JP2023516283A - カンナビジオールを含む局所用組成物 - Google Patents

Abstract

５００ｎｍ未満のサイズを有するニオソーム中のカンナビノイド、特にカンナビジオールを含む水性組成物と、少なくとも１つの局所的に許容可能な賦形剤とを含む局所用組成物であって、前記ニオソームが、（ｉ）飽和又はモノ不飽和直鎖脂肪酸でエステル化された少なくとも１つの直鎖又は分岐鎖ポリグリセロールと、（ｉｉ）少なくとも１つの多糖と、任意選択で（ｉｉｉ）４～１６個の炭素原子を有する少なくとも１つのグリコールと、を含むことを特徴とする、局所用組成物。

Description

本発明は、カンナビノイドを含む局所用組成物に関する。特に、本発明は、ニオソーム、好ましくは５００ｎｍ未満のサイズを有するニオソームに組み込まれたカンナビジオールと、少なくとも１つの局所的に許容可能な賦形剤とを含む局所用組成物に関する。

カンナビス・サティバ・Ｌ(Cannabis sativa L.)は、その工業的及び治療的使用のために古代から知られている、カンナバシ科に属する一年生の草本植物である。

大麻花序(inflorescences or flos)は大麻植物の特徴的かつ独占的な活性物質であるカンナビノイドを最高濃度で含有し、２つの主要な活性物質は、デルタ－９－テトラヒドロカンナビノール（ＴＨＣ）及びカンナビジオール（ＣＢＤ）である。

現在、５００を超える物質が大麻植物から分離されており、その中には１２０を超えるカンナビノイド、例えば、テトラヒドロカンナビノール（ＴＨＣ）、カンナビジオール（ＣＢＤ）、カンナビクロメン（ＣＢＣ）、カンナビゲロール（ＣＢＧ）、カンナビジバリン（ＣＢＤＶ）、カンナビノール（ＣＢＮ）などがあり、これらは大麻植物の気中部分に様々な量で存在する。

大麻及びその誘導体は、現在、化学療法誘発嘔吐、悪心及び疼痛、多発性硬化症及び一部のてんかんに関連する痙縮を含む、多くの病的状態の治療のために認められている(Abrams, D.I., European Journal of Internal Medicine, March 2018, Volume 49, Pages 7-11)。Δ９－ＴＨＣはその治療作用及び用途に関与する大麻における主要なカンナビノイドの１つであるが、その精神活性の可能性及び習慣性はその治療開発を制限している。カンナビジオール（ＣＢＤ）は大麻植物中に存在する他の主要なカンナビノイドであり、Δ９－ＴＨＣとは異なり、向精神作用がなく、カンナビミメティック作用がなく、嗜癖可能性がない(Babalonis et al. , Drug Alcohol Depend. 2017 March 01 ; 172: 9-13)。ＣＢＤの化学及び薬理学、並びにその分子標的が最近概説されている。実際、長い間放置されていたＣＢＤは現在、皮膚障害を含むその治療特性について注目を集めている(Pisanti et al., Cannabidiol: State of the art and new challenges for therapeutic applications, Pharmacology and Therapeutics, Volume 175, July 2017, Pages 133-150)。

カンナビジオールは大麻(Cannabis sativa L.)の地上部から主に抽出されるが、合成的にも生産される。カンナビジオールは皮膚に対して有益な作用を有するかもしれず、例えば皮脂分泌を調節することによって、皮膚の内在性カンナビノイド系と相互作用するかもしれない。多くの科学的研究によりカンナビジオールの再生能力が確認されており、これはまた皮膚及び皮膚付属器官のための抗炎症剤、抗酸化剤、治癒剤、及び抗菌剤としても有用である。カンナビジオールはまた、自然な細胞再生を支援することができ、有害な環境の影響に対する保護シールドとして作用すること（抗汚染作用）ができる。

しかしながら、カンナビジオールはまた、局所製剤の調製、特に化粧品及び／又は医療デバイス及び／又は皮膚及び粘膜への適用のための医薬製剤の調製に適していないことが知られており、その理由は、水へのその乏しい溶解性、及びその結果として生じる不安定性又はクリーム、ローション、ゲル又は他の局所製剤中に通常存在する高い割合の水との不適合性である。したがって、カンナビジオールは、現在、皮膚及び上皮を透過する能力が乏しい油性溶液／懸濁液において使用され、これは局所カンナビジオール投与の有効性を抑制し又は低減している。

カンナビジオールの局所製剤における溶解性及び安定性並びに皮膚を通した透過を改善するためのニオソームの使用が、E. Ripamonti et al, "Evaluation of the efficacy of proprietary niosomes as enhancers of skin permeability of plant extracts: an in vitro study", H&PC Today, vol.13(2) March/April 2018に示唆されているが、ＷＯ２０１７／１６８３５４Ａ１に記載されているニオソームモデルで得られた結果は、統計的に有意な結果をもたらさなかった。

今日まで、化粧品産業は局所適用のためのカンナビジオールの製剤化を可能にし、皮膚を通してカンナビジオールを効果的に送達することができる組成物を依然として探索している。

出願人はカンナビジオールの局所投与の問題に直面しており、驚くべきことに、当技術分野で既知の欠点を克服することができる、ニオソームに組み込まれたカンナビジオールの製剤を見出した。

特に、本出願人は、経時的に安定であり、分離及び／又は沈殿及び／又はその成分の変化を生じない水性エマルジョンの形態の、カンナビジオールを含む局所用組成物を作製するという問題に直面している。

同時に、本出願人は、より多い量のカンナビジオールを可溶化することができる、カンナビジオールを含む局所用組成物を作製する問題に直面した。

最後に、本出願人は、皮膚を通したカンナビジオールの透過を改善するカンナビジオールを含む局所用組成物を作製するという問題に直面した。

広汎な実験の後、本出願人は飽和又はモノ不飽和直鎖脂肪酸でエステル化された、少なくとも１つの直鎖又は分岐鎖ポリグリセロール、（ｉｉ）少なくとも１つの多糖、好ましくはβ－グルカン、及び任意選択で（ｉｉｉ）４～１６個の炭素原子を有する少なくとも１つのグリコール、好ましくはカプリリルグリコール、を含むニオソームに組み込まれたカンナビジオール組成物を含む局所用組成物が、５重量％以上までのカンナビジオールを可溶化することを可能にし、皮膚を通るカンナビジオールの透過を増強し、それによって、同じ量の投与される製品について、より多くのカンナビジオールを利用可能にし、より有効にすることを見出した。

特に、本出願人は、本発明の組成物が、押出測定によって推定される、増加した弾性を示すことを見出し、これはニオソームに皮膚の細胞間空間を横切る際の改善した可塑性及び変形性を与えるβ－グルカンの存在によって補助される。

本出願人はさらに、得られた局所用組成物が経時的に安定であり、刺激を引き起こさず、十分な微生物に対する抵抗性を有することを見出した。

最後に、本出願人はこのようにして得られた局所用組成物が大気汚染物質、例えば粒子状物質からの効果的な保護を提供することに加えて、皮膚細胞生存率及び細胞栄養を改善することもできたこと、有意な抗炎症能力を発揮することができたことを見出し、これは、部分的にカンナビジオール成分の透過の改善に関連し、部分的にβ－グルカンの存在に関連する。

さらに、本出願人は、本発明の組成物が毛球細胞における有糸分裂誘発の刺激と共に、皮膚におけるかなりの鎮静及び抗かゆみ活性を有することも見出した。一方、未だ進行中の予備評価は、本発明の組成物が皮膚においてかなりの疼痛緩和活性を有することを示唆している。

本出願人はまた、カンナビジオールを用いて得られた結果は、安定性及び透過能力に関して、例えば、前述のカンナビゲロール（ＣＢＧ）及びカンナビノール（ＣＢＮ）などの他のカンナビノイドに拡張することができると考える。

したがって、本発明の第１の目的は、５００ｎｍ未満のサイズを有するニオソーム中のカンナビノイド、特にカンナビジオールを含む水性組成物と、少なくとも１つの局所的に許容可能な賦形剤とを含む局所用組成物であって、前記ニオソームが、（ｉ）飽和又はモノ不飽和直鎖脂肪酸でエステル化された少なくとも１つの直鎖又は分岐鎖ポリグリセロールと、（ｉｉ）少なくとも１つの多糖と、任意選択で（ｉｉｉ）４～１６個の炭素原子を有する少なくとも１つのグリコールと、を含むことを特徴とする局所用組成物に関する。

本発明の第２の態様は、ニオソームに組み込まれたカンナビノイド、特にカンナビジオールを含む水性組成物、特に水性分散液又は溶液に関し、前記ニオソームが、（ｉ）飽和又はモノ不飽和直鎖脂肪酸でエステル化された少なくとも１つの直鎖又は分岐鎖ポリグリセロールと、（ｉｉ）少なくとも１つの多糖と、任意選択で（ｉｉｉ）４～１６個の炭素原子を有する少なくとも１つのグリコールと、を含むことを特徴とする。

本発明の第３の態様はカンナビノイド、特にカンナビジオールを含むニオソームを含む水性組成物を調製する方法であって、手振とう又は超音波振とう技術の使用を含み、前記ニオソームが、（ｉ）飽和又はモノ不飽和直鎖脂肪酸でエステル化された少なくとも１つの直鎖又は分岐鎖ポリグリセロールと、（ｉｉ）少なくとも１つの多糖と、任意選択で（ｉｉｉ）４～１６個の炭素原子を有する少なくとも１つのグリコールと、を含むことを特徴とする方法に関する。

本発明は添付の図面を参照して以下に記載される以下の詳細な説明において最も良く説明され、添付の図面は説明の目的のみのために提供され、したがって、限定するものではない。

ネガティブ染色法を用いてＴＥＭ透過電子顕微鏡(JEM-1200EX, JEOL Co., Tokyo, Japan)によって観察された実施例１のニオソーム分散ベシクル（ＣＢＤ－Ｓ５）の顕微鏡写真を示す。 Brookhaven 90Plus-Particle Size Analyzer装置を用いて、実施例１と同じ試料のニオソーム分散液（ＣＢＤ－Ｓ５）を分析することによって得られた動的光散乱（ＤＳＬ）のグラフを示す。 実施例５Ａに記載された、陽性対照（ＰＣ）及び陰性対照（ＮＣ）に対する、実施例１のニオソーム分散液（ＣＢＤ－Ｓ５）で処理された再構成ヒト表皮モデルの相対細胞生存率のグラフを示す。 実施例８に記載された、陽性対照（ＰＣ）及び陰性対照（ＮＣ）に対する、ＰＭ２．５の存在下又は非存在下における、実施例１のニオソーム分散液（ＣＢＤ－Ｓ５）で処理された再構成ヒト表皮モデルの相対細胞生存率のグラフを示す。 実施例８に記載された、陽性対照（ＰＣ）及び陰性対照（ＮＣ）に対する、ＰＭ２．５の存在下又は非存在下における、実施例１のニオソーム分散液（ＣＢＤ－Ｓ５）で処理された再構成ヒト表皮モデルの、ＩＬ－１α放出の相対パーセントのグラフを示す。

本発明は、第１の態様において、５００ｎｍ未満のサイズを有するニオソームに組み込まれたカンナビジオール、特にカンナビジオールと、少なくとも１つの局所的に許容可能な賦形剤とを含む水性組成物を含む局所用組成物であって、ニオソームが（ｉ）飽和又はモノ不飽和直鎖脂肪酸でエステル化された、少なくとも１つの直鎖又は分岐鎖ポリグリセロール、（ｉｉ）少なくとも１つの多糖、及び任意選択で（ｉｉｉ）４～１６個の炭素原子を有する少なくとも１つのグリコールを含むことを特徴とする、局所用組成物に関する。

本明細書で使用される「局所的に許容可能」という表現は、皮膚、上皮及び／又は粘膜に適用された場合に有害な副作用（刺激、毒性など）を有さないと認識される物質を定義することが意図される。

本明細書で使用される「ニオソーム(niosome or niosomes)」という表現は、二重層に配向した非イオン性界面活性剤から形成される親水性ベシクルを定義することを意図する。

有利には、本発明において使用されるニオソームは、４００ｎｍ未満、より好ましくは３００ｎｍ未満、さらにより好ましくは２００ｎｍ未満の直径を有する。

好ましくは、本発明において使用されるニオソームは、１０ｎｍより大きい、より好ましくは２０ｎｍより大きい、さらにより好ましくは４０ｎｍより大きい直径を有する。

有利には、本発明において使用されるニオソームが５０ｎｍ～１８０ｎｍ、好ましくは７０ｎｍ～１５０ｎｍの直径を有する。

本発明において有用な飽和又はモノ不飽和直鎖脂肪酸でエステル化された直鎖又は分岐鎖ポリグリセロールは、直鎖又は分岐鎖ポリグリセロールを飽和又はモノ不飽和直鎖脂肪酸でエステル化することによって得られる。

本発明において有用なカンナビジオールは天然及び／又は合成由来のものであってもよく、好ましくは９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、又は９９以上の純度を有する。有利には、本発明において有用なカンナビジオールは約１００％の純度を有する。

天然由来のカンナビジオールは例えば、カンナビクロメン、カンナビゲロール、及びカンナビノールなどの他のカンナビノイドを少ないパーセント含んでいてもよく、一般に、総計で５％以下、４％以下、３％以下、２％以下、又は１％以下含んでいてもよい。

ポリグリセロールの好ましい例は、トリグリセロール、テトラグリセロール、ヘキサグリセロール、オクタグリセロール、デカグリセロールである。本発明において有用な直鎖又は分岐鎖ポリグリセロールは商業的に入手可能である。

市販品の例は、American International Chemical LLCによりＰｏｌｙｇｌｙｃｅｒｏｌ－３の商品名で、Spiga Nord SpA.によりＶｅｇｅｔａｂｌｅ Ｐｏｌｙｇｌｙｃｅｒｉｎｅ－３、Ｖｅｇｅｔａｂｌｅ Ｐｏｌｙｇｌｙｃｅｒｉｎｅ－４、Ｖｅｇｅｔａｂｌｅ Ｐｏｌｙｇｌｙｃｅｒｉｎｅ－６、及びＶｅｇｅｔａｂｌｅ Ｐｏｌｙｇｌｙｃｅｒｉｎｅ－１０の商品名で、Solvay Chemicals, Inc.によりＰｏｌｙｇｌｙｃｅｒｏｌ－３及びＰｏｌｙｇｌｙｃｅｒｏｌ－４の商品名で、販売されているポリグリセロールである。

飽和直鎖脂肪酸の有用な例は、４～３２個の炭素原子を有するモノカルボン酸、例えば酪酸、吉草酸、カプロン酸、エナント酸、カプリル酸、ペラルゴン酸、カプリン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、マルガリン酸、ステアリン酸、アラキジン酸、ベヘン酸、リグノセリン酸、セロチン酸、モンタン酸、メリシン酸、及びラクセル酸を含む。

好ましい飽和直鎖脂肪酸は、１２～２２個の炭素原子を有するモノカルボン酸、例えば、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、マルガリン酸、ステアリン酸、アラキジン酸、及びベヘン酸を含む。

直鎖モノ不飽和脂肪酸の有用な例は、１４～２４個の炭素原子を有するモノカルボン酸、例えばミリストレイン酸、パルミトレイン酸、オレイン酸、ガドレイン酸、及びエルカ酸を含む。

脂肪酸の混合物の有用な例は、種子又は果実を圧縮又は抽出することによって得られる植物油、例えば、オリーブ油、ピーナッツ油、ココナッツ油、パーム油、及び菜種油である。多価不飽和酸の含有量が低いため、オリーブ油及びココナッツ油、特にオリーブ油が好ましい。

本発明において有用な、直鎖飽和又はモノ不飽和脂肪酸との直鎖又は分岐鎖ポリグリセロールのエステル、又はそれらの混合物は、商業的に利用可能である。市販品の例は、LonzaによりＰｏｌｙａｌｄｏ、例えばＰｏｌｙａｌｄｏ（登録商標）６－２－Ｓ［ジステアリン酸ポリグリセリル－６］、Ｐｏｌｙａｌｄｏ（登録商標）１０－１－Ｓ［ステアリン酸ポリグリセリル－１０］、Ｐｏｌｙａｌｄｏ（登録商標）１０－１－Ｏ［オレイン酸ポリグリセリル－１０］、Ｐｏｌｙａｌｄｏ（登録商標）１０－２－Ｐ［ジパルミチン酸ポリグリセリル－１０］の商品名で、Hydrior AG, GermanyによりＨｙｄｒｉｏｌ、例えばＨＹＤＲＩＯＬ（登録商標）ＰＧＯ（ポリグリセロール－４－オレイン酸エステル）、ＨＹＤＲＩＯＬ（登録商標）ＰＧＤ（ポリグリセロール－３－ジイソステアリン酸エステル）の商品名で、Naturalis s.r.l.によりＳｏａｖｉｒｏｌ、例えばＳｏａｖｉｒｏｌ ＯＶ６（オリーブ油ポリグリセリル－６エステル）、Ｓｏａｖｉｒｏｌ ＯＶ４（オリーブ油ポリグリセリル－４エステル）の商品名で、及びNikko Chemicals Co, Ltd.によりＮｉｋｋｏｌ Ｈｅｘａｇｌｙｎ、例えばＮｉｋｋｏｌ Ｈｅｘａｇｌｙｎ １－Ｌ（ラウリン酸ポリグリセリル－６）及びＮｉｋｋｏｌ Ｈｅｘａｇｌｙｎ ＰＲ－１５（ポリリシノレイン酸ポリグリセリル－６）の商品名で、市販されているポリグリセロールエステルである。化粧品への適用のためのポリグリセロールエステルのさらなる供給業者は、https://cosmetics.specialchem.com/selectors?q=polyglvcerylで見つけることができる。

本発明において有用な多糖は、好ましくは天然由来の多糖、例えばプルラン、グルカン、アルギネート、アミロース、グリコーゲン、イヌリンなどからなる群から選択される。

有利には、本発明において有用な多糖がα－及びβ－グルカン、より好ましくはβ－グルカンからなる群から選択される。

β－グルカンは、β（１－３）グリコシド結合によって一緒に連結されたグルコース分子を含む直鎖多糖である。β－グルカンは、穀類、細菌及び真菌に見られる天然産物である。オーツ及びオオムギは特にβ－グルカンが豊富であり、それらの生産は、主にこれらの穀類からの抽出に由来する。真菌から得られるβ－グルカンも広く商業的に利用可能されている。真菌及び酵母由来のβ－グルカンはグリコシド性及びβ（１－６）の結合を有する分岐結合を含み、一方で穀類由来のβ－グルカンはグリコシド性、β（１－３）及びβ（１－４）の結合を有する。穀類に由来するβ－グルカンは水にさらに可溶性であり、したがって、本発明の目的のために好ましい。

本発明の目的に特に有用なβ－グルカンは、Ohly GmbH, GermanyによりＯｈｌｙ－ＧＯ（登録商標）Ｇｌｕｃａｎの商品名で、Maypro Industries LLCによりＣｈｉｔｏｇｌｕｃａｎ（登録商標）の商品名で、Lesaffre Human CareによりＬｙｎｓｉｄｅ（登録商標)Ｗａｌｌ Ｇｌｕｃａｎの商品名で、及びHerbaKraft IncによりＢｅｔａ Ｇｌｕｃａｎの商品名で、販売されているβ－グルカンである。化粧品への適用のためのβ－グルカンのさらなる供給業者は、https://cosmetics.specialchem.com/inci/beta-qlucanで見つけることができる。

本発明において有用な４～１６個の炭素原子を有するグリコールは、好ましくは１，２－ブタンジオール、１，２－ペンタンジオール、１，２－ヘキサンジオール、１．２－ヘプタンジオール、１，２－オクタンジオール（カプリリルグリコール）、１，２－デカンジオール（カプリルグリコール）、１，２－ドデカンジオール（ラウリルグリコール）、及び１，２－ヘキサデカンジオールからなる群から選択される。

１．２－ヘキサンジオール、１，２－ヘプタンジオール、１，２－オクタンジオール（カプリリルグリコール）、１，２－デカンジオール（カプリルグリコール）が特に好ましい。本発明の目的のために、１，２－オクタンジオール（カプリリルグリコール）が有利に使用される。

本発明の目的に有用なグリコールを含む市販品は、CBW Chemie GmbH, Germanyにより、Inolex Inc., USAによりＬｅｘｇａｒｄ（登録商標）の商品名で、Wintersun Chemical, USAにより、及びChemos GmbH & Co. KGにより、市販されている。

本発明において有利なポリグリセロール及びそれらのエステル、β－グルカン、並びにグリコールの供給業者は、インターネット上で、例えばhttps://www.food-inqredients.com/enqlish/、http://www.buversquidechem.com/、及びhttps://cosmetics.specialchem.comで見つけることができる。

本発明の目的のために採用されるニオソームの製造において、ニオソームの水溶液／分散液を安定化及び保存するのに適したさらなる成分、例えば、アスコルビン酸及びその誘導体、並びにポリフェノールなどの水溶性天然抗酸化剤が好ましく使用される。

本発明のニオソームを含む水性組成物は、当技術分野で既知の技術に従って、例えば、手振とう技術によって、又は超音波技術によって調製することができる。

手振とう技術は、ガラスフラスコ中で行われる、例えばエチルエーテル、クロロホルム又はメタノールなどの揮発性有機溶媒中で成分を可溶化する第１の工程、室温（２０～２５℃）でロータリーエバポレーターにおいて行われる蒸発であって、フラスコの壁に付着した成分の薄層を残す第２の工程、及び最後に、わずかな撹拌下で０℃～６０℃の温度で植物抽出物を含む水相で再水和する第３の工程を含む。

超音波技術は、界面活性剤を含む有機相と植物抽出物を含む水相とを混合することによって得られる分散液の、０℃～６０℃の温度での超音波処理を含む。

ニオソームを含む組成物を調製するこれらの方法及び他の方法は、文献、例えばMadhav et alによる"Niosomes: a novel drug delivery system"; International journal of research in pharmacy and chemistry, IJRPC 2011 , 1 (3), 498-5.11.の論文に記載されている。

本発明のニオソーム分散液／溶液は好ましくは以下に記載される成分の量を含み、ニオソーム分散液／溶液の総重量に対する重量パーセント（％ｗ／ｗ）として表される。

カンナビジオールは、１０％ｗ／ｗまでの量でニオソーム分散液／溶液中に含まれる。好ましくは、カンナビジオールは、１％～８％ｗ／ｗの範囲、より好ましくは２％～７％ｗ／ｗの範囲、さらにより好ましくは３％～６％ｗ／ｗの範囲の量で存在する。有利には、カンナビジオールの量は４％～５％ｗ／ｗの範囲である。

分散液／ニオソーム溶液は、４０％～９０％ｗ／ｗの範囲、好ましくは５０％～８０％ｗ／ｗの範囲の量でポリグリセロールエステルを含む。

ニオソーム分散液／溶液に含まれるβ－グルカンの量は、１％～５％ｗ／ｗ、好ましくは１％～３％ｗ／ｗの範囲である。

ニオソーム分散液／溶液に含まれるグリコールの量は、０．１％～５％ｗ／ｗ、好ましくは０．５％～３％ｗ／ｗの範囲である。

得られたニオソーム分散液／溶液は、１０％～４０％ｗ／ｗ、好ましくは２０％～３０％ｗ／ｗの量の水を含む。

ニオソーム分散液／溶液は、例えば安定化剤及び保存剤などの他の成分を、１％ｗ／ｗまでの量で含んでもよい。

本発明の局所用組成物は、液体又は半固体であってもよい。

特に、本発明の局所用組成物は、皮膚、上皮及び粘膜に適用するための化粧品組成物及び／又は医療デバイス及び／又は医薬製剤である。

本発明の局所用組成物は、有利には、水性ニオソーム組成物が局所用組成物の総重量に対して０．５重量％～１０重量％、好ましくは１重量％～５重量％の量で分散されている液体又は半固体組成物を含む。

本発明の液体組成物は、広い粘度のバリエーションを有する、溶液、エマルジョン、マイクロエマルジョン、ローション、ゲル、フォーム、ミルク、ミセル水、油、テンシオライト又は懸濁液を含む。

液体組成物は、例えば、水溶液、含水アルコール溶液、油性溶液、油相の水相中への分散によって得られるエマルジョン（水中油滴型）、又はその逆に水相の油相中への分散によって得られるエマルジョン（油中水滴型）、並びに、固体粒子からなる分散相の、特定の粘度の水性又は油性液体によって一般に表される分散媒体中への分散によって得られる懸濁液、を含む。

本発明の半固体組成物は、クリーム、ゲル、バーム、軟膏、ペースト、クリームゲル、スティック、及びワックスを含む。

加えて、本発明の局所用組成物は、化粧品及び／又は医療デバイス及び／又は医薬製剤の調製に有用な、当業者に既知の様々な局所的に許容可能な添加剤又はビヒクル、例えば、乳化剤、保湿剤、溶媒、軟化剤、安定化剤、増粘剤、保存剤、滑沢剤、金属イオン封鎖剤又はキレート剤、充填剤、粉末、芳香剤、香料、吸収剤、着色剤及び乳白剤、酸化防止剤、ビタミン、天然抽出物、多糖類、シールド物質、ＵＶフィルター、精油、ケラチン活性物質、及びアミノ酸を含んでいてもよい。

適切な溶媒添加剤は、例えば、水、アルコール、ケトン（アセトン及びメチルイソブチルケトンなど）、グリコール（エチレングリコール、プロピレングリコール及びブチレングリコールなど）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ－４０、ＰＥＧ－５０、ＰＥＧ－６０など）、酢酸アルキル（酢酸アミル、酢酸イソプロピル、酢酸ブチルなど）、パラフィン及びイソパラフィン、シクロアルキル（シクロヘキサンなど）、グリセリン、天然及び合成油、天然及び合成トリグリセリド、精油を含む。

有利には、本発明の局所用組成物は水性組成物である。

水性組成物において、水は組成物の主成分を表し、組成物全体の重量に対して９９重量％までの量にさえ達する。水性組成物は、好ましくは全組成物の重量に対して２５重量％～９９重量％、好ましくは３５重量％～９５重量％、より好ましくは５０重量％～９０重量％の範囲の量の水を含有する。

本発明の水性組成物は、好ましくは全組成物の重量に対して約０．１重量％～約６０重量％、より好ましくは１重量％～４０重量％、さらにより好ましくは５重量％～３５重量％の範囲の総量の非水性溶媒を含んでいてもよい。

適切な乳化性添加剤の例は、非イオン性、カチオン性、アニオン性、及び両性の界面活性剤、又はこれらの組合せである。本発明における有用な乳化剤の例は、ソルビタン、エトキシル化長鎖アルコール、アルキルポリグリコシド、石鹸、例えばセチルステアリル硫酸ナトリウムのような硫酸アルキル、モノアルキル及びジアルキルリン酸塩、アルキルスルホン酸塩、水素化ヒマシ油、アシルイソチオネート、スクロースエステル、ベタイン、レシチン、第四級アンモニウム塩、アルキルオレイン酸塩、例えばカプリロカプロイルポリオキシルグリセリドのようなグリセリド、及びオリーブ油からの乳化剤である。

好ましくは、本発明の組成物は、全組成物の重量に対して約０．１重量％～約６０重量％、より好ましくは０．５重量％～２５重量％、さらにより好ましくは０．５重量％～１０重量％の範囲の総量の乳化剤を含む。

本発明において有用な典型的な粘性添加剤は、例えば、キサンタンガム、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、カルボポール、カラギーナン、ポリオキサマー、及びアカシアガムである。

有利には、本発明の組成物は、全組成物の重量に対して約０．１重量％～約２５重量％、より好ましくは０．５重量％～１０重量％、さらにより好ましくは０．５重量％～５重量％の範囲の総量の増粘剤を含む。

本発明において有用な保湿作用を有する添加剤の例は例えば、尿素、アラントイン、ヒアルロン酸及びその誘導体、グリセリン、アミノ酸、アセチルモノエタノールアミド、ブトキシプロパノール、ブチルグリコール、低分子量ポリエチレングリコール（例えば、ＰＥＧ－４０、ＰＥＧ－５０、ＰＥＧ－６０）、アロエ、マロー、トレハロース及びソルビトールである。

好ましくは、本発明の組成物は、全組成物の重量に対して約０．０５重量％～約２５重量％、より好ましくは０．５重量％～１０重量％、さらにより好ましくは０．１重量％～５重量％の範囲の総量の保湿剤を含む。

本発明において有用な適切な軟化剤添加剤の例は、例えば、ラノリン、アーモンド油、オリーブ油、植物油、ホホバ油、アルガン油、硬化ヒマシ油、天然親油性抽出物、微結晶性ワックス、ポリジメチルシロキサン（ジメチコン）、ポリメチルフェニルシロキサン、グリコール及びシリコーンポリマー、鉱油、パラフィン、オゾケライト、セレシン、トリグリセリドエステル、アセチル化モノグリセリド、エトキシル化グリセリド、脂肪酸のアルキルエステル、脂肪酸、脂肪酸、長鎖アルコール、ステロール、蜜蝋、多価アルコール、ポリエステル、及び脂肪酸アミドが挙げられる。

好ましくは、本発明の組成物は、全組成物の重量に対して約０．１重量％～約２５重量％、より好ましくは０．５重量％～１０重量％、さらにより好ましくは０．５重量％～５重量％の範囲の総量の軟化剤を含む。

本発明における有用な芳香剤の例は例えば、レモン油、ベルガモット油、ラベンダー油、リモネン、リナロールなどの天然精油又は精油の画分若しくは濃縮物である。好ましくは、本発明の組成物は、約０．００１％～約０．１％の範囲の総量の芳香剤を含む。

本発明において有用な適切な防腐性添加剤の例としては、例えば、例えばエタノール、フェノキシエタノール及びベンジルアルコールのようなアルコール、パラヒドロキシ安息香酸メチル及びプロピル、ブチル化ヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、ソルビン酸塩、尿素誘導体、及びイソチアゾリノン、例えば、アスコルビン酸及び誘導体、トコフェロール及び誘導体、ポリフェノールのような天然防腐剤、を含む。本発明の局所用組成物に使用することができる染料のさらなる例は、２００９年１１月３０日の規則（ＥＣ）第１２２３／２００９号のＡｎｎｅｘ Ｖに見出すことができる。

好ましくは、本発明の組成物は、全組成物の重量に対して、約０．０１％～約２．００％、より好ましくは０．０５％～１．００％、さらにより好ましくは０．１重量％～０．５重量％の範囲の総量の防腐剤を含む。

本発明において有用な金属イオン封鎖剤又はキレート添加剤の例は、ＥＤＴＡ、ＨＥＤＴＡ、シュウ酸アルキル、シュウ酸リチウム又はシュウ酸カリウム、ピロリン酸ナトリウム又はピロリン酸カリウムである。好ましくは、本発明の組成物は、全組成物の重量に対して約０．０１重量％～約２０重量％、より好ましくは０．０５重量％～１０重量％、さらにより好ましくは０．１重量％～５重量％の範囲の総量の金属イオン封鎖剤又はキレート添加剤を含む。

本発明において有用な適切な安定化添加剤の例は、長鎖アルコール（例えば、セチルアルコール、ステアリルアルコール）及びそれらの混合物、高分子量ポリエチレングリコール（例えば、ＰＥＧ－９０００及びＰＥＧ １４０００）及びポリビニルピロリドン（例えば、ポビドン）である。

好ましくは、本発明の組成物は、全組成物の重量に対して約０．１重量％～約２５重量％、より好ましくは０．５重量％～１５重量％、さらにより好ましくは１重量％～１０重量％の範囲の総量の安定化剤を含む。

本発明において有用な適切な粉末添加剤の例は、ジメチコン／ビニルジメチコンクロスポリマー（ＤＣ ９５０６、Dow-Corning）、シクロメチコン及びジメチコンクロスポリマーの混合物（ＤＣ ９０４０、Dow-Corning)、ジメチコン及びビニルジメチコンのシリカ処理クロスポリマー（ＤＣ ９７０１、Dow Corning)、シクロメチコン及びジメチコン／ビニルジメチコンのクロスポリマーの混合物（ＳＦＥ ８３９、GE Bayer Silicones)などのエラストマーシリコーンである。

好ましくは、本発明の組成物は、全組成物の重量に対して約０．１重量％～約５重量％、より好ましくは０．２重量％～１重量％の範囲の総量の粉末添加剤を含む。

本発明において有用な乳白剤の例は、酸化亜鉛又は酸化アルミニウム、二酸化チタン又は二酸化亜鉛、アルミナ、雲母、アルミニウムとの脂肪酸塩、及び石膏である。

本発明において好ましく使用される染料の例は皮膚を汚さず、残留物を残さない容易に洗浄可能な水溶性染料であり、例えば、アシッドブルー３ Ｃ．Ｉ．４２０５１、アシッドブルー９ Ｃ．Ｉ．４２０９０、アシッドブルー７４ Ｃ．Ｉ．７３０１５、ピグメントブルー１５ Ｃ．Ｉ．７４１６０、アシッドイエロー３ Ｃ．Ｉ．４７００５、フードイエロー３ Ｃ．Ｉ．１５９８５、 アシッドイエロー２３ Ｃ．Ｉ．１９１４０、アシッドイエロー７３ Ｃ．Ｉ．４５３５０、アシッドレッド１４ Ｃ．Ｉ．１４７２０、アシッドレッド１８ Ｃ．Ｉ．１６２５５、アシッドレッド２７ Ｃ．Ｉ．１６１８５、アシッドレッド５１ Ｃ．Ｉ．４５４３０、アシッドグリーン１ Ｃ．Ｉ．１００２０、アシッドグリーン２５ Ｃ．Ｉ．６１５７０、及びそれらの混合物である。本発明の局所用組成物に使用することができる染料のさらなる例は、２００９年１１月３０日の規則（ＥＣ）第１２２３／２００９号のＡｎｎｅｘ ＩＶに見出すことができる。

好ましくは、本発明の組成物は、全組成物の重量に対して約０．０１重量％～約１５重量％、より好ましくは０．０５重量％～５重量％の範囲の総量の乳白剤及び着色剤を含む。

好ましくは、本発明の組成物は、紫外線放射の作用から皮膚をシールドすることができるＵＶフィルターを含むことができる。ＵＶフィルターの例は、例えば、２－エチルヘキシル２－シアノ－３，３－ジフェニルアクリレート（ＰＡＲＳＯＬ ３４０）及びエチル２－シアノ－３，３－ジフェニルアクリレートなどのアクリレート、カンファー４－メチルベンジリデン（ＰＡＲＳＯＬ ５０００）及びカンファー３－ベンジリデンなどのカンファー誘導体、オクチルメトキシシンナメート（ＰＡＲＳＯＬ ＭＣＸ）、エトキシエチルメトキシシンナメート、ジエタノールアミンメトキシシンナメート（ＰＡＲＳＯＬ Ｈｙｄｒｏ）などのシンナメート、エチルヘキシルトリアゾン（ＵＶＩＮＵＬ Ｔ－１５０）、ジエチルヘキシルブタミドトリアゾン（ＵＶＡＳＯＲＢ ＨＥＢ）などのトリアゾン誘導体、４－ｔｅｒｔ－ブチル－４’－メトキシジベンゾイルメタン（ＰＡＲＳＯＬ １７８９）、ジメトキシジベンゾイルメタンなどのジベンゾイルメタン誘導体、２，２’－メチレン－ビス－（６－（２Ｈ－ベンゾトリアゾール－２－イル）－４－（１，１，３，－テトラメチルブチル）－フェノール（ＴＩＮＯＳＯＲＢ Ｍ）などのベンゾトリアゾール誘導体、ビス－エチルヘキシルオキシフェノールメトキシフェニルトリアジン（ＴＩＮＯＳＯＲＢ Ｓ）などのトリアジン誘導体、である。本発明の局所用組成物に使用することができるＵＶフィルターの他の例は、２００９年１１月３０日の規則（ＥＣ）第１２２３／２００９号のＡｎｎｅｘ ＶＩに見出すことができる。

好ましくは、本発明の組成物は、全組成物の重量に対して約０．１重量％～約２０重量％、より好ましくは０．５重量％～１５重量％の範囲の総量のＵＶフィルターを含む。

以下の実験部分は本発明の少なくとも１つの実施形態を例示するが、本説明に添付される特許請求の範囲に定義される保護の範囲を何ら限定するものではない。

［実施例１－ニオソームの調製］
カンナビジオール（ＣＢＤ）を含むニオソーム分散液（ＣＢＤ－Ｓ５）を、以下の表１に示す組成で調製した。得られた組成物は、均一な淡黄色の粘性ゲルの外観を有していた。全組成物の重量に対する重量パーセントは、各成分について表される。

［実施例２］
実施例１のニオソーム分散液（ＣＢＤ‐Ｓ５）のベシクル形態を、ネガティブ染色法を用いてＴＥＭ透過型電子顕微鏡(JEM-1200EX, JEOL Co., Tokyo, Japan)で検討した。

ＣＢＤ－Ｓ５分散液の小さなアリコート（５．０ｍｌ）を、４℃で、約８００００×ｇを発揮可能な速度で３０分間遠心分離した。ペレットを乾燥させ、次いで１％酢酸ウラニル溶液で希釈した。炭素被覆電子顕微鏡スクリーンにロードするために、懸濁液の滴が直接用いられた。過剰の試料を、普通ろ紙を用いて吸収することによって除去した。このように調製したスクリーンを３０℃で１０分間インキュベートして完全に乾燥させ、８０ｋＶでＴＥＭにより観察した。観察されたベシクルの顕微鏡写真を図１に示す。番号付けされたベシクルは、以下の表２に示す直径を有していた。

透過型電子顕微鏡による微細構造分析は、平均サイズが約２００ｎｍの回転楕円体ベシクル構造の存在を示した。

図２は、Brookhaven 90Plus-Particle Size Analyzerを用いて同じＣＢＤ－Ｓ５の試料を分析することによって得られた動的光散乱（ＤＬＳ）グラフを示す。測定により、平均直径が１９０．４ｎｍであり、多分散インデックスが０．１３７であることを確認した。

［実施例３］
弾性は、ニオソームの最も重要な特徴の１つである。弾性は、押出測定によって推定される。実施例１のニオソーム分散液（ＣＢＤ－Ｓ５）のベシクルを、一定圧力下で１００ｎｍの孔径を有するポリカーボネートフィルターを通して押し出した。弾性率は、以下の式を用いて算出される変形性インデックス（Ｄ）で表される。
Ｄ＝Ｊ×（ｒｖ／ｒｐ）２
式中、Ｊは５分間で押し出された懸濁液の割合であり、ｒｖはＤＬＳによって測定されたフィルターを通過した後のベシクルのサイズであり、ｒｐはフィルターの孔径である。

良好な変形性は、変形性インデックスが８０より大きいときに示される。試験は、Avestin LiposoFast instrumentを用いて、Brookhaven 90Plus-Particle Size Analyzerで粒子を測定することによって行われた。

結果は、１４１ｎｍのｒｖベシクルサイズで、８７％の５分間押出懸濁液比（Ｊ）を示した。したがって、変形性インデックス（Ｄ）は１７２．９６であり、ニオソームの優れた変形性が確認され、これは、皮膚、上皮及び皮膚付属器官を貫通する優れた能力を予測する特徴である。弾性及び変形能の特性は皮膚及び皮膚付属器官の表層との相互作用に必須であり、化学的相互作用を介するものだけではない吸収及び透過を促進する。

［実施例４］
実施例１からのニオソーム分散ベシクル（ＣＢＤ－Ｓ５）及びＭＣＴ中のカンナビジオールの５％溶液（ＣＢＤ－５％）を、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を陰性対照として使用して、人工膜を通して拡散する能力について評価した。比較のために使用される中鎖トリグリセリド油（ＭＣＴ）は、局所使用についてさえ、最も一般的なカンナビジオール可溶化システムに含まれる。

アッセイは、フランツセルを用いた、膜貫通拡散試験に使用されるＳｔｒａｔ－Ｍ（登録商標）人工膜（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を通るカンナビジオールの拡散評価を含んでいた。これは、様々なタイプの化合物及び製剤のヒト表皮における拡散をシミュレートする。

人工Ｓｔｒａｔ－Ｍ（登録商標）膜は、表面上に配置された２層のポリエーテルスルホン（ＰＥＳ、より拡散抵抗性）及びポリオレフィンの層（より拡散性）からなる。これらのポリマー層は、拡散勾配を有する多孔質構造を作り出す。加えて、この多孔質構造には、合成脂質の混合物を含浸させており、皮膚様の特性を与える。

拡散セルは、ドナーチャンバとレセプターチャンバとからなり、これらの間に膜が配置される。レセプターチャンバ内には、５％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含むリン酸緩衝液及び十分な溶液の混合のための磁石が存在する。試料塗布可能面積は０．２ｃｍ^２である。

ＣＢＤ－Ｓ５及びＣＢＤ－５％試料を、高密度液用の特別なGilson P100ポジティブディスプレイスメント式ピペットを使用して、膜に塗布した（１ｇ／ｃｍ^２）。陰性対照は、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）のみで処理した膜であった。

試料及び対照を３２℃、５％ＣＯ_２でインキュベートし、曝露を１６、２４及び４８時間行った。試料は三重に試験された。異なる曝露時間において、レセプター流体の一部をシリンジで抜き取った。このようにして回収された試料を直ちに－２０℃で凍結し、続いて定量的クロマトグラフィ分析のために解凍した。

各評価時において膜の下に拡散していた量のアリコートを、０．３％リン酸（ｖ／ｖ）で酸性化したメタノール溶液で希釈した。下清を、以下の分析条件を用いて、WATERS 2695装置を用いてＨＰＬＣ－ＤＡＤによって分析した。
波長：２１２ｎｍ
注入量：１０μｌ
カラム：Eclipse XDB-C18 3.5pm 3,0x150mm
カラム温度：３５℃
流速：０．６ｍｌ／ｍｉｎ
移動相Ａ：Ｈ_２Ｏ ｍｉｌｌｉＱ中０．３％Ｈ_３ＰＯ_４
移動相Ｂ：ＡＣＮ中０．３％Ｈ_３ＰＯ_４
勾配：表３の通り

結果を以下の表４にまとめる。

表４の結果は、ＣＢＤ－５％試料と比較して、本発明のＣＢＤ－Ｓ５試料のカンナビジオール拡散の有意な増加を実証した。

試験の結果から、皮膚への活性成分の透過及び放出能力の向上を予測することができる。

［実施例５］
実施例１のニオソーム分散液（ＣＢＤ－Ｓ５）の刺激能力を、再構成された表皮におけるインビトロ試験及び２０の対象群におけるインビボ試験によって評価した。

局所製品及び化粧品が刺激物であるかどうかを決定することは、正しく安全に使用するための手順を確立するための重要な評価である。

Ａ．インビトロ試験
インビトロ試験は、再構成ヒト表皮（ＲＨＥ）への被験物質の局所曝露と、それに続く細胞生存性試験からなる。

細胞生存率は、ＭＴＴ(３－（４，５－ジメチルチアゾール－２－イル）－２，５－ジフェニルテトラゾリウムブロミド）のホルマザンブルー塩への変換によって決定され、これは組織からの抽出後に定量的に測定される。変換は生細胞においてのみ活性を有するミトコンドリア酵素コハク酸デヒドロゲナーゼを介して起こり、これはＭＴＴのテトラゾール環を開環させてホルマザンを形成させる。陰性対照（ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水－ＤＰＢＳで処理）及び陽性対照（ドデシル硫酸ナトリウム－ＳＤＳで処理）と比較した、被験物質に曝露した組織の生存率の評価が、皮膚刺激性を予測するために用いられる。

再構成されたヒト表皮モデルは、高度に分化した多層ヒト表皮を再形成するために培養された正常ヒト由来表皮ケラチノサイトからなる。これは、基底層、有棘層、及び顆粒層、並びにインビボで存在するものと同様に配列された細胞間ラメラ脂質層を含有する多層の角質層からなる。

再構成された皮膚試料は、０．６３ｃｍ^２の領域を覆っている。試験は三重に実施される。各試料は２５μｇのＣＢＤ－Ｓ５で処理される。並行して、陽性対照（ＰＣ）試験は３０μＬの５％ＳＤＳ溶液を皮膚試料に塗布することによって、陰性対照（ＮＣ）試験は３０μＬのＤＰＢＳを皮膚試料に塗布することによって、実施される。処理には６０分を要し、次いで試料は試験物質を除去するためにを洗浄され、ＭＴＴアッセイを行う前に２４時間インキュベートする。

ＭＴＴアッセイは、ＭＴＴ溶液（１ｍｇ／ｍｌ）を含む２４ウェルプレートに試料を移すことによって行われる。細胞ミトコンドリアによって生産されたブルーホルマザン塩は、試料当たり２．０ｍｌのイソプロパノールで抽出される。

抽出されたホルマザンの光学濃度は、pQUANT BIO TEK Microplate Spectrophotometerを用いて、５７０ｎｍの波長で分光測定により決定される。相対細胞生存率は、各組織について、陰性対照組織についての平均光学濃度に対する％として算出される。結果を以下の表５及び図３にまとめる。

したがって、実施例１からのニオソーム分散液（ＣＢＤ－Ｓ５）は、非刺激性であることが見出された。

Ｂ．インビボ試験
インビボ試験は、フィンチャンバ（２０マイクロリットル容量のセル）を使用して、実施例１からのニオソーム分散液（ＣＢＤ－Ｓ５）を、選択された対象の背中及び／又は前腕に塗布することからなった。製品の刺激性は、３回の別々の時点において試験することによって評価された。即時皮膚刺激性は、６０分間（Ｔ１）製品を塗布することによって評価された。皮膚刺激性は、４８時間生成物を塗布することにより（Ｔ２）、及び製品の除去後２４時間において（Ｔ３）、評価された。評価は以下の表６に記載されるように、４つの刺激のレベルに分けられた。

以下の表７は、試験終了時おける、調査された対象について得られた結果をまとめたものである。

インビボ試験は、実施例１のニオソーム分散液（ＣＢＤ－Ｓ５）の非刺激性を確認した。

［実施例６－抗微生物抵抗性試験（チャレンジ試験）］
試験は、適切な微生物の特定された接種材料を用いて調製物の「チャレンジ」を行うこと、接種された調製物を所定の温度に放置すること、及び特定の時間間隔において容器から試料を取り出すこと、及び採取された試料中に存在する生物の数を計数することからなる。

試験はイタリア薬局方－第ＩＸ版及び同等の欧州薬局方５．１．３の勧告に従い、以下の微生物株の細菌培養物を用いて実施した。
・Pseudomonas aeruginosa ＡＴＣＣ ９０２７
・Escherichia coli ＡＴＣＣ ８７３９
・Staphylococcus aureus ＡＴＣＣ ６５３８
・Candida albicans ＡＴＣＣ １０２３１
・Aspergillus brasiliensis ＡＴＣＣ １６４０４

実施例１のニオソーム分散液（ＣＢＤ－Ｓ５）には、１０^５～１０^６の個数の細菌を含む接種材料及び１０^４～１０^５の個数の真菌又は酵母を含む接種材料を用いて、様々な微生物が接種された。接種された製品は、光を避けて室温（２０～２５℃）で保存された。製品の試料は、存在する微生物の個数を決定するために、時刻ｔ０（基礎値）において、及び２（ｔ２）、７（ｔ７）、１４（ｔ１４）、及び２８（ｔ２８）日の間隔で採取された。

結果を以下の表８にまとめる。ここでは、様々な観察時間における、対数ベースで表現された、各微生物について見出された値が示されている。データは、１ｇの製品に対するコロニー形成単位（ｃｆｕ）を表す。

得られた結果に基づいいて、実施例１のニオソーム分散液（ＣＢＤ－Ｓ５）はチャレンジ試験に合格し、接種の７日以内において接種された細菌の９９．９％の減少、及びカビ若しくは真菌の９０％の減少、並びにその後の期間におけるさらなる減少を与えるという、許容基準(CTFA M-3 and M4, ISO 11930:2012, and Ph Eu 5.3.1 )に従う全ての微生物に対する阻害活性を示した。

［実施例７－加速劣化による安定性試験］
実施例１のニオソーム分散液（ＣＢＤ－Ｓ５）を、異なる条件下での一連の安定性及び加速劣化試験に供した。
（Ａ）室温（２５℃）、光に９０日間曝露
（Ｂ）４０℃９０日間
（Ｃ）４℃９０日間
（Ｄ）熱衝撃：４℃で１５日、４０℃で１５日（３サイクル）

関心のあるパラメータ（外観、色、ｐＨ、密度）は、計９０日間、隔週でモニターされた。

結果を以下の表９にまとめる。

様々なストレス条件下での９０日間の加速劣化後に、製品パラメータ、特にニオソームベシクルの安定性の指標としての密度は、黄色から赤色に変化した色を除いて、有意に変化しなかった。この変化は、熱及び光に対するカンナビジオールの既知の不安定性に起因する。ニオソーム調製物のための保管条件は、光及び空気に対して不透過性である包装と、室温に維持することを含む。

［実施例８－微粒子抵抗性及び細胞生存性試験］
この試験は、実施例１のニオソーム分散液（ＣＢＤ－Ｓ５）で保護されている又は保護されていない再構成ヒト表皮（ＲＨＥ）組織を、周囲の微粒子汚染を表現するように選択された２．５μｍ未満の空気動力学的径を有する微粒子試料（ＰＭ２．５）で処理することを含む。並行して、再構成されたヒト表皮組織を、ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（ＤＰＢＳ－陰性対照ＮＣ）、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ－陽性対照ＰＣ）、及び実施例１からのニオソーム分散液（ＣＢＤ－Ｓ５）単独で処理した。

具体的には、（１）３０μｌ ＤＰＢＳ（ＮＣ）、（２）３０μｌ ＳＤＳ５％（ＰＣ）、（３）３０μｌ ＰＢＳに溶解した２０μｇ ＰＭ２．５、（４）３０μｌ ＣＢＤ－Ｓ５、及び（５）２０μｇ ＰＭ２．５を有する３０μｌ ＣＢＤ－Ｓ５で処理したＲＨＥ(EpiDerm^TM EPI-200, MakTek Corporation)を、自身の培養培地（EpiDerm^TM EPI-100-NMM, MakTek Corporation）中に含むウェルを、三重にセットアップした。

５％ＣＯ_２に制御された雰囲気中、３７℃で２４時間インキュベートした後、実施例５Ａに記載されるように、ＲＨＥ試料の細胞生存率がＭＴＴアッセイにより評価され、一方で培地が回収され、ＥＭＩＬ１ＡＬＰＨＡキット(Invitrogen-Thermo Scientific)を用いて、ＥＬＩＳＡアッセイにより以下の手順でＩＬ－１α放出について分析された。

各処理からの１００μｌの培地が、抗ヒトＩＬ－１αでコーティングしたウェルに移され、室温で２時間インキュベートされた。インキュベーションの最後に、培地が除去され、ウェルを1X Wash Bufferで４回洗浄された。ビオチン化抗体１００μＬが各ウェルに添加され、室温で１時間インキュベートされた。最後に、ウェルが1X Wash Bufferで４回洗浄され、１００μｌのストレプトアビジン－ＨＲＰ溶液で４５分間室温で処理され、最後に1X Wash Bufferで４回洗浄された。１００μｌのＴＭＢ基質が各ウェルに添加され、暗所で１０分間インキュベートされた。最後に、各ウェルにストップ溶液１００μｌが加えられ、pQUANT BIO TEK Microplate Spectrophotometer装置を用いて４５０ｎｍ及び５５０ｎｍの波長で分光測定値が取得された。

各処理後にＲＨＥ組織から放出されたＩＬ－１αレベルの変化を、対照として使用した未処理のＲＨＥ（ＮＣ）（１００％）と比較した％値として表した。以下の表１０は試験の結果をまとめたものであり、これは図４及び５にも示されている。

インビトロＭＴＴ試験は、ＰＭ２．５が細胞生存率を２８．５１％に低下させる一方、ＣＢＤ－Ｓ５との共処理はＰＭ２．５の毒性作用に対して再構成ヒト表皮（ＲＨＥ）を保護することを示した。このデータは、ＣＢＤ－Ｓ５が細胞生存率を２８．５％から７１．２５％に増加させることができたことを示した。同時に、ＣＢＤ－Ｓ５のみの試験の結果は驚くべきことに、１１０．８６％までの、コントロールを超える細胞生存率の増加を示し、このように驚くべき再生活性を示した。この増加は、多糖β－グルカンの存在によってもたらされる再生作用によるものであり得ると考えられる。

ＥＬＩＳＡアッセイは、（ｉ）２０μｇ／ウェルの濃度のＰＭ２．５がＩＬ－１α放出の増加を誘導し、（ｉｉ）ＣＢＤ－Ｓ５による処理が未処理及び２０μｇ／ウェルのＰＭ２．５処理の双方の組織におけるＩＬ－１α放出を減少させることができたことを示した。ここでも、ＣＢＤ－Ｓ５単独で処理された試料において、ＩＬ－１α放出の驚くべき減少が観察され、このように有意な抗炎症活性が示された。

［実施例９－鎮静作用のインビトロ評価］
多層インビトロ皮膚細胞モデルを用いて、皮膚細胞の保護及びラウリル硫酸ナトリウム（ＳＬＳ）のような中程度の刺激剤によって引き起こされる鎮静反応の阻害における試料の作用を定量的に評価した。

ＳＬＳによって誘導されるＩＬ－１αサイトカイン放出の阻害が、試験物質への曝露後、及び皮膚の未処理試料に関して、（特異的ＥＬＩＳＡアッセイを通して）調べられた。
細胞生存率はＭＴＴアッセイによって決定された。

両方のアッセイは、統合された三次元細胞培養モデルとして成長し、インビトロでヒト皮膚を完全に模倣する、正常なヒト表皮ケラチノサイトを含む再構成された人工ヒト皮膚モデルを使用した。このモデルは、正常なバリア機能（高分化角質層の存在）を示す。このモデルは、Episkin (Lion, Batch 20-RHE-041)によって供給された。

表皮は、ＩＬ－１αの合成及び放出を誘導するために、０．３０％のＳＬＳで７０分間処理された。その後、実施例１のニオソーム分散液（ＣＢＤ－Ｓ５）（滅菌水中２％に希釈）４０μｌが２つの表皮に塗布され、３７℃、５％ＣＯ_２で２４時間曝露した。陰性対照として、２つの表皮ユニットがリン酸緩衝液で処理され、一方で、ＳＬＳ０．３０％で７０分間処理された表皮ユニットが陽性対照として使用された。試験は、二重の反復で行われた。

曝露期間の最後に、試料はリン酸緩衝液洗浄（ＰＢＳ）によって除去され、細胞生存を評価するためにＭＴＴアッセイが行われた。

表皮ユニットは１ｍｇ／ｍｌのＭＴＴ溶液（３－［４，５－ジメチルチアゾール－２－イル］－２，５－ジフェニルテトラゾリウムブロミド）で３７℃で３時間処理された。
次いで、溶液が除去され、イソプロパノールで置換され、室温でさらに２時間インキュベートした。各試料の２つのアリコートが、読み取りのために９６ウェルプレートに移された。マイクロプレートリーダーを備えた比色計(Tecan model Infinite F200)を用いて、５７０ｎｍの波長で吸光度（ＯＤ）が読み取られた。

結果は、以下の式を用いて得られた、細胞生存率パーセント及び％相対保護で表された。
％細胞生存率（ｃｖ）＝［ＯＤ_５７０ＴＳ／ＯＤ_５７０ＮＣ］×１００
％相対保護＝（％ｃｖＴＳ－％ｃｖＰＣ）／（％ｃｖＮＣ－％ｃｖＰＣ）

結果を以下の表６にまとめる。

ＩＬ－１αアッセイのために、培養培地を６時間及び２４時間において回収した。陰性対照として、ＰＢＳで処理されたユニットの培養培地が使用され、一方、ＳＬＳ０．３０％で処理された２ユニットの培養培地が陽性対照として使用された。直接ＥＬＩＳＡ試験（酵素結合免疫吸着アッセイ）を用いて、処理された表皮及び処理されていない表皮の培地中のＩＬ－１αが決定された。比色シグナルは、培地中のサイトカインの量に正比例した。試料は４５０ｎｍで読み取られた。感度限界は１０ｐｇ／ｍｌ未満であった。

サイトカイン濃度は、標準曲線を用いて決定された。結果は、以下の式で得られた、ＩＬ－１αの放出阻害パーセントによって表された。
％ＩＬ－１α阻害＝１００－（ｐｇ／ｍｌ ＩＬ－１α放出テスト試料 ／ ｐｇ／ｍｌ ＩＬ－１α陽性対照）＊１００

結果を以下の表７にまとめる。

表６及び７にまとめたデータは、ＣＢＤ－Ｓ５が皮膚細胞を保護し、ＩＬ－１αの放出を阻害することができたことを示し、したがってインビトロの鎮静活性を示すことを実証した。

［実施例１０－毛球細胞における有糸分裂］
このアッセイの目的は、飢餓後の細胞生存率アッセイ（ＭＴＴ）による、ヒト毛髪真皮乳頭線維芽細胞における細胞周期の刺激及び総タンパク質合成に対するＣＢＤ－Ｓ５の作用、並びに毒性水準下での連続投与における異なる曝露時間での総タンパク質抽出及び定量化を、定量的に評価することであった。組成物が細胞増殖及びタンパク質合成を増加させることができる場合、これは、濾胞成長の刺激及び組織再生の初期相における役割を示唆する。

この試験は、線維芽細胞様の形態を有するヒト毛髪真皮乳頭細胞（ＨＨＤＰＣ）に対して行われる。

細胞は、１０％ＦＢＳ及び抗生物質を含有するＭＥＭ中で培養される。細胞は２４ウェルプレートに播種され、３７℃及び５％ＣＯ_２で２４時間増殖させられた。細胞は、処理前に無血清培地中で６時間飢餓状態にされた。次いで、血清を含まず、実施例１のニオソーム分散液（ＣＢＤ－Ｓ５）の連続希釈物（０．００６及び０．００３ｍｇ／ｍｌ）が追加された新鮮な培地が、細胞に添加された。ニオソーム分散液は培地培養物に直接溶解された。試験は、三重の反復で実施された。

２４時間及び４８時間の曝露後、細胞生存率及び細胞タンパク質総量が別々のプレート上で評価された。未処理細胞は陰性対照（ＮＣ）として用いられ、ヒトインスリンで処理した細胞が陽性対照（ＰＣ）として使用された。

細胞生存率は、ＭＴＴ（３－［４，５－ジメチルチアゾール－２－イル］－２，５－ジフェニルテトラゾリウムブロミド）溶液と共に組織を２時間インキュベートすることによって評価された。次いで、沈殿したホルマザンがＤＭＳＯを用いて抽出され、分光測定により定量された。５７０ｎｍの吸光度（ＯＤ５７０）がマイクロプレートリーダー(Tecan, Infinite 200 PRO)で測定され、６５０ｎｍでのバックグラウンド（ＯＤ６５０）を差し引いた。

細胞生存率は、以下の式に従ってパーセンテージで表された。
％細胞生存率＝［（ＯＤ_５７０－ＯＤ_６５０）試験製品 ／ （ＯＤ_５７０－ＯＤ_６５０）ＮＣ］×１００

結果を以下の表８にまとめる。

細胞タンパク質総量は、Ｂｒａｄｆｏｒｄ法に従って試験された。処理終了時の細胞はＰＢＳで２回洗浄され、４℃で精製水での処理により溶解された。色素試薬が各試料に添加された。滴定された標準曲線が、２～１２μｇ／ｍｌの濃度範囲で設定された。２００μｌの各試料、対照、及び標準が、９６ウェルプレートに移された。プレートリーダーを備える比色計を用いて、５９５ｎｍで読取が行われた。

タンパク質を定量するために、アルブミンを用いた標準プロットが設計され、補間プロット式を用いて、試料濃度がそれらの吸光度値に基づいて決定された。各組のデータの平均値が算出され、各試料について、以下の式に従って、陰性対照（ＮＣ）との比較により、タンパク質合成の増加パーセントが決定された。
％タンパク質合成の増加＝（μｇ／ｍｌ タンパク質試料 ／ μｇ／ｍｌ ＮＣ）*１００

結果を以下の表９にまとめる。

表８及び９にまとめたデータは、ＣＢＤ－Ｓ５が４８時間の曝露期間後に、０．００３ｍｇ／ｍｌ濃度で、未処理の対照細胞培養物（陰性対照）と比較して、ヒト毛髪真皮乳頭線維芽細胞における細胞増殖及びタンパク質合成を刺激することができたことを実証した。

［実施例１１－抗かゆみ活性］
インビボでは、ＩｇＥによって媒介される好塩基球細胞の脱顆粒が、予め貯蔵された炎症性メディエーター（ヒスタミン、ロイコトリエン、トロンボキサン、好塩基性酵素、ヘキソサミニダーゼ）の迅速な放出によって特徴付けられる即時アレルギー反応を誘発し、発赤、発疹、かゆみ及び局所炎症反応を引き起こす。好塩基球細胞の脱顆粒を阻害する組成物の能力は、上記の症状、とりわけ主にかゆみを阻害するその能力の指標である。

試験は、ＩｇＥヒト受容体（ＦｃＲＩ）を発現する、トランスフェクトされたラット好塩基球細胞のセルライン(RBL-2H3 ATCC^(R) CRL-2256^TM)に対して行われる。細胞は、１０％ＦＣＳ及び２ｍＭグルタミンを含有するＲＰＭＩ中に保持される。

未処理細胞が、自然脱顆粒についての陰性対照として使用された。

抗ヒトＩｇＥ受容体抗体に曝露された細胞からなる陽性対照が、最大脱顆粒レベルを評価するために用いられた。

１％トリトン中の細胞溶解物もまた、分析された分子の可能な最大の放出を評価するために分析された。

好塩基球の脱顆粒に対する実施例１のニオソーム分散液（ＣＢＤ－Ｓ５）の作用を評価するために、試料が、ＩｇＥヒト受容体（ＦｃＲＩ）を発現するトランスフェクトされたラット好塩基球細胞（ＲＢＬ）のセルラインとプレインキュベートされた。

脱顆粒中のβ－ヘキソサミニダーゼの放出が、０．１Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ ６．２）中でｐ－ニトロフェニル－Ｎ－アセチル－ｐ－Ｄ－グルコサミン(Sigma-Aldrich)が添加され、３７℃で１２０分間インキュベートされたＲＢＬ－ＳＸ３８細胞上清においてモニターされた。反応は、０．１Ｍ炭酸緩衝液（ｐＨ１０）を用いて停止され、４０５ｎｍで吸光度が読み取られた（ＯＤ_４０５）。

未処理細胞の上清は陰性対照として使用された。ＲＢＬ－ＳＸ３８の最大刺激が、細胞単層の１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００溶解物において評価された。

陰性及び陽性対照並びにＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００溶解物の光学密度を以下の表１０に報告する。

実施例１のニオソーム分散液（ＣＢＤ－Ｓ５）は、以下の表１１に示すように、異なる濃度で細胞培養培地に可溶化された。

以下の表１１に示すように、連続希釈のヒアルロン酸ナトリウムも、好塩基球の脱顆粒阻害の対照として使用された。

４０５ｎｍで測定された光学濃度（ＯＤ_４０５）を以下の表１１に報告する。

ＩｇＥ受容体を有する活性化好塩基球の脱顆粒阻害パーセントは、以下の式で算出された。
％脱顆粒抑制＝１００－［（ＯＤ_４０５ＣＢＤ－Ｓ５＋ＰＣ － ＯＤ_４０５ＮＣ） ／ （ＯＤ_４０５ＰＣ － ＯＤ_４０５ＮＣ）］＊１００

以下の表１２に結果を示す。

ニオソーム分散液（ＣＢＤ－Ｓ５）は、用量依存的に好塩基球の脱顆粒を阻害することができた。最も高い作用は、試験された最も高い濃度で示された。自然脱顆粒に対する干渉は検出できなかった。

上記の結果は、ニオソーム分散液（ＣＢＤ－Ｓ５）が抗かゆみ活性を有することを実証した。

Claims (13)

1. ５００ｎｍ未満のサイズを有するニオソーム中のカンナビノイド、特にカンナビジオールを含む水性組成物と、少なくとも１つの局所的に許容可能な賦形剤とを含む局所用組成物であって、前記ニオソームが、（ｉ）直鎖飽和又はモノ不飽和脂肪酸でエステル化された少なくとも１つの直鎖又は分岐鎖ポリグリセロールと、（ｉｉ）少なくとも１つの多糖とを含むことを特徴とする、局所用組成物。
2. 前記カンナビノイド、特にカンナビジオールが、天然又は合成由来のものである、請求項１に記載の局所用組成物。
3. 前記多糖が、天然由来の多糖、好ましくはプルラン、グルカン、アルギネート、アミロース、グリコーゲン、及びイヌリンからなる群から選択される、請求項１に記載の局所用組成物。
4. 前記多糖が、α－グルカン及びβ－グルカン、好ましくはβ－グルカンからなる群から選択される、請求項１に記載の局所用組成物。
5. 前記直鎖又は分岐鎖ポリグリセロールが、トリグリセロール、テトラグリセロール、ヘキサグリセロール、オクタグリセロール、デカグリセロールからなる群から選択される、請求項１に記載の局所用組成物。
6. 前記直鎖飽和又はモノ不飽和脂肪酸が、４～３２個の炭素原子を有するモノカルボン酸からなる群から選択される、請求項１に記載の局所用組成物。
7. 前記直鎖飽和脂肪酸が、酪酸、吉草酸、カプロン酸、エナント酸、カプリル酸、ペラルゴン酸、カプリン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、マルガリン酸、ステアリン酸、アラキジン酸、ベヘン酸、リグノセリン酸、セロチン酸、モンタン酸、メリシン酸、及びラクセル酸からなる群から選択される、請求項１に記載の局所用組成物。
8. 前記直鎖モノ不飽和脂肪酸が、ミリストレイン酸、パルミトレイン酸、オレイン酸、ガドレイン酸、及びエルカ酸からなる群から選択される、請求項１に記載の局所用組成物。
9. 前記ニオソームが、（ｉｉｉ）４～１６個の炭素原子を有する少なくとも１つのグリコールを含む、請求項１に記載の局所用組成物。
10. ４～１６個の炭素原子を有する前記グリコールが、１，２－ブタンジオール、１，２－ペンタンジオール、１，２－ヘキサンジオール、１，２－ヘプタンジオール、１，２－オクタンジオール（カプリリルグリコール）、１，２－デカンジオール（カプリルグリコール）、１，２－ドデカンジオール（ラウリルグリコール）、及び１，２－ヘキサデカンジオールからなる群から選択される、請求項９に記載の局所用組成物。
11. ニオソームに組み込まれたカンナビジオールを含む水性組成物であって、前記ニオソームが、（ｉ）直鎖飽和又はモノ不飽和脂肪酸でエステル化された少なくとも１つの直鎖又は分岐鎖ポリグリセロールと、（ｉｉ）少なくとも１つの多糖と、任意選択で（ｉｉｉ）４～１６個の炭素原子を有する少なくとも１つのグリコールと、を含むことを特徴とする、水性組成物。
12. 前記組成物が水性の溶液又は分散液である、請求項１１に記載の組成物。
13. 手振とう技術又は超音波振とう技術の使用を含む、請求項１１又は１２に記載の水性組成物の製造方法。

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