CN111135346A - 一种人源性细胞生物复合血管 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种细胞生物复合血管，它具有人类来源的细胞，复合并在血管样管形支架上生长复制，人类来源的细胞分泌细胞外基质与原管状结构相交联。这是一种活的管状血管组织。该血管可提供和自体血管匹配良好的顺应性，满足血管移植物所需要的力学性能，而且有助于宿主血管组织细胞长入其中，减少吻合口区域形成的瘢痕。所述人源性细胞可来源于各种人类组织来源的异体间质细胞或间充质干细胞，脐带血间充质干细胞。也可以包括异体内皮细胞、平滑肌细胞。

Description

一种人源性细胞生物复合血管
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种人源性细胞生物复合血管。
背景技术
干(gàn)细胞(stem cell)是一类具有自我复制能力(self-renewing)的多潜能细胞。在一定条件下，它可以分化成多种功能细胞。根据干细胞所处的发育阶段分为胚胎干细胞(embryonic stem cell，ES细胞)和成体干细胞(somatic stem cell)。根据干细胞的发育潜能分为三类：全能干细胞(totipotent stem cell，TSC)、多能干细胞(pluripotentstem cell)和单能干细胞(unipotent stem cell)(专能干细胞)。干细胞(Stem Cell)是一种未充分分化，尚不成熟的细胞，具有再生各种组织器官和人体的潜在功能，医学界称为″万用细胞″。2013年12月1日，美国哥伦比亚大学医学研究中心的科学家首次成功地将人体干细胞转化成了功能性的肺细胞和呼吸道细胞。2014年4月，爱尔兰首个可用于人体的干细胞制造中心获得爱尔兰药品管理局的许可，在爱尔兰国立戈尔韦大学成立。
目前临床上广泛使用的人工血管主要缺点有聚四氟乙烯血管和自体血管不匹配、人工血管的顺应性较差、完全不具备人体动脉的柔韧性与弹性，这个缺陷在与小口径动脉吻合时就表现的非常明显，这也是血栓易在吻合口部位形成的主要原因，导致血栓形成及内膜增生，远期通畅率极低。人工血管与血液相互作用的结果取决于其表面的性质如形态结构、电荷、与水的亲合力以及表面化学性质，这会引发不同的凝血途径。移植后人工血管表面会吸附纤维蛋白原，激活血小板，使其聚集产生血栓。
人脐带血干细胞分为两种，一种为异体干细胞库，储存正常新生儿的脐带血干细胞库。通过各种检测和组织配型后，用于适合干细胞移植的无关病人。产妇填写自愿捐献荣誉证书，凭此证书，当捐献本人及子女在若干年后需进行干细胞移植时，可有一次优先配型权，并可享受供体价格上10-20％的优惠。另一种为自体干细胞库，用来保存婴儿本人的脐带血干细胞，为将来婴儿本人或亲属需要时做储备。产妇签署“脐带血自体储存协议书”并交付一定的费用，采集成功后，新生儿脐血干细胞被存入自体储存库。
干细胞移植治疗法在本地还算是医学治疗新概念，许多人对它的整个形式或好处都很模糊。其实从储存到移植，整个程序一点也不复杂，而且很专业。刘翰仪曾报道“当婴儿诞生后，有关方面的专业人士将从脐带静脉内抽取80到180毫升的血液，然后在净空试验室内进行去掉干细胞样本内的红血球，再检查干细胞的存活率，但是一般上都超过90％都可以收存。之后，就将干细胞样本隔离，待确定干细胞的纯度、没被病菌/病毒侵害后，将送往摄氏零下196℃的净空室冷藏起来；直到有病人需要，再次肯定干细胞的存活率以及可用性，方才送往指定医院的专科医生，做移植手术。”
自1988年在法国利用脐带血移植方法治疗恶性贫血之血液病，Fanconi′s anemia之后，脐带血的功能就开始被医学界慢慢发掘。脐带血除了用于治贫血之外，还可以在癌症、先天代谢失常、免疫功能不全疾病上发挥。
发明内容
本发明的目的在于提供一种人源性细胞生物复合血管。
本发明的技术方案如下：一种人源性细胞生物复合血管，包括一具有抗凝、抗血小板和促进内膜化的功能的致密高分子纳米纤维层和一多孔支架层，多孔支架层包绕在致密高分子纳米纤维层之外，多孔支架层内生长有人源性细胞及其生长增殖产生的细胞外基质；
多孔支架层的孔隙的大小允许人源性细胞长入，且孔隙间相通以允许上述细胞外基质相互连接；
上述致密高分子纳米纤维层由静电纺丝或3D打印制备而成，
上述多孔支架层由发泡快速冷冻成型或3D打印制备而成。
在本发明的一个优选实施方案中，所述致密高分子纳米纤维层的厚度为5-2000μm，其孔隙的直径为1-20μm，纤维直径为10-1000nm。
在本发明的一个优选实施方案中，所述多孔支架层的厚度为10-2000μm。
在本发明的一个优选实施方案中，所述致密高分子纳米纤维层的厚度为10-2000μm，其孔隙的直径为1-100μm，纤维直径为10-1000nm；所述多孔支架层的厚度为10-2000μm。
在本发明的一个优选实施方案中，所述致密高分子纳米纤维层的材质包括聚氨酯、聚四氟乙烯、膨化聚四氟乙烯、丝素蛋白、聚己内酯、聚乳酸、聚对苯二甲酸乙二醇酯、聚羟基乙酸、聚乳酸-聚羟基乙酸、羧甲基纤维素、明胶、胶原、透明质酸、聚乙烯醇、聚丙烯酰胺、聚丙烯、聚丙烯酸、聚乙烯吡咯烷酮和海洋动植物来源的高分子聚合物中的至少一种，该海洋动植物来源的高分子聚合物包括壳聚糖、羧甲基壳聚糖和海藻酸/海藻酸盐，上述胶原包括胶原I、胶原II、胶原III和胶原IV。
在本发明的一个优选实施方案中，所述多孔支架层的材质包括聚氨酯、聚四氟乙烯、膨化聚四氟乙烯、丝素蛋白、聚己内酯、聚乳酸、聚对苯二甲酸乙二醇酯、聚羟基乙酸、聚乳酸-聚羟基乙酸、羧甲基淀粉、醋酸淀粉、羧甲基纤维素、明胶、胶原、透明质酸、聚乙烯醇、聚丙烯酰胺、聚丙烯酸、聚乙烯吡咯烷酮和海洋动植物来源的高分子聚合物中的至少一种，该海洋动植物来源的高分子聚合物包括壳聚糖、羧甲基壳聚糖和海藻酸/海藻酸盐，上述胶原包括胶原I、胶原II、胶原III和胶原IV。
在本发明的一个优选实施方案中，所述人源性细胞包括人类组织来源的异体间质细胞或间充质干细胞、脐带血间充质干细胞、异体内皮细胞和平滑肌细胞。
本发明的有益效果是：本发明具有人源性细胞成分，是一种活的管状血管组织，可避免或最大程度上减少免疫反应，提高组织相容性，同时可提供和自体血管匹配良好的顺应性，满足血管移植物所需要的力学性能，且人体正常的组织细胞可长入其中，而不在吻合口区域形成瘢痕。
附图说明
图1为本发明实施例1制得的人源性细胞生物复合血管的致密高分子纳米纤维层的外观照片。
图2为本发明实施例1制得的致密高分子纳米纤维层的扫描电镜照片。
图3为本发明实施例1制得的人源性细胞生物复合血管(不含细胞)的外观照片。
图4为本发明实施例1制得的多孔支架层的扫描电镜照片。
图5位本发明实施例1制得的人源性细胞生物复合血管(不含细胞)的拉伸力检测数据图。
图6为本发明实施例2制得的人源性细胞生物复合血管的致密高分子纳米纤维层的扫描电镜照片。
图7为本发明实施例2中制得的人源性细胞生物复合血管的多孔支架层的扫描电镜照片。
图8为本发明实施例2中制得的人源性细胞生物复合血管(不含细胞)的外观照片。
图9为本发明实施例3中制得的人源性细胞生物复合血管的致密高分子纳米纤维层的扫描电镜照片。
图10为本发明实施例3中制得的人源性细胞生物复合血管的多孔支架层的扫描电镜照片。
具体实施方式
以下通过具体实施方式结合附图对本发明的技术方案进行进一步的说明和描述。
实施例1
(1)将PCL和明胶7∶3的重量比溶解于六氟异丙醇中，获得6％的溶液，获得静电纺丝原液，其具体参数如下表所示：
静电纺丝溶液配制参数
Figure BDA0002328380820000041
(2)将上述静电纺丝原液进行静电纺丝，获得如图1所示的管状的致密高分子纳米纤维层(厚度为100-300μm，纤维直径200nm-500nm，内径为4-6mm，长度为10-30cm，平均空隙5-10μm)，其外观结构如图1所示，其内部结构如图2所示，其具体吸水性能下表所示：
吸水性测试
长度(mm) 重量(g) 吸水量(g) 吸水率(％)
75.90±0.0715 0.1299±0.1301 0.31158±0.0265 265.02±0.0401
静电纺丝的具体参数如下表所示：
静电纺丝参数控制
Figure BDA0002328380820000042
(3)发泡液的制备：7.7g聚己内酯溶解于90mL二氯甲烷中，搅拌溶解，加入6g的200-300微米大小的NaCl颗粒，搅拌分散均匀，加入5g span-80，再加入40mL去离子水，搅拌乳化1h，使溶液形成稳定的乳化液，利用直径4-6mm的聚四氟乙烯管作为模具。
发泡液的成分也可以是聚氨酯、聚四氟乙烯、膨化聚四氟乙烯、丝素蛋白(silk fibroin)、聚己内酯(PCL)、聚乳酸(PLA)、聚对苯二甲酸乙二醇酯、聚羟基乙酸(PGA)、聚乳酸-聚羟基乙酸(PLGA)、壳聚糖(Chitosan)、羧甲基壳聚糖、海藻酸/海藻酸盐、羧甲基纤维素、明胶、胶原(I、II、III、IV)、透明质酸(HA)、聚乙烯醇(PVA)、聚丙烯酰胺(PAM)、聚丙烯酸、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)和海洋动植物来源的高分子聚合物中的至少一种，该海洋动植物来源的高分子聚合物包括壳聚糖、羧甲基壳聚糖和海藻酸/海藻酸盐，于液氮进行冷冻定型，再于-4℃进行冷冻真空干燥24h，获得厚度为1mm-5mm的多孔支架层(照片如图3所示)；
(4)将步骤(2)获得的管状的致密高分子纳米纤维层套于步骤(3)所得的多孔支架层的内部，如图4所示；
对步骤(4)所得的物料进行拉伸力检测，得到如图5结果。
(5)将基质胶(BD MatrigelTM基底膜基质，GFR，无酚红，货号：356231)化为溶液，通过移液枪将1-2mL该溶液加入到步骤(4)所得的多孔支架层中，并包被其中，接着置于细胞培养箱进行平衡；将从液氮中取出的人源性脐带血干细胞的冻存管快速浸入37℃温水中，快速摇动，使其在1～2min内快速解冻；离心将其逐滴加入含有人脐带血干细胞完全培养基的15mL离心管中，1000rpm离心3min；离心后弃上清加200μL人脐带血干细胞完全培养基对干细胞沉淀进行吹吸混匀；吹吸均匀后，将已经平衡好的多孔支架层内的基质胶弃掉，将吹吸均匀的干细胞悬液加入其中，使细胞均匀分布；然后置于37℃，5％CO2的恒温培养箱培养4h，加人脐带血干细胞完全培养基1mL；从复苏的时间开始每1-2天换液一次；培养1-3天后即得所述-人源性细胞生物复合血管，以备移植。
上述人脐带血干细胞完全培养基的配制方法包括：将
Figure BDA0002328380820000052
脐带血干细胞无酚红培养基500mL(BM0008)、
Figure BDA0002328380820000053
胎牛血清25mL(BM0001)和
Figure BDA0002328380820000054
脐带血干细胞培养添加物1mL，(BM0003)在37℃解冻并迅速混合，为防污染，再加1％双抗。
实施例2
(1)将PVA(MW：89000-980000)溶解于水，形成10％的纺丝溶液，获得高压静电纺丝原液。
(2)将上述(1)静电纺丝原液进行静电纺丝(表1)，获得管状的致密高分子纳米纤维层(厚度为20-300μm，纤维直径200nm-500nm，内径为4-6mm，长度为10-30cm，平均空隙5-10μm)。扫描电镜结果如图6所示。
静电纺丝参数控制
Figure BDA0002328380820000051
Figure BDA0002328380820000061
(3)7.7g聚己内酯溶解于90mL二氯甲烷中，搅拌溶解，加入5g span-80，再加入40mL去离子水，搅拌乳化1h，使溶液形成稳定的乳化液，将发泡液均匀涂抹于(2)所得的管状的致密高分子纳米纤维层外，可根据需要调节多孔支架层的厚度(本实施例中为1mm-5mm)，-80℃冷冻定型，室温真空干燥即得，该多孔支架层的微观结构如图7所示。
本实施例制备的以PVA膜为内层、PCL多孔支架为外层的双层血管外观如图8所示。(4)用层黏连蛋白溶液(20ug/mL)包被在上述多孔支架层内，置于细胞培养箱进行平衡4h；将人脐带血间充质干细胞快速解冻；离心后得到细胞团，加200-500μL人间充质干细胞完全培养基对干细胞沉淀进行吹吸混匀；吹吸均匀后，将已经平衡好的多孔支架层内的溶液吸液泵吸取弃掉，将吹吸均匀的干细胞悬液加入其中，使细胞均匀分布；然后置于37℃，5％CO2的恒温培养箱培养4h，加培养基5mL；从复苏的时间开始每1-2天换液一次；培养1-3天后即得所述人源性细胞生物复合血管，以备移植。
(5)上述人间充质干细胞培养基是专门为人类间充质干细胞体外培养所设计的、最适合其生长的培养基。是经灭菌的液体培养基，包含必需和非必需氨基酸、维生素、有机和无机化合物、激素、生长因子、微量矿物质和低浓度胎牛血清(5％)。该培养基缓冲体系为重碳酸盐，在含5％CO2的细胞培养箱中平衡后pH值为7.4。该培养基的配方能够选择性的促进正常人类微血管内皮细胞体外培养中的增殖和生长，可以达到最理想营养平衡状态。
具体的，该人间充质干细胞培养基包含500mL基础培养基，25mL胎牛血清(FBS，Cat.No.0025)，5mL间充质干细胞生长添加物(MSCGS，Cat.No.7552)和5mL青霉素/链霉素溶液(P/S，Cat.No.0503).
实施例3
(1)将PLA 1g溶解于10六氟异丙醇中，形成10％的溶液，即获得静电纺丝原液。
(2)将上述静电纺丝原液进行静电纺丝，获得管状的致密高分子纳米纤维层(厚度为100-500μm，纤维直径200nm-500nm，内径为4-6mm、长度为10-30cm、平均空隙5-10μm)；扫描电镜结果如图9所示。
静电纺丝参数控制
Figure BDA0002328380820000062
Figure BDA0002328380820000071
(3)称取10g的PVA(MW：90000-130000)，溶解于100mL 80-90℃的去离子水中，完全溶解后，恢复至室温，将其均匀涂抹于(2)所得的管状的致密高分子纳米纤维层外，-80℃或液氮下快速冷冻定型，室温真空干燥即得厚度为1mm-5mm的多孔支架层。该多孔支架层的微观结构如图10所示。
(4)用层黏连蛋白、纤维黏连蛋白的混合溶液(1∶1混合，20ug/mL)包被在上述多孔支架层，置于细胞培养箱进行平衡4h；将人平滑肌细胞快速解冻；离心后得到细胞团，加200-500μL人平滑肌细胞完全培养基对干细胞沉淀进行吹吸混匀；吹吸均匀后，将已经平衡好的多孔支架层内的溶液吸液泵吸取弃掉，将吹吸均匀的干细胞悬液加入其中，使细胞均匀分布；然后置于37℃，5％CO2的恒温培养箱培养4h，加培养基5mL；从复苏的时间开始每1-2天换液一次；培养14-21天后即得所述人源性细胞生物复合血管，以备移植。
(5)平滑肌细胞培养基包含500mL基础培养基，10mL胎牛血清(FBS，Cat.No.0010)、5mL平滑肌细胞生长因子(SMCGS，Cat.No.1152)、5mL青霉素/链霉素溶液(P/S，Cat.No.0503)
实施例4
(1)将PCL-gelation(7∶3)1g溶解于10ml六氟异丙醇中，形成10％的溶液，即获得静电纺丝原液。
(2)将上述静电纺丝原液进行静电纺丝，获得管状的致密高分子纳米纤维层(厚度为100-500μm，纤维直径200nm-500nm，内径为4-6mm、长度为10-30cm、平均空隙5-10μm)。
静电纺丝参数控制
Figure BDA0002328380820000072
(3)称取10g的PVA(MW：90000-118000)，溶解于100mL 80-90℃的去离子水中，完全溶解后，恢复至室温，将其均匀涂抹于(2)所得的管状的致密高分子纳米纤维层外，-80℃或液氮下快速冷冻定型12h，室温放置5h，如此反复，之后冷冻真空即得厚度为1mm-5mm的多孔支架层。
(4)用多聚赖氨酸溶液(10ug/mL)包被在上述多孔支架层，置于细胞培养箱进行平衡4h；将人内皮细胞快速解冻；离心后得到细胞团，加200-500拉L人内皮细胞完全培养基对内皮细胞沉淀进行吹吸混匀；吹吸均匀后，将已经平衡好的多孔支架层内的溶液吸液泵吸取弃掉，将吹吸均匀的人内皮细胞悬液加入其中，使细胞均匀分布；然后置于37℃，5％CO2的恒温培养箱培养4-6h，加培养基5mL，摸过血管靠近培养皿的一侧即可；从复苏的时间开始每2-3天换液一次；培养21天后即得所述人源性细胞生物复合血管，以备移植。
(5)内皮细胞培养基是专门为正常人类微血管内皮细胞体外培养设计的最适于其生长的完全培养基。是经灭菌的液体培养基，包含必需和非必需氨基酸、维生素、有机和无机化合物、激素、生长因子、微量矿物质和低浓度胎牛血清(5％)。该培养基缓冲体系为重碳酸盐，在含5％CO2的细胞培养箱中平衡后pH值为7.4。该培养基的配方能够选择性的促进正常人类微血管内皮细胞体外培养中的增殖和生长，并为其达到最理想营养平衡状态。
具体内皮细胞培养基包含500mL基础培养基，25mL胎牛血清(FBS，Cat.No.0025)、5mL内皮细胞生长因子(ECGS，Cat.No.1052)、5mL青霉素/链霉素溶液(P/S，Cat.No.0503)。
以上所述，仅为本发明的较佳实施例而已，故不能依此限定本发明实施的范围，即依本发明专利范围及说明书内容所作的等效变化与修饰，皆应仍属本发明涵盖的范围内。

Claims (7)

1.一种人源性细胞生物复合血管，其特征在于：包括一具有抗凝、抗血小板和促进内膜化的功能的致密高分子纳米纤维层和一多孔支架层，多孔支架层包绕在致密高分子纳米纤维层之外，多孔支架层内生长有人源性细胞及其生长增殖产生的细胞外基质；
多孔支架层的孔隙的大小允许人源性细胞长入，且孔隙间相通以允许上述细胞外基质相互连接；
上述致密高分子纳米纤维层由静电纺丝或3D打印制备而成，
上述多孔支架层由发泡快速冷冻成型或3D打印制备而成。
2.如权利要求1所述的人源性细胞生物复合血管，其特征在于：所述致密高分子纳米纤维层的厚度为5-2000μm，其孔隙的直径为1-20μm，纤维直径为10-1000nm。
3.如权利要求1所述的干细胞生物复合血管，其特征在于：所述多孔支架层的厚度为10-2000μm。
4.如权利要求1所述的人源性细胞生物复合血管，其特征在于：所述致密高分子纳米纤维层的厚度为10-2000μm，其孔隙的直径为1-100μm，纤维直径为10-1000nm；所述多孔支架层的厚度为10-2000μm。
5.如权利要求1所述的人源性细胞生物复合血管，其特征在于：所述致密高分子纳米纤维层的材质包括聚氨酯、聚四氟乙烯、膨化聚四氟乙烯、丝素蛋白、聚己内酯、聚乳酸、聚对苯二甲酸乙二醇酯、聚羟基乙酸、聚乳酸-聚羟基乙酸、羧甲基纤维素、明胶、胶原、透明质酸、聚乙烯醇、聚丙烯酰胺、聚丙烯、聚丙烯酸、聚乙烯吡咯烷酮和海洋动植物来源的高分子聚合物中的至少一种，该海洋动植物来源的高分子聚合物包括壳聚糖、羧甲基壳聚糖和海藻酸/海藻酸盐，上述胶原包括胶原I、胶原II、胶原III和胶原IV。
6.如权利要求1所述的人源性细胞生物复合血管，其特征在于：所述多孔支架层的材质包括聚氨酯、聚四氟乙烯、膨化聚四氟乙烯、丝素蛋白、聚己内酯、聚乳酸、聚对苯二甲酸乙二醇酯、聚羟基乙酸、聚乳酸-聚羟基乙酸、羧甲基淀粉、醋酸淀粉、羧甲基纤维素、明胶、胶原、透明质酸、聚乙烯醇、聚丙烯酰胺、聚丙烯酸、聚乙烯吡咯烷酮和海洋动植物来源的高分子聚合物中的至少一种，该海洋动植物来源的高分子聚合物包括壳聚糖、羧甲基壳聚糖和海藻酸/海藻酸盐，上述胶原包括胶原I、胶原II、胶原III和胶原IV。
7.如权利要求1所述的人源性细胞生物复合血管，其特征在于：所述人源性细胞包括人类组织来源的异体间质细胞或间充质干细胞、脐带血间充质干细胞、异体内皮细胞和平滑肌细胞。
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