CN103920196A - 含TGFα-Saporin的给药载体及给药载体制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种含TGFα-Saporin的给药载体及给药载体制备方法,该给药载体包括载体本体和药物涂层,药物涂层包覆于载体本体表面上,药物涂层包括:包覆于载体本体表面上的至少一层TGFα-Saporin药物层和包覆于TGFα-Saporin药物层最外层的至少一层高分子多聚物层。本发明提供的药物给药载体以在常用药物载体上包覆能同时选择性抑制平滑肌细胞增殖和促进损伤血管内皮化的TGFα-Saporin,使得该涂层支架能有效防止术血管再狭窄的发生,降低支架植入术后支架内血栓和急性心脏事件发生率。
Description
技术领域
本发明涉及冠心病术后治疗领域,特别地,涉及一种含TGFα-Saporin的给药载体及给药载体制备方法。
背景技术
转化生长因子-α(transforminggrowthfactorα,TGFα)是由巨噬细胞、脑细胞和表皮细胞产生的小份子多肽,可以诱导上皮或内皮修复,可以促使多种细胞增殖和分化。TGFα通过细胞表面受体表皮生长因子受体(EGFR)结合而发挥其作用,在与表皮生长因子高亲和力受体的结合后,经过一系列生物信号传导,使得细胞增殖并合成相应的DNA,同时TGFα又是内皮细胞强有力的趋化因子,可促使内皮细胞歉意和修复。
皂草毒素蛋白(Saporin)是来自皂草的I型核糖体失活蛋白质,由254个氨基酸残基组成。在细胞外皂草毒素蛋白对完整的真核生物细胞并无明显毒性作用。由于动物细胞无这种植物蛋白的联结受体,故皂草毒素蛋白不通过介导无法进入动物细胞内产生细胞毒性作用。Saporin在体内具有良好的稳定性,TGFα-Saporin经TGFα/EGFR介导进入细胞内后可通过抑制伸展因子2(EF2)与核糖体60S亚单位的联结而抑制靶细胞蛋白质合成,导致细胞死亡或诱导凋亡,由于平滑肌细胞表型转化后EGFR(原癌基因c-erbB1的表达产物)呈10倍的上调,故TGFα-Saporin可有效抑制平滑肌细胞的增殖并改善血管重构。同时由于内皮细胞表面的EGFR表达很少,TGFα-Saporin对内皮细胞有着较低的细胞毒性作用。
药物给药载体是以支架或球囊等常见血管给药装置为载体,将药物直接或者通过适当的介质涂布于载体表面得到的。药物给药载体是一个局部药物释放系统。以下以药物涂层支架为例进行说明,目前,公知的药物洗脱支架主要是紫衫醇药物洗脱支架和雷帕霉素药物洗脱支架,其涂层中所用药物都是非选择性细胞毒性药物,现有涂层药物在抑制内膜损伤后平滑肌细胞过度增殖的同时,也会对参与内皮修复的内皮细胞和内皮祖细胞产生明显细胞毒性作用,抑制其迁移,增殖和修复,故可导致持续的内皮损伤和内皮化不全问题。进而引起死亡率高达45%的支架内血栓。因此开发出一种选择性抑制平滑肌细胞增殖,又能促进损伤血管内皮化的涂层药物已成为药物支架发展的关键。
经皮冠状动脉腔内成形术在冠心病临床治疗上已得到十分迅速的普及和发展,但如何能降低术后高达30%~50%的再狭窄发生率,现有技术多通过在药物涂层支架或球囊上负载具有抑制血管上皮细胞增生的药物,将该支架或球囊送入患处,使涂覆与支架或球囊上的药物发挥作用。这类药物多为雷帕霉素或紫杉醇,这类支架会导致支架内血栓的发生,一旦发生支架内血栓则患者死亡率可高达45%。通过联结TGFα和Saporin所得药物能有效避免血管上皮细胞过度增殖导致术后血管再狭窄的产生。目前我们现采用的TGFα和Saporin的联结方法所得产物中TGFα-Saporin含量低,提纯复杂,存在大量未连接的Saporin,并存在不稳定未反应 基团,降低了联接物的稳定性和产物的疗效。
发明内容
本发明目的在于提供一种含TGFα-Saporin的给药载体及给药载体制备方法,以解决现有技术中给药载体不能同时起到选择性抑制平滑肌细胞增殖和促进损伤血管内皮化作用的技术问题。
为实现上述目的,根据本发明的一个方面,提供了一种含TGFα-Saporin的给药载体,包括载体本体和药物涂层,药物涂层包覆于载体本体表面上,药物涂层包括:包覆于载体本体表面上的至少一层TGFα-Saporin药物层和包覆于TGFα-Saporin药物层最外层的至少一层高分子多聚物层。
进一步地,高分子多聚物层为壳聚糖层、PLGA、明胶层或肝素层,优选的高分子多聚物层为肝素层。
进一步地,药物涂层还包括设置在最内层TGFα-Saporin药物层与载体本体表面之间的至少一层聚合物底层,优选聚合物底层为壳聚糖层或肝素层。
进一步地,药物涂层中包括多层TGFα-Saporin药物层时,任意相邻两层TGFα-Saporin药物层之间设置有插设层,插设层为壳聚糖插设层或肝素插设层,或者插设层同时包括壳聚糖插设层和肝素层插设时,且壳聚糖插设层和肝素插设层交替设置在多层TGFα-Saporin药物层之间。
进一步地,药物涂层中TGFα-Saporin药物的层数为14~16层。
进一步地,TGFα-Saporin药物层数为15层。
进一步地,TGFα-Saporin药物的联结方法包括以下步骤:
1)将TGFα溶液与联接剂溶液混合反应,得到衍化TGFα;
2)将Saporin溶液与还原剂混合反应,得到第一产物并将第一产物加入衍化TGFα中进行反应,得到第二产物;
3)将半胱氨酸溶液加入第二产物中钝化反应5~7小时,得到TGFα-Saporin药物;优选半胱氨酸溶液浓度为0.1~0.3mmol/L。
进一步地,衍化TGFα与第一产物按TGFα与Saporin摩尔比为2~4:1混合进行反应。
进一步地,衍化TGFα与第一产物按TGFα与Saporin摩尔比为2.5~4:1混合进行反应。
根据本发明的另一方面还提供了一种上述含TGFα-Saporin的给药载体的制备方法,包括以下步骤:
1)将载体本体至少一次浸入到TGFα-Saporin药物溶液中,形成表面包覆有至少一层TGFα-Saporin药物层的载体中间体;
2)将载体中间体至少一次浸入到高分子多聚物溶液中,在TGFα-Saporin药物层上形成至少一层高分子多聚物层,形成血管内给药载体;高分子多聚物溶液包括明胶溶液、PLGA溶液、壳聚糖溶液或肝素溶液。
进一步地,还包括在步骤2)后对给药载体进行后处理步骤,后处理步骤包括对给药载体照射紫外线;TGFα-Saporin药物溶液和高分子多聚物溶液中均含有PLGA。
进一步地,PLGA加入TGFα-Saporin溶液中时PLGA的加入量为按TGFα-Saporin:PLGA的摩尔比为1:9~11加入;PLGA的加入高分子多聚物溶液中时PLGA的加入量为按高分子多聚物溶液:PLGA的摩尔比为4~6%加入。
本发明具有以下有益效果:
本发明提供的药物给药载体以在常用药物载体上包覆能同时选择性抑制平滑肌细胞增殖和促进损伤血管内皮化的TGFα-Saporin,使得该涂层支架能有效防止术血管再狭窄的发生,降低支架植入术后支架内血栓和急性心脏事件发生率。
除了上面所描述的目的、特征和优点之外,本发明还有其它的目的、特征和优点。下面将参照图,对本发明作进一步详细的说明。
附图说明
构成本申请的一部分的附图用来提供对本发明的进一步理解,本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明,并不构成对本发明的不当限定。在附图中:
图1是本发明优选实施例的含TGFα-Saporin的涂层支架的局部横剖面示意图;
图2是本发明优选实施例的含TGFα-Saporin的涂层支架的局部横剖面示意图;
图3是本发明优选实施例的含TGFα-Saporin的涂层支架的局部横剖面示意图;
图4是SAP(10-3M)组平滑肌细胞倒置相差显微镜下观察结果图;
图5是本发明提供TGFα-SAP(10-7M)平滑肌细胞倒置相差显微镜下观察结果图;
图6是空白对照组平滑肌细胞倒置相差显微镜下观察结果图;
图7是本发明提供TGFα-SAP对比SAP对SMCs增殖率影响结果图;
图8是本发明提供TGFα-SAP对比和SAP对SMCs增殖的抑制率结果图;
图9是本发明优选实施例的TGFa-SAP组、SAP组和空白对照组的SMC氚标TdR渗入量对比图;
图10是本发明优选实施例的TGFα-SAP和bFGF-SAP对SMC氚标TdR渗入量影响的比较结果图;
图11是本发明优选实施例的TGFα-SAP动物试验实验组和对照组细胞PCNA(增殖细胞核抗原)阳性细胞百分率的比较结果图;
图12是本发明优选实施例的TGFα-SAP实验组1-28天损伤血管图;以及
图13是本发明优选实施例的TGFα-SAP实验组术后2个月损伤血管标本电镜;
图14是本发明优选实施例的TGFα-SAP涂层支架药物释放曲线;以及
图15是本发明优选实施例的TGFα-SAP涂层支架支架植入组术后28天肝组织病理切片图。
具体实施方式
以下结合附图对本发明的实施例进行详细说明,但是本发明可以由权利要求限定和覆盖的多种不同方式实施。
本发明所提供的含TGFα-Saporin的给药载体进入血管后,TGFα将具有选择性抑制平滑肌增殖作用的Saporin导向至患处发挥抑制增殖作用。同时TGFα则起到促进患处上皮化的作用。在药物释放过程中高分子多聚物、聚合物底层和TGFα-Saporin协同作用促进损伤血管内皮化作用,降低了术后再狭窄发生的几率,提高病患存活率。
给药载体中的载体本体是指本领域常用载体如支架或球囊,在载体本体表面设置药物涂层,使之进入人体后成为药物释放系统,直达患处发挥作用。本文中肝素包括肝素钠(钙)或低分子量的肝素钠(钙)。
本发明一方面提供了一种含TGFα-Saporin的给药载体,该给药载体包括药物涂层和载体本体,药物涂层包覆于载体本体表面。药物涂层包括包覆于载体本体上的至少一层TGFα-Saporin药物层和在包覆于TGFα-Saporin药物层最外层的高分子多聚物层。当药物涂层包括多层TGFα-Saporin药物层时,药物涂层的最外层仍然是高分子多聚物层。
TGFα-Saporin药物层可以采用常规方法包覆于载体本体上,比如可以采用涂层自组装、浸入干燥法、多层组装法等。包覆了TGFα-Saporin药物层后,还需在药物涂层的最外层设置高分子多聚物层,使得给药载体进入人体后能发挥缓慢释放TGFα-Saporin药物的作用,并能保护给药载体上的TGFα-Saporin药物层在运输过程中出现损失。该高分子多聚物层可以为壳聚糖、PLGA(聚乳酸-羟基乙酸共聚物)/明胶或肝素。其中尤以肝素效果最优。采用肝素作为高分子多聚物层时给药载体表面更光滑,便于内皮细胞的攀附。肝素层处于给药载体的最外层,进入人体后能第一时间释放药效,可以更有效的防止支架进入人体后血栓形成的问题。肝素作为抗凝剂主要通过增强抗凝血酶的活性而发挥作用。能防止在给药过程中血栓在给药载体外表面形成,阻碍支架到达患处。当所用给药载体是通过进入人体内缓慢释放药物给药时,TGFα-Saporin药物层中的TGFα是生长因子可以和肝素结合,聚集TGFα-Saporin并使 TGFα-Saporin的药效缓慢释放,延长给药时间,促进支架在血管内发挥药效。
如图1所示,在载体本体1表面依次包覆TGFα-Saporin药物层2和高分子多聚物层3。该给药载体制备过程简单,仅需包覆一层TGFα-Saporin药物层。给药载体所负载药物的含量易于控制,有利于保证载体所含药量与给药过程所需药量相吻合。优选药物涂层厚度为18μm。此时能保证给药载体上TGFα-Saporin药物含量在血管内能达到最优的抑制细胞增生和促进上皮化效果。
优选的,给药载体还包括包覆于载体本体表面上,TGFα-Saporin药物层下的聚合物底层。载体本体上先包覆聚合物底层后,聚合物底层能发挥聚集、缓释TGFα-Saporin药物的作用。
以载体本体为支架为例,由于载体本体通常在使用前需要经过清洗,以除去其表面的杂质,常用10%的氢氧化钠进行处理,经过处理的载体本体带负电荷。为了提高载体本体与药物层之间的连接力,防止药物涂层从载体本体上脱离,可以利用载体本体所带负电,将其浸泡于带正电的聚合物底物溶液中,则聚合物底物对载体粘结紧密,不易脱落。优选的,该聚合物底层为至少一层壳聚糖层或肝素层。壳聚糖是几丁质脱乙酰的产物,带正电荷,能作用于表皮细胞,促进创面上皮化。同时壳聚糖能和肝素、生长因子等结合形成聚电解质复合物而刺激细胞的生长。而肝素带负电,当聚合物底层为肝素层时为了提高载体支架的吸附力,需要将载体本体先浸入带正电的多聚赖氨酸溶液中,使其获得正电荷层,再浸入肝素溶液中,以获得肝素层。
显然通过上述分析可知,为了提高给药载体的疗效,可以在每层TGFα-Saporin药物层之间设置插设层。插设层可以为壳聚糖层重复插入两两相邻的TGFα-Saporin药物层之间。也可以为肝素层重复插入两两相邻的TGFα-Saporin药物层之间。还可以为一层肝素层或壳聚糖长,一层肝素层或壳聚糖层的交替插入两两相邻的TGFα-Saporin药物层之间。优选的插设层为壳聚糖层和肝素层交替插入两两相邻的TGFα-Saporin药物层之间。例如图2所示。该给药载体包括载体本体1、壳聚糖层4、肝素层3和TGFα-Saporin药物层2。壳聚糖层4包覆于载体本体1表面上,壳聚糖层4的外表面上包覆肝素层3,肝素层3的外表面上包覆TGFα-Saporin药物层2。可以以依次叠置的壳聚糖层4、TGFα-Saporin药物层2和肝素层3作为一个单元,重复多次后,可得到具有多个该单元结构的给药载体。
优选的含TGFα-Saporin的给药载体中TGFα-Saporin药物层数为14~16层,此时所得给药载体中药物的浓度和释放的时间曲线正好符合防治术后再狭窄的要求。能保证在药物释放完全之前,血管内上皮化完全,同时又不发生血管内再狭窄。最优选的为15层,此时药物释放效果最优。该14~16层TGFα-Saporin药物层可以通过常规方法获得,如喷涂一层TGFα-Saporin药物层后,待其干燥后,再喷涂第二次TGFα-Saporin药物层2,如此循环多次获得。或将载体本体1浸入TGFα-Saporin溶液中,拉出,干燥后重复多次浸入、拉出、干燥过程得到多层TGFα-Saporin药物层2。PLGA和明胶,壳聚糖一样也是药物缓释基质和高分子多聚物层,这些物质为具有生物可降解功能的高分子有机化合物。制备TGFα-Saporin药物层时可以根据常规方法选择是否需要在TGFα-Saporin药物层中加入PLGA。TGFα-Saporin溶液浓度为0.01~0.05mg/ml。
优选TGFα-Saporin药物溶液中可以加入如PLGA给予TGFα-Saporin药物层与层之间以更强粘结力。
具有多层TGFα-Saporin药物层2的给药载体的药物涂层结构可以如图3所示。含TGFα-Saporin的给药载体包括载体本体1,包覆于载体本体1表面的肝素层3,包覆于第一TGFα-Saporin药物层20上的壳聚糖层4,包覆于壳聚糖4外表面上的第二TGFα-Saporin药物层21。以此作为一个单元,可循环多次,以获得具有多层TGFα-Saporin药物层的给药载体。此时优选TGFα-Saporin药物层层数为14~16层,优选为15层。
以上给药载体在的载体可以为支架或球囊等常用血管给药系统。此处的支架材质可以为钛合金、钛、不锈钢等支架。
当载体本体为球囊时,球囊为一次给药,球囊表面可以依次包覆TGFα-Saporin药物层2和高分子多聚物层3即可。当然为了提高给药计量时,可以设置多层TGFα-Saporin药物层2或设置插设层和聚合物底层的等结构。球囊本体可以为常用球囊材料制成。也可以为高压球囊、低压球囊、顺应性球囊、非顺应性球囊、半顺应性球囊优选为PVC(聚氯乙烯)球囊、PE(交联聚乙烯)球囊、PET(聚对苯二甲酸乙二醇酯)和尼龙共聚物球囊或PET球囊。
本发明还提供了上述含TGFα-Saporin的给药载体中TGFα-Saporin药物的联结方法,包括以下步骤:
1)将TGFα溶液与联接剂溶液混合反应,得到衍化TGFα;
2)将Saporin溶液与还原剂混合反应,得到第一产物并将第一产物加入衍化TGFα中进行反应,得到第二产物。
3)将半胱氨酸溶液加入第二产物中钝化反应5~7小时,得到TGFα-Saporin药物。
以上步骤可以通过常规的SPDP(N-琥珀酰亚胺基3-[2-吡啶基二硫]丙酯)联接方法进行。还原剂包括SPDP反应中常用的还原剂。优选为DTT(二硫苏糖醇)或TCEP(三(2-羟乙基)膦)任一。更优选的为DTT。此时还原效果最优。
衍化反应中联接剂使TGFα中形成氨基。Saporin溶液与还原剂反应后使Saporin形成巯基。之后将衍化后的TGFα与还原后的Saporin混合后。TGFα上的氨基与Saporin上的巯基形成二硫键,从而将TGFα与Saporin连接,得到导向药物。
联接剂可以为常用联接剂如SMPT(4-琥珀酰亚胺基氧羰基-甲基-α[2-吡啶基二硫]甲苯)、SANPAH(N-琥珀酰亚胺6-[4’-叠氮基-2’-硝基苯基氨基]己酯)、SBAP(琥珀酰亚胺基3-[溴代乙酰基氨基]丙酯)、SIA(N-琥珀酰亚胺基碘代乙酯)、SIAB(N-琥珀酰亚胺基[4-碘代乙酰基]氨基苯甲酸酯)、SMCC(琥珀酰亚胺基4-[N-马来酰亚胺甲基]环己烷-1-羧化物)、SMPB(琥珀酰亚胺基4-[p-马来酰亚胺苯基]丁酸盐)、SM(PEG)n(包含N-羟基琥珀酰亚胺-(聚乙二醇)n-马来酰亚胺(NHS-(PEG)n-aleimide)形式,此处n代表2,4,6,8,12或24个聚乙二醇(PEG)单位)、SMPH(琥珀酰亚胺基-6-[(β-马来酰亚胺丙酰胺基)]己酯)、SPB(琥珀酰亚胺基-[4-(补骨脂素-8-氧基)]丁酸酯)、SPDP(N-琥珀酰亚胺基3-[2-吡啶基二硫]丙酯)、Sulfo-EGS(乙二醇双[硫代琥珀酰亚胺基 琥珀酸酯])、Sulfo-EMCS(N-[ε-马来酰亚胺乙酰基氧]硫代琥珀酰亚胺酯)、Sulfo-GMBS(N-[γ-马来酰亚胺丁酰氧]琥珀酰亚胺酯)、Sulfo-HSAB(N-羟基硫代琥珀酰亚胺基-4-叠氮基苯甲酸酯)、Sulfo-KMUS(N-[κ-马来酰亚胺十一酰氧]-硫代琥珀酰亚胺酯)、Sulfo-LC-SMPT(硫代琥珀酰亚胺基-6-[α-甲基-α-(2-吡啶基二硫)甲苯酰胺基]己酯)、Sulfo-LC-SPDP(硫代琥珀酰亚胺基6-[3’-(2-吡啶基二硫)-丙酰胺基]己酯)、Sulfo-MBS(1m-马来酰亚胺苯甲酰-N-羟基硫代琥珀酰亚胺酯)、Sulfo-NHS(N-羟基硫代琥珀酰亚胺)等。优选所用联接剂为SMPT。
反应中还原剂:Saporin按摩尔比100~1000:1混合反应。优选为500:1。提高还原剂的加入比例能使反应体系中的Saporin反应完全。由于还原剂是小分子物质,可通过后续提纯过滤除去,并不会对产物的纯度造成影响。反应终点为反应体系中还原剂的浓度为25~50mmol/L时,此时能保证溶液中的Saporin反应完全。优选的反应中还原剂选用DTT并以固体形式加入。
将衍化TGFα与第一产物混合后使得TGFα与Saporin联结,同时二者仍然具有各自的生物活性。为了提高产物中Saporin:TGFα分子比为1:2~3产物的量,优选的提高衍化TGFα的加入量。更优选的,第一产物按TGFα与Saporin摩尔比为2~4:1混合进行反应。最优选的衍化TGFα与第一产物按TGFα与Saporin摩尔比为2.5~4:1混合进行反应。按此比例混合进入反应时,产物中Saporin:TGFα分子比为1:2~3的产物量增多。具有该分子结构的导向药物量增多后,所得TGFα-Saporin药物的生物导向性得到增强,能更精准的作用于患处,提高产物的治疗准确性。同时按此比例进行反应还能较好的保存TGFα以及Saporin分子结构中具有生物活性的三维结构,从而提高产物的生物效价。当然这种看似简单的改变却能取得如此显著的效果,是在克服了常规导向反应过程中,提高反应物加入量会导致产物中副反应过多,副产物过度交联且难以洗脱的问题的基础上的。经过上述处理终产物经过一次过柱清洗即可得到纯度为95%以上的TGFα-Saporin药物。
所得第二产物为混合物,其中含有大量未形成二硫键的带有巯基和胺基的杂质。巯基和胺基的存在会增加药物的不稳定性,影响药效的发挥。单纯的过滤提纯,也不能将与TGFα-Saporin结构较接近的这些杂质除去。因而需对第二产物进行钝化处理。
向第二产物中加入半胱氨酸溶液搅拌反应5~7小时。半胱氨酸中含有巯基和胺基,可以封闭第二产物中未封闭形成二硫键的活性羧基基团,提高导向药物的稳定性。现有常用物质中虽然含有巯基和胺基物质很多,但很多此类物质均存在会改变TGFα构象、影响TGFα-Saporin进入细胞并在动物细胞内产生细胞毒性等影响药物发挥效果的问题,进而影响TGFα-Saporin的药效。为从浩如烟海的此类物质中找到即不影响TGFα-Saporin药效,又能起到钝化作用的物质,则需要进行创造性的劳动。优选半胱氨酸溶液的浓度为0.1~0.3mmol/L。按此浓度进行反应,对产物中二硫键钝化效果最优。
TGFα-Saporin药物制备方法以SMPT反应过程为例进行说明,首先将TGFα溶于硼酸缓冲液(pH=9)中。以二甲基甲酰胺作为溶剂溶解SMPT,将SMPT溶液加入TGFα溶液中,TGFα溶液与SMPT溶液按TGFα与SMPT摩尔比为1:0.9~1.2混合,优选为1:1。为了保证反应 过程中SMPT的溶解性二甲基甲酰胺的加入体积为反应体系10%(v/v)。在室温下搅拌反应0.5~1小时。经过纯化用磷酸-EDTA缓冲液平衡,得到衍化TGFα。
将Saporin溶于磷酸-EDTA缓冲液中,并与还原剂在室温下反应,以反应体系中还原剂的浓度为45~55mmol/L为反应终点。反应时间约20~40分钟后,过SephadexG25柱(Sephadex是交联葡聚糖凝胶,蛋白质纯化常用工具)纯化后,将所得蛋白峰直接加到已浓缩的衍化TGFα中。将反应物浓缩到10ml,然后在室温下通氮气情况下反应65~75小时,得到第二产物。
在室温下加入半胱氨酸,钝化第二产物中的TGFα-Saporin中剩余的活性二硫基团,得到TGFα-Saporin药物。
TGFα-Saporin经SephacrylS-200柱纯化,用0.05mol/L磷酸缓冲液平衡并洗脱。Explorer蛋白纯化系统紫外监测收集到的第一峰洗脱液,收集过柱液即为联结后经纯化的导向药物TGFα-Saporin。浓缩后置4℃冰箱中保存。
本发明另一方面还提供了一种上述含TGFα-Saporin的给药载体的制备方法,该方法包括以下步骤:将载体本体依序浸入药物溶液中,拉出干燥,得到含TGFα-Saporin的给药载体。
具体步骤为当含TGFα-Saporin的给药载体由TGFα-Saporin药物层和高分子多聚物层组成时,此时首先将载体本体浸入TGFα-Saporin药物溶液中,停留1~15分钟后,将该载体拉出,干燥所得载体。再将该干燥后的载体浸入高分子多聚物溶液中,浸泡1~15分钟,拉出,干燥所得载体即为含TGFα-Saporin的给药载体。显然,载体本体具体以何种顺序浸入哪种溶液中,可以根据前述含TGFα-Saporin的给药载体的药物涂层结构的所带电荷,选择相应药物层的药物溶液进行浸泡。也可以根据需要循环浸泡以提高给药载体的含药量以及达到稳定缓慢释放效果。
其中药物溶液包括TGFα-Saporin溶液和高分子聚合物溶液,TGFα-Saporin溶液和高分子聚合物溶液中含有PLGA(聚乳酸-羟基乙酸共聚物)。PLGA与人体具有较好的生物相容性而且为生物可降解物质。PLGA加入TGFα-Saporin溶液中能使TGFα-Saporin药物层中的TGFα-Saporin药物缓慢释放,延长药物释放时间,减少重复多次给药给患者带来的痛苦。PLGA还能防止TGFα-Saporin在制造、使用过程中TGFα-Saporin出现损失或以抑制平滑肌细胞再生药物为基质的药物层中加入PLGA后能使药物在支架植入人体后缓慢释放出来,并在数周时间内缓慢扩散到血管壁中及支架边界以外的区域,抑制平滑肌细胞再生,将有效抑制再狭窄的发生。
PLGA加入药物涂层的某一层中后,所形成的薄膜能控制药物缓慢释放。药物涂层厚度优选为11~500μm,单层药物涂层的厚度为5~50nm,根据单层药物涂层的厚度和总的涂层的厚度对所用药物涂层的层数进行调整。(单层厚度为5-50nm总厚度1-50μm,根据涂得层数)整个给药载体上携带的TGFα-Saporin药物密度为120μg/cm2。此时给药效果最优。
PLGA的加入量为按TGFα-Saporin:PLGA的摩尔比为1:9~11混合。在肝素层中,PLGA的加入量为肝素或壳聚糖:PLGA的摩尔质量为5%。按此比例加入PLGA后,给药载体中药物体外模拟试验中,药物释放开始后3天内药物浓度达到峰值。之后3~30天药物浓度可持 续处于低浓度,进入药物平缓期,延长了药物作用时间。给药载体制备的过程中通过控制药物涂层中各层的厚度来控制包覆于给药载体上的药物的量。主要控制对象为TGFα-Saporin和肝素的量。
药物溶液采用相应的对人体无害,易于分解吸收的溶剂,可以为常用的支架或球囊制备过程中常用的溶剂。
优选的,给药载体的制备方法还包括对干燥后表面包覆药物的给药载体整体进行紫外光照射,紫外线可强化药物涂层分子间的交联,以使载体表面药物涂层各层之间被激发产生自由基反应,发生分子内或分子间交联,提高药物涂层的稳定性和释放效果同时使得所得给药涂层外表面更稳定、表面更光滑,便于内皮细胞覆盖。优选紫外照射条件为用波长为254nm的紫外灯距离给药载体20cm照射1~5小时。
优选的,该方法包括预处理步骤:对载体本体进行清洗,可以为碱洗或酸洗,根据具体所用支架材质的特性进行选择,经过预处理后,金属支架表面形成多孔结构并带式负电荷层。便于后续处理过程中支架表面易于留存相应物质。提高相应层与支架表面的结合力。优选的清洗载体本体的方法包括将载体本体浸泡于强碱或强酸溶液中后,清洗,超声清洗,干燥。
当载体为球囊时,可以按以下方法制备:
1)称取1份PLGA加入70份的丙酮中溶解,在室温条件下,用振动培养器振摇至溶解并分散均匀后,同时加入1份TGFα-Saporin,配制成药物球囊涂层溶液;
2)将上述涂层溶液涂覆在球囊囊体表面,球囊压力保持在1.2Psi,高纯氮气同步固化,直到载药量达到200-400μg/cm2;可降解药物涂层设置在球囊体两侧孔之间,即球囊横截面直径最大的工作段,球囊工作段的两端设置球囊标记带,长度为1mm;
3)带有涂层的球囊囊体置于真空干燥箱中干燥12小时,干燥条件为:真空度为-0.2Mpa、温度为18℃;
4)将上述经表面处理后的支架浸泡在0.1%肝素钠水溶液中,干燥箱中氮气吹干,得到表面涂覆有TGFα-Saporin的球囊。
具体所用方法与CN103316382A中公开的球囊制作方法相同,区别在于本发明中负载药物为TGFα-Saporin。所得球囊可以按常规方法使用。
实施例
静电喷涂装置是利用电压使聚合物溶液形成细小雾滴,并在强电场力作用下吸附在基体表面,得到均匀光滑药物涂层的一种常见装置。
以下实施例中所用溶液的溶剂均为生物可降解无毒无害的溶剂,如乙醇、水等。
以下实施例中紫外光照射条件为紫外线交联胶原膜的方法是将胶原覆盖的支架,用波长为254nm的紫外灯距离给药载体20cm照射1~5小时。
TGFα-Saporin药物制备方法实施例
实施例1
衍化的TGFα制备方法
1)TGFα20mg溶于2.67ml硼酸缓冲液中。加267ul溶于二甲基甲酰胺的SMPT(0.48mg/m1),使SMPT与TGFα摩尔比过量2.5倍,为了保持SMPT的溶解性,反应体系中二甲基甲酰胺的量在10%(V/V),室温下搅拌1小时,得到第一衍化的TGFα。
2)第一衍化TGFα过SephadexG25柱(30*1.5cm)后用磷酸-EDTA缓冲液平衡,收集第一流出峰,通过吹氮气干燥浓缩或者通过分子筛过滤浓缩,得到纯化后的衍化TGFα。
活化Saporin的第一产物制备方法
10mgSaporin溶于7ml磷酸-EDTA缓冲液中,与固体TCEP在室温下反应,反应终点为反应体系中DTT浓度为50mmol/L时,约为30分钟,得到第一产物。
TGFα-Saporin药物制备方法
1)将第一产物过SephadexG25柱,将从柱上流出的蛋白峰加入已衍化TGFα中,按TGFα与Saporin摩尔比为2:1混合。分子筛过滤浓缩所得产物至10ml,然后在室温下通氮气情况下搅拌反应65~75小时,得到第二产物。
2)将0.1mmol/L半胱氨酸溶液加入第二产物中,在室温下搅拌反应5~7小时,钝化第二产物得到TGFα-Saporin药物。
3)TGFα-Saporin药物在SephacrylS-200柱(90*2.2cm)上纯化,用0.05mol/L磷酸缓冲液平衡并洗脱。Explorer蛋白纯化系统紫外监测收集第一峰洗脱液,并收集过柱液并在吹氮气环境下干燥浓缩,得到纯化后的TGFα-Saporin药物并保持在4℃的冰箱中。
实施例2
衍化的TGFα制备方法
1)TGFα20mg溶于2.67ml硼酸缓冲液中。加267ul溶于二甲基甲酰胺的SMPT(0.48mg/ml),使SMPT与TGFα摩尔比过量2.5倍,为了保持SMPT的溶解性,反应体系中二甲基甲酰胺的量在10%(V/V),室温下搅拌1小时,得到第一衍化的TGFα。
2)第一衍化TGFα过SephadexG25柱(30*1.5cm)后用磷酸-EDTA缓冲液平衡,收集第一流出峰,通过吹氮气干燥浓缩或者通过分子筛过滤浓缩,得到纯化后的衍化TGFα。
活化Saporin的第一产物制备方法
10mgSaporin溶于7ml磷酸-EDTA缓冲液中,与固体DTT在室温下反应,反应终点为反应体系中DTT浓度为50mmol/L时,约为30分钟,得到第一产物。
TGFα-Saporin药物制备方法
1)将第一产物过SephadexG25柱,将从柱上流出的蛋白峰加入已衍化TGFα中,按TGFα与Saporin摩尔比为4:1。分子筛过滤浓缩所得产物至10ml,然后在室温下通氮气情况下搅拌反应65~75小时,得到第二产物。
2)将0.3mmol/L半胱氨酸溶液加入第二产物中,在室温下搅拌反应5~7小时,钝化第二产物得到TGFα-Saporin药物。
3)TGFα-Saporin药物在SephacrylS-200柱(90*2.2cm)上纯化,用0.05mol/L磷酸缓冲液平衡并洗脱。Explorer蛋白纯化系统紫外监测收集第一峰洗脱液,并收集过柱液并在吹氮气环境下干燥浓缩,得到纯化后的TGFα-Saporin药物并保持在4℃的冰箱中。
实施例3
衍化的TGFα制备方法
1)TGFα20mg溶于2.67ml硼酸缓冲液中。加267ul溶于二甲基甲酰胺的SMPT(0.48mg/ml),使SMPT与TGFα摩尔比过量2.5倍,为了保持SMPT的溶解性,反应体系中二甲基甲酰胺的量在10%(V/V),室温下搅拌1小时,得到第一衍化的TGFα。
2)第一衍化TGFα过SephadexG25柱(30*1.5cm)后用磷酸-EDTA缓冲液平衡,收集第一流出峰,通过吹氮气干燥浓缩或者通过分子筛过滤浓缩,得到纯化后的衍化TGFα。
活化Saporin的第一产物制备方法
10mgSaporin溶于7ml磷酸-EDTA缓冲液中,与50mmol/LDTT在室温下反应30分钟,得到第一产物。
TGFα-Saporin药物制备方法
1)将第一产物过SephadexG25柱,将从柱上流出的蛋白峰加入已衍化TGFα中,按TGFα与Saporin摩尔比为2.5:1混合。分子筛过滤浓缩所得产物至10ml,然后在室温下通氮气情况下搅拌反应65~75小时,得到第二产物。
2)将0.15mmol/L半胱氨酸溶液加入第二产物中,在室温下搅拌反应5~7小时,钝化第二产物得到TGFα-Saporin药物。
3)TGFα-Saporin药物在SephacrylS-200柱(90*2.2cm)上纯化,用0.05mol/L磷酸缓冲液平衡并洗脱。Explorer蛋白纯化系统紫外监测收集第一峰洗脱液,并收集过柱液并在吹氮气环境下干燥浓缩,得到纯化后的TGFα-Saporin药物并保持在4℃的冰箱中。
实施例4
衍化的TGFα制备方法
1)TGFα20mg溶于2.67ml硼酸缓冲液中。加267ul溶于二甲基甲酰胺的SMPT(0.48mg/ml),使SMPT与TGFα摩尔比过量2.5倍,为了保持SMPT的溶解性,反应体系中二甲基甲酰胺的量在10%(V/V),室温下搅拌1小时,得到第一衍化的TGFα。
2)第一衍化TGFα过SephadexG25柱(30*1.5cm)后用磷酸-EDTA缓冲液平衡,收集第一流出峰,通过吹氮气干燥浓缩或者通过分子筛过滤浓缩,得到纯化后的衍化TGFα。
活化Saporin的第一产物制备方法
10mgSaporin溶于7ml磷酸-EDTA缓冲液中,与将固体DTT加入Saporin溶液中,在室温下反应,反应终点为反应体系中DTT浓度为50mmol/L时)得到第一产物。
TGFα-Saporin药物制备方法
1)将第一产物过SephadexG25柱,将从柱上流出的蛋白峰加入已衍化TGFα中,按TGFα与Saporin摩尔比为3:1混合。分子筛过滤浓缩所得产物至10ml,然后在室温下通氮气情况下搅拌反应65~75小时,得到第二产物。
2)将0.2mmol/L半胱氨酸溶液加入第二产物中,在室温下搅拌反应5~7小时,钝化第二产物得到TGFα-Saporin药物。
3)TGFα-Saporin药物在SephacrylS-200柱(90*2.2cm)上纯化,用0.05mol/L磷酸缓冲液平衡并洗脱。Explorer蛋白纯化系统紫外监测收集第一峰洗脱液,并收集过柱液并在吹氮气环境下干燥浓缩,得到纯化后的TGFα-Saporin药物并保持在4℃的冰箱中。
含TGFα-Saporin药物的给药载体的制备方法实施例
实施例5
取镍钛合金支架浸泡在60℃、20%NaOH溶液中浸泡24小时,充分清洗,再用双蒸水中超声清洗,室温干燥;将PLGA溶解得到PLGA溶液(该溶液浓度为25/75(mol/mol))(摩尔数比为5%),将TGFα-SAP(与PLGA按摩尔数比例为1:9~11混合于(与PLGA的摩尔数比例为1:9~11)PLGA溶液中,充分搅拌。用浸涂提拉法将支架浸入该溶液中,匀速拉出,然后放入真空干燥箱内室温下干燥直至溶剂完全挥发。此条件下制得载TGFα-SAP药物层。利用静电喷涂装置将PLGA与肝素的混合溶液(采用肝素钠作为肝素,肝素钠的加入量为溶液总体积的2%;每个支架上肝素的质量为0.35-0.50μg)(2%肝素钠;总量0.35-0.50μg肝素/支架)雾化喷出,在涂覆载TGFα-SAP药物层的镍钛合金支架表面形成载肝素层,溶剂自然挥发。然后放入真空干燥箱内室温下干燥直至溶剂完全挥发,制得含TGFα-Saporin药物的镍钛合金支架。药物涂层厚度18μm。该方法便于控制所得支架上药物的含量,防止包覆过多的药物,使得所得支架上药物的浓度和释放的时间曲线正好符合治疗的要求。
实施例6
取3.0mm×20.0mm国产铂-铱合金支架浸泡在60℃、20%NaOH溶液中浸泡24小时,充分清洗,再用双蒸水中超声清洗,室温干燥。取多聚赖氨酸溶解于PBS(磷酸盐缓冲液)中,得到pH=7.2、质量浓度2.5g/L的聚阳离子溶液。将上述经NaOH表面处理后的合金裸支架浸泡在多聚赖氨酸溶液中30分钟,取出备用。
取肝素溶解于双蒸水中,制备成pH=4,质量浓度5g/L的聚阴离子溶液。将壳聚糖溶解于体积分数1%的醋酸溶液中,制备成pH=4,质量浓度5g/L的聚阳离子溶液。(以下实施例中所用壳聚糖溶液和肝素钠溶液均按此制备)取实施例1中制得的TGFα-SAP药物溶解于乙醇中制成浓度为0.01mg/ml的溶液。
将浸泡过氢氧化钠溶液的合金裸支架分别依次浸泡在肝素溶液,TGFα-SAP乙醇溶液,壳聚糖溶液和TGFα-SAP乙醇溶液中,浸泡时间分别为15分钟,1分钟,15分钟,1分钟,每次浸泡结束后均对包覆药物层的支架进行干燥;以此作为一个单元,重复多次该单元,重复进行15次该单元。最后将所得支架浸入肝素钠溶液中得到肝素钠层作为高分子聚合物层,得到含TGFα-Saporin药物的药物涂层。
实施例7
合金裸支架依次浸入壳聚糖溶液(聚阳离子)15分钟,肝素溶液(聚阴离子)15分钟和TGFα-SAP溶液中10分钟,每次浸泡完毕后均需对支架进行干燥。最后利用静电喷涂装置将PLGA与肝素的混合溶液雾化喷出至所得支架表面。待支架表面该涂层中的溶剂自然挥发后,放入真空干燥箱内室温下干燥直至溶剂挥发完全。再经紫外线照射后激发支架表面药物涂层产生自由基反应,使药物涂层发生分子内或分子间交联。制得含TGFα-Saporin药物的药物涂层镍钛合金支架。
实施例8
取3.0mm×20.0mm国产合金支架浸泡在60℃、20%NaOH溶液中浸泡24小时,充分清洗,再用双蒸水中超声清洗,室温干燥(带负电荷);将壳聚糖溶解于体积分数1%醋酸中,制备成相同pH值和浓度的的聚阳离子溶液。将上述经NaOH表面处理后的合金裸支架浸泡壳聚糖聚阳离子溶液中,氮气吹干。再取肝素钠溶解于双蒸水中,制备成pH=4,质量浓度5g/L的聚阴离子溶液。吹干的支架再浸泡肝素钠聚阴离子溶液中,然后氮气吹干。最后将支架浸泡在TGFα-SAP液中,反应时间分别为15,15,1min,每次浸泡完毕后对所得支架进行干燥,以此作为一个单元,并重复15次该单元制备操作。将所得支架表面包覆肝素钠层。将所得支架置于紫外线下经过照射1小时后照射后激发支架药物涂层产生自由基反应,使药物涂层发生分子内或分子间交联。制得含TGFα-Saporin药物的药物涂层合金支架。
实施例9
1)将TGFα-Saporin药物包覆至球囊本体1的外表面。TGFα-Saporin药物包覆方法按公开号为CN103316382A的中国发明专利公开文本中记载的球囊涂层制备方法进行,将该文献中公开的方法中所用紫杉醇置换为TGFα-Saporin药物;
2)将包覆有TGFα-Saporin药物层2的球囊的TGFα-Saporin药物层2外侧包覆高分子多聚物层。高分子多聚物层按公开号为CN103316382A的中国发明专利公开文本中记载的球囊涂层制备方法进行,将该文献中公开的方法中所用紫杉醇置换为肝素钙。即可制得本发明提供的血管内涂层球囊。
含TGFα-Saporin药物的给药载体的实施例
实施例10
如图1所示,在载体本体1表面包覆TGFα-Saporin药物层2和高分子多聚物层3,得到含TGFα-Saporin药物的给药载体。
实施例11
具体实施例如图2所示。该给药载体包括载体本体1、壳聚糖层4、肝素层3和TGFα-Saporin药物层2。壳聚糖层4包覆于载体本体1表面上,壳聚糖层4的外表面上包覆肝素层3,肝素层3的外表面上包覆TGFα-Saporin药物层2。可以以此作为一个单元,重复多次后,药物涂层支架的涂层中含有16层TGFα-Saporin药物层后,得到含TGFα-Saporin药物的给药载体。
实施例12
如图3所示结构,给药载体包括载体本体1、壳聚糖层4、肝素层3和TGFα-Saporin药物层2。壳聚糖层4包覆于载体本体1表面上,壳聚糖层4的外表面上包覆肝素层3,肝素层3的外表面上包覆TGFα-Saporin药物层2。将壳聚糖层4、肝素层3和TGFα-Saporin药物层2的重复作为一个单元,重复多次后,涂层支架的药物涂层中含有14层TGFα-Saporin药物层后,得到含TGFα-Saporin药物的给药载体。
TGFα-Saporin药物疗效动物实验
1.平滑肌细胞的培养与鉴定
平滑肌细胞的培养与鉴定按周晓莉,雷寒,柳青等发表于《重庆医学》,2005年06期的《血管平滑肌细胞的培养及鉴定》(血管平滑肌细胞的培养及鉴定周晓莉,雷寒,柳青重庆医学,2005年06期)论文中的方法进行。
2.TGFα-SAP对培养的SMCs增殖率的影响
2.1实验材料
2.1.1主要试剂TGFα-SAP(以乙醇为溶剂制得浓度为10-6mol/L的溶液)、SAP(10-2mol/L)、其余试剂同述论文。
2.1.2主要仪器96孔培养板(GBIC0公司),细胞计数板(国产),其余细胞培养仪器同前。
2.2实验方法
选用生长良好的第4代SMCs悬液,调整细胞密度为1×105个/ml,接种于96孔培养板(直径6.4mm),以含10%胎牛血清DMEM培养液培养24小时,使细胞生长处于增殖期,然后换成含TGFα-SAP(10-7mol/L)、SAP(10-3mol/L)及空白的10%胎牛血清DMEM培养液,共分3组,每组种植20孔,于24小时后收样计算细胞数,每孔计算3次。
2.3统计学处理
结果以X±S表示,两组资料之间的比较采用Student'st检验,p<0.05有显著性意义。
2.4结果
SMCs在含血清培养液中培养24小时后,换成含TGFα-SAP(10-7mol/L)、SAP(10-3mol/L)及空白培养液的10%胎牛血清,分别于1天后收集样本计数,结果列于图4~图6中。由图4~6可知,TGFα-SAP组、SAP组和对照组细胞计数分别为1.64×106、3.27×106、3.64×106个/ml。TGFα-SAP组和SAP组SMCs增殖率分别是对照组的45.1%和89.7%。由图7~8可见TGFα-SAP组能有效抑制细胞增殖,这表明TGFα-SAP(10-7mol/L)可明显抑制SMCs增殖,而高浓度的SAP(10-3mol/L)却不能抑制SMCs的增殖,与TGFα-SAP组之间有显著性差异(p<0.05)。
3.TGFα-SAP对培养的平滑肌细胞的DNA合成的影响
3.1.实验材料
3.1.1主要试剂:3H-TdR为中国原子能科学研究院产品(3H-TdR放射性比活度为28Ci/mmo l)、TGFα-SAP(10-6mol/L)、SAP(10-2mol/L),其余试剂同前。
3.1.2主要仪器液体闪烁分析仪(LKB1209),真空泵(国产),其余仪器同前。
3.2实验方法
选用生长良好的第4代SMCs悬液,调整细胞密度为5×105个/ml,接种于96孔培养板,每孔50μl。以含10%胎牛血清的DMEM培养液培养24小时后,使细胞生长处于增殖期,然后换成含不同浓度TGFα-SAP及SAP的10%胎牛血清DMEM培养液,共分4组,培养液中TGFα-SAP终浓度分别为10-7mol/L和10-9mol/L,SAP为10-3mol/L,以空白一组作为对照组,每组设20孔,相应两孔平均并作一例。37℃、5%CO2培养48小时后弃去培养液,每孔加入3H-TdR使终浓度为1μCi/ml,继续培养48小时后用Hanks液洗两次,最后以0.25%胰蛋白酶消化,0.45mm微孔滤膜负压抽滤,生理盐水和10%三氯醋酸冲洗滤膜,滤膜烘干后置入门烁杯中,加入PPO/POPOP/二甲苯闪烁液4ml,静置过夜后在液体闪烁计数仪上测定细胞3H-TdR放射活度。
3.3统计学处理
结果以X±S表示,两组资料之间的比较采用Student'st检验,p<0.05有显著性意义。
3.4结果
TGFα-SAP对培养的SMCs3H-TdR掺入量的影响见图9。结果显示,TGFα-SAP可明显抑制SMCs增殖,而当SAP的浓度增高到10-3mol/L时都未明显抑制SMCs增殖,与高低浓度的TGFα-SAP组(浓度分别为10-7mol/L和10-9mol/L)之间都存在显著性差异(p值分别为0.00013和0.039)。TGFα-SAP浓度稀释到10-9mol/L时仍有明显抑制SMCs增殖的效果(与对照组比较p=0.0017),同时,在抗SMCs增殖的作用上,高低浓度的TGFα-SAP两组之间并无显著性差异(p=0.1348)。提示:TGFα-SAP不仅能使SMCs的DNA合成明显降低,而且在较低浓度下 也能起到与高浓度相似的细胞毒性作用;但同样浓度,甚至更高浓度的SAP(10-3mol/L)却对SMCs的DNA合成没有影响。
4.TGFα-SAP与FGF-SAP对SMCs的细胞毒性比较
4.1实验材料、
4.1.1主要试剂及仪器:同前。
4.1.2实验方法
选用生长良好的第4代SMCs悬液,调整细胞密度为5×105个/ml,接种于96孔培养板,每孔50ul。以含10%胎牛血清的DMEM培养液培养24小时后,使细胞生长处于增殖期,然后换成含相同浓度TGFα-SAP及FGF-SAP(以同样方法联结提纯)的DMEM培养液(含10%胎牛血清),共分2组,培养液中TGFα-SAP终浓度均为10-9mol/L,设只含胎牛血清的一组作为对照组,每组设20孔,对应两孔平均算作一例。37℃、5%CO2培养箱中培养24小时后弃去培养液,每孔加入3H-TdR使终浓度为1μCi/ml,继续培养48小时用Hanks液洗两次,最后以0.25%胰蛋白酶消化细胞。负压抽滤后,用生理盐水和10%三氯醋酸冲洗滤膜,滤膜烘干后置入闪烁杯中,加入PPO/POPOP/二甲苯闪烁液4ml,静置过夜后在液体闪烁计数仪上测定细胞3H-TdR放射活度。
4.3.3统计学处理
结果以X±S表示,两组资料之间的比较采用Student'st检验,p<0.05有显著性意义。
4.3.4结果
TGFα-SAP和FGF-SAP对培养的SMCs3H-TdR掺入量的影响见图10。结果显示,TGFα-SAP可明显抑制了SMCs增殖及DNA合成,3H-TdR掺入量较对照组减少33.6%(p=0.0017),而同样浓度的FGF-SAP却无明显抑制SMCsDNA合成的作用,与对照组比较3H-TdR掺入量无显著性差异(P=0.34),与TGFα-SAP组之间存在显著性差异(p=0.009)。这提示在低浓度下,TGFα-SAP较FGF-SAP能更明显地抑制SMCs的DNA合成,而在同样浓度下的FGF-SAP却对SMCs的DNA合成没有明显影响。
TGFα-SAP药物动物实验
1.实验材料
1.1实验动物Sprague-Dawle大鼠64只,体重500-600g,雄性,由中山医科大学实验动物中心提供。
1.2主要试剂戊巴比妥钠(为国产),PCNA抗血清(DAKO公司),青霉素,链霉素,肝素,其余试剂(均同第一、第二部分)。
1.3主要仪器普通手术器械和动脉夹均为国产,PTCA导引钢丝(直径0.014英寸,长度175cm)、普通PTCA球囊导管(导管直径1.2mm,球囊直径2.5mm,长度20mm)和PTCA压力泵均为 美国USCI公司产品),透射电子显微镜(日立H-600),显微图像分析仪(EMAIL),细胞凋亡试剂盒(德国BochringerNannheim公司产品)、伊文氏蓝(EvensBlueDye,Sigma公司)
2.实验方法
2.1动物分组与实验处理
64只Sprague-Dawle大鼠分笼饲养,按照完全随机的方法分为治疗组和对照组各32只。每组动物再按照取材时间随机分成4个亚组:术后1天、3天、9天、28天,每个亚组各8只。(1)对照组:仅做右颈总动脉球囊扩张术,在术后局部注射生理盐水0.05ml(2)治疗组:做右颈总动脉球囊扩张术并在术后局部注射TGFα-SAP0.05ml,每组动物分别于术后1天、3天、9天、28天用过量戊巴比妥钠处死,立即取出左右颈总动脉标本,置10%中性甲醛固定。
2.2动物模型制备
动物饲养2周后,行右侧颈总动脉球囊扩张术。用戊巴比妥钠(40-50mg/kg)腹腔注射麻醉后,固定在动物专用固定架上;在颈前作一正中切口,钝性分离左右颈总动脉,结扎远侧段,近端线拉阻断血流。在两线间靠剪一小口,缓慢逆行插入PTCA球囊导管(导管直径1.2mm,球囊直径2.5mm,长度20mm),插入深度为5cm。向球囊内注入肝素生理盐水0.2ml使其膨胀,并维持压力为3大气压,缓慢回拉导管平切口处,抽出球囊内液体,使压力降为零。重复上述过程三次,退出导管,在结扎动脉前,局部注射TGFα-SAP0.05ml或生理盐水0.05ml,近侧段用血管夹夹闭保留半小时后松开血管夹,缝合切口,给予青霉素20万单位肌注以预防感染。
3.观察指标
按范长青;田野;杨巍等发表于中国实用内科杂志,2004年02期的《冠状动脉不稳定斑块中平滑肌细胞和炎性细胞PCNA阳性及TUNEL阳性细胞分布特点》文献中的方法进行观察。
结果
1.细胞增殖活性检测
显微镜下观察可见:PCNA表达阳性的细胞的胞核中存在棕黄色染物质。在显微图像分析仪上计算PCNA的阳性细胞数(P)及观察细胞总数(A),并算出PCNA阳性细胞百分率(P/A,%)。术后第1天可见实验组PCNA阳性细胞百分率明显低于对照组(分别为9.1±6.5vs34.1±6.0,p=0.001,见图11),仅为对照组的26.6%。到第9天后,对照组的增殖率明显下降,实验组和对照组两组间差异已不明显(分别为15.0±12.9vs11.7±3.0,p=0.247)。术后第28天时我们发现实验组和对照组细胞增殖率进一步降低,而且还可以见到:同一标本上,在原来增殖最活跃的区域(新生内膜近腔面),更多的细胞发生了凋亡,而在中膜和远离腔面的细胞则基本恢复了静止状态,很少见到PCNA的阳性细胞参见图12)。由图12可见实验组1~28天损伤血管(20×,TUNEL染色),中膜可见大量棕染TUNEL阳性细胞。
2.细胞凋亡检测
在光学显微镜(20×)下分别对血管中膜和内膜凋亡细胞(TUNEL阳性细胞)进行记数。每张切片记数200个以上的细胞,每个标本观察4张切片,取其平均值。细胞凋亡指数(apoptosisindex)=凋亡细胞数/记数细胞总数×100%。镜下可见凋亡细胞的细胞核呈棕黄色,均匀致密。术后第1天和第9天凋亡指数在实验组和对照组两组间无显著性差异,但第1天实验组比对照组细胞凋亡指数略高(分别为60.1±9.8vs53.2±10.3,p=0.134),而术后第28天则可看到对照组细胞凋亡指数比实验组更高一些(分别为20.3±2.8vs14.0±5.1,p=0.022,见图12)。
3.透射电镜观察结果:
由透射电镜可看到:在术后第3天,对照组增生的内膜中近腔面的SMC就主要表现为合成表型:胞浆内细胞器增多,可见大量的线粒体、粗面内质网、溶酶体和高尔基体等,而肌丝却明显减少。同时在对照组增生内膜中地平滑肌细胞之间还可看到较多的胶原纤维堆积。一直到术后2个月,在对照组增生内膜中仍可见合成表型的平滑肌细胞内有大量的线粒体、溶酶体增生。相反,实验组内膜的SMC主要为收缩表型,胞浆中细胞器少,而存在大量的肌丝,在细胞之间只见到少量的胶原纤维。同时在实验组术后第9天的电镜标本中我们还可见到损伤的内膜已经有内皮细胞覆盖(见图13)。由图13可见实验组术后2月损伤血管标本电镜下观察可见平滑肌细胞主要呈收缩表型,细胞浆内只有少量细胞器,但存在大量肌丝。细胞之间很少见到弹性纤维等细胞间质。
由以上细胞试验和动物试验可知,按本发明提供的方法制得的TGFα-SAP具有选择性抑制细胞增生同时促进损伤细胞上皮化的作用,能有效防止血管内再狭窄的发生。
以下以涂层支架为例对其疗效进行研究。涂层支架的药物体外释放效果测试按慈洪丽,姜启凤,廉雪飞,发表于《技术与方法》2013年第01期第390页的《药物支架体外释放测试方法(流通池法)研究报告》中提到的方法进行研究。
本发明提供的药物支架的TGFα-SAP涂层支架药物释放曲线如图14所示:当TGFα-Saporin药物层含药为30%,高分子多聚物层厚度为5.0μm时,涂层支架药物释放曲线显示,药物在34天左右释放完全,达到94%。说明按本发明提供的支架用于人体后药物释放速度缓慢能延长药物在体内的作用时间,延长药效的发挥。
本发明提供的药物涂层支架的动物试验条件按杨巍,葛均波,刘红玲,安毅,刘学波,田野,曲秀芬,李为民,黄永麟发表于《中华心血管病杂志》2006年1月34卷第1期14~18页的《三氧化二砷洗脱支架防治兔血管损伤后再狭窄的实验研究》的方法进行。
本发明提供的药物涂层支架的动物试验结果:
1.体重变化
在大鼠颈总动脉植入药物涂层支架,观察植入前后体重变化,结果显示支架植入组大鼠体重变化与对照组比较未显示出明显差异。支架植入组和对照组动物实验前后体重变化两组比较P>0.05。说明本发明提供的支架并不会影响实验动物的体重。
2.肝功能损害观察
支架植入组和对照组动物都在第1,3,9天处死前抽血测定血中谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、总胆红素(TBIL)、直接胆红素(DBIL)。将所得结果列于表1中。
表1支架植入组和对照组实验后血浆肝功能比较(mmol/L,n=8)
由表1可见,对照组和支架组各项肝功能相差较小,说明本发明提供的支架用于动物体是并不会造成肝损伤。
在第28天天处死动物并取肝组织行病理检查,本发明提供的药物涂层支架动物试验结果如图15所示,图15为药物涂层支架植入组术后28天肝组织病理切片,结果显示光镜下支架植入组和对照组肝组织都无明显浊肿变性及空泡变,亦无气球样变和变性坏死表现。提示TGF-SAP并没有引起肝组织损伤的有关病理改变。说明使用本发明提供的药物载体后,不但能起到治疗效果,而且不存在对机体的毒副作用。
3.药物涂层支架的抗内膜增生作用:
在大鼠颈总动脉植入药物涂层支架,观察不同时间点血管内膜增生和管腔狭窄的明显差异。使用药物涂层支架组和空白对照组的病理形态学结果列于表2中。使用药物涂层支架的实验组和空白对照组的损伤血管和正常血管中膜细胞密度结果列于表3中。使用药物涂层支架的实验组和空白对照组对侧颈动脉正常血管相关指标结果列于表4中。
表2实验组和对照组病理形态学结果的比较
注:实验组与对照组相比,*表示p<0.05;表示p<0.01。
表3实验组和对照组损伤血管和正常血管中膜细胞密度的比较
注:实验组与对照组相比,*表示p<0.05;实验组与正常血管组相比,表示p<0.05。
表4实验组和对照组对侧颈动脉正常血管相关指标比较
由表2所得结果可知,使用药物涂层支架后28天时管腔狭窄程度仅为17.6%,而未使用药物支架的空白对照组中管腔狭窄程度达到75.2%。说明本发明提供的载有TGFα-Saporin的给药支架能有效抑制术后血管再狭窄的发生。
在表3中,使用药物涂层支架后28天时中膜细胞密度为446.9±328.3而空白对照组中的中膜细胞密度为699.9±344.2远高于正常血管的417.2±100.3。说明使用本发明提供的载有TGFα-Saporin的给药支架后术后血管的中膜细胞密度基本接近于正常细胞的水平,说明该支架有利于促进术后血管挥发正常,而不发生过度增殖。
由表2~4综合可知,使用本发明提供的含TGFα-Saporin的给药载体能选择性抑制平滑肌 细胞增殖和促进损伤血管内皮化,减少术后再狭窄的发生,有利于机体回复到正常水平。
以上仅为本发明的优选实施例而已,并不用于限制本发明,对于本领域的技术人员来说,本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内,所作的任何修改、等同替换、改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (12)
1.一种含TGFα-Saporin的给药载体,包括载体本体和药物涂层,所述药物涂层包覆于所述载体本体表面上,其特征在于,所述药物涂层包括:包覆于所述载体本体表面上的至少一层TGFα-Saporin药物层和包覆于所述TGFα-Saporin药物层最外层的至少一层高分子多聚物层。
2.根据权利要求1所述的载体,其特征在于,所述高分子多聚物层为壳聚糖层、PLGA、明胶层或肝素层,优选的所述高分子多聚物层为肝素层。
3.根据权利要求1或2所述的载体,其特征在于,所述药物涂层还包括设置在最内层所述TGFα-Saporin药物层与所述载体本体表面之间的至少一层聚合物底层,优选所述聚合物底层为壳聚糖层或肝素层。
4.根据权利要求3所述的载体,其特征在于,所述药物涂层中包括多层所述TGFα-Saporin药物层时,任意相邻两层TGFα-Saporin药物层之间设置有插设层,所述插设层为壳聚糖插设层或肝素插设层,或者所述插设层同时包括壳聚糖插设层和肝素层插设时,且所述壳聚糖插设层和肝素插设层交替设置在多层所述TGFα-Saporin药物层之间。
5.根据权利要求1~3中任一项所述的载体,其特征在于,所述药物涂层中所述TGFα-Saporin药物的层数为14~16层。
6.根据权利要求5述的载体,其特征在于,所述TGFα-Saporin药物层数为15层。
7.根据权利要求1所述的载体,其特征在于,所述TGFα-Saporin药物的联结方法包括以下步骤:
1)将TGFα溶液与联接剂溶液混合反应,得到衍化TGFα;
2)将Saporin溶液与还原剂混合反应,得到第一产物并将所述第一产物加入所述衍化TGFα中进行反应,得到第二产物;
3)将半胱氨酸溶液加入所述第二产物中钝化反应5~7小时,得到所述TGFα-Saporin药物;优选所述半胱氨酸溶液浓度为0.1~0.3mmol/L。
8.根据权利要求7所述的载体,其特征在于,所述衍化TGFα与所述第一产物按TGFα与Saporin摩尔比为2~4:1混合进行反应。
9.根据权利要求8所述的载体,其特征在于,所述衍化TGFα与所述第一产物按TGFα与Saporin摩尔比为2.5~4:1混合进行反应。
10.一种权利要求1~9中任一项所述的含TGFα-Saporin的给药载体的制备方法,其特征在于,包括以下步骤:
1)将所述载体本体至少一次浸入到TGFα-Saporin药物溶液中,形成表面包覆有至少一层TGFα-Saporin药物层的载体中间体;
2)将所述载体中间体至少一次浸入到高分子多聚物溶液中,在所述TGFα-Saporin药物层上形成至少一层高分子多聚物层,形成所述血管内给药载体。
所述高分子多聚物溶液包括明胶溶液、PLGA溶液、壳聚糖溶液或肝素溶液。
11.根据权利要求10所述的方法,其特征在于,还包括在所述步骤2)后对所述给药载体进行后处理步骤,所述后处理步骤包括对所述给药载体照射紫外线;所述TGFα-Saporin药物溶液和所述高分子多聚物溶液中均含有PLGA。
12.根据权利要求11所述的方法,其特征在于,所述PLGA加入所述TGFα-Saporin溶液中时所述PLGA的加入量为按TGFα-Saporin:PLGA的摩尔比为1:9~11加入;
所述PLGA的加入所述高分子多聚物溶液中时所述PLGA的加入量为按所述高分子多聚物溶液:所述PLGA的摩尔比为4~6%加入。
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