CN101397132A - 水溶性富勒烯衍生物、组合物及其在制备抑制肿瘤生长和转移药物中的应用 - Google Patents

Abstract

一种水溶性富勒烯衍生物、组合物及其在制备抑制肿瘤生长和转移药物中的应用，所述的衍生物是以通式：C₆₀O_xH_y(10＜y≤x＜50)表示的富勒醇或以通式C₆₀(C(COOH)₂)_n(n＝1－3)表示的富勒烯羧基衍生物；一种肿瘤抑制组合物，它包括：上述的水溶性富勒烯衍生物的颗粒，和药学上可接受的载体。本发明的优点是：与目前临床普遍使用的环磷酰胺、顺铂、紫杉醇等相比，富勒醇和羧基化富勒烯纳米颗粒具有用量小，毒性低，且具有抑制肿瘤生长和抑制肿瘤转移的优点。

Description

水溶性富勒烯衍生物、组合物及其在制备抑制肿瘤生长和转移药物中的应用

技术领域

本发明涉及一种新型纳米材料及其在生物医学中的应用。具体地说，涉及富勒醇颗粒[C₆₀O_xH_y]_n(10<Y≤X<50，n＝15-50)和富勒烯羧酸衍生物C60(C(COOH)₂)_n(n＝1-4的整数)及其在抑制肿瘤生长和转移中的应用。

背景技术

恶性肿瘤是威胁人类健康的重要疾病，目前已成为人类死亡的主要原因。在中国，肺癌，胃癌，肝癌和乳腺癌是发病率最高的肿瘤。资料显示，在中国，肺癌的发病率约为27/10,000，胃癌的发病率为26.8/10,000，乳腺癌的发病率约为16.39/10,000。目前全世界至少有700万人死于癌症，其中我国约130万。肿瘤是严重威胁人民生命、健康的常见多发病。我国每年恶性肿瘤发病人数约160万。已超过心脑血管病成为致死原因的第1位。

90％的肿瘤病人死于转移。转移是肿瘤恶性行为的特征性表现，也是临床治疗失败的主要原因。控制转移成功与否是决定癌症患者生存预后的关键。只有能有效地控制肿瘤转移的发生和发展，肿瘤治疗才算真正完成。可以毫不夸张的说攻克肿瘤转移的过程就是攻克肿瘤的过程。目前，手术切除、化疗和放疗是治疗恶性肿瘤的主要方法，但是这些方法都存在着其无法克服的缺陷：手术只能切除肉眼可见的瘤块而不能去除残余的肿瘤细胞；化疗和放疗毒副作用非常强烈，在抑制肿瘤生长的同时也损伤了机体正常的组织器官，从而使患者的生活质量急剧下降；如环磷酰胺、阿霉素、顺铂等在起到治疗作用的同时，产生骨髓抑制、消化道剧烈反应、肾脏毒性等重度副作用，严重地限制了其临床使用剂量。此外，不少抗肿瘤药在临床应用过程中产生耐药性，降低疗效。因此，抗肿瘤药的研究面临严重的挑战，新型抗肿瘤以及抗肿瘤转移药物研究开发势在必行。

当粒子尺寸进入纳米量级时，其本身具有量子尺寸效应、小尺寸效应、表面效应和宏观量子隧道效应。在生命科学研究中，纳米颗粒已经显示出其独特的优势和诱人的应用前景，如靶向性纳米药物载体、疾病高效检测的量子点、高效医学成像以及肿瘤治疗技术相关的纳米材料等，已经成为国际前沿科学问题。

Kroto等[1]于1985年发现了巴基球，并提出了球型中空分子的模型，将之命名为富勒烯。C₆₀的结构研究表明，C₆₀是一个由12个五元环和20个六元环组成的球形三十二面体，它的外形酷似足球，直径为0.71nm。六元环的每个碳原子均以双键与其他碳原子结合，形成类似苯环的结构。独特的结构赋予了它特殊的理化性质，在生物医学、材料科学等领域有着重要的应用前景。Friedman等于1993年在J.Am.Chem.Soc.115：6506-6509理论计算模拟了富勒烯C₆₀衍生物可以抑制HIV病毒的活性：C₆₀是强疏水性球形分子，直径为0.71nm，而HIV是末端开口的圆柱状分子，尺寸与C₆₀直径相似，其活性位置表面也是强疏水性的，两者有可能以共价键结合，从而阻止HIV病毒的生长。含有14核苷酸富勒烯衍生物和DNA的加合物可形成较稳定的三螺旋结构，在光催化下可对DNA进行选择性的位点切割。

由于C₆₀本身具有强烈的疏水性，在极性溶液中的溶解度很低，难以在生理介质中直接使用，严重影响了富勒烯在生物医学中的应用，因此改善C₆₀的水溶性成为研究的关键。通过引入新的基团，如-OH、-COOH、-NH₂等，改善了富勒烯的水溶性，并可同时赋予富勒烯新的物理化学性质。在水环境中，羟基衍生化以及羧基衍生化的富勒烯并不是以单独的分子形式存在的，而是通过自身、或者与大分子相互作用团聚成纳米颗粒物，这些颗粒物有很好的生物亲和性[2-5]。发表在2004年10月份Nano Lett的一篇论文[2]，指出富勒烯的细胞毒性高度依赖于其碳笼表面是否修饰和修饰的基团。在两种细胞系中，不同的结构的毒性可相差7个数量级，以富勒醇(C₆₀(OH)₂₄)最小，富勒烯三加成丙二酸(C₆₀-C₃)次之，富勒烯毒性最大。富勒醇(C₆₀(OH)₂₄)的LD50>5,000ppm，C₆₀-C₃的LD50为10ppm，而富勒烯的LD50为20ppb。人们对富勒烯及其衍生物在实验动物体内的分布进行了初步的研究。Yamago等[6]用¹⁴C标记的富勒烯羧基衍生物研究了它们在大鼠体内的分布代谢情况。研究发现：经口给药后，药物吸收比较差，并主要是以粪便排出；而静脉注射给药后，药物迅速地分布在各个器官中，药物在一周后大多还保留在体内。研究还发现药物能够穿过血脑屏障，这种水溶性富勒烯的急性毒性非常低。利用¹²⁵I标记的C60(OH)x对不同瘤株的荷瘤鼠的研究发现其主要分布在不同荷瘤鼠的肝、肾和骨骼，在肿瘤组织中有少量富集[7]。运用放射性核素⁶⁷Ga标记技术[8]研究了富勒烯衍生物C₆₀(OH)_x在正常小鼠体内的分布和代谢。研究结果表明，标记物很快被体内各脏器和组织摄取，主要分布在骨髓、骨、肝脏和脾中，不能通过血脑屏障。其分布具有微粒特征，通过皮下或肌肉注射，有望用于淋巴显像剂或恶性淋巴肿瘤导向治疗的药物载体。富勒烯的羧基衍生物在动物实验中具有良好的生物活性和细胞活性，可作为中枢神经系统的神经保护剂，在治疗神经变性疾病，如帕金森病等有潜在的应用前景[9]。羧基化衍生物可以清除体内的自由基，还可以抑制角化细胞增生，保护人角化细胞免遭紫外线(UVB)介导的细胞凋亡[10]。多羟基化富勒醇还在细胞培养模型中具有NO自由基的功能[4]。

参考文献：

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发明内容

发明人设计并制备了一种富勒醇和富勒烯羧酸衍生化合物，使其在生理盐水溶液中形成平均粒径为100nm至200nm的纳米颗粒，结果发现这两类纳米颗粒具有一定的抑制肿瘤生长和很强的肿瘤转移抑制作用，其作用机制不是通过对肿瘤细胞的直接杀死作用而完成的。

本发明的一个目的是提供一种富勒醇和富勒烯丙二酸加成衍生物及其制备方法。

本发明的另一目的是提供一种肿瘤抑制组合物，其中含有治疗有效量的富勒醇和富勒烯丙二酸加成衍生物颗粒和药学上可接受的载体。

本发明的再一目的是提供一种富勒醇和富勒烯丙二酸加成衍生物在制备抑制肿瘤和抑制肿瘤转移药物中的应用。

为实现上述目的，本发明包含以下方案：

一种富勒醇，它以通式C₆₀O_xH_y表示，其中，10<Y≤X<50。

一种富勒烯羧基衍生物，它的分子式以C₆₀(C(COOH)₂)_n表示，其中，n＝1-3。

上述化合物包括一个由碳原子构成的纳米碳笼，其表面存在许多羟基基团或羧基基团，这些羟基和羧基基团通过与环境中的氢耦合形成水合分子，因此富勒醇和富勒烯丙二酸衍生物在生物体内有很好的生物亲和性。同时，进行水溶化修饰后，与富勒烯本身比较毒性大大降低。富勒醇除与氢原子构成羟基之外，碳笼表面还存在少量的氧离子。

本发明的通式为C₆₀O_xH_y(10<y≤x<50)的富勒醇及

通式为C₆₀(C(COOH)₂)_n(n＝1-3)的制备方法。

一种肿瘤抑制组合物，其中含有以通式C₆₀O_xH_y(10<y≤x<50)的羟基化富勒烯颗粒。所述肿瘤为实质固态瘤，其包括但不限于肺癌、肝癌、乳腺癌、子宫颈癌、脑瘤、皮肤癌或直肠结肠癌。

另一种肿瘤抑制组合物，其中含有以通式C₆₀(C(COOH)₂)_n(n＝1-3)的羧基化富勒烯颗粒。所述肿瘤为实质固态瘤，其包括但不限于肺癌、肝癌、乳腺癌、子宫颈癌、脑瘤、皮肤癌或直肠结肠癌。

上述组合物还可包括溶剂和/或药学上可接受的载体。上述溶剂优选水或生理盐水。上述药学上可接受的载体是指药学领域常规的药物载体，例如：稀释剂、赋形剂，填充剂，吸收促进剂等。合适的药物载体可以是有机或者无机的惰性载体材料，包括水、明胶、淀粉、二氧化硅、氧化钛、阿拉伯树胶等等。也可加入公认的其它添加剂，例如防腐剂、稳定剂、乳化剂等。

在治疗应用中，本发明的化合物可通过仁毅常规的施药途径使用。这类途径包括：静脉、皮下、腹膜内、局部或经口等途径。该化合物可制备成任何常规形式，包括经口使用的固体形式，例如丸剂、胶囊、片剂、粒剂等；如静脉使用的制剂，无菌水溶液，如生理盐水、磷酸缓冲液等。

在溶剂环境中，通式为C₆₀O_xH_y(10<y≤x<50)的富勒醇和C₆₀(C(COOH)₂)_n(n＝1-3)的富勒烯羧基衍生物通过与自身或者其它分子的相互作用团聚成纳米颗粒物，可以通过超声波等方法控制颗粒物的尺寸，形成直径分布范围在1-400nm的颗粒。

本发明的肿瘤抑制组合物，其中，所述的组合物中富勒烯衍生物在溶剂中的浓度优选为1x10^-6～10mmol/L。当浓度高于10mmol/L时富勒烯衍生物的溶解性降低，且颗粒易发生团聚。此外，两类富勒烯衍生物在细胞培养体系的终浓度在0.1～10⁶nmol/L之间，对细胞无明显毒性作用。

一种富勒醇在制备抑制肿瘤和肿瘤转移药物中的应用，该药物被制备成所述富勒醇0.4～2mg/kg/天或0.5μmol/kg/天的剂型。

一种富勒烯二加成丙二酸衍生物在制备抑制肿瘤药物中的应用，该药物被制备成所述C₆₀(C(COOH)₂)₂的0.4mg/kg/天的剂型。

上述肿瘤抑制组合物优选通过腹腔内注射或局部给药的方式施用于需要治疗的患者。在本发明的一个优选实施方案中，将上述肿瘤抑制组合物制成注射用溶液。

本发明的优点是：与目前临床普遍使用的环磷酰胺、顺铂、紫杉醇等相比，富勒醇和羧基化富勒烯纳米颗粒具有用量小，毒性低，且具有抑制肿瘤转移的优点。

附图说明

图1C₆₀(C(COOEt)₂)₂的基质辅助激光电离飞行时间质谱图。负离子、反射模式。

图2C₆₀(C(COOH)₂)₂的红外光谱图。

图3为富勒醇的红外光谱图.

图4生理盐水溶液中富勒醇纳米颗粒的高分辨原子力显微镜图

图5生理盐水溶液中C₆₀(C(COOH)₂)n纳米颗粒的高分辨原子力显微镜图

图6采用激光动态光散射法测定羧基化富勒烯在纯水溶液(A，161.8nm)和生理盐水(B，171.1nm)的粒径分布

图7溶解于生理盐水溶液中的富勒醇纳米颗粒的扫描电镜图

图8溶解于生理盐水溶液中的羧基化富勒烯纳米颗粒的扫描电镜图

图9腹腔注射给药C₆₀(C(COOH)₂)₂和富勒醇后小鼠EMT6乳腺癌的生长曲线图。

图10小鼠乳腺癌EMT6模型中肺组织病理切片照片

图11.采用乳酸脱氢酶(LDH)释放法检测共培养48小时后羧基化富勒烯对两种细胞(鼠肝癌细胞RH 35或鼠纤维原3T3 L1细胞)繁殖与毒性作用。

图12利用流式细胞分析技术检测C₆₀(C(COOH)₂)₂对人宫颈癌Hela细胞的潜在毒性。

图13采用MTT检测羧基化富勒烯对不同细胞包括人神经母细胞瘤SHSY-5Y(A)和人肝癌HepG2细胞(B)存活率的影响

图14采用CCK-8检测富勒醇对人乳腺癌细胞MCF-7存活率的影响

图1中，m/z代表质荷比。图2中，横座标为波数，纵座标为透过率。图6中，横座标为直径，纵座标为体积％。图11横座标为浓度，纵座标为比率。图12A横座标为C60浓度，纵座标为凋亡百分率。图12中，横座标PI为碘化丙啶，纵座标为总数。

具体实施方式

C₆₀的二加成丙二酸衍生物的合成方法基于经典的Bingle-Hirsch反应，在碱存在下，C₆₀与溴代丙二酸酯类化合物的反应，利用这一反应可以得到富勒烯碳笼上的6-6闭环丙烷化产物。具体制备过程如下：

首先，将NaH加入已经配制好的1.5mg/ml C₆₀甲苯溶液中，溶液由原来的紫色变为深红色，然后滴加入溴代丙二酸二乙酯。将上述溶液体系在氩气保护下搅动10h，将反应后的溶液过滤。过滤后的上清液通过旋转蒸发仪真空浓缩去除溶剂，剩余物经硅胶柱(400目)进行层析分离，层析分离的流动相分别为甲苯，甲苯/氯仿1∶1，氯仿。通过层析分离分别可以得到色带I～XI，均为不同加成数目的C₆₀丙二酸酯衍生物。将其中经过甲苯洗脱的深棕色带IV再经旋转蒸发后，投入甲苯溶液中，并加入20倍过量的NaH。溶液在Ar保护下继续加热搅动10h，反应温度为80℃。移去加热源后，立即在溶液中加入CH₃OH终止反应，并加入HCl。通过离心法收集容器中的红色粉末状沉淀。收集的沉淀物分别经CH₃OH、2M盐酸和水分别快速洗涤沉淀各两次。再将沉淀物用水溶解，并用0.22μm的滤膜滤去不溶物。最后通过真空干燥去除溶剂，所获得的棕色干燥粉末状产物即为所需C₆₀的二加成丙二酸衍生物。C₆₀丙二酸酯衍生物的质谱表征是在基质辅助激光解析电离飞行时间质谱仪(德国Bruker公司，AutoFlex型)上进行的。最终合成的C60丙二酸衍生物的特征基团表征在红外光谱仪(美国Nicolet公司，AVATAR360型)上获得。

我们采用高效相转移催化剂四丁基氢氧化铵(TBAH)催化C₆₀甲苯溶液与浓NaOH水溶液之间的相转移反应直接将甲苯溶液中的C₆₀转化为C₆₀(OH)_n的水溶液。

富勒醇的具体制备过程如下：

在1.5mg/ml C₆₀甲苯溶液中加入1.0g/ml的NaOH溶液，然后滴加数滴40％四丁基氢氧化铵(TBAH，tetrabutylammonium hydroxide)，并在室温下搅拌。当烧杯中的甲苯溶液从深黄色变成无色，同时烧杯底部出现褐色沉淀时，加适量水到烧杯，并搅拌过夜。倾倒上清夜，用100％甲醇洗涤褐色沉淀，并真空干燥。甲醇洗涤过程重复数次，以洗脱大量的TBAH和NaOH。将沉淀溶于去离子水，以去离子水为流动相，用Sephadex G-25柱层析(5×100cm²)对多羟基富勒烯进行分离纯化，以去除痕量的Na+离子。分离过程中，5mL/管收集洗脱液，以获得羟基数目分布较窄的羟基富勒烯。冷冻干燥保存待用。

采用本发明方法制备的富勒醇C₆₀O_xH_y，其羟基数目在10～50的范围，羟基数目的正态分布的峰值为12～32，具体峰值由合成反应中NaOH溶液的浓度决定，可根据需要调节NaOH溶液的浓度，从而获得指定羟基数目的富勒醇。当羟基数目低于10时，富勒醇的生物相溶性不好；当羟基数目高于50时，碳笼的结构不稳定。我们采用高效相转移催化剂四丁基氢氧化铵(TBAH)催化C₆₀甲苯溶液与浓NaOH水溶液之间的相转移反应直接将甲苯溶液中的C₆₀转化为C₆₀(OH)_n的水溶液。

精确测定富勒醇的羟基数目至关重要，本发明中，我们利用北京大学X射线光电子能谱(XPS)并结合元素分析方法来确定富勒烯的表面修饰后的羟基数目。

XPS实验在北京大学进行。在单晶硅片上通过磁控离子溅射镀上高纯Pt作为XPS样品测试基底。富勒醇滴加在高纯Pt基底上获得XPS测量的薄膜，富勒醇的C1s光电子发射谱用于确定样品包含的羟基数目。改变入射光子能量，采集样品的价带光电子能谱。采集样品的部分产额谱以获得样品的吸收谱。装置的能量分辨率约为～0.5eV。样品的在采集数据前，先进行XPS扫描，以确保样品表面清洁并确定仪器处于良好运行状态。

以下结合实施例和对比例进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述实施例范围之中。

实施例1

测定富勒醇的羟基数

富勒醇的Cls电子的XPS谱图，C-C和C-O键之间的相对强度用于分析富勒醇中的羟基数目。经过高斯拟合分析表明分子中主要存在三种不同的碳原子：峰位置在284.8eV的是没有连接其它基团的具有sp2杂化的碳原子(C-C)的结合能；位于286.6_eV的峰是羟基化的碳原子(C-OH)，288.19_eV左右的峰属于酮或环氧结构C＝O的峰。由此，获得富勒醇的羟基数目，本发明方法制得的富勒醇主要控制在为10-50，其中15-25为最佳值，碳笼稳定，水溶性较好。

实施例2

纳米颗粒粒径的测定

富勒醇C₆₀(OH)_x分子的粒径约为1nm。在不同溶剂环境中，富勒醇分子通过与自身或其它大分子相互作用团聚成纳米颗粒物，可以通过超声波等方法控制颗粒物的尺寸，形成直径分布范围在1-400nm的颗粒。

将富勒醇溶于双蒸水或生理盐水，浓度为200μmol/L，取10μl滴于平整云母片上，风干。高分辨原子力显微镜(SPM-9500J3，SHIMAZU)证实生理盐水溶液中富勒醇，平均粒径167nm存在，参见图4。在含血清的溶剂环境中，富勒醇通过与白蛋白等大分子相互作用，可以形成200-400nm的颗粒。

实施例3

纳米颗粒粒径的测定

C₆₀(C(COOH)₂)₂分子的粒径约为1nm。在不同溶剂环境中，富勒醇分子通过与自身或其它分子相互作用团聚成纳米颗粒物，可以通过超声波等方法控制颗粒物的尺寸，形成直径分布范围在1-400nm的颗粒。

将C₆₀(C(COOH)₂)₂溶于双蒸水或生理盐水，浓度为200μmol/L，取10μl滴于平整云母片上，风干。用高分辨原子力显微镜(SPM-9500J3)2.5μm探头扫描，扫描速度1Hz。Profile软件分析表明C60(C(COOH)2)2在水相中的平均粒径为118.0nm。参见图5。在含血清的溶剂环境中，通过与白蛋白等大分子相互作用，可以形成200-400nm的颗粒。

实施例4

纳米颗粒粒径的测定

动态光散射(Dynamic light scattering，DLS，又名光子相干散射)是指通过测量样品散射光强度起伏的变化来得出样品颗粒大小信息的一种技术。测量过程不干扰样品本身的性质，能够反映出溶液中样品分子的真实状态。将C60(C(COOH)2)2溶于双蒸水或生理盐水，浓度为200μmol/L，采用MalvernNano ZS90动态光散射仪测定。结果显示，在水以及生理盐水中的粒径分别为161.8和171.1nm，与AFM结果基本一致。参见图6。

实施例5

采用SEM表征富勒醇纳米颗粒的粒径大小

首先，用无水乙醇浸泡硅片，超声处理5min，双蒸水清洗后，再超声清洗5min，42℃烘箱烘干备用。将富勒醇溶于生理盐水，浓度为200μmol/L，超声处理5次，每次3min。然后吸一滴到预处理好的硅片上，室温干燥后，采用SEM(Hitachi S-4800，Japan)观察，结果如图7所示。表明超声处理后，分散较好，富勒醇在水相中的粒径为20-150nm，与AFM结果基本一致。

实施例6

采用SEM表征C₆₀(C(COOH)₂)₂纳米颗粒的粒径大小

首先，用无水乙醇浸泡硅片，超声处理5min，双蒸水清洗后，再超声清洗5min，42℃烘箱烘干备用。将C₆₀(C(COOH)₂)₂溶于生理盐水，浓度为200μmol/L。然后吸一滴到预处理好的硅片上，室温干燥后，采用SEM(HitachiS-4800，Japan)观察，结果如图8所示。表明C₆₀(C(COOH)₂)₂在水相中的平均粒径为120.0nm，与AFM和DLS结果基本一致。

实施例7

C₆₀(OH)₂₀O₁₄与C₆₀(C(COOH)₂)₂纳米颗粒对小鼠EMT6乳腺癌肿瘤的抑制作用

动物品系：BALB/C种雌性小鼠，体重为18到22克。

肿瘤模型：高转移乳腺癌(EMT6)瘤株。

实验分组：A.阴性对照组：生理盐水(saline)；B.阳性对照组：环磷酰胺(Cyclophosphamide，CTX)，临床上普遍使用的一种抗癌药物，剂量(20mg/kg)，接种后连续给药7天；C.药物组：C₆₀(C(COOH)₂)₂，剂量(0.4mg/kg)，每天给药；D.药物组：C₆₀(OH)₂₀O₁₄，剂量(0.4mg/kg)，每天给药；E.药物组：C₆₀(OH)₂₀O₁₄，剂量(2mg/kg)，每天给药；每组10只小鼠。

给药方式：腹腔注射(intraperitoneal，i.p.)。

CTX，C₆₀(OH)₂₀O₁₄与C₆₀(C(COOH)₂)₂溶液以0.9％的生理盐水为溶剂。

注射体积均为0.2ml。

实验方法：每只小鼠右后肢皮下接种小鼠EMT6乳腺癌瘤株1×10⁶癌细胞(溶于100μl的0.9％生理盐水中)，接种24小时后开始给药0.2ml/只；实验期间每24小时给药一次，每隔一天测量接种肿瘤的后肢直径，记录其生长情况；同时观察小鼠的摄食量和反应情况；当生理盐水组小鼠右后肢直径长到20mm左右时，停止实验(正常小鼠后肢直径为6mm)。

实验结束：摘除眼球取血；摘取肿瘤，称重；取脏器/器官并称重，计算脏器系数；同时用10％的福尔马林固定脏器/器官。为观察肿瘤肺转移情况，解剖完毕后，将肺浸入Bouis液中染色，放置12小时后，取出，计数转移灶数目。肺转移灶一般为圆形小突起如疱状，正、反面及肺叶间的瘤灶均计数在内。

实验结果：腹腔注射给药C₆₀(C(COOH)₂)₂和富勒醇后小鼠EMT6乳腺癌的生长曲线图图9。C₆₀(OH)₂₀O₁₄与C₆₀(C(COOH)₂)₂纳米颗粒的抗乳腺癌EMT6活性以及抗乳腺癌转移活性分别如表1和表2中所示，注射两种富勒烯衍生物纳米颗粒后可以抑制小鼠的肿瘤生长，并可以抑制乳腺癌EMT6的肺转移。

小鼠乳腺癌EMT6模型中肺组织病理切片结果：

以下参见图10，富勒醇与二加成羧基化富勒烯纳米颗粒治疗组的肺组织中转移灶与生理盐水对照组相比明显减少。生理盐水组的肺部肺泡间隔增宽现象明显，产生严重实变；各给药治疗组的肺泡间隔没有明显增宽现象，特别是富勒醇高剂量组效果更加明显。由肺组织病理结果说明：C₆₀O_xH_y与C₆₀(C(COOH)₂)₂纳米颗粒可以抑制乳腺癌EMT6细胞的肺转移，并可以明显改善肺部炎症反应。图中箭头所指为肿瘤转移灶，药物组转移灶的大小数目均大大减少。

表1.腹腔注射C₆₀(C(COOH)₂)₂和富勒醇后小鼠肿瘤抑制情况

(表中数据以(平均值±标准差)表示)

表2.腹腔注射C₆₀(C(COOH)₂)₂和富勒醇后小鼠肺转移抑制情况

实施例8

富勒醇纳米颗粒对小鼠Lewis肺癌肿瘤模型抑制肿瘤效果

实验方法：C57BL纯系雌性小鼠(18-22克)，腋下接种Lewis肺癌细胞悬液(1.5×10⁶)后，接种24小时后开始给药，分别给给予富勒醇(0.5μmol/kg)、表阿霉素和生理盐水。

给药方法：

富勒醇  0.5μmol/kg/天×12天，以富勒醇浓度计算；注射液浓度为0.05μmol/ml，注射体积均为0.2ml。

表阿霉素    第一周3.45μmol/kg q.d.×7

生理盐水    0.2ml/天.×12

动物品系：C57BL纯系雌性小鼠，每组10只

肿瘤模型：小鼠lewis肺癌肿瘤模型

给药方式：腹腔注射(intraperitoneal injection，i.p.)。

注射体积：均为0.2ml。

表阿霉素和富勒醇溶液，以0.9％的生理盐水为溶剂。

抑制肿瘤实验结果如表3所示，富勒醇组在0.5μmol/kg体重给药12天时抑瘤率可达到37.7％。富勒醇组小鼠在实验结束时未出现明显的毒性反应。

实验结果表明，与目前临床普遍使用的表阿霉素相比，富勒醇具有用量小，毒性低，且肿瘤抑制率高的优点。

表3.腹腔注射富勒醇后小鼠Lewis肺癌抑制情况

实施例9

细胞毒性试验：

采用乳酸脱氢酶(LDH)释放法分析羧基化富勒烯对不同癌细胞存活率的影响取对数生长期细胞消化成单细胞悬液，调节细胞浓度为2×10⁴/ml，接种于96孔细胞培养板，每孔接种100μl，分为6个剂量组，每组8个复孔。接种24h后，换成无血清培养基，每孔100μl，按剂量组浓度分别加入药物，继续培养48h后。取上清，检测LDH酶的活性。细胞死亡或细胞膜发生破坏时胞质会释放出乳酸脱氢酶到培养上清液中。通过检测羧基化富勒烯对两种细胞(鼠肝癌细胞RH 35或鼠纤维原3T3 L1细胞)共培养48小时后上清液中LDH的活性，可以判断富勒烯衍生物对细胞的毒性。实验结果如图11所示，在0-100μmol/L的浓度范围内，未发现释放LDH有明显变化，即羧基化富勒醇没有明显的细胞毒性。

实施例10

细胞毒性试验：

流式细胞仪的方法分析羧基化富勒烯对人宫颈癌细胞的毒性

将5ml浓度为10⁵个/ml的人宫颈癌细胞(Hela细胞)接种于25cm²培养瓶中，24h后换成5ml无血清培养基，分别加入1×10¹ppb，1×10²ppb，1×10³ppb，1×10⁴ppb，1×10⁵ppb五种不同浓度的C60(C(COOH)₂)₂，对照组不加C60(C(COOH)₂)₂(control)。24h后收取细胞，包括培养基中的少量细胞，收集好的细胞用生理盐水洗两次，然后用70％乙醇在4℃固定。做流式分析前，用生理盐水洗2次，最后用生理盐水悬起细胞，加入RNase A及碘化丙啶(PI)，终浓度分别是25ppm和50ppm，在37℃水浴中放置30min，用尼龙纱布过滤后上机进行测定。PI不能通过正常细胞的细胞膜，但对于凋亡中晚期细胞或死细胞，PI能透过细胞膜而使细胞核红染。DNA结合PI染色后，可在G1峰前出现一亚二倍体峰，根据此峰的百分率可检测凋亡细胞数。

结果如图12所示，A为不同浓度下，凋亡细胞的百分比柱状图。B为细胞凋亡直方图。C60(C(COOH)₂)₂的终浓度在10～10⁵ng/mL范围内，细胞凋亡比例与对照组基本一致，凋亡细胞的比例均在2.0％～3.5％之间，细胞凋亡直方图中均无凋亡小峰的出现，周期分析表明在不同浓度C₆₀(C(COOH)₂)₂作用下的细胞各周期分布比例基本一致，S％(S期细胞所占比例)在25％～31％之间，G2/G1(G2期与G1期细胞数之比)在1.89～1.94之间。结果表明10～10⁵ppb浓度范围内C₆₀(C(COOH)₂)₂对Hela细胞作用24h，没有观察到细胞毒性作用。药物各剂量组之间没有显著性差别。不诱导Hela细胞凋亡，对细胞的增值和生长没有影响。

实施例11

细胞毒性试验：

采用噻唑兰(MTT)细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒的方法分析羧基化富勒烯对人神经母细胞瘤SHSY-5Y和人肝癌HepG2细胞存活率的影响

MTT法：作为四氮唑类染料之一的MTT进入细胞后，被线粒体呼吸链酶(如琥珀酸脱氢酶)还原为不溶性有色产物，结晶物能被二甲基亚砜(DMSO)溶解，利用光吸收的方法测定有色产物的量，从而间接反映细胞的活性。

实验结果如图13所示，羧基化富勒烯终浓度在1～100μmol/L范围内，人肝癌HepG2细胞存活率较未加任何药物的对照组有所增加，但没有显著性差异。在羧基化富勒烯终浓度在1～1000μmol/L范围内，与人神经母细胞瘤SHSY-5Y细胞共培养48h后，细胞存活率没有变化，说明药物对细胞的生长没有影响，没有明显的毒性作用。

实施例12

细胞毒性试验：采用CCK-8的方法分析富勒醇对人乳腺癌MCF-7细胞的作用。

Cell Counting Kit-8简称CCK-8试剂盒，是一种基于WST-8的广泛应用于细胞增殖和细胞毒性的快速高灵敏度检测试剂盒。WST-8是一种类似于MTT的化合物，在电子耦合试剂存在的情况下，可以被线粒体内的一些脱氢酶还原生成水溶性橙黄色的formazan。细胞增殖越多越快，则颜色越深；细胞毒性越大，则颜色越浅。对于同样的细胞，颜色的深浅和细胞数目呈线性关系。

实验结果如图14所示，富勒醇C₆₀(OH)₂₂终浓度在1～100mg/L范围内，与人乳腺癌MCF-7细胞共培养48h后，与对照组相比，细胞存活率没有变化，说明药物对细胞的生长没有影响，没有明显的毒性作用。

Claims (11)

1、一种水溶性富勒烯衍生物，其特征在于：所述的衍生物是以通式C₆₀O_xH_y(10<y≤x<50)表示的富勒醇或以通式C₆₀(C(COOH)₂)_n(n＝1-3)表示的富勒烯羧基衍生物。

2、根据权利要求1所述的一种水溶性富勒烯衍生物，其特征在于：所述的通式C₆₀(C(COOH)₂)_n(n＝1-3)中，n＝2。

3、根据权利要求1所述的一种水溶性富勒烯衍生物，其特征在于：所述的富勒醇为C60(OH)_15-25。

4、一种肿瘤抑制组合物，其特征在于：它包括：权利要求1所述的水溶性富勒烯衍生物的颗粒，和药学上可接受的载体。

5、根据权利要求4所述的一种肿瘤抑制组合物，其特征在于：所述的富勒烯羧基衍生物为通式C₆₀(C(COOH)₂)_n(n＝1-3)中，n＝2或富勒醇为C60(OH)_15-25。

6、根据权利要求4或5所述的一种肿瘤抑制组合物，其特征在于：所述的药学上可接受的载体为溶剂和/或药学上常规的药物载体。

7、根据权利要求6所述的一种肿瘤抑制组合物，其特征在于：所述的药学上可接受的载体为溶剂，该溶剂为水或生理盐水，所述的富勒烯衍生物的浓度为1×10^-6～10mmol/L。

8、一种权利要求1所述的水溶性富勒烯衍生物在制备抑制肿瘤药物中的应用。

9、根据权利要求8所述的水溶性富勒烯衍生物在制备抑制肿瘤药物中的应用，其特征在于：所述的富勒烯羧基衍生物为通式C₆₀(C(COOH)₂)_n(n＝1-3)中，n＝2或富勒醇为C60(OH)_15-25。

10、根据权利要求9所述的水溶性富勒烯衍生物在制备抑制肿瘤药物中的应用，其特征在于，所述的药物被制备成各种剂型，这些剂型所对应的给药量以水溶性富勒烯衍生物计为5 x 10^-6～5 x 10^-3mmol/kg/天。

11、根据权利要求6所述的一种肿瘤抑制组合物，其特征在于：所述的富勒烯衍生物在溶剂中的纳米颗粒物直径分布范围为1-400nm。

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