CN114606184A - 诱导血管生成的间充质干细胞支架及其制备方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种诱导血管生成的间充质干细胞支架，该间充质干细胞支架包括间充质干细胞和支架材料，其中该间充质干细胞在该间充质干细胞支架中的数量是均匀分布的或者该间充质干细胞在该间充质干细胞支架中的数量是由该支架的外周向该支架的中央逐渐增高分布的，或者由该支架的一端向该支架的另一端逐渐增高分布的。该间充质干细胞支架能够很好地促进血管生成与延长，可应用于心脏及肢体缺血缺氧部位诱导血管生成，具有改善微循环和供血供氧、缓解和治疗缺血缺氧性疾病的前景。

Description

诱导血管生成的间充质干细胞支架及其制备方法与应用
技术领域
本发明涉及细胞培养技术领域，具体涉及一种诱导血管生成的间充质干细胞支架及其制备方法与应用。
背景技术
目前，机体局部血管痉挛或堵塞造成的血流降低或中断，常导致该区域的组织细胞因缺氧和营养物质供给不足而坏死，持续的细胞死亡导致炎症和纤维增生，由此引发的心脑血管疾病和肢体缺血性疾病在临床上具有很高的致死率、致残率。传统的治疗方法多以疏通血管为主，但血管再灌注造成的损伤也不容忽视。近年来，在缺血部位诱导血管新生成为一种新的治疗手段。血管生成与成熟是一个多因子高度时序性调控的过程。新血管的生成由VEGF、bFGF等促血管生成因子起始，招募平滑肌细胞和外周细胞pericytes，随后PDGF促进新生血管的成熟(Luís Henrique Wolff Gowdak and José Eduardo Krieger，2018)。在缺血部位引入血管生成诱导因子VEGF、bFGF、PDGF等，可诱导原有血管的内皮细胞增殖、迁移形成新的血管。因此，将促进血管生成与成熟的因子高效、便捷地导入缺血部位是改善和治疗缺血性疾病的关键。
目前研究中，大多利用PLGA[poly(lactic-co-glycolic acid)](Mohandas etal.,2015)、PLLA[poly(L-lactic acid)]和fibrin(Golub et al.,2010)、丝素蛋白(Wanget al.,2017)、热休克蛋白(Takagishi et al.,2021)等生物大分子材料包被VEGF、PDGF等细胞因子制成纳米颗粒(nanoparticles，NPs)，再将纳米颗粒装载于纤维素、甲壳素-透明质酸、水凝胶等支架材料中进行移植，实现因子的原位递送和缓释、控释，达到诱导血管生成的作用。利用细菌纤维素/明胶海绵VEGF的装载效率为66.5％，2d内91％以上的VEGF都被释放；将VEGF先用丝素蛋白制成纳米颗粒、再结合细菌纤维素/明胶海绵几乎可装载全部的因子，因子的突释现象得到显著改善，第1d仅9.9％的VEGF释放，28d的累积释放率为51.4％(Wang et al.,2017)。静电纺丝法制备的核-壳支架(polycaprolactone&1％PEG)装载VEGF，18h内累积释放38％，随后达到平台期，缓慢释放(Zigdon-Giladi et al.,2017)。针对不同种类的细胞因子可根据需要分别制备NPs，其中核-壳(core-shell)2层结构的NPs可实现细胞因子的延迟释放。如，PLGA单层NPs包埋VEGF、bFGF，PLGA-PLLA核-壳2层结构的NPs包埋PDGF，可实现VEGF、bFGF先释放而PDGF延迟释放，有效促进血管生成与成熟(Izadifaret al.,2016)。然而，纳米颗粒的制备步骤多、工艺复杂，往往需要一些特殊的仪器设备，如超声波材料乳化分散器、超速冷冻离心机、冷冻干燥仪等，涉及多种细胞因子的NPs制备与工艺控制更为复杂；另外，细胞因子、包埋材料如PLGA等价格昂贵、包埋效率有限，药物制备成本高，大大限制了其推广应用。
除了用细胞因子诱导缺血部位生成新的血管，干细胞移植，再由干细胞分化为血管内皮细胞和平滑肌细胞从而形成新的血管，提供了一种新的治疗手段。胚胎干细胞、诱导多能干细胞和间充质干细胞等，都具有分化为血管内皮细胞和平滑肌细胞、形成新血管的潜能，其中间充质干细胞因来源广泛、易于分离获得、增殖和分化能力强、免疫原性低且具有很强的免疫调节、减轻纤维化等作用，成为临床上备受关注和认可的移植细胞来源之一。
间充质干细胞不仅具有分化形成新血管的潜能，而且具有强大的旁分泌能力，可分泌水溶性细胞因子(如血管内皮细胞生长因子VEGF、血小板衍生生长因子PDGF、碱性成纤维细胞生长因子bFGF、肝细胞生长因子HGF、胰岛素样生长因子IGF-1等)、microRNAs和外泌体exosomes等，这些物质被认为是间充质干细胞移植后发挥治疗作用的重要成分，其中VEGF、bFGF、PDGF、HGF等可溶性细胞因子具有诱导血管生成与成熟的作用。间充质干细胞(MSCs)的分泌物还具有调节免疫反应、减轻纤维化的作用，有助于改善微环境、进一步促进新生血管网络的形成与生长。
发明内容
基于此，本发明提供了一种诱导血管生成的间充质干细胞支架，该间充质干细胞支架包括间充质干细胞和支架材料，其中该间充质干细胞在该间充质干细胞支架中的数量是均匀分布的或者该间充质干细胞在该间充质干细胞支架中的数量是由该支架的外周向该支架的中央逐渐增高分布的，或者由该支架的一端向该支架的另一端逐渐增高分布的。
进一步地，该间充质干细胞选自以下的一种或多种：骨髓间充质干细胞、外周血间充质干细胞、脂肪间充质干细胞、脐带间充质干细胞、脐带血间充质干细胞、羊水间充质干细胞、牙齿间充质干细胞、睾丸间充质干细胞、皮肤间充质干细胞和胎盘间充质干细胞。
进一步地，该间充质干细胞为自体来源的间充质干细胞和/或异体来源的间充质干细胞。
进一步地，该自体来源为自体外周血和/或脂肪来源。
进一步地，该异体来源为异体脐带华通氏胶、脐带血、羊水和/或胎盘来源。
进一步地，该间充质干细胞分泌选自以下的一种或多种物质：可溶性细胞因子、微小核糖核酸和外泌体。
进一步地，该可溶性细胞因子选自以下的一种或多种：血管内皮细胞生长因子、血小板衍生生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、肝细胞生长因子、基质细胞源性因子和胰岛素样生长因子。
进一步地，该支架材料是可降解生物材料。
进一步地，该支架材料是部分降解的、改性的化合物例如温敏性化合物和/或光敏性化合物。
进一步地，该支架材料选自以下的一种或多种：可降解的蛋白质或多肽类材料、可降解的多糖类材料、聚酯类水凝胶、聚丙烯酰胺水凝胶例如聚(N-异丙基丙烯酰胺)水凝胶、聚丙烯酸水凝胶和聚乙烯醇水凝胶。
进一步地，该可降解的蛋白质或多肽类材料选自以下的一种或多种：胶原、纤粘连蛋白、层粘连蛋白、弹性蛋白、丝素蛋白、改性的明胶水凝胶例如甲基丙烯酰化明胶、改性的丝素蛋白水凝胶例如甲基丙烯酰化丝素蛋白和改性的弹性蛋白水凝胶例如甲基丙烯酰化弹性蛋白。
进一步地，该可降解的多糖类材料选自以下的一种或多种：纤维素、甲壳素、透明质酸、硫酸软骨素、藻酸盐、改性的光敏性甲壳素例如甲基丙烯酰化羧甲基壳聚糖、改性的褐藻酸盐水凝胶例如甲基丙烯酰化藻酸盐、改性的透明质酸水凝胶例如甲基丙烯酰化透明质酸、改性的硫酸软骨素水凝胶例如甲基丙烯酰化硫酸软骨素和细菌纤维素水凝胶。
进一步地，该甲基丙烯酰化明胶的氨基取代度为30％～90％例如约30％、约60％或约90％。
进一步地，该甲基丙烯酰化明胶的浓度为5％～20％。
进一步地，该甲基丙烯酰化明胶的浓度为5％～10％例如约5％、约8％或约10％。
根据本发明的另一个方面，提供了一种制备上述间充质干细胞支架的方法，该方法包括以下步骤：
(1)将间充质干细胞重悬于水凝胶中，形成细胞悬液；以及
(2)将该细胞悬液通过3D打印形成该间充质干细胞支架，或者将该细胞悬液通过铺展于培养皿/模具中并进行交联形成该间充质干细胞支架，
其中该间充质干细胞在该间充质干细胞支架中的数量是均匀分布的或者该间充质干细胞在该间充质干细胞支架中的数量是由该支架的外周向该支架的中央逐渐增高分布的，或者由该支架的一端向该支架的另一端逐渐增高分布的。
进一步地，在步骤(1)中，该细胞悬液的细胞密度为(0.01～10)×105个/ml。
进一步地，该间充质干细胞支架的形状为适用于损伤区域的形状。
进一步地，该形状为方形、圆形或椭圆形。
进一步地，在步骤(2)中，通过3D打印形成的间充质干细胞支架为底面约5～20mm×约5～20mm，高约1～3mm的间充质干细胞支架或者上底约3～15mm×约3～15mm、下底约10～20mm×约10～20mm、高约1～3mm且纵切面为梯形的间充质干细胞支架。
进一步地，在步骤(2)中，通过3D打印形成的间充质干细胞支架为底面约10mm×约10mm，高约1mm的间充质干细胞支架或者上底约3mm×约3mm、下底约10mm×约10mm、高约2mm且纵切面为梯形的间充质干细胞支架。
进一步地，在步骤(2)中，通过3D打印形成的间充质干细胞支架为一层或多层由丝线构成的丝状物。
进一步地，该丝线的形状为直线或曲线。
进一步地，该丝线的丝径为约200μm和/或丝间距为约0.5-1.0mm。
进一步地，该丝线是平行不交叉的。
进一步地，该丝线物为由三角形、四边形、五边形、六边形、圆形或椭圆形构成的丝线网状物。
进一步地，在步骤(2)中，该交联的条件为在405nm光源下光交联10～30秒，交联1～3次。
进一步地，在步骤(2)中，该交联的条件为在405nm光源下光交联约20秒，交联3次。
根据本发明的另一个方面，提供了一种制备新生血管网络的方法，该方法包括以下步骤：
(1)将主动脉环或主动脉切段转入培养孔中的上述间充质干细胞支架或者根据上述方法制备的间充质干细胞支架的中央；
(2)在该主动脉环或该主动脉切段上滴加5～10％的支架材料从而包埋该主动脉环或该主动脉切段，在405nm光源下光交联10～30秒；
(3)以血管培养基于37℃培养箱中洗涤该培养孔1～3次，每次5～15min；以及
(4)将该血管培养基与该主动脉环或该主动脉切段共培养3天至30天，得到该新生血管网络。
进一步地，在步骤(1)之前，将上述间充质干细胞支架或者根据上述方法制备的间充质干细胞支架在含5～10％血清或血清替代物的间充质干细胞培养基中，或者在间充质干细胞无血清培养基中预培养3～15天。
进一步地，在步骤(1)之前，将上述间充质干细胞支架或者根据上述方法制备的间充质干细胞支架在含约10％血清或血清替代物的间充质干细胞培养基中，或者在间充质干细胞无血清培养基中预培养3～15天。
进一步地，在步骤(1)之前，将上述间充质干细胞支架或者根据上述方法制备的间充质干细胞支架在含约10％血清或血清替代物的间充质干细胞培养基中，或者在间充质干细胞无血清培养基中预培养约15天。
进一步地，在步骤(1)中，将主动脉以血管培养基冲洗过后切成主动脉环或主动脉切段。
进一步地，在步骤(1)中，该主动脉环或主动脉切段是在血管培养基中饥饿过夜的主动脉环或主动脉切段。
进一步地，该血管培养基为H-DMEM培养基或血管内皮细胞生长培养基。
根据本发明的另一个方面，提供了一种根据上述间充质干细胞支架或者根据上述方法制备的间充质干细胞支架或者根据上述方法制备的新生血管网络在制备用于预防和/或治疗缺血性和/或缺氧性疾病和/或损伤的产品中的用途。
根据本发明的另一个方面，提供了一种根据上述间充质干细胞支架或者根据上述方法制备的间充质干细胞支架或者根据上述方法制备的新生血管网络在制备用于预防和/或治疗纤维化和/或瘢痕形成的产品中的用途。
根据本发明的另一个方面，提供了一种根据上述间充质干细胞支架或者根据上述方法制备的间充质干细胞支架或者根据上述方法制备的新生血管网络在制备用于诱导血管生成的产品中的用途。
本发明的有益效果：
本发明利用间充质干细胞和可降解生物材料制备一种诱导血管生成的支架，其中MSCs在支架中的数量可以均匀分布，也可以由支架中心向外围逐渐减少，或由支架一端向另一端逐渐减少，呈梯度分布，使其分泌物(如VEGF等细胞因子)浓度也由支架中央向外周逐渐降低，或由支架一端向另一端逐渐降低，利用这种因子浓度梯度更好地促进血管生成与延长。该支架可应用于心脏及肢体缺血缺氧部位诱导血管生成，具有改善微循环和供血供氧、缓解和治疗缺血缺氧性疾病的前景。与以往单纯利用包埋VEGF、PDGF、bFGF等细胞因子的缓释微球诱导血管生成相比，MSCs支架可持续分泌细胞因子，不仅可诱导血管生成，而且其免疫调节、减轻纤维化等潜能可进一步改善微环境、促进血管生成和损伤修复。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，还可以根据这些附图获得其它的附图，而并不超出本发明要求保护的范围。
图1为间充质干细胞(MSCs)支架中的MSCs梯度及其旁分泌因子的浓度梯度诱导血管生成示意图。其中，矩形代表血管环，圆形代表MSCs，星形代表旁分泌因子。
图2为制备实施例一的3D生物打印制备的MSCs支架示意图。其中A为MSCs非梯度支架三维结构模型，B-C为3D打印的MSCs非梯度支架；D为MSCs梯度支架三维结构模型，E-F为3D打印的MSCs梯度支架。
图3为制备实施例一的3D打印MSCs支架分别与血管环在添加2.5％FBS的培养基中共培养3天、7天、12天诱导新生血管生成及生长情况示意图。其中，3D打印支架中MSCs均匀分布(A)或呈梯度分布(B)，标尺＝500μm。
图4为与制备实施例一的MSCs梯度支架共培养18天的血管环的鉴定图。其中，多聚甲醛固定后以BS1 lectin-FITC、DAPI进行染色，分别标记血管内皮细胞和细胞核，标尺＝500μm。其中A显示新生血管(lectin-FITC标记血管内皮细胞)，B显示细胞核(DAPI标记)，C显示血管环及新生血管(明场)，D为A、C叠加图。
图5为制备实施例二的预培养10天的MSCs支架与血管环在无血清培养基中共培养4天、12天、30天时新生血管的形成及生长情况图。其中，MSCs支架包括GelMA60-MSCs均匀分布支架、GelMA60-MSCs梯度分布支架和GelMA90-MSCs梯度分布支架，标尺＝200μm。
图6为制备实施例三的预培养15天的GelMA60-MSCs支架在无血清条件下与血管环培养4天(A)、12天(B)、30天(C，D)新生血管的形成及生长情况图。其中，标尺＝200μm(A-C)，500μm(D)。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
除非另外说明，本文所用的所有技术和科学术语和缩略语具有本发明领域或该术语应用领域中普通技术人员通常所理解的含义。虽然本发明实施过程中可使用类似于或等价于本文公开的那些的制备方法或材料，但本文描述了优选的制备方法或材料。
正如背景技术部分所描述的，现有的治疗方法存在易造成血管再灌注损伤、纳米颗粒支架材料制备步骤多、工艺复杂、价格昂贵、包埋效率有限以及药物制备成本高的问题。为了解决上述问题，本发明提供了一种诱导血管生成的间充质干细胞支架，该间充质干细胞支架包括间充质干细胞和支架材料，其中该间充质干细胞在该间充质干细胞支架中的数量是均匀分布的或者该间充质干细胞在该间充质干细胞支架中的数量是由该支架的外周向该支架的中央逐渐增高分布的，或者由该支架的一端向该支架的另一端逐渐增高分布的。
在一定的程度上，具体实施方式和/或权利要求中使用术语“包括(including，includes)”、“包含(comprising，comprises)”和“具有(having，has，with)”或其变体，这些术语意在包括与术语“包括(including，includes)”类似的方式。
在本发明中，制成的MSCs支架，用完全培养基培养1-2周，用于体外研究或体内移植。体外研究中，MSCs支架与内皮细胞或主动脉血管环共培养，检测其诱导血管生成情况。体内可将MSCs支架移植到缺血性损伤部位，3～4周后检测损伤部位血管生成及损伤修复情况。
在一种优选的实施方式中，该间充质干细胞在该间充质干细胞支架中的数量是由该支架的外周向该支架的中央逐渐增高分布的，或者由该支架的一端向该支架的另一端逐渐增高分布的。
在本发明中，鉴于MSCs具有强大的旁分泌能力，MSCs的数量梯度会带来其旁分泌因子的浓度梯度，从而更好地诱导血管向高浓度方向生长。在无血清培养条件下，与均匀分布支架相比，与梯度支架共培养的血管环新生血管的长度和日平均生长率均显著增高，这表明MSCs梯度支架比MSCs均匀分布支架能够更有效地诱导血管生成与生长。
本发明的梯度支架的实现方式包括以下两种：(1)3D打印逐层打印，每层内部填充图案的样式不限，可以是平行丝状或多边网格状，丝间距、网格的大小、夹角等根据生物材料不同调整；可以使用一种细胞密度的生物墨水打印，或使用多种细胞密度的生物墨水进行多头分控打印，实现间充质干细胞在形成的生物支架中由外周向中央或由一端向另外一端逐渐递增的梯度分布；(2)使用一种细胞密度的生物墨水，或同时制备多种细胞密度的生物墨水，加入特定模型或模具中，采用合适方法交联，实现间充质干细胞在形成的生物支架中由外周向中央或由一端向另外一端逐渐递增的梯度分布。
在一种优选的实施方式中，该间充质干细胞选自以下的一种或多种：骨髓间充质干细胞、外周血间充质干细胞、脂肪间充质干细胞、脐带间充质干细胞、脐带血间充质干细胞、羊水间充质干细胞、牙齿间充质干细胞、睾丸间充质干细胞、皮肤间充质干细胞和胎盘间充质干细胞。
在一种优选的实施方式中，该间充质干细胞为自体来源的间充质干细胞和/或异体来源的间充质干细胞。
在一种优选的实施方式中，该自体来源为自体外周血和/或脂肪来源。
在一种优选的实施方式中，该异体来源为异体脐带华通氏胶、脐带血、羊水和/或胎盘来源。
在一种优选的实施方式中，该间充质干细胞分泌选自以下的一种或多种物质：可溶性细胞因子、微小核糖核酸和外泌体。
在一种优选的实施方式中，该可溶性细胞因子选自以下的一种或多种：血管内皮细胞生长因子、血小板衍生生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、肝细胞生长因子、基质细胞源性因子和胰岛素样生长因子。
在一种优选的实施方式中，该支架材料是可降解生物材料。
在一种优选的实施方式中，该支架材料是部分降解的、改性的化合物。
在一种优选的实施方式中，该化合物为温敏性化合物或光敏性化合物。
在一种优选的实施方式中，该支架材料选自以下的一种或多种：可降解的蛋白质或多肽类材料、可降解的多糖类材料、聚酯类水凝胶、聚丙烯酰胺水凝胶、聚丙烯酸水凝胶和聚乙烯醇水凝胶。
在一种优选的实施方式中，该聚丙烯酰胺水凝胶为聚(N-异丙基丙烯酰胺)水凝胶。
在一种优选的实施方式中，该可降解的蛋白质或多肽类材料选自以下的一种或多种：胶原、纤粘连蛋白、层粘连蛋白、弹性蛋白、丝素蛋白、改性的明胶水凝胶、改性的丝素蛋白水凝胶和改性的弹性蛋白水凝胶。
在一种优选的实施方式中，该改性的明胶水凝胶为甲基丙烯酰化明胶。
在一种优选的实施方式中，该改性的丝素蛋白水凝胶为甲基丙烯酰化丝素蛋白。
在一种优选的实施方式中，该改性的弹性蛋白水凝胶为甲基丙烯酰化弹性蛋白。
在一种优选的实施方式中，该可降解的多糖类材料选自以下的一种或多种：纤维素、甲壳素、透明质酸、硫酸软骨素、藻酸盐、改性的光敏性甲壳素、改性的褐藻酸盐水凝胶、改性的透明质酸水凝胶、改性的硫酸软骨素水凝胶和细菌纤维素水凝胶。
在一种优选的实施方式中，该改性的光敏性甲壳素为甲基丙烯酰化羧甲基壳聚糖。
在一种优选的实施方式中，该改性的褐藻酸盐水凝胶为甲基丙烯酰化藻酸盐。
在一种优选的实施方式中，该改性的透明质酸水凝胶为甲基丙烯酰化透明质酸。
在一种优选的实施方式中，该改性的硫酸软骨素水凝胶为甲基丙烯酰化硫酸软骨素。
在一种优选的实施方式中，该甲基丙烯酰化明胶的氨基取代度为30％～90％。
在一种优选的实施方式中，该甲基丙烯酰化明胶的氨基取代度为约30％。
在本发明中，“约”是指一个特定值的±5％范围的值。例如，“约30”包括30的±5％，或从28.5到31.5，包含28.5和31.5。
在一种优选的实施方式中，该甲基丙烯酰化明胶的氨基取代度为约60％。
在本发明中，“约”是指一个特定值的±5％范围的值。例如，“约60”包括60的±5％，或从57到63，包含57和63。
在本发明中，与GelMA90-MSCs梯度支架相比，GelMA60-MSCs梯度支架诱导的新生血管平均长度明显增高，表明GelMA60-MSCs支架比GelMA90-MSCs支架能更有效地诱导血管生成与生长。
在一种优选的实施方式中，该甲基丙烯酰化明胶的氨基取代度为约90％。
在本发明中，“约”是指一个特定值的±5％范围的值。例如，“约90”包括90的±5％，或从85.5到94.5，包含85.5和94.5。
在一种优选的实施方式中，该甲基丙烯酰化明胶的浓度为5％～20％。
在本发明中，氨基取代度、浓度、密度、时间、次数、长度、宽度、高度、距离或者其它值或参数以范围、优选范围、或一系列上限优选值和下限优选值限定的范围表示时，这应当被理解为具体公开了由任何范围上限或优选值与任何范围下限或优选值的任一配对所形成的所有范围，而不论该范围是否单独公开了。例如，当公开了范围“5％～20％”时，除非另外说明，否则该范围意图包括其端值(例如5％和20％)和在该范围内的所有整数(例如6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％和19％)和非整数，且在上述数值范围内均能实现本发明的技术效果。
在一种优选的实施方式中，该甲基丙烯酰化明胶的浓度为5％～10％。
在一种优选的实施方式中，该甲基丙烯酰化明胶的浓度为约5％。
在本发明中，“约”是指一个特定值的±5％范围的值。例如，“约5”包括5的±5％，或从4.75到5.25，包含4.75和5.25。
在一种优选的实施方式中，该甲基丙烯酰化明胶的浓度为约8％。
在本发明中，“约”是指一个特定值的±5％范围的值。例如，“约8”包括8的±5％，或从7.6到8.4，包含7.6和8.4。
在一种优选的实施方式中，该甲基丙烯酰化明胶的浓度为约10％。
在本发明中，“约”是指一个特定值的±5％范围的值。例如，“约10”包括10的±5％，或从9.5到10.5，包含9.5和10.5。
根据本发明的另一个方面，提供了一种制备上述间充质干细胞支架的方法，该方法包括以下步骤：
(1)将间充质干细胞重悬于水凝胶中，形成细胞悬液；以及
(2)将该细胞悬液通过3D打印形成该间充质干细胞支架，或者将该细胞悬液通过铺展于培养皿/模具中并进行交联形成该间充质干细胞支架，
其中该间充质干细胞在该间充质干细胞支架中的数量是均匀分布的或者该间充质干细胞在该间充质干细胞支架中的数量是由该支架的外周向该支架的中央逐渐增高分布的，或者由该支架的一端向该支架的另一端逐渐增高分布的。
在一种优选的实施方式中，在步骤(1)中，该细胞悬液的细胞密度为(0.01～10)×105个/ml。
在一种优选的实施方式中，该间充质干细胞支架的形状为方形、圆形、椭圆形或者适用于损伤区域的形状。
在一种优选的实施方式中，在步骤(2)中，通过3D打印形成的间充质干细胞支架为底面约5～20mm×约5～20mm，高约1～3mm的间充质干细胞支架或者上底约3～15mm×约3～15mm、下底约10～20mm×约10～20mm、高约1～3mm且纵切面为梯形的间充质干细胞支架。
在一种优选的实施方式中，在步骤(2)中，通过3D打印形成的间充质干细胞支架为底面约10mm×约10mm，高约1mm的间充质干细胞支架或者上底约3mm×约3mm、下底约10mm×约10mm、高约2mm且纵切面为梯形的间充质干细胞支架。
在一种优选的实施方式中，在步骤(2)中，通过3D打印形成的间充质干细胞支架为一层或多层由丝线构成的丝状物。
在一种优选的实施方式中，该丝线的形状为直线或曲线。
在一种优选的实施方式中，该丝线的丝径为约200μm和/或丝间距为约0.5-1.0mm。
在一种优选的实施方式中，该丝线是平行不交叉的。
在一种优选的实施方式中，该丝线物为由三角形、四边形、五边形、六边形、圆形或椭圆形构成的丝线网状物。
在一种优选的实施方式中，在步骤(2)中，该交联的条件为在405nm光源下光交联10～30秒，交联1～3次。
在一种优选的实施方式中，在步骤(2)中，该交联的条件为在405nm光源下光交联约20秒，交联3次。
根据本发明的另一个方面，提供了一种制备新生血管网络的方法，该方法包括以下步骤：
(1)将在无血清H-DMEM培养基中饥饿过夜的主动脉环或主动脉切段转入培养孔中的上述间充质干细胞支架或者根据上述方法制备的间充质干细胞支架的中央；
(2)在该主动脉环或该主动脉切段上滴加5～10％的支架材料从而包埋该主动脉环或该主动脉切段，在405nm光源下光交联10～30秒；
(3)以H-DMEM培养基于37℃培养箱中洗涤该培养孔1～3次，每次5～15min；以及
(4)添加含有1～3mM GlutaMAX的H-DMEM培养基，与该主动脉环或该主动脉切段共培养3天至30天，得到该新生血管网络。
在一种优选的实施方式中，在步骤(1)之前，将上述间充质干细胞支架或者根据上述方法制备的间充质干细胞支架在含5～10％血清或血清替代物的间充质干细胞培养基中，或者在间充质干细胞无血清培养基中预培养3～15天。
在一种优选的实施方式中，在步骤(1)之前，将上述间充质干细胞支架或者根据上述方法制备的间充质干细胞支架在含约10％血清或血清替代物的间充质干细胞培养基中，或者在间充质干细胞无血清培养基中预培养3～15天。
在一种优选的实施方式中，在步骤(1)之前，将上述间充质干细胞支架或者根据上述方法制备的间充质干细胞支架在含约10％血清或血清替代物的间充质干细胞培养基中，或者在间充质干细胞无血清培养基中预培养约15天。
在本发明中，预培养约15天后的间充质干细胞支架诱导生成的血管平均长度比预培养10天后的间充质干细胞支架诱导生成的血管平均长度明显升高，这可能是由于预培养约15天时MSCs在支架中的生长状态更好，从而能够更有效地诱导血管生成与生长。
在一种优选的实施方式中，在步骤(1)中，将主动脉以血管培养基冲洗过后切成主动脉环或主动脉切段。
在一种优选的实施方式中，在步骤(1)中，该主动脉环或主动脉切段是在血管培养基中饥饿过夜的主动脉环或主动脉切段。
在本发明的实际应用过程中，主动脉环饥饿过夜不是必需的步骤。实施例中血管环在无血清培养基中饥饿过夜、MSCs支架使用无血清培养基清洗，是为了去除这些环节中的血清，然后与MSCs支架一起进行无血清培养，证明MSCs分泌的因子能够诱导血管环生成新的血管。
在一种优选的实施方式中，该血管培养基为H-DMEM培养基或血管内皮细胞生长培养基。
在一种优选的实施方式中，在步骤(1)中，所述5～10％的支架材料的滴加量为50～100μl。
根据本发明的另一个方面，提供了一种根据上述间充质干细胞支架或者根据上述方法制备的间充质干细胞支架或者根据上述方法制备的新生血管网络在制备用于预防和/或治疗缺血性和/或缺氧性疾病和/或损伤的产品中的用途。
根据本发明的另一个方面，提供了一种根据上述间充质干细胞支架或者根据上述方法制备的间充质干细胞支架或者根据上述方法制备的新生血管网络在制备用于预防和/或治疗纤维化和/或瘢痕形成的产品中的用途。
根据本发明的另一个方面，提供了一种根据上述间充质干细胞支架或者根据上述方法制备的间充质干细胞支架或者根据上述方法制备的新生血管网络在制备用于诱导血管生成的产品中的用途。
需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将结合实施例来详细说明本发明。
以下结合具体实施例对本发明作进一步详细描述，这些实施例不能理解为限制本申请所要求保护的范围。
实施例
1.大鼠骨髓间充质干细胞(rat bone marrow derived MSCs，rBMSCs)的分离培养
rBMSCs分离自SD大鼠股骨和胫骨骨髓，具有很强的贴壁性，采用贴壁培养法筛选分离。原代培养细胞在3天后可见细胞呈现短梭形，单个、散在贴壁生长；培养6～8天，细胞呈现间充质干细胞典型的长梭形，细胞密度较高。传代培养rBMSCs(P2～P4)细胞形态均一，呈典型的长梭形，漩涡状生长。
本发明的以下各实施例取P4-P6 rBMSCs用于实验。
2.MSCs在GelMA中的培养及生长情况观察
本实验采用甲基丙烯酸酐(methacrylic anhydride，MA)与明胶(Gelatin)制备的光敏性水凝胶——甲基丙烯酰化明胶(GelMA)，氨基取代度60％、90％。加入含0.25％LAP的L-DMEM，于50℃水浴中溶解制成5％的水凝胶用于实验。
P4-P6代rBMSCs，以5％的GelMA60或GelMA90重悬制成(1-10)×105/ml的细胞悬液，分别加入24孔板中，每孔0.3ml，405nm交联60s。加入含10％FBS的L-DMEM培养基，于37℃培养箱中孵育10min，洗2次，更换为新鲜培养基后培养，每隔3天换液。倒置显微镜下观察可见MSCs在GelMA中培养3天即开始铺展，培养10天、15天更多细胞形态铺展。
3.大鼠腹主动脉血管环的准备
SD大鼠(100-150g，雄性)乙醚麻醉后颈椎脱臼处死，70％乙醇消毒胸腹部，打开胸腔，拨开内脏，暴露出腹主动脉，钝性分离腹主动脉，转移至预冷的含100单位/ml青霉素、100μg/ml链霉素的H-DMEM中，用显微剪和眼科镊小心剥离血管外层的脂肪和纤维组织、剪断微小的血管分枝，将分离的主动脉转移至新鲜的预冷H-DMEM中，使用无菌注射器冲洗血管腔数次，切成1-2mm的小段，转移至新的含抗生素、2mM GlutaMAX的H-DMEM培养基中，37℃培养过夜。全程注意保持主动脉浸没于培养基中，保持湿润。
4.制备实施例一
3D打印载MSCs支架及其体外诱导血管生成作用
将MSCs以8％GelMA重悬，制成1×106/ml的细胞悬液，通过3D生物打印技术制成：底面10×10mm2，高0.927mm的MSCs均匀分布支架(如图2A-C所示)和上底3×3mm2、下底10×10mm2、高2mm、纵切面为梯形的MSCs梯度支架(如图2D-F所示)，丝径200μm、丝间距0.5mm。打印好的支架转入12孔培养板中，用含10％FBS的L-DMEM培养基预培养4天，更换为无血清H-DMEM培养基，于37℃培养箱中洗2次，每次孵育10min。吸净无血清H-DMEM培养基，加GelMA水凝胶于支架四周，405nm光交联20s，使支架固定于培养孔中央。剔除外周结缔组织的大鼠腹主动脉切成1-2mm的小段，在无血清H-DMEM培养基中饥饿过夜，转入各培养孔中，将大鼠腹主动脉环置于支架一侧，切口一端正对支架，加入5％GelMA包埋血管环，405nm光交联20s；以新鲜H-DMEM培养基于37℃培养箱中洗2次，每次10min。最后加入含2.5％FBS、2mMGlutaMAX的H-DMEM培养基，与主动脉环共培养。显微镜下观察血管环上新生血管的生长情况并拍照，分析血管分枝复杂度，ImageJ软件测量新生血管的长度，计算日平均生长速度。
结果如图3、表1和表2所示，培养3天、7天、12天时，与MSCs梯度支架共培养的血管环新生血管的长度均显著大于与MSCs均匀分布支架共培养的血管环(p<0.001)，前7天的日平均生长率分别高约57.1％(3天)、131.3％(7天)，表明MSCs梯度支架能够更好地诱导血管生成与生长。
表1 3D打印MSCs均匀分布支架不同时间诱导新生血管的平均长度(μm)及日平均生长率(μm/天)
Figure BDA0003568092670000161
表2 3D打印MSCs梯度分布支架不同时间诱导新生血管的平均长度(μm)及日平均生长率(μm/天)
Figure BDA0003568092670000171
与MSCs梯度支架共培养18天的血管环，4％多聚甲醛室温固定30min，PBS洗3次，每次15min；0.25％Triton X-100室温孵育2次，每次15min，5％BSA室温封闭1h，PBS洗3次，每次10min。加入10μg/ml BS1 lectin-FITC 4℃孵育1-3天，1μg/ml DAPI室温孵育1h，PBS洗3次，每次10min。荧光显微镜下可见由绿色荧光标记的血管内皮细胞和蓝色荧光标记的细胞核形成新生血管，从血管环四周伸出(如图4所示)。
5.制备实施例二
MSCs-GelMA支架体外诱导大鼠主动脉环血管生成的作用研究一
将MSCs以5％GelMA重悬，制成2×105/ml、1×105/ml、5×104/ml三种浓度的细胞悬液，分别吸取100μl，在24孔板的每个培养孔中由外周向中央依次加入上述高、中、低三种浓度的细胞悬液，使MSCs的数量在外周最多，向孔中央逐渐减少，呈梯度分布。另将三种浓度的细胞悬液分别取100μl，吹吸混匀后一次性加入培养孔中，使MSCs的数量在培养孔中趋于均匀分布。405nm交联3次，每次20s，制成MSCs呈梯度分布、均匀分布两种状态的贴片。
本实施例中GelMA采用了两种不同取代度，即GelMA60、GelMA90，制成的MSCs-GelMA60贴片、MSCs-GelMA 90贴片分别在添加了10％FBS、2mM GlutaMAX的L-DMEM培养基中预培养10天，更换为无血清培养基于37℃培养箱中洗2次，每次10min，然后与血管环在无血清H-DMEM培养基中共培养。
将在无血清H-DMEM培养基中饥饿过夜的大鼠主动脉环转入各培养孔中，置于MSCs贴片的中央，滴加5％GelMA包埋血管环，405nm交联20s。H-DMEM洗10min，再加入含2mMGlutaMAX的H-DMEM培养基培养，每隔3天换液，第4天显微镜下可观察到动脉环的外周生成新的血管分枝，拍照，ImageJ软件测量新生血管的长度，计算日平均生长速度。
结果如图5、表3、表4和表5所示，在无血清培养条件下，与GelMA60-MSCs均匀分布支架相比，与GelMA60-MSCs梯度支架共培养的血管环新生血管的长度和日平均生长率均较高，共培养12天，其中新生血管的长度显著高于MSCs均匀分布组(p<0.01)，日平均生长率是MSCs均匀分布组的2倍；共培养30天，其新生血管的长度也显著高于MSCs均匀分布组(p<0.05)，日平均生长率比MSCs均匀分布组高约28％，表明MSCs梯度支架比MSCs均匀分布支架能够更有效地诱导血管生成与生长。
与GelMA90-MSCs梯度支架相比，GelMA60-MSCs梯度支架诱导的新生血管平均长度长约86.0％(4天，p<0.001)、76.2％(12天，p<0.05)、54.0％(30天，p<0.05)，日平均生长率高约86.2％(4天)、70.2％(12天)、28.3％(30天)，表明GelMA60-MSCs支架比GelMA90-MSCs支架能更有效地诱导血管生成与生长。
表3与GelMA60-MSCs均匀分布支架共培养不同时间新生血管的平均长度(μm)及日平均生长率(μm/天)
Figure BDA0003568092670000181
表4与GelMA60-MSCs梯度支架共培养不同时间新生血管的平均长度(μm)及日平均生长率(μm/天)
Figure BDA0003568092670000182
表5与GelMA90-MSCs梯度支架共培养不同时间新生血管的平均长度(μm)及日平均生长率(μm/天)
Figure BDA0003568092670000191
6.制备实施例三
MSCs-GelMA支架体外诱导大鼠主动脉环血管生成的作用研究二
MSCs-GelMA60支架预培养10天或15天与血管环在无血清培养基中共培养4天、12天、30天新生血管的形成及生长情况：将MSCs以5％GelMA60重悬，制成2×105/ml、1×105/ml、5×104/ml三种浓度的细胞悬液，分别吸取100μl，在24孔板的每个培养孔中由外周向中央依次加入上述高、中、低三种浓度的细胞悬液，每加完一次即405nm交联20s，共交联3次，使MSCs的数量在外周最多，向孔中央逐渐减少，呈梯度分布。加入1ml含10％FBS、2mMGlutaMAX的L-DMEM培养基培养，每3-4天换液，预培养10天或15天。更换为无血清培养基于37℃培养箱中洗2次，每次10min，然后与血管环在无血清H-DMEM培养基中共培养。
将在无血清H-DMEM培养基中饥饿过夜的大鼠主动脉环转入各培养孔中，置于已体外预培养10天或15天的MSCs支架中央，滴加5％GelMA包埋切段，405nm交联20s。H-DMEM洗10min，再加入含2mM GlutaMAX的H-DMEM培养基培养，4天、12天、30天后显微镜下观察动脉环上新生血管的生长情况并拍照，ImageJ软件测量新生血管的长度，计算日平均生长率。
结果如图6、表6和表7所示，将GelMA60-MSCs支架分别预培养10天或15天后再与血管环在无血清条件下共培养，诱导生成新生血管的长度、生长速率均有显著差异，其中预培养15天的MSCs梯度支架诱导生成的血管平均长度比预培养10天的分别高约115.4％(4天，p<0.001)、41.3％(12天，p<0.05)、57.1％(30天，p<0.05)，这可能是由于预培养15天时MSCs在支架中的生长状态更好，从而能够更有效地诱导血管生成与生长。
表6预培养10天的MSCs支架诱导新生血管的平均长度(μm)及日平均生长率(μm/天)
Figure BDA0003568092670000201
表7预培养15天的MSCs支架诱导新生血管的平均长度(μm)及日平均生长率(μm/天)
Figure BDA0003568092670000202
以上对本发明实施例进行了详细介绍，本文中应用了具体个例对本发明的原理及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明仅用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。同时，本领域技术人员依据本发明的思想，基于本发明的具体实施方式及应用范围上做出的改变或变形之处，都属于本发明保护的范围。
在不偏离本发明实质特征的条件下，本发明可以其它具体形式来体现。所述的实施方案在所有方面中均应认为是举例性的而不是限制性的。因而本发明的范围由所附权利要求书来指明，而不是由前述说明来指明。综上所述，本说明书内容不应理解为对本发明的限制。

Claims (10)

1.一种诱导血管生成的间充质干细胞支架，其特征在于，所述间充质干细胞支架包括间充质干细胞和支架材料，其中所述间充质干细胞在所述间充质干细胞支架中的数量是均匀分布的或者所述间充质干细胞在所述间充质干细胞支架中的数量是由所述支架的外周向所述支架的中央逐渐增高分布的，或者由所述支架的一端向所述支架的另一端逐渐增高分布的。
2.根据权利要求1所述的间充质干细胞支架，其特征在于，所述间充质干细胞选自以下的一种或多种：骨髓间充质干细胞、外周血充质干细胞、脂肪间充质干细胞、脐带间充质干细胞、脐带血间充质干细胞、羊水间充质干细胞、牙齿间充质干细胞、睾丸间充质干细胞、皮肤间充质干细胞和胎盘间充质干细胞；
优选地，所述间充质干细胞为自体来源的间充质干细胞和/或异体来源的间充质干细胞；
优选地，所述自体来源为自体外周血和/或脂肪来源；
优选地，所述异体来源为异体脐带华通氏胶、脐带血、羊水和/或胎盘来源；
更优选地，所述间充质干细胞分泌选自以下的一种或多种物质：可溶性细胞因子、微小核糖核酸和外泌体；
又优选地，所述可溶性细胞因子选自以下的一种或多种：血管内皮细胞生长因子、血小板衍生生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、肝细胞生长因子、基质细胞源性因子和胰岛素样生长因子。
3.根据权利要求1所述的间充质干细胞支架，其特征在于，所述支架材料是可降解生物材料；
优选地，所述支架材料是部分降解的、改性的化合物例如温敏性化合物和/或光敏性化合物；
优选地，所述支架材料选自以下的一种或多种：可降解的蛋白质或多肽类材料、可降解的多糖类材料、聚酯类水凝胶、聚丙烯酰胺水凝胶例如聚(N-异丙基丙烯酰胺)水凝胶、聚丙烯酸水凝胶和聚乙烯醇水凝胶；
又优选地，所述可降解的蛋白质或多肽类材料选自以下的一种或多种：胶原、纤粘连蛋白、层粘连蛋白、弹性蛋白、丝素蛋白、改性的明胶水凝胶例如甲基丙烯酰化明胶、改性的丝素蛋白水凝胶例如甲基丙烯酰化丝素蛋白和改性的弹性蛋白水凝胶例如甲基丙烯酰化弹性蛋白；
又优选地，所述可降解的多糖类材料选自以下的一种或多种：纤维素、甲壳素、透明质酸、硫酸软骨素、藻酸盐、改性的光敏性甲壳素例如甲基丙烯酰化羧甲基壳聚糖、改性的褐藻酸盐水凝胶例如甲基丙烯酰化藻酸盐、改性的透明质酸水凝胶例如甲基丙烯酰化透明质酸、改性的硫酸软骨素水凝胶例如甲基丙烯酰化硫酸软骨素和细菌纤维素水凝胶；
更优选地，所述甲基丙烯酰化明胶的氨基取代度为30％～90％例如约30％、约60％或约90％；
尤其优选地，所述甲基丙烯酰化明胶的浓度为5％～20％；
特别优选地，所述甲基丙烯酰化明胶的浓度为5％～10％例如约5％、约8％或约10％。
4.一种制备权利要求1至3中任一项所述的间充质干细胞支架的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
(1)将间充质干细胞重悬于水凝胶中，形成细胞悬液；以及
(2)将所述细胞悬液通过3D打印形成所述间充质干细胞支架，或者将所述细胞悬液通过铺展于培养皿/模具中并进行交联形成所述间充质干细胞支架，
其中所述间充质干细胞在所述间充质干细胞支架中的数量是均匀分布的或者所述间充质干细胞在所述间充质干细胞支架中的数量是由所述支架的外周向所述支架的中央逐渐增高分布的，或者由所述支架的一端向所述支架的另一端逐渐增高分布的。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，在步骤(1)中，所述细胞悬液的细胞密度为(0.01～10)×105个/ml。
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述间充质干细胞支架的形状为适用于损伤区域的形状；
优选地，所述形状为方形、圆形或椭圆形；
优选地，在步骤(2)中，通过3D打印形成的间充质干细胞支架为底面约5～20mm×约5～20mm，高约1～3mm的间充质干细胞支架或者上底约3～15mm×约3～15mm、下底约10～20mm×约10～20mm、高约1～3mm且纵切面为梯形的间充质干细胞支架；
更优选地，在步骤(2)中，通过3D打印形成的间充质干细胞支架为底面约10mm×约10mm，高约1mm的间充质干细胞支架或者上底约3mm×约3mm、下底约10mm×约10mm、高约2mm且纵切面为梯形的间充质干细胞支架；
又优选地，在步骤(2)中，通过3D打印形成的间充质干细胞支架为一层或多层由丝线构成的丝状物；
又优选地，所述丝线的形状为直线或曲线；
又优选地，所述丝线的丝径为约200μm和/或丝间距为约0.5-1.0mm；
又优选地，所述丝线是平行不交叉的；
又优选地，所述丝线物为由三角形、四边形、五边形、六边形、圆形或椭圆形构成的丝线网状物；
特别优选地，在步骤(2)中，所述交联的条件为在405nm光源下光交联10～30秒，交联1～3次；
尤其优选地，在步骤(2)中，所述交联的条件为在405nm光源下光交联约20秒，交联3次。
7.一种制备新生血管网络的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
(1)将主动脉环或主动脉切段，转入培养孔中的权利要求1至3中任一项所述的间充质干细胞支架或者根据权利要求4至6中任一项所述的方法制备的间充质干细胞支架的中央；
(2)在所述主动脉环或所述主动脉切段上滴加5～10％的支架材料从而包埋所述主动脉环或所述主动脉切段，在405nm光源下光交联10～30秒；
(3)以血管培养基于37℃培养箱中洗涤所述培养孔1～3次，每次5～15min；以及
(4)将所述血管培养基与所述主动脉环或所述主动脉切段共培养3天至30天，得到所述新生血管网络；
优选地，在步骤(1)之前，将权利要求1至3中任一项所述的间充质干细胞支架或者根据权利要求4至6中任一项所述的方法制备的间充质干细胞支架在含5～10％血清或血清替代物的间充质干细胞培养基中，或者在间充质干细胞无血清培养基中预培养3～15天；
更优选地，在步骤(1)之前，将权利要求1至3中任一项所述的间充质干细胞支架或者根据权利要求4至6中任一项所述的方法制备的间充质干细胞支架在含约10％血清或血清替代物的间充质干细胞培养基中，或者在间充质干细胞无血清培养基中预培养3～15天；
更优选地，在步骤(1)之前，将权利要求1至3中任一项所述的间充质干细胞支架或者根据权利要求4至6中任一项所述的方法制备的间充质干细胞支架在含约10％血清或血清替代物的间充质干细胞培养基中，或者在间充质干细胞无血清培养基中预培养约15天；
又优选地，在步骤(1)中，将主动脉以血管培养基冲洗过后切成主动脉环或主动脉切段；
又优选地，在步骤(1)中，所述主动脉环或主动脉切段是在血管培养基中饥饿过夜的主动脉环或主动脉切段；
特别优选地，所述血管培养基为H-DMEM培养基或血管内皮细胞生长培养基。
8.根据权利要求1至3中任一项所述的间充质干细胞支架或者根据权利要求4至6中任一项所述的方法制备的间充质干细胞支架或者根据权利要求7所述的方法制备的新生血管网络在制备用于预防和/或治疗缺血性和/或缺氧性疾病和/或损伤的产品中的用途。
9.根据权利要求1至3中任一项所述的间充质干细胞支架或者根据权利要求4至6中任一项所述的方法制备的间充质干细胞支架或者根据权利要求7所述的方法制备的新生血管网络在制备用于预防和/或治疗纤维化和/或瘢痕形成的产品中的用途。
10.根据权利要求1至3中任一项所述的间充质干细胞支架或者根据权利要求4至6中任一项所述的方法制备的间充质干细胞支架或者根据权利要求7所述的方法制备的新生血管网络在制备用于诱导血管生成的产品中的用途。
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