CN105582541B - 聚乙二醇化的氧化石墨烯-卟啉二聚体盐复合物及其用途 - Google Patents
聚乙二醇化的氧化石墨烯-卟啉二聚体盐复合物及其用途 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及聚乙二醇化的氧化石墨烯‑卟啉二聚体盐复合物及其用途。具体地，本发明涉及新的光敏剂复合物以及其在制备用于光动力疗法的药物中的用途。更具体地，本发明涉及聚乙二醇化的氧化石墨烯与卟啉二聚体盐的复合物、其制备方法、包含其的药物组合物及其在制备用于荧光成像和光动力疗法的药物中用途。
Description
技术领域
本发明涉及新的光敏剂复合物及其在制备用于光动力疗法(photodynamictherapy,PDT)的药物中的用途。更具体地，本发明涉及聚乙二醇化的氧化石墨烯与卟啉二聚体盐的复合物、其制备方法、包含其的药物组合物及其在制备用于荧光成像和光动力疗法的药物中用途。
发明背景
光动力疗法是一种新型的治疗方式，其利用光敏剂的光动力效应，具有特殊的时空选择性和最小的侵入性，能够同时进行荧光成像和光动力学治疗。在特定波长的激发下，光敏剂从激发态回到基态的过程中会发射荧光，这种荧光可以用于进行荧光成像，从而可以用于疾病的光学诊断、进行活体光敏剂运输和体内分布的可视化以及用于进行荧光指导下的PDT。同时，光敏剂能够将吸收的光能转移给周围的氧分子，产生活性氧，包括单线态氧和自由基，从而杀死肿瘤细胞。
大部分光敏剂由于皮肤光毒性强、水溶性差和在非肿瘤部位的聚集性，使得其在PDT中的应用受到限制。为了改善光敏剂分子的水溶性、增加其在肿瘤细胞或组织中的聚集，相关领域的技术人员已经进行了多种探索。例如，已经报道了各种各样的纳米载体进行光敏剂的体内输送，如脂质体、聚合物、硅纳米颗粒、磁性纳米粒子、金纳米粒子、碳纳米材料等。尽管这些纳米载体能够通过实体瘤的高通透性和滞留效应(enhanced permeabilityand retention effect,EPR效应)提高光敏剂在肿瘤部位的聚集效率，但是光敏剂的荧光也会被这些载体不同程度的淬灭。
例如，在众多的纳米级载体中，氧化石墨烯(graphene oxide,GO)具有独特的优势，如表面积大、水溶性好、具有丰富的表面活性官能团(例如，环氧基、羟基、羧基)、易于表面修饰，从而在生物检测、生物成像、药物或基因运输中得到了广泛的应用。GO的荧光能量共振转移性能使其在纳米检测器中具有巨大的作为许多荧光单位(包括小分子荧光染料、量子点和共轭聚合物等)的荧光淬灭剂的潜能。大量研究表明氧化石墨烯与光敏剂通过π-π堆积(π-π stacking)作用连接之后可以作为光敏剂的有效载体，增加光敏剂在肿瘤部位的聚集，从而可用于进行光动力学治疗。然而，氧化石墨烯和光敏剂形成紧密复合物后，光敏剂的荧光会被淬灭，从而限制了氧化石墨烯-光敏剂复合物在通过荧光成像方面的应用。
研究人员已经尝试了将氧化石墨烯与光敏剂连接在一起进行荧光成像和光动力学治疗。然而，发现该应用受限于光敏剂的荧光被GO淬灭。例如，二氢卟吩e6(Ce6)与叶酸修饰的GO连接后，Ce6的荧光被彻底淬灭(Huang P,Xu C,Lin J,Wang C,Wang X,Zhang C等,Folic acid-conjugated graphene oxide loaded with photosensitizers fortargeting photodynamic therapy.Theranostics.2011；1:240-50)。此外，2-(1-己氧基乙基)-2-去乙烯基焦脱镁叶绿酸-α(2-(1-hexyloxyethyl)-2-devinyl pyropheophorbide-alpha,HPPH)的荧光也被GO-PEG淬灭(Rong P,Yang K,Srivastan A,Kiesewetter DO,YueX,Wang F等,Photosensitizer loaded nano-graphene for multimodality imagingguided tumor photodynamic therapy.Theranostics.2014；4:229-39)。改善用GO作为载体的荧光淬灭问题在本领域中是一个巨大的挑战。
因此，需要研究不发生荧光淬灭的运输载体-光敏剂复合物，提高光敏剂的荧光成像效果和PDT效果。
发明内容
在寻求解决上述问题的过程中，发明人令人惊奇地发现用聚乙二醇(PEG)修饰的GO与光敏剂卟啉二聚体盐形成复合物不仅不会导致卟啉二聚体盐的荧光被淬灭，而且能增强其荧光，并且增强其在肿瘤部位的聚集，进一步增强了卟啉二聚体盐的诊断和治疗一体化应用性和靶向性。相应地，发明人设计并成功制备了这种复合物，从而提供了一种新型的用于荧光成像和PDT、尤其是荧光指导下的PDT的诊疗一体化复合物。
在实施方案1中，本发明提供了一种GO-PEG-卟啉二聚体盐复合物，其中：
GO是氧化石墨烯；
PEG是聚乙二醇，其分子量为200-20000，优选2000-12000；且
卟啉二聚体盐是式(1)、(2)或(3)的化合物，
其中
R独立地选自C1-6烷基、C2-6链烯基、C2-6炔基、C1-6烷氧基和C1-6酰基，其任选地被一个或多个选自卤素和羟基的取代基取代，
M是碱金属、碱土金属或NH4 +，
p是M的化合价数的倒数。
在实施方案2中，本发明提供了如实施方案1所述的GO-PEG-卟啉二聚体盐复合物，其中R独立地选自任选被一个或多个羟基取代的C1-6烷基、C2-6链烯基、C2-6炔基和C1-6酰基，M是碱金属或NH4 +，且p是1。
在实施方案3中，本发明提供了如实施方案2所述的GO-PEG-卟啉二聚体盐复合物，其中R独立地选自-CH＝CH2、-CH(OH)CH3和-COCH3，M是碱金属或NH4 +，且p是1。
在实施方案4中，本发明提供了如实施方案3所述的GO-PEG-卟啉二聚体盐复合物，其中R独立地选自-CH＝CH2和-CH(OH)CH3，M是碱金属或NH4 +，且p是1。
在实施方案5中，本发明提供了如实施方案1-4中任意一个实施方案所述的GO-PEG-卟啉二聚体盐复合物，其中M是碱金属。
在实施方案6中，本发明提供了如实施方案5所述的GO-PEG-卟啉二聚体盐复合物，其中M是Na或K。
在实施方案7中，本发明提供了如实施方案1所述的GO-PEG-卟啉二聚体盐复合物，其中所述的卟啉二聚体盐选自：
二[1-[6,7-二丙酸钠-1,3,5,8-四甲基-4-乙烯基-2-卟吩]乙基]醚(DVDMS-1)，
二[1-[6,7-二丙酸钠-1,3,5,8-四甲基-2-乙烯基-4-卟吩]乙基]醚(DVDMS-2)，
1-[6,7-二丙酸钠-1,3,5,8-四甲基-2-乙烯基-4-卟吩]乙基1-[6’,7’-二丙酸钠-1’,3’,5’,8’-四甲基-4-乙烯基-2-卟吩]乙基醚(DVDMS-3)，
二[1-[6,7-二丙酸钾-1,3,5,8-四甲基-4-乙烯基-2-卟吩]乙基]醚，
二[1-[6,7-二丙酸钾-1,3,5,8-四甲基-2-乙烯基-4-卟吩]乙基]醚，
1-[6,7-二丙酸钾-1,3,5,8-四甲基-2-乙烯基-4-卟吩]乙基1-[6’,7’-二丙酸钾-1’,3’,5’,8’-四甲基-4-乙烯基-2-卟吩]乙基醚，
二[1-[6,7-二丙酸铵-1,3,5,8-四甲基-4-乙烯基-2-卟吩]乙基]醚，
二[1-[6,7-二丙酸铵-1,3,5,8-四甲基-2-乙烯基-4-卟吩]乙基]醚，
1-[6,7-二丙酸铵-1,3,5,8-四甲基-2-乙烯基-4-卟吩]乙基1-[6’,7’-二丙酸铵-1’,3’,5’,8’-四甲基-4-乙烯基-2-卟吩]乙基醚，和
它们中两种或更多种的混合物。
在实施方案8中，本发明提供了如实施方案1所述的GO-PEG-卟啉二聚体盐复合物，其中所述的卟啉二聚体盐选自二[1-[6,7-二丙酸钠-1,3,5,8-四甲基-4-乙烯基-2-卟吩]乙基]醚(DVDMS-1)、二[1-[6,7-二丙酸钠-1,3,5,8-四甲基-2-乙烯基-4-卟吩]乙基]醚(DVDMS-2)、1-[6,7-二丙酸钠-1,3,5,8-四甲基-2-乙烯基-4-卟吩]乙基1-[6’,7’-二丙酸钠-1’,3’,5’,8’-四甲基-4’-乙烯基-2’-卟吩]乙基醚(DVDMS-3)以及它们中两种或三种的混合物。
在实施方案9中，本发明提供了如实施方案1-8中任意一个实施方案所述的GO-PEG-卟啉二聚体盐复合物，其中GO与PEG的重量比是1:1–1:8，优选1:2-1:4，更优选1:3。
在实施方案10中，本发明提供了如实施方案1-9中任意一个实施方案所述的GO-PEG-卟啉二聚体盐复合物，其中GO-PEG与卟啉二聚体盐的重量比是0.1:1、0.5:1、1:1或2:1，优选0.5:1。
在实施方案11中，本发明提供了如实施方案1-9中任意一个实施方案所述的GO-PEG-卟啉二聚体盐复合物，其中所述的GO-PEG与卟啉二聚体盐是通过包括以下步骤的方法制备的：将卟啉二聚体盐的水溶液与GO-PEG水溶液混合并反应6-12小时(例如在pH 5-8、优选pH 7.4下反应)，然后用100kD的滤器过滤，从而获得GO-PEG-卟啉二聚体盐复合物。
在实施方案12中，本发明提供了如实施方案11所述的GO-PEG-卟啉二聚体盐复合物，其中反应中加入的GO-PEG与卟啉二聚体盐的重量比是0.1:1、0.5:1、1:1或2:1，从而分别获得其中GO-PEG与卟啉二聚体盐的重量比是0.1:1、0.5:1、1:1或2:1的GO-PEG-卟啉二聚体盐复合物。
在实施方案13中，本发明提供了一种药物组合物，其包含实施方案1-12中任意一个实施方案所述的GO-PEG-卟啉二聚体盐复合物，并且任选地包含可药用的载体。
在实施方案14中，本发明提供了实施方案1-12中任意一个实施方案所述的GO-PEG-卟啉二聚体盐复合物在制备药物中的用途，所述药物用在荧光成像和光动力疗法中、特别是用在荧光指导下的光动力疗法中，用于治疗或诊断恶性肿瘤、癌前病变、良性病变。
在实施方案15中，本发明提供了如实施方案14所述的用途，其中所述的恶性肿瘤是实体瘤。
在实施方案16中，本发明提供了如实施方案15所述的用途，其中所述的实体瘤选自膀胱癌、食管癌、支气管癌、口腔颌面部癌、鼻咽癌、肋膜间皮瘤、肝癌、胰腺癌、皮肤癌、阴茎癌、宫颈癌、乳腺癌及乳腺癌切除术后皮下转移结节、肛周肿瘤及肛周肿瘤扩大切除术后癌残留、卡波西肉瘤、肺癌、胃癌、胆管癌、前列腺癌、黑素瘤和脑肿瘤。
在实施方案17中，本发明提供了如实施方案14所述的用途，其中所述的癌前病变是巴雷特氏食管和口腔粘膜白斑。
在实施方案18中，本发明提供了如实施方案14所述的用途，其中所述的良性病变选自老年性眼底黄斑病变、动脉粥样硬化斑块、类风湿性关节炎、皮肤微血管畸形、牛皮癣和红斑狼疮皮损。
在实施方案19中，本发明提供了一种药盒，其包含实施方案1-12中任意一个实施方案所述的GO-PEG-卟啉二聚体盐复合物；以及将其用于荧光成像或光动力疗法、特别是荧光指导下的光动力疗法的说明书。
在实施方案20中，本发明提供了一种制备实施方案1-9中任意一个实施方案所述的GO-PEG-卟啉二聚体盐复合物的方法，其包括以下步骤：将卟啉二聚体盐的水溶液与GO-PEG水溶液混合并反应6-12小时(例如在pH5-8、优选pH 7.4下反应)，然后用100kD的滤器过滤，从而获得GO-PEG-卟啉二聚体盐复合物。
在实施方案21中，本发明提供了如实施方案20所述的方法，其中反应中加入的GO-PEG与卟啉二聚体盐的重量比是0.1:1、0.5:1、1:1或2:1，优选0.5:1，从而分别获得其中GO-PEG与卟啉二聚体盐的重量比是0.1:1、0.5:1、1:1或2:1、优选0.5:1的GO-PEG-卟啉二聚体盐复合物。
本文所用的术语“氧化石墨烯”是指石墨烯(graphene)的氧化物，其是纳米级的。例如，所述的“纳米级”氧化石墨烯是指氧化石墨烯具有≤300nm、例如5-300nm、例如20-200nm的横径，并且具有≤10nm、优选≤5nm(例如0.5-5nm)、≤2nm的厚度。纳米级的氧化石墨烯具有被动靶向性。氧化石墨烯可以由石墨烯经强酸氧化而得到。制备氧化石墨烯的已知方法主要有三种：Brodie法、Staudenmaier法和Hummers法，其中Hummers法的制备过程时效性相对较好而且制备过程也比较安全，是目前最常用的一种。这些方法在本领域中有广泛报道，例如，Hmmers法可参见：Yang K,Feng L,Hong H,Cai W,Liu Z.Preparation andfunctionalization of graphene nanocomposites for biomedical applications.NatProtoc.2013；8:2392-403；Hummers Jr WS,Offeman RE.Preparation of graphiticoxide.J Am Chem Soc.1958；80:1339；和Sun Z,Huang P,Tong G,Lin J,Jin A,Rong P等,VEGF-loaded graphene oxide as theranostics for multi-modality imaging-monitored targeting therapeutic angiogenesis of ischemicmuscle.Nanoscale.2013；5:6857-66。氧化石墨烯也可以商购获得，例如从纳诺昂纳米材料科技有限公司、Master Germany Co.,Ltd.、Sigma-Aldrich Co.,Ltd.商购获得。
本文所用的术语“聚乙二醇”或“PEG”是同义词，二者可以互换使用，是指式CH2(OH)[CH2O-CHS2]nCH2OH的化合物，根据变量n取不同的数值其分子量可以不同，聚乙二醇的平均分子量可以是200～20000，优选是2000～12000，更优选是2000～8000。聚乙二醇的具体实例包括但不限于聚乙二醇2000、聚乙二醇3000、聚乙二醇3350、聚乙二醇4000、聚乙二醇4500、聚乙二醇6000、聚乙二醇8000、聚乙二醇10000、聚乙二醇12000、聚乙二醇20000等。聚乙二醇是可商购获得的。
本文所用的“GO-PEG”是指聚乙二醇化的氧化石墨烯(PEG functionalizedgrapheme oxide,PEGylated grapheme oxide)，在本领域中也称为聚乙二醇修饰的氧化石墨烯。聚乙二醇化的氧化石墨烯可以通过本申请中所述的方法或本领域已知的方法(例如，参见Yang K,Gong H,Shi X,Wan J,Zhang Y,Liu Z.In vivo biodistribution andtoxicology of functionalized nano-graphene oxide in mice after oral andintraperitoneal administration.Biomaterials.2013；34(11):2787-95；Vila M,Portolés MT,Marques PA,Feito MJ,Matesanz MC,Ramírez-Santillán C等,Cell uptakesurvey of pegylated nanographene oxide.Nanotechnology.2012；23(46):465103)制备。GO-PEG的制备方法在本领域中是公知的，并且公认的是其可通过分子间的π-π堆积作用装载药物分子例如HPPH等。GO-PEG也可以商购获得。在GO-PEG中，GO与PEG的重量比是1:1–1:8，优选1:2-1:4，更优选1:3。
本文所述的“卟啉二聚体盐”是一种新型的光敏剂，其化学结构以及制备方法、药学活性等均公开在中国专利200910179116.5(授权公告号是CN 102030765B，授权公告日是2012年8月29日)中，将该专利的全部内容合并入本文作为参考，就如同将其全部内容逐一在本文中列出一样。最优选的三种卟啉二聚体盐是二[1-[6,7-二丙酸钠-1,3,5,8-四甲基-4-乙烯基-2-卟吩]乙基]醚(DVDMS-1)、二[1-[6,7-二丙酸钠-1,3,5,8-四甲基-2-乙烯基-4-卟吩]乙基]醚(DVDMS-2)和1-[6,7-二丙酸钠-1,3,5,8-四甲基-2-乙烯基-4-卟吩]乙基1-[6’,7’-二丙酸钠-1’,3’,5’,8’-四甲基-4’-乙烯基-2’-卟吩]乙基醚(DVDMS-3)，它们均是优良的光敏剂，具有以下结构式：
DVDMS-1、DVDMS-2、DVDMS-3或者其两种或三种的混合物在本申请中也被称为“华卟啉钠”或“DVDMS”。在姜智换等发表的题为“华卟啉钠介导的光动力疗法在体外和体内对肿瘤生长的抑制作用”一文(癌变.畸变.突变,2013,25(3):163-167)中介绍了华卟啉钠DVDMS-2对人肝癌细胞HepG2、人肺癌细胞H460、人胃癌细胞BGC823和人肾癌细胞Ketr-3的生长抑制作用以及H460荷瘤裸鼠的治疗作用。
本文所用的术语“C1-6烷基”意指具有1至6个碳原子的支链或直链的一价饱和烃基。优选C1-4烷基。其实例包括但不限于甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基、异戊基、新戊基和正己基等。
本文所用的术语“C2-6链烯基”意指具有2至6个碳原子的包含一个或多个碳碳双键的直链或支链一价不饱和烃基。优选C2-4链烯基。其实例包括但不限于乙烯基、丙-1-烯基、烯丙基、丁-1-烯基、戊-1-烯基、戊-1,4-二烯基等。
本文所用的术语“C2-6炔基”意指具有2至6个碳原子的包含一个或多个碳碳三键的直链或支链一价不饱和烃基。优选C2-4炔基。其实例包括但不限于乙炔基、丙-1-炔基、丙-2-炔基、丁-1-炔基、戊-1-炔基、戊-1,3-二炔基等。
本文所用的术语“C1-6烷氧基”意指基团R’-O-，其中R’是上文所定义的C1-6烷基。优选C1-4烷氧基。其实例包括但不限于甲氧基、乙氧基、正丙氧基、异丙氧基、正丁氧基、仲丁氧基、叔丁氧基、正戊氧基、异戊氧基、新戊氧基和正己氧基等。
本文所用的术语“C1-6酰基”意指基团R’-C(O)-，其中R’是H或具有1至5个碳原子的支链或直链的一价饱和烃基。优选C1-4酰基。其实例包括但不限于甲酰基、乙酰基、丙酰基、丁酰基、戊酰基和己酰基等。
“任选”或“任选地”意指随后所述的事件或情况可以发生但是不必须发生，该描述包括该事件或情况发生的情形和不发生的情形。例如，“C1-6烷基……，其任选地被一个或多个选自卤素和羟基的取代基取代”意指可以被、但不必须被一个或多个卤素和/或羟基所取代的C1-6烷基，该描述包括未被取代的C1-6烷基和被一个或多个卤素和/或羟基取代的C1-6烷基。
本文所用的术语“卤素”意指氟、氯、溴和碘，优选氟、氯和溴，更优选氟和氯。
本文所用的术语“羟基”意指基团-OH。
本文所用的术语“碱金属”意指元素周期表中第IA族的元素锂(Li)、钠(Na)、钾(K)、铷(Rb)、铯(Cs)、钫(Fr)，优选钠和钾。
本文所用的术语“碱土金属”意指元素周期表中IIA族元素铍(Be)、镁(Mg)、钙(Ca)、锶(Sr)、钡(Ba)和镭(Ra)，优选钙和美，最优选钙。
本文所用的术语“化合价数”意指化学元素的1个原子所形成的共用电子对数。离子的化合价数等于其电荷数。例如，碱金属以及NH4 +的化合价数是1，碱土金属的化合价数是2。
本文所用的术语“复合物”所对应的英文是complex，是指由多个组分结合而成的一个整体结构，该结构通常由两种或更多种相同或不同的离子化学物质或不带电荷的化学物质组成，所述的两种或更多种化学物质通常以整数比例采用弱相互作用的方式而不是共价键相互连接。在本发明的复合物中，GO-PEG与卟啉二聚体盐是通过π-π堆积作用和疏水性相互作用连接、从而形成复合物的。
本文所用的术语“个体”意指动物，包括哺乳动物和非哺乳动物。哺乳动物意指哺乳动物类的任何成员，包括但不限于人、非人灵长类动物(如黑猩猩和其它猿类和猴类)、农场动物(如牛、马、绵羊、山羊和猪)、家养动物(如兔、犬和猫)、实验室动物(包括啮齿类动物，如大鼠、小鼠和豚鼠)等。非哺乳动物的实例包括但不限于鸟类等。
本文所用的术语“有效量”意指本发明的复合物产生研究人员或临床医师所寻求或期望的生物学或医学响应的量。
本文所用的术语“药盒”意指任何商业包装，其包含用于盛放本发明的复合物或本发明的药物组合物的容器，并且还任选地包含分开的容器如分开的小瓶或分开的铝箔包装，例如用以盛放重配溶剂。所述容器可以是本领域中已知的任何常规形状或形式，其由可药用的材料制成。
本文所用的术语“治疗”包括：
(i)预防疾病，即，使疾病的临床症状在可能罹患该疾病但尚未感受到或显示出该疾病症状的个体中不发生，
(ii)抑制疾病，即，阻止疾病或其临床症状的发展，或者
(iii)减轻或治愈疾病，即，使疾病或其临床症状暂时性或永久性消退。
本文所用的术语“可药用的载体”表示这样的物质，其可用于制备药物组合物，一般是安全的、无毒的、在生物学或其它方面没有不希望的性质，包括在兽医学以及人药用上可接受的载体。
本说明书中没有详细定义的其它术语具有本领域技术人员所知的常规含义。
本发明的GO-PEG-卟啉二聚体盐、特别是GO-PEG-华卟啉钠在450-550nm下、优选在500-530nm下、最优选在515-25nm下进行活体光学成像，在这些波长的激发下其能产生高强度的荧光，并且能在610-640nm下、优选在615-635nm下、最优选在620-630nm下良好地发挥卟啉二聚体盐的光动力学活性。
本发明的GO-PEG-卟啉二聚体盐复合物不仅不淬灭卟啉二聚体盐的荧光，反而预料不到地使其荧光增强，并且增加了其肿瘤靶向性，所以可用于荧光成像和PDT，并且特别适合用于荧光指导下的PDT，能用于诊断或治疗恶性肿瘤、癌前病变或良性病变。
本文所用的术语“恶性肿瘤”也称为癌或癌症，例如实体瘤，如膀胱癌、食管癌、支气管癌、口腔颌面部癌、鼻咽癌、肋膜间皮瘤、肝癌、胰腺癌、皮肤癌、阴茎癌、宫颈癌、乳腺癌及乳腺癌切除术后皮下转移结节、肛周肿瘤及肛周肿瘤扩大切除术后癌残留、卡波西肉瘤、肺癌、胃癌、胆管癌、前列腺癌、黑素瘤和脑肿瘤。
本文所用的术语“癌前病变”是指从正常组织到发生癌变的中间阶段状态，例如巴雷特氏食管、口腔粘膜白斑等。
本文所用的术语“良性病变”是指没有恶性病变趋势的异常状态，例如老年性眼底黄斑病变、动脉粥样硬化斑块、类风湿性关节炎、皮肤微血管畸形、牛皮癣、红斑狼疮皮损等。
本发明的复合物可以被配制成任何适宜的盖仑形式并且可通过任何适宜的途径被施用给需要其的个体。例如，本发明的复合物可以被配制成溶液、混悬剂、乳剂、冻干制剂等用于注射(例如动脉内、静脉内、肌内、皮下、腹膜内注射等)或输注施用，被配制成片剂、溶液、胶囊剂等用于口服施用，被配制成软膏剂、乳膏剂、栓剂、贴剂等用于局部施用，被配制成气雾剂、喷雾剂、粉末等用于吸入施用。优选的施用方式一般是注射/输注、口服和局部施用。注射/输注施用可使得本发明的化合物快速达到分布平衡，例如在24小时内达到分布平衡。
将本发明的复合物配制成盖仑形式的方法和赋形剂均是本领域技术人员熟知的常规方法和已知赋形剂。例如，关于这些盖仑形式以及适合的赋形剂可参见：罗明生、高天惠主编,《药剂辅料大全》,第2版,四川科学技术出版社。制剂领域的技术人员可以在本说明书的教导范围内对制剂进行调整，以提供各种制剂用于特定的施用途径，而不使本发明的复合物不稳定或者损害它们的治疗活性。
一般而言，对于动物例如人，以其中所含有的卟啉二聚体盐的量计算，本发明的复合物的有效量为0.01-5mg/kg体重，优选0.05-4mg/kg体重，更优选0.1-2mg/kg体重，更优选0.2mg-1mg/kg体重。但是，应当理解的是，本发明的复合物的有效量将由研究人员或临床医师根据合理医学判断来确定。具体的有效量将取决于许多因素，例如，所治疗的疾病的种类和严重程度；所用的具体复合物；所用的治疗光波长、光能流率和照射时间；患者的年龄、体重、一般健康状况；治疗的持续时间；合并用药；以及医学领域中众所周知的其它因素。在某些情况下，有效量可能高于上述范围的上限或低于上述范围的下限。
实施例
下文提供了本发明的复合物的一些实例及其制备方法、活性测试。提供这些实施例的目的在于使本领域技术人员能够更加清楚地理解和实施本发明，而不是限制本发明的范围。
下列实施例中所使用的DVDMS-1、DVDMS-2和DVDMS-3是按照中国专利200910179116.5中所公开的方法制备的。
实施例1
(1)GO-PEG-DVDMS-1的合成
按照文献(Yang K,Feng L,Hong H,Cai W,Liu Z.Preparation andfunctionalization of graphene nanocomposites for biomedical applications.NatProtoc.2013；8:2392-403；Hummers Jr WS,Offeman RE.Preparation of graphiticoxide.J Am Chem Soc.1958；80:1339)中报道的改良的Hummers方法合成GO。简言之，将2-5g石墨粉(国药集团化学试剂北京有限公司，分子量12.01,粒度为≥95％的颗粒≤30μm,碳含量≥99.85％)加入到在冰浴中冷却着的37.5ml浓硫酸(95％)中，搅拌并逐渐加入6.25gKMnO4和3g NaNO3，35℃搅拌1h。加入去离子水并将温度升高至90℃搅拌1h。用去离子水和30％H2O2混合物终止反应。所得产物用HCl水溶液和去离子水洗涤，用100kD超滤管超滤离心(3000rpm)3次，得到横径20-200nm、厚度0.5-5nm范围内的氧化石墨烯，将终产物溶于去离子水中备用。
在25ml玻璃瓶中，向上述步骤获得的GO溶液(1mg/ml,5ml)中加入25mg PEG2000(Sigma)。将该混合物超声10-20min，加入羧基活化剂1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐水溶液(EDC,Sigma)(终浓度为10mg/ml)。于室温搅拌过夜，通过于1000rpm离心去除聚集物，收集上清液。所得PEG化的GO溶液用100kD超滤管(Millipore Inc)纯化，用去离子水清洗。利用GO在230nm处的吸光度测定GO-PEG的浓度。光谱测定结果显示在所生成的GO-PEG中GO与PEG的重量比为1:3。
将10mg DVDMS-1溶解于1ml水中作为备用溶液。按照GO-PEG:DVDMS-1的重量比＝0.5:1的比例，将DVDMS-1水溶液(0.4mg/ml)和磷酸盐缓冲盐水(PBS)(0.02M)(pH 7.4)缓慢加入到上面得到的GO-PEG水溶液(0.1mg/ml)中，反应6-12小时，生成GO-PEG-DVDMS-1。用100kD超滤管(Millipore Inc)离心，从而获得GO-PEG-DVDMS-1复合物，将其用纯水清洗6-8次。在所得的GO-PEG-DVDMS-1中GO-PEG与DVDMS-1的重量比是0.5:1。
(2)GO-PEG-DVDMS的表征
利用原子力显微镜(AFM,Veeco Instruments,Inc,Multimode 8)测定了如上所述合成的GO-PEG-DVDMS-1的形貌。根据DVDMS-1在516nm处的特征性吸收峰测定了GO-PEG上装载的DVDMS-1的浓度。使用F-7000荧光分光光度计测定DVDMS-1和GO-PEG-DVDMS-1在385nm波长激发下的荧光光谱，并且根据光学吸收和荧光光谱分析GO-PEG和DVDMS-1之间的相互作用。结果如图2和图3所示。
图2是如上所述合成的GO-PEG(A)和GO-PEG-DVDMS-1(B)的AFM图，其显示反应前GO-PEG的厚度为1.5nm，反应后得到的产物GO-PEG-DVDMS-1的厚度增加到了2nm，由此可见DVDMS-1成功地装载延伸了GO-PEG的表面，导致其增厚。
图3显示了GO-PEG-DVDMS-1(a)、DVDMS-1(b)和GO-PEG(c)的吸收光谱，其中GO-PEG在230nm处有一个明显的峰；DVDMS-1在385nm处有很强的吸收峰，Q带在500nm至700nm之间；GO-PEG-DVDMS-1的紫外-可见光吸收光谱是DVDMS-1和GO-PEG二者的重叠。然而，GO-PEG-DVDMS-1的特征性吸收峰与DVDMS-1的吸收峰并不完全一致，在430nm处有一个新的峰出现，这很可能是由于DVDMS-1分子上的两个卟啉环之间空间的阻隔作用使其中一个环吸附在GO表面而另一个环与GO隔离所造成的。此外，在反应后超滤液体的吸收光谱中并没有检测到游离的DVDMS-1的特征性吸收峰，表明游离的DVDMS-1在该比例反应下完全装载在GO-PEG纳米复合物上。
实施例2
按照实施例1(1)中所述的方法，用DVDMS-2替换DVDMS-1，制备了GO-PEG-DVDMS-2，并且按照实施例1(2)中所述的方法对GO-PEG-DVDMS-2进行了表征。
在所得的GO-PEG-DVDMS-2中GO-PEG与DVDMS-2的重量比是0.5:1。
GO-PEG-DVDMS-2的AFM图和吸收光谱与实施例1中制备的GO-PEG-DVDMS-1的AFM图和吸收光谱基本相同，其显示GO-PEG-DVDMS-2的厚度为2nm，DVDMS-2成功地装载延伸了GO-PEG的表面(未重复提供相关图片)。
实施例3
按照实施例1(1)中所述的方法，用DVDMS-3替换DVDMS-1，制备了GO-PEG-DVDMS-3，并且按照实施例1(2)中所述的方法对GO-PEG-DVDMS-3进行了表征。
在所得的GO-PEG-DVDMS-3中GO-PEG与DVDMS-3的重量比是0.5:1。
GO-PEG-DVDMS-3的AFM图和吸收光谱与实施例1制备的GO-PEG-DVDMS-1的AFM图和吸收光谱基本相同，其显示GO-PEG-DVDMS-3的厚度为2nm，DVDMS-3成功地装载延伸了GO-PEG的表面(未重复提供相关图片)。
实施例4
按照实施例1(1)中所述的方法制备了GO-PEG-DVDMS-1，不同之处在于反应中所使用的GO-PEG:DVDMS-1的重量比＝0.1:1，并且按照实施例1(2)中所述的方法对所制备的GO-PEG-DVDMS-1进行了表征。
在所得的GO-PEG-DVDMS-1中GO-PEG与DVDMS-1的重量比是0.1:1。
本实施例中所制备的GO-PEG-DVDMS-1的AFM图和吸收光谱与实施例1中制备的GO-PEG-DVDMS-1的AFM图和吸收光谱基本相同，其显示GO-PEG-DVDMS-1的厚度为2nm，DVDMS-1成功地装载延伸了GO-PEG的表面(未重复提供相关图片)。
实施例5
按照实施例1(1)中所述的方法制备了GO-PEG-DVDMS-1，不同之处在于反应中所使用的GO-PEG:DVDMS-1的重量比＝1:1，并且按照实施例1(2)中所述的方法对所制备的GO-PEG-DVDMS-1进行了表征。
在所得的GO-PEG-DVDMS-1中GO-PEG与DVDMS-1的重量比是1:1。
本实施例中所制备的GO-PEG-DVDMS-1的AFM图和吸收光谱与实施例1中制备的GO-PEG-DVDMS-1的AFM图和吸收光谱基本相同，其显示GO-PEG-DVDMS-1的厚度为2nm，DVDMS-1成功地装载延伸了GO-PEG的表面(未重复提供相关图片)。
实施例6
按照实施例1(1)中所述的方法制备了GO-PEG-DVDMS-1，不同之处在于反应中所使用的GO-PEG:DVDMS-1的重量比＝2:1，并且按照实施例1(2)中所述的方法对所制备的GO-PEG-DVDMS-1进行了表征。
在所得的GO-PEG-DVDMS-1中GO-PEG与DVDMS-1的重量比是2:1。
本实施例中所制备的GO-PEG-DVDMS-1的AFM图和吸收光谱与实施例1中制备的GO-PEG-DVDMS-1的AFM图和吸收光谱基本相同，其显示GO-PEG-DVDMS-1的厚度为2nm，DVDMS-1成功地装载延伸了GO-PEG的表面(未重复提供相关图片)。
实施例7
按照实施例1(1)中所述的方法制备了GO-PEG-DVDMS-1，不同之处在于将PEG2000替换为PEG6000(Sigma)，并且按照实施例1(2)中所述的方法对所制备的GO-PEG-DVDMS-1进行了表征。
在所得的GO-PEG-DVDMS-1中GO-PEG与DVDMS-1的重量比是0.5:1。
本实施例中所制备的GO-PEG-DVDMS-1的AFM图和吸收光谱与实施例1中制备的GO-PEG-DVDMS-1的AFM图和吸收光谱基本相同，其显示GO-PEG-DVDMS-1的厚度为2nm，DVDMS-1成功地装载延伸了GO-PEG的表面(未重复提供相关图片)。
实施例8
按照实施例1(1)中所述的方法制备了GO-PEG-DVDMS-1，不同之处在于将PEG2000替换为PEG10000(Sigma)，并且按照实施例1(2)中所述的方法对所制备的GO-PEG-DVDMS-1进行了表征。
在所得的GO-PEG-DVDMS-1中GO-PEG与DVDMS-1的重量比是0.5:1。
本实施例中所制备的GO-PEG-DVDMS-1的AFM图和吸收光谱与实施例1中制备的GO-PEG-DVDMS-1的AFM图和吸收光谱基本相同，其显示GO-PEG-DVDMS-1的厚度为2nm，DVDMS-1成功地装载延伸了GO-PEG的表面(未重复提供相关图片)。
实施例9
(1)单线态氧检测：
使用单线态氧检测试剂盒(Life Technology,MP36002)检测实施例1和4-6中所制备的各种GO-PEG-DVDMS-1和游离的DVDMS-1所产生的单线态氧。将GO-PEG-DVDMS-1或游离的DVDMS-1水溶液与检测试剂水溶液(终浓度为1.0μM)混合。按照DVDMS-1的量计算，每个样品中的DVDMS-1浓度均为0.5μg/ml。然后用630nm激光器照射上述溶液。用F-7000荧光分光光度计测定SOSG(Singlet Oxygen Sensor Green)在485nm波长激发下的发生光谱。通过SOSG荧光增强评价样品的单线态氧生成(singlet oxygen generation,SOG)。
(2)结果：
单线态氧检测实验的结果如图4所示。随着GO-PEG所占比例的变化(以重量计，GO-PEG:DVDMS-1＝0.1:1～2:1)，实施例1和4-6中所制备的GO-PEG-DVDMS-1的荧光强度比游离的DVDMS-1(即，图4中所示的GO-PEG:DVDMS-1＝0:1的情况)的荧光强度高3-5倍。这种荧光增强使得可以实时监测DVDMS-1在体内的运输和分布情况，并且使得荧光成像指导下的PDT的效果被增强。
另外，通过单线态氧试剂盒检测GO-PEG-DVDMS-1所产生的单线态氧还可确认GO-PEG-DVDMS-1的光动力学效果。在该实验中还发现SOSG的荧光强度随着时间逐渐增强，这说明GO-PEG-DVDMS-1在激光照射下产生了单线态氧。当GO-PEG-DVDMS-1中所含的DVDMS-1与游离的DVDMS-1的浓度相同时，GO-PEG-DVDMS-1产生的单线态氧略低于DVDMS-1，但是足够进行光动力学治疗。
实施例10
(1)细胞摄取和内化：
将U87MG人神经胶质瘤细胞(美国标准生物品收藏中心(ATCC))用DMEM培养基加10％的胎牛血清和1％青霉素/链霉素培养在37℃、5％CO2培养箱中。为了进行细胞摄取实验，将细胞以1×104个/ml接种在Lab Tek II 8孔板中，培养24h。然后更换培养基，加入实施例1中所制备的GO-PEG-DVDMS-1或游离的DVDMS-1至其中按DVDMS-1的量计算DVDMS-1的浓度均为1μg/mL，避光培养24h。用PBS清洗3次，用DAPI染液进行核染色，IX81荧光显微镜观察。
按照相同的方法测试实施例2中制备的GO-PEG-DVDMS-2和实施例3中所制备的GO-PEG-DVDMS-3。
(2)流式细胞仪计数：
将U87MG人神经胶质瘤细胞(美国标准生物品收藏中心(ATCC))用DVDMS-1浓度为1μg/mL的实施例1中所制备的GO-PEG-DVDMS-1或游离的DVDMS-1处理24h，用PBS清洗并重新混悬。使用Accuri C6流式细胞仪计数并用FlowJo version 7.6.5软件分析数据。
按照相同的方法测试实施例2中制备的GO-PEG-DVDMS-2和实施例3中所制备的GO-PEG-DVDMS-3。
(3)结果：
上述实验显示了U87MG人神经胶质瘤细胞对实施例1-3中所制备的GO-PEG-DVDMS-1、GO-PEG-DVDMS-2、GO-PEG-DVDMS-3和游离的DVDMS-1、DVDMS-2、DVDMS-3的摄取结果。
如上所述将肿瘤细胞用含实施例1-3中所制备的GO-PEG-DVDMS-1、GO-PEG-DVDMS-2、GO-PEG-DVDMS-3或游离的DVDMS-1、DVDMS-2、DVDMS-3的培养基避光培养24h，发现荧光强度随着培养时间变化。具体而言，随着培养时间的延长，细胞内有很强的红色荧光，并且该红色荧光随着时间增强。在处理后24h，用GO-PEG-DVDMS-1GO-PEG-DVDMS-2、GO-PEG-DVDMS-3处理的细胞荧光很强，并且均分别显著强于游离的DVDMS-1、DVDMS-2、DVDMS-3处理的细胞的荧光强度，这表明GO-PEG-DVDMS-1、GO-PEG-DVDMS-2、GO-PEG-DVDMS-3均具有很高的细胞内聚集。
图5(A)是将肿瘤细胞用含实施例1中所制备的GO-PEG-DVDMS-1和游离的DVDMS-1的培养基避光培养24h的荧光照片，可以清楚地看出用GO-PEG-DVDMS-1处理的细胞比用游离的DVDMS-1处理的细胞荧光更强，这说明GO-PEG-DVDMS-1具有更高的细胞内聚集。
图5(B)中所示的流式细胞仪计数是肿瘤细胞对实施例1中所制备的GO-PEG-DVDMS-1的摄取量的定量显示，其中(a)是处理前的曲线，(b)是用游离的DVDMS-1处理24h的曲线，(c)是用实施例1中所制备的GO-PEG-DVDMS-1处理24h的曲线。GO-PEG-DVDMS-1的平均荧光强度随着培养时间的延长而增强，培养24h后，GO-PEG-DVDMS-1的平均荧光强度比游离的DVDMS-1的荧光强度高5倍。这与荧光显微镜观察的结果一致。
用实施例2中制备的GO-PEG-DVDMS-2或实施例3中制备的GO-PEG-DVDMS-3处理所获得的荧光显微镜照片以及荧光强度与细胞计数曲线图与图5中所示的GO-PEG-DVDMS-1的结果基本相同(未重复提供相关图片)。
实施例11
(1)细胞毒性实验：
将U87MG人神经胶质瘤细胞(美国标准生物品收藏中心(ATCC))接种在96孔板中(5-10×103个/孔)，培养24h，设置对照组(用作为溶媒的生理盐水处理)和不同浓度的处理组。各处理组分别用不同浓度的DVDMS-1(浓度为0.3、0.5、1、3、5μg/ml)、GO-PEG(浓度为0.3、0.5、1、3、5μg/ml)和实施例1、7、8中所制备的GO-PEG-DVDMS-1(以DVDMS-1的量计算，浓度分别为0.3、0.5、1、3、5μg/ml)处理，37℃避光培养。16-24h后，用PBS清洗两次，每孔加入10μl MTT溶液(5mg/ml MTT,pH 7.4)，培养3-6h。PBS清洗后用二甲基亚砜(DMSO,Sigma)溶解细胞内的甲瓒晶体。记录490nm处的吸光度，与对照组比较以测定细胞活性。
(2)体外光动力学治疗：
将U87MG人神经胶质瘤细胞(美国标准生物品收藏中心(ATCC))以5-10×103个/孔培养在96孔板中，设置了不进行激光照射的对照组(用作为溶媒的去离子水处理)、进行激光照射的对照组(用作为溶媒的去离子水处理)和不同浓度的化合物处理组。各化合物处理组分别用不同浓度的实施例1、7或8中所制备的GO-PEG-DVDMS-1(以DVDMS-1的量计算，浓度分别为0.3、0.5、1、3、5μg/ml)、游离的DVDMS-1(浓度为0.3、0.5、1、3、5μg/ml)或游离的GO-PEG(浓度为0.3、0.5、1、3、5μg/ml)处理。培养16-24h后，用PBS清洗3-5次，每孔加入100μL培养基，立即用630nm激光器(5J/孔)照射。细胞在培养24h后通过标准的MTT实验测细胞活性。
(3)结果：
通过上述细胞毒性实验评价了实施例1、7或8中制备的GO-PEG-DVDMS-1的细胞毒性。结果显示，没有装载DVDMS-1的GO-PEG在不进行激光照射的情况下没有细胞毒性。发明人在上述细胞毒性实验中发现甚至在GO-PEG浓度达到5μg/mL时，GO-PEG处理的细胞活性仍然能达到90％。然而，DVDMS-1和GO-PEG-DVDMS-1的细胞毒性均随着DVDMS-1浓度的增加而增加。在该实验中，实施例1、7或8中制备的GO-PEG-DVDMS-1产生了高度类似的结果。发明人以实施例1中所制备的GO-PEG-DVDMS-1所产生的结果绘制了图6(A)。如图6(A)所示，GO-PEG在不进行激光照射的情况下没有细胞毒性，甚至在高浓度下也基本没有细胞毒性；DVDMS-1和实施例1中所制备的GO-PEG-DVDMS-1的细胞毒性随着浓度的增加而有所增加。
通过上述体外光动力学治疗实验评价了实施例1、7或8中制备的GO-PEG-DVDMS-1的光动力学治疗效果。没有装载DVDMS-1的GO-PEG无论是否进行激光照射均没有细胞毒性(即，既没有暗毒性，也没有光毒性)，甚至在高浓度下也基本没有细胞毒性。在激光照射的情况下，实施例1、7或8中制备的GO-PEG-DVDMS-1的光动力学治疗效果均显著好于游离的DVDMS-1。当按GO-PEG-DVDMS-1中所含的DVDMS-1计浓度为5μg/ml时，几乎所有的肿瘤细胞被GO-PEG-DVDMS-1杀死。在该实验中，实施例1、7或8中制备的GO-PEG-DVDMS-1产生了高度类似的结果。发明人以实施例1中所制备的GO-PEG-DVDMS-1所产生的结果绘制了图6(B)。如图6(B)所示，在各个浓度下，实施例1中所制备的GO-PEG-DVDMS-1的光动力学治疗效果均好于游离的DVDMS-1。从图中可清晰地看出，经630nm激光照射后，在培养24h后，GO-PEG-DVDMS-1的肿瘤细胞杀伤效果显著高于DVDMS-1。当按GO-PEG-DVDMS-1中所含的DVDMS-1计浓度为5μg/ml时，几乎所有的肿瘤细胞被GO-PEG-DVDMS-1杀死。
图6(C)显示了类似的结果。图6(C)是用钙黄绿素AM/碘化丙啶染色的照片，显示了由实施例7中所制备的GO-PEG-DVDMS-1所产生的结果。最左侧的照片是对照组的染色照片，中间的照片是用实施例7中所制备的GO-PEG-DVDMS-1(按DVDMS-1的量计算，所含的DVDMS-1浓度为0.5μg/ml)处理的细胞的染色照片，最右侧的照片是用实施例7中所制备的GO-PEG-DVDMS-1(按DVDMS-1的量计算，所含的DVDMS-1浓度为5μg/ml)处理的细胞的染色照片。其中浅色的斑点是活的肿瘤细胞。从该图可以直观地看出，与对照组相比，经激光照射，培养24h后，GO-PEG-DVDMS-1处理导致肿瘤细胞大量死亡。用实施例1和8中所制备的GO-PEG-DVDMS-1获得了高度类似的照片(未重复提供相关照片)。
由本实施例中的实验结果可见，与游离的DVDMS-1相比，本发明的实施例1、7、8中制备的复合物GO-PEG-DVDMS-1均表现出更强的效果，发明人推断这是因为其细胞摄取量更高所导致的。换言之，本发明的复合物GO-PEG-DVDMS-1进一步增强了光敏剂DVDMS-1的疗效。
实施例12
(1)肿瘤模型的制备：
挑选6-8周龄的成年雄性Balb/c裸鼠(体重16-24g)，将其右臂皮下接种100μL溶于PBS的U87MG人神经胶质瘤细胞(美国标准生物品收藏中心(ATCC)，5×106个)。当肿瘤体积达到规定体积时，将裸鼠随机分组，进行荧光成像和PDT治疗。
(2)GO-PEG-DVDMS-1活体增强的荧光成像：
当肿瘤体积达到100mm3时，将荷瘤裸鼠随机分组，每组三只。按DVDMS-1计算，以相同剂量(2mg DVDMS-1/kg体重)静脉注射实施例1、7或8中所制备的GO-PEG-DVDMS-1和游离的DVDMS-1。使用MaestroII光学成像系统(Cambridge Research&Instrumentation,Maestro EX)在注射后2h、6h、24h进行荧光成像。为了分析GO-PEG-DVDMS-1在体内的分布情况，于注射后24h处死动物，取肿瘤和其它重要脏器，测定其荧光强度。
(3)活体光动力学治疗：
当肿瘤体积达到100mm3时，将荷瘤裸鼠随机分组(6只/组)：激光照射的GO-PEG-DVDMS-1处理组，激光照射的游离的DVDMS-1处理组，不进行激光照射的GO-PEG-DVDMS-1处理组，不进行激光照射的游离的DVDMS-1处理组，激光照射的游离的GO-PEG处理组和不进行激光照射的游离的GO-PEG处理组和溶媒对照组(进行激光照射)。给所述溶媒对照组的动物尾静脉注射作为溶媒的生理盐水，其它组分别相应地注射GO-PEG-DVDMS-1、游离的DVDMS-1或GO-PEG，按DVDMS-1的量计算各组中DVDMS-1的剂量均为2mg/kg体重，GO-PEG的剂量为1mg/kg体重。进行激光照射的组在注射后24h用50J能力的630nm激光照射肿瘤。治疗后连续30天检测肿瘤体积及动物的体重。PDT治疗24h后，收集动物的肿瘤和主要器官，用4％甲醛溶液固定后拍照。用此实验方案测试了实施例1、7、8中所制备的GO-PEG-DVDMS-1。
(4)结果：
图7中的照片显示了在注射实施例1中所制备的GO-PEG-DVDMS-1或游离的DVDMS-1之前、注射后2h、6h和24h的活体荧光成像照片。由这些照片可以清晰地观察到，在GO-PEG-DVDMS-1处理的小鼠中，荧光信号大部分集中在肿瘤区域，而在游离的DVDMS-1处理组中，荧光信号遍布小鼠的全身，尤其是在皮肤中。发明人推断，在GO-PEG-DVDMS-1处理组中GO-PEG-DVDMS-1在肿瘤部位明显富集可能是由于EPR效应所致。用实施例7和8中所制备的GO-PEG-DVDMS-1产生了相同的结果。
此外，实施例1、7、8中所制备的GO-PEG-DVDMS-1在上述活体光动力学治疗中所产生的结果还显示，在激光照射的GO-PEG-DVDMS-1处理组中，使用激光照射后2天肿瘤消融，留下黑疤，并且在10天后复原。在激光照射的游离的DVDMS-1处理组中，用激光照射后肿瘤部分消除，与溶媒对照组比较肿瘤生长减缓。相反，各对照组的肿瘤生长速度相似：溶媒对照组(进行激光照射)、进行激光照射的游离的GO-PEG处理组、不进行激光照射的游离的GO-PEG处理组、不进行激光照射的GO-PEG-DVDMS-1处理组和不进行激光照射的游离的DVDMS-1处理组均不能抑制肿瘤生长，并且这五个对照组的动物存活时间是12天。激光照射的游离的DVDMS-1处理组的动物寿命期限延长到3周。激光照射的GO-PEG-DVDMS-1处理组的动物寿命期限超过一个月，并且在观察期间没有观察到明显的细胞毒性，也没有体重减轻。
激光照射24h后，所有组的动物均取肿瘤做苏木精-伊红染色(HE染色)。与激光照射的游离的DVDMS-1处理组相比，所有激光照射的GO-PEG-DVDMS-1处理组的细胞坏死更多，表现为例如肿瘤细胞萎缩、与周围组织脱离、出现嗜酸性细胞质、核破裂。各对照组的肿瘤没有区别。不同组的小鼠的主要脏器HE染色结果表明，实施例1、7、8中制备的GO-PEG-DVDMS-1注射后进行激光照射均没有毒性损伤和炎症存在。
总之，上述实验结果显示，用GO-PEG装载卟啉二聚体盐(例如DVDMS)后，使卟啉二聚体盐的荧光显著增强，因此本发明的PEG修饰的GO装载的卟啉二聚体盐能够通过增强的荧光成像更好地指导PDT。同时，GO-PEG还能促进卟啉二聚体盐(例如DVDMS)在肿瘤部位的富集。因此，本发明的GO-PEG-卟啉二聚体盐在整合纳米药物运输、活体成像、光动力学治疗方面、从而在高效治疗肿瘤方面具有巨大的潜能。
实施例13
GO-PEG-卟啉二聚体盐注射剂的制备
称取一定量的GO-PEG-卟啉二聚体盐，置于避光玻璃容器中，加注射用水溶解，按卟啉二聚体盐的量计浓度为5μg/ml。在无菌操作间，经孔径为0.22μm的薄膜过滤器(Sigma)过滤，将溶液定量分装于10ml的玻璃安瓶中。
附图说明
图1(A)是GO-PEG-DVDMS的合成路径示意图，其中通过改良的Hmmers法以片状可膨胀石墨为原料制备了GO，然后PEG与GO通过氨基羧基偶联反应相连，形成GO-PEG，从而提高GO的水溶性、稳定性和生物相容性。随后，通过疏水性相互作用和π-π堆积作用将DVDMS装载到GO-PEG中GO的表面；图1(B)是GO-PEG-DVDMS的结构示意图。需要说明的是，DVDMS分子的两个环中的一个环通过π-π共轭连在石墨烯上，处理为黑色之后在图1中变得不明显。
图2(A)是实施例1中所制备的GO-PEG的AFM图，图2(B)是实施例1中所制备的GO-PEG-DVDMS-1的AFM图，其显示反应前GO-PEG的厚度为1.5nm，反应后得到的产物GO-PEG-DVDMS-1的厚度增加到了2nm，由此可见DVDMS-1成功地装载延伸了GO-PEG的表面，导致其增厚。
图3是实施例1中制备的GO-PEG-DVDMS-1(a)、DVDMS-1(b)和GO-PEG(c)的吸收光谱，其中GO-PEG的浓度为2.5μg/ml，按DVDMS-1的量计算，GO-PEG-DVDMS-1中所含的DVDMS-1和游离的DVDMS-1的浓度均为5μg/ml。
图4显示了DVDMS-1在620nm的荧光强度以及实施例1和4-6中所制备的不同比例的GO-PEG-DVDMS-1在640nm的荧光强度，横坐标是GO-PEG-DVDMS-1中GO-PEG与DVDMS-1的重量比，纵坐标是荧光强度。按DVDMS-1的量计算，每个样品中的DVDMS-1浓度均为0.5μg/ml。
图5(A)是将肿瘤细胞用含实施例1中所制备的GO-PEG-DVDMS-1和游离的DVDMS-1(按DVDMS-1的量计算，每个样品中的DVDMS-1浓度均为1μg/mL)的培养基避光培养24h之前和之后的荧光照片，可以清楚地看出用GO-PEG-DVDMS-1处理的细胞比用游离的DVDMS-1处理的细胞荧光更强。图5(B)是U87MG肿瘤细胞用GO-PEG-DVDMS-1和DVDMS-1(按DVDMS-1的量计算，每个样品中的DVDMS-1浓度均为1μg/mL)处理24h的流式细胞仪计数分析平均荧光强度，其中(a)是处理前的曲线，(b)是用DVDMS-1处理24h的曲线，(c)是用实施例1中制备的GO-PEG-DVDMS-1处理24h的曲线。
图6(A)显示了用不同浓度的游离的GO-PEG、游离的DVDMS-1、实施例1中所制备的GO-PEG-DVDMS-1孵育的细胞活性；图6(B)显示了用不同浓度的游离的GO-PEG、游离的DVDMS-1、实施例1中所制备的GO-PEG-DVDMS-1孵育并用630nm激光照射后的细胞活性；图6(C)是用钙黄绿素AM/碘化丙啶染色的照片，显示了实施例7中所制备的GO-PEG-DVDMS-1杀灭肿瘤细胞的效果，其中最左侧的照片是对照组的染色照片，中间的照片是用实施例7中所制备的GO-PEG-DVDMS-1(按DVDMS-1的量计算，所含的DVDMS-1浓度为0.5μg/ml)处理的细胞的染色照片，最右侧的照片是用实施例7中所制备的GO-PEG-DVDMS-1(按DVDMS-1的量计算，所含的DVDMS-1浓度为5μg/ml)处理的细胞的染色照片，照片中浅色的斑点是活的肿瘤细胞。
图7显示了使用分子成像系统观察到的实施例1中所制备的GO-PEG-DVDMS-1和游离的DVDMS-1在注射前、注射后2h、6h、24h的体内分布情况，其中按DVDMS-1的量计算，静脉注射DVDMS-1的量为2mg/kg体重。
Claims (32)
1.GO-PEG-卟啉二聚体盐复合物，其中：
GO-PEG是聚乙二醇化的氧化石墨烯；
GO是氧化石墨烯；
PEG是聚乙二醇，其分子量为200-20000；且
卟啉二聚体盐是式(1)、(2)或(3)的化合物，
其中
R独立地选自C1-6烷基、C2-6链烯基、C2-6炔基、C1-6烷氧基和C1-6酰基，其任选地被一个或多个选自卤素和羟基的取代基取代，
M是碱金属、碱土金属或NH4 +，
p是M的化合价数的倒数，
并且其中GO-PEG与卟啉二聚体盐是通过π-π堆积作用和疏水性相互作用连接的。
2.如权利要求1所述的GO-PEG-卟啉二聚体盐复合物，其中R独立地选自任选被一个或多个羟基取代的C1-6烷基、C2-6链烯基、C2-6炔基和C1-6酰基，M是碱金属或NH4 +，且p是1。
3.如权利要求2所述的GO-PEG-卟啉二聚体盐复合物，其中R独立地选自-CH＝CH2、-CH(OH)CH3和-COCH3，M是碱金属或NH4 +，且p是1。
4.如权利要求3所述的GO-PEG-卟啉二聚体盐复合物，其中R独立地选自-CH＝CH2和-CH(OH)CH3，M是碱金属或NH4 +，且p是1。
5.如权利要求1所述的GO-PEG-卟啉二聚体盐复合物，其中M是碱金属。
6.如权利要求5所述的GO-PEG-卟啉二聚体盐复合物，其中M是Na或K。
7.如权利要求1所述的GO-PEG-卟啉二聚体盐复合物，其中所述的卟啉二聚体盐选自：
二[1-[6,7-二丙酸钠-1,3,5,8-四甲基-4-乙烯基-2-卟吩]乙基]醚(DVDMS-1)，
二[1-[6,7-二丙酸钠-1,3,5,8-四甲基-2-乙烯基-4-卟吩]乙基]醚(DVDMS-2)，
1-[6,7-二丙酸钠-1,3,5,8-四甲基-2-乙烯基-4-卟吩]乙基1-[6’,7’-二丙酸钠-1’,3’,5’,8’-四甲基-4-乙烯基-2-卟吩]乙基醚(DVDMS-3)，
二[1-[6,7-二丙酸钾-1,3,5,8-四甲基-4-乙烯基-2-卟吩]乙基]醚，
二[1-[6,7-二丙酸钾-1,3,5,8-四甲基-2-乙烯基-4-卟吩]乙基]醚，
1-[6,7-二丙酸钾-1,3,5,8-四甲基-2-乙烯基-4-卟吩]乙基1-[6’,7’-二丙酸钾-1’,3’,5’,8’-四甲基-4-乙烯基-2-卟吩]乙基醚，
二[1-[6,7-二丙酸铵-1,3,5,8-四甲基-4-乙烯基-2-卟吩]乙基]醚，
二[1-[6,7-二丙酸铵-1,3,5,8-四甲基-2-乙烯基-4-卟吩]乙基]醚，
1-[6,7-二丙酸铵-1,3,5,8-四甲基-2-乙烯基-4-卟吩]乙基1-[6’,7’-二丙酸铵-1’,3’,5’,8’-四甲基-4-乙烯基-2-卟吩]乙基醚，和
它们中两种或更多种的混合物。
8.如权利要求1所述的GO-PEG-卟啉二聚体盐复合物，其中所述的卟啉二聚体盐选自二[1-[6,7-二丙酸钠-1,3,5,8-四甲基-4-乙烯基-2-卟吩]乙基]醚(DVDMS-1)、二[1-[6,7-二丙酸钠-1,3,5,8-四甲基-2-乙烯基-4-卟吩]乙基]醚(DVDMS-2)、1-[6,7-二丙酸钠-1,3,5,8-四甲基-2-乙烯基-4-卟吩]乙基1-[6’,7’-二丙酸钠-1’,3’,5’,8’-四甲基-4’-乙烯基-2’-卟吩]乙基醚(DVDMS-3)以及它们中两种或三种的混合物。
9.如权利要求1-8中任意一项权利要求所述的GO-PEG-卟啉二聚体盐复合物，其中GO与PEG的重量比是1:1-1:8。
10.如权利要求9所述的GO-PEG-卟啉二聚体盐复合物，其中GO与PEG的重量比是1:2-1:4。
11.如权利要求9所述的GO-PEG-卟啉二聚体盐复合物，其中GO与PEG的重量比是1:3。
12.如权利要求1-8中任意一项权利要求所述的GO-PEG-卟啉二聚体盐复合物，其中GO-PEG与卟啉二聚体盐的重量比是0.1:1、0.5:1、1:1或2:1。
13.如权利要求1-8中任意一项权利要求所述的GO-PEG-卟啉二聚体盐复合物，其中GO-PEG与卟啉二聚体盐的重量比是0.5:1。
14.如权利要求1-8中任意一项权利要求所述的GO-PEG-卟啉二聚体盐复合物，其中PEG是聚乙二醇，其分子量为2000-12000。
15.如权利要求14所述的GO-PEG-卟啉二聚体盐复合物，其中PEG是聚乙二醇2000、聚乙二醇6000或聚乙二醇10000。
16.如权利要求1-8中任意一项权利要求所述的GO-PEG-卟啉二聚体盐复合物，其中所述的GO-PEG与卟啉二聚体盐是通过包括以下步骤的方法制备的：将卟啉二聚体盐的水溶液与GO-PEG水溶液混合并反应6-12小时，然后用100kD的滤器过滤，获得GO-PEG-卟啉二聚体盐复合物。
17.如权利要求16所述的GO-PEG-卟啉二聚体盐复合物，其中所述的GO-PEG与卟啉二聚体盐是通过包括以下步骤的方法制备的：将卟啉二聚体盐的水溶液与GO-PEG水溶液混合并在pH 5-8下反应6-12小时，然后用100kD的滤器过滤，获得GO-PEG-卟啉二聚体盐复合物。
18.如权利要求16所述的GO-PEG-卟啉二聚体盐复合物，其中所述的GO-PEG与卟啉二聚体盐是通过包括以下步骤的方法制备的：将卟啉二聚体盐的水溶液与GO-PEG水溶液混合并在pH 7.4下反应6-12小时，然后用100kD的滤器过滤，获得GO-PEG-卟啉二聚体盐复合物。
19.如权利要求16所述的GO-PEG-卟啉二聚体盐复合物，其中反应中加入的GO-PEG与卟啉二聚体盐的重量比是0.1:1、0.5:1、1:1或2:1，从而分别获得其中GO-PEG与卟啉二聚体盐的重量比是0.1:1、0.5:1、1:1或2:1的GO-PEG-卟啉二聚体盐复合物。
20.如权利要求17所述的GO-PEG-卟啉二聚体盐复合物，其中反应中加入的GO-PEG与卟啉二聚体盐的重量比是0.1:1、0.5:1、1:1或2:1，从而分别获得其中GO-PEG与卟啉二聚体盐的重量比是0.1:1、0.5:1、1:1或2:1的GO-PEG-卟啉二聚体盐复合物。
21.如权利要求18所述的GO-PEG-卟啉二聚体盐复合物，其中反应中加入的GO-PEG与卟啉二聚体盐的重量比是0.1:1、0.5:1、1:1或2:1，从而分别获得其中GO-PEG与卟啉二聚体盐的重量比是0.1:1、0.5:1、1:1或2:1的GO-PEG-卟啉二聚体盐复合物。
22.药物组合物，其包含权利要求1-21中任意一项权利要求所述的GO-PEG-卟啉二聚体盐复合物，并且任选地包含可药用的载体。
23.权利要求1-21中任意一项权利要求所述的GO-PEG-卟啉二聚体盐复合物在制备药物中的用途，所述药物用在荧光成像和荧光指导下的光动力疗法中，用于治疗或诊断恶性肿瘤、癌前病变、良性病变。
24.如权利要求23所述的用途，其中所述的恶性肿瘤是实体瘤。
25.如权利要求24所述的用途，其中所述的实体瘤选自膀胱癌、食管癌、支气管癌、口腔颌面部癌、鼻咽癌、肋膜间皮瘤、肝癌、胰腺癌、皮肤癌、阴茎癌、宫颈癌、乳腺癌及乳腺癌切除术后皮下转移结节、肛周肿瘤及肛周肿瘤扩大切除术后癌残留、卡波西肉瘤、肺癌、胃癌、胆管癌、前列腺癌、黑素瘤和脑肿瘤。
26.如权利要求23所述的用途，其中所述的癌前病变是巴雷特氏食管和口腔粘膜白斑。
27.如权利要求23所述的用途，其中所述的良性病变选自老年性眼底黄斑病变、动脉粥样硬化斑块、类风湿性关节炎、皮肤微血管畸形、牛皮癣和红斑狼疮皮损。
28.药盒，其包含权利要求1-21中任意一项权利要求所述的GO-PEG-卟啉二聚体盐复合物；以及将其用于荧光成像或荧光指导下的光动力疗法的说明书。
29.制备权利要求1-15中任意一项权利要求所述的GO-PEG-卟啉二聚体盐复合物的方法，其包括以下步骤：将卟啉二聚体盐的水溶液与GO-PEG水溶液混合并反应6-12小时，然后用100kD的滤器过滤，从而获得所述的GO-PEG-卟啉二聚体盐复合物。
30.制备权利要求1-15中任意一项权利要求所述的GO-PEG-卟啉二聚体盐复合物的方法，其包括以下步骤：将卟啉二聚体盐的水溶液与GO-PEG水溶液混合并在pH 5-8下反应6-12小时，然后用100kD的滤器过滤，获得GO-PEG-卟啉二聚体盐复合物。
31.制备权利要求1-15中任意一项权利要求所述的GO-PEG-卟啉二聚体盐复合物的方法，其包括以下步骤：将卟啉二聚体盐的水溶液与GO-PEG水溶液混合并在pH 7.4下反应6-12小时，然后用100kD的滤器过滤，获得GO-PEG-卟啉二聚体盐复合物。
32.如权利要求29-31中任意一项权利要求所述的方法，其中反应中加入的GO-PEG与卟啉二聚体盐的重量比是0.1:1、0.5:1、1:1或2:1，从而分别获得其中GO-PEG与卟啉二聚体盐的重量比是0.1:1、0.5:1、1:1或2:1的GO-PEG-卟啉二聚体盐复合物。
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| Intracellular Imaging with a Graphene-Based Fluorescent Probe;Cheng Peng et al.,;《small》;20101231;第6卷(第15期);说明书第2页第7段至说明书第5页第32段；说明书第13页第69段至第71段；说明书第15页第98段和说明书第25页第232段 * |
| 石墨烯衍生物在肿瘤治疗方面的研究进展;王晓敏 等;《新型炭材料》;20131031;第322页左栏第2节 * |
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