架提供足够的机械强度以承受物理载荷。由于功能不同，我们为每个部分设计了支架(参见图20)。
对于长骨愈合，我们旨在优化支架以找到最佳的用于长骨再生的设计。例如，皮质骨支架需要承受比骨髓支架大得多的载荷。因此，有必要研究形状(例如单位晶胞)、材料及其机械性能之间的关系。我们设计了具有三种不同形状的支架：网格基质、微晶格结构和仿生骨结构(参见图21)。
实施例25.材料选择
用于临界颅骨缺损再生的光固化HA/TCP悬浮液的合成。
本研究中使用的羟磷灰石是粒径小于200nm的纳米级粉末(购自Sigma-Aldrich)，并且本研究中使用的β-磷酸三钙是粒径为4μm的微米级粉末(购自Sigma-Aldrich)。可以精确地构建具有高特征细节的部件的光固化液体聚合物SI500(购自EnvisionTEC.Inc)被用作聚合物粘合剂。为了找出最佳的HA/TCP粒子质量比δ，遵循以下程序制备10重量％至40重量％的HA/TCP悬浮液。首先，将HA/TCP粉末倒入液体光敏聚合物树脂(SI500)中。然后将HA/TCP浆料以200rpm的转速球磨40分钟。此后，在制造之前将HA/TCP悬浮液在真空中脱气。为了减小HA/TCP悬浮液的固化深度，将0.1重量％、0.25重量％、0.5重量％、0.75重量％和1重量％的光吸收剂(购自Sigma-Aldrich的油红)分别加入到聚合物树脂SI500。然后将30重量％的HA/TCP加入到该聚合物混合物中，并遵循上述程序制备具有光吸收剂的30重量％的HA/TCP悬浮液。
实施例26.用于长骨再生的基于聚己内酯的光固化复合材料的合成。
光固化聚合物溶液制备：
聚己内酯二甲基丙烯酸酯(PCL-DA)购自Sigma-Aldrich，光引发剂Irgacure 819获自BASF Chemistry。HA(羟磷灰石)和TCP(磷酸三钙)是骨材料，我们还使用rh/mlhh(c28II)-N和rh/m/rBMP-2作为生长因子。作为光吸收剂的油红被用于减小单体的固化深度并在制造过程中调节微结构的厚度。为了制备具有生长因子的40％HA/TCP溶液，首先将1％(w/v)Irgacure 819在35℃下充分溶解于100％(w/v)PCL-DA持续一小时。之后，我们使用球磨机在PCL-DA溶液内加入10％HA和10％TCP。为了控制材料的固化深度，我们还在溶液内加入了0.1％(w/v)的油红。获得材料后，我们准备了生长因子，将rh/mlhh(c28II)-N和rh/m/rBMP-2溶解在磷酸盐缓冲盐水(PBS)溶液中。由于水基生长因子不能溶解在PCL-DA溶液内。如图21所示，我们使用超声波机器将溶解了生长因子的水滴均匀地分布在PCL-DA溶液内。
实施例27.高粘度HA/TCP悬浮液打印工艺。
硬件和软件设计
立体光刻术(SLA)是加工高粘度材料的主要高分辨率增材制造技术之一。在基于掩模图像投影的立体光刻术(MIP-SL)工艺中，首先通过一组水平面对3D对象进行切片，然后将每个薄切片转换为二维(2D)掩模图像。由具有掩模图像的DMD芯片生成的2D图案化光束投射在光固化材料的表面上。在从曝光接收到足够的能量之后，可以通过2D图案化的光束来固化材料层。因此，可以通过堆叠每一层来逐步打印3D对象。使用基于MIP的立体光刻术，可以高效地制造具有数百层沉积物的宏观尺度模型，因为它在一次照明中只能制造一层。使用基于MIP的SLA工艺成功地制造了复合材料如多功能陶瓷。
打印装置包括硬件和软件模块。所有制造过程都受到控制和监控。高粘度3D打印机的原型包含三个子系统：光学成像系统、机械移动系统和材料进料系统。原型机的示意图如图23所示。对于光学成像系统，光线照亮数字微镜装置(DMD)并被DMD芯片反射。光强度可以根据DMD中的反射镜角度更改。光穿过光学透镜，并且将在树脂表面产生聚焦图像，并且树脂将通过合适的曝光进行固化。固化一层后，z载物台将移至下一层位置，然后刷新树脂表面并曝光下一个聚焦图像。图像的每一层都基于制造对象的几何形状。对于每个MIP系统的尺寸和分辨率，透镜的组合在所需的尺寸和分辨率上是不同的，并且通常模型的尺寸可以在1微米(微观尺度)至200毫米(宏观尺度)的范围内。
在此测试中讨论的投影图像的尺寸为45x 33.75mm2。而来自Texas InstrumentsCo.的DMD芯片的分辨率为1920*1080，这意味着该3D打印机的分辨率可以达到24μm/像素。利用Microsoft VISUAL C++编译器使用C++语言开发了掩模规划测试台。该测试台集成了几何切片和运动控制。它还使图像投影与X和Z运动同步。由于光分布不均匀，因此使用具有整个灰度级的掩模图像，部件的某些部分会过度固化，而某些部分则无法固化。为了提高制造分辨率，我们进行了实验来校准投影图像的光强度。我们调整掩模图像的灰度级以实现均匀的光分布，参见图26。在获得均匀的光强度后，由于支架内存在微观尺度孔洞，因此我们可能需要使用最少数目的像素来制造结构。例如，我们可能需要几个像素。为了制造如此小的特征，我们需要增加曝光时间，以确保材料接收到足够的能量以引起光聚合。曝光时间设置的结果也显示在图24中。
然而，仅通过气压和材料的重力驱动，HA/TCP悬浮液无法流到薄膜上。高粘度材料的材料重新填充是一个巨大的挑战，它限制了MIP-SLA工艺来制造高粘度材料。因此，我们添加了材料进料系统，以连续涂覆厚度为100μm的材料。为了重新填充高粘度材料，必须使用专用工具如刀片来实现材料的均匀涂覆，并且剪切力应该足够大以将材料铺展成薄膜层。
工艺规划
对于宏观尺度工艺，改进了材料进料过程以获得更大的投影面积和更多的构建层。与材料进料的线性方式不同，将所述材料放入圆形构建槽中，该槽与旋转平台相连，该平台可以使槽以可变速度旋转。在材料上方添加了一个刀片，以通过允许平行于构建槽底部的较小水平间隙来控制材料的厚度。在制造过程中，在构建每一层之后，将构建平台升高一定距离，并且旋转平台旋转以将材料进料到刀片。刀片在材料顶部刮擦，因此只有每一层所需厚度的材料才能到达构建平台下方的位置。在材料被正确进料并开始当前层的构建后，将构建平台降低到构建位置。类似地，重复此过程，直到完成部件构建为止(参见图23)。为了解决高粘度HA/TCP悬浮液的重新填充问题，在微观尺度MIP-SL系统中集成了具有圆周运动的快速材料进料过程。首先，通过刀片在具有特氟隆膜的玻璃板的顶面上均匀地涂覆厚度为100μm的HA/TCP悬浮液的薄层(参见图23)。在固化第一层HA/TCP悬浮液后，首先将构建平台升高Z1，该高度大于涂覆的HA/TCP层的厚度，并且同时，涂覆有HA/TCP悬浮液的载玻片正确地在X方向上移动。即使材料板沿x方向移动，投射光和构建平台的相对位置也不会改变。在玻璃板移动之后，新材料被运送到投射曝光的地方。当平台和玻璃板的移动结束时，将构建平台向下移回，直至预固化部件的表面与光投射位置之间的距离等于材料的固化深度。通过上述圆周运动，仅需几秒钟的时间，新的HA/TCP悬浮液层就会不断被进料到构建平台正下方的位置，以进行后续制造，这大大提高了高粘度材料的打印效率。在构建过程中，重复进行圆周运动，直到在平台上构建了所有层。
HA/TCP支架的后处理
HA/TCP悬浮液首先由已开发的微观尺度MIP-SL打印，并且必须进行低温脱脂和高温烧结以除去内部聚合物，并将HA/TCP粒子分别融合在一起(参见图25)。在脱脂工艺中，必须完全除去光敏聚合物，因为残留的碳延迟会影响HA/TCP支架的后续过程和生物学性能。因此，进行了热重分析(TG)以确定脱脂参数。随着温度从300℃升高到600℃，支架生坯的重量急剧下降。当温度达到600℃时，生坯的重量保持为恒定值，该值等于内部HA/TCP粒子的原始重量。根据TG测试的结果，脱脂温度设置遵循如图19(b)所示的曲线。脱脂工艺中使用的管式炉是GSL-1100X-SK(购自MTI Corp)。由于如果热解产生的气体超过安全值，生坯会被破坏，尤其是对于微观尺度结构，因此脱脂工艺应以缓慢的加热速率进行，以确保聚合物的分解速度小于热解速度。鉴于此，在真空条件下将加热速率设置为1℃/min，并且通过机械真空泵连续抽出气体，以将加热区的压力保持在-0.12mPA。每增加100℃，温度保持30分钟，并且最终温度升至600℃并保持180分钟，以完成聚合物的去除。在脱脂工艺后，聚合物的去除形成了多孔结构。
HA/TCP粒子稀疏排列，并且棕坯太弱以致于无法承受任何载荷。因此，需要烧结工艺以固定HA/TCP粒子和改善HA/TCP支架的机械特性。HA/TCP支架的收缩率和机械强度将受到烧结温度的影响，因为温度会影响陶瓷粒子的晶界和体积扩散。在烧结工艺中测试了三个不同的最高温度(1050℃、1150℃、1250℃)，以确定HA/TCP支架的最佳烧结温度。使用GSL-1500(购自MTI Corp)在正常空气条件下烧结样品，并且烧结工艺中的温度设定曲线如图19(c)中所示。具体而言，以3℃/min的加热速率将温度固定升高到200℃。等待30分钟后，以5℃/min的加热速率将温度从200℃加热到280℃。使用3℃/min的加热速率，将温度逐渐升高至1080℃并在1080℃保持30分钟。最后，将样品加热到最高温度并保持180分钟。之后，将样品自然冷却至室温。
HA/TCP支架的补偿
在烧结工艺后，内部聚合物被除去并且HA/TCP粒子被固定，使得HA/TCP支架的体积降低。收缩率rs与HA/TCP粒子的质量比δ和烧结温度T有关。由于更多的内部聚合物被烧掉，因此较少的HA/TCP粒子将融合在一起。因此，HA/TCP支架的收缩率rs随着HA/TCP粒子质量比的降低而提高。当升高烧结温度T时，可以观察到相同的趋势。这是因为发生了扩散，并且HA/TCP粒子的中心随着烧结温度的升高而彼此更靠近。此外，HA/TCP支架的收缩率rs在轴向和径向上变化。HA/TCP悬浮液在曝光下在径向平面上均匀固化，然后应力在X/Y方向上是各向同性的。但是HA/TCP悬浮液在轴向上是逐层堆叠的，因此Z方向上的应力不同于X/Y方向上的应力。3D打印的HA/TCP支架表现出各向异性的烧结行为，轴向收缩率rsz大于径向收缩率rsr。具体而言，由30重量％的HA/TCP悬浮液制成的28mm的HA/TCP支架在1250℃下烧结后降低到原始值的仅70％。在测量了X/Y平面中的微孔的形状变化之后，获得了在X/Y方向上的补偿因子
Figure BDA0002552473210000561
类似地，使用相同的HA/TCP悬浮液打印一系列边长在30μm至350μm范围内的正方形。在烧结工艺后，打印结构的尺寸在轴向和径向上均缩小。为了实现具有设计的微观尺度孔的HA/TCP支架的精确制造，基于实验结果开发了补偿算法。
制造结果的实例
在通过上述方法打印HA/TCP支架的生坯后进行脱脂和烧结。在脱脂工艺中，将温度升至600℃后，用于将HA/TCP粒子粘合在一起的光敏聚合物被除去。HA/TCP支架内部使用光敏聚合物的地方产生了大量的孔。在该阶段，HA/TCP支架的孔隙率达到峰值，然而，由于HA/TCP粒子的疏松排列而没有任何结合力，因此HA/TCP棕坯易碎。因此，需要烧结工艺来固定HA/TCP粒子并进一步提高HA/TCP支架的机械性能。每个工艺之后使用HA/TCP悬浮液打印的HA/TCP支架如图28所示。根据SEM图像，HA/TCP支架内部存在纳米级的孔。为了增加孔洞的密度，在HA/TCP支架内部设计了数百个微米尺寸的孔洞。对于颅骨缺损的再生，应用了三种不同的微观结构来设计HA/TCP支架。通过使用我们开发的高粘度MIP-SL工艺，我们成功地制造了具有不同几何形状的HA/TCP。图29示出了HA/TCP支架的制造结果，以及具有晶格结构和仿生骨结构的HA/TCP支架分别在烧结前后的比较。
实施例28.微观尺度光聚合打印工艺
硬件和软件设计
根据基于MIP的SLA的原理，我们进一步开发了图30(a)所示的生物打印设置。在我们的微观尺度生物打印系统中，我们使用可见光灯作为光源，并且我们将所述光源视为点光源，即从光源发出的光会穿过所有方向。为了保留所有的光能，来自灯的光在照射到DMD之前应进行准直。我们使用消色差双合透镜来会聚光束并降低畸变的影响，我们还使用滤光镜来阻挡除波长为410nm的一组指定光束以外的大多数光束。准直光将通过4x物镜，该物镜将图像缩放到我们需要的尺寸，并且可以更改物镜与准直透镜lco之间的距离。该测试中讨论的图像尺寸为4mm x 3mm并且我们使用的DMD分辨率为1920x 1080，这意味着基于微观尺度SLA的生物打印系统的分辨率为2.5μm/像素，如图30(b)所示。我们还设计了光监控系统，以检查光投射质量并观察整个制造过程。我们将3D对象的CAD模型导入我们为生物打印系统开发的软件中，并且将模型切成所需厚度，如图30(c)所示。在生成投影图像时，将基于校准数据库调整每个像素的灰度级，以实现均匀的光分布。图30(d)显示了生物打印装置的制造区域，并且高分辨率聚焦投影图像将位于制造区域的表面。使用所述生物打印装置，我们可以微观尺度分辨率制造生物相容或可生物降解的材料，如图30(e)所示。
基于PCL的复合材料的固化特性
PCL-DA复合材料是透明的，并且材料的固化深度高于400μm(图31)。由于我们要在支架的侧壁上制造尺寸为80μm的孔洞，因此，当材料的固化深度大于制造方向上的微观尺度特征时，由于过度固化特征，微观尺度将丢失。为了增加制造分辨率，我们通过添加光吸收剂来降低基于PCL的复合材料的固化深度。我们尝试了0.02％、0.05％和0.1％的范围的不同百分比的光吸收剂，并且具有不同百分比的光吸收剂的PCLDA固化深度在35μm至450μm的范围内(图31)。
生长因子释放
我们在基于PCL的光固化复合材料内混合了生长因子，并且在打印工艺中，生长因子和HA/TCP被锁定在支架的每个固化层内。结果总结在下表中。
Figure BDA0002552473210000581
表1.具有和不具有生长因子的PCLDA材料的固化特性。
Figure BDA0002552473210000582
表2.具有不同浓度的HA/TCP的PCL-DA材料的固化特性。
在PCL-DA降解期间，生长因子将逐渐从我们制造的支架中释放出来(参见图32)。为了加速组织再生，我们需要研究生长因子的释放速度、支架结构的几何形状和打印材料的生长因子百分比之间的关系。如图32(c)所示，我们分别打印了具有0.1μg/μl和0.2μg/μl生长因子的2D基质支架，以研究具有不同生长因子百分比的基于PCL的复合材料的生长因子释放速度。
光固化聚合物通过曝光获得的能量决定了光固化聚合物的交联密度。能量等于光强度和曝光时间的乘积。随着曝光时间的增加，光固化聚合物获得更多的能量。因此，聚合物的交联密度也将随着曝光时间而增加。聚合物的降解取决于交联密度。如图33所示，与具有高交联密度的聚合物相比，具有较低交联密度的聚合物可能降解得更快。为了找出基于PCL-DA的复合材料的合适的交联水平，我们使用在15s至25s范围内的不同曝光时间，以0.1μg/μL和0.2μg/μL的生长因子打印了网格基质。
初步制造结果
通过使用我们开发的微观尺度MIP-SL，我们制造了长骨支架。图34显示了用于长骨临界缺损再生的基于PCL的支架的制造结果。我们将CAD模型导入软件，并且将所述模型切成所需的厚度。当生成投影图像时，根据校准数据库调整灰度级。根据显微镜图像，HA/TCP骨材料粒子和生长因子均匀分布在HA/TCP支架内部。
我们还制造了具有不同几何形状的基于PCL的支架。具有仿生骨结构的基于PCL的支架的制造结果示于图35中。我们用不同浓度的HA/TCP粒子(15重量％HA/TCP和20重量％HA/TCP)打印了PCL支架，并且根据SEM图像确认，粒子均匀分布在基于PCL的支架的每一层内部。
总之，我们描述了长骨和颅骨缺损再生的支架设计。为了使骨组织再生，我们提出了两种材料解决方案：可生物降解材料(基于PCL的复合材料)和基于HA/TCP的悬浮液。基于材料特性，我们进一步开发了适当的基于MIP的SLA工艺，以打印具有不同内部结构的支架，这实现了具有高分辨率的复杂几何形状的支架的制造。超声辅助方法被应用于将生长因子和HA/TCP粒子均匀分布在打印的可生物降解的基于PCL的支架内，以实现长骨愈合。将高粘度HA/TCP悬浮液成形为3D形支架，以用于颅骨缺损再生。
实施例29.用于长骨临界缺损的具有分级多孔结构的羟磷灰石/β-磷酸三钙支架的3D打印。
在该实施例中，我们开发了具有特殊浆料进料模块的微观尺度MIP-SL工艺，该模块允许制造高粘度HA/TCP浆料(图36(b))。研究了HA/TCP悬浮液的固化性能和物理特性。借助于高分辨率光学系统并在优化工艺参数后，通过3D打印方法成功制造了具有30μm孔的30重量％HA/TCP支架。此外，还进行了HA/TCP支架的收缩分析和设计补偿，以确保在后处理后具有所需尺寸。此类仿生HA/TCP支架涵盖从微观尺度的多孔结构(直径：约60-100μm)到后处理期间因聚合物烧尽而引起的相互连接的小孔(<10μm)的分级特征(参见图36(c)-(g))。随后研究了3D打印的HA/TCP支架的生物学性能。根据细胞增殖结果，具有分级多孔结构的HA/TCP支架具有生物相容性且无毒，从而提供合适的细胞培养环境。具有30重量％HA/TCP的支架被设计用于小鼠的长骨临界缺损模型，然后向30重量％HA/TCP支架植入CNCC和BMMSC。体内结果显示在HA/TCP支架上有利的骨形成，表明这种方法可以为构建用于长骨组织再生的支架提供潜在的解决方案。
实施例30.可固化的基于HA/TCP的陶瓷浆料的合成。
本研究中使用的羟磷灰石为纳米级粉末形式，其粒径小于200nm(购自Sigma-Aldrich)，以及β-磷酸三钙，一种粒径小于4μm的微米级粉末(购自Sigma-Aldrich)。使用光固化液体聚合物SI500(购自EnvisionTEC Inc)作为粘合剂，因为它可以精确地构建具有高特征细节的部件。为了找出HA/TCP粒子的最佳浓度δ，按照以下程序制备10重量％至40重量％的HA/TCP悬浮液。首先，将相同比例的HA和TCP粉末倒入液体光敏聚合物树脂(SI500)中。然后将混合的HA/TCP浆料以200rpm的转速球磨40分钟。此后，在制造之前将HA/TCP悬浮液在真空中脱气。此外，为了研究如何增加HA/TCP悬浮液的固化深度，向30重量％的HA/TCP悬浮液中分别加入0.1重量％、0.25重量％、0.5重量％、0.75重量％和1重量％的光吸收剂(油红，购自Sigma-Aldrich)，其余制备程序相同。
实施例31.用于长骨再生的支架设计
为了测试所开发工艺在X/Y平面和Z方向上的打印能力，如下设计了两组2mm的圆柱形外壳。为了检查在X/Y平面上的制造精度，在支架的侧壁上设计了具有200μm高度和30μm至300μm的不同宽度的矩形孔，厚度为250μm。为了检查Z方向的制造能力，设计了另一种具有正方形孔的支架，其中孔高度在30um至350um范围内(参见图41)。同时，设计了不同密度(12、18、24和30个孔数)的具有2mm(高度)x 1.8mm(直径)x 250μm(厚度)的支架，其中每个孔测得边缘长度在200μm至400μm内，以便研究后处理后HA/TCP支架的收缩(参见图40)。此外，设计了具有2mm高度的实心立方体，以分析后处理条件对烧结的HA/TCP支架的机械强度和孔隙率的影响。
在长骨的情况下，柔软的内核(通常称为骨髓)被坚硬的皮质密质骨基质所包围(Basu等)。骨基质为骨骼提供坚硬的机械支撑，并且骨髓同时提供充足的血液和营养物供应。我们基于小鼠长骨模型的数字CT扫描数据，设计了具有分级结构的HA/TCP支架，用于骨基质的再生。小鼠的长骨临界缺损的长度设置为2mm，在该长度下，骨组织将无法自行愈合(参见图36)。为了增加机械应力，分别设计了具有微晶格结构和仿生骨结构的2mm(高度)x0.9mm(直径)的支架。具有晶格空间网格结构的支架涵盖50μm至150μm范围内的微孔。对于由仿生骨结构组成的支架，微观尺度多孔结构的直径设置为60μm至100μm(参见图41)。
实施例32.基于浆料的μMIP-SL
为了实现具有分级结构的HA/TCP支架的高分辨率制造，我们开发了基于MIP-SL技术的微观尺度3D打印工艺(参见图37(a))。在我们的基于浆料的μMIP-SL中，光由数字微镜装置(DMD)照明和反射，其中集成并封装了数百万个微反射镜(来自Texas instruments,Inc)。可以通过调整每个反射镜的角度来更改光强度(Yang,Y.等，Li等，Yang,Y.等，Zhou等，Li等，Zhou等)。为了获得均匀的光分布，通过消色差双合透镜(购自Thorlabs.Inc)将光准直，并且稍后将准直的平行光通过4x物镜(购自Thorlabs Inc.)聚焦。在我们的基于浆料的μMIP-SL系统中，投影图像的最终分辨率为2.5μm/像素。为了降低畸变的影响，使用滤光镜(购自Thorlabs Inc.)透射405nm波长的光，同时滤去其它波段的光辐射。还设计了一个由摄影机、凸透镜和分光镜组成的光监控系统，以在3D打印过程中监控投射光(Yang,Y.等，Li等)。
由于HA/TCP悬浮液的粘度很高，因此不能直接应用在基于液体的MIP-SL系统中常用的树脂进料模块，因为HA/TCP浆料不能在每一层处理后自发地重新填充制造区域。为了解决浆料进料问题，开发了带有刮刀的辅助圆周运动的基于自底向上的MIP-SL(Li等，Song等(2015)，Song等(2017))。在我们的原型系统中，从载玻片底部照射的投影图像聚焦在玻璃板的顶部表面，其中涂有特氟隆膜(参见图36(b))。基于投影系统，在从受控曝光中接收到足够的能量后，HA/TCP悬浮液会在平台上固化。该平台沿Z方向安装在线性载物台(购自AeroTEC Inc.)上，线性运动精度为±1μm。将玻璃板固定在沿X方向横移的线性载物台上，提供快速的进料速度以重新填充材料。使用刮刀将浆料重新涂覆在玻璃板上。应注意，层厚度小于通过刮刀再涂覆的浆料的厚度，并且可以通过Z载物台进行精确控制(Song等(2107))。
实施例33.3D打印支架的后处理
首先通过基于浆料的μMIP-SL工艺打印基于HA/TCP悬浮液的生坯。然后，使用由低温脱脂和高温烧结组成的后处理程序来完全除去支架中的聚合物，并将HA/TCP粒子融合在一起(参见图36(b))。在脱脂工艺中，由于残留的碳将对随后的烧结工艺以及最终HA/TCP支架的生物学性能产生重大影响，因此需要将光敏聚合物完全除去。随着温度从300℃升高到600℃，所制造的生坯的重量急剧下降。当温度达到600℃时，生坯的重量保持在恒定值，其等于HA/TCP粒子的原始重量(Song等(2015)，Song等(2017))。脱脂工艺中的温度设置遵循图26(a)中所示的曲线。在脱脂工艺中使用管式炉(购自MTI Corp的GSL-1100X-SK)。应注意，脱脂工艺应在缓慢的加热速率下进行，以确保聚合物的分解速率低于热解速率。否则，由于热解过程中产生的气体可能超过阈值，可能会损坏生坯。在我们的研究中，在真空条件下将加热速率设置为1℃/min。产生的气体通过真空泵连续排出，以将加热区的压力维持在-0.1mPa。另外，温度每升高100℃保持30分钟，直到温度达到600℃。然后将温度在600℃下保持180分钟，以便可以完全除去HA/TCP支架的生坯内的聚合物。
在脱脂工艺后，在聚合物所处的位置形成了多孔结构。由于HA/TCP粒子稀疏排列，因此HA/TCP支架的棕坯的强度不足以承受外部载荷。因此，为了将HA/TCP粒子融合在一起以改善HA/TCP支架的机械特性，需要额外的烧结工艺。同时，HA/TCP支架的收缩率和机械强度取决于烧结温度，因为烧结温度会影响陶瓷粒子的晶界和体积扩散(Griffith等，Song等(2106)，Frisch等)。测试了三种不同的烧结温度(1050℃、1150℃、1250℃)，以针对收缩率和机械应力确定HA/TCP支架的最佳烧结温度。使用GSL-1500炉(购自MTI Corp)在正常空气条件下烧结HA/TCP棕坯。图26(b)显示了在烧结工艺中使用的测试温度曲线之一。具体而言，将温度逐渐升高至1080℃并在此保持30分钟。之后，将样品加热到最高温度(1250℃)，并在该温度下保持180分钟。最后，在取出样品之前，将样品自然冷却至室温。
实施例34.3D打印支架的表征
XRD测试。
为了验证脱脂和烧结工艺后HA/TCP支架的组成、结构和物理性质的变化，在每个步骤之后对制造的HA/TCP支架进行X射线衍射(XRD)测试。图37(c)中显示了原始HA/TCP粒子与每个后处理步骤后HA/TCP支架的比较。在脱脂工艺后，支架显示出与原始HA和TCP粒子相似的整合强度。然而，在高温烧结工艺后，HA/TCP支架的峰数和峰值都增加，因为与原始HA/TCP粉末相比，HA/TCP粒子的晶体尺寸更大。
机械测试。
使用压缩机(Instron 5492双柱测试系统，Instron,MA,USA)研究了后处理的HA/TCP支架的机械特性。我们建立了2mm×2mm×2mm HA/TCP实心立方体以进行压缩测试，并为每种情况准备了三个样品。通过逐渐增加载荷直到样品完全失效来进行每个试样的压缩测试。基于应力-应变曲线计算HA/TCP材料的抗压强度。
孔隙率测试。
应用重量分析(Archimedes)方法来计算后处理后最终支架的孔隙率。首先测量干燥状态的支架质量Md。然后将HA/TCP支架合并到硅油中，然后置于真空中，以使孔用硅油完全饱和。此后，进一步测量支架的质量Msat。其后，将支架浸入水槽中并测量质量Msub。然后可以通过以下等式计算3D打印支架的孔隙率：
Figure BDA0002552473210000641
基于上述方法测量由20重量％至40重量％浓度的HA/TCP粒子制造的HA/TCP支架的孔隙率。此外，使用Image J软件通过在大的放大倍数下分析其扫描电子显微镜(SEM)图像来计算HA/TCP支架的孔隙率分布。对于每种情况，在相同条件下测试了三个样品，并对结果取平均值。
实施例35.生物相容性和生物活性
NIH3T3细胞在含10％胎牛血清的杜尔贝科改良伊格尔培养基中培养。将1×106个细胞加载到凝胶包被的HA/TCP支架的表面上，并在37℃下温育。遵循标准方案，使用活染色测定和死染色测定在不同时间点观察细胞活力。将1×104个细胞接种在96孔板中，并使其附着24小时。用细胞培养具有不同百分比的HA/TCP的支架，以测试其对细胞增殖活性的影响。共培养48小时后，使用MTT测定法测量细胞增殖。
实施例36.体内
动物。
在本研究中使用8-10周龄的雄性免疫受损小鼠(无胸腺裸鼠，nu/nu，The Jacksonlaboratory,Sacramento,CA)。所有小鼠实验都根据由动物资源部和美国南加州大学机构动物护理和使用委员会批准的方案进行。
小鼠牙髓细胞培养。
将来自P3.5小鼠的下颌切牙的牙髓间充质分离，切碎并用PBS中含有2mg/ml I型胶原酶(Worthington Biochemical)和4mg/ml分散酶II(Roche Diagnostics)的溶液在37℃下消化1分钟。通过使细胞通过70μm过滤器(BD Biosciences)获得单细胞悬浮液，并将其接种到具有补充有20％FBS、2mm L-谷氨酰胺、55μm 2-巯基乙醇、100U ml-1青霉素和100μg/ml链霉素(Life Science Technologies)的α-MEM的10cm平板培养皿(Corning)中。最初温育48小时后，更换培养基。
临界尺寸缺损模型。
将动物置于腹卧位，左后肢伸展。使用前外侧入路来暴露股骨的前表面。简言之，沿着从髋关节延伸至膝关节的股骨进行外侧纵向皮肤切口后，切开筋膜以暴露股骨的全长，保留尾端的坐骨神经和远端的关节囊。将前PEEK微锁定板(MouseFix板；RISystem AG,Davos,Switzerland)应用在股骨前侧。接下来，使用0.3mm钻头(钻头0.30mm；RISystem AG,Davos,Switzerland)钻出四个孔洞，穿过板的最近端和最远端的孔洞，并插入四个自攻锁定螺钉(MouseFix螺钉2mm；RISystem AG,Davos,Switzerland)并锁定以固定板。然后插入Gigli锯(0.22mm；RISystem AG,Davos,Switzerland)，在夹具(钻和锯导板；RISystem AG,Davos,Switzerland)的两个狭槽中各插入一个，随后进行2mm长的中骨干股骨切除术。将缺损留空，或在存在或不存在细胞的情况下用测试的HA/TCP支架填充。
射线照相分析、样品收集和组织学。
每2周进行射线照相以评估骨接合过程，直到手术后3个月。实施安乐死后，立即切除所有左股骨。小心地除去所有覆盖的肌肉组织。将股骨在4％多聚甲醛(pH 7.4)中固定过夜。在各个组织试样的多聚甲醛固定后，除去板和螺钉。然后将样品在10％DEPC处理的EDTA(pH 7.4)中脱钙4周。
实施例37.统计分析
本研究在所有实验设计和分析中均应用了统计分析理论。实验数据的统计计算是在R软件环境中执行的。使用方差分析(ANOVA)找出每个实验中的重要参数，并且此处呈现的所有数据均为±标准差(SD)(Tabachnick等)。
实施例38.HA/TCP浆料的固化性能
将纳米级和微米级HA/TCP粉末与由单体、低聚物、稳定剂和光引发剂组成的光固化聚合物混合，并且混合的浆料可通过暴露于电磁辐射而固化(Zissi等，Jacobs等)。由于HA/TCP悬浮液逐层固化形成3D形状，因此Z方向上固化过程的分辨率取决于光可以穿透HA/TCP悬浮液的固化深度(Cd)。与纯聚合物相比，额外的HA/TCP粒子吸收和散射HA/TCP悬浮液内部的光。因此，HA/TCP悬浮液的光敏性随HA/TCP粒子浓度的增加而降低。基于Jacobs和Griffith模型(Jacobs等，Griffith等)，HA/TCP悬浮液的固化深度可以定量表示为以下等式：
Figure BDA0002552473210000671
其中k是常数；d是HA/TCP的平均粒径；
Figure BDA0002552473210000673
是散射有效值；nr和np分别是纯树脂和HA/TCP浆料的折射率；E是投射光能；并且Ec是材料聚合所需的临界能量。
然而，尽管HA/TCP粉末部分地阻挡光，但是对于微米尺度制造而言，HA/TCP悬浮液的渗透深度仍然过大。因此，投射光不仅会在Z方向上固化HA/TCP悬浮液的当前层，而且还会在之前的层上产生出乎意料的固化特征。Cd值大会导致Z方向上尺寸小于100μm的微孔的制造困难。为了降低HA/TCP悬浮液的光穿透深度，将不同百分比的光吸收剂加入到30％的HA/TCP悬浮液中，并且每组的固化深度如图38(f)和下表所示。
Figure BDA0002552473210000672
表3.悬浮液浓度和曝光时间对固化深度的影响。
根据Bear定律，光固化材料的光穿透深度与光吸收剂的百分比Pd成反比(Li等，Yang,Y.等，Frisch等)。加入1重量％的光吸收剂后，30重量％的HA/TCP悬浮液的固化深度从400μm减小到仅20μm。具有光吸收剂的HA/TCP悬浮液的固化深度Cd可以表示为以下等式：
Figure BDA0002552473210000681
同时，曝光时间t随着光吸收剂浓度的增加而改变。由于投射光能E是曝光时间t和光强度I的乘积，因此可以将曝光时间t修改为：
Figure BDA0002552473210000682
随着光吸收剂浓度的增加，曝光时间呈指数增长(参见图38(e))。固化一层纯的30重量％HA/TCP悬浮液仅需5秒钟，而用1重量％的光吸收剂固化一层30重量％的HA/TCP需要35秒。
实施例39.经由基于浆料的μMIP-SL制造HA/TCP支架
首先需要根据支架的计算机辅助设计(CAD)模型来制造HA/TCP支架的生坯(图36(b))。基于浆料的μMIP-SL工艺用于将HA/TCP悬浮液选择性固化为具有分级多孔结构的复杂形状。在基于浆料的μMIP-SL工艺中，HA/TCP悬浮液的薄层在充分暴露于由高分辨率投影图像控制的聚焦光束后固化(图38(c))。因此，将3D支架的CAD模型切成一组掩模投影图像，其切割厚度小于HA/TCP悬浮液的固化深度[35]。为了获得均匀的光强度，需要基于光强度校准数据库来调整投影图像中每个像素的灰度级(参见图36(e))(Li等，Yang,Y.等，Zhou等)。
在基于自下而上的微型MIP-SL工艺中，新固化的材料附着在平台上，并且固化部件的底表面与涂有特氟隆膜的玻璃板的表面平行。随着平台上移，在平台和玻璃板之间产生间隙，并且如果液体树脂或浆料的粘度较低，则液体树脂或浆料可以流入其中。在气压和自身重力的驱动下，光固化材料将回流并重新填充投影区域。由于材料是不可压缩的液体流，并且材料的粘度在填充过程中不会发生变化，因此自填充材料满足以下Navier-stokes动量等式(Frisch等)：
Figure BDA0002552473210000691
其中P、ν、ρ、μ分别是材料的压力、速度、密度和粘度。
根据等式5，材料的重新填充速度ν取决于其粘度μ和压力P。HA/TCP悬浮液的粘度随HA/TCP浓度的增加呈指数增长(参见图38(d))。下表显示了悬浮液的HA/TCP浓度对悬浮液粘度的影响。
悬浮液的HA/TCP浓度 悬浮液粘度
0 180cP
5重量％HA+5重量％TCP 612.5cP
10重量％HA+10重量％TCP 1125cP
15重量％HA+15重量％TCP 5375cP
12.5重量％HA+12.5重量％TCP 22000cP
20重量％HA+20重量％TCP 57812cP
表4.悬浮液的HA/TCP浓度对悬浮液粘度的影响。
当HA/TCP粒子的浓度小于25重量％时，在Z载物台移动期间，HA/TCP悬浮液仍能够重新填充制造区域。因此，仍然可以使用传统的基于层的SL方法使用自填充材料3D打印HA/TCP浓度为0至25重量％的HA/TCP悬浮液，其中平台在一层固化后直接向上移动一定距离。然而，当HA/TCP粒子的浓度高于25重量％时，HA/TCP悬浮液的粘度从数百cPa急剧增加至数万cPa。HA/TCP悬浮液增加的粘性阻力极大地阻碍了平台与玻璃板之间的材料流动。因此，如果物流仅由气压和自身重力驱动，则粒子浓度大于25重量％的HA/TCP悬浮液将无法重新填充制造区域。
为解决HA/TCP粒子浓度大于25重量％的HA/TCP悬浮液的重新填充问题，在基于浆料的μMIP-SL中集成了具有圆周运动的自动材料进料模块。首先，通过使用刮刀将厚度为100μm的HA/TCP悬浮液薄层均匀地重新涂覆在玻璃板的顶面上(参见图36(c)和图36(b))。一层HA/TCP悬浮液固化后，首先将平台抬升一段距离，该距离大于重新涂覆的HA/TCP层的厚度；同时将涂有HA/TCP悬浮液的玻璃板沿X方向移动(图38(c))。应注意，投射光和构建平台的相对位置保持不变。玻璃板在X方向上移动后，一个新的重新涂覆的HA/TCP悬浮液层被传送到光投射位置。然后将平台缓慢下移，直到预固化的部件表面与玻璃板之间的距离等于基于浆料的固化深度设置的层厚度。通过上述圆周运动，一个新的HA/TCP悬浮液层会在几秒钟内不断地进料到平台正下方的位置。在构建过程中，重复进行圆周运动，直到在平台上构建了生坯的所有层。
实施例40.孔隙率和机械性能
在通过基于浆料的μMIP-SL工艺打印生坯后，进行脱脂和烧结程序。在脱脂工艺中，将温度升高到600℃后除去生坯中的光敏聚合物，并获得HA/TCP支架的棕坯。在这个阶段，HA/TCP支架的孔隙率达到峰值。然而，由于HA/TCP粒子的松散排列，因此HA/TCP支架的棕坯易碎(参见图39(a))；因此，遵循烧结工艺以改善HA/TCP粒子之间的结合。
测试了三种不同的烧结温度(1050℃、1150℃、1250℃)，以确定适当的烧结温度和HA/TCP粒子的浓度。下表总结了烧结温度TS和HA/TCP粒子浓度δ对支架孔隙率和机械性能的影响。
Figure BDA0002552473210000701
表5.烧结温度和悬浮液的HA/TCP浓度对支架的机械(抗压)强度的影响。
悬浮液浓度 1050℃ 1150℃ 1250℃
10重量％HA+10重量％TCP 27％ 23％ 20％
15重量％HA+15重量％TCP 20.5％ 17.3％ 14.6％
20重量％HA+20重量％TCP 10.4％ 8.7％ 5.9％
表6.悬浮液浓度和烧结温度对支架孔隙率的影响。
HA/TCP支架的孔隙率取决于粒径φ、烧结温度T和粒子浓度δ(Deng等，Jordan等)。HA/TCP支架的孔隙率p随着烧结温度的升高而线性降低(图39)。例如，当烧结温度从1050℃升高到1250℃时，30重量％HA/TCP支架的孔隙率p降低了6％。与烧结温度T相比，HA/TCP粒子的浓度δ显示出更显著的对孔隙率的影响(图39(c))。根据孔径分布的结果，烧结的HA/TCP支架的孔径主要在纳米级范围内(图39(d))。这是因为HA/TCP粒子的主晶粒尺寸的增加进一步减小了烧结后每个晶粒之间的间隙，并且HA/TCP粒子的晶粒在更高的温度下变得更大。
同时，HA/TCP支架的孔隙率p是影响HA/TCP支架的机械性能的重要因素，并且机械强度可以表示如下(Rice等)：
σ＝σ0exp(-ap) 等式6
其中σ是HA/TCP支架的强度，σ0是不具有孔的完全HA/TCP的强度，并且a为常数。
尽管在1050℃下烧结的20重量％HA/TCP支架的孔隙率p最大，但是其机械强度太弱以致于不能承受来自骨两侧的压缩载荷。可以通过提高烧结温度T或增加HA/TCP悬浮液的粒子浓度δ来提高HA/TCP支架的抗压强度。例如，当烧结温度从1050℃升高到1250℃时，30重量％HA/TCP的抗压强度从0.13mPa增加至4.32mPa。此外，当HA/TCP的浓度从20重量％增加至40重量％时，在1250℃烧结的20重量％HA/TCP的抗压强度提高了5倍(参见图39(b))。总体而言，在考虑孔隙率和机械性能时，在1250℃烧结的30重量％HA/TCP支架比其它支架表现出优势。
然而，对于由30重量％HA/TCP制成的支架，在1250℃烧结后，孔很小。如图39(d)所示，在1250℃烧结的30重量％HA/TCP支架的平均孔径小于5μm。即使机械强度是可以接受的，营养物和血管也很难穿过这种致密的HA/TCP支架。应注意，支架的孔隙率在骨形成中起着至关重要的作用。孔径与营养物和氧气的扩散以及细胞整合直接相关。
实施例41.收缩率分析
下表总结了烧结工艺后支架的收缩率。
温度 轴向 径向
1050℃ 17.75％ 15.45％
1150℃ 22.68％ 18.72％
1250℃ 35.5％ 28.19％
表7.烧结温度对支架在轴向和径向上的收缩率的影响。
Figure BDA0002552473210000721
表8.在1250℃的烧结温度下，悬浮液浓度对支架在轴向和径向上的收缩率的影响。
由于在后处理过程中除去了光固化聚合物并且将HA/TCP粒子烧结在一起，因此烧结的HA/TCP支架的总体积相比于通过μMIP-SL工艺制造的生坯有所降低。如图40(c)所示，可以分别计算Z方向(rsz)和XY平面(rsr)的收缩率：
Figure BDA0002552473210000731
收缩率rs与HA/TCP粒子浓度δ和烧结温度T密切相关(Heunisch等，Boccaccini等)。随着更多内部聚合物被烧掉，HA/TCP支架的收缩率rs随HA/TCP粒子浓度的降低而增加(参见图40(e))。因此，随着HA/TCP粒子的浓度从10重量％增加至40重量％，在1150℃下烧结的HA/TCP支架的轴向收缩率rsz从45.25％下降到17.8％。当烧结温度T升高时，可以观察到相同的趋势(参见图40(d))。这是随着烧结温度的升高发生扩散而发生的，并且HA/TCP粒子变得彼此更靠近(Boccaccini等，Hollister等)。例如，在1050℃烧结的30重量％HA/TCP支架在轴向(Z)方向上仅收缩17.75％，但是当烧结温度提高到1250℃时，30重量％HA/TCP支架减少35.5％。
HA/TCP支架的收缩率rs也受到几何设计的影响。如图40(a)-(b)所示，制造了具有不同密度的微孔的30重量％HA/TCP支架。当将支架设计为具有更大的微孔密度时，HA/TCP支架的体积收缩较小。此外，HA/TCP支架的收缩率rs在轴向(Z)和径向(XY)上变化。如图40(d)-(e)所示，轴向收缩率rsz大于径向收缩率rsr。具体而言，由30重量％的HA/TCP悬浮液制成的HA/TCP支架在1250℃烧结后，在轴向上从2mm减小至仅1.29mm，而支架的直径仅收缩至原始值的71.8％。这是因为轴向上的部件体积大于径向上的部件体积。此外，HA/TCP悬浮液在XY方向上的曝光下均匀地固化，因此应力在径向平面上更具各向同性。相反，HA/TCP悬浮液在Z方向上逐层堆叠；因此，Z方向的应力与XY平面的应力不同。因此，3D打印的HA/TCP支架显示出各向异性的收缩行为。
实施例42.具有分级多孔结构的复杂支架制造
如上所述，在烧结工艺后，HA/TCP支架在轴向和径向上都呈现收缩。为了在具有微观尺度孔的HA/TCP支架的制造中实现精确的形状控制，需要应用输入CAD模型的尺寸偏移以补偿制造收缩(Xu等,2017)。首先，使用30重量％的HA/TCP悬浮液打印一系列高度为200μm且宽度在30μm至300μm之间变化的矩形。3D打印部件和烧结部件如图41(a)所示。在测量了XY平面上的微孔的形状变化率之后，获得在XY方向上的补偿因子
Figure BDA0002552473210000742
类似地，使用相同的HA/TCP悬浮液3D打印了一系列边长在30μm至350μm范围内的正方形。3D打印结果和烧结部件如图41(b)所示。根据Z方向上微正方形的形状变化率研究补偿因子
Figure BDA0002552473210000743
根据如下所述的公式，分别根据轴向和径向所需的补偿来调整分级微观尺度特征的尺寸：
Figure BDA0002552473210000741
其中ldxy和ldz分别是微结构在轴向和径向上的打印尺寸；loxy和loz分别是轴向和径向的理想尺寸；并且
Figure BDA0002552473210000745
和
Figure BDA0002552473210000744
是两个常数，对于在1250℃烧结的30重量％HA/TCP支架而言，它们是1.39和1.55。
天然骨具有分级多孔结构，其尺寸在从数百微米到某些纳米的范围内(Basu等)。通过在设计阶段补偿制造收缩，我们的工艺可以准确地制造孔洞尺寸在从数百微米到数十微米范围内的多孔结构。另外，前述的后处理程序可以在所制造的多孔结构中产生孔洞，其尺寸范围为几微米到某些纳米。在这项研究中，使用已开发的基于浆料的μMIP-SL工艺设计并制造了微晶格结构和仿生骨结构。具有微晶格结构和仿生骨结构的HA/TCP支架的CAD模型和3D打印结果分别如图41(e)和图41(b)所示。设计为仿生骨结构和微观尺度晶格结构的HA/TCP支架的抗压强度分别为9.5MPa和15.5MPa，显示出令人满意的机械性能。更重要的是，由于在设计中添加了数百个微孔并通过已开发的3D打印工艺成功制造了数百个微孔，因此极大地改善了两种结构设计的支架孔隙率，这对于随后的细胞再生是重要的。
实施例43.体外性能
接下来，我们测试了基于HA/TCP的支架的生物相容性。具体而言，我们首先在具有微晶格结构的支架表面上培养细胞时测试了细胞活力。细胞接种24小时后，细胞能够附着于支架并显示正常纺锤状形态，表明健康状况。我们进一步在不同的时间点进行了活染色和死染色。自接种起24小时后，我们几乎看不到任何由红色荧光指示的死细胞。自接种起96小时后，我们观察到死细胞略有增加；然而，死细胞仍不到总细胞群体的10％(参见图42(a))。这可能是由于细胞数量过度汇合所致。我们还研究了支架中不同浓度的HA/TCP粒子对细胞增殖的影响(图42(b))。三天后，与对照组相比，用HA/TCP支架培养的细胞显示出相似的生长速率。然而，我们没有观察到用不同浓度的HA/TCP粒子打印的支架之间有任何显著差异。总体而言，这些数据清楚地表明基于HA/TCP的支架具有生物相容性。
实施例44.体内性能
我们进一步使用HA/TCP支架测试了基于干细胞的骨再生。与其它骨组织如颅顶相比，作为骨再生模型的小鼠股骨具有许多优势，例如承载、骨化方式以及来自周围环境的影响较小。然而，小鼠的小尺寸增加了小鼠股骨手术的难度。最近，我们开发了一种使用活裸鼠的股骨缺损手术技术(图43(a)-(b))。这些小鼠在初始手术后可以支持至多三到四个月的骨再生，因此可以作为干细胞介导的骨再生的模型。在对照组中，在手术后8周，根据放射影像学分析，我们没有观察到骨接合，证实该缺损确实是临界尺寸缺损(CSD)模型。在存在或不存在支架的情况下，将约一百万个骨髓来源的间充质干细胞混合在一起，并装载入小鼠的长骨CSD中。手术后两周，我们立即开始通过MSC治疗来检测两组中的新骨形成。与对照组相比，在前后方向上的骨长出得到显著促进。同时，我们还发现，基于X射线成像，支架的尺寸较小，表明支架在骨再生过程中降解。自手术起8周后，治疗组中的骨再生显著改善，并且与对照组和单独的细胞组相比，具有支架的细胞组中的小鼠在缺损部位的间隙更小。然而，我们仍然未能观察到皮质骨基质的接合(参见图43(d))。有趣的是，我们注意到HA/TCP支架被略微推离了损伤部位，这表明支架的更快降解速率可以进一步改善缺损的愈合结果。综上所述，这些数据表明HA/TCP支架对小鼠CSD模型中的骨再生具有骨诱导作用。在未来的研究中，我们将继续优化基于HA/TCP的支架的成分，以控制支架的降解，从而更好地促进长骨缺损的再生。
支架的适用材料和功能结构是处理骨愈合和细胞再生问题时要考虑的两个重要因素。在促进骨形成细胞的粘附和增殖方面具有优异性能的生物相容性陶瓷HA/TCP被广泛用于骨组织再生。然而，使用当前的制造方法，HA/TCP本身被认为难以形成复杂的几何形状。在本公开中，我们提出了一种基于浆料的μMIP-SL工艺，该工艺使得使用纳米级HA/TCP粒子构建具有复杂分级多孔结构的HA/TCP支架成为可能。首先，对HA/TCP悬浮液的固化性能进行了研究，并且介绍和演示了以浆料进料模块为特征的3D打印方法的过程。在结构孔隙率和机械性能方面，系统地优化了HA/TCP支架的后处理设置和悬浮液成分。为了提高分级多孔结构的制造精度，基于HA/TCP制造工艺的收缩行为，开发了一种形状补偿方案。同时，为了获得具有足够孔隙率的高机械强度，设计并制造了具有仿生骨结构和微晶格结构的HA/TCP支架。进行了HA/TCP支架的细胞增殖和体内试验，并且实验结果表明，具有BMMSC的HA/TCP支架可以促进小鼠动物模型的长骨临界缺损的骨愈合。将来，将使用我们开发的3D打印方法来制造具有其它可生物降解聚合物的纳米级HA/TCP粒子，以加速HA/TCP支架的降解，并且将其它生物分子如生长因子与3D打印的HA/TCP支架整合在一起以进一步加速骨愈合。
实施例45.骨再生产品的示例性制剂。
在第一阶段，我们开发了一种工艺，所述工艺可以使用可生物降解的聚合物和骨材料制造具有生长因子的支架。如图18所示，对于长骨再生，可以设计并构建3D多孔支架，该支架上可容易地附着细胞。
首先，扫描受损的骨骼以获得其在骨骼的受损和未受损区域上的详细特征。然后可以设计具有合适的多孔结构的支架，其具有适当的机械性能来容纳活细胞。然后可以将基于微观尺度掩模图像投影的SLA工艺应用于制造多孔支架，该多孔支架包括与生长因子和生物陶瓷化合物(例如HA/TCP)混合的聚合物。
然后可以将细胞加载并培养在3D打印的可生物降解支架的表面上，以用于受损区域的再生。类似地，然后可以设计和制造用于颅骨缺损的3D支架(实例显示于图18中)。颅骨缺损的模型可以通过扫描生成，以便可以获得缺损的所有详细特征。根据颅骨缺损的细节设计定制的多孔支架。
最后，制备生物陶瓷(HA/TCP)悬浮液以构建多孔3D支架，并且可以通过使用具有圆周运动的基于掩模图像投影的立体光刻术(MIP-SL)来制造被设计用于颅骨临界缺损的HA/TCP支架。
我们已经开发了猪的颅顶骨CSD模型，并成功地将自体MSC与3D打印支架一起用于CSD中的颅顶骨再生，从而放弃了金属或塑料植入物和骨移植物的使用。我们使用了来自颅面区域的DPNCC，它们能够产生致密的皮质骨。为了促进MSC分化为功能性成骨细胞，我们将它们与使用羟磷灰石和磷酸三钙(HA/TCP)制造的3D打印的骨诱导性支架相结合，间充质干细胞可以附着在该支架上。我们已经创建并测试了具有与人类相似的头部尺寸的大型动物模型。
对于骨组织，大多数骨移植物由金属、高应力聚合物或陶瓷制成，其提供一定的机械强度。由于几何形状的局限性，传统的骨移植物不能完全提供例如骨形成和加速新生长制造方法的功能。为了克服所述挑战，用干细胞培养的三维支架为组织再生带来了有希望的解决方案，并且支架的材料组成和几何结构两者都在新骨再生中起着关键作用。
实施例46.示例性的生物可降解支架
骨组织的再生可以通过用可生物降解的支架培养患者的细胞来实现。在支架的生物降解过程中，组织可能会长回以用生物活性细胞愈合缺损。
在组织工程中，具有复杂三维(3D)结构的支架为细胞提供支撑，并调节细胞生长和营养运输。已经使用了许多不同的技术来制造支架，其中一些包括基于织造和非织造纤维的织物，溶剂浇铸，颗粒浸出，相分离，熔融成型，高压加工，锻造，注射成型，以及热压和冷压。
通过这些方法制造的支架的3D结构具有规则的形状。由于这些结构的局限性，传统的骨移植物可能无法完全提供例如骨形成和加速新生长制造方法的功能。
已经讨论的组分、步骤、特征、目的、益处和优点仅仅是说明性的。它们或与它们有关的讨论均无意以任何方式限制保护范围。还设想了许多其它实施方式。这些包括具有更少、额外和/或不同的组分、步骤、特征、目的、益处和/或优点的实施方式。这些还包括其中组分和/或步骤被不同地布置和/或排序的实施方式。
实施例47.进一步包括Smurf1抑制剂的骨再生产品。
在该实施例中，以结合以上公开的实施例描述的方式进行实验。HA/TCP粉末形式用作支架。CNCC:BMMSC比率为9:1。非那米尔的量为300μM并且BMP2的量为2μg。
我们在四周后检测到缺损部位的愈伤组织形成，并且在AP方向上的骨长出显著改善。手术后八周，观察到皮质骨接合(图44A)。通过组织学检查，我们发现连续的皮质骨仅在骨髓隙中保留了一些小梁结构，这表明不仅实现了良好的骨接合，而且重塑过程也进展顺利(图44B)。
除非另有说明，否则本说明书(包括所附权利要求书)中列出的所有测量、值、额定值、位置、量级、尺寸和其它规格都是近似值，而不是精确值。它们意欲具有与它们所涉及的功能以及它们所属领域中的惯例相一致的合理范围。
上述骨再生产品、其特征、其制备方法和/或其在治疗具有缺损的骨骼中的用途的任何组合都在本公开的范围内。
本公开中引用的所有文章、专利、专利申请和其它出版物均通过引用并入本文。
当在权利要求中使用时，短语“用于……的手段”意指并且应被解释为涵盖已描述的相应结构和材料及其等同物。类似地，当在权利要求中使用时，短语“用于……的步骤”意指并且应被解释为涵盖已经描述的相应动作及其等同物。权利要求中不存在这些短语意味着该权利要求不意指且不应解释为限于这些相应的结构、材料、或动作或其等同物。
保护范围仅受所附权利要求书的限制。当根据本说明书和随后的起诉历史进行解释时，除了已经阐明了特定含义的地方之外，该范围意指并且应解释为与权利要求中使用的语言的普通含义相一致的宽范围，并涵盖所有结构和功能上的等同物。
关系术语如“第一”和“第二”等可以仅用于将一个实体或动作与另一个实体或动作区分开，而不必要求或暗示它们之间的任何实际关系或顺序。当与本说明书或权利要求书中的要素列表结合使用时，术语“包括”及其任何其它变化形式意欲指示该列表不是排他性的，并且可以包含其它要素。类似地，在没有进一步限制的情况下，不带具体数量的要素不会排除存在相同类型的其它要素。
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提供了摘要以帮助读者快速确定技术公开的本质。提交它的同时应该理解，它不用于解释或限制权利要求的范围或含义。另外，在各个实施方式中，前述详细描述中的多种特征被组合在一起以简化本公开。本公开的方法不应解释为要求所要求保护的实施方式需要比每个权利要求中明确叙述的特征更多的特征。相反，如所附权利要求所反映的，本发明主题在于少于单个公开实施方式的所有特征。因此，以下权利要求由此被并入详细描述中，其中每个权利要求独立地作为单独要求保护的主题。

Claims (152)

1.一种骨再生产品，所述骨再生产品包括：
间充质干细胞(MSC)制剂；和
支架；
其中所述MSC制剂包括干细胞混合物；并且
其中所述干细胞混合物包括密质骨再生干细胞(DBR-SC)、松质骨再生干细胞(SBR-SC)或其混合物。
2.如权利要求1所述的骨再生产品，所述DBR-SC包括牙髓干细胞、牙髓组织来源的神经嵴细胞、来自人脱落乳牙的干细胞、牙周膜干细胞、牙囊干细胞、牙胚祖细胞、来自根尖牙乳头的干细胞、口腔上皮祖细胞/干细胞、牙龈来源的间充质干细胞、骨缝干细胞或其混合物。
3.如权利要求1所述的骨再生产品，所述DBR-SC包括颅神经嵴来源的间充质干细胞(CNCC)、牙髓来源的干细胞(DPSC)或其混合物。
4.如权利要求1所述的骨再生产品，所述SBR-SC包括骨髓来源的间充质干细胞(BMMSC)、脂肪组织来源的间充质干细胞(AMSC)或其混合物。
5.如权利要求1所述的骨再生产品，所述SBR-SC包括骨髓来源的间充质干细胞(BMMSC)。
6.如权利要求1所述的骨再生产品，所述MSC制剂包括DBR-SC和SBR-SC；其中DBR-SC包括牙髓干细胞、来自人脱落乳牙的干细胞、牙周膜干细胞、牙囊干细胞、牙胚祖细胞、来自根尖牙乳头的干细胞、口腔上皮祖细胞/干细胞、牙龈来源的间充质干细胞、骨缝干细胞或其混合物；并且SBR-SC包括骨髓来源的间充质干细胞(BMMSC)、脂肪组织来源的间充质干细胞(AMSC)或其混合物。
7.如权利要求1所述的骨再生产品，所述MSC制剂包括DBR-SC和SBR-SC；其中DBR-SC包括DPSC、CNCC或其混合物；并且SBR-SC包括BMMSC。
8.如权利要求1所述的骨再生产品，其中所述干细胞混合物中DBR-SC的浓度在50％至100％的范围内。
9.如权利要求1所述的骨再生产品，其中所述干细胞混合物中DBR-SC的浓度在60％至100％的范围内。
10.如权利要求1所述的骨再生产品，其中所述干细胞混合物中DBR-SC的浓度在70％至100％的范围内。
11.如权利要求1所述的骨再生产品，其中所述干细胞混合物中DBR-SC的浓度在80％至100％的范围内。
12.如权利要求1所述的骨再生产品，其中所述干细胞混合物中DBR-SC的浓度在85％至95％的范围内。
13.如权利要求1所述的骨再生产品，其中所述干细胞混合物中DBR-SC的浓度在90％的范围内。
14.如权利要求1所述的骨再生产品，其中所述干细胞混合物中SBR-SC的浓度在50％至100％的范围内。
15.如权利要求1所述的骨再生产品，其中所述干细胞混合物中SBR-SC的浓度在60％至100％的范围内。
16.如权利要求1所述的骨再生产品，其中所述干细胞混合物中SBR-SC的浓度在70％至100％的范围内。
17.如权利要求1所述的骨再生产品，其中所述干细胞混合物中SBR-SC的浓度在80％至100％的范围内。
18.如权利要求1所述的骨再生产品，其中所述干细胞混合物中SBR-SC的浓度在85％至95％的范围内。
19.如权利要求1所述的骨再生产品，其中所述干细胞混合物中SBR-SC的浓度在90％的范围内。
20.如权利要求1所述的骨再生产品，其中所述骨再生产品进一步包括生长因子。
21.如权利要求1所述的骨再生产品，其中所述骨再生产品进一步包括生长因子；其中所述生长因子包括骨形态发生蛋白(BMP)、印度刺猬因子(IHH)、转化生长因子β(TGFβ)；骨形态发生蛋白(BMP)；成纤维细胞生长因子(FGF)；Wnt配体和β-连环蛋白；胰岛素生长因子(IGF)；胶原蛋白-1；Runx2；骨桥蛋白；osterix；血管内皮生长因子(VEGF)；血小板衍生生长因子(PDGF)；骨保护素(OPG)；NEL样蛋白1(NELL-1)；或其混合物。
22.如权利要求1所述的骨再生产品，其中所述骨再生产品进一步包括生长因子；其中所述生长因子包括BMP、IHH或其混合物。
23.如权利要求1所述的骨再生产品，其中所述骨再生产品进一步包括Smad泛素化调节因子-1(Smurf1)抑制剂。
24.如权利要求1所述的骨再生产品，其中所述骨再生产品进一步包括Smad泛素化调节因子-1(Smurf1)抑制剂；其中所述Smurf 1抑制剂包括A01、A02、A03、A04、A05、A06、A07、A08、A09、A10、A11、A14、A15、A17、A18、A25、A54、A63、A75、非那米尔等，或其组合。
25.如权利要求1所述的骨再生产品，其中所述骨再生产品进一步包括Smad泛素化调节因子-1(Smurf1)抑制剂；其中所述Smurf 1抑制剂包括A01、A17、非那米尔或其组合。
26.如权利要求1所述的骨再生产品，其中所述骨再生产品进一步包括Smad泛素化调节因子-1(Smurf1)抑制剂；其中所述Smurf 1抑制剂包括非那米尔。
27.如权利要求1所述的骨再生产品，其中所述骨再生产品进一步包括生长因子和Smurf 1抑制剂。
28.如权利要求1所述的骨再生产品，其中所述骨再生产品进一步包括生长因子和Smurf 1抑制剂；其中所述生长因子包括骨形态发生蛋白(BMP)、印度刺猬因子(IHH)、转化生长因子β(TGFβ)；骨形态发生蛋白(BMP)；成纤维细胞生长因子(FGF)；Wnt配体和β-连环蛋白；胰岛素生长因子(IGF)；胶原蛋白-1；Runx2；骨桥蛋白；osterix；血管内皮生长因子(VEGF)；血小板衍生生长因子(PDGF)；骨保护素(OPG)；NEL样蛋白1(NELL-1)；或其混合物；并且其中所述Smurf 1抑制剂包括A01、A02、A03、A04、A05、A06、A07、A08、A09、A10、A11、A14、A15、A17、A18、A25、A54、A63、A75、非那米尔等，或其组合。
29.如权利要求1所述的骨再生产品，其中所述骨再生产品进一步包括生长因子和Smurf 1抑制剂；其中所述生长因子包括BMP、IHH或其混合物；并且其中所述Smurf 1抑制剂包括A01、A17、非那米尔或其组合。
30.如权利要求1所述的骨再生产品，其中所述骨再生产品进一步包括生长因子和Smurf 1抑制剂；其中所述生长因子包括BMP、IHH或其混合物；并且其中所述Smurf 1抑制剂包括非那米尔。
31.如权利要求1所述的骨再生产品，其中所述MSC制剂进一步包括生长因子。
32.如权利要求1所述的骨再生产品，其中所述MSC制剂进一步包括生长因子；其中所述生长因子包括骨形态发生蛋白(BMP)、印度刺猬因子(IHH)、转化生长因子β(TGFβ)；骨形态发生蛋白(BMP)；成纤维细胞生长因子(FGF)；Wnt配体和β-连环蛋白；胰岛素生长因子(IGF)；胶原蛋白-1；Runx2；骨桥蛋白；osterix；血管内皮生长因子(VEGF)；血小板衍生生长因子(PDGF)；骨保护素(OPG)；NEL样蛋白1(NELL-1)；或其混合物。
33.如权利要求1所述的骨再生产品，其中所述MSC制剂进一步包括生长因子；其中所述生长因子包括BMP、IHH或其混合物。
34.如权利要求1所述的骨再生产品，其中所述MSC制剂进一步包括Smad泛素化调节因子-1(Smurf1)抑制剂。
35.如权利要求1所述的骨再生产品，其中所述MSC制剂进一步包括Smad泛素化调节因子-1(Smurf1)抑制剂；其中所述Smurf 1抑制剂包括A01、A02、A03、A04、A05、A06、A07、A08、A09、A10、A11、A14、A15、A17、A18、A25、A54、A63、A75、非那米尔等，或其组合。
36.如权利要求1所述的骨再生产品，其中所述MSC制剂进一步包括Smad泛素化调节因子-1(Smurf1)抑制剂；其中所述Smurf 1抑制剂包括A01、A17、非那米尔或其组合。
37.如权利要求1所述的骨再生产品，其中所述MSC制剂进一步包括Smad泛素化调节因子-1(Smurf1)抑制剂；其中所述Smurf 1抑制剂包括非那米尔。
38.如权利要求1所述的骨再生产品，其中所述MSC制剂进一步包括生长因子和Smurf 1抑制剂。
39.如权利要求1所述的骨再生产品，其中所述MSC制剂进一步包括生长因子和Smurf 1抑制剂；其中所述生长因子包括骨形态发生蛋白(BMP)、印度刺猬因子(IHH)、转化生长因子β(TGFβ)；骨形态发生蛋白(BMP)；成纤维细胞生长因子(FGF)；Wnt配体和β-连环蛋白；胰岛素生长因子(IGF)；胶原蛋白-1；Runx2；骨桥蛋白；osterix；血管内皮生长因子(VEGF)；血小板衍生生长因子(PDGF)；骨保护素(OPG)；NEL样蛋白1(NELL-1)；或其混合物；并且其中所述Smurf 1抑制剂包括A01、A02、A03、A04、A05、A06、A07、A08、A09、A10、A11、A14、A15、A17、A18、A25、A54、A63、A75、非那米尔等，或其组合。
40.如权利要求1所述的骨再生产品，其中所述MSC制剂进一步包括生长因子和Smurf 1抑制剂；其中所述生长因子包括BMP、IHH或其混合物；并且其中所述Smurf 1抑制剂包括A01、A17、非那米尔或其组合。
41.如权利要求1所述的骨再生产品，其中所述MSC制剂进一步包括生长因子和Smurf 1抑制剂；其中所述生长因子包括BMP、IHH或其混合物；并且其中所述Smurf 1抑制剂包括非那米尔。
42.如权利要求1所述的骨再生产品，其中所述支架包括生长因子。
43.如权利要求1所述的骨再生产品，其中所述支架包括生长因子；并且其中所述生长因子包括骨形态发生蛋白(BMP)、印度刺猬因子(IHH)、转化生长因子β(TGFβ)；骨形态发生蛋白(BMP)；成纤维细胞生长因子(FGF)；Wnt配体和β-连环蛋白；胰岛素生长因子(IGF)；胶原蛋白-1；Runx2；骨桥蛋白；osterix；血管内皮生长因子(VEGF)；血小板衍生生长因子(PDGF)；骨保护素(OPG)；NEL样蛋白1(NELL-1)；或其混合物。
44.如权利要求1所述的骨再生产品，其中所述支架包括生长因子；其中所述生长因子包括BMP、IHH或其混合物。
45.如权利要求1所述的骨再生产品，其中所述支架进一步包括Smad泛素化调节因子-1(Smurf1)抑制剂。
46.如权利要求1所述的骨再生产品，其中所述支架进一步包括Smad泛素化调节因子-1(Smurf1)抑制剂；其中所述Smurf 1抑制剂包括A01、A02、A03、A04、A05、A06、A07、A08、A09、A10、A11、A14、A15、A17、A18、A25、A54、A63、A75、非那米尔等，或其组合。
47.如权利要求1所述的骨再生产品，其中所述支架进一步包括Smad泛素化调节因子-1(Smurf1)抑制剂；其中所述Smurf 1抑制剂包括A01、A17、非那米尔或其组合。
48.如权利要求1所述的骨再生产品，其中所述支架进一步包括Smad泛素化调节因子-1(Smurf1)抑制剂；其中所述Smurf 1抑制剂包括非那米尔。
49.如权利要求1所述的骨再生产品，其中所述支架进一步包括生长因子和Smurf 1抑制剂。
50.如权利要求1所述的骨再生产品，其中所述支架进一步包括生长因子和Smurf 1抑制剂；其中所述生长因子包括骨形态发生蛋白(BMP)、印度刺猬因子(IHH)、转化生长因子β(TGFβ)；骨形态发生蛋白(BMP)；成纤维细胞生长因子(FGF)；Wnt配体和β-连环蛋白；胰岛素生长因子(IGF)；胶原蛋白-1；Runx2；骨桥蛋白；osterix；血管内皮生长因子(VEGF)；血小板衍生生长因子(PDGF)；骨保护素(OPG)；NEL样蛋白1(NELL-1)；或其混合物；并且其中所述Smurf 1抑制剂包括A01、A02、A03、A04、A05、A06、A07、A08、A09、A10、A11、A14、A15、A17、A18、A25、A54、A63、A75、非那米尔等，或其组合。
51.如权利要求1所述的骨再生产品，其中所述支架进一步包括生长因子和Smurf 1抑制剂；其中所述生长因子包括BMP、IHH或其混合物；并且其中所述Smurf 1抑制剂包括A01、A17、非那米尔或其组合。
52.如权利要求1所述的骨再生产品，其中所述支架进一步包括生长因子和Smurf 1抑制剂；其中所述生长因子包括BMP、IHH或其混合物；并且其中所述Smurf 1抑制剂包括非那米尔。
53.如权利要求1所述的骨再生产品，其中所述支架包括包含羟磷灰石和磷酸三钙的混合物。
54.如权利要求1所述的骨再生产品，其中所述支架包括包含羟磷灰石、磷酸三钙和生长因子的混合物。
55.如权利要求1所述的骨再生产品，其中所述支架包括包含羟磷灰石、磷酸三钙和生长因子的混合物；其中所述生长因子包括BMP、IHH或其混合物。
56.如权利要求1所述的骨再生产品，其中所述支架包括包含羟磷灰石、磷酸三钙和生长因子的混合物；其中所述生长因子包括BMP2、IHH或其混合物。
57.如权利要求1所述的骨再生产品，其中所述支架包括由包含聚己内酯(PCL)、聚己内酯二甲基丙烯酸酯(PCL-DA)、磷酸钙、羟磷灰石(HA)、磷酸三钙(TCP)、聚乙二醇二丙烯酸酯(PEGDA)、甲基丙烯酰化明胶(GelMA)或其混合物的制剂生产的制品。
58.如权利要求1所述的骨再生产品，其中所述支架包括由包含聚己内酯(PCL)、聚己内酯二甲基丙烯酸酯(PCL-DA)、磷酸钙、羟磷灰石(HA)、磷酸三钙(TCP)、聚乙二醇二丙烯酸酯(PEGDA)、甲基丙烯酰化明胶(GelMA)或其混合物，以及生长因子的制剂生产的制品。
59.如权利要求1所述的骨再生产品，其中所述支架包括由包含聚己内酯(PCL)、聚己内酯二甲基丙烯酸酯(PCLDA)、磷酸钙、羟磷灰石(HA)、磷酸三钙(TCP)、聚乙二醇二丙烯酸酯(PEGDA)、甲基丙烯酰化明胶(GelMA)或其混合物，以及生长因子的制剂生产的制品；其中所述生长因子包括BMP、IHH或其混合物。
60.如权利要求1所述的骨再生产品，其中所述支架包括由包含聚己内酯(PCL)、聚己内酯二甲基丙烯酸酯(PCLDA)、磷酸钙、羟磷灰石(HA)、磷酸三钙(TCP)、聚乙二醇二丙烯酸酯(PEGDA)、甲基丙烯酰化明胶(GelMA)或其混合物，以及生长因子的制剂生产的制品；其中所述生长因子包括BMP2、IHH或其混合物。
61.如权利要求1所述的骨再生产品，其中所述支架包括由包含通过光固化单体、光固化聚合物的聚合所制备的聚合物、羟磷灰石(HA)、磷酸三钙(TCP)或其混合物的制剂生产的制品。
62.如权利要求1所述的骨再生产品，其中所述支架包括由包含通过光固化单体、光固化聚合物的聚合所制备的聚合物、羟磷灰石(HA)、磷酸三钙(TCP)或其混合物，以及生长因子的制剂生产的制品。
63.如权利要求1所述的骨再生产品，其中所述支架包括由包含通过光固化单体、光固化聚合物的聚合所制备的聚合物、羟磷灰石(HA)、磷酸三钙(TCP)或其混合物，以及生长因子的制剂生产的制品；其中所述生长因子包括BMP、IHH或其混合物。
64.如权利要求1所述的骨再生产品，其中所述支架包括由包含通过光固化单体、光固化聚合物的聚合所制备的聚合物、羟磷灰石(HA)、磷酸三钙(TCP)或其混合物，以及生长因子的制剂生产的制品；其中所述生长因子包括BMP2、IHH或其混合物。
65.如权利要求1所述的骨再生产品，其中所述支架包括聚己内酯(PCL)、聚己内酯二甲基丙烯酸酯(PCL-DA)或其混合物。
66.如权利要求1所述的骨再生产品，其中所述支架包括聚己内酯(PCL)、聚己内酯二甲基丙烯酸酯(PCL-DA)或其混合物；和生长因子。
67.如权利要求1所述的骨再生产品，其中所述支架包括聚己内酯(PCL)、聚己内酯二甲基丙烯酸酯(PCL-DA)或其混合物；和生长因子；其中所述生长因子包括BMP、IHH或其混合物。
68.如权利要求1所述的骨再生产品，其中所述支架包括聚己内酯(PCL)、聚己内酯二甲基丙烯酸酯(PCL-DA)或其混合物；和生长因子；其中所述生长因子包括BMP2、IHH或其混合物。
69.如权利要求1所述的骨再生产品，其中：
所述支架包括至少一个第一腔室和至少一个第二腔室；
所述至少一个第一腔室容纳包含干细胞混合物的间充质干细胞制剂，其中所述干细胞混合物中DBR-SC的浓度在50％至100％的范围内；并且
所述至少一个第二腔室容纳包含干细胞混合物的间充质干细胞制剂，其中所述干细胞混合物中SBR-SC的浓度在50％至100％的范围内。
70.如权利要求1所述的骨再生产品，其中：
所述支架至少包括至少一个外部腔室和至少一个内部腔室；
至少一个外部腔室容纳骨再生产品，所述骨再生产品包括包含干细胞混合物的间充质干细胞制剂，其中所述干细胞混合物中DBR-SC的浓度在50％至100％的范围内；
至少一个内部腔室容纳骨再生产品，所述骨再生产品包括包含干细胞混合物的间充质干细胞制剂，其中所述干细胞混合物中SBR-SC的浓度在50％至100％的范围内；并且
所述外部腔室部分地或基本上围绕所述内部腔室。
71.如权利要求1所述的骨再生产品，其中所述支架包括羟磷灰石和磷酸三钙，其中所述羟磷灰石浓度在5重量％至30重量％的范围内并且所述磷酸三钙浓度在5重量％至30重量％的范围内。
72.如权利要求1所述的骨再生产品，其中所述支架包括羟磷灰石和磷酸三钙，其中所述羟磷灰石浓度在10重量％至20重量％的范围内并且所述磷酸三钙浓度在10重量％至20重量％的范围内。
73.如权利要求1所述的骨再生产品，其中所述支架包括羟磷灰石和磷酸三钙，其中所述羟磷灰石浓度在15重量％至20重量％的范围内并且所述磷酸三钙浓度在15重量％至20重量％的范围内。
74.如权利要求1所述的骨再生产品，其中所述支架包括羟磷灰石和磷酸三钙；其中所述羟磷灰石浓度为15重量％并且所述磷酸三钙浓度为15重量％，或者所述羟磷灰石浓度为20重量％并且所述磷酸三钙浓度为20重量％。
75.如权利要求1所述的骨再生产品，其中所述支架的抗压强度在0.1MPa至10MPa的范围内。
76.如权利要求1所述的骨再生产品，其中所述支架的抗压强度在1MPa至8MPa的范围内。
77.如权利要求1所述的骨再生产品，其中所述支架的抗压强度在5MPa至7MPa的范围内。
78.如权利要求1所述的骨再生产品，其中所述支架的孔隙率在1％至40％的范围内。
79.如权利要求1所述的骨再生产品，其中所述支架的孔隙率在3％至30％的范围内。
80.如权利要求1所述的骨再生产品，其中所述支架的孔隙率在3％至20％的范围内。
81.如权利要求1所述的骨再生产品，其中所述支架的孔隙率在3％至10％的范围内。
82.一种骨再生产品，所述骨再生产品包括支架。
83.如权利要求82所述的骨再生产品，其中所述支架包括生长因子。
84.如权利要求82所述的骨再生产品，其中所述支架包括生长因子；其中所述生长因子包括骨形态发生蛋白(BMP)、印度刺猬因子(IHH)、转化生长因子β(TGFβ)；骨形态发生蛋白(BMP)；成纤维细胞生长因子(FGF)；Wnt配体和β-连环蛋白；胰岛素生长因子(IGF)；胶原蛋白-1；Runx2；骨桥蛋白；osterix；血管内皮生长因子(VEGF)；血小板衍生生长因子(PDGF)；骨保护素(OPG)；NEL样蛋白1(NELL-1)；或其混合物。
85.如权利要求82所述的骨再生产品，其中所述支架包括生长因子；并且所述生长因子包括BMP、IHH或其混合物。
86.如权利要求82所述的骨再生产品，其中所述支架包括包含羟磷灰石和磷酸三钙的混合物。
87.如权利要求82所述的骨再生产品，其中所述支架包括包含羟磷灰石、磷酸三钙和生长因子的混合物。
88.如权利要求82所述的骨再生产品，其中所述支架包括包含羟磷灰石、磷酸三钙和生长因子的混合物；其中所述生长因子包括BMP、IHH或其混合物。
89.如权利要求82所述的骨再生产品，其中所述支架包括包含羟磷灰石、磷酸三钙和生长因子的混合物；其中所述生长因子包括BMP2、IHH或其混合物。
90.如权利要求82所述的骨再生产品，其中所述支架进一步包括Smad泛素化调节因子-1(Smurf1)抑制剂。
91.如权利要求82所述的骨再生产品，其中所述支架进一步包括Smad泛素化调节因子-1(Smurf1)抑制剂；其中所述Smurf 1抑制剂包括A01、A02、A03、A04、A05、A06、A07、A08、A09、A10、A11、A14、A15、A17、A18、A25、A54、A63、A75、非那米尔等，或其组合。
92.如权利要求82所述的骨再生产品，其中所述支架进一步包括Smad泛素化调节因子-1(Smurf1)抑制剂；其中所述Smurf 1抑制剂包括A01、A17、非那米尔或其组合。
93.如权利要求82所述的骨再生产品，其中所述支架进一步包括Smad泛素化调节因子-1(Smurf1)抑制剂；其中所述Smurf 1抑制剂包括非那米尔。
94.如权利要求82所述的骨再生产品，其中所述支架进一步包括生长因子和Smurf 1抑制剂。
95.如权利要求82所述的骨再生产品，其中所述骨再生产品进一步包括生长因子和Smurf 1抑制剂；其中所述生长因子包括骨形态发生蛋白(BMP)、印度刺猬因子(IHH)、转化生长因子β(TGFβ)；骨形态发生蛋白(BMP)；成纤维细胞生长因子(FGF)；Wnt配体和β-连环蛋白；胰岛素生长因子(IGF)；胶原蛋白-1；Runx2；骨桥蛋白；osterix；血管内皮生长因子(VEGF)；血小板衍生生长因子(PDGF)；骨保护素(OPG)；NEL样蛋白1(NELL-1)；或其混合物；并且其中所述Smurf 1抑制剂包括A01、A02、A03、A04、A05、A06、A07、A08、A09、A10、A11、A14、A15、A17、A18、A25、A54、A63、A75、非那米尔等，或其组合。
96.如权利要求82所述的骨再生产品，其中所述骨再生产品进一步包括生长因子和Smurf 1抑制剂；其中所述生长因子包括BMP、IHH或其混合物；并且其中所述Smurf 1抑制剂包括A01、A17、非那米尔或其组合。
97.如权利要求82所述的骨再生产品，其中所述骨再生产品进一步包括生长因子和Smurf 1抑制剂；其中所述生长因子包括BMP、IHH或其混合物；并且其中所述Smurf 1抑制剂包括非那米尔。
98.如权利要求82所述的骨再生产品，其中所述支架包括由包含聚己内酯(PCL)、聚己内酯二甲基丙烯酸酯(PCL-DA)、磷酸钙、羟磷灰石(HA)、磷酸三钙(TCP)、聚乙二醇二丙烯酸酯(PEGDA)、甲基丙烯酰化明胶(GelMA)或其混合物的制剂生产的制品。
99.如权利要求82所述的骨再生产品，其中所述支架包括由包含聚己内酯(PCL)、聚己内酯二甲基丙烯酸酯(PCL-DA)、磷酸钙、羟磷灰石(HA)、磷酸三钙(TCP)、聚乙二醇二丙烯酸酯(PEGDA)、甲基丙烯酰化明胶(GelMA)或其混合物，以及生长因子的制剂生产的制品。
100.如权利要求82所述的骨再生产品，其中所述支架包括由包含聚己内酯(PCL)、聚己内酯二甲基丙烯酸酯(PCLDA)、磷酸钙、羟磷灰石(HA)、磷酸三钙(TCP)、聚乙二醇二丙烯酸酯(PEGDA)、甲基丙烯酰化明胶(GelMA)或其混合物，以及生长因子的制剂生产的制品；其中所述生长因子包括BMP、IHH或其混合物。
101.如权利要求82所述的骨再生产品，其中所述支架包括由包含聚己内酯(PCL)、聚己内酯二甲基丙烯酸酯(PCLDA)、磷酸钙、羟磷灰石(HA)、磷酸三钙(TCP)、聚乙二醇二丙烯酸酯(PEGDA)、甲基丙烯酰化明胶(GelMA)或其混合物，以及生长因子的制剂生产的制品；其中所述生长因子包括BMP2、IHH或其混合物。
102.如权利要求82所述的骨再生产品，其中所述支架包括由包含通过光固化单体、光固化聚合物的聚合所制备的聚合物、羟磷灰石(HA)、磷酸三钙(TCP)或其混合物的制剂生产的制品。
103.如权利要求82所述的骨再生产品，其中所述支架包括由包含通过光固化单体、光固化聚合物的聚合所制备的聚合物、羟磷灰石(HA)、磷酸三钙(TCP)或其混合物，以及生长因子的制剂生产的制品。
104.如权利要求82所述的骨再生产品，其中所述支架包括由包含通过光固化单体、光固化聚合物的聚合所制备的聚合物、羟磷灰石(HA)、磷酸三钙(TCP)或其混合物，以及生长因子的制剂生产的制品；其中所述生长因子包括BMP、IHH或其混合物。
105.如权利要求82所述的骨再生产品，其中所述支架包括由包含通过光固化单体、光固化聚合物的聚合所制备的聚合物、羟磷灰石(HA)、磷酸三钙(TCP)或其混合物，以及生长因子的制剂生产的制品；其中所述生长因子包括BMP2、IHH或其混合物。
106.如权利要求82所述的骨再生产品，其中所述支架包括聚己内酯(PCL)、聚己内酯二甲基丙烯酸酯(PCL-DA)或其混合物。
107.如权利要求82所述的骨再生产品，其中所述支架包括聚己内酯(PCL)、聚己内酯二甲基丙烯酸酯(PCL-DA)或其混合物；和生长因子。
108.如权利要求82所述的骨再生产品，其中所述支架包括聚己内酯(PCL)、聚己内酯二甲基丙烯酸酯(PCL-DA)或其混合物；和生长因子；其中所述生长因子包括BMP、IHH或其混合物。
109.如权利要求82所述的骨再生产品，其中所述支架包括聚己内酯(PCL)、聚己内酯二甲基丙烯酸酯(PCL-DA)或其混合物；和生长因子；其中所述生长因子包括BMP2、IHH或其混合物。
110.如权利要求82所述的骨再生产品，其中：
所述支架包括至少一个第一腔室和至少一个第二腔室；
所述至少一个第一腔室容纳间充质干细胞制剂，所述制剂包含大于1的DBR-SC与SBR-SC比率(DBR-SC:SBR-SC)；并且
所述至少一个第二腔室容纳间充质干细胞制剂，所述制剂包含小于1的DBR-SC与SBR-SC比率(DBR-SC:SBR-SC)。
111.如权利要求82所述的骨再生产品，其中：
所述支架至少包括至少一个外部腔室和至少一个内部腔室；
至少一个外部腔室容纳包含间充质干细胞制剂的骨再生产品，其中DBR-SC与SBR-SC的比率(DBR-SC:SBR-SC)大于1；
至少一个内部腔室容纳包含间充质干细胞制剂的骨再生产品，其中DBR-SC与SBR-SC的比率(DBR-SC:SBR-SC)小于1；
所述外部腔室部分地或基本上包围所述内部腔室；
所述外部腔室和所述内部腔室各自包括开口，
所述开口具有特征性长度；并且
所述特征性长度小于特定尺寸，使得每个干细胞能够保持限制在内部和/或外部腔室中。
112.如权利要求82所述的骨再生产品，其中所述支架包括羟磷灰石和磷酸三钙，其中所述羟磷灰石浓度在5重量％至30重量％的范围内并且所述磷酸三钙浓度在5重量％至30重量％的范围内。
113.如权利要求82所述的骨再生产品，其中所述支架包括羟磷灰石和磷酸三钙，其中所述羟磷灰石浓度在10重量％至20重量％的范围内并且所述磷酸三钙浓度在10重量％至20重量％的范围内。
114.如权利要求82所述的骨再生产品，其中所述支架包括羟磷灰石和磷酸三钙，其中所述羟磷灰石浓度在15重量％至20重量％的范围内并且所述磷酸三钙浓度在15重量％至20重量％的范围内。
115.如权利要求82所述的骨再生产品，其中所述支架包括羟磷灰石和磷酸三钙；其中所述羟磷灰石浓度为15重量％并且所述磷酸三钙浓度为15重量％，或者所述羟磷灰石浓度为20重量％并且所述磷酸三钙浓度为20重量％。
116.如权利要求82所述的骨再生产品，其中所述支架的抗压强度在0.1MPa至10MPa的范围内。
117.如权利要求82所述的骨再生产品，其中所述支架的抗压强度在1MPa至8MPa的范围内。
118.如权利要求82所述的骨再生产品，其中所述支架的抗压强度在5MPa至7MPa的范围内。
119.如权利要求82所述的骨再生产品，其中所述支架的孔隙率在1％至40％的范围内。
120.如权利要求82所述的骨再生产品，其中所述支架的孔隙率在3％至30％的范围内。
121.如权利要求82所述的骨再生产品，其中所述支架的孔隙率在3％至20％的范围内。
122.如权利要求82所述的骨再生产品，其中所述支架的孔隙率在3％至10％的范围内。
123.如前述权利要求中任一项所述的骨再生产品，其中所述DBR-SC包括CNCC。
124.如前述权利要求中任一项所述的骨再生产品，其中所述SBR-SC包括BMMSC。
125.如前述权利要求中任一项所述的骨再生产品，其中所述干细胞混合物中DBR-SC的浓度在50％至100％的范围内。
126.如前述权利要求中任一项所述的骨再生产品，其中所述干细胞混合物中DBR-SC的浓度在60％至100％的范围内。
127.如前述权利要求中任一项所述的骨再生产品，其中所述干细胞混合物中DBR-SC的浓度在70％至100％的范围内。
128.如前述权利要求中任一项所述的骨再生产品，其中所述干细胞混合物中DBR-SC的浓度在80％至100％的范围内。
129.如前述权利要求中任一项所述的骨再生产品，其中所述干细胞混合物中DBR-SC的浓度在85％至95％的范围内。
130.如前述权利要求中任一项所述的骨再生产品，其中所述干细胞混合物中DBR-SC的浓度在90％的范围内。
131.如前述权利要求中任一项所述的骨再生产品，其中所述干细胞混合物中SBR-SC的浓度在50％至100％的范围内。
132.如前述权利要求中任一项所述的骨再生产品，其中所述干细胞混合物中SBR-SC的浓度在60％至100％的范围内。
133.如前述权利要求中任一项所述的骨再生产品，其中所述干细胞混合物中SBR-SC的浓度在70％至100％的范围内。
134.如前述权利要求中任一项所述的骨再生产品，其中所述干细胞混合物中SBR-SC的浓度在80％至100％的范围内。
135.如前述权利要求中任一项所述的骨再生产品，其中所述干细胞混合物中SBR-SC的浓度在85％至95％的范围内。
136.如前述权利要求中任一项所述的骨再生产品，其中所述干细胞混合物中SBR-SC的浓度在90％的范围内。
137.如前述权利要求所述的骨再生产品，其中所述支架包括羟磷灰石和磷酸三钙，其中所述羟磷灰石浓度在5重量％至30重量％的范围内并且所述磷酸三钙浓度在5重量％至30重量％的范围内。
138.如前述权利要求所述的骨再生产品，其中所述支架包括羟磷灰石和磷酸三钙，其中所述羟磷灰石浓度在10重量％至20重量％的范围内并且所述磷酸三钙浓度在10重量％至20重量％的范围内。
139.如前述权利要求所述的骨再生产品，其中所述支架包括羟磷灰石和磷酸三钙，其中所述羟磷灰石浓度在15重量％至20重量％的范围内并且所述磷酸三钙浓度在15重量％至20重量％的范围内。
140.如前述权利要求所述的骨再生产品，其中所述支架包括羟磷灰石和磷酸三钙；其中所述羟磷灰石浓度为15重量％并且所述磷酸三钙浓度为15重量％，或者所述羟磷灰石浓度为20重量％并且所述磷酸三钙浓度为20重量％。
141.如前述权利要求所述的骨再生产品，其中所述支架的抗压强度在0.1MPa至10MPa的范围内。
142.如前述权利要求所述的骨再生产品，其中所述支架的抗压强度在1MPa至8MPa的范围内。
143.如前述权利要求所述的骨再生产品，其中所述支架的抗压强度在5MPa至7MPa的范围内。
144.如前述权利要求所述的骨再生产品，其中所述支架的孔隙率在1％至40％的范围内。
145.如前述权利要求所述的骨再生产品，其中所述支架的孔隙率在3％至30％的范围内。
146.如前述权利要求所述的骨再生产品，其中所述支架的孔隙率在3％至20％的范围内。
147.如前述权利要求所述的骨再生产品，其中所述支架的孔隙率在3％至10％的范围内。
148.如前述权利要求所述的任何组合都在本公开的范围内。
149.一种骨再生方法，所述骨再生方法包括：将如前述权利要求中任一项所述的骨再生产品植入到骨缺损中或整个骨缺损。
150.一种骨再生方法，所述骨再生方法包括：将如前述权利要求中任一项所述的骨再生产品植入到长骨的骨缺损中或整个长骨的骨缺损。
151.一种骨再生方法，所述骨再生方法包括：将如前述权利要求中任一项所述的骨再生产品植入到骨缺损中或整个骨缺损；其中所述骨缺损是临界尺寸缺损。
152.一种骨再生方法，所述骨再生方法包括：将如前述权利要求中任一项所述的骨再生产品植入到长骨的骨缺损中或整个长骨的骨缺损；其中所述骨缺损是临界尺寸缺损。
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