CN108530309A - 一种富勒烯衍生物及其制备方法和其在化疗保护中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种带有羟基和水溶性氨基酸的富勒烯衍生物，该衍生物具有良好的生物相容性，并保持了富勒烯分子的高效清除自由基的特点，能用作自由基清除剂或抗氧化剂。本发明的富勒烯衍生物在分子间相互作用下可聚集成较大尺寸的颗粒，可非特异性的富集到肝脏、心脏等目标靶器官中，并因颗粒尺寸大于肾小球滤过膜的孔径，而不会被肾滤过，可在体内长时间循环，具有长效作用。

Description

一种富勒烯衍生物及其制备方法和其在化疗保护中的应用
技术领域
本发明涉及一种富勒烯衍生物及其制备方法和应用，尤其涉及一种具有自由基清除活性的富勒烯衍生物，属于生物医药领域。
背景技术
自由基指外层轨道含有未配对电子的基团。自由基具有高度的化学活性，是动物体生命活动中多种生化反应的中间代谢产物。自由基是机体有效的防御系统，但自由基产生过多，会通过攻击生命大分子物质及各种细胞器，引起细胞膜的脂质过氧化，蛋白质和核酸的变性等，造成机体在分子水平、细胞水平以及组织器官水平的各种损伤。目前已知，许多病理过程都与体内过多的自由基密切相关，如衰老、心血管疾病、癌症、帕金森病与阿尔茨海默病、糖尿病、缺血再灌注损伤等。
此外，很多体外的化学物质进入体内后，在机体代谢过程中，会产生大量自由基，或者干扰体内自由基的清除而导致自由基积累，从而通过自由基造成对机体的损伤。典型的化学物质包括各种化疗药物，例如阿霉素、柔红霉素、紫杉醇、环磷酰胺等；化学试剂，例如四氯化碳、酒精等。另外，电离辐射也会给生物体带来大量的自由基，经由自由基对生物体产生损伤。
近年来，恶性肿瘤的发病率不断上升，其已成为全球最大的公共卫生问题之一，极大地威胁到了人类的健康，并将成为新世纪人类的第一杀手。我国作为发展中大国，承受着更大的疾病负担，恶性肿瘤的发病人数以及死亡人数也在持续增加。目前化疗和放疗仍为恶性肿瘤的主要治疗手段，例如60％-80％的乳腺癌、子宫癌患者还必须使用化疗药物来维持生命。几乎所有的化疗药物均可引起肝功能损害，轻者可出现肝功能异常，患者可出现肝区不适，甚至可导致中毒性肝炎。部分化疗药物还可产生心脏毒性，损害心肌细胞，使患者出现心慌、心悸、胸闷、心前区不适、气短等症状，甚至出现心力衰竭。放疗也会引发体内自由基的大量产生。目前已知，化疗和放疗的很多副作用与活性氧自由基作用机理密切相关。临床治疗中为了增加活性氧自由基的数量，采用了扩张血管、提高血氧含量等增效手段以增加对肿瘤细胞的杀伤力。但在提高肿瘤杀伤作用的同时，也加大了对机体正常器官的损害。
医学界对抗氧化剂在疾病的保护性治疗上给予了越来越多的关注和实践，积极寻找和开发清除自由基的药物，包括，抗衰老；联合治疗药物改善心血管疾病、缺血再灌注损伤等等的病理改变的程度；在使用化疗药物或放疗时联合抗氧化剂，减轻化疗或放疗的脏器损伤等副反应。目前已知的抗氧化剂，如维生素E、维生素C、N-乙酰半胱氨酸、天然化合物等，抗氧化效果并不是那么理想。
因此，仍然需要寻找有效的自由基清除剂，改善与自由基关联的病理病变，包括能用于预防和/或修复化疗药物或放疗引起的器官损伤等。
发明内容
本发明的目的之一是提供一种富勒烯衍生物，所述富勒烯衍生物是经羟基和氨基酸修饰的水溶性富勒烯衍生物。
本发明的目的之二是提供一种上述富勒烯衍生物的制备方法。
本发明的目的之三是提供上述富勒烯衍生物的应用，其可以用于清除自由基。
本发明的技术方案如下：
一种富勒烯衍生物，其平均分子式为C2n(OH)x(AA)y；其中，n为整数，20≤n≤50；0<x≤30；0<y≤18；其中，OH代表羟基，AA代表水溶性氨基酸；羟基和水溶性氨基酸均连接于富勒烯上。
优选地，所述分子式中，28≤n≤40；进一步优选，30≤n≤37；更优选n为30或35。
优选地，所述分子式中5≤x≤20；进一步优选，7≤x≤15。
优选地，所述分子式中4≤y≤15；进一步优选，6≤y≤12。
根据本发明，所述水溶性氨基酸为甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、谷氨酸、精氨酸、赖氨酸和天冬氨酸中的至少一种。优选地，所述水溶性氨基酸为丙氨酸、甘氨酸、丝氨酸、精氨酸、赖氨酸和天冬氨酸中的至少一种。更优选所述水溶性氨基酸为丙氨酸、丝氨酸和赖氨酸中的至少一种。
根据本发明，所述富勒烯衍生物的水合半径范围为1-1000nm，优选为80-500nm，更优选为100-200nm。
根据本发明，所述富勒烯衍生物还可进一步用氨基、羧基等基团进行修饰。
在本发明中，“平均分子式”与本领域相同技术术语的含义相同，取代基的数目表示富勒烯上外接的相应取代基的平均数目。
本发明还提供上述富勒烯衍生物的制备方法，所述富勒烯衍生物是通过羟基和水溶性氨基酸修饰富勒烯得到的。
根据本发明，所述制备方法可以是将富勒烯固体粉末与水溶性氨基酸在碱性溶液下反应，或者将富勒烯的有机溶液与水溶性氨基酸的碱溶液在相转移催化剂下进行反应。
在本发明的一个实施方式中，所述制备方法包括如下步骤：
1)配制水溶性氨基酸的碱溶液；
2)将步骤1)的碱溶液与醇混合；
3)将步骤2)得到的混合溶液加入到含有富勒烯的有机溶剂中反应。
优选地，所述碱溶液中碱的质量分数为15～60％；进一步优选为28～40％。
优选地，所述水溶性氨基酸与碱的摩尔比为1:1～5；进一步优选为1:1.15～3，例如为1:1.5，1:2，1:2.5，1:3等。
优选地，所述碱溶液与醇的体积比为1:1～10；优选为1:1～6，例如1:1，1:2，1:3，1:4，1:5，1:6。
根据本发明，所述水溶性氨基酸与富勒烯的摩尔比为10～1000:1；优选为20～500:1，更优选为50～100:1，例如为50:1，60:1，70:1，80:1，90:1，100:1等。
优选地，所述碱选自氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化锂、氢氧化钙中的至少一种；进一步优选为氢氧化钠和氢氧化钾中的至少一种。
优选地，所述醇为C1-6的醇，例如乙醇、甲醇、异丙醇等；进一步优选为乙醇。
根据本发明，所述有机溶剂只要能溶解富勒烯即可，例如苯、甲苯、二甲苯(包括邻二甲苯、间二甲苯、对二甲苯的任一种或其组合)等。优选所述有机溶剂选自苯、甲苯中的至少一种；更优选为甲苯。
根据本发明，所述反应的温度为50～80℃。
根据本发明，所述反应时间为1～72h；优选为10～48h。
根据本发明，所述制备方法优选进一步包括后处理步骤。
所述后处理步骤为，在反应结束后，除去上层有机溶剂，将下层产物透析，除去碱，冷冻干燥。
本发明还提供上述富勒烯衍生物的应用。
所述应用为用作自由基清除剂或抗氧化剂。
所述自由基清除剂或抗氧化剂能用于治疗或改善与自由基有关的病理或病变，包括但不限于抗衰老，用于预防和/或修复自由基引起的器官损伤，包括但不限于由化疗或者辐射引起的器官损伤，例如：抑制化疗药物伴随的白细胞下降、或者贫血、或者血清中肌酸激酶、谷丙转氨酶、谷草转氨酶、乳酸脱氢酶和α-羟丁酸脱氢酶中任一种的升高，或者同时具有上述改变中的至少两种。
所述富勒烯衍生物在制备自由基清除剂或抗氧化剂中的应用。
所述富勒烯衍生物在制备预防和/或修复自由基引起的器官损伤的药物中的应用。
根据本发明，所述器官损伤可由化疗药物、化学毒物或者辐射等诱导产生。所述化疗药物包括但不限于目前临床上常用的有器官毒性的药物，如阿霉素、紫杉醇、环磷酰胺等。所述化学毒物包括但不限于四氯化碳、酒精等。所述辐射包括但不限于X射线、γ射线等。
根据本发明，所述器官损伤包括但不限于心脏损伤、肝脏损伤、血液系统损伤和/或肾脏损伤等。优选所述器官损伤为心脏损伤、肝脏损伤和/或血液系统损伤。
优选所述药物可用于预防和/或修复器官损伤伴随的白细胞下降、或者贫血、或者血清中肌酸激酶、谷丙转氨酶、谷草转氨酶、乳酸脱氢酶和α-羟丁酸脱氢酶中任一种的升高，或者同时具有上述改变中的至少两种。
本发明还提供一种利用所述富勒烯衍生物预防和/或修复器官损伤的方法。
本发明所述的预防和/或修复器官损伤的方法，包括如下步骤：向需要预防和/或修复器官损伤的生物体内给予有效剂量的本发明的富勒烯衍生物，所述富勒烯衍生物通过血液循环或腹腔扩散或消化系统富集到靶器官中，借助富勒烯衍生物高效的自由基清除能力预防和/或修复器官损伤。
本发明中，所述的“有效剂量”是指当通过本发明的方法给予生物体富勒烯衍生物，足以有效传递用于预防和/或修复器官损伤的活性成分的量。器官损伤较轻者可以单剂量使用，严重者亦可以多剂量使用，单次或多次使用后达到显著预防和/或修复器官损伤的效果。
所述的生物体为哺乳动物，包括但不限于人、鼠、兔、猪、猴、牛、羊、马和狗等。
根据本发明，所述给药的方式包括但不限于静脉注射、腹腔注射、口服和局部给药。
当所述富勒烯衍生物的剂型为注射剂时，所述注射剂的溶剂可为水、生理盐水、PBS缓冲液和Tris-HCl溶液中的至少一种；所述生理盐水的浓度可为0.85～0.90％；PBS缓冲液的浓度可为0.01～0.1mol/L；Tris-HCl溶液的浓度可为0.05～0.1mol/L；所述富勒烯衍生物的浓度可为0.1mg/mL～10mg/mL。
根据本发明，所述富勒烯衍生物用于对器官损伤的预防和/或修复时，可提前化疗药物注射或放疗开始的7天之内使用，也可以进一步同时配合化疗或放疗过程，还可以在停止化疗或放疗后持续使用，直至器官损伤症状减轻。
根据本发明，所述富勒烯衍生物可通过生物体代谢排出体外，无毒副作用。
本发明中，所述富勒烯衍生物具有良好的生物相容性，且相比于只含有羟基的富勒烯衍生物有更高的自由基清除效果。
由于所述富勒烯衍生物在分子间相互作用下可聚集成较大尺寸的颗粒，能够非特异性的富集到目标器官中，例如肝脏、心脏等器官中，并且因颗粒粒径尺寸能到达大于肾小球滤过膜的孔径的程度，而不会被肾滤过，可在体内长时间循环，达到长效的作用。
实验研究发现，本发明的富勒烯衍生物在不同器官的高度富集并不影响化疗药物的抗肿瘤效果。
附图说明
图1为实施例2.1中C70-Lys的热重分析及微商热重分析曲线。
图2为实施例2.2中C70-Ala的热重分析及微商热重分析曲线。
图3为实施例3.1中C70-Lys及实施例3.2中C70-Ala在纯水中的水合粒径曲线。
图4为实施例4中C70-Lys及C70-Ala体外ESR清除自由基实验结果。
图5为实施例5中C70-Lys及C70-Ala在细胞水平清除自由基的结果。
图6为实施例6中不同组别小鼠体重变化曲线。
图7为实施例6中不同组别小鼠的部分血生化指标。
图8为实施例7.1中C60-Lys在纯水中的水合粒径曲线。
图9为实施例8中C70-Lys及C60-Lys体外ESR清除自由基实验结果。
图10为实施例9中C70-Lys及C70-OH体外ESR清除自由基实验结果。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外，应理解，在阅读了本发明所记载的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本发明所限定的范围。
下面结合附图通过具体实施例对本发明的方法进行说明，但本发明并不局限于此。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1.1
羟基和赖氨酸修饰的富勒烯衍生物(为方便表述，下简称“C70-Lys”)的制备
将赖氨酸与NaOH溶液混合(其中NaOH质量分数为28％，赖氨酸与NaOH的摩尔比是1:2)，再与乙醇混合(其中NaOH溶液与乙醇的体积比为1:5)，将制备得到的赖氨酸的乙醇碱溶液逐滴加入到C70(赖氨酸与C70的摩尔比是100:1)的甲苯溶液中，搅拌过夜(反应温度为50℃；反应时间为24h)，之后除去上层甲苯层，下层产物透析除过量NaOH，冷冻干燥保存，即制备得到所述羟基和赖氨酸修饰的富勒烯衍生物(C70-Lys)。
所述C70-Lys用于以下相应实施例中。
实施例1.2
羟基和丙氨酸修饰的富勒烯衍生物(为方便表述，下简称“C70-Ala”)的制备
将丙氨酸与NaOH溶液混合(其中NaOH质量分数28％，丙氨酸与NaOH的摩尔比是1:2)，再与乙醇混合(其中NaOH溶液与乙醇的体积比为1:5)，将制备得到的丙氨酸的乙醇碱溶液逐滴加入到C70(丙氨酸与C70的摩尔比是100:1)的甲苯溶液中，搅拌过夜(反应温度为50℃；反应时间为36h)，之后除去上层甲苯层，下层产物透析除过量NaOH，冷冻干燥保存，即制备得到所述羟基和丙氨酸修饰的富勒烯衍生物(C70-Ala)。
所述C70-Ala用于以下相应实施例中。
实施例2.1
测定C70-Lys的羟基及赖氨酸数
对上述实施例1.1制备得到的羟基和赖氨酸修饰的富勒烯衍生物(C70-Lys)进行元素分析(Flash EA 1112)，并结合热重分析、微商热重分析，其结果表明：从元素分析的结果可以看出，所述C70-Lys中，C含量为51.65％，H含量为5.24％，N含量为8.26％，结合热重分析、微商热重分析曲线(如图1所示)计算C70-Lys的羟基数目。
从热重分析可知，C70-Lys固体粉末中含9.9％的水，约为15个水分子，结合元素分析中N含量与C含量的比值，可推算碳笼表面修饰了8个赖氨酸分子。再根据元素分析所测粉末H总量与H2O及赖氨酸中H含量的差值，可计算得羟基数目为9，所以C70-Lys的平均分子式为C70(OH)9(C6H13N2O2)8。
实施例2.2
测定C70-Ala的羟基及丙氨酸数
对上述实施例1.2制备得到的羟基和丙氨酸修饰的富勒烯衍生物(C70-Ala)进行元素分析(Flash EA 1112)，并结合热重分析、微商热重分析，其结果表明：从元素分析的结果可以看出，所述C70-Ala中，C含量为48.24％，H含量为3.69％，N含量为4.02％，结合热重分析、微商热重分析曲线(如图2所示)计算C70-Ala的羟基数目。
从热重分析可知，C70-Ala固体粉末中含12.4％的水，约为15个水分子，结合元素分析中N含量与C含量的比值，可推算碳笼表面修饰了6个丙氨酸分子。再根据元素分析所测粉末H总量与H2O及丙氨酸中H含量的差值，可计算得羟基数目为15，所以该产物的平均分子式为C70(OH)15(NHCH2CH2COOH)6。
实施例3.1
C70-Lys水合粒径的测定
取少量上述实施例1.1制备得到的C70-Lys粉末溶于水配成稀溶液，由于分子间相互作用，C70-Lys在水中团聚成纳米颗粒，形成水合粒径在1～200nm的颗粒。
采用动态光散射(DLS，Zetasizer Nano ZSP)测定了在pH＝7.0的纯水中C70-Lys纳米颗粒的水合粒径，平均粒径为155.2±1.2nm，参见图3。
实施例3.2
C70-Ala水合粒径的测定
取少量上述实施例1.2制备得到的C70-Ala粉末溶于水配成稀溶液，由于分子间相互作用，C70-Ala在水中团聚成纳米颗粒，形成水合粒径在1～200nm的颗粒。
采用动态光散射(DLS，Zetasizer Nano ZSP)测定了在pH＝7.0的纯水中C70-Ala纳米颗粒的水合粒径，平均粒径为139.8±0.8nm，参见图3。
实施例4
C70-Lys和C70-Ala在体外清除自由基的效果及其比较
电子顺磁共振(ESR)检测羟基自由基强度实验，采用紫外诱导产生羟基自由基的方法：
对照组为：将50μL浓度为1M的双氧水、50μL PBS缓冲液(pH＝7.4)和微量(0.133mM)二甲基吡啶N-氧化物(DMPO、自由基捕获剂)溶液混合，用280nm紫外光照射4min，此时即可产生羟基自由基的信号；
实验组为：将50μL浓度为1M的双氧水、50μL PBS缓冲液(pH＝7.4)和微量(0.133mM)二甲基吡啶N-氧化物(DMPO、自由基捕获剂)溶液混合，立即加入100μg/mL的C70-Lys或C70-Ala的水溶液10μL，用280nm紫外光照射4min，检测自由基的信号强度，检测结果参见图4。
当C70-Lys及C70-Ala的浓度均为100μg/mL时，两者均能猝灭羟基自由基，C70-Lys能清除约87％的羟基自由基，C70-Ala的清除率则为49％，由此可见，C70-Lys的自由基清除效果明显优于C70-Ala。
实施例5
C70-Lys和C70-Ala保护细胞免受化疗药物的损伤的效果及其比较
选用人脐静脉血管内皮细胞(HUVEC)为研究对象，分别研究C70-Lys及C70-Ala对保护HUVEC抗阿霉素氧化的效果。
预保护实验：将不同浓度的C70-Lys及C70-Ala(100,300,500,800,1000μg/mL)分别与HUVEC在96孔板中孵育3h，毎孔细胞浓度为1×104。然后吸出富勒烯溶液，加入阿霉素(4μg/mL)孵育1h，最后用新鲜培养基，在细胞培养箱中继续孵育24h，用CCK-8检测细胞活性。
细胞修复实验：与以上预保护实验操作基本相同，只是改变了富勒烯及阿霉素与细胞孵育的顺序，即，先将阿霉素与细胞共同孵育1h，之后将富勒烯与细胞共同孵育3h。
相应的检测结果如图5所示。
在预保护实验中，随着加入的C70-Lys的浓度升高，细胞在阿霉素处理后的活性相应增强；随着加入的C70-Ala的浓度升高，细胞在阿霉素处理后的活性有增强，但不明显。
在细胞修复实验中，当细胞与浓度为4μg/mL的阿霉素孵育1h时，HUVEC会有一定程度的损伤，随着处理后加入的C70-Lys或C70-Ala浓度的提高，细胞活性逐渐提升，其中在相同浓度下，加入C70-Lys后的细胞活性高于加入C70-Ala的。
这说明在细胞水平上，C70-Lys和C70-Ala能预防细胞对抗化疗药物带来的自由基损伤，也能修复化疗药物造成的细胞损伤，C70-Lys比C70-Ala的效果好。
实施例6
C70-Lys和C70-Ala在活体水平的器官损伤预防和/或修复
动物模型：选用4-5周的Balb/c雌性小鼠，随机分成6组，每组6只，分别为空白对照组(Control)、阿霉素(DOX)+生理盐水(Saline)组、DOX+维生素C(VC)组、DOX+C70-Lys组和DOX+C70-Ala组。
空白对照组：实验组所注射的药物均用同体积的生理盐水所替代，静脉和腹腔均注射相同体积的生理盐水。
DOX+Saline组：小鼠连续腹腔注射生理盐水10天(200μL每天)，在第四天的时候静脉注射一次20mg/kg的阿霉素溶液。
DOX+VC组：小鼠连续腹腔注射VC溶液10天(10mg/kg)，在第四天的时候静脉注射一次20mg/kg的阿霉素溶液。
DOX+C70-Lys组:小鼠连续腹腔注射C70-Lys溶液10天(10mg/kg)，在第四天的时候静脉注射一次20mg/kg的阿霉素溶液。
DOX+C70-Ala组:小鼠连续腹腔注射C70-Ala溶液10天(10mg/kg)，在第四天的时候静脉注射一次20mg/kg的阿霉素溶液。
每隔1天对小鼠称重。在第11天从小鼠眼眶取血约20μL，用血细胞自动分析仪检测血常规；取1mL血于离心管中离心取血清测血生化指标；取小鼠的心脏和肝脏称重，计算脏器系数；并测定器官内的氧化还原指标。
从各组小鼠的体重变化曲线(如图6)可以看出，DOX+Saline及DOX+VC组体重在给予DOX之后下降很快，而C70-Lys和C70-Ala的两组在给予DOX之后体重下降相对缓慢，且DOX+C70-Lys组的体重下降缓于DOX+C70-Ala组。
表1给出了不同组别小鼠的肝脏及心脏系数，从表1中可以看出，DOX+Saline及DOX+VC组的肝脏和心脏的脏器系数明显高于DOX+C70-Lys及DOX+C70-Ala两组，远高于对照组。
脏器系数增大，在一定程度上代表脏器发生了充血、水肿或增生肥大等病生理的变化，表1的结果提示化疗药物阿霉素可能引起了给药动物脏器的充血、水肿或增生肥大等，而C70-Lys和C70-Ala能在一定程度上降低这些病生理改变。
表1 不同组别小鼠的肝脏及心脏系数
表2给出了不同组别小鼠的血常规指标。
表2 不同组别小鼠的血常规指标
从表2中的数据可见，DOX+C70-Lys及DOX+C70-Ala两组的各项血常规指标都较接近对照组，而好于DOX+Saline及DOX+VC组，尤其在红细胞、血红蛋白、血小板和中性粒细胞上，并且DOX+C70-Lys组的血常规指标又好于DOX+C70-Ala组。
血常规一般代表动物体整体的生理状态，例如是否有贫血，是否有炎症等。由表2的结果可见，C70-Lys或C70-Ala处理后的小鼠整体的生理状态好于模型组，也好于VC处理组，并且C70-Lys的效果又好于C70-Ala。此外，中性粒细胞的升高说明体内有炎症，而DOX+C70-Lys组其中性粒细胞基本与对照组相近，说明虽然富勒烯对于小鼠而言是外源性物质，但其并未引起明显的炎症，反而在一定程度上能改善阿霉素引起的炎症。
图7给出了各组小鼠的血生化指标，包括肌酸激酶、谷丙转氨酶、谷草转氨酶、乳酸脱氢酶和α-羟丁酸脱氢酶。
从图7的数据可见：DOX+C70-Lys及DOX+C70-Ala两组的各项血生化指标都较接近对照组，而好于DOX+Saline及DOX+VC组，尤其在谷丙转氨酶、谷草转氨酶、乳酸脱氢酶上，并且DOX+C70-Lys组的血生化指标又好于DOX+C70-Ala组。
肌酸激酶和α-羟丁酸脱氢酶的升高一般与心脏的损伤有关，由图7的结果说明阿霉素造成了小鼠的心脏损伤，而C70-Lys和C70-Ala，尤其是C70-Lys，能降低阿霉素造成的心脏损伤。
谷丙转氨酶、谷草转氨酶和乳酸脱氢酶一般与肝脏的损伤关联，由图7的结果说明阿霉素造成了小鼠的肝脏损伤，而C70-Lys和C70-Ala，尤其是C70-Lys，能降低阿霉素造成的肝脏损伤。
表3给出了不同组别小鼠的肝脏的氧化还原指标。
表3 不同组别小鼠的肝脏的氧化还原指标
从表3的氧化还原指标可见，阿霉素处理组小鼠体内的氧化水平升高，出现了氧化应激，C70-Lys、C70-Ala和Vc都能降低相应的氧化水平，其作用效果的优劣顺序为C70-Lys>C70-Ala>Vc。说明C70-Lys和C70-Ala能抵抗阿霉素造成的体内氧化应激损伤。
图7和表3都表明C70-Lys、C70-Ala能显著预防和/或修复阿霉素对小鼠的心脏及肝脏损伤，且清除自由基效果更好的C70-Lys在活体水平效果也更佳。
实施例7.1
羟基和赖氨酸修饰的富勒烯衍生物(为方便表述，下简称“C60-Lys”)的制备
将赖氨酸与NaOH溶液混合(其中NaOH质量分数为28％，赖氨酸与NaOH的摩尔比是1:2)，再与乙醇混合(其中NaOH溶液与乙醇的体积比为1:5)，将制备得到的赖氨酸的乙醇碱溶液逐滴加入到C60(赖氨酸与C60的摩尔比是100:1)的甲苯溶液中，搅拌过夜(反应温度为50℃；反应时间为24h)，之后除去上层甲苯层，下层产物透析除过量NaOH，冷冻干燥保存，即制备得到所述羟基和赖氨酸修饰的富勒烯衍生物(C60-Lys)。
所述C60-Lys用于以下相应实施例中。
实施例7.2
C60-Lys水合粒径的测定
取少量上述实施例7.1制备得到的C60-Lys粉末溶于水配成稀溶液，由于分子间相互作用，C60-Lys在水中团聚成纳米颗粒，形成水合粒径在1～200nm的颗粒。
采用动态光散射(DLS，Zetasizer Nano ZSP)测定了在pH＝7.0的纯水中C60-Lys纳米颗粒的水合粒径，平均粒径为138.3±1.1nm，参见图8。
实施例8
C70-Lys和C60-Lys在体外清除自由基的效果及其比较
电子顺磁共振(ESR)检测羟基自由基强度实验，采用紫外诱导产生羟基自由基的方法：
对照组为：将50μL浓度为1M的双氧水、50μL PBS缓冲液(pH＝7.4)和微量(0.133mM)二甲基吡啶N-氧化物(DMPO、自由基捕获剂)溶液混合，用280nm紫外光照射4min，此时即可产生羟基自由基的信号；
实验组为：将50μL浓度为1M的双氧水、50μL PBS缓冲液(pH＝7.4)和微量(0.133mM)二甲基吡啶N-氧化物(DMPO、自由基捕获剂)溶液混合，立即加入100μg/mL的C70-Lys或C60-Lys的水溶液10μL，用280nm紫外光照射4min，检测自由基的信号强度，检测结果参见图9。
当C70-Lys及C60-Lys的浓度均为100μg/mL时，两者均能猝灭羟基自由基，C70-Lys能清除约60％的羟基自由基，C60-Lys的清除率则为22％，由此可见C70-Lys的自由基清除效果明显优于C60-Lys。
实施例9
C70-Lys和只修饰了羟基的C70衍生物(为方便表述，以下简称“C70-OH”)在体外清除自由基的效果及其比较
C70-OH制备方法如下：将7mL质量百分含量为30％的过氧化氢(分析纯，购于国药试剂)水溶液和3mL质量百分含量为40％的氢氧化钠(分析纯，国药试剂)加入100mL圆底烧瓶，加入200mg富勒烯C70固体(纯度：99％，厦门福纳新材料科技有限公司)，再加入磁力搅拌子(型号：B200)，使用磁力搅拌器搅拌24h(温度：70℃，转速：1000r/min)，使用溶剂过滤器(容积：1L，滤膜孔径：200nm，津腾公司)过滤得到棕黄色溶液。将上述步骤得到的溶液加入50ml的离心管中，再加入过量的浓度为95％的乙醇(分析纯，国药试剂)。经过离心(转速：10000r/min，时间：4min)后去除上层无色溶液，将收集的沉淀溶于超纯水中，得到黄色澄清溶液。将溶液装入透析袋(截止分子量为3500)放入超纯水中透析，透析至超纯水的电导率小于1μs/cm，得到C70-OH。根据其投料比和反应效率，测算所述C70-OH上的羟基数为20-40。
电子顺磁共振(ESR)检测羟基自由基强度实验，采用紫外诱导产生羟基自由基的方法：
对照组为：将50μL浓度为1M的双氧水、50μL PBS缓冲液(pH＝7.4)和微量(0.133mM)二甲基吡啶N-氧化物(DMPO、自由基捕获剂)溶液混合，用280nm紫外光照射4min，此时即可产生羟基自由基的信号；
实验组为：将50μL浓度为1M的双氧水、50μL PBS缓冲液(pH＝7.4)和微量(0.133mM)二甲基吡啶N-氧化物(DMPO、自由基捕获剂)溶液混合，立即加入100μg/mL的C70-Lys或C70-OH的水溶液10μL，用280nm紫外光照射4min，检测自由基的信号强度，检测结果参见图10。
当C70-Lys及C70-OH的浓度均为100μg/mL时，两者均能猝灭羟基自由基，C70-Lys能清除约62％的羟基自由基，C70-OH的清除率则为14％，由此可见C70-Lys的自由基清除效果明显优于C70-OH。
以上，对本发明的实施方式进行了说明。但是，本发明不限定于上述实施方式。凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种富勒烯衍生物，其平均分子式为C2n(OH)x(AA)y；其中，n为整数，20≤n≤50；0<x≤30；0<y≤18；其中，OH代表羟基，AA代表水溶性氨基酸；羟基和水溶性氨基酸均连接于富勒烯上；
优选，28≤n≤40；进一步优选，30≤n≤37；更优选n为30或35；
优选，5≤x≤20；进一步优选，7≤x≤15；
优选，4≤y≤15；进一步优选，6≤y≤12；
优选，所述水溶性氨基酸为丙氨酸、甘氨酸、丝氨酸、精氨酸、赖氨酸和天冬氨酸中的至少一种；更优选为丙氨酸、丝氨酸和赖氨酸中的至少一种。
2.如权利要求1所述的富勒烯衍生物，其水合半径范围为1-1000nm，优选为80-500nm，更优选为100-200nm。
3.一种制备权利要求1或2所述富勒烯衍生物的方法，所述富勒烯衍生物是通过羟基和水溶性氨基酸修饰富勒烯得到的。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，将富勒烯固体粉末与水溶性氨基酸在碱性溶液下反应，或者将富勒烯的有机溶液与水溶性氨基酸的碱溶液在相转移催化剂下进行反应。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于包括如下步骤：
1)配制水溶性氨基酸的碱溶液；
2)将步骤1)的碱溶液与醇混合；
3)将步骤2)得到的混合溶液加入到含有富勒烯的有机溶剂中反应；
优选，所述碱溶液中碱的质量分数为15～60％；进一步优选为28～40％；
优选，所述水溶性氨基酸与碱的摩尔比为1:1～5；进一步优选为1:1.15～3；
优选，所述水溶性氨基酸与富勒烯的摩尔比为10～1000:1；优选为20～500：1；更优选为50～100:1；
优选，所述碱溶液与醇的体积比为1:1～10；优选为1:1～6。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于进一步包括后处理步骤；优选所述后处理步骤为，在反应结束后，除去上层有机溶剂，将下层产物透析，除去碱，冷冻干燥。
7.权利要求1或2所述的富勒烯衍生物在制备自由基清除剂或抗氧化剂中的应用。
8.权利要求1或2所述的富勒烯衍生物在制备预防和/或修复自由基引起的器官损伤的药物中的应用；
优选，所述器官损伤由化疗药物、化学毒物或者辐射产生；优选所述化疗药物为阿霉素、紫杉醇和环磷酰胺中的至少一种；优选所述化学毒物为四氯化碳和酒精中的至少一种；
优选，所述器官损伤为心脏损伤、肝脏损伤、血液系统损伤和肾脏损伤中的至少一种；
优选，所述药物用于预防和/或修复器官损伤伴随的白细胞下降、或者贫血、或者血清中肌酸激酶、谷丙转氨酶、谷草转氨酶、乳酸脱氢酶和α-羟丁酸脱氢酶中任一种的升高，或者同时具有上述改变中的至少两种。
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