JP4359520B2 - 細胞播種基材の保管方法 - Google Patents

Description

本発明は、患者から採取した骨髄細胞、又は、骨髄細胞から分化若しくは誘導させてできた細胞を組織再生用基材に播種した細胞播種基材を、高い活性を維持したまま一時的に保管する細胞播種基材の保管方法に関する。

近年の細胞工学技術の進展によって、数々の動物細胞の単離や培養が可能となり、また、それらの細胞を用いてヒトの組織や器官を再構築しようとする、いわゆる再生医療の研究が急速に進んでいる。再生医療においては、播種した細胞が増殖分化して三次元的な生体組織様の構造物を構築できるかがポイントであり、そのためには、細胞を効率よく三次元的に培養できる組織再生用基材に播種して細胞播種基材を作製し、その後直ちに又は一定期間培養した後、該細胞播種基材を患者に移植することが行われている。

再生医療においては、ヒトの免疫反応による拒絶をいかに防ぐかが大きな課題となっているが、選択肢の一つとして患者自身の細胞（自家細胞）を用いる検討がなされている。骨髄細胞は、患者の骨髄液から比較的容易に採取できることに加え、血管内皮細胞、軟骨細胞、心筋細胞、皮膚細胞等の種々の細胞に分化できることから、その応用が試みられている。なかでも、先天性心疾患の治療、又は、狭窄や血栓等により閉塞してしまった血管の置換等に用いる再生血管は、近年の再生医療の重要なテーマの１つとして注目されており、極めて実用化に近いといえる。

再生血管等の細胞播種基材を用いた治療では、通常、まず患者の腸骨から骨髄液を採取し、得られた骨髄液を遠心分離することにより骨髄細胞を含む細胞分画、血清、赤血球及び勾配液に分離することを行う。次いで、単離した細胞分画を組織再生用基材上に播種して細胞播種基材を作製する。

ここで、得られた細胞播種基材を手術に供するまで保管しておく必要が生じる。この保管時間は、手術の進行状況によっても異なるが、通常は１〜３時間程度、場合によっては６時間程度に達することもある。しかしながら、この間の細胞播種基材の保管方法については特に検討されたこともなく、せいぜい表面が乾燥しないように、生理的食塩水を染み込ませたガーゼにくるむか、バッファー溶液や市販の培養液中に浸漬した状態で静置しているのが現状であった。
しかしながら、本発明者らが検討したところ、この保管時間中における細胞播種基材の保管方法が、治療の成功率に極めて重大な影響を与えることがわかった。

本発明は、上記現状に鑑み、組織再生用基材上に患者から採取した骨髄細胞、又は、骨髄細胞から分化若しくは誘導させてできた細胞、例えば、間葉系幹細胞、造血幹細胞等を播種した細胞播種基材を、高い活性を維持したまま一時的に保管する細胞播種基材の保管方法を提供することを目的とする。

本発明は、患者から採取した骨髄細胞、又は、骨髄細胞から分化若しくは誘導させてできた細胞を組織再生用基材に播種した細胞播種基材を保管する方法であって、前記患者から採取した骨髄液由来の血清のみの中に前記細胞播種基材を浸漬する細胞播種基材の保管方法である。
以下に本発明を詳述する。

本発明者らは、検討の結果、細胞播種基材を手術に供するまでの保管期間中に、播種して接着させた細胞の多くが組織再生用基材から剥離してしまうことを見出した。患者に移植した細胞播種基材が生着し、正常な組織、器官を再構築するためには、充分な数の細胞が細胞播種基材中に存在することが重要であり、これが治療の成功を左右するといっても過言ではない。ましてや、患者から採取可能な骨髄液は限られており、そこから分離した骨髄細胞をできる限り有効に利用すべきであることはいうまでもない。
本発明者らは、更に鋭意検討の結果、患者から採取した骨髄液に由来する血清中に細胞播種基材を浸漬しておけば、通常の手術にかかる１〜６時間程度の間、細胞の組織再生用基材からの剥離を最小限に抑制し、治療効果の高い組織を供することができることを見出し、本発明を完成するに至った。

本発明の保管方法では、細胞播種基材を、患者から採取した骨髄液由来の血清中に浸漬する。従来から、細胞保存成分としては、各種の合成培養液をそのまま用いたり、ウシ胎児をはじめとする異種動物の血清や、ＶＥＧＦ、ＨＧＦ、ｂＦＧＦ等のタンパク質性の細胞成長因子を添加した培養液を用いたりすることが知られているが、患者自身の骨髄液由来の血清を用いれば、これらの細胞保存成分を用いた場合と比較しても顕著に高い細胞の維持率を達成できる。従来、骨髄細胞を分離した後の骨髄液は廃棄する以外に使い道がなかったが、本発明では、かかる廃棄される骨髄液に含まれる血清を有効利用して、細胞播種基材を保存する。この方法によれば、患者から別に血液を採取する必要がなく、患者に与える負担を最小限に抑えることができる。更に、他種又は他家由来の生体成分やタンパク質性成分を用いた場合のような免疫反応による拒絶や、プリオン等のタンパク成分やウィルス等による感染等の生物汚染を防止することができる。

上記細胞播種基材を骨髄液由来の血清中に浸漬する方法としては特に限定されないが、例えば、保管中の汚染等を防げることから、適当な蓋付きの容器中に血清を満たし、この中に浸漬する方法が好ましい。
図１に細胞播種基材の保存容器の一例を示した。図１に示した保存容器３は、本体部３２と蓋部３１とからなり、支持棒３４で支持した状態で筒状の細胞播種基材１を血清２中に浸漬して保存することができる。本体３２の蓋側の縁部には切欠３３が設けられていることから、血清には気液交換により酸素が供給される。かかる構成において、支持捧３４の使用により、筒状の細胞播種基材１を変形しないよう支持すると共に、血清の容量を極限まで少なくする利点がある。かかる構成のものは血管用等、筒状のものを対象としたときに好適である。
また、図２に細胞播種基材の保存容器の別の一例の断面図を示した。図２に示した保存容器４は、本体部４２と蓋部４１とからなり、蓋部４１に設けられた押板４３により押さえつけることにより細胞播種基材１を血清２中に浸漬して保存することができ、この場合も血清の使用量を少なくできる。かかる発想は、他に容器全体の大きさを細胞播種基材１に対して適当なものとすることにより、より少量の血清でも保存が可能になる。また、気液界面を大きくとれることから、気液交換による血清への酸素供給効率にも優れる。
上記容器の材質としては特に限定されないが、滅菌や温度管理が容易であることから、ステンレス等からなるものが好適である。

本発明の細胞播種基材の保管方法では、細胞播種基材を骨髄由来血清中に浸漬した状態で３７℃程度の温度に保温することが好ましい。保温の方法としては特に限定されず、例えば、上記保存容器ごとインキュベータ中（５％ＣＯ_２、３７℃、湿度１００％）に静置する方法等が挙げられる。

次に、本発明の保管方法により保管する細胞播種基材について説明する。
上記細胞播種基材としては、組織再生用基材上に患者から採取した骨髄細胞、又は、骨髄細胞から分化若しくは誘導させてできた細胞を播種することにより作製されたものであれば特に限定されず、その目的により、血管、心筋、軟骨、骨、消化管、皮膚等を再生するのに用いることができる。
上記骨髄細胞は、通常、患者の腸骨から骨髄液を採取し、得られた骨髄液を遠心分離することにより、血清、赤血球及び勾配液等の他の成分から分離したものを用いることができる。なお、上述のように、この際に分離された血清は本発明の保管方法に用いる。
また、上記骨髄細胞から分化若しくは誘導させてできた細胞としては、例えば、間葉系幹細胞、造血幹細胞等が挙げられる。

上記組織再生用基材としては特に限定されないが、近年では、生体内吸収性高分子材料からなるものが好適に用いられている。生体内吸収性高分子材料を用いた組織再生用基材は、播種した骨髄細胞が増殖し分化して組織を再生するまで基材としての機能を果たし、組織を再生した後には、分解され生体内に吸収される性質を有することから、再手術等により取り出す必要がない。
上記生体内吸収性高分子材料としては特に限定されないが、例えば、ポリラクチド、ポリグリコリド、ラクチド−ε−カプロラクトン共重合体等が好適であり、なかでも、Ｌ−ラクチド−ε−カプロラクトン共重合体は、Ｌ−ラクチドとε−カプロラクトンとの配合比を調整することにより、強度や柔軟性、生体内に吸収されるまでの期間を調整できることから好ましい。

上記組織再生用基材は、１０〜５００μｍ程度の孔径の多数の微細小孔を有することが好ましい。このような微細小孔を多数有することにより、播種した骨髄細胞が上記微細小孔内に接着して三次元的に伸展することが可能となり、また、接着した骨髄細胞へ充分な栄養を供給することが可能となり、骨髄細胞を正常に増殖、分化させることができる。上記組織再生用基材の微細小孔は、貫通した孔であってもよいし、貫通しない孔であってもよい。
上記組織再生用基材の形状としては特に限定されず、例えば、シート状、チューブ状等が挙げられる。

本発明の細胞播種基材の保管方法によれば、組織再生用基材上に患者から採取した骨髄細胞等を播種した細胞播種基材を、手術に供するまでの間、細胞の剥離を最小限に抑えながら保管できる。また、他種又は他家由来の生体成分やタンパク質性成分を用いないことから、免疫反応による拒絶や、ウィルス等による生物汚染の心配もない。本発明の細胞播種基材の保管方法により保管した細胞播種基材を用いれば、高い治療効果を得ることができる。

本発明によれば、患者から採取した骨髄細胞、又は、骨髄細胞から分化若しくは誘導させてできた細胞を組織再生用基材に播種した細胞播種基材を、高い活性を維持したまま一時的に保管する細胞播種基材の保管方法を提供できる。

以下に実施例を掲げて本発明を更に詳しく説明するが、本発明はこれら実施例のみに限定されるものではない。

（実施例１）
２００デシテックスのポリグリコリド糸から編成した直径１６ｍｍの筒状平編地をテフロンロッドにかぶせ、真空下で１２０℃、３時間熱処理した。これを−８０℃に冷却し、次いでＬ−ラクチド−ε−カプロラクトン共重合体（重量平均分子量４０万、ラクチド含有量５０モル％）をジオキサンに溶解して得た４重量％の溶液にディップした。これを−８０℃で凍結し、真空度０．１Ｔｏｒｒの条件で凍結乾燥した後、７０℃、１２時間真空乾燥した。更に、ロッドから取り外して、反転してテフロンロッドにかぶせた後、−８０℃に冷却し、再度ディップし、−８０℃で凍結し、凍結乾燥した後、７０℃、１２時間真空乾燥し、ポリグリコリド繊維で補強されたＬ−ラクチド−ε−カプロラクトン共重合体からなる内径１６ｍｍ、長さ１３０ｍｍのチューブ状の血管用の組織再生用基材を得た。

体重１０ｋｇの患児の腸骨から骨髄液１００ｍＬを採取し、得られた骨髄液を遠心分離することにより骨髄細胞を含む細胞分画、血清、赤血球及び勾配液に分離した。次いで、単離した細胞分画（骨髄細胞）を５ｍＬのリン酸バッファーで希釈し、組織再生用基材に播種して、細胞播種基材を作製した。

図１に示した形状の保存容器中に上記の骨髄液から分離した血清を満たし、この中に得られた細胞播種基材を入れ、３７℃に保温したインキュベータ中に静置して１、３及び６時間保管した。

（比較例１）
骨髄液由来の血清の代わりに、リン酸緩衝食塩水（シグマ社製；ＰＢＳ）、細胞培養液（シグマ社製；ＲＰＭＩ１６４０）、成長因子（Ｒ＆Ｄシステムズ社製；ＶＥＧＦ、Ｒ＆Ｄシステムズ社製；ＨＧＦ、シグマ社製；ｂＦＧＦ：ＧＦ）を１．２５μｇ／５００ｍＬの濃度で含有する培養液（ＲＰＭＩ１６４０＋ＧＦ）、成長因子ＧＦとウシ胎児血清（モーゲイトエクスポーツプテイ社製；ＦＢＳ）をそれぞれ１．２５μｇ／５００ｍＬ及び１０重量％の濃度で含有する培養液（ＲＰＭＩ１６４０＋ＧＦ＋ＦＢＳ）を用いて保管を行った以外は実施例１と同様の方法により、細胞播種基材を作製し、これを保管した。

（評価）
実施例１及び比較例１において保管した後、細胞播種基材を直径６ｍｍに打ち抜き、細胞播種基材中の細胞数を、ＤＮＡアッセイ法により計数した。即ち、凍結融解法にて細胞膜を破壊した後、流出した細胞核内ＤＮＡに蛍光Ｈｏｅｃｈｓｔを結合させ、蛍光量を測定し、検量線から細胞数を算出した。実験は、各区についてｎ＝３で行い、その平均値を求めた。
結果を表１に示した。
また、６時間保管後の細胞播種基材の一部を採取し、その走査型電子顕微鏡像を、実施例１につていは図３に、比較例１でＰＢＳを用いた場合を図４に、比較例１でＲＰＭＩ１６４０を用いた場合を図５に、比較例１でＲＰＭＩ１６４０＋ＧＦを用いた場合を図６に、比較例１でＲＰＭＩ１６４０＋ＧＦ＋ＦＢＳを用いた場合を図７にそれぞれ示した。

本発明によれば、患者から採取した骨髄細胞、又は、骨髄細胞から分化若しくは誘導させてできた細胞を組織再生用基材に播種した細胞播種基材を、高い活性を維持したまま一時的に保管する細胞播種基材の保管方法を提供することができる。

細胞播種基材用保存容器の一例を示す模式図である。 細胞播種基材用保存容器の一例を示す断面図である。 実施例１において６時間保管後の細胞播種基材の一部の走査型電子顕微鏡像である。 比較例１（ＰＢＳ）において６時間保管後の細胞播種基材の一部の走査型電子顕微鏡像である。 比較例１（ＲＰＭＩ１６４０）において６時間保管後の細胞播種基材の一部の走査型電子顕微鏡像である。 比較例１（ＲＰＭＩ１６４０＋ＧＦ）において６時間保管後の細胞播種基材の一部の走査型電子顕微鏡像である。 比較例１（ＲＰＭＩ１６４０＋ＧＦ＋ＦＢＳ）において６時間保管後の細胞播種基材の一部の走査型電子顕微鏡像である。

符号の説明

１ 細胞播種基材
２ 血清
３ 細胞播種基材保存容器
３１ 蓋部
３２ 本体部
３３ 切欠
３４ 支持棒
４ 細胞播種基材保存容器
４１ 蓋部
４２ 本体部
４３ 押板

Claims (2)

1. 患者から採取した骨髄細胞、又は、骨髄細胞から分化若しくは誘導させてできた細胞を組織再生用基材に播種した細胞播種基材を保管する方法であって、前記患者から採取した骨髄液由来の血清のみの中に前記細胞播種基材を浸漬することを特徴とする細胞播種基材の保管方法。
2. 細胞播種基材は、血管、心筋、軟骨、骨、消化管、又は皮膚を再生することを特徴とする請求項１記載の保管方法。