CN105267238A - 一种预防和/或治疗骨髓抑制的微纳材料及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种富勒烯和/或金属富勒烯微纳材料的新用途。所述新用途是富勒烯和/或金属富勒烯微纳材料在制备具有如下1)-5)中的至少一种性质的药物或药物载体中的应用：1)预防和/或治疗骨髓抑制；2)清除自由基；3)骨髓富集；4)预防和/或治疗由于骨髓抑制导致的白细胞下降、血小板下降、血红蛋白下降和单核细胞下降中的至少一种；5)保护骨髓细胞和/或造血细胞。该富勒烯和/或金属富勒烯微纳材料制备简单快速，生物相容性好，在骨髓区域高度富集，有一定的停留时间又可以最终代谢出体外，对骨髓细胞及正常细胞没有明显的细胞毒性，安全无毒。作为一种针对化疗引起的骨髓抑制保护剂具有良好的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于生物医药领域，涉及一种预防和/或治疗骨髓抑制的微纳材料及其应用具体涉及到一种富勒烯和/或金属富勒烯微纳材料的新用途。
背景技术
近年来恶性肿瘤的发病率越来越高，严重危害着人们的健康。虽然近年来新兴了多种治疗癌症的方法手段，但是目前化疗仍然是恶性肿瘤的临床常用的治疗方法之一。众所周知，大多数化疗药物在杀伤癌细胞的同时，亦损伤人体的正常细胞，有较大的副作用，尤其是对于骨髓细胞的杀伤作用可能会对病人产生二次伤害甚至于患上白血病等疾病，严重影响病人的生活质量及其在临床上的应用。目前60％-70％的肿瘤病人需要放化疗，一般手术后2到4周进行合理的放化疗可以及时杀灭“转移灶”，有效抵制肿瘤的复发和转移，而放化疗能否坚持的关键是骨髓造血细胞的保护。然而，许多放化疗均能引起不同程度的骨髓抑制，最初表现为白细胞，血小板下降，随着剂量的增加，严重时红细胞和血红蛋白均下降，甚至可能发生再生障碍性贫血。因此，寻找能够减弱化疗药物造成的骨髓抑制毒性，又不影响其化疗作用的理想药物具有重要临床意义。在防治骨髓造血抑制中，不少的中西医药物虽有具有一定的疗效，但由于在人体胃肠道内的吸收率低下，并且易造成胃肠道反应，因而限制了该类药物的应用；另一种有效的治疗方法是利用造血生长因子(HGFs)，但因价格昂贵及自身缺陷，目前尚不能广泛使用。
综上，能够找到一种对于降低化疗药物诱导的骨髓抑制的方法对于减轻患者病情具有重要临床研究价值。
发明内容
本发明的目的之一是提供一种富勒烯和/或金属富勒烯微纳材料的新用途。
本发明所提供的新用途是富勒烯和/或金属富勒烯微纳材料在制备具有如下1)-5)中的至少一种性质的药物或药物载体中的应用：1)预防和/或治疗骨髓抑制；2)清除自由基；3)骨髓富集；4)预防和/或治疗由于骨髓抑制导致的白细胞下降、血小板下降、血红蛋白下降和单核细胞下降中的至少一种；5)保护骨髓细胞和/或造血细胞。
上述应用中，所述富勒烯和/或金属富勒烯微纳材料具备下述所有性质：(1)表面为亲水性，使其能够经由静脉注入到生物体内并通过血液循环富集于骨髓中；(2)微纳材料具有刚性(即不易变形)，使其可以通过骨髓血窦的内皮细胞间隙进入骨髓中。
本发明所述的富勒烯和/或金属富勒烯微纳材料是由富勒烯和/或金属富勒烯本体材料经水溶性修饰得到的，所述的富勒烯和/或金属富勒烯微纳材料是富勒烯和/或金属富勒烯水溶性衍生物。
所述的富勒烯和/或金属富勒烯微纳材料的颗粒尺寸范围为1-500nm，具体可为140-200nm。
本发明所述的富勒烯和/或金属富勒烯本体材料既包括空心富勒烯C2n等，亦包括内嵌金属富勒烯，主要种类有MC2n、M2C2n、MAC2n、M3NC2n、M2C2C2n、M2SC2n、M2OC2n和MxA3-xNC2n；其中，M、A均代表金属元素，所述M、A均选自Sc、Y和镧系金属元素(La-Lu)中的任意一种；30≤n≤60；0≤x≤3。
为了获得具有刚性结构的水溶性富勒烯和/或金属富勒烯微纳材料，有效的途径是通过在共价或非共价作用将非水溶性富勒烯和/或金属富勒烯本体材料经水溶性修饰得到。常用的共价修饰可以通过在碱性条件下的固液反应制备得到。例如，通过富勒烯和/或金属富勒烯固体粉末与H2O2在碱性下反应，即可制备羟基衍生物；通过富勒烯和/或金属富勒烯固体粉末与H2O2和氨反应，可制备氨基衍生物，均能达到水溶性修饰的目的。非共价键修饰方法可以使用常规水溶性载体，如脂质体、聚合物胶束、蛋白等通过疏水-疏水相互作用形成水溶性富勒烯和/或金属富勒烯微纳材料。上述修饰方法均可按照现有技术公开的方法进行修饰。
所述的水溶性富勒烯和/或金属富勒烯微纳材料具体可为在所述富勒烯和/或金属富勒烯本体材料表面修饰亲水性官能团羟基、氨基和羧基中的至少一种，或者，通过疏水-疏水相互作用(非共价共价键)使所述富勒烯和/或金属富勒烯固体与水溶性载体(如：脂质体、聚合物胶束、蛋白等)形成所述的水溶性富勒烯和/或金属富勒烯微纳材料。
所述水溶性载体为医学中常用的药物载体，具体可选自脂质体、聚合物胶束和蛋白中的至少一种。
其中，所述聚合物胶束为聚乙丙交酯聚乙二醇(PEG-PLGA)、聚赖氨酸或壳聚糖。所述蛋白为白蛋白或转铁蛋白。
所述富勒烯和/或金属富勒烯微纳材料具体可为水溶性羟基化钆金属富勒烯，水溶性羟基化C60或水溶性羟基化C70等，其具有良好的生物相容性，保持了富勒烯分子的高效清除自由基等特点，由于此分子特殊的物理化学性质和水溶液中聚集尺寸，可以高效快速的富集在骨髓之中，并将这种骨髓部位靶向富集的特性用于化疗的骨髓抑制保护剂，并且不影响化疗药物对于肿瘤的治疗等研究。该水溶性羟基化钆金属富勒烯制备简单快速，对活体无明显的毒副作用，在骨髓组织高度富集，不影响化疗药物的抗肿瘤功能，同时可以减少其带来的骨髓抑制伤害。
本发明所述水溶性富勒烯和/或金属富勒烯微纳材料在水溶液中一般具有1-500nm的尺寸，并且该微纳材料具有一定的刚性(不易变形)，使得微纳材料经血液循环易于穿过骨髓血窦中内皮细胞间的纳米孔隙，能够利用血管内外压力差即可快速地进入骨髓中。
上述应用中，所述骨髓抑制可由药物化疗、化学毒物或具有骨髓抑制副作用的药物诱导产生，所述药物化疗包括目前临床上常规使用的对骨髓具有抑制作用的药物，如环磷酰胺(CTX)等；亦可以由于化学毒物诱导产生，如苯及其衍生物等；还可以服用具有骨髓抑制副作用的药物诱导，如氯霉素、四环素或消炎痛等。
本发明的另一个目的是提供一种利用富勒烯和/或金属富勒烯微纳材料预防和/或治疗骨髓抑制的方法。
本发明所提供的骨髓抑制方法，包括如下步骤：向需要预防和/或治疗的骨髓抑制的生物体内注射有效剂量的所述富勒烯和/或金属富勒烯微纳材料，所述富勒烯和/或金属富勒烯微纳材料经血液循环穿过骨髓血窦中内皮细胞间的纳米孔隙，利用血管内外压力差即可快速地富集于骨髓中，借助富勒烯和/或金属富勒烯微纳材料高效清除自由基的特性，预防和/或治疗骨髓抑制。
本发明中所述的“有效剂量”是指当通过本发明的方法给予生物体富勒烯和/或金属富勒烯微纳材料，足以有效传递用于防护骨髓抑制的活性成分的量。骨髓抑制较轻者可以单剂量使用，骨髓抑制严重者亦可以多剂量使用，单次或多次使用后骨髓抑制现象得到显著防治。
所述富勒烯和/或金属富勒烯微纳材料是以其水溶液的形式存在，生物体体内使用浓度范围为0.1mM-10mM。
所述生物体为哺乳动物，如：人。
所述注射的方式具体可为静脉注射，直接经血液循环发挥作用，无需渗透，所用的药剂量小，疗效高。
所述骨髓抑制可由药物化疗、化学毒物或具有骨髓抑制副作用的药物诱导产生，所述药物化疗包括目前临床上常规使用的对骨髓具有抑制作用的药物，如环磷酰胺(CTX)、阿霉素、顺铂、紫杉醇等；亦可以由于化学毒物诱导产生，如苯及其衍生物(如苯丁酸氮芥)等；还可以服用具有骨髓抑制副作用的药物诱导，如氯霉素、四环素、他巴哇或消炎痛等。
本发明中对于化疗药物骨髓抑制防护，富勒烯和/或金属富勒烯微纳材料可以在化疗药物使用24h内提前注射使用，同时在化疗过程中配合使用，高效快速清除药物(如化疗药物等)诱导骨髓抑制过程中产生的自由基，可快速防治和修复骨髓抑制现象。
本发明中所使用的富勒烯和/或金属富勒烯微纳材料不仅可以代谢出生物体外，而且静脉注射后，通过血液循环富集于骨髓中，由于其高效的清除自由基的效果，在体内具有优异的防治化疗诱导的骨髓抑制的作用，不影响化疗对于肿瘤的治疗效果，可以有效降低化疗对于骨髓以及其他器官的毒副作用。同时，其对骨髓细胞及正常细胞没有明显的细胞毒性，安全无毒。
附图说明
图1为实施例1中GFNC体外ESR清除自由基实验的结果，其中，实线为对照组；虚线为实验组。
图2为实施例1中GFNC在细胞水平清除自由基实验效果。
图3为实施例2中水溶性空心富勒烯体外ESR清除自由基实验的结果，其中，实线为对照组；虚线为实验组。
图4为实施例2中C60水溶性衍生物在细胞水平清除自由基实验效果。
图5为实施例3中不同组别小鼠血常规指标。
图6为实施例4中不同组别小鼠肿瘤大小变化曲线。
图7为实施例4中不同组别小鼠体重变化曲线。
图8为实施例4中不同组别小鼠血生化指标。
图9为实施例4中不同组别小鼠组织器官病理切片经H&E染色后的切片图像。
图10为实施例5中使用C60水溶性衍生物不同组别小鼠血常规指标。
具体实施方式
下面结合附图通过具体实施例对本发明的方法进行说明，但本发明并不局限于此。
下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
下述各实施例中所用的水溶性羟基化钆金属富勒烯(简称GFNC)由如下制备方法制备得到：1)将100mgGdC82固体粉末(购买于厦门福纳新材料科技有限公司)加入100ml的单口瓶中，分别加入7ml体积分数为30％的过氧化氢水溶液和3ml2M的氢氧化钠水溶液，油浴加热到70℃，反应2-5h；2)反应后使用M.W.＝3500透析袋除去小分子，使用电导率仪监测直至透析完成，浓缩得到的产物即可得到水溶性羟基化金属富勒烯，经DLS测定，其在水溶液中的平均粒径为140nm，粒径分布均一。
下述各实施例中所用的水溶性羟基化空心富勒烯由如下制备方法制备得到：1)将100mgC60固体粉末(购买于厦门福纳新材料科技有限公司)加入100ml的单口瓶中，分别加入7ml体积分数为30％的过氧化氢水溶液和3ml2M的氢氧化钠水溶液，油浴加热到70℃，反应2-5h；2)反应后使用M.W.＝3500透析袋除去小分子，使用电导率仪监测直至透析完成，浓缩得到的产物即可得到水溶性羟基化金属富勒烯，经DLS测定，其在水溶液中的平均粒径为200nm，粒径分布均一。
下述各实施例中所用的环磷酰胺(CTX)购买于Sigma-Aldrich公司，货号为C0768。
实施例1、水溶性羟基化钆金属富勒烯(GFNC)在体外清除自由基效果：
1)电子顺磁共振(ESR)检测自由基强度实验：
采用紫外诱导产生羟基自由基的方法，对照组为：将50μL质量浓度为37％的双氧水、50μLPBS缓冲液(pH＝7.4)和微量(0.133mM)二甲基吡啶N-氧化物(DMPO、自由基捕获剂)溶液混合，用280nm紫外光照射8min，此时即可产生羟基自由基的信号；实验组为：将50μL质量浓度为37％的双氧水、50μLPBS缓冲液(pH＝7.4)和微量(0.133mM)二甲基吡啶N-氧化物(DMPO、自由基捕获剂)溶液混合，立即加入20μM的水溶性羟基化钆金属富勒烯水溶液10μL，用280nm紫外光照射8min，检测自由基的信号强度。
相应的检测结果如图1所示，从图1可得知：实验组中，在GFNC浓度仅为20μM时，即能有效淬灭由紫外光照射双氧水产生的自由基，保护细胞免受双氧水所产生的自由基的伤害作用。
2)水溶性羟基化钆金属富勒烯(GFNC)保护细胞免受双氧水产生自由基的杀伤作用：
选用小鼠骨髓细胞(FDC-P1)为所研究对象，其培养基为添加了细胞因子IL-3的高糖DMEM。将小鼠骨髓细胞以每孔ca.1x104个的浓度种在96孔板中，种8×6个孔，阴性对照组，种6个孔；阳性对照组种6个孔；实验组共有7个不同GFNC浓度，每个浓度均种6个孔，实验重复三次。阴性对照组为不加双氧水和GFNC，仅为接种有小鼠骨髓细胞的培养基；阳性对照组为仅加入10μL、30μM的GFNC，不加双氧水溶液；实验组为平行加入浓度为100μM的双氧水溶液20μL、90μL的培养基，以及不同浓度的GFNC(使其最终浓度分别为0.5μM、1μM、2.5μM、5μM、10μM、20μM和30μM)。
阴性对照组的加样顺序为：不加双氧水也不加GFNC，均用相同体积的PBS代替。
阳性对照组的加样顺序为：双氧水用同体积PBS代替，小鼠骨髓细胞孵育1h，之
后，加入GFNC，孵育3h。
实验组加样顺序为：先加入双氧水和细胞培养基，和小鼠骨髓细胞孵育1h，吸出双氧水溶液，用PBS缓冲液洗三次，洗去残留的双氧水溶液；再加入一定浓度的GFNC，同时加入细胞培养基，和细胞孵育3h之后，吸去含有GFNC的培养基，用PBS缓冲液洗三次；最后加入细胞培养基，在细胞培养箱中继续培养24h，然后用CCK-8检测细胞活性。
相应的检测结果如图2所示，从图2可得知：当加入浓度为100μM的双氧水溶液20μL时，双氧水会对小鼠骨髓细胞产生一定的杀伤作用，随着水溶性羟基化钆金属富勒烯的加入量逐渐增加时，细胞的活性也随着有所提升，表明：在细胞水平上，水溶性羟基化钆金属富勒烯对于自由基的清除有效果并且可以保护细胞不受其影响。同时，不添加双氧水，仅仅加入水溶性羟基化钆金属富勒烯的阳性对照组，其细胞活性稍高于阴性对照组，表明材料没有细胞毒性。
实施例2、水溶性羟基化空心富勒烯在体外清除自由基效果：
1)电子顺磁共振(ESR)检测自由基强度实验：
采用紫外诱导产生羟基自由基的方法，对照组为：将50μL质量浓度为37％的双氧水、50μLPBS缓冲液(pH＝7.4)和微量(0.133mM)二甲基吡啶N-氧化物(DMPO、自由基捕获剂)溶液混合，用280nm紫外光照射8min，此时即可产生羟基自由基的信号；实验组为：将50μL质量浓度为37％的双氧水、50μLPBS缓冲液(pH＝7.4)和微量(0.133mM)二甲基吡啶N-氧化物(DMPO、自由基捕获剂)溶液混合，立即加入20μM的水溶性羟基化空心富勒烯水溶液10μL，用280nm紫外光照射8min，检测自由基的信号强度。
相应的检测结果如图3所示，从图3可得知：实验组中，在羟基化空心富勒烯水溶液浓度仅为20μM时，即能有效淬灭由紫外光照射双氧水产生的自由基，保护细胞免受双氧水所产生的自由基的伤害作用。
2)羟基化空心富勒烯水溶液保护细胞免受双氧水产生自由基的杀伤作用：
选用小鼠骨髓细胞(FDC-P1)为所研究对象，其培养基为添加了细胞因子IL-3的高糖DMEM。将小鼠骨髓细胞以每孔ca.1x104个的浓度种在96孔板中，种8×6个孔，阴性对照组，种6个孔；阳性对照组种6个孔；实验组共有7个不同羟基化空心富勒烯水溶液浓度，每个浓度均种6个孔，实验重复三次。阴性对照组为不加双氧水和羟基化空心富勒烯水溶液，仅为接种有小鼠骨髓细胞的培养基；阳性对照组为仅加入10μL、30μM的羟基化空心富勒烯水溶液，不加双氧水溶液；实验组为平行加入浓度为100μM的双氧水溶液20μL、90μL的培养基，以及不同浓度的羟基化空心富勒烯水溶液(使其最终浓度分别为0.5μM、1μM、2.5μM、5μM、10μM、20μM和30μM)。
阴性对照组的加样顺序为：不加双氧水也不加羟基化空心富勒烯水溶液，均用相
同体积的PBS代替。阳性对照组的加样顺序为：双氧水用同体积PBS代替，小鼠骨
髓细胞孵育1h，之后，加入羟基化空心富勒烯水溶液，孵育3h。
实验组加样顺序为：先加入双氧水和细胞培养基，和小鼠骨髓细胞孵育1h，吸出双氧水溶液，用PBS缓冲液洗三次，洗去残留的双氧水溶液；再加入一定浓度的羟基化空心富勒烯水溶液，同时加入细胞培养基，和细胞孵育3h之后，吸去含有羟基化空心富勒烯水溶液的培养基，用PBS缓冲液洗三次；最后加入细胞培养基，在细胞培养箱中继续培养24h，然后用CCK-8检测细胞活性。
相应的检测结果如图4所示，从图4可得知：当加入浓度为100μM的双氧水溶液20μL时，双氧水会对小鼠骨髓细胞产生一定的杀伤作用，随着羟基化空心富勒烯水溶液的加入量逐渐增加时，细胞的活性也随着有所提升，表明：在细胞水平上，羟基化空心富勒烯水溶液对于自由基的清除有效果并且可以保护细胞不受其影响。同时，不添加双氧水，仅仅加入羟基化空心富勒烯水溶液的阳性对照组，其细胞活性稍高于阴性对照组，表明材料没有细胞毒性。
实施例3、水溶性羟基化钆金属富勒烯在活体水平的骨髓抑制保护：
动物模型：选用4-5周ICR小鼠，将其随机分为4组，每组6只，分别对应空白对照组、GFNC实验组、环磷酰胺(CTX)实验组和CTX+GFNC实验组。在小鼠右侧大腿上接种106个小鼠肝癌细胞(H22细胞)，接种5-7天后，肿瘤直径达到5mm左右时，进行实验。
空白对照组：实验组所注射的药物均用同体积的生理盐水所代替，静脉和腹腔均注射同等体积的生理盐水。
GFNC实验组：小鼠尾静脉注射GFNC水溶液(1mM)，药物用量为0.004mmolGFNC/kg小鼠体重。
环磷酰胺(CTX)实验组：小鼠腹腔注射CTX溶液，药物用量为60mg/kg小鼠体重
CTX+GFNC实验组：鼠腹腔注射CTX溶液，药物用量为60mg/kg小鼠体重，静脉注射GFNC溶液，药物用量为0.004mmolGFNC/kg小鼠体重。
于肿瘤接种后第七天开始是注射药物，作为开始实验的第一天，每天一次，连续5天腹腔注射CTX或静脉注射GFNC，分别在第四天，第七天，第十天，第十四天和第十七天，从小鼠眼眶取血(20μl)，置于3ml离心管中，用血细胞自动分析仪检测血常规，其中和骨髓抑制相关的主要指标为白细胞计数(WBC)，血小板计数(PLT)，血红蛋白测定(HGB)，单核细胞比例(MO％)。
相应的检测结果如图5所示，从图5可得知：与空白对照组相比，环磷酰胺(CTX)实验组中的小鼠中与骨髓抑制相关的指标：白细胞，血小板，血红蛋白在小鼠体内都有着不同程度的减少，其中以白细胞的减少最为明显，其单核细胞出现了异常的增生现象，也说明其骨髓受到损伤，相关指标都有明显的异常；而CTX+GFNC实验组中的小鼠，由于GFNC的保护作用，其白细胞，血小板，血红蛋白的量相较于环磷酰胺(CTX)实验组都有着很大程度的提高，单核细胞的数值更接近于正常组，并且随着时间的延长，相关指标越来越接近于正常小鼠的值，表明：GFNC对于化疗药物CTX所导致的小鼠骨髓抑制有明显的保护效果。
实施例4、水溶性羟基化钆金属富勒烯在活体水平对于化疗药物CTX肿瘤治疗效果的影响和毒性实验：
动物模型：选用4-5周ICR小鼠，将其随机分为4组，每组6只，分别对应空白对照组、GFNC实验组、环磷酰胺(CTX)实验组和CTX+GFNC实验组。在小鼠右侧大腿上接种106个小鼠肝癌细胞(H22细胞)，接种5-7天后，肿瘤直径达到5mm左右时，进行实验。
空白对照组：实验组所注射的药物均用同体积的生理盐水所代替。
环磷酰胺(CTX)实验组：小鼠腹腔注射CTX溶液，药物用量为60mg/kg小鼠体重。
金属富勒烯衍生物(GFNC)实验组：小鼠静脉注射GFNC溶液，药物用量为0.04mmolGd3+/kg小鼠体重。
CTX+GFNC实验组：鼠腹腔注射CTX溶液，药物用量为60mg/kg小鼠体重，静脉注射GFNC溶液，药物用量为0.04mmolGd3+/kg小鼠体重。
于肿瘤接种后第七天开始是注射药物，作为开始实验的第一天，每天一次，连续5天腹腔注射CTX或静脉注射GFNC，每两天测量小鼠的体重和肿瘤直径，在第17天，取小鼠摘眼球眼眶取血，置于5ml离心管中，于3500r，离心15min，将得到的血清转移到200μL离心管中，在血生化检测仪中检测小鼠的血生化指标，ALT，ALP，AST，BUN，LDH，UA，脱颈处死小鼠后，取小鼠主要组织器官(心，肝，脾，肺，肾)称重，泡在4％福尔马林溶液中，之后做组织病理切片，H&E染色。同时空白对照组、环磷酰胺(CTX)实验组和金属富勒烯衍生物(GFNC)实验组做相同的处理用以对比。
相应的检测结果如图6和7所示，从图6可得知：与环磷酰胺(CTX)实验组相比，CTX+GFNC实验组中的小鼠的肿瘤直径不仅没有增大，还变小，表明：GFNC不会影响化疗药物CTX对于小鼠肿瘤的治疗效果，同时又可以显著的抑制化疗药物所导致的骨髓抑制毒性，两者之间具有协同作用；从图7可得知：通过对比不同组的小鼠的体重变化，环磷酰胺(CTX)实验组中的小鼠其体重在打药初期有着明显的下降，之后由于停止打药，而靠着小鼠自身的恢复功能有一定程度的回升，但仍是体重最轻的一组，而CTX+GFNC实验组中的小鼠，虽然在打药初期，其体重也略有下降，但是后期明显恢复，并且接近于正常小鼠的体重值，说明GFNC可以保护小鼠尽可能的免于化疗药物所带来的副作用，保护小鼠骨髓抑制毒性的同时，其本身的毒性较小，可以进一步用于临床研究。
从图8可得知：CTX+GFNC实验组所测试得到的酶活性相对于CTX实验组有一定的下降或者持平，表明：其对于小鼠体内的活性氧成分有一定的清除效果，同时GFNC毒性较小。
从图9可得知：通过对比组织病理切片图像，CTX+GFNC实验组的主要组织器官并无肿大，坏死或者发炎等现象，和空白对照组几乎无异，而环磷酰胺(CTX)实验组中的小鼠，其组织器官均有一定程度的损伤，而且从肿瘤部位的病理切片亦可看出，空白对照组的肿瘤组织生长很旺盛，肿瘤细胞很致密，而CTX+GFNC实验组和CTX实验组的肿瘤组织细胞出现大量死亡的现象，组织疏松。表明GFNC是安全无毒的并且不影响化疗药物CTX的治疗肿瘤效果。
实施例5、水溶性羟基化空心富勒烯在活体水平的骨髓抑制保护：
动物模型：选用4-5周ICR小鼠，将其随机分为4组，每组6只，分别对应空白对照组、水溶性羟基化空心富勒烯实验组、环磷酰胺(CTX)实验组和CTX+水溶性羟基化空心富勒烯实验组。在小鼠右侧大腿上接种106个小鼠肝癌细胞(H22细胞)，接种5-7天后，肿瘤直径达到5mm左右时，进行实验。
空白对照组：实验组所注射的药物均用同体积的生理盐水所代替，静脉和腹腔均注射同等体积的生理盐水。
水溶性羟基化空心富勒烯实验组：小鼠尾静脉注射GFNC水溶液(1mM)，药物用量为0.004mmol水溶性羟基化空心富勒烯/kg小鼠体重。
环磷酰胺(CTX)实验组：小鼠腹腔注射CTX溶液，药物用量为60mg/kg小鼠体重
CTX+水溶性羟基化空心富勒烯实验组：鼠腹腔注射CTX溶液，药物用量为60mg/kg小鼠体重，静脉注射水溶性羟基化空心富勒烯溶液，药物用量为0.004mmol水溶性羟基化空心富勒烯/kg小鼠体重。
于肿瘤接种后第七天开始是注射药物，作为开始实验的第一天，每天一次，连续5天腹腔注射CTX或静脉注射水溶性羟基化空心富勒烯，分别在第四天，第七天，第十天，第十四天和第十七天，从小鼠眼眶取血(20μl)，置于3ml离心管中，用血细胞自动分析仪检测血常规，其中和骨髓抑制相关的主要指标为白细胞计数(WBC)，血小板计数(PLT)，血红蛋白测定(HGB)，单核细胞比例(MO％)。
相应的检测结果如图10所示，从图10可得知：与空白对照组相比，环磷酰胺(CTX)实验组中的小鼠中与骨髓抑制相关的指标：白细胞，血小板，血红蛋白在小鼠体内都有着不同程度的减少，其中以白细胞的减少最为明显，其单核细胞出现了异常的增生现象，也说明其骨髓受到损伤，相关指标都有明显的异常；而CTX+水溶性羟基化空心富勒烯实验组中的小鼠，由于水溶性羟基化空心富勒烯的保护作用，其白细胞，血小板，血红蛋白的量相较于环磷酰胺(CTX)实验组都有着很大程度的提高，单核细胞的数值更接近于正常组，并且随着时间的延长，相关指标越来越接近于正常小鼠的值，表明：水溶性羟基化空心富勒烯对于化疗药物CTX所导致的小鼠骨髓抑制有明显的保护效果。
Claims (10)
1.富勒烯和/或金属富勒烯微纳材料在制备具有如下1)-5)中的至少一种性质的药物或药物载体中的应用：1)预防和/或治疗骨髓抑制；2)清除自由基；3)骨髓富集；4)预防和/或治疗由于骨髓抑制导致的白细胞下降、血小板下降、血红蛋白下降和单核细胞下降中的至少一种；5)保护骨髓细胞和/或造血细胞。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于：所述富勒烯和/或金属富勒烯微纳材料具备下述所有性质：(1)表面为亲水性，使其能够经由静脉注入到生物体内并通过血液循环富集于骨髓中；(2)微纳材料具有刚性，使其可以通过骨髓血窦的内皮细胞间隙进入骨髓中。
3.如权利要求1或2所述的应用，其特征在于：所述富勒烯和/或金属富勒烯微纳材料是由富勒烯和/或金属富勒烯本体材料经水溶性修饰得到的；
所述的富勒烯和/或金属富勒烯微纳材料是富勒烯和/或金属富勒烯水溶性衍生物；
所述的富勒烯和/或金属富勒烯微纳材料的颗粒尺寸范围为1-500nm。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于：所述富勒烯和/或金属富勒烯本体材料选自空心富勒烯C2n、MC2n、M2C2n、MAC2n、M3NC2n、M2C2C2n、M2SC2n、M2OC2n和MxA3-xNC2n中的任一种，其中，M和A均为金属元素，所述M和A均选自Sc、Y和镧系金属元素中的任意一种；30≤n≤60；0≤x≤3。
5.如权利要求3或4所述的应用，其特征在于：所述的水溶性修饰的富勒烯和/或金属富勒烯微纳材料为在所述富勒烯和/或金属富勒烯本体材料表面修饰亲水性官能团羟基、氨基和羧基中的至少一种；
或者，通过疏水-疏水相互作用使所述富勒烯和/或金属富勒烯本体材料与水溶性载体形成所述的水溶性富勒烯和/或金属富勒烯微纳材料。
6.如权利要求5所述的应用，其特征在于：所述水溶性载体选自脂质体、聚合物胶束和蛋白中的至少一种，和/或，所述聚合物胶束为聚乙丙交酯聚乙二醇、聚赖氨酸或壳聚糖；所述蛋白为白蛋白或转铁蛋白。
7.如权利要求1-6中任一项所述的应用，其特征在于：所述骨髓抑制由药物化疗、化学毒物或具有骨髓抑制副作用的药物诱导产生。
8.如权利要求7所述的应用，其特征在于：所述药物化疗中的药物为环磷酰胺、阿霉素、顺铂或紫杉醇；所述化学毒物为苯或苯的衍生物；所述具有骨髓抑制副作用的药物为氯霉素、四环素或消炎痛。
9.利用权利要求1-8中任一项所述应用中的富勒烯和/或金属富勒烯微纳材料预防和/或治疗骨髓抑制的方法，包括如下步骤：向需要预防和/或治疗的骨髓抑制的生物体内注射有效剂量的所述富勒烯和/或金属富勒烯微纳材料，所述富勒烯和/或金属富勒烯微纳材料经血液循环穿过骨髓血窦中内皮细胞间的纳米孔隙，利用血管内外压力差即可快速地富集于骨髓中，预防和/或治疗骨髓抑制。
10.如权利要求9所述的方法，其特征在于：所述富勒烯和/或金属富勒烯微纳材料是以其水溶液的形式存在，浓度范围为0.1mM-10mM；
所述生物体为哺乳动物；
所述注射的方式为静脉注射；
所述骨髓抑制由药物化疗、化学毒物或具有骨髓抑制副作用的药物诱导产生，所述药物化疗中的药物具体为环磷酰胺、阿霉素、顺铂或紫杉醇；所述化学毒物具体为苯或苯的衍生物；所述具有骨髓抑制副作用的药物具体为氯霉素、四环素或消炎痛。
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