JP6775589B2 - 骨髄抑制を治療するための薬物の製造におけるフラーレン／金属フラーレンの使用 - Google Patents

Description

（相互参照）
本発明は、北京福納康生物技術有限公司と中国科学院化学研究所が中国特許庁へ提出した、出願番号がＣＮ２０１６１００４１９１４．１であり、発明の名称が「骨髄抑制を予防及び／又は治療するフラーレンマイクロナノ材料及びその使用」である中国特許出願に基づき優先権を主張し、その全体において参照によって本発明に組み込まれる。

本発明は、さらに、中国科学院化学研究所と北京福納康生物技術有限公司が中国特許庁へ提出した、出願番号がＣＮ２０１６１０６５６８２１．Ｘであり、発明の名称が「骨髄抑制を予防及び／又は治療するマイクロナノ材料及びその使用」である中国特許出願に基づき優先権を主張し、その全体において参照によって本発明に組み込まれる。

本発明は、バイオメディシン分野に属し、具体的なには、骨髄抑制を治療するための薬物の製造におけるフラーレンマイクロナノ材料及び／又は金属フラーレンマイクロナノ材料の使用に関する。

近年、悪性腫瘍の発生率がますます高まりつつあり、人々の健康を重大な危害を与えている。科学技術の進歩に伴い、癌を治療するための様々の方法や手段が新たに登場しているが、化学療法剤の治療及び放射線の治療は、依然として、臨床でよく使用される悪性腫瘍の治療法の一つである。現在、腫瘍患者の６０％〜７０％に対しては、化学療法剤の治療又は放射線の治療が必要とし、一般的に、腫瘍の切除手術後、合理的な放射線の治療又は化学療法剤の治療を２〜４週間で受けると、「転移性病変」を即刻に消滅することができ、腫瘍の再発及び転移を効率的に防止することができる。しかしながら、大部分の化学療法剤及び放射線療法の放射線は、癌細胞の殺傷と同時に、人体で積極的に増殖する正常細胞も損傷するため、非常に大きな副作用を起こす。特に、骨髄細胞、造血幹細胞等については、化学療法剤及び放射線療法の放射線による殺傷作用は患者に二次性損傷をもたらし、化学放射線治療による骨髄抑制は、最初は白血球、血小板の減少を示し、疾病の場合には、赤血球及びヘモグロビンがともに減少し、ひいては、再生不良性貧血、白血病等の疾患が発生する可能性もある。したがって、化学放射線治療が継続できるか否かの主な要因の一つは、患者の骨髄造血機能が化学放射線治療の過程で保護できるか否か、化学放射線治療による骨髄抑制が緩和できるか否かによる。骨髄抑制の予防及び治療において、多くの漢方薬及び化学薬は一定の効果を有するが、人体胃腸管内での吸収率が低く、胃腸管の副作用を起こしやすいため、これらの薬物の使用が制限される。また、他の有効的な治療法として、組換えヒト顆粒球コロニー刺激因子を使用することがあるが、高価格及び自体の欠点の原因で、まだ広く使用することができない。したがって、化学療法剤及び放射線療法の放射線に起因する骨髄抑制の毒性を減少できるのに適切な薬物を見つけることには、患者の病状を軽減させ、腫瘍をさらに治療するために重要な臨床的意義がある。

フラーレンは、黒鉛、金剛石及び非晶質炭素以外の炭素元素の別の同素体である。それらは、Ｃ６０、Ｃ７０、Ｃ７６、Ｃ７８、Ｃ８２及びＣ８４等を含む、炭素原子からなるケージ状構造を有するものである。また、フラーレンのカーボンケージの内部は空洞構造であるため、その内部空洞に異なる原子、イオン又は原子クラスターを挿入することができ、それを金属フラーレンと言い、例えば、Ｌａ＠Ｃ６０は、Ｃ６０のケージ状構造にＬａが挿入されていることを表し、＠はａｔを表し、挿入されている意味を象徴的に表示している。

上記の背景技術に開示された情報は、本発明の全体的な背景の理解を高めるためのものだけであって、この情報が当業者に既知された先行技術であることを認めたり、あるいは如何なる形で示唆するものと見なしてはいけない。

本発明の目的は、骨髄抑制を治療するための薬物の製造におけるフラーレンマイクロナノ材料及び／又は金属フラーレンマイクロナノ材料の使用を提供することであり、さらに、本発明の目的は、骨髄抑制を治療するための薬物組成物及びその方法を提供することである。本発明に係るフラーレンマイクロナノ材料及び／又は金属フラーレンマイクロナノ材料は、フラーレン分子の高共役性及びラジカルを効率的に除去する等の特徴を有し、骨髄へ高効率で迅速に濃縮することができ、体内で骨髄抑制に優れた予防及び治療効果を有し、放射線療法の放射線及び化学療法剤による骨髄及び他の器官に対する毒性副作用を効率的に減少し、骨髄抑制による白血球の減少、血小板の減少、ヘモグロビンの減少及び単核細胞の減少を治療することができ、且つ、安全で無毒であり、生体外へ代謝することができる。

目的を達成するために、本発明は下記のものを提供する。

（１）骨髄抑制を治療すること、（２）骨髄抑制による白血球の減少、血小板の減少、ヘモグロビンの減少及び単核細胞の減少の少なくとも一つを治療すること、（３）骨髄細胞及び／又は造血細胞を保護すること、（４）骨髄に濃縮することができること、（５）肝臓組織、脾臓組織及び腎臓組織を保護すること、（６）ラジカルを除去すること、（７）生体の抗酸化システムの機能を高めることからなる性質の少なくとも一つを有する薬物の製造におけるフラーレンマイクロナノ材料及び／又は金属フラーレンマイクロナノ材料の使用である。

本発明は、骨髄抑制の治療を必要とする生体内に有効量のフラーレンマイクロナノ材料及び／又は金属フラーレンマイクロナノ材料を投与するステップを含む、骨髄抑制を治療する方法をさらに提供する。

本発明は、フラーレンマイクロナノ材料及び／又は金属フラーレンマイクロナノ材料を含み、薬学的に許容される担体、薬学的に許容される希釈剤及び薬学的に許容される賦形剤の少なくとも一つをさらに含む、骨髄抑制を治療する薬物組成物をさらに提供する。

上記の使用、方法又は薬物組成物の他の実施態様において、上記のフラーレンマイクロナノ材料及び／又は金属フラーレンマイクロナノ材料は、油溶性フラーレンマイクロナノ材料、油溶性金属フラーレンマイクロナノ材料、上記の油溶性フラーレンマイクロナノ材料と上記の油溶性金属フラーレンマイクロナノ材料の組成物、水溶性フラーレンマイクロナノ材料、水溶性金属フラーレンマイクロナノ材料、上記の水溶性フラーレンマイクロナノ材料と上記の水溶性金属フラーレンマイクロナノ材料の組成物、上記の６つのものの薬学的に許容されるエステル又は上記の６つのものの薬学的に許容される塩からなる群から選ばれた少なくとも一つの有効成分を含む。

上記の使用、方法又は薬物組成物の他の実施態様において、上記の油溶性フラーレンマイクロナノ材料は、フラーレン本体材料を油溶性修飾することによって得られたものであり、上記の油溶性金属フラーレンマイクロナノ材料は、金属フラーレン本体材料を油溶性修飾することによって得られる。

上記の使用、方法又は薬物組成物の他の実施態様において、油溶性修飾の有効な方法は、共有又は非共有作用によりフラーレン本体材料及び／又は金属フラーレン本体材料を油溶性修飾することによって得られ、具体的な油溶性修飾方法は従来技術に開示された方法に従って行うことができる。例えば、上記のフラーレン本体材料及び／又は金属フラーレン本体材料を食用油で被覆することにより上記の油溶性フラーレンマイクロナノ材料及び／又は油溶性金属フラーレンマイクロナノ材料を得る方法を選択し得、具体的な被覆方式としてはボールミル又は超音波方式を使用することができる。即ち、上記のフラーレン本体材料及び／又は金属フラーレン本体材料（ともに粉末状である）と上記の食用油を混合し、得られた混合物を一定の時間で超音波処理或いはボールミル機でボールミルすることにより、油溶性フラーレンマイクロナノ材料及び／又は油溶性金属フラーレンマイクロナノ材料を製造し得る。

上記の使用、方法又は薬物組成物の他の実施態様において、上記の混合物を一定の時間で超音波処理或いはボールミル機でボールミルするステップの後、順次に遠心分離によって沈降物を除去した後、得られた上層液を濾過することにより、得られた油溶性フラーレンマイクロナノ材料及び／又は油溶性金属フラーレンマイクロナノ材料を精製するステップをさらに含む。

上記の使用、方法又は薬物組成物の他の実施態様において、超音波処理或いはボールミルした混合物には、上記の食用油１ｍｌあたり０．０５〜５００ｍｇフラーレン本体材料及び／又は金属フラーレン本体材料が分散されており、この範囲の開示は、範囲内のすべての数値の開示として見なすべきであり、選択し得るものは、０．０５〜１ｍｇ、０．０５〜１０ｍｇ、０．０５〜１００ｍｇ等である。

上記の使用、方法又は薬物組成物の他の実施態様において、上記の混合物を３０分〜１５時間でボールミル或いは超音波処理する。

上記の使用、方法又は薬物組成物の他の実施態様において、上記の油溶性フラーレンマイクロナノ材料及び／又は油溶性金属フラーレンマイクロナノ材料において、フラーレン本体材料及び／又は金属フラーレン本体材料の濃度は１２００〜１５００ｐｐｍ（ｍｇ／ｋｇ）であってもよく、例えは、１５００ｐｐｍであってもよい。

上記の使用、方法又は薬物組成物の他の実施態様において、上記の食用油は、オリーブ油、アマニ油、ヒマワリ種子油、コーン胚芽油、コーン油及びスクワランの少なくとも一つを含むが、これに限定されるものではない。

上記の使用、方法又は薬物組成物の他の実施態様において、上記の油溶性フラーレンマイクロナノ材料及び／又は油溶性金属フラーレンマイクロナノ材料は、具体的には、食用油に被覆されたガドリニウム金属フラーレン（例えば、食用油に被覆されたＧｄ＠Ｃ８２）、食用油に被覆されたＣ６０、食用油に被覆されたＣ７０又は食用油に被覆されたＣ８４等であってもよく、その中、「食用油」は、オリーブ油、アマニ油、ヒマワリ種子油、コーン胚芽油、コーン油及びスクワランのいずれかの一つを指す。

以上の記載から分かるように、上記の油溶性フラーレンマイクロナノ材料及び／又は油溶性金属フラーレンマイクロナノ材料は、（１）フラーレン本体材料及び／又は金属フラーレン本体材料は上記の食用油で被覆され、その脂溶性特性によって、細胞に進入しやすく、且つ、生体内で血液循環を介して臓器に到達することができ、（２）被覆して得られた材料中のフラーレン及び／又は金属フラーレンはカーボンケージの完全性を維持でき、良好なラジカルの除去効果を有する、という全ての性質を有する。

上記の使用、方法又は薬物組成物の他の実施態様において、本発明の上記の水溶性フラーレンマイクロナノ材料は、フラーレン本体材料を水溶性修飾することによって得られたものであり、上記の水溶性金属フラーレンマイクロナノ材料は、金属フラーレン本体材料を水溶性修飾することによって得られたものである。

上記の使用、方法又は薬物組成物の他の実施態様において、水溶性修飾は、従来技術に開示された方法に従って修飾してもよい。選択し得る上記の水溶性修飾の方法は、以下の方法の任意の一種を含む。方法１として、共有結合修飾によって本体材料の表面に親水性基を修飾する方法は、一般的には、アルカリの作用下での固液反応或いは液液反応により実現し、具体的には、フラーレン本体材料及び／又は金属フラーレン本体材料を過酸化水素及びアルカリ（このアルカリは、具体的には、水酸化ナトリウム或いは水酸化カリウム）と混合して反応することにより、水溶性フラーレンマイクロナノ材料及び／又は水溶性金属フラーレンマイクロナノ材料が得られ、このマイクロナノ材料はヒドロキシル基で修飾されるものであり、アミノ基で修飾されたマイクロナノ材料を得る必要がある場合、上記のステップの水酸化ナトリウム及び／又は水酸化カリウムをアンモニア水で置換すれば良い。方法２として、非共有作用は、疎水−疎水作用を介して、水溶性担体とフラーレン本体材料及び／又は金属フラーレン本体材料を対応する水溶性材料に形成させる。

上記の使用、方法又は薬物組成物の他の実施態様において、フラーレン本体材料及び／又は金属フラーレン本体材料と過酸化水素及びアルカリを混合して反応するステップの後、エタノールで洗浄した後に透析する精製ステップをさらに含む。

上記の使用、方法又は薬物組成物の他の実施態様において、５０〜３００ｍｇのＣ６０、Ｃ７０又はＧｄ＠Ｃ８２固体、５〜３０ｍｌの２０〜４０％の過酸化水素、２〜２０ｍｌの１Ｍ〜３Ｍのアルカリ溶液を秤量し、対応するＣ６０、Ｃ７０又はＧｄ＠Ｃ８２固体が完全に溶解するまでに、５０〜１００℃条件下で混合する。上記記載は、各物質間の添加割合の関係を示しており、実際の使用は、５０〜３００ｍｇ、５〜３０ｍｌ及び２〜２０ｍｌ等の具体的な反応スケールに限定されず、割合に応じて拡大することができる。

上記の使用、方法又は薬物組成物の他の実施態様において、上記の水溶性フラーレンマイクロナノ材料及び／又は水溶性金属フラーレンマイクロナノ材料は、カーボンケージ外表面が親水性基で修飾されるフラーレン、カーボンケージ外表面が親水性基で修飾される金属フラーレン、水溶性担体に担持されたフラーレン、及び水溶性担体に担持された金属フラーレンからなる群から選ばれた少なくとも一つを含む。ここで、修飾された或いは担持されたフラーレン及び／又は金属フラーレンは、フラーレン本体材料及び／又は金属フラーレン本体材料を修飾又は担持することにより得られた水溶性フラーレンマイクロナノ材料及び／又は水溶性金属フラーレンマイクロナノ材料を指す。

上記の使用、方法又は薬物組成物の他の実施態様において、上記の親水性基は、ヒドロキシル基、カルボキシル基、メルカプト基及びアミノ基の一つ又は複数を含む。

上記の使用、方法又は薬物組成物の他の実施態様において、上記の水溶性フラーレンマイクロナノ材料及び／又は水溶性金属フラーレンマイクロナノ材料は、具体的には、水溶性のヒドロキシル化ガドリニウム金属フラーレン（ＧＦＮＣ、Ｇｄ＠Ｃ８２（ＯＨ）_ｎ）、水溶性のヒドロキシル化Ｃ６０（Ｃ６０（ＯＨ）_ｎ）又は水溶性のヒドロキシル化Ｃ７０（Ｃ７０（ＯＨ）_ｎ）等の水溶性のヒドロキシル化フラーレンであってもよい。

上記の使用、方法又は薬物組成物の他の実施態様において、上記の水溶性担体は、リポソーム、ポリマ−ミセル及びタンパク質の少なくとも一つを含む医学分野でよく使用される薬物担体である。上記のポリマ−ミセルは、ポリ（乳酸−コ−グリコール酸）−ポリエチレングリコール（ＰＥＧ−ＰＬＧＡ）、ポリリジン又はキトサンであってもよく、上記のタンパク質は、アルブミン又はトランスフェリンであってもよい。

上記の使用、方法又は薬物組成物の他の実施態様において、上記の水溶性フラーレンマイクロナノ材料及び／又は水溶性金属フラーレンマイクロナノ材料は、（１）静脈を介して生体内に注入され且つ血液循環を介して骨髄に濃縮することができるように、表面を親水性にさせ、（２）血液循環によって骨髄の血洞の内皮細胞隙間を通過し、血管内外の圧力差によって骨髄に迅速に進入することができるように、マイクロナノ材料は剛性（即ち、変形し難い）を有するという全ての性質を有する。

上記の使用、方法又は薬物組成物の他の実施態様において、上記の骨髄抑制は、薬物化学療法、化学的毒物又は骨髄抑制の副作用のある薬物によって誘発される。上記の薬物化学療法は、現在、臨床でよく使用される骨髄に対して抑制作用を有する薬物を含んでもよく、この薬物は、シクロホスファミド（ＣＴＸ）、アドリアマイシン、シスプラチン又はパクリタキセル等であってもよく、上記の化学的毒物は、ベンゼン又はベンゼンの誘導体（例えは、クロラムブシル）であってもよく、骨髄抑制の副作用のある上記の薬物はクロラムフェニコール、テトラサイクリン、メチダチオン又はインドメタシンであってもよい。

上記の使用、方法又は薬物組成物の他の実施態様において、上記の骨髄抑制は、腫瘍放射線療法又は骨髄抑制の副作用を生成する光線によって誘発される。放射線療法に用いられる放射線は、α線、β線、γ線又はＸ線であってもよく、骨髄抑制の副作用を生成する放射線は、関連する作業のために不可避的な放射線であってもよい。

上記の使用、方法又は薬物組成物の他の実施態様において、上記のフラーレン本体材料は、一般式がＣ_２ｍである炭素原子からなるケージ状構造を一つ又は複数有し、ここで、３０≦ｍ≦６０であり、例えば、Ｃ_６０、Ｃ_７０及びＣ_８４等である。

上記の使用、方法又は薬物組成物の他の実施態様において、上記の金属フラーレン本体材料は、Ｍ＠Ｃ_２ｎ、Ｍ_２＠Ｃ_２ｎ、ＭＡ＠Ｃ_２ｎ、Ｍ_３Ｎ＠Ｃ_２ｎ、Ｍ_２Ｃ_２＠Ｃ_２ｎ、Ｍ_２Ｓ＠Ｃ_２ｎ、Ｍ_２Ｏ＠Ｃ_２ｎ及びＭ_ｘＡ_３−ｘＮ＠Ｃ_２ｎの一つ又は複数を含み、ここで、Ｍ、Ａは、いずれも金属元素を表し、且つ、Ｍ、Ａは、いずれもランタニド金属元素、Ｓｃ及びＹから選ばれた一つ任意の一種であり、ここで、３０≦ｎ≦６０であり、０≦ｘ≦３である。Ｎは窒素元素を表し、Ｃは炭素元素を表し、Ｓは硫黄元素を表し、ランタニド金属元素はＬａ、Ｃｅ、Ｐｒ、Ｎｄ、Ｐｍ、Ｓｍ、Ｅｕ、Ｇｄ、Ｔｂ、Ｄｙ、Ｈｏ、Ｅｒ、Ｔｍ、Ｙｂ及びＬｕを含み、例えば、Ｇｄ＠Ｃ８２である。

上記の使用、方法又は薬物組成物の他の実施態様において、上記の水溶性フラーレンマイクロナノ材料及び／又は水溶性金属フラーレンマイクロナノ材料の平均粒子サイズ範囲は１〜５００ｎｍであり、具体的には、１４０〜２００ｎｍであってもよい。

上記の使用、方法又は薬物組成物の他の実施態様において、上記の油溶性フラーレンマイクロナノ材料及び／又は水溶性金属フラーレンマイクロナノ材料の平均粒子サイズ範囲は０．５〜５０ｎｍであり、具体的には、０．５〜１０ｎｍ、０．５〜５ｎｍ、０．５〜２ｎｍ又は約１ｎｍであってもよい。

上記の使用における薬物又は上記の薬物組成物の他の実施態様において、この薬物又は薬物組成物は、錠剤、丸剤、散剤、錠剤、マイクロカプセル、カシェー剤（ｃａｃｈｅｔｓ）、エリキシル剤、懸濁剤、乳剤、液剤、シロップ剤、エアロゾル剤、軟膏剤、軟質及び硬質ゼラチンカプセル、坐剤、無菌注射液又は無菌包装の注射用粉末剤の製剤であってもよい。本発明において、受験者に投与する後、有効成分を即時放出、持続放出又は遅延放出するように、有効成分を薬物又は薬物組成物に製造する方法は、当業者に公知の方法により製造することができ、例えば、有効成分を担体と混合して、担体で希釈し又は担体に封入することができる。

上記の使用における薬物又は上記の薬物組成物の他の実施態様において、担体、賦形剤及び希釈剤として適切な実例は、例えば、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、デンプン、樹脂、アラビアガム、リン酸カルシウム、アルギン酸塩、トラガカントガム、ゼラチン、ケイ酸カルシウム、微結晶セルロース、ポリビニルピロリドン、セルロース、水シロップ（ｗａｔｅｒ ｓｙｒｕｐ）、メチルセルロース、メチルパラベン、プロピルパラベン、タルク、ステアリン酸マグネシウム及び流動パラフィンを含む。

上記の使用における薬物又は上記の薬物組成物の他の実施態様において、この薬物又は薬物組成物は、潤滑剤、湿潤剤、乳化剤、懸濁剤、防腐剤、甘味剤又は矯味剤等の助剤をさらに含んでもよい。

上記の使用における薬物又は上記の薬物組成物の他の実施態様において、製剤中の上記の水溶性フラーレンマイクロナノ材料及び／又は水溶性金属フラーレンマイクロナノ材料の濃度は０．１ｍＭ〜１０ｍＭであり、製剤中の上記の油溶性フラーレン及び／又は油溶性金属フラーレンの濃度は３００ｐｐｍ〜５０００ｐｐｍ（ｍｇ／ｋｇ）である。

上記の方法の他の実施態様において、フラーレンマイクロナノ材料及び／又は金属フラーレンマイクロナノ材料は、化学療法剤又は放射線療法の放射線を使用する前の２４時間以内に使用してもよく、化学放射線治療の過程において使用してもよく、化学放射線治療が完了した後の１〜２週間以内に継続して使用してもよい。

上記の方法の他の実施態様において、上記の有効成分の投与量は１ｍｇ／ｋｇ／ｄ〜５００ｍｇ／ｋｇ／ｄであり、その中、１〜１００ｍｇ／ｋｇ／ｄ、１〜２０ｍｇ／ｋｇ／ｄ又は１〜１０ｍｇ／ｋｇ／ｄであってもよい。

上記の方法の他の実施態様において、上記の投与方式は注射投与または経口投与である。有効成分は体内に進入した後、血液循環を介して直接に作用するため、透過する必要がなく、使用容量が小さく、治療効果が高いため、上記の注射は腹腔内注射又は静脈内注射であってもよい。また、消化器系の濾過及び吸収によって、副作用がさらに小さくなり、治療効果が顕著であるため、経口摂取してもよい。

上記の方法の他の実施態様において、上記の生体は人又は動物であり、動物は、例えば、マウス、モルモット、ラット、イヌ、ウサギ、サル等の哺乳類動物であってもよい。

本発明に用いられる「治療」という用語は、一般的に許容される意味を含み、この意味は、発生した症状又は予定の病変の発症を阻止、予防、抑止、改善、及び遅延、停止又は逆転する事情を含む。従って、本発明は治療的投与及び予防的投与という意味を含む。

本発明に用いられる用語「有効量」は、本発明の方法により生体にフラーレンマイクロナノ材料及び／又は金属フラーレンマイクロナノ材料が与えられた場合、骨髄抑制を防止するための活性成分を効率的に伝達するのに十分な量である。骨髄抑制病状が軽い者は単回で投与し、骨髄抑制病状が重い者は複数回で投与してもよく、単回又は複数回で使用した後、骨髄抑制現象は顕著に予防及び治療される。

本発明に用いられる用語「有効成分」は、水溶性フラーレンマイクロナノ材料、水溶性金属フラーレンマイクロナノ材料、水溶性フラーレンマイクロナノ材料と水溶性金属フラーレンマイクロナノ材料の組成物、油溶性フラーレンマイクロナノ材料、油溶性金属フラーレンマイクロナノ材料、油溶性フラーレンマイクロナノ材料と油溶性金属フラーレンマイクロナノ材料の組成物、及び、上記の６つのものの薬学的に許容されるエステル及び上記の６つのものの薬学的に許容される塩の少なくとも一つを指す。

本発明に用いられる用語「フラーレン本体材料」は、油溶性修飾又は水溶性修飾が行われていないフラーレンを指し、即ち、フラーレン自体を指す。

本発明に用いられる用語「金属フラーレン本体材料」は、油溶性修飾又は水溶性修飾が行われていない金属フラーレンを指し、即ち、金属フラーレン自体を指す。

計量を容易にするために、本発明では全ての水溶性フラーレンマイクロナノ材料、水溶性金属フラーレンマイクロナノ材料、油溶性フラーレンマイクロナノ材料及び油溶性金属フラーレンマイクロナノ材料に関する具体的な含有量、濃度等の定量値の限定は、それに対応するフラーレン本体材料又は金属フラーレン本体材料の具体的な含有量、濃度等によって確定され、例えば、有効成分の投与量は１ｍｇ／ｋｇ／ｄ〜５００ｍｇ／ｋｇ／ｄであることは、１日当たり１ｋｇマウス当たり投与される有効成分中の、対応するフラーレン本体カーボンケージ又は金属フラーレン本体カーボンケージの量は、１ｍｇ〜５００ｍｇであるということを指す。

従来技術に比べて、本発明は以下のような有益な効果を含む。

１、本発明において、フラーレンマイクロナノ材料及び／又は金属フラーレンマイクロナノ材料は、フラーレン分子の高共役性及びラジカルを効率的に除去する等の特徴を有する。

２、本発明において、フラーレンマイクロナノ材料及び／又は金属フラーレンマイクロナノ材料は、その特殊な物理化学的性質を有するため、血液循環を介して骨髄類洞血管中の内皮細胞間のナノ穴を通過することができ、且つ血管内外の圧力差によって臓器、骨髄に高効率で迅速に濃縮することができる。骨髄中のフラーレンマイクロナノ材料及び／又は金属フラーレンマイクロナノ材料の単位質量の含有量は骨質の１２倍と大きく、骨髄中の滞留時間は他の器官に比べて著しく高いため、良好な骨髄ターゲティング性を有することを示している。

３、本発明において、フラーレンマイクロナノ材料及び／又は金属フラーレンマイクロナノ材料は、ラジカルを効率的に除去することができ、体内で骨髄抑制に対して優れた予防及び治療作用を有し、放射線療法の放射線及び化学療法剤の骨髄及び他の器官に対する毒性副作用を効率的に低減し、骨髄抑制による白血球の減少、血小板の減少、ヘモグロビンの減少及び単核細胞の減少を治療することができ、且つ、多回の治療コースの後でも、保護効果が依然として顕著であり、且つ、フラーレンマイクロナノ材料及び／又は金属フラーレンマイクロナノ材料は放射線療法及び化学療法剤による腫瘍治療に影響を与えることはない。したがって、本発明において、フラーレンマイクロナノ材料及び／又は金属フラーレンマイクロナノ材料は、化学療法剤又は放射線療法の放射線等による骨髄抑制の予防及び治療のために使用することができ、骨髄抑制治療用薬物の製造に使用することができる。

４、本発明において、フラーレンマイクロナノ材料及び／又は金属フラーレンマイクロナノ材料は、その製造が簡単で迅速であり、生体、骨髄細胞及び正常細胞に対し明白な細胞毒性が無く、安全で無毒であり、体外へ代謝することができ、良好な生体適合性を有する。

５、本発明において、フラーレンマイクロナノ材料及び／又は金属フラーレンマイクロナノ材料は肝臓、腎臓及び脾臓等の損傷をも保護することができる。

本発明の実施例２に係る異なる群別のマウスの血液検査指標である。 本発明の実施例２に係る異なる群別のマウスの血液検査指標である。 本発明の実施例２に係る異なる群別のマウスの血液検査指標である。 本発明の実施例２に係る異なる群別のマウスの血液検査指標である。 本発明の実施例２に係る異なる群別のマウスの体重変化グラフである。 本発明の実施例２に係る異なる群別のマウスの関連酵素指標である。 本発明の実施例２に係る異なる群別のマウスの関連酵素指標である。 本発明の実施例２に係る異なる群別のマウスの関連酵素指標である。 本発明の実施例２に係る異なる群別のマウスの関連酵素指標である。 本発明の実施例３に係る異なる群別のマウスの血液検査指標である。 本発明の実施例３に係る異なる群別のマウスの血液検査指標である。 本発明の実施例３に係る異なる群別のマウスの血液検査指標である。 本発明の実施例３に係る異なる群別のマウスの血液検査指標である。 本発明の実施例３に係る異なる群別のマウスの体重変化グラフである。 本発明の実施例３に係る異なる群別のマウスの関連酵素指標である。 本発明の実施例３に係る異なる群別のマウスの関連酵素指標である。 本発明の実施例３に係る異なる群別のマウスの関連酵素指標である。 本発明の実施例３に係る異なる群別のマウスの関連酵素指標である。 本発明の実施例３に係る異なる群別のマウスの血液生化学指標である。 本発明の実施例３に係る異なる群別のマウスの血液生化学指標である。 本発明の実施例３に係る異なる群別のマウスの血液生化学指標である。 本発明の実施例３に係る異なる群別のマウスの血液生化学指標である。 実施例４で製造された水溶性のヒドロキシル化ガドリニウム金属フラーレンの粒度分布図である。 実施例５に係るＩＣＰ−ＭＳを使用して測定したマウス体内の水溶性のヒドロキシル化ガドリニウム金属フラーレンの代謝分布図である。 実施例６に係る１３１Ｉ標識法を使用して測定したマウス体内の水溶性のヒドロキシル化ガドリニウム金属フラーレンの代謝分布図である。 実施例７に係るマウス骨髄中の水溶性のヒドロキシル化ガドリニウム金属フラーレン試料の含有量を異なる時点で測定した電子プローブスペクトルである。 実施例７に係るマウス骨髄中の水溶性のヒドロキシル化ガドリニウム金属フラーレン試料の含有量を異なる時点で測定した電子プローブスペクトルである。 実施例７に係るマウス骨髄中の水溶性のヒドロキシル化ガドリニウム金属フラーレン試料の含有量を異なる時点で測定した電子プローブスペクトルである。 実施例７に係るマウス骨髄中の水溶性のヒドロキシル化ガドリニウム金属フラーレン試料の含有量を異なる時点で測定した電子プローブスペクトルである。 実施例７に係るマウス骨髄中の水溶性のヒドロキシル化ガドリニウム金属フラーレン試料の含有量を異なる時点で測定した電子プローブスペクトルである。 実施例７に係るマウス骨髄中の水溶性のヒドロキシル化ガドリニウム金属フラーレン試料の含有量を異なる時点で測定した電子プローブスペクトルである。 実施例８に係る水溶性のヒドロキシル化ガドリニウム金属フラーレン注射群と対照群のマウス臓器係数を示し、いずれも３０日注射後の値である。 実施例８に係る水溶性のヒドロキシル化ガドリニウム金属フラーレン注射群と対照群のマウスの体重変化図である。 実施例８に係る水溶性のヒドロキシル化ガドリニウム金属フラーレン注射群と対照群のマウスの血液生化学検査であり、いずれも３０日注射後の値である。 実施例９に係るＥＳＲによるＧＦＮＣの体外ラジカル除去実験の結果であり、その中、実線は対照群であり、点線は実験群である。 実施例１０に係る細胞レベルでのＧＦＮＣのラジカル除去の実験効果である。 実施例１１に係る異なる群別のマウスの血液検査指標である。 実施例１２に係る異なる群別のマウス腫瘍の大きさ変化グラフである。 実施例１２に係る異なる群別のマウスの体重変化グラフである。 実施例１３に係る異なる群別のマウスの血液検査指標である。 実施例１４に係る異なる群別のマウス腫瘍の大きさ変化グラフである。 実施例１４に係る異なる群別のマウスの体重変化グラフである。 実施例１４に係る異なる群別のマウスの血液生化学指標である。 実施例１４に係る異なる群別のマウス組織器官の病理学的切片をＨ＆Ｅ染色した後の切片画像である。 実施例１５で製造された水溶性のヒドロキシル化中空フラーレンの粒度分布図である。 実施例１６に係る水溶性のヒドロキシル化中空フラーレン注射群と対照群のマウス臓器係数を示し、いずれも３０日注射後の値である。 実施例１６に係る水溶性のヒドロキシル化中空フラーレン注射群と対照群のマウスの体重変化図である。 実施例１６に係る水溶性のヒドロキシル化中空フラーレン注射群と対照群のマウスの血液生化学検査であり、いずれも３０日注射後の値である。 実施例１７に係るＥＳＲによる水溶性中空フラーレンの体外ラジカル除去実験の結果であり、その中、実線は対照群であり、点線は実験群である。 実施例１８に係る細胞レベルでのＣ６０水溶性誘導体のラジカル除去の実験効果である。 実施例１９に係るＣ６０水溶性誘導体を使用する場合の異なる群別のマウスの血液検査指標である。 実施例２０に係るＣ６０水溶性誘導体を使用する場合の異なる群別のマウスの血液検査指標である。 本発明の図９、図１０、図１７、図２０及び図３２の柱状図において、レジェンド（ｌｅｇｅｎｄ）に示された上から下の順は、柱状図の左から右の順に従って順次に配列されている。

以下、図面を参照しながら、具体的な実施例に従って本発明を説明するが、本発明はそれらの実施例に限定されるものではない。

本発明の実施例に係るフラーレン固体粉末Ｃ６０、Ｃ７０及び金属フラーレン固体粉末Ｇｄ＠Ｃ８２は、いずれもいずれも、廈門福納新材料科技有限公司から購入したもので、純度は９９％であり、シクロホスファミド（ＣＴＸ）はシグマアルドリッチ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）会社から購入したもので、商品番号はＣ０７６８であり、Ｘ線治療装置は北京朝陽医院放療科で使用するものである。その他の材料、試薬、装置等は、特に特定されない限り、商業的供給源から得ることができ、他の実験方法は、特に特定しない限り、常用の方法である。

実施例１、油に被覆された中空フラーレン及び／又は油に被覆された金属フラーレンの製造
（１）フラーレン固体粉末及び／又は金属フラーレン固体粉末及びオリーブ油のような食用油を異なる割合で混合し、ボールミル機で６〜１０時間ボールミルし、
（２）ボールミル処理が終了した後、遠心分離機を用いて、未被覆のフラーレン固体粉末及び／又は金属フラーレン固体粉末を１００００ｒの回転速度で遠心分離を繰り返して固体粉末が遠心分離されるまで除去することにより、油に被覆された中空フラーレン及び／又は油に被覆された金属フラーレンを得た。

（３）紫外可視分光計を用いて、得られた油に被覆された中空フラーレン及び／又は油に被覆された金属フラーレン中の、被覆された中空フラーレン固体粉末及び／又は金属フラーレン固体粉末の具体的な含有量を測定した。

上記の方法に係る一つの具体的な実施例において、中空フラーレンＣ６０固体粉末１００ｍｇとオリーブ油１００ｍｌを混合して６時間ボールミルし、回転速度１００００ｒで遠心分離を繰り返して未被覆の中空フラーレンＣ６０固体粉末を除去することにより、オリーブ油に被覆された中空フラーレン（以下、Ｏｌｉｖｅ−Ｃ６０と略称する）を製造した。検出した結果、Ｏｌｉｖｅ−Ｃ６０中の中空フラーレンＣ６０固体粉末の含有量は１５００ｐｐｍ（ｍｇ／ｋｇ）であり、即ち、Ｏｌｉｖｅ−Ｃ６０１ｋｇ当たり中空フラーレンＣ６０固体粉末１５００ｍｇがあった。

実施例２、生体レベルの第１の治療コースにおけるＯｌｉｖｅ−Ｃ６０の骨髄抑制及び関連酵素活性への影響
動物モデル：４〜５週のＩＣＲマウスを選択して、１群あたり６匹、５群にランダムに分け、これらは、それぞれシクロホスファミド（ＣＴＸ） ＋ Ｏｌｉｖｅ−Ｃ６０胃内投与実験群、ＣＴＸ ＋ Ｏｌｉｖｅ−Ｃ６０腹腔内投与実験群、ＣＴＸ ＋ Ｏｌｉｖｅ胃内投与実験群、ＣＴＸ実験群及び空白対照群に対応した。

シクロホスファミド（ＣＴＸ） ＋ Ｏｌｉｖｅ−Ｃ６０胃内投与実験群：マウスにＣＴＸ溶液を腹腔内注射し、薬物用量は６０ｍｇ／ｋｇマウス体重であり、Ｏｌｉｖｅ−Ｃ６０溶液を胃内投与し、薬物用量は１５００ｐｐｍ、１００μＬであった。

シクロホスファミド（ＣＴＸ） ＋ Ｏｌｉｖｅ−Ｃ６０腹腔内投与実験群：マウスにＣＴＸ溶液を腹腔内注射し、薬物用量は６０ｍｇ／ｋｇマウス体重であり、Ｏｌｉｖｅ−Ｃ６０溶液を腹腔内投与し、薬物用量は１５００ｐｐｍ、１００μＬであった。

シクロホスファミド（ＣＴＸ） ＋ Ｏｌｉｖｅ胃内投与実験群：マウスにＣＴＸ溶液を腹腔内注射し、薬物用量は６０ｍｇ／ｋｇマウス体重であり、純オリーブ油Ｏｌｉｖｅを胃内投与し、薬物用量は１００μＬであった。

シクロホスファミド（ＣＴＸ）実験群：マウスにＣＴＸ溶液を腹腔内注射し、薬物用量は６０ｍｇ／ｋｇマウス体重であり、生理食塩水１００μＬを胃内投与することによって、胃内投与の刺激によるマウスへの影響の差異を除去した。

空白対照群：実験群で注射する薬物をすべて同じ容量の生理食塩水で置換し、胃内及び腹腔内にすべて同じ容量の生理食塩水を投与した。

実験室で４〜５週のＩＣＲマウスを飼育し始めてからの７日目、マウスの状態が安定した後に薬物を注射し始め、実験を開始した１日目から、１日に１回で、５日間連続してＣＴＸを腹腔内注射すると同時にＯｌｉｖｅ−Ｃ６０或いはＯｌｉｖｅを胃内又は腹腔内投与し、５日後、注射を止め、観察又はサンプリングのみを行った。

生体レベルの第１の治療コースにおけるＯｌｉｖｅ−Ｃ６０の骨髄抑制への影響：４日目、７日目、１０日目及び１７日目に、それぞれマウスの眼窩から採血し（１３μｌ）、３ｍｌ遠心チューブに入れ、血液細胞自動分析装置で血液検査を行った。その中、骨髄抑制に関連する主な指標は白血球計数（ＷＢＣ）、血小板計数（ＰＬＴ）、赤血球計数（ＲＢＣ）及びヘモグロビン測定（ＨＧＢ）である。同時に、マウスの体重変化を監視した。

対応する検出結果を図１Ａ〜図１Ｄに示し、図１Ａ〜図１Ｄから分かるように、空白対照群に比べて、シクロホスファミド（ＣＴＸ）実験群におけるマウスの骨髄抑制に関連する指標である白血球、赤血球、血小板及びヘモグロビンは、いずれもマウス体内である程度の減少を示しており、その中、白血球の減少が最も顕著であり、これは、骨髄が損傷したことを示し、関連指標はすべて明らかな異常があった。これに対し、ＣＴＸ ＋ Ｏｌｉｖｅ−Ｃ６０実験群のマウスは、腹腔内または胃内投与にかかわらず、Ｃ６０のラジカル除去効果及び保護作用により、その白血球計数レベルはシクロホスファミド（ＣＴＸ）実験群に比べて大きく向上し、赤血球、血小板及びヘモグロビンの数値は、いずれも正常群にさらに近づく、経時に従って、関連指標が正常マウスの値に近づくようになった。体重監視については、投与初期には、ＣＴＸの毒性副作用により、異なる群のマウスの体重がすべて減少したが、薬物終了後は、Ｏｌｉｖｅ−Ｃ６０実験群のマウス体重はＣＴＸ群より回復が速く、正常のマウス体重レベルに近づいた。

上記のデータは、Ｏｌｉｖｅ−Ｃ６０の化学療法剤ＣＴＸによるマウス骨髄抑制への明らかな保護効果を示しており、且つ、異なる投与方式はすべて明らかな保護効果を示している。同時に、図２の通り、実験後半に、シクロホスファミド群のマウス体重は他の群に比べて最も低く、これは、マウスの全体的な生存質量に対するＯｌｉｖｅ−Ｃ６０の保護及び向上作用を示している。

生体レベルの第１の治療コースにおけるＯｌｉｖｅ−Ｃ６０の関連酵素活性への影響：実験の１８日目に、眼窩から全血を取り、遠心分離して血清を取って、異なる関連酵素活性を測定した。

対応する検出結果を図３Ａ〜図３Ｄに示し、図３Ａ〜図３Ｄから分かるように、治療過程において、オリーブ油−Ｃ６０を注射したマウス体内の抗酸化関連酵素（ＳＯＤ、ＣＡＴ及びＧＰｘ）等の活性は、いずれもオリーブ油のみ注射した実験群より高く、シクロホスファミドのみ投与したマウスの酵素活性よりもさらに高かった。生体内の過酸化物は、主に抗酸化システム自体の酸化によって除去されるため、抗酸化損傷を防ぐことは、抗酸化システムの生体への免疫力を向上させるのに非常に重要な役割を果たしており、一方、抗酸化酵素の活性が低下すると、生体への損傷がひどくなるため、生体の抗酸化システムを保護することは化学療法による損傷を減少するのに非常に重要な意義がある。本実施例では、Ｏｌｉｖｅ−Ｃ６０の摂取は、生体の抗酸化システムに顕著な保護効果を有するため、化学療法による更なる損傷を保護することは明らかであった。ＭＤＡは、フリーラジカルによる脂質酸化によって生成したものであり、体内のＭＤＡレベルは、体内のラジカルのレベルを表し、ＭＤＡレベルの向上は体内に迅速に除去されていないラジカルが過度に存在することを示しており、同時に、細胞膜システムの損傷が悪化することを示す。本実施例において、Ｏｌｉｖｅ−Ｃ６０は、ヒドロキシルラジカル等のラジカルを除去することにより、生体細胞膜のシステムの損傷を減少し、生体がシクロホスファミド等の化学療法剤による二次性損傷を受けないように保護している。

実施例３、生体レベルの第２の治療コースにおけるＯｌｉｖｅ−Ｃ６０の骨髄抑制、関連酵素活性及び血液生化学指標への影響
動物モデル：４〜５週のＩＣＲマウスを選択して、１群あたり６匹、５群にランダムに分け、これらは、それぞれシクロホスファミド（ＣＴＸ） ＋ Ｏｌｉｖｅ−Ｃ６０胃内投与実験群、ＣＴＸ ＋ Ｏｌｉｖｅ−Ｃ６０腹腔内投与実験群、ＣＴＸ ＋ Ｏｌｉｖｅ胃内投与実験群、ＣＴＸ実験群及び空白対照群に対応した。

シクロホスファミド（ＣＴＸ） ＋ Ｏｌｉｖｅ−Ｃ６０胃内投与実験群：マウスにＣＴＸ溶液を腹腔内注射し、薬物用量は６０ｍｇ／ｋｇマウス体重であり、Ｏｌｉｖｅ−Ｃ６０溶液を胃内投与し、薬物用量は１５００ｐｐｍ、１００μＬであった。

シクロホスファミド（ＣＴＸ） ＋ Ｏｌｉｖｅ−Ｃ６０腹腔内投与実験群：マウスにＣＴＸ溶液を腹腔内注射し、薬物用量は６０ｍｇ／ｋｇマウス体重であり、Ｏｌｉｖｅ−Ｃ６０溶液を腹腔内投与し、薬物用量は１５００ｐｐｍ、１００μＬであった。

シクロホスファミド（ＣＴＸ） ＋ Ｏｌｉｖｅ胃内投与実験群：マウスにＣＴＸ溶液を腹腔内注射し、薬物用量は６０ｍｇ／ｋｇマウス体重であり、純オリーブ油Ｏｌｉｖｅを胃内投与し、薬物用量は１００μＬであった。

シクロホスファミド（ＣＴＸ）実験群：マウスにＣＴＸ溶液を腹腔内注射し、薬物用量は６０ｍｇ／ｋｇマウス体重であった。同時に、生理食塩水１００μＬを胃内投与することによって、胃内投与の刺激によるマウスへの影響の差異を除去した。

空白対照群：実験群で注射する薬物をすべて同じ容量の生理食塩水で置換し、胃内及び腹腔内にすべて同じ容量の生理食塩水を投与した。

第１の治療コースの実験を行い始めてからの２０日目に、マウスが基本的に回復した後、第２の治療コースの実験を開始し、即ち、第１の治療コースの２１日目を第２の治療コースの１日目とし、その後、１日に１回で、５日間連続してＣＴＸを腹腔内注射すると同時に、Ｏｌｉｖｅ−Ｃ６０或いはＯｌｉｖｅを胃内／腹腔内投与し、５日後、投与を止め、観察又はサンプリングのみを行った。

生体レベルの第２の治療コースにおけるＯｌｉｖｅ−Ｃ６０の骨髄抑制への影響：第２の治療コースの４日目、７日目、１０日目及び１７日目に、それぞれマウスの眼窩から採血し（１３μｌ）、３ｍｌ遠心チューブに入れ、血液細胞自動分析装置で血液検査を行った。その中、骨髄抑制に関連する主な指標は白血球計数（ＷＢＣ）、血小板計数（ＰＬＴ）、赤血球計数（ＲＢＣ）及びヘモグロビン測定（ＨＧＢ）であった。同時に、マウスの体重変化を監視した。

対応する検出結果を図４Ａ〜図４Ｄに示し、図４Ａ〜図４Ｄから分かるように、第２の治療コース中の服薬の過程において、空白対照群に比べて、シクロホスファミド（ＣＴＸ）実験群におけるマウスの骨髄抑制に関連する指標である白血球、赤血球、血小板及びヘモグロビンは、いずれもマウス体内である程度の減少を示しており、その中、白血球の減少が最も顕著であり、これは、骨髄が二次性損傷を受けていることを示し、関連指標はすべて明らかな異常があった。これに対し、ＣＴＸ ＋ Ｏｌｉｖｅ−Ｃ６０実験群のマウスは、腹腔内または胃内投与にかかわらず、Ｃ６０のラジカル除去効果及び保護作用により、その白血球計数レベルはシクロホスファミド（ＣＴＸ）実験群に比べて大きく向上し、赤血球、血小板及びヘモグロビンの数値は、いずれも正常群にさらに近づく、経時に従って、関連指標が正常マウスの値に近づくようになった。１７日目に、投与群のマウスの白血球は正常値にほぼ戻ったが、ＣＴＸ群のマウスの白血球はまだ正常値よりも低いレベルにあった。同時に、マウス体重の検出により、投与群のマウス体重は空白対照群にさらに近づくのに対し、ＣＴＸ群のマウスの体重は他の群と大きな差があることが分かった。

上記の結果は、Ｏｌｉｖｅ−Ｃ６０は、複数の治療コースの服薬過程におけるＣＴＸによるマウス骨髄抑制に明らかな保護効果を有するため、マウスの造血レベルをより迅速に正常に戻すようにし、異なる投与方式はすべて明らかな保護効果を有することを示している。同時に、図５に示すように、実験後半に、シクロホスファミド群のマウス体重は他の群に比べて最も低く、これは、マウスの全体的な生存質量に対するＯｌｉｖｅ−Ｃ６０の保護及び向上作用を示している。

生体レベルの第２の治療コースにおけるＯｌｉｖｅ−Ｃ６０の関連酵素活性への影響：第２の治療コースの実験の１８日目に、眼窩から全血を取り、遠心分離して血清を取って、異なる関連酵素活性を測定した。

対応する検出結果を図６Ａ〜図６Ｄに示し、図６Ａ〜図６Ｄから分かるように、複数の治療コースの治療過程が完了した後、オリーブ油−Ｃ６０を注射したマウス体内の抗酸化関連酵素（ＳＯＤ、ＣＡＴ及びＧＰｘ）等の活性は、いずれもオリーブ油のみ注射した実験群よりやや高く、同時に、シクロホスファミドを投与したマウス酵素活性より高かった。上記のように、生体内の過酸化物は、主に抗酸化システム自体の酸化によって除去されるため、抗酸化損傷を防ぐことは、抗酸化システムの生体への免疫力を向上させるのに非常に重要な役割を果たしており、一方、抗酸化酵素の活性が低下すると、生体への損傷がひどくなるため、生体の抗酸化システムを保護することは化学療法による損傷を減少するのに非常に重要な意義がある。本実施例では、Ｏｌｉｖｅ−Ｃ６０の摂取は、生体の抗酸化システムに顕著な保護効果を有するため、化学療法による更なる損傷を保護することは明らかであった。ＭＤＡは、フリーラジカルによる脂質酸化によって生成したものであり、体内のＭＤＡレベルは、体内のラジカルのレベルを表し、ＭＤＡレベルの向上は体内に除去迅速に除去され切れないラジカルが過度に存在することを示しており、同時に、細胞膜システムの損傷が悪化することを示す。複数の治療コースの後、シクロホスファミド服薬群のＭＤＡレベルは正常対照群により高いのに対し、胃内投与のマウスＭＤＡレベルは正常対照群によりも低く、これは、オリーブ油−Ｃ６０のラジカルを除去する効果が顕著であることを示している。本実施例において、Ｏｌｉｖｅ−Ｃ６０は、ヒドロキシルラジカル等のラジカルを除去することにより、生体細胞膜のシステムの損傷を減少し、生体がシクロホスファミド等の化学療法剤による二次性損傷を受けないように保護している。

生体レベルの第２の治療コースにおけるＯｌｉｖｅ−Ｃ６０の血液生化学指標への影響：第２の治療コースの実験の１８日目に、眼窩から全血を取り、遠心分離して血清を取って、血液生化学指標を測定した。

対応する検出結果を図７Ａ〜図７Ｄに示し、図７Ａ〜図７Ｄから分かるように、複数の治療コースの治療過程が完了した後、異なる実験群においてアラニンアミノトランスフェラーゼ、アルカリホスファターゼ及び尿窒素のレベルはほぼ同一であり、共に正常レベルに戻った。注目すべきものは尿酸のレベルであり、シクロホスファミド服薬群のマウス血清における尿酸のレベルは正常対照群に比べてはるかに低く、還元剤としての尿酸濃度が減少すると、生体の動きによって大量の酸素が発生し、ラジカルの除去能力は下降され、その毒性により腎臓機能の損害、肝臓の損傷のような一連の傷害が発生する。胃内或いは腹腔内にＯｌｉｖｅ−Ｃ６０を注射したマウス血清内の尿酸含有量は正常対照群のレベルとほぼ一致しており、これは、Ｏｌｉｖｅ−Ｃ６０は生体のラジカル除去システムを十分に保護して、生体の各臓器及び機能を保護することを示している。

実施例４、水溶性のヒドロキシル化ガドリニウム金属フラーレンの製造
（１）Ｇｄ＠Ｃ８２固体粉末１００ｍｇを１００ｍｌの一口フラスコに添加し、体積分率が３０％である過酸化水素水７ｍｌ及び２Ｍ水酸化ナトリウム水溶液３ｍｌをそれぞれ添加し、油浴を７０℃に加熱し、２〜５時間反応し、
（２）反応後、Ｍ．Ｗ．＝３５００透析バッグを用いて小分子を除去し、透析が完了するまで導電率計を用いて監視し、得られた生成物を濃縮することにより水溶性のヒドロキシル化金属フラーレンを得、ＤＬＳで測定した結果、水溶液中の平均粒径は１４０ｎｍであり、粒度分布は均一であり、粒度分布図を図８に示し、本実施例で得られた水溶性のヒドロキシル化金属フラーレンを以下でＧＦＮＣと略称した。

実施例５、生体内でのＧＦＮＣの代謝分布状況
（１）試験前処理：
動物モデル：４〜５週ＢＡＬＢ／ｃマウスを選択して、右大腿に１０^６個のマウス肝癌細胞（Ｈ２２細胞）（北京協和細胞庫より提供）１００μＬを接種し、５〜７日接種後、腫瘍直径が５ｍｍ程度に達した時点で実験を行った。
（２）試験：
濃度が１ｍＭである水溶性のヒドロキシル化ガドリニウム金属フラーレン１５０μＬを静脈注射し、注射後、１５分、３０分、４５分、１時間、４時間、２４時間、７日、１５日及び３０日に、頸部脱臼によりマウスを安楽死させ、且つ、直ちに解剖して、マウスの主な臓器（心臓、肝臓、脾臓、肺、腎臓、腸、胃等）、マウスの脳、脛骨及び筋肉をそれぞれ採取した。臓器、脳および筋肉等の部位の一部を秤量し、脛骨を秤量し、その後、ＰＢＳでマウスの脛骨骨髄を洗い出させ、脛骨を再度秤量し、骨髄の質量を計算した。上記の組織を消化した後、２００ｎｍフィルター膜を用いて濾過し、
（３）ＩＣＰ−ＭＳによるガドリニウムイオン濃度測定
ＩＣＰ−ＭＳ測定の標準サンプルとして、１００ｐｐｂ濃度のＧｄ^３＋標準溶液を取って、０、３０、５０、１００、２００、３００ｐｐｂの標準溶液試料に調製し、上記の消化液中のＧｄ^３＋濃度をそれぞれ測定し、その後、換算式により、等質量の異なる組織中のガドリニウムイオンの濃度に換算した。各群の並行実験で６匹のマウスを用い、平均値を取った。

測定結果を図９に示し、図９から分かるように、１時間以内に、水溶性のヒドロキシル化ガドリニウム金属フラーレン材料は、肝臓部位の濃度よりわずかに低いだけで、骨に明らかな濃縮効果を有するようになった。しかし、経時に従って、骨中のバリウムの濃度を比較的高いレベルで維持できたが、３０日後に骨中の材料の濃度が大幅に低下した。これは、代謝特性を有することを示しており、これは、生体レベルでのフラーレンの代謝が可能なことと一致している。

実施例４で得られた水溶性のヒドロキシル化ガドリニウム金属フラーレンのマウス骨髄及び骨質中の相対含有量を下記表１に示し、表１から分かるように、骨質と骨髄を分離して、水溶性のヒドロキシル化ガドリニウム金属フラーレンのマウス骨髄及び骨質中の含有量をそれぞれ測定した。試料を注射した２４時間後、骨髄中のガドリニウム含有量は５．８４±０．５８ｎｇ／ｍｇであり、骨質中の含有量（０．４５±０．０４４ｎｇ／ｍｇ）よりはるかに高く、これは、骨髄中の材料のターゲット濃縮特性をさらに示している。

実施例６、放射性標識法で測定したＧＦＮＣの生体内代謝分布の状況
（１）試験前処理：
動物モデル：４〜５週ＢＡＬＢ／ｃマウスを選択して、右大腿に１０^６個のマウス肝癌細胞（Ｈ２２細胞）を接種し、５〜７日接種後、腫瘍直径が５ｍｍ程度に達した時点で実験を行った。
（２）ヨウ素標識：
標識条件：基質：〜５ｍｇ／ｍｌ、１ｍｌ、ｐＨ＝８、Ｈ３ＰＯ４／ＮａＯＨ、１３１Ｉ：５．０ＭＢｑ、２０μＬ、クロラミン−Ｔ：２０ΜＬ、３ｍｇ／ｍｌ、反応温度：３０℃、反応時間：３時間、終結剤：Ｎａ２Ｓ２Ｏ５、標識率：〜８０％、放射化学的純度≧９９％。
（３）１３１Ｉ放射性標識方法で測定：
水溶性のヒドロキシル化ガドリニウム金属フラーレン表面に存在するヒドロキシル基は１３１Ｉと置換反応を行うことができ、１３１Ｉによって放出されたガンマ線は、生体内での代謝挙動を高感度に検出することに使用できる。具体的に、まず、クロラミン−Ｔ水溶液（１０ｍｇ／ｍｌ）を用いて３７ＭＢｑのＮａ １３１Ｉ溶液（体積比２：５）を１０分間酸化した後、標識待ち試料を添加し、常温で反応を２時間振動した。反応が完了した後、得られた反応液をＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５ゲルカラムを用いて分離精製し、無機塩イオンを除去して、放射性ヨウ素−１３１標識試料（放射化学的純度≧９７％）を得た。５０μＬの活性化された溶液をそれぞれ担がんマウス体内に尾静脈注射し、注射後１．０時間、４．０時間、２４時間及び４８時間に、それぞれ頸部脱臼によりマウスを安楽死させ、且つ、解剖して、重要な組織器官（心、肝臓、脾臓、肺、腎臓、腫瘍、脳、骨、肉等）を採取し、ガンマ計数し、各器官における標識された試料の含有量を統計した。

測定結果を図１０に示し、図１０から分かるように、ＩＣＰイオン濃度の測定方法で得られた結果と類似に、水溶性のヒドロキシル化ガドリニウム金属フラーレン材料は、骨中に明らかな濃縮効果を有することを確認できる。同時に、脛骨からマウスの骨髄を洗い出させ、骨髄、骨質の質量及びガンマ計数の強度をそれぞれ測定し、表２から分かるように、水溶性のヒドロキシル化ガドリニウム金属フラーレンは主に骨髄に濃縮された。

実施例７、電子プローブによるＧＦＮＣ骨髄濃縮量の測定
（１）試験前処理：
動物モデル：４〜５週ＢＡＬＢ／ｃマウスを選択して、右大腿に１０^６個のマウス肝癌細胞（Ｈ２２細胞）を接種し、５〜７日接種後、腫瘍直径が５ｍｍ程度に達した時点で実験を行った。
実験群：４〜５週ＢＡＬＢ／ｃマウスを選択して、右大腿に１０^６個のマウス肝癌細胞（Ｈ２２細胞）を接種し、５〜７日接種後、腫瘍直径が５ｍｍ程度に達した時点で、濃度が９００ｐｐｂである水溶性のヒドロキシル化金属フラーレン１５０μＬを静脈注射した。
（２）試験：
マウス実験：濃度が１ｍＭである水溶性のヒドロキシル化ガドリニウム金属フラーレン１５０μＬを静脈注射し、注射前、注射後０．５時間、１時間、４時間及び２４時間に、それぞれ頸部脱臼によりマウスを安楽死させ、且つ、直ちに解剖して、マウスの両側脛骨を採取した。ＰＢＳでマウスの脛骨骨髄を直ちに洗い出させ、且つ、導電性接着剤の表面に均一に塗布した後、電子プローブ装置を用いてガドリニウム元素の含有量を検出した。

水溶性のヒドロキシル化ガドリニウム金属フラーレン試料実験：水溶性のヒドロキシル化ガドリニウム金属フラーレン試料水溶液を導電性接着剤の表面に均一に塗布し、乾燥した後、電子プローブ装置で測定した。

対応する測定結果を図１１Ａ〜Ｆに示し、図１１Ａから分かるように、２．０４Ａの位置は、電子プローブ実験における水溶性のヒドロキシル化ガドリニウム金属フラーレン中のガドリニウムイオンの位置であり、これは、以下のマウス骨髄中のガドリニウムイオン含有量に対して参照するようになった。

図１１Ｂから分かるように、ガドリニウムイオンの存在は、薬物投与前のマウスの骨髄からほぼ検出されなかった。図１１Ｃ〜１１Ｆから分かるように、薬物投与後、マウス骨髄から検出されたガドリニウムの含有量は経時に従って増加し、それぞれ、０．５時間の場合は０．５８％（質量百分率、以下同様）であり、１時間の場合は１．３３％であり、４時間の場合は１．４９％であり、及び、２４時間の場合は２．２％であった。電子プローブの実験に基づき、本発明の材料がマウスの骨髄に迅速に進入して濃縮することができることをさらに確認した。

実施例８、生体レベルでのＧＦＮＣの毒性研究：
水溶性のヒドロキシル化ガドリニウム金属フラーレン群：濃度が１ｍＭである水溶性のヒドロキシル化ガドリニウム金属フラーレン１５０μＬを静脈注射し、注射後、１５分、３０分、４５分、１時間、４時間、２４時間、７日、１５日及び３０日に、マウスの眼球を落として眼窩からそれぞれ採血し、５ｍｌ遠心チューブに入れ、３５００ｒで１５分間遠心分離し、得られた血清を２００μＬ遠心チューブに移し、血液生化学検出器でＡＬＴ、ＡＬＰ、ＡＳＴ、ＢＵＮ、ＬＤＨ等のマウスの血液生化学指標を検出した。３０日以内のマウスの体重変化を観察した。

生理食塩水群：対比として、金属フラーレン群と同じ処理を行い、水溶性のヒドロキシル化ガドリニウム金属フラーレンの代わりに生理食塩水を使用した。

対応する測定結果は、図１２、図１３及び図１４の通り、金属フラーレン群及び生理食塩水群は、マウス体重や短期および長期の臓器係数にはすべて著しい差がないため、この材料は毒性が低く、さらに、臨床研究に使用可能であることを示している。図１４から分かるように、生理食塩水群に比べて、金属フラーレン群の肝機能及び腎機能が著しく低下しないため、この材料は毒性が低いことを示しており、本発明の材料は安全で無毒であることを確認できる。

実施例９、ＧＦＮＣの体外のラジカル除去効果
（１）電子常磁性共鳴（ＥＳＲ）検出によるラジカル強度実験：
ＵＶ誘導でヒドロキシルラジカルを生成する方法において、対照群は、質量濃度が３７％である過酸化水素５０μＬ、ＰＢＳ緩衝液５０μＬ（ｐＨ＝７．４）及び微量の（０．１３３ｍＭ）ジメチルピリジンＮ−オキシド（ＤＭＰＯ、ラジカル捕獲剤）溶液を混合し、２８０ｎｍの紫外光で８分間照射すると、この時点でヒドロキシルラジカルの信号を生成することができた。実験群は、質量濃度が３７％である過酸化水素５０μＬ、ＰＢＳ緩衝液（ｐＨ＝７．４）５０μＬ及び微量の（０．１３３ｍＭ）ジメチルピリジンＮ−オキシド（ＤＭＰＯ、ラジカル捕獲剤）溶液を混合し、２０μＭの水溶性のヒドロキシル化ガドリニウム金属フラーレン水溶液１０μＬを直ちに添加し、２８０ｎｍの紫外光で８分間照射して、ラジカルの信号強度を検出した。

対応する検出結果を図１５に示し、図１５から分かるように、実験群において、ＧＦＮＣは２０μＭの濃度だけで、紫外光で過酸化水素を照射することにより生成したラジカルを効率的にクエンチングすることができ、過酸化水素から生成されたラジカルの損傷影響から細胞を保護することができた。

実施例１０、細胞が過酸化水素から生成されたラジカルの殺傷影響を受けないための細胞レベルでのＧＦＮＣの保護作用
マウスの骨髄細胞（ＦＤＣ−Ｐ１）を研究対象として選択し、その培地は細胞因子ＩＬ−３を添加した高糖ＤＭＥＭであった。マウスの骨髄細胞を１ウェルあたりｃａ．１ｘ１０^４個の濃度で９６ウェルプレートに播種し、８×６個のウェルを播種し、陰性対照群は６個のウェルを播種し、陽性対照群は６個のウェルを播種し、実験群には７種類のＧＦＮＣ濃度があり、各濃度に６個のウェルを播種し、実験を３回繰り返した。陰性対照群は、過酸化水素及びＧＦＮＣを添加せず、マウスの骨髄細胞のみ接種した培地であり、陽性対照群は、過酸化水素溶液を添加せず、１０μＬ、３０μＭのＧＦＮＣのみ添加し、実験群は、濃度が１００μＭである過酸化水素溶液２０μＬ、９０μＬの培地を並行して添加し、また、異なる濃度のＧＦＮＣ（その最終濃度がそれぞれ０．５μＭ、１μＭ、２．５μＭ、５μＭ、１０μＭ、２０μＭ及び３０μＭとなるようにする）を添加した。

陰性対照群の添加順序は、過酸化水素もＧＦＮＣも添加せず、すべて同じ容量のＰＢＳで置換した。

陽性対照群の添加順序は、過酸化水素を同じ容量のＰＢＳで置換し、マウスの骨髄細胞を１時間インキュベートした後、ＧＦＮＣを添加して、３時間インキュベートした。

実験群の添加順序は、まず、過酸化水素と細胞培地及びマウスの骨髄細胞を添加して、１時間インキュベートし、過酸化水素溶液を吸出し、ＰＢＳ緩衝液で３回洗浄して、残っている過酸化水素溶液を除去した。一定濃度のＧＦＮＣをさらに添加し、同時に、細胞培地を添加して細胞を３時間インキュベートした後、ＧＦＮＣを含む培地を吸出し、ＰＢＳ緩衝液で３回洗浄した。最後に、細胞培地を添加し、細胞インキュベータ中で２４時間で培養を続けた後、ＣＣＫ−８を用いて細胞活性を検出した。

対応する検出結果を図１６に示し、図１６から分かるように、濃度が１００μＭである過酸化水素溶液２０μＬを添加する場合、過酸化水素がマウスの骨髄細胞に一定の殺傷作用を起こし、水溶性のヒドロキシル化ガドリニウム金属フラーレンの添加量が増加すると、細胞の活性も向上した。これは、細胞レベルで、水溶性のヒドロキシル化ガドリニウム金属フラーレンはラジカル除去に有効であり、且つ、細胞が影響を受けないように保護できることを示している。同時に、過酸化水素を添加せず、水溶性のヒドロキシル化ガドリニウム金属フラーレンのみ添加した陽性対照群は、その細胞活性は陰性対照群より僅かに高く、これは、材料が細胞毒性が無いことを示している。

実施例１１、生体レベルでのＧＦＮＣの骨髄抑制保護
動物モデル：４〜５週のＩＣＲマウスを選択して、１群あたり６匹、４群にランダムに分け、これらは、それぞれ空白対照群、ＧＦＮＣ実験群、Ｘ線照射実験群及びＸ線＋ＧＦＮＣ実験群に対応した。マウスの右大腿に１０^６個のマウス肝癌細胞（Ｈ２２細胞）を接種し、５〜７日接種後、腫瘍直径が５ｍｍ程度に達した時点で実験を行った。

空白対照群：実験群で注射する薬物をすべて同じ容量の生理食塩水で置換し、同じ容量の生理食塩水を静脈注射した。

ＧＦＮＣ実験群：マウスにＧＦＮＣ水溶液（１ｍＭ）を尾静脈注射し、薬物用量は０．００４ｍｍｏｌ ＧＦＮＣ／ｋｇマウス体重であった。

Ｘ線照射実験群：マウスの全身は６Ｇｙ Ｘ線照射を一括で受けた。

Ｘ線＋ＧＦＮＣ実験群：マウスの全身は６Ｇｙ Ｘ線照射を一括で受け、同時に、ＧＦＮＣ溶液を静脈注射し、薬物用量は０．００４ｍｍｏｌ ＧＦＮＣ／ｋｇマウス体重であった。

実験の１日目として、腫瘍を接種した後の７日目に薬物を注射し始め、１日目から、１日に１回で、５日間連続してＧＦＮＣを静脈注射し、且つ、１日目にＸ線照射を行い、その後、それぞれ４日目、７日目、１０日目、１４日目及び１７日目に、マウスの眼窩から採血し（２０μＬ）、３ｍｌ遠心チューブに入れ、血液細胞自動分析装置で血液検査を行い、その中、骨髄抑制に関連する主な指標は、白血球計数（ＷＢＣ）、血小板計数（ＰＬＴ）、ヘモグロビン測定（ＨＧＢ）、単核細胞の割合（ＭＯ％）であった。

対応する検出結果を図１７に示し、図１７から分かるように、空白対照群に比べて、Ｘ線照射実験群のマウス中の骨髄抑制に関連する指標である白血球、血小板、ヘモグロビンは、いずれもマウス体内である程度の減少を示し、その中、白血球の減少が最も顕著であり、単核細胞は異常な増殖現象を現し、これは、骨髄が損傷したことを示し、関連指標はすべて明らかな異常があった。これに対し、Ｘ線＋ＧＦＮＣ実験群のマウスは、ＧＦＮＣの保護作用により、その白血球、血小板、ヘモグロビンの量はＸ線実験群に比べて大きく向上し、単核細胞の数値は正常群にさらに近づく、経時に従って、関連指標が正常マウスの値に近づくようになった。これは、ＧＦＮＣは放射線療法Ｘ線によるマウスの骨髄抑制に明らかな保護効果を有することを示している。

実施例１２、生体レベルでのＧＦＮＣのＸ線放射線療法による腫瘍治療効果への影響
動物モデル：４〜５週のＩＣＲマウスを選択して、１群あたり６匹、４群にランダムに分け、これらは、それぞれ空白対照群、ＧＦＮＣ実験群、Ｘ線照射実験群及びＸ線＋ＧＦＮＣ実験群に対応した。マウスの右大腿に１０^６個のマウス肝癌細胞（Ｈ２２細胞）を接種し、５〜７日接種後、腫瘍直径が５ｍｍ程度に達した時点で実験を行った。

空白対照群：実験群で注射する薬物をすべて同じ容量の生理食塩水で置換した。

Ｘ線照射実験群：マウスの全身に一括でＸ線を照射し、照射線量は６Ｇｙであった。

金属フラーレン誘導体（ＧＦＮＣ）実験群：マウスにＧＦＮＣ溶液を静脈注射し、薬物用量は０．０４ｍｍｏｌ Ｇｄ３＋／ｋｇマウス体重であった。

Ｘ線＋ＧＦＮＣ実験群：マウスの全身に一括でＸ線を照射し、照射線量は６Ｇｙであり、ＧＦＮＣ溶液を静脈注射し、薬物用量は０．０４ｍｍｏｌ Ｇｄ３＋／ｋｇマウス体重であった。

腫瘍を接種した後の７日目に薬物を注射し始め、実験の１日目から、１日に１回で、５日間連続してＧＦＮＣを静脈注射し、マウスの体重及び腫瘍直径を２日ごとに測定した。

対応する検出結果を図１８及び１９に示し、図１８から分かるように、Ｘ線実験群に比べて、Ｘ線＋ＧＦＮＣ実験群のマウスの腫瘍直径は増大しないだけでなく、むしろ減少し、これは、ＧＦＮＣはマウス腫瘍に対する放射線療法の治療効果に影響を与えなく、同時に、放射線療法による骨髄抑制毒性を顕著に抑制でき、両者の間に相乗効果があることを示している。図１９から分かるように、異なる群のマウスの体重変化を比較すると、Ｘ線実験群のマウスは、薬物投与の初期には体重が大幅に減少したが、その後は薬物投与を終了し、マウス自体の回復機能により一定の程度に回復されたが、まだ体重が最も軽い群であった。これに対し、Ｘ線＋ＧＦＮＣ実験群のマウスは、投与の初期には体重が少し減少したが、後期には著しく回復し正常マウスの体重に近づいた。これは、ＧＦＮＣはマウスが放射線療法の放射線による副作用の影響を受けないように保護し、マウスの骨髄抑制毒性から保護できるとともに、自体の毒性も比較的小さく、さらに、臨床研究に使用可能であることを示している。

実施例１３、生体レベルでの水溶性のヒドロキシル化ガドリニウム金属フラーレンの骨髄抑制保護
動物モデル：４〜５週のＩＣＲマウスを選択して、１群あたり６匹、４群にランダムに分け、これらは、それぞれ空白対照群、ＧＦＮＣ実験群、シクロホスファミド（ＣＴＸ）実験群及びＣＴＸ＋ＧＦＮＣ実験群に対応した。マウスの右大腿に１０^６個のマウス肝癌細胞（Ｈ２２細胞）を接種し、５〜７日接種後、腫瘍直径が５ｍｍ程度に達した時点で実験を行った。

空白対照群：実験群で注射する薬物をすべて同じ容量の生理食塩水で置換し、静脈及び腹腔内にすべて同じ容量の生理食塩水を注射した。

ＧＦＮＣ実験群：マウスにＧＦＮＣ水溶液（１ｍＭ）を尾静脈注射し、薬物用量は０．００４ｍｍｏｌ ＧＦＮＣ／ｋｇマウス体重であった。

シクロホスファミド（ＣＴＸ）実験群：マウスにＣＴＸ溶液を腹腔内注射し、薬物用量は６０ｍｇ／ｋｇマウス体重であった。

ＣＴＸ＋ＧＦＮＣ実験群：マウスにＣＴＸ溶液を腹腔内注射し、薬物用量は６０ｍｇ／ｋｇマウス体重であり、ＧＦＮＣ溶液を静脈注射し、薬物用量は０．００４ｍｍｏｌ ＧＦＮＣ／ｋｇマウス体重であった。

実験の１日目として、腫瘍を接種した後の７日目に薬物を注射し始め、１日目から、１日に１回で、５日間連続してＣＴＸを腹腔内注射又はＧＦＮＣを静脈注射し、それぞれ４日目、７日目、１０日目、１４日目及び１７日目に、マウスの眼窩から採血し（２０μＬ）、３ｍｌ遠心チューブに入れ、血液細胞自動分析装置で血液検査を行い、その中、骨髄抑制に関連する主な指標は白血球計数（ＷＢＣ）、血小板計数（ＰＬＴ）、ヘモグロビン測定（ＨＧＢ）、単核細胞の割合（ＭＯ％）であった。

対応する検出結果を図２０に示し、図２０から分かるように、空白対照群に比べて、シクロホスファミド（ＣＴＸ）実験群におけるマウスの骨髄抑制に関連する指標である白血球、血小板、ヘモグロビンは、いずれもマウス体内である程度の減少を示し、その中、白血球の減少が最も顕著であり、単核細胞は異常な増殖現象を現し、これは、骨髄が損傷したことを示し、関連指標はすべて明らかな異常があった。これに対し、ＣＴＸ＋ＧＦＮＣ実験群のマウスは、ＧＦＮＣの保護作用により、その白血球、血小板、ヘモグロビンの量はシクロホスファミド（ＣＴＸ）実験群に比べて大きく向上し、単核細胞の数値は正常群にさらに近づく、経時に従って、関連指標が正常マウスの値に近づくようになった。これは、ＧＦＮＣは化学療法剤ＣＴＸによるマウス骨髄抑制に明らかな保護効果を有することを示している。

実施例１４、生体レベルでの水溶性のヒドロキシル化ガドリニウム金属フラーレンの化学療法剤ＣＴＸの腫瘍治療効果への影響及び毒性実験
動物モデル：４〜５週のＩＣＲマウスを選択して、１群あたり６匹、４群にランダムに分け、これらは、それぞれ空白対照群、ＧＦＮＣ実験群、シクロホスファミド（ＣＴＸ）実験群及びＣＴＸ＋ＧＦＮＣ実験群に対応した。マウスの右大腿に１０^６個のマウス肝癌細胞（Ｈ２２細胞）を接種し、５〜７日接種後、腫瘍直径が５ｍｍ程度に達した時点で実験を行った。

空白対照群：実験群で注射する薬物をすべて同じ容量の生理食塩水で置換した。

シクロホスファミド（ＣＴＸ）実験群：マウスにＣＴＸ溶液を腹腔内注射し、薬物用量は６０ｍｇ／ｋｇマウス体重であった。

金属フラーレン誘導体（ＧＦＮＣ）実験群：マウスにＧＦＮＣ溶液を静脈注射し、薬物用量は０．０４ｍｍｏｌ Ｇｄ３＋／ｋｇマウス体重であった。

ＣＴＸ＋ＧＦＮＣ実験群：マウスにＣＴＸ溶液を腹腔内注射し、薬物用量は６０ｍｇ／ｋｇマウス体重であり、ＧＦＮＣ溶液を静脈注射し、薬物用量は０．０４ｍｍｏｌ Ｇｄ３＋／ｋｇマウス体重であった。

実験の１日目として、腫瘍を接種した後の７日目に薬物を注射し始め、１日目から、１日に１回で、５日間連続してＣＴＸを腹腔内注射又はＧＦＮＣを静脈注射し、マウスの体重及び腫瘍直径を２日ごとに測量し、１７日目に、マウスの眼球を落として眼窩からそれぞれ採血し、５ｍｌ遠心チューブに入れ、３５００ｒで１５分間遠心分離し、得られた血清を２００μＬ遠心チューブに移し、血液生化学検出器でＡＬＴ、ＡＬＰ、ＡＳＴ、ＢＵＮ、ＬＤＨ、ＵＡ等のマウスの血液生化学指標を検出し、頸部脱臼によりマウスを安楽死させた後、マウスの主な組織器官（心臓、肝臓、脾臓、肺、腎臓）を採取して秤量し、４％ホルマリン溶液に浸した後、組織病理学的切片を作成し、Ｈ＆Ｅ染色した。同時に、比較のために、空白対照群、シクロホスファミド（ＣＴＸ）実験群及び金属フラーレン誘導体（ＧＦＮＣ）実験群に、同じ処理を行った。

対応する検出結果を図２１及び２２に示し、図２１から分かるように、シクロホスファミド（ＣＴＸ）実験群に比べて、ＣＴＸ＋ＧＦＮＣ実験群のマウスの腫瘍直径は増大しないだけでなく、むしろ減少し、これは、ＧＦＮＣはマウス腫瘍に対する化学療法剤ＣＴＸの治療効果に影響を与えなく、同時に、化学療法剤による骨髄抑制毒性を顕著に抑制でき、両者の間に相乗効果があることを示している。図２２から分かるように、異なる群のマウスの体重変化を比較すると、シクロホスファミド（ＣＴＸ）実験群のマウスは、薬物投与の初期には体重が大幅に減少したが、その後は薬物投与を終了し、マウス自体の回復機能により一定の程度に回復されたが、まだ体重が最も軽い群であった。これに対し、ＣＴＸ＋ＧＦＮＣ実験群のマウスは、投与の初期には体重が少し減少したが、後期には著しく回復し正常マウスの体重に近づいた。これは、ＧＦＮＣはマウスが化学療法剤による副作用の影響を受けないように保護し、マウスの骨髄抑制毒性から保護できるとともに、自体の毒性も比較的小さく、さらに、臨床研究に使用可能であることを示している。

図２３から分かるように、ＣＴＸ＋ＧＦＮＣ実験群で測定した酵素活性は、ＣＴＸ実験群に比べて少し減少し、或いは一致している。これは、マウス体内の活性酸素成分に一定の除去効果があるとともに、ＧＦＮＣの毒性が少ないことを示している。

図２４から分かるように、組織病理学的切片の画像を比較することによって、ＣＴＸ＋ＧＦＮＣ実験群の主な組織器官は膨張、壊死或いは炎症等の現象を示されておらず、空白対照群とほぼ同一であることに対し、シクロホスファミド（ＣＴＸ）実験群のマウスの組織器官はすべて一定の程度の損傷を受けている。また、腫瘍の部位の病理学的切片からも分かるように、空白対照群の腫瘍組織は盛んに成長しており、腫瘍細胞が非常に緻密することに対し、ＣＴＸ＋ＧＦＮＣ実験群及びＣＴＸ実験群の腫瘍組織細胞は大量に死んだ現象を示し、組織が弛緩している。これは、ＧＦＮＣは安全で無毒であり、且つ化学療法剤ＣＴＸの腫瘍治療効果に影響しないことを示している。

実施例１５、水溶性のヒドロキシル化中空フラーレンの製造
（１）Ｃ６０固体粉末１００ｍｇを１００ｍｌの一口フラスコに添加し、体積分率が３０％である過酸化水素水７ｍｌ及び２Ｍの水酸化ナトリウム水溶液３ｍｌをそれぞれ添加し、油浴を７０℃に加熱し、２〜５時間反応し、
（２）反応後、Ｍ．Ｗ．＝３５００透析バッグを用いて小分子を除去し、透析が完了するまで導電率計を用いて監視し、得られた生成物を濃縮することにより水溶性のヒドロキシル化金属フラーレンを得、ＤＬＳで測定した結果、水溶液中の平均粒径は２００ｎｍであり、粒度分布は均一であり、粒度分布図を図２５に示す。

実施例１６、生体レベルでの水溶性のヒドロキシル化中空フラーレンの毒性研究
水溶性のヒドロキシル化中空フラーレン群：濃度が１ｍＭである水溶性のヒドロキシル化中空フラーレン１５０μＬを静脈注射し、注射後３０日に、マウスの眼球を落として眼窩からそれぞれ採血し、５ｍｌ遠心チューブに入れ、３５００ｒで１５分間遠心分離し、得られた血清を２００μＬ遠心チューブに移し、血液生化学検出器でＡＬＴ、ＡＬＰ、ＡＳＴ、ＢＵＮ、ＬＤＨ等のマウスの血液生化学指標を検出した。同時に、３０日以内のマウスの体重変化を観察した。

生理食塩水群：比較のために、中空フラーレン群と同じ処理を行い、水溶性のヒドロキシル化中空フラーレンを生理食塩水で置換した。

対応する測定結果を図２６、図２７及び図２８に示し、図２６及び図２７から分かるように、中空フラーレン群及び生理食塩水群は、マウス体重や短期および長期の臓器係数にはすべて著しい差がないため、この材料は毒性が低く、さらに、臨床研究に使用可能であることを示している。図２８から分かるように、生理食塩水群に比べて、中空フラーレン群の肝機能及び腎機能が著しく低下しないため、この材料は毒性が低いことを示しており、本発明の材料は安全で無毒であることを確認できる。

実施例１７、水溶性のヒドロキシル化中空フラーレンの体外のラジカル除去効果
（１）電子常磁性共鳴（ＥＳＲ）検出によるラジカル強度実験：
ＵＶ誘導でヒドロキシルラジカルを生成する方法において、対照群は、質量濃度が３７％である過酸化水素５０μＬ、ＰＢＳ緩衝液（ｐＨ＝７．４）５０μＬ及び微量の（０．１３３ｍＭ）ジメチルピリジンＮ−オキシド（ＤＭＰＯ、ラジカル捕獲剤）溶液を混合し、２８０ｎｍの紫外光で８分間照射すると、この時点でヒドロキシルラジカルの信号を生成することができた。実験群は、質量濃度が３７％である過酸化水素５０μＬ、ＰＢＳ緩衝液（ｐＨ＝７．４）５０μＬ及び微量の（０．１３３ｍＭ）ジメチルピリジンＮ−オキシド（ＤＭＰＯ、ラジカル捕獲剤）溶液を混合し、２０μＭの水溶性のヒドロキシル化中空フラーレン水溶液１０μＬを直ちに添加し、２８０ｎｍ紫外光で８分間照射して、ラジカルの信号強度を検出した。

対応する検出結果を図２９に示し、図２９から分かるように、実験群において、ヒドロキシル化中空フラーレン水溶液は２０μＭの濃度だけで、紫外光で過酸化水素を照射することにより生成したラジカルを効率的にクエンチングすることができ、過酸化水素から生成されたラジカルの損傷影響から細胞を保護することができた。

実施例１８、細胞が過酸化水素から生成されたラジカルの殺傷影響を受けないための細胞レベルでの水溶性のヒドロキシル化中空フラーレンでの保護作用
マウス骨髄細胞（ＦＤＣ−Ｐ１）を研究対象として選択し、その培地は細胞因子ＩＬ−３を添加した高糖ＤＭＥＭであった。マウスの骨髄細胞をウェルあたりｃａ．１ｘ１０^４個の濃度で９６ウェルプレートに播種し、８×６個のウェルを播種し、陰性対照群は６個のウェルを播種し、陽性対照群は６個のウェルを播種し、実験群には７種類のヒドロキシル化中空フラーレン水溶液濃度があり、各濃度に６個のウェルを播種し、実験を３回繰り返した。陰性対照群は、過酸化水素及びヒドロキシル化中空フラーレン水溶液を添加せず、マウス骨髄細胞のみ接種した培地であり、陽性対照群は、過酸化水素溶液を添加せず、１０μＬ、３０μＭのヒドロキシル化中空フラーレン水溶液のみ添加し、実験群は、濃度が１００μＭである過酸化水素溶液２０μＬ、９０μＬの培地を並行して添加し、また、異なる濃度のヒドロキシル化中空フラーレン水溶液（その最終濃度がそれぞれ０．５μＭ、１μＭ、２．５μＭ、５μＭ、１０μＭ、２０μＭ及び３０μＭとなるようにする）を添加した。

陰性対照群の添加順序は、過酸化水素もヒドロキシル化中空フラーレン水溶液も添加せず、すべて同じ容量のＰＢＳで置換した。陽性対照群の添加順序は、過酸化水素を同じ容量のＰＢＳで置換し、マウス骨髄細胞を１時間インキュベートした後、ヒドロキシル化中空フラーレン水溶液を添加し、３時間インキュベートした。

実験群の添加順序は、まず、過酸化水素、細胞培地及びマウス骨髄細胞を添加して、１時間インキュベートし、過酸化水素溶液を吸出し、ＰＢＳ緩衝液で３回洗浄して、残っている過酸化水素溶液を除去した。一定濃度のヒドロキシル化中空フラーレン水溶液をさらに添加し、同時に、細胞培地を添加して細胞を３時間インキュベートした後、ヒドロキシル化中空フラーレン水溶液を含む培地を吸出し、ＰＢＳ緩衝液で３回洗浄した。最後に、細胞培地を添加し、細胞インキュベータ中で２４時間で培養を続けた後、ＣＣＫ−８を用いて細胞活性を検出した。

対応する検出結果を図３０に示し、図３０から分かるように、濃度が１００μＭである過酸化水素溶液２０μＬを添加する場合、過酸化水素がマウス骨髄細胞に一定の殺傷作用を起こしており、ヒドロキシル化中空フラーレン水溶液の添加量が増加すると、細胞の活性も向上した。これは、細胞レベルで、ヒドロキシル化中空フラーレン水溶液はラジカル除去に有効であり、且つ、細胞が影響を受けないように保護できることを示している。同時に、過酸化水素を添加せず、ヒドロキシル化中空フラーレン水溶液のみ添加した陽性対照群は、その細胞活性は陰性対照群より僅かに高く、材料が細胞毒性が無いことを示している。

実施例１９、生体レベルでの水溶性のヒドロキシル化中空フラーレンの骨髄抑制保護
動物モデル：４〜５週のＩＣＲマウスを選択して、１群あたり６匹、４群にランダムに分け、これらは、それぞれ空白対照群、水溶性のヒドロキシル化中空フラーレン実験群、Ｘ線照射実験群及びＸ線＋水溶性のヒドロキシル化中空フラーレン実験群に対応した。マウスの右大腿に１０^６個のマウス肝癌細胞（Ｈ２２細胞）を接種し、５〜７日接種後、腫瘍直径が５ｍｍ程度に達した時点で実験を行った。

空白対照群：実験群で注射する薬物をすべて同じ容量の生理食塩水で置換し、静脈及び腹腔内にすべて同じ容量の生理食塩水を注射した。

水溶性のヒドロキシル化中空フラーレン実験群：マウスに水溶性のヒドロキシル化中空フラーレン水溶液（１ｍＭ）を尾静脈注射し、薬物用量は０．００４ｍｍｏｌ水溶性のヒドロキシル化中空フラーレン／ｋｇマウス体重であった。

Ｘ線照射実験群：マウスの全身に一括でＸ線を照射し、照射線量は６Ｇｙであった。

Ｘ線＋水溶性のヒドロキシル化中空フラーレン実験群：マウスの全身に一括でＸ線を照射し、照射線量は６Ｇｙであり、水溶性のヒドロキシル化中空フラーレン溶液を静脈注射し、薬物用量は０．００４ｍｍｏｌ水溶性のヒドロキシル化中空フラーレン／ｋｇマウス体重であった。

実験の１日目として、腫瘍を接種した後の７日目に薬物を注射し始め、１日目から、１日に１回で、５日間連続して水溶性のヒドロキシル化中空フラーレンを静脈注射し、それぞれ４日目、７日目、１０日目、１４日目及び１７日目に、マウスの眼窩から採血し（２０μＬ）、３ｍｌ遠心チューブに入れ、血液細胞自動分析装置で血液検査を行い、その中、骨髄抑制に関連する主な指標は白血球計数（ＷＢＣ）、血小板計数（ＰＬＴ）、ヘモグロビン測定（ＨＧＢ）、単核細胞の割合（ＭＯ％）であった。

対応する検出結果を図３１に示し、図３１から分かるように、空白対照群に比べて、Ｘ線実験群におけるマウスの骨髄抑制に関連する指標である白血球、血小板、ヘモグロビンは、いずれもマウス体内である程度の減少を示し、その中、白血球の減少が最も顕著であり、単核細胞は異常な増殖現象を現し、これは、骨髄が損傷したことを示し、関連指標はすべて明らかな異常があった。これに対し、Ｘ線＋水溶性のヒドロキシル化中空フラーレン実験群のマウスは、水溶性のヒドロキシル化中空フラーレンの保護作用により、その白血球、血小板、ヘモグロビンの量はＸ線照射実験群に比べて大きく向上し、単核細胞の数値は正常群にさらに近づく、経時に従って、関連指標が正常マウスの値に近づくようになった。これは、水溶性のヒドロキシル化中空フラーレンは、放射線療法の放射線によるマウス骨髄抑制に明らかな保護効果を有することを示している。

実施例２０、生体レベルでの水溶性のヒドロキシル化中空フラーレンの骨髄抑制保護
動物モデル：４〜５週のＩＣＲマウスを選択して、１群あたり６匹、４群にランダムに分け、これらは、それぞれ空白対照群、水溶性のヒドロキシル化中空フラーレン実験群、シクロホスファミド（ＣＴＸ）実験群及びＣＴＸ＋水溶性のヒドロキシル化中空フラーレン実験群に対応した。マウスの右大腿に１０^６個のマウス肝癌細胞（Ｈ２２細胞）を接種し、５〜７日接種後、腫瘍直径が５ｍｍ程度に達した時点で実験を行った。

空白対照群：実験群で注射する薬物をすべて同じ容量の生理食塩水で置換し、静脈及び腹腔内にすべて同じ容量の生理食塩水を注射した。

水溶性のヒドロキシル化中空フラーレン実験群：マウスに水溶性のヒドロキシル化中空フラーレン水溶液（１ｍＭ）を尾静脈注射し、薬物用量は０．００４ｍｍｏｌ水溶性のヒドロキシル化中空フラーレン／ｋｇマウス体重であった。

シクロホスファミド（ＣＴＸ）実験群：マウスにＣＴＸ溶液を腹腔内注射し、薬物用量は６０ｍｇ／ｋｇマウス体重であった。

ＣＴＸ＋水溶性のヒドロキシル化中空フラーレン実験群：マウスにＣＴＸ溶液を腹腔内注射し、薬物用量は６０ｍｇ／ｋｇマウス体重であり、水溶性のヒドロキシル化中空フラーレン溶液を静脈注射し、薬物用量は０．００４ｍｍｏｌ水溶性のヒドロキシル化中空フラーレン／ｋｇマウス体重であった。

実験の１日目として、腫瘍を接種した後の７日目に薬物を注射し始め、１日目から、１日に１回で、５日間連続してＣＴＸを腹腔内注射又は水溶性のヒドロキシル化中空フラーレンを静脈注射し、それぞれ４日目、７日目、１０日目、１４日目及び１７日目に、マウスの眼窩から採血し（２０μＬ）、３ｍｌ遠心チューブに入れ、血液細胞自動分析装置で血液検査を行い、その中、骨髄抑制に関連する主な指標は白血球計数（ＷＢＣ）、血小板計数（ＰＬＴ）、ヘモグロビン測定（ＨＧＢ）、単核細胞の割合（ＭＯ％）であった。

対応する検出結果を図３２に示し、図３２から分かるように、空白対照群に比べて、シクロホスファミド（ＣＴＸ）実験群におけるマウスの骨髄抑制に関連する指標である白血球、血小板、ヘモグロビンは、いずれもマウス体内である程度の減少を示し、その中、白血球の減少が最も顕著であり、単核細胞は異常な増殖現象を現し、これは、骨髄が損傷したことを示し、関連指標はすべて明らかな異常があった。これに対し、ＣＴＸ＋水溶性のヒドロキシル化中空フラーレン実験群のマウスは、水溶性のヒドロキシル化中空フラーレンの保護作用により、その白血球、血小板、ヘモグロビンの量はシクロホスファミド（ＣＴＸ）実験群に比べて大きく向上し、単核細胞の数値は正常群にさらに近づく、経時に従って、関連指標が正常マウスの値に近づくようになった。これは、水溶性のヒドロキシル化中空フラーレンは、化学療法剤ＣＴＸによるマウス骨髄抑制に明らかな保護効果を有することを示している。

Claims (10)

1. （１）骨髄抑制を治療するため、及び／又は
   （２）骨髄抑制による白血球の減少、血小板の減少、ヘモグロビンの減少及び単核細胞の減少の少なくとも一つを治療するための薬物、の製造におけるフラーレンマイクロナノ材料及び／又は金属フラーレンマイクロナノ材料の使用であって、
   前記骨髄抑制は、薬物化学療法、化学的毒物又は骨髄抑制の副作用のある薬物によって誘発されること、
   前記フラーレンマイクロナノ材料は、１以上の、食用油に被覆されたフラーレン本体材料又はそのカーボンケージ外表面に親水性基で修飾されたフラーレン本体材料であること、
   前記金属フラーレンマイクロナノ材料は、１以上の、食用油に被覆された金属フラーレン本体材料又はそのカーボンケージ外表面に親水性基で修飾された金属フラーレン本体材料であること、及び
   前記フラーレン本体材料は、１以上のＣ_６０又はＣ_７０ であり、金属フラーレン本体材料は、Ｇｄ＠Ｃ_８２ であることを特徴とする、前記使用。
2. （１）骨髄抑制を治療するため、及び／又は
   （２）骨髄抑制による白血球の減少、血小板の減少、ヘモグロビンの減少及び単核細胞の減少の少なくとも一つを治療するための薬物組成物であって、フラーレンマイクロナノ材料及び／又は金属フラーレンマイクロナノ材料を含み、薬学的に許容される担体、薬学的に許容される希釈剤及び薬学的に許容される賦形剤の少なくとも一つをさらに含み、前記骨髄抑制は、薬物化学療法、化学的毒物又は骨髄抑制の副作用のある薬物によって誘発されること、前記フラーレンマイクロナノ材料は、１以上の、食用油に被覆されたフラーレン本体材料又はそのカーボンケージ外表面に親水性基で修飾されたフラーレン本体材料であること、前記金属フラーレンマイクロナノ材料は、１以上の、食用油に被覆された金属フラーレン本体材料又はそのカーボンケージ外表面に親水性基で修飾された金属フラーレン本体材料であること、及び前記フラーレン本体材料は、１以上のＣ６０又はＣ７０であり、金属フラーレン本体材料は、Ｇｄ＠Ｃ_８２ であることを特徴とする、前記薬物組成物。
3. 前記食用油は、オリーブ油、アマニ油、ヒマワリ種子油、コーン胚芽油、コーン油及びスクワランの少なくとも一つを含むことを特徴とする、請求項２に記載の薬物組成物。
4. 前記親水性基は、ヒドロキシル基、アミノ基及びカルボキシル基の少なくとも一つを含むことを特徴とする、請求項２に記載の薬物組成物。
5. 前記フラーレンマイクロナノ材料及び／又は前記金属フラーレンマイクロナノ材料は、１以上の、オリーブ油で被覆されたＣ_６０、オリーブ油で被覆されたＣ_７０、オリーブ油で被覆されたＧｄ＠Ｃ_８２、ヒドロキシル基で修飾されたＣ_６０、ヒドロキシル基で修飾されたＣ_７０、又はヒドロキシル基で修飾されたＧｄ＠Ｃ_８２ であることを特徴とする、請求項２に記載の薬物組成物。
6. 前記薬物化学療法に用いられる薬物は、シクロホスファミド、アドリアマイシン、シスプラチン又はパクリタキセルであり、前記化学的毒物は、ベンゼン又はベンゼンの誘導体であり、前記骨髄抑制の副作用のある薬物は、クロラムフェニコール、テトラサイクリン又はインドメタシンであることを特徴とする、請求項２に記載の薬物組成物。
7. 前記フラーレンマイクロナノ材料及び／又は金属フラーレンマイクロナノ材料を、（１）化学療法剤を使用する前の２４時間以内に使用する段階、（２）化学療法の過程において使用する段階及び（３）化学療法が完了した後の１〜２週間以内に使用する段階の少なくとも一つの段階に、骨髄抑制の治療を必要とする生体へ投与することを特徴とする、請求項２に記載の薬物組成物。
8. フラーレンマイクロナノ材料及び／又は金属フラーレンマイクロナノ材料の投与量は、１ｍｇ／ｋｇ／ｄ〜５００ｍｇ／ｋｇ／ｄであり、１〜１００ｍｇ／ｋｇ／ｄ、１〜２０ｍｇ／ｋｇ／ｄ又は１〜１０ｍｇ／ｋｇ／ｄを選択し得ることを特徴とする、請求項２に記載の薬物組成物。
9. 前記生体は、人又は動物であり、動物は、マウス、モルモット、ラット、イヌ、ウサギ、サル等の哺乳類動物であってもよいことを特徴とする、請求項７に記載の薬物組成物。
10. 前記の油溶性フラーレンマイクロナノ材料及び／又は油溶性金属フラーレンマイクロナノ材料において、フラーレン本体材料及び／又は金属フラーレン本体材料の濃度は１２００〜１５００ｐｐｍ(ｍｇ／ｋｇ)である、請求項２に記載の薬物組成物。