CN102784418A - 可程序性释放的生物药物纳米微孔血管支架及制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种可程序性释放的生物药物纳米微孔血管支架及制备方法，制备方法是：（1）在裸支架上形成纳米微孔；（2）①将促进内皮愈合的基因溶于PBS缓冲液中为溶液1，将高分子聚合物溶解于有机溶剂中为溶液2，溶液1溶液2混合制成均匀的悬液，注入聚乙烯醇水溶液中，搅拌成基因纳米粒子，挥发，洗涤，干燥；②将抗增殖药物与高分子聚合物共同溶解于有机溶剂中为溶液4，注入聚乙烯醇水溶液中，形成抗增殖药物纳米粒子，搅拌，挥发，洗涤，干燥；（3）将步骤（2）步骤①获得的产物和步骤②获得的产物依次结合到步骤（1）获得的产物上。本发明是用带有纳米微孔的支架上结合纳米药物，实现与再狭窄病程相吻合的治疗过程。
Description
技术领域
本发明涉及一种可程序性释放的生物药物纳米微孔血管支架及制备方法。
背景技术
2008年世界卫生组织发布全球疾病状况的评估报告显示，心血管疾病是当前导致人类死亡的第一杀手，占全球总死亡人数的29%。且该类疾病中青年，脑力劳动者所占比例显著增加，严重威胁着人类的健康和生命。介入治疗是心血管疾病治疗的主要手段，包括经皮冠状动脉成形术（PTCA）,冠状动脉内支架置入术。每年大约有超过200万冠心病病例施行PTCA术，其中约70％病例同时植入血管支架。尽管大量技术设备已改进，但是单纯PTCA术后6个月内血管造影显示再狭窄（RS）率达15-60%，支架内再狭窄（ISR）也高达10－20%。从而极大地限制介入治疗的远期效果和广泛应用，因而预防和治疗血管再狭窄成为心血管病临床治疗中急待解决的难题。
血管再狭窄的发生可分为弹性回缩期，血栓期，炎症期，新生内膜形成期和血管重塑期。当然，这五个时期并非截然分开，而是相互作用，相互影响，互为因果的，血管再狭窄是一系列病理生理过程联合作用的最终结果，所有作用因素都会对最终的管腔丢失产生影响。这其中弹性回缩期，炎症期，血管重塑期的问题通过血管支架的植入，给予单核巨噬细胞趋化因子等方法可以给予改善，而血栓期内皮的愈合和新生内膜形成期平滑肌细胞的增殖就成为了血管再狭窄的两个关键性的原因。血管内皮快速愈合和抑制平滑肌的增殖同样重要，但目前的临床治疗大多仅针对平滑肌增殖的抑制。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种可程序性释放的生物药物纳米微孔血管支架。
本发明的第二个目的是提供一种可程序性释放的基因蛋白药物纳米微孔血管支架的制备方法。
本发明的第三个目的是提供一种可程序性释放的基因蛋白药物纳米微孔血管支架的用途。
本发明的技术方案概述如下：
一种可程序性释放的生物药物纳米微孔血管支架制备方法，包括如下步骤：
（1）通过激光打孔或者电腐蚀的方法，在金属不锈钢316L裸支架上形成纳米微孔；
（2）通过两种方法之一种进行操作：
方法一：
①将促进内皮愈合的基因或蛋白溶解于PBS缓冲液中使浓度为0.001mg/ml～100mg/ml，记为溶液1，将高分子聚合物溶解于有机溶剂中使浓度为0.001mg/ml～100mg/ml，记为溶液2，按1:1～50的体积比，将溶液1加入到溶液2中，在1000rpm～100000rpm搅拌或超声乳化制成均匀的悬液，再按体积比为1:1～100的比例将所述悬液注入浓度为0.001mg/ml～100mg/ml的聚乙烯醇水溶液中，在1000rpm～100000rpm搅拌或超声乳化制成均匀的悬液，形成基因纳米粒子或蛋白纳米粒子，挥发有机溶剂，洗涤，冷冻干燥保存；
②将抗增殖药物与高分子聚合物共同溶解于有机溶剂中，得到抗增殖药物的浓度为0.001mg/ml～1000mg/ml、高分子聚合物浓度为0.001mg/ml～1000mg/ml的溶液，记为溶液4，再按体积比为1：0.01～100的比例，将溶液4注入浓度为0.001mg/ml～3000mg/ml的聚乙烯醇水溶液中，使均匀分散形成抗增殖药物纳米粒子，继续搅拌1～48小时，得到水包油乳液，挥发有机溶剂，经洗涤，冷冻干燥保存；
方法二：
①将抗增殖药物与高分子聚合物共同溶解于有机溶剂中，得到抗增殖药物的浓度为0.001mg/ml～1000mg/ml、高分子聚合物浓度为0.001mg/ml～1000mg/ml的溶液，记为溶液4，再按体积比为1：0.01～100的比例，将溶液4注入浓度为0.001mg/ml～100mg/ml的聚乙烯醇水溶液中，使均匀分散形成抗增殖药物纳米粒子，继续搅拌1～48小时，得到水包油乳液，挥发有机溶剂，经洗涤，冷冻干燥保存；
②将步骤①获得的冻干粒子与基因或蛋白共同溶解于PBS缓冲液中,使基因或蛋白的浓度为0.001mg/ml～100mg/ml，使冻干粒子的终浓度为0.0001mg/ml～10000mg/ml，记为溶液3，将高分子聚合物溶解于有机溶剂中使浓度为0.001mg/ml～100mg/ml，记为溶液2，按1:1～50的体积比，将溶液3加入到溶液2中，在转速1000rpm～100000rpm搅拌或超声乳化形成均匀的悬液，再按体积比为1:1～100的比例将所述悬液注入浓度为0.001mg/ml～100mg/ml的聚乙烯醇水溶液中，在转速1000rpm～100000rpm搅拌或超声乳化形成双层结构的纳米粒子，挥发有机溶剂，洗涤，冷冻干燥保存；
所述基因为VEGF、iNos或eNos；
所述蛋白为VEGF蛋白、酸性成纤维细胞生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、表皮生长因子、转化生长因子a、转化生长因子b、血小板源性生长因子、胰岛素样生长因子或血管内皮生长因子；
所述高分子聚合物为聚乳酸聚乙醇酸共聚物（PLGA）或聚己内酯（PCL）；
所述有机溶剂为丙酮、二氯甲烷、三氯甲烷、乙醇或二甲基亚砜；
所述抗增殖药物为雷帕霉素、紫杉醇、基质金属蛋白酶抑制剂、氨基胍、吡格列酮、伊贝沙坦，导向药物转化生长因子α.-Saporin、氟伐他汀、血管抑肽或鱼油；
（3）通过超声喷涂的方法按质量比为0.001～1000:0.001～1000的比例，将步骤（2）方法一的步骤①获得的产物和步骤②获得的产物依次结合到步骤（1）获得的产物上，制成可程序性释放的生物药物纳米微孔血管支架，或通过超声喷涂的方法将步骤（2）方法二获得的产物结合到步骤（1）获得的产物上，制成可程序性释放的生物药物纳米微孔血管支架。
所述溶液1的浓度为0.1mg/ml～10mg/ml，最好是1mg/ml～5mg/ml。
所述溶液2的浓度为0.1mg/ml～10mg/ml，最好是1mg/ml～5mg/ml。
溶液1和溶液2的体积比为1:10～30。
步骤（2）方法二的步骤①为：将抗增殖药物与高分子聚合物共同溶解于有机溶剂中，得到抗增殖药物的浓度为0.1mg/ml～100mg/ml、高分子聚合物的浓度为0.1mg/ml～100mg/ml的溶液，记为溶液4，再按体积比为1：1～10的比例，将溶液4注入浓度为1mg/ml～10mg/ml的聚乙烯醇水溶液中，使均匀分散形成抗增殖药物纳米粒子，继续搅拌10-24小时，得到水包油乳液，挥发有机溶剂，经洗涤，冷冻干燥保存。
步骤（3）为：通过超声喷涂的方法按质量比为1:10～20，将步骤（2）方法一步骤①获得的产物和步骤②获得的产物依次结合到步骤（1）获得的产物上，制成可程序性释放的生物药物纳米微孔血管支架，或通过超声喷涂的方法将步骤（2）方法二获得的产物结合到步骤（1）获得的产物上，制成可程序性释放的生物药物纳米微孔血管支架。
上述方法制备的一种可程序性释放的生物药物纳米微孔血管支架。
上述一种可程序性释放的生物药物纳米微孔血管支架的用途。
本发明的支架上结合有运载促进内皮愈合的药物（如VEGF基因，VEGF蛋白等）和抗增殖药物（如雷帕霉素，紫杉醇等）的纳米制剂，在支架植入体内后，两者协同作用，实现最佳治疗效果。这将为建立临床适用性强的血管再狭窄治疗方法奠定坚实的理论与研究基础，为临床治疗血管再狭窄提供一个安全有效的途径。
本发明的支架的基础是带有纳米微孔的支架上结合纳米药物的，因此表面积的增加，进而增加了与纳米药物的结合力；静电喷涂上的纳米制剂同时或分别包裹抗增殖药物（如紫杉醇，雷帕霉素等）和促进血管内皮愈合的药物（如VEGF蛋白，CD34），从而实现与再狭窄病程相吻合的治疗过程。
附图说明
图1为实施例2制备的支架上细胞生长状况良好，证明该支架生物相容性良好。
图2-1为紫杉醇支架（作对照）再狭窄血管造影结果；官腔丢失率为48%；
图2-2为实施例2制备的支架再狭窄血管造影结果，其中双功能纳米胶束组有效的抑制了血管再狭窄，管腔丢失率仅为22.3%，远远低于对照组48%的官腔丢失率。
图3-1为裸金属支架植入后病理结果,平滑肌增殖明显;
图3-2为实施例2一种可程序性释放的生物药物纳米微孔血管支架治疗血管再狭窄猪病理结果，未见平滑肌增殖,说明血管再狭窄被有效抑制。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明。
实施例1
一种可程序性释放的生物药物纳米微孔血管支架制备方法，包括如下步骤：
（1）通过激光打孔的方法，在金属不锈钢316L裸支架上形成纳米微孔；
（2）①将VEGF基因溶解于PBS缓冲液中使浓度为3mg/ml，记为溶液1，将聚乳酸聚乙醇酸共聚物（PLGA）溶解于丙酮中使浓度为3mg/ml，记为溶液2，按1:20的体积比，将溶液1加入到溶液2中，在10000rpm搅拌制成均匀的悬液，再按体积比为1:20的比例将悬液注入浓度为10mg/ml的聚乙烯醇水溶液中，在10000rpm搅拌制成均匀的悬液，形成VEGF基因纳米粒子，挥发丙酮，洗涤，冷冻干燥保存；
②将雷帕霉素与PLGA共同溶解于丙酮中，得到雷帕霉素的浓度为3mg/ml、PLGA浓度为3mg/ml的溶液记为溶液4，再按体积比为1：20的比例，将溶液4注入浓度为3mg/ml的聚乙烯醇水溶液中，使均匀分散形成雷帕霉素纳米粒子，继续搅拌24小时，得到水包油乳液，挥发丙酮，经洗涤，冷冻干燥保存；
（3）通过超声喷涂的方法按质量比为1:1的比例，将步骤（2）方法一步骤①获得的产物和②获得的产物依次结合到步骤（1）获得的产物上，制成可程序性释放的生物药物纳米微孔血管支架。
实施例2
一种可程序性释放的生物药物纳米微孔血管支架制备方法，包括如下步骤：
（1）通过电腐蚀的方法，在金属不锈钢316L裸支架上形成纳米微孔；
（2）①将VEGF蛋白溶解于PBS缓冲液中使浓度1mg/ml，记为溶液1，将聚己内酯(PCL)溶解于二氯甲烷中使浓度为1mg/ml，记为溶液2，按1:30的体积比，将溶液1加入到溶液2中，超声乳化制成均匀的悬液，再按体积比为1:30的比例将所述悬液注入浓度为50mg/ml的聚乙烯醇水溶液中，经超声乳化制成均匀的悬液，形成VEGF蛋白纳米粒子，挥发二氯甲烷，洗涤，冷冻干燥保存；
②将紫杉醇与PCL共同溶解于二氯甲烷中，得到紫杉醇的浓度为1mg/ml、PCL浓度为1mg/ml的溶液，记为溶液4，再按体积比为1：30的比例，将溶液4注入浓度为1mg/ml的聚乙烯醇水溶液中，使均匀分散形成紫杉醇纳米粒子，继续搅拌36小时，得到水包油乳液，挥发二氯甲烷，经洗涤，冷冻干燥保存；
（3）通过超声喷涂的方法按质量比为0.1:10的比例，将步骤（2）①获得的产物和②获得的产物依次结合到步骤（1）获得的产物上，制成可程序性释放的生物药物纳米微孔血管支架。见图2，图2-1为对照支架；官腔丢失率为48%；
图2-2为本实施例制备的支架；官腔丢失率为22.3%。
实施例3
一种可程序性释放的生物药物纳米微孔血管支架制备方法，包括如下步骤：
（1）通过激光打孔的方法，在金属不锈钢316L裸支架上形成纳米微孔；
（2）①将酸性成纤维细胞生长因子溶解于PBS缓冲液中使浓度为5mg/ml，记为溶液1，将PLGA溶解于三氯甲烷中使浓度为5mg/ml，记为溶液2，按1:50的体积比，将溶液1加入到溶液2中，在5000rpm搅拌制成均匀的悬液，再按体积比为1:50的比例将悬液注入浓度为1mg/ml的聚乙烯醇水溶液中，在5000rpm搅拌制成均匀的悬液，形成酸性成纤维细胞生长因子纳米粒子，挥发三氯甲烷，洗涤，冷冻干燥保存；
②将基质金属蛋白酶抑制剂与PLGA共同溶解于三氯甲烷中，得到基质金属蛋白酶抑制剂的浓度为5mg/ml、PLGA浓度为5mg/ml的溶液，记为溶液4，再按体积比为1：50的比例，将溶液4注入浓度为5mg/ml的聚乙烯醇水溶液中，使均匀分散形成基质金属蛋白酶抑制剂纳米粒子，继续搅拌12小时，得到水包油乳液，挥发三氯甲烷，经洗涤，冷冻干燥保存；
（3）通过超声喷涂的方法按质量比为0.01:100的比例，将步骤（2）①获得的产物和②获得的产物依次结合到步骤（1）获得的产物上，制成可程序性释放的生物药物纳米微孔血管支架。
实施例4
一种可程序性释放的生物药物纳米微孔血管支架制备方法，包括如下步骤：
（1）通过电腐蚀的方法，在金属不锈钢316L裸支架上形成纳米微孔；
（2）①将碱性成纤维细胞生长因子溶解于PBS缓冲液中使浓度为0.1mg/ml，记为溶液1，将PCL溶解于乙醇中使浓度为0.1mg/ml，记为溶液2，按1:1的体积比，将溶液1加入到溶液2中，在8000rpm搅拌制成均匀的悬液，再按体积比为1:70的比例将悬液注入浓度为0.01mg/ml的聚乙烯醇水溶液中，在8000rpm搅拌制成均匀的悬液，形成碱性成纤维细胞生长因子纳米粒子，挥发乙醇，洗涤，冷冻干燥保存；
②将氨基胍与PCL共同溶解于乙醇中，得到氨基胍的浓度为0.1mg/ml、PCL浓度为0.1mg/ml的溶液，记为溶液4，再按体积比为1：1的比例，将溶液4注入浓度为0.1mg/ml的聚乙烯醇水溶液中，使均匀分散形成氨基胍纳米粒子，继续搅拌6小时，得到水包油乳液，挥发乙醇，经洗涤，冷冻干燥保存；
（3）通过超声喷涂的方法按质量比为0.001:1000的比例，将步骤（2）①获得的产物和②获得的产物依次结合到步骤（1）获得的产物上，制成可程序性释放的生物药物纳米微孔血管支架。
实施例5
一种可程序性释放的生物药物纳米微孔血管支架制备方法，包括如下步骤：
（1）通过激光打孔的方法，在金属不锈钢316L裸支架上形成纳米微孔；
（2）①将表皮生长因子溶解于PBS缓冲液中使浓度为10mg/ml，记为溶液1，将PLGA溶解于二甲基亚砜中使浓度为10mg/ml，记为溶液2，按1:50的体积比，将溶液1加入到溶液2中，在10000rpm搅拌制成均匀的悬液，再按体积比为1:1的比例将悬液注入浓度为10mg/ml的聚乙烯醇水溶液中，在10000rpm搅拌制成均匀的悬液，形成表皮生长因子纳米粒子，挥发二甲基亚砜，洗涤，冷冻干燥保存；
②将吡格列酮与PLGA共同溶解于二甲基亚砜中，得到吡格列酮的浓度为10mg/ml、PLGA浓度为10mg/ml的溶液，记为溶液4，再按体积比为1：1的比例，将溶液4注入浓度为10mg/ml的聚乙烯醇水溶液中，使均匀分散形成吡格列酮纳米粒子，继续搅拌36小时，得到水包油乳液，挥发二甲基亚砜，经洗涤，冷冻干燥保存；
（3）通过超声喷涂的方法按质量比为10:0.01的比例，将步骤（2）①获得的产物和②获得的产物依次结合到步骤（1）获得的产物上，制成可程序性释放的生物药物纳米微孔血管支架。
实施例6
一种可程序性释放的生物药物纳米微孔血管支架制备方法，包括如下步骤：
（1）通过激光打孔的方法，在金属不锈钢316L裸支架上形成纳米微孔；
（2）①将转化生长因子a溶解于PBS缓冲液中使浓度为0.001mg/ml，记为溶液1，将PCL溶解于丙酮中使浓度为0.001mg/ml，记为溶液2，按1:10的体积比，将溶液1加入到溶液2中，在50000rpm搅拌制成均匀的悬液，再按体积比为1:100的比例将悬液注入浓度为0.001mg/ml的聚乙烯醇水溶液中，在50000rpm搅拌制成均匀的悬液，形成转化生长因子a纳米粒子，挥发丙酮，洗涤，冷冻干燥保存；
②将伊贝沙坦与PCL共同溶解于丙酮中，得到伊贝沙坦的浓度为0.001mg/ml、PCL浓度为0.001mg/ml的溶液，记为溶液4，再按体积比为1：0.01的比例，将溶液4注入浓度为0.001mg/ml的聚乙烯醇水溶液中，使均匀分散形成伊贝沙坦纳米粒子，继续搅拌1小时，得到水包油乳液，挥发丙酮，经洗涤，冷冻干燥保存；
（3）通过超声喷涂的方法按质量比为100:0.1的比例，将步骤（2）①获得的产物和②获得的产物依次结合到步骤（1）获得的产物上，制成可程序性释放的生物药物纳米微孔血管支架。
实施例7
一种可程序性释放的生物药物纳米微孔血管支架方法，包括如下步骤：
（1）通过激光打孔的方法，在金属不锈钢316L裸支架上形成纳米微孔；
（2）①将转化生长因子b溶解于PBS缓冲液中使浓度为100mg/ml，记为溶液1，将PLGA溶解于丙酮中使浓度为100mg/ml，记为溶液2，按1:20的体积比，将溶液1加入到溶液2中，在100000rpm搅拌制成均匀的悬液，再按体积比为1:20的比例将悬液注入浓度为100mg/ml的聚乙烯醇水溶液中，在100000rpm搅拌制成均匀的悬液，形成转化生长因子b纳米粒子，挥发丙酮，洗涤，冷冻干燥保存；
②将导向药物转化生长因子α.-Saporin与PLGA共同溶解于丙酮中，得到导向药物转化生长因子α.-Saporin的浓度为1000mg/ml、PLGA浓度为1000mg/ml的溶液，记为溶液4，再按体积比为1：100的比例，将溶液4注入浓度为3000mg/ml的聚乙烯醇水溶液中，使均匀分散形成导向药物转化生长因子α.-Saporin纳米粒子，继续搅拌48小时，得到水包油乳液，挥发丙酮，经洗涤，冷冻干燥保存；
（3）通过超声喷涂的方法按质量比为1000:0.001的比例，将步骤（2）①获得的产物和②获得的产物依次结合到步骤（1）获得的产物上，制成可程序性释放的生物药物纳米微孔血管支架。
实施例8
一种可程序性释放的生物药物纳米微孔血管支架制备方法，包括如下步骤：
（1）通过激光打孔的方法，在金属不锈钢316L裸支架上形成纳米微孔；
（2）①将氟伐他汀与PLGA共同溶解于丙酮中，得到氟伐他汀的浓度为3mg/ml、PLGA的浓度为3mg/ml的溶液，记为溶液4，再按体积比为1：20的比例，将溶液4注入浓度为3mg/ml的聚乙烯醇水溶液中，使均匀分散形成氟伐他汀纳米粒子，继续搅拌24小时，得到水包油乳液，挥发丙酮，经洗涤，冷冻干燥保存；
②将步骤①获得的冻干粒子与VEGF基因共同溶解于PBS缓冲液中,使VEGF基因的浓度为3mg/ml，使冻干粒子的浓度为3mg/ml，记为溶液3，将PLGA溶解于丙酮中使浓度为3mg/ml，记为溶液2，按1:20的体积比，将溶液3加入到溶液2中，在超声乳化形成均匀的悬液，再按体积比为1:20的比例将悬液注入浓度为3mg/ml的聚乙烯醇水溶液中，在超声乳化形成形成双层结构的纳米粒子，挥发丙酮，洗涤，冷冻干燥保存；
（3）通过超声喷涂的方法将步骤（2）获得的产物结合到步骤（1）获得的产物上，制成可程序性释放的生物药物纳米微孔血管支架。
实施例9
一种可程序性释放的生物药物纳米微孔血管支架制备方法，包括如下步骤：
（1）通过电腐蚀的方法，在金属不锈钢316L裸支架上形成纳米微孔；
（2）①将血管抑肽与PCL共同溶解于二氯甲烷中，得到血管抑肽的浓度为1mg/ml、PCL的浓度为1mg/ml的溶液，记为溶液4，再按体积比为1：30的比例，将溶液4注入浓度为1mg/ml的聚乙烯醇水溶液中，使均匀分散形成血管抑肽纳米粒子，继续搅拌36小时，得到水包油乳液，挥发二氯甲烷，经洗涤，冷冻干燥保存；
②将步骤①获得的冻干粒子与VEGF蛋白共同溶解于PBS缓冲液中,使VEGF蛋白的浓度为1mg/ml，使冻干粒子的浓度为1mg/ml，记为溶液3，将PCL溶解于二氯甲烷中使浓度为1mg/ml，记为溶液2，按1:30的体积比，将溶液3加入到溶液2中，在转速1000rpm搅拌形成均匀的悬液，再按体积比为1:30的比例将悬液注入浓度为1mg/ml的聚乙烯醇水溶液中，在转速1000rpm搅拌形成双层结构的纳米粒子，挥发二氯甲烷，洗涤，冷冻干燥保存；
（3）通过超声喷涂的方法将步骤（2）获得的产物结合到步骤（1）获得的产物上，制成可程序性释放的生物药物纳米微孔血管支架。
实施例10
一种可程序性释放的生物药物纳米微孔血管支架制备方法，包括如下步骤：
（1）通过激光打孔的方法，在金属不锈钢316L裸支架上形成纳米微孔；
（2）①将鱼油与PLGA共同溶解于三氯甲烷中，得到鱼油的浓度为5mg/ml、PLGA的浓度为5mg/ml的溶液，记为溶液4，再按体积比为1：50的比例，将溶液4注入浓度为5mg/ml的聚乙烯醇水溶液中，使均匀分散形成鱼油纳米粒子，继续搅拌12小时，得到水包油乳液，挥发三氯甲烷，经洗涤，冷冻干燥保存；
②将步骤①获得的冻干粒子与酸性成纤维细胞生长因子共同溶解于PBS缓冲液中,使酸性成纤维细胞生长因子的浓度为5mg/ml，使冻干粒子的浓度为5mg/ml，记为溶液3，将PLGA溶解于三氯甲烷中使浓度为5mg/ml，记为溶液2，按1:50的体积比，将溶液3加入到溶液2中，在转速5000rpm搅拌形成均匀的悬液，再按体积比为1:50的比例将悬液注入浓度为5mg/ml的聚乙烯醇水溶液中，在转速5000rpm搅拌形成双层结构的纳米粒子，挥发三氯甲烷，洗涤，冷冻干燥保存；
（3）通过超声喷涂的方法将步骤（2）获得的产物结合到步骤（1）获得的产物上，制成可程序性释放的生物药物纳米微孔血管支架。
实施例11
一种可程序性释放的生物药物纳米微孔血管支架制备方法，包括如下步骤：
（1）通过电腐蚀的方法，在金属不锈钢316L裸支架上形成纳米微孔；
（2）①将雷帕霉素与PCL共同溶解于乙醇中，得到雷帕霉素的浓度为0.1mg/ml、PCL的浓度为0.001mg/ml～1000mg/ml的溶液，记为溶液4，再按体积比为1：0.1的比例，将溶液4注入浓度为0.1mg/ml的聚乙烯醇水溶液中，使均匀分散形成雷帕霉素纳米粒子，继续搅拌6小时，得到水包油乳液，挥发乙醇，经洗涤，冷冻干燥保存；
②将步骤①获得的冻干粒子与碱性成纤维细胞生长因子共同溶解于PBS缓冲液中,使碱性成纤维细胞生长因子的浓度为0.1mg/ml，使冻干粒子的浓度为0.001mg/ml，记为溶液3，将PCL溶解于乙醇中使浓度为0.1mg/ml，记为溶液2，按1:1的体积比，将溶液3加入到溶液2中，在转速8000rpm搅拌形成均匀的悬液，再按体积比为1:1的比例将悬液注入浓度为0.01mg/ml的聚乙烯醇水溶液中，在转速8000rpm搅拌形成双层结构的纳米粒子，挥发乙醇，洗涤，冷冻干燥保存；
（3）通过超声喷涂的方法将步骤（2）获得的产物结合到步骤（1）获得的产物上，制成可程序性释放的生物药物纳米微孔血管支架。
实施例12
一种可程序性释放的生物药物纳米微孔血管支架制备方法，包括如下步骤：
（1）通过电腐蚀的方法，在金属不锈钢316L裸支架上形成纳米微孔；
（2）①将基质金属蛋白酶抑制剂与PCL共同溶解于丙酮中，得到基质金属蛋白酶抑制剂的浓度为0.001mg/ml、PCL的浓度为0.001mg/ml的溶液，记为溶液4，再按体积比为1：10的比例，将溶液4注入浓度为10mg/ml的聚乙烯醇水溶液中，使均匀分散形成基质金属蛋白酶抑制剂纳米粒子，继续搅拌36小时，得到水包油乳液，挥发丙酮，经洗涤，冷冻干燥保存；
②将步骤①获得的冻干粒子与血小板源性生长因子共同溶解于PBS缓冲液中,使血小板源性生长因子的浓度为10mg/ml，使冻干粒子的浓度为100mg/ml，记为溶液3，将PCL溶解于丙酮中使浓度为10mg/ml，记为溶液2，按1:10的体积比，将溶液3加入到溶液2中，在转速10000rpm搅拌形成均匀的悬液，再按体积比为1:10的比例将所述悬液注入浓度为10mg/ml的聚乙烯醇水溶液中，在转速10000rpm搅拌形成双层结构的纳米粒子，挥发丙酮，洗涤，冷冻干燥保存；
（3）通过超声喷涂的方法将步骤（2）获得的产物结合到步骤（1）获得的产物上，制成可程序性释放的生物药物纳米微孔血管支架。
实施例13
一种可程序性释放的生物药物纳米微孔血管支架制备方法，包括如下步骤：
（1）通过激光打孔的方法，在金属不锈钢316L裸支架上形成纳米微孔；
（2）①将紫杉醇与PLGA共同溶解于二甲基亚砜中，得到紫杉醇的浓度为10mg/ml、PLGA的浓度为10mg/ml的溶液，记为溶液4，再按体积比为1：0.01的比例，将溶液4注入浓度为0.001mg/ml的聚乙烯醇水溶液中，使均匀分散形成紫杉醇纳米粒子，继续搅拌1小时，得到水包油乳液，挥发二甲基亚砜，经洗涤，冷冻干燥保存；
②将步骤①获得的冻干粒子与胰岛素样生长因子共同溶解于PBS缓冲液中,使胰岛素样生长因子浓度为0.001mg/ml，使冻干粒子的浓度为0.0001mg/ml，记为溶液3，将PLGA溶解于二甲基亚砜中使浓度为0.001mg/ml，记为溶液2，按1:20的体积比，将溶液3加入到溶液2中，在转速1000rpm搅拌形成均匀的悬液，再按体积比为1:20的比例将所述悬液注入浓度为0.001mg/ml的聚乙烯醇水溶液中，在转速1000rpm搅拌形成双层结构的纳米粒子，挥发二甲基亚砜，洗涤，冷冻干燥保存；
（3）通过超声喷涂的方法将步骤（2）获得的产物结合到步骤（1）获得的产物上，制成可程序性释放的生物药物纳米微孔血管支架。
实施例14
一种可程序性释放的生物药物纳米微孔血管支架制备方法，包括如下步骤：
（1）通过激光打孔的方法，在金属不锈钢316L裸支架上形成纳米微孔；
（2）①将氨基胍与PLGA共同溶解于二氯甲烷中，得到氨基胍的浓度为1000mg/ml、PLGA的浓度为1000mg/ml的溶液，记为溶液4，再按体积比为1：100的比例，将溶液4注入浓度为100mg/ml的聚乙烯醇水溶液中，使均匀分散形成氨基胍纳米粒子，继续搅拌48小时，得到水包油乳液，挥发二氯甲烷，经洗涤，冷冻干燥保存；
②将步骤①获得的冻干粒子与血管内皮生长因子共同溶解于PBS缓冲液中,使血管内皮生长因子的浓度为100mg/ml，使冻干粒子的浓度为10000mg/ml，记为溶液3，将PLGA溶解于二氯甲烷中使浓度为100mg/ml，记为溶液2，按1:30的体积比，将溶液3加入到溶液2中，在转速100000rpm搅拌形成均匀的悬液，再按体积比为1:100的比例将悬液注入浓度为100mg/ml的聚乙烯醇水溶液中，在转速100000rpm搅拌形成双层结构的纳米粒子，挥发二氯甲烷，洗涤，冷冻干燥保存；
（3）通过超声喷涂的方法将步骤（2）获得的产物结合到步骤（1）获得的产物上，制成可程序性释放的生物药物纳米微孔血管支架。
实施例15
本发明的一种可程序性释放的生物药物纳米微孔血管支架在制备治疗血管再狭窄支架的应用
实验选用试验猪为35kg的健康普通白猪，雄，术前行肌注诱导麻醉，麻醉诱导成功后行吸入麻醉，然后进行气管插管建呼吸通路、耳缘静脉穿刺建静脉通路。动物移入手术台后消毒两侧股动脉穿刺部位附近的区域，股动脉穿刺，插入血管鞘，建立动脉通路。静脉注射低分子肝素使实验动物肝素化后插入造影导管造影，植入支架。手术后动物正常喂养2周后取移植段血管，分别提取RNA进行斑点杂交检测转染表达情况以及进行病理形态学分析，测定内膜增生程度，见图3。（图3-1猪冠脉埋植裸金属支架后病理切片结果；图3-2猪冠脉埋植实施例2可程序性释放的生物药物纳米微孔血管支架后病理切片结果）。
植入可程序性释放的生物药物纳米微孔血管支架治疗血管再狭窄,官腔丢失率明显降低,远远低于市售药物洗脱冠脉支架率48%的管腔丢失率,而临床判定管腔丢失率48%以下为未见血管再狭窄发生。各实施例的效果见表1。
表1：
| 实施例 | 管腔丢失率 | 实施例 | 管腔丢失率 |
| 1 | 23.4% | 8 | 25.4% |
| 2 | 22.3% | 9 | 24.2% |
| 3 | 21.6% | 10 | 25.6% |
| 4 | 25.3% | 11 | 23.0% |
| 5 | 25.0% | 12 | 24.1% |
| 6 | 21.5% | 13 | 24.9% |
| 7 | 22.8% | 14 | 24.2% |
Claims (10)
1.一种可程序性释放的生物药物纳米微孔血管支架制备方法，其特征是包括如下步骤：
（1）通过激光打孔或者电腐蚀的方法，在金属不锈钢316L裸支架上形成纳米微孔；
（2）通过两种方法之一种进行操作：
方法一：
①将促进内皮愈合的基因或蛋白溶解于PBS缓冲液中使浓度为0.001mg/ml～100mg/ml，记为溶液1，将高分子聚合物溶解于有机溶剂中使浓度为0.001mg/ml～100mg/ml，记为溶液2，按1:1～50的体积比，将溶液1加入到溶液2中，在1000rpm～100000rpm搅拌或超声乳化制成均匀的悬液，再按体积比为1:1～100的比例将所述悬液注入浓度为0.001mg/ml～100mg/ml的聚乙烯醇水溶液中，在1000rpm～100000rpm搅拌或超声乳化制成均匀的悬液，形成基因纳米粒子或蛋白纳米粒子，挥发有机溶剂，洗涤，冷冻干燥保存；
②将抗增殖药物与高分子聚合物共同溶解于有机溶剂中，得到抗增殖药物的浓度为0.001mg/ml～1000mg/ml、高分子聚合物浓度为0.001mg/ml～1000mg/ml的溶液，记为溶液4，再按体积比为1：0.01～100的比例，将溶液4注入浓度为0.001mg/ml～3000mg/ml的聚乙烯醇水溶液中，使均匀分散形成抗增殖药物纳米粒子，继续搅拌1～48小时，得到水包油乳液，挥发有机溶剂，经洗涤，冷冻干燥保存；
方法二：
①将抗增殖药物与高分子聚合物共同溶解于有机溶剂中，得到抗增殖药物的浓度为0.001mg/ml～1000mg/ml、高分子聚合物浓度为0.001mg/ml～1000mg/ml的溶液，记为溶液4，再按体积比为1：0.01～100的比例，将溶液4注入浓度为0.001mg/ml～100mg/ml的聚乙烯醇水溶液中，使均匀分散形成抗增殖药物纳米粒子，继续搅拌1～48小时，得到水包油乳液，挥发有机溶剂，经洗涤，冷冻干燥保存；
②将步骤①获得的冻干粒子与基因或蛋白共同溶解于PBS缓冲液中,使基因或蛋白的浓度为0.001mg/ml～100mg/ml，使冻干粒子的终浓度为0.0001mg/ml～10000mg/ml，记为溶液3，将高分子聚合物溶解于有机溶剂中使浓度为0.001mg/ml～100mg/ml，记为溶液2，按1:1～50的体积比，将溶液3加入到溶液2中，在转速1000rpm～100000rpm搅拌或超声乳化形成均匀的悬液，再按体积比为1:1～100的比例将所述悬液注入浓度为0.001mg/ml～100mg/ml的聚乙烯醇水溶液中，在转速1000rpm～100000rpm搅拌或超声乳化形成双层结构的纳米粒子，挥发有机溶剂，洗涤，冷冻干燥保存；
所述基因为VEGF、iNos或eNos；
所述蛋白为VEGF蛋白、酸性成纤维细胞生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、表皮生长因子、转化生长因子a、转化生长因子b、血小板源性生长因子、胰岛素样生长因子或血管内皮生长因子；
所述高分子聚合物为聚乳酸聚乙醇酸共聚物或聚己内酯；
所述有机溶剂为丙酮、二氯甲烷、三氯甲烷、乙醇或二甲基亚砜；
所述抗增殖药物为雷帕霉素、紫杉醇、基质金属蛋白酶抑制剂、氨基胍、吡格列酮、伊贝沙坦，导向药物转化生长因子α.-Saporin、氟伐他汀、血管抑肽或鱼油；
（3）通过超声喷涂的方法按质量比为0.001～1000:0.001～1000的比例，将步骤（2）方法一的步骤①获得的产物和步骤②获得的产物依次结合到步骤（1）获得的产物上，制成可程序性释放的生物药物纳米微孔血管支架，或通过超声喷涂的方法将步骤（2）方法二获得的产物结合到步骤（1）获得的产物上，制成可程序性释放的生物药物纳米微孔血管支架。
2.根据权利要求1所述的一种可程序性释放的生物药物纳米微孔血管支架制备方法，其特征是所述溶液1的浓度为0.1mg/ml～10mg/ml。
3.根据权利要求2所述的一种可程序性释放的生物药物纳米微孔血管支架制备方法，其特征是所述溶液1的浓度为1mg/ml～5mg/ml。
4.根据权利要求1所述的一种可程序性释放的生物药物纳米微孔血管支架制备方法，其特征是所述溶液2的浓度为0.1mg/ml～10mg/ml。
5.根据权利要求4所述的一种可程序性释放的生物药物纳米微孔血管支架制备方法，其特征是所述溶液2的浓度为1mg/ml～5mg/ml。
6.根据权利要求1所述的一种可程序性释放的生物药物纳米微孔血管支架制备方法，其特征是所述溶液1和溶液2的体积比为1:10～30。
7.根据权利要求1所述的一种可程序性释放的生物药物纳米微孔血管支架制备方法，其特征是所述步骤（2）方法二的步骤①为：将抗增殖药物与高分子聚合物共同溶解于有机溶剂中，得到抗增殖药物的浓度为0.1mg/ml～100mg/ml、高分子聚合物的浓度为0.1mg/ml～100mg/ml的溶液，记为溶液4，再按体积比为1：1～10的比例，将溶液4注入浓度为1mg/ml～10mg/ml的聚乙烯醇水溶液中，使均匀分散形成抗增殖药物纳米粒子，继续搅拌10～24小时，得到水包油乳液，挥发有机溶剂，经洗涤，冷冻干燥保存。
8.根据权利要求1所述的一种可程序性释放的生物药物纳米微孔血管支架制备方法，其特征是所述步骤（3）为：通过超声喷涂的方法按质量比为1:10～20，将步骤（2）方法一步骤①获得的产物和步骤②获得的产物依次结合到步骤（1）获得的产物上，制成可程序性释放的生物药物纳米微孔血管支架，或通过超声喷涂的方法将步骤（2）方法二获得的产物结合到步骤（1）获得的产物上，制成可程序性释放的生物药物纳米微孔血管支架。
9.权利要求1～8之一的方法制备的一种可程序性释放的生物药物纳米微孔血管支架。
10.权利要求9的一种可程序性释放的生物药物纳米微孔血管支架的用途。
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