JP5284345B2

JP5284345B2 - しわ抑制方法

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Publication number: JP5284345B2
Application number: JP2010502776A
Authority: JP
Inventors: 信比古三羽; 央江青島
Original assignee: 公益財団法人ひろしま産業振興機構
Priority date: 2008-03-14
Filing date: 2009-03-03
Publication date: 2013-09-11
Anticipated expiration: 2029-03-03
Also published as: CN105168008A; CN101969917A; JPWO2009113426A1; KR20100135703A; WO2009113426A1

Description

本発明は、しわ抑制方法に関するものである。

皮膚外用組成物には、クリーム、乳液、化粧水、オイルなど、種々の剤型があるが、いずれの剤型のものにおいても、紫外線防御を目的として紫外線吸収剤や紫外線散乱剤が配合されている。

一方、近年ではナノテクノロジーを利用した化粧品の開発が盛んに行われているが、このうちC₆₀、C₇₀などのフラーレン類を含有する化粧品は、各種の美肌効果を示すことが知られている。たとえば特許文献１には、フラーレンを油分に溶解して得られる化粧品が紫外線吸収作用を示すことが記載されている。また、炭素燃焼残渣の超微粒子としてのフラーレンをスクワランに浮遊分散させたものが健康増進効果を示すことも特許文献２に記載されている。

また、水に難溶のフラーレンを可溶化する技術も開発されており（特許文献３参照）、化粧品などの皮膚外用組成物への応用も実用化されている。

さらに、フラーレン類は活性酸素の消去能力を有するものとして注目されており、外用塗布への安全性も期待できることから、フリーラジカル疾患予防などに使用されるフラーレン類含有の皮膚外用組成物が提案されている（特許文献４参照）。

先行技術文献

特開平０９−２７８６２５号公報特開２００１−３１６２５１号公報特開２００５−０６０３８０号公報特開２００６−１６０６６４号公報

以上のように、フラーレン類は、化粧品などの皮膚外用組成物への各種の応用が期待されているが、その機能や作用については多くが未知のものであると予想され、フラーレン類の応用のための開発は未だ発展段階にあると言ってよい。

このような背景において、本発明者は、皮膚への適用での皮膚細胞への作用について詳細な検討を進めてきた。この検討に際しての課題の一つが「しわの抑制」であった。

それと言うのも、従来より、「しわの抑制」の作用をより有効に発揮させる技術の開発が望まれていたからである。

本発明は、以上の通りの事情に鑑みてなされたものであり、高いしわ抑制能を有する、フラーレン類を用いた新しい組成物を提供することを課題としている。

本発明は、「しわ」形成の機序についての本発明者によるヒト皮膚再構成組織での詳細な検証と、これを踏まえての「しわ抑制」のための手段の探索研究の結果から得られた全く新しい知見に基づいて導かれ、完成されたものである。

すなわち、まず、しわ形成の誘因である過酸化脂質2,4-ノナジエナールは、紫外線（UV）照射された皮膚細胞のグリセロ脂質の1,2-位の脂肪酸（主にリノール酸、アラキドン酸など）の過酸化中間体として比較的安定で皮膚内滞留性があり、そのため、しわ形成の要因となる。実際、2,4-ノナジエナールで皮下処理すると、次の３種のしわ関連症状を生じる。
（１）皮膚表面に凹凸起伏の形成を生じる。（シリコンゴム複製法を用いたレプリカ解析を示している図１（ａ）から図１（ｂ）への変化）
（２）皮膚表面に多数の角質の鱗片剥離を生じる（走査型電子顕微鏡写真を示している図２（ａ）から図２（ｂ）への変化）
（３）皮膚断面に真皮の多層分離と垂直萎縮が生じる（DMSO凍結割断法を用いた電子顕微鏡写真を示している図３（ａ）から図３（ｂ）への変化）
ところが驚くべきことに、これら３種（１）（２）（３）のしわ関連症状のいずれも、スクワランにフラーレンを溶解させた油溶状フラーレンの皮膚表面への塗布によって防御されることが確認された。一方、スクワラン単独では無効であることも確認された。

そして、油溶状フラーレンの抗しわ効果のメカニズムは、ヒト皮膚角化細胞での過酸化脂質ノナジエナールによる細胞膜傷害をともなうDNA２本鎖切断を防御することによることも確認された。

そこで、本発明では、前記のとおりの課題を解決するために、スクワランおよびスクワレンのいずれか一方、もしくは両者の混合物であるスクワラン類と、このスクワラン類に２〜５００ｐｐｍ溶解したC ₆₀ 、C _70、およびこれらの塩から選ばれる少なくとも１種のフラーレン類とからなるしわ抑制用組成物を単独で用いた皮膚外用組成物を皮膚に適用してしわを抑制することを特徴とするしわ抑制方法を提供する。

本発明によれば、スクワラン類に溶解した油溶状のフラーレン類（「リポフラーレン」と呼ぶことができる）によって、これまで困難とされてきた「しわ」を効果的に抑制することが可能となる。これによって、従来では全く予期、予測できなかった皮膚外用組成物としてのフラーレン類による美肌効果の新しい地平が拓かれることになる。

図１は、実施例１における３次元皮膚組織モデル表面のレプリカ画像とそのNIH-imageによる解析結果を示した図である。図２は、実施例１における３次元皮膚組織モデルの表面形状の走査型電子顕微鏡写真である。図３は、実施例１における３次元皮膚組織モデルの断面構造の走査型電子顕微鏡写真である。図４は、実施例２におけるヒト皮膚角化細胞の細胞死の抑制効果について示した図である。図５は、実施例４におけるヒト皮膚通常組織モデルの表面形状の走査型電子顕微鏡写真である。図６は、実施例４におけるヒト皮膚通常組織モデルの断面構造の走査型電子顕微鏡写真である。図７は、実施例５におけるヒト皮膚通常組織モデル切片の断面の蛍光顕微鏡写真である。図８は、実施例６の無作為化二重盲検マッチドペア比較試験におけるシワ面積率変化量の評価結果を示すグラフである。図９は、実施例７におけるヒト皮膚通常組織モデルの表面形状の走査型電子顕微鏡写真である。図１０は、実施例７におけるヒト皮膚通常組織モデルの表面SEM画像のNIH-imageによる解析方法を説明する図である。図１１は、実施例７におけるヒト皮膚通常組織モデルの表面SEM画像のNIH-imageによる解析結果を示した図である。図１２は、実施例７におけるヒト皮膚通常組織モデルの断面構造の走査型電子顕微鏡写真である。図１３は、実施例７におけるヒト皮膚通常組織モデルの断面SEM画像のNIH-imageによる解析結果を示した図である。図１４は、実施例７におけるヒト皮膚通常組織モデルのレプリカ画像である。図１５は、実施例７におけるヒト皮膚通常組織モデルのレプリカ画像のNIH-imageによる解析結果を示した図である。

以下、本発明について詳細に説明する。

本発明において使用される油溶状フラーレン（略称：リポフラーレン）は、スクワラン類にフラーレン類を溶解したものである。フラーレン類としては、C₃₂、C₄₄、C₅₀、C₆₀、C₅₈、C₆₀、C₇₀、C₇₆、C₇₈、C₈₂、C₈₄、C₉₀、C₉₆および、これらの塩または誘導体などを使用できるが、中でもC₆₀、C₇₀およびその塩または誘導体が好適に用いられる。また、これらのフラーレンのうち２種以上の混合物を用いてもよい。

スクワラン類については、スクワランおよびスクワレンのいずれか一方、もしくは両者の混合物であってもよい。植物性由来のもの、あるいは動物や魚類からのもののいずれであってもよい。

フラーレン類をスクワラン類に溶解させるには、フラーレン類の溶解可能量以下であればよく、その溶解量については、本発明組成物の応用の形態に沿って決めることができる。溶解時には攪拌してもよいし、加温してもよい。組成物としては、皮膚外用組成物とすることができる。

この場合の皮膚外用組成物には、その効果を損なわない範囲内において、化粧品、医薬部外品、医薬品などに一般に用いられる各種成分、たとえば水、油脂類、炭化水素類、高級脂肪酸、高級アルコール、シリコーン、アニオン界面活性剤、カチオン界面活性剤、両性界面活性剤、非イオン界面活性剤、防腐剤、糖類、金属イオン封鎖剤、水溶性高分子等の高分子、増粘剤、粉体成分、紫外線吸収剤、紫外線遮蔽剤、保湿剤、香料、ｐＨ調整剤などを配合することができる。その他、ビタミン類、皮膚賦活剤、血行促進剤、活性酸素消去剤、抗炎症剤、美白剤、殺菌剤等の他の薬効成分、生理活性成分などを配合することができる。

油脂類の具体例としては、ツバキ油、月見草油、マカデミアナッツ油、オリーブ油、ナタネ油、トウモロコシ油、ゴマ油、ホホバ油、胚芽油、小麦胚芽油、トリオクタン酸グリセリン等の液体油脂、カカオ脂、ヤシ油、硬化ヤシ油、パーム油、パーム核油、モクロウ、モクロウ核油、硬化油、硬化ヒマシ油等の固体油脂、ミツロウ、キャンデリラロウ、綿ロウ、ヌカロウ、ラノリン、酢酸ラノリン、液状ラノリン、サトウキビロウ等のロウ類などが挙げられる。

炭化水素類の具体例としては、流動パラフィン、スクワレン、スクワラン、マイクロクリスタリンワックスなどが挙げられる。

高級脂肪酸の具体例としては、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、オレイン酸、リノール酸、リノレン酸、ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）、エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）などが挙げられる。

高級アルコールの具体例としては、ラウリルアルコール、ステアリルアルコール、セチルアルコール、セトステアリルアルコール等の直鎖アルコール、モノステアリルグリセリンエーテル、ラノリンアルコール、コレステロール、フィトステロール、オクチルドデカノール等の分枝鎖アルコールなどが挙げられる。

シリコーンの具体例としては、鎖状ポリシロキサンのジメチルポリシロキサン、メチルフェニルポリシロキサン、環状ポリシロキサンのデカメチルシクロペンタシロキサンなどが挙げられる。

アニオン界面活性剤の具体例としては、ラウリン酸ナトリウム等の脂肪酸塩、ラウリル硫酸ナトリウム等の高級アルキル硫酸エステル塩、ＰＯＥラウリル硫酸トリエタノールアミン等のアルキルエーテル硫酸エステル塩、Ｎ−アシルサルコシン酸、スルホコハク酸塩、Ｎ−アシルアミノ酸塩などが挙げられる。

カチオン界面活性剤の具体例としては、塩化ステアリルトリメチルアンモニウム等のアルキルトリメチルアンモニウム塩、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウムなどが挙げられる。

両性界面活性剤の具体例としては、アルキルベタイン、アミドベタイン等のベタイン系界面活性剤などが挙げられる。

非イオン界面活性剤の具体例としては、ソルビタンモノオレエート等のソルビタン脂肪酸エステル類、硬化ヒマシ油誘導体などが挙げられる。

防腐剤の具体例としては、メチルパラベン、エチルパラベンなどが挙げられる。

金属イオン封鎖剤の具体例としては、エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム、エデト酸、エデト酸ナトリウム塩等のエデト酸塩などが挙げられる。

高分子の具体例としては、アラビアゴム、トラガカントガム、ガラクタン、グアーガム、カラギーナン、ペクチン、寒天、クインスシード、デキストラン、プルラン、カルボキシメチルデンプン、コラーゲン、カゼイン、ゼラチン、メチルセルロース、メチルヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム（ＣＭＣ）、アルギン酸ナトリウム、カルボキシビニルポリマー等のビニル系高分子などが挙げられる。

増粘剤の具体例としては、カラギーナン、トラガカントガム、クインスシード、カゼイン、デキストリン、ゼラチン、ＣＭＣ、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、カルボキシビニルポリマー、グアーガム、キサンタンガム、ベントナイトなどが挙げられる。

粉体成分の具体例としては、タルク、カオリン、雲母、シリカ、ゼオライト、ポリエチレン粉末、ポリスチレン粉末、セルロース粉末、無機白色顔料、無機赤色系顔料、酸化チタンコーテッドマイカ、酸化チタンコーテッドタルク、着色酸化チタンコーテッドマイカ等のパール顔料、赤色２０１号、赤色２０２号等の有機顔料などが挙げられる。

紫外線吸収剤の具体例としては、パラアミノ安息香酸、サリチル酸フェニル、パラメトキシケイ皮酸イソプロピル、パラメトキシケイ皮酸オクチル、２，４−ジヒドロキシベンゾフェノンなどが挙げられる。

紫外線遮蔽剤の具体例としては、酸化チタン、タルク、カルミン、ベントナイト、カオリン、酸化亜鉛などが挙げられる。

保湿剤の具体例としては、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、ジプロピレングリコール、1,3-ブチレングリコール、1,2-ペンタンジオール、グリセリン、ジグリセリン、ポリグリセリン、キシリトール、マルチトール、マルトース、ソルビトール、ブドウ糖、果糖、コンドロイチン硫酸ナトリウム、ヒアルロン酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、ピロリドンカルボン酸、シクロデキストリンなどが挙げられる。

本発明の組成物は、たとえば、水溶液、油剤、乳液、懸濁液等の液剤、ゲル、クリーム等の半固形剤、固形等の固形剤の形態で適用可能である。従来から公知の方法でこれらの形態に調製し、ローション剤、乳剤、ゲル剤、クリーム剤、軟膏、硬膏、ハップ剤、エアゾール剤などの種々の剤型とすることができ、これらを身体に塗布、貼付、噴霧などにより適用することができる。特にこれら剤型の中で、ローション剤、乳剤、クリーム剤、軟膏剤、硬膏剤、ハップ剤、エアゾール剤等が皮膚外用組成物に適している。

本発明の組成物は、水や水性溶媒、たとえばアルコール等と水との混合物等の水系溶媒に分散されていることで、化粧品をはじめとする外用剤等として、実用的な技術としてより有効に展開される。

水系溶媒への分散は、たとえばO/Wエマルジョン等として具体化されるが、この水系分散体の製造には、超音波の照射やボルテックスミキサー、ホモジナイザー等による処理がより有効である。

そして、この水系溶媒へのフラーレン脂溶体の分散にはノニオン界面活性剤も有効に使用される。たとえばポリオキシエチレンエーテル構造を主体とするノニオン界面活性剤である。これらのノニオン界面活性剤の添加使用量は、全体量の0.01〜2質量％の範囲とすることが好ましい。

ホモジナイザーとしてはPotter型ホモジナイザーが好適なものとして考慮される。このものは、ガラス製筒、筒内腔にフィットしたフッ素樹脂製回転棒との組み合わせで、両者の回転とピストン運動の摺り合わせで粒子を微粒化する。エアーを巻き込み難いため、微粒化に有効である。

これら手段による分散処理では滅気泡条件したで行うことが好ましく、さらに好ましくは、水分散体は外用剤として適用することができ、その形態についてはたとえば以下のことが考慮される。

１．適用量
皮膚外用組成物におけるフラーレン類の濃度は、たとえば0.00001〜30質量％であり、使用感的側面などを考慮すると5質量％以下が好ましい。皮膚に適用する場合、外用組成物の量は、たとえば皮膚面積１平方メートル当たり液体0.001〜20ml、好ましくは0.01〜5.0mlであり、外用塗布、湿布または噴霧などにより適用することが望ましい。

２．適用形態
皮膚外用組成物の形態の例としては、特に限定されず、たとえば、水溶剤、軟膏、乳液、クリーム、ジェル剤、パック、浴剤、洗浄剤、パップ剤、分散液などのあらゆる外用剤の形態を取ることができ、その剤型についても特に制限はなく、ペースト状、ムース状、ジェル状、粉末状、溶液系、可溶化系、乳化系とすることができる。特に水溶液、乳剤、軟膏剤、ジェル剤、水溶性剤、美容液、パック剤については、これらの剤を外用した後に加湿導入器、振動導入器、イオン導入器、音波導入器、電磁波導入器を用いることによりフラーレン類の皮膚への浸透を促進することができより大きな効果を発揮できる。

塗布方法は、液剤の場合、スプレー、貼布、湿布、ディッピング、マスクなど物理的に可能な全ての方法を用いることができる。

本発明の組成物を化粧料として使用する場合には、化粧水、乳液、クリーム、パック等の皮膚化粧料、メイクアップベースローション、メイクアップクリーム、乳液状、クリーム状、または軟膏型のファンデーション、ハンドクリーム、レッグクリーム、ボディローション等の身体用化粧料等とすることができる。

以下、実施例により本発明をさらに詳しく説明するが、本発明はこれらの実施例に何ら限定されるものではない。なお、下記において％表示は特に明示しない限り質量％を表す。
＜実施例１＞
３次元皮膚組織モデル（Test skin LSE-high、東洋紡績）を用いて、下記表１の手順に従って試験サンプルを作製し、リポフラーレンによるシワ抑制試験を行った。

試験サンプルとしてコントロール（PBS(-)のみ投与）、過酸化脂質2,4-ノナジエナール（NDA）500μM投与、NDA 500μMとスクワラン投与、およびNDA 500μMとリポフラーレン投与の３次元皮膚組織モデルサンプルを用意し、シリコンゴム複製法を用いたレプリカの実体顕微鏡による画像撮影およびシワ度の解析等の評価を行った。リポフラーレンは、植物性スクワラン（Uniquema）にフラーレン（C₆₀, C₇₀を含む）を溶解させ、C₆₀濃度として500ppm含むよう調整した。

その結果を図１に示す。なお、実験検証においては、2,4-ノナジエナール（NDA）500μMを含む培地でヒト皮膚組織サンプルを42時間培養し、リポフラーレンは、NDA投与の5時間前に培地に投与している。図１中、（ａ）はコントロール（PBS(-)）、（ｂ）はNDAのみ投与（500μM）、（ｃ）はリポフラーレンの代わりに植物性スクワランを投与した場合の比較結果を示している。同図に示されるように、リポフラーレン投与サンプルは、NDA投与サンプル、更にはコントロールおよびスクワラン投与サンプルに比較しても皮膚表面のシワ形成を抑制した。すなわち、図１（ｃ）に示したように、スクワラン単独の場合には表面凹凸はほとんど改善されないのに対し、図１（ｄ）に示したようにリポフラーレン投与の場合には表面凹凸がほぼ改善されることが確認された。

また、上記と同様の試験サンプルについて、３次元皮膚組織モデルの表面形状を走査型電子顕微鏡で観察し（図２）、３次元皮膚組織モデルの断面構造をDMSO凍結割断法を用いて電子顕微鏡で観察した（図３）。図２および図３中、（ａ）はコントロール（PBS(-)）、（ｂ）はNDAのみ投与（500μM）、（ｃ）はリポフラーレンの代わりに植物性スクワランを投与した場合、（ｄ）はリポフラーレンを投与した場合の結果を示している。

図２（ｄ）に示すようにリポフラーレンの場合には、皮膚表面に生じる多数の角質鱗片剥離を制御し、図３（ｄ）に示すように、皮膚断面での真皮の多層分離と萎縮を防御することも確認された。図２（ｃ）、図３（ｃ）に示すように、スクワラン単独ではこれらの効果は弱かった。
＜実施例２＞
スクワランに溶解したフラーレン、すなわちリポフラーレンを用いて、NDAによるヒト皮膚角化細胞（HaCaT）の細胞死（アポトーシス）抑制の効果をTUNEL染色により検証した。

図４はその結果を示したものであって、コントロール、NDA（30μM）のみ投与、リポフラーレンの代わりに植物性スクワランを投与した場合、リポフラーレンを投与した場合を左から順に示している。リポフラーレン（4％：C₆₀として20ppm）においては、DNA２本鎖切断が顕著に抑制されていることが確認された。一方、スクワラン単独では、このようなことはほぼ無効であった。
＜実施例３＞
C₆₀フラーレンの割合が概ね95％のC₆₀標品を、植物性スクワランに溶解し、次いでPotter型ホモジナイザーによって減気泡条件下（アスピレータで減圧化して気泡を減少させるに水分散させ、O/Wエマルジョンを形成した。

このエマルジョンの各々をヒト皮膚角化細胞：HaCaT Cell培養系に添加して細胞生存率について評価した。その結果、大きく向上していることが確認された。
＜実施例４＞
真皮、基底膜、表皮、および角質層を有する直径24mmのヒト皮膚通常組織モデルを次の手順にて作製した。

コラーゲンゲル培養キット（新田ゼラチン（株））を用いて、コラーゲンゲルの培養を、新田ゼラチン（株）のプロトコル（http://www.nitta-gelatin.co.jp/products/labo/column_1.html参照）に準拠して行った。遠心回収した繊維芽細胞OUMS-36 5×10⁵/wellを含むペレットに、冷却したI型コラーゲンゲル混合溶液を加え、均一になるように混合した。この繊維芽細胞OUMS-36を含んだI型コラーゲン混合溶液を培養皿に分注し、インキュベータ中で37℃、30分間静置しゲル化した。

次に、培地（DMEM/10%FCS）中でI型コラーゲンゲルを液相培養した。5日後にはゲルが収縮した。

次に、I型コラーゲンゲルの上にIV型コラーゲン、ラミニン、およびエンタクチンを含有する基底膜形成用ゲルを重層した。

次に、基底膜形成用ゲル上にヒト皮膚角化細胞（HaCaT）5×10⁵/wellを播種し、これを培地（DMEM/Ham’s F12（1:1）+5%FBS+15% Knock out serum replacement（SR、Introgen Inc.））中で１日間液相培養した。

次に、培地（DMEM/Ham’s F12（1:1）+1%FBS+15% Knock out serum replacement）に交換して4日間液相培養した。

次に、ヒト皮膚角化細胞を重層したゲルを培地（DMEM/Ham’s F12（1:1）+15% Knock out serum replacement）に漬けた濾紙上に置き、ヒト皮膚角化細胞を空気暴露し14日間培養した。これにより基底膜上に表皮と角質層が形成された。

このようにして得られたヒト皮膚通常組織モデルを用いて、下記表２の手順に従って試験サンプルを作製し、リポフラーレンによるNDA防御効果の評価試験を行った。

試験サンプルとしてコントロール（PBS(-)のみ投与）、NDA 450μM投与、NDA 450μM+スクワラン投与、NDA 450μM+リポフラーレン（C₆₀として2-500ppm）投与のヒト皮膚通常組織モデルサンプルを用意し、その表面形状を走査型電子顕微鏡で観察し（図５）、断面構造をDMSO凍結割断法を用いて電子顕微鏡で観察した（図６）。図５、６に示されるように、NDA投与サンプル、NDA+スクワラン投与サンプルではNDAにより皮膚の構造が傷害された。一方、リポフラーレンの投与によってNDAによる皮膚の傷害が抑制され、その防御効果はフラーレン含有量に依存して増大した。
＜実施例５＞
実施例４と同様の試料を用い、リポフラーレンによるNDA防御効果（細胞核保持効果）を、Hoechst33342核染色を用いた蛍光顕微鏡測定により調べた。スクワランまたはリポフラーレン（C₆₀として2, 50, 200ppm） 150μL/wellをヒト皮膚通常組織モデル（φ 24mm）に投与してインキュベート（5hr, 37℃）した。次いで450μM NDA/wellを含む培地に交換し、インキュベート（42hr, 37℃, 5% CO₂）した。PBS(-) 200μLで3回リンスし、凍結後、皮膚切片（厚さ5mm）についてHoechst33342核染色を行い、蛍光顕微鏡で観察した。

ヒト皮膚通常組織モデルの核染色は次の手順で行った。

ヒト皮膚通常組織モデル切片（厚さ5μm）の断面の蛍光顕微鏡写真を図７に示す。コントロールでは、細胞核は健常な状態であった。NDA投与サンプル、NDA+スクワラン投与サンプルでは、NDAにより表皮細胞でアポトーシス症状の一つである、DNA断裂、核凝縮および変形が起こっていた。一方、リポフラーレンの投与により、NDAによる細胞核への傷害をC₆₀の濃度依存的に防御した。
＜実施例６＞
リポフラーレン配合化粧品について、無作為化二重盲検マッチドペア比較試験を行った。被験者23名を対象として、下記表４に示す処方の化粧品（クリーム、左：被験品、フラーレン 1.8μg/日、右：プラセボ、フラーレン 0.0μg/日）を塗布した。I群（11名）には被験品を右半顔に塗布、プラセボを左半顔に塗布し、II群（12名）にはプラセボを右半顔に塗布、被験品を左半顔に塗布した。

被験者の選択基準は、シワグレードが2〜3の成人女性（左右同じグレード）とした。化粧品は、1日2回朝と晩、洗顔後、指定のスキンケア製剤で肌を整えた後、メイク前に指定された側の半顔に塗布させた。使用化粧品は、見本に従い毎日同じ量（半顔につき0.3g程度）をとり、顔の4ヶ所（額、頬、あご、目尻）に置いてから、顔半分に十分になじませた。目尻は優しくなじませ、しっかり浸透させた。使用期間は8週間とした。

シワ面積率を評価項目とし、評価方法は、化粧品機能性評価法ガイドライン（日本香粧品学会2006年）に準じた。化粧品の使用前と使用後の目尻および目尻下のシワをレプリカにとり、一定方向（水平面から30°）より並行光を照射し、生じた陰影を画像処理した。そこから陰影面積の長さ、深さを算出した。同様に標準スケールからも陰影面積とその長さを算出し検量線を作製し、目尻シワレプリカの数値を補正した。

シワ面積率、シワ面積率変化量の評価結果を表５、図８に示す。

シワ面積率は使用前と比較して被験品は4週、8週目に減少した。プラセボは、4週、8週目ともに増加した。そしてシワ面積率変化量において、被験品とプラセボで対応のあるt検定を行った結果、8週目に有意（p=0.021)な差が認められた。また、安全性に問題となる有害事象は発現されなかった。

以上より、リポフラーレン配合クリームはシワを減少させる抗シワ作用を有することが確認された。
＜実施例７＞
実施例４と同様にして真皮、基底膜、表皮、および角質層を有するヒト皮膚通常組織モデルを作製した。

このヒト皮膚通常組織モデルを用いて、下記表６の手順に従って試験サンプルを作製し、リポフラーレンと、ラジカルスポンジ（Radical Sponge(R)、ビタミンC60バイオリサーチ（株）、混合フラーレン（C₆₀、C₇₀）を10%のポリビニルピロリドンにて包接した後、水に溶解したもの、C₆₀ 200ppm以上）とのシワ抑制効果の比較を行った。

試験サンプルとしてコントロール（PBS(-)のみ投与）、NDA 500μM投与、NDA 500μM+ラジカルスポンジ（C₆₀として4ppm, 30ppm）投与、NDA 500μM+リポフラーレン（C₆₀として4ppm, 30ppm）投与のヒト皮膚通常組織モデルサンプルを用意し、その表面形状を走査型電子顕微鏡で観察した（図９）。また、図１０に示すように、ヒト皮膚通常組織モデル表面形状のSEM画像のNIH-imageによる解析を行った。具体的には、SEM画像の３つのエリアについてNIH-image 1.6.3によりラインヒストグラムを作成し、凹凸の中間にラインを引いて上下の面積を合計し、平均値を求めて各処理区のシワ度(μm²/area)とした。その結果を図１１に示す。

図９〜図１１より、等量のラジカルスポンジよりもリポフラーレンの方が刺激物質（NDA）による皮膚刺激を低減することが示された。

また、同様のヒト皮膚通常組織モデルサンプルについて断面構造をDMSO凍結割断法を用いて走査型電子顕微鏡により観察し（図１２）、ヒト皮膚通常組織モデル断面形状のSEM画像のNIH-imageによる解析を行った（図１３）。

図１２、図１３より、等量のラジカルスポンジよりもリポフラーレンの方が刺激物質（NDA）による皮膚刺激を低減することが示された。

また、同様のヒト皮膚通常組織モデルサンプルについてシリコンゴム複製法を用いたレプリカの実体顕微鏡による画像撮影を行い（図１４）、レプリカ画像のNIH-imageによる解析を行った（図１５）。

図１４、図１５より、等量のラジカルスポンジよりもリポフラーレンの方が皮膚表面のシワ形成を抑制した。

以上のように、フラーレン含有製剤としてはラジカルスポンジよりもリポフラーレンの方がより有望な抗しわ剤であることが明らかとなった。

Claims

スクワランおよびスクワレンのいずれか一方、もしくは両者の混合物であるスクワラン類と、このスクワラン類に２〜５００ｐｐｍ溶解したC₆₀、C_70、およびこれらの塩から選ばれる少なくとも１種のフラーレン類とからなるしわ抑制用組成物を単独で用いた皮膚外用組成物を皮膚に適用してしわを抑制することを特徴とするしわ抑制方法。