JP6801042B2 - 医療用細胞シートの製造方法 - Google Patents
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Description
しかし心臓移植は、免疫抑制治療に伴う感染症の危険性、遠隔期の冠動脈硬化病変の出現、絶対的なドナー不足などが深刻な問題となっており、また現在の補助人工心臓は、血栓塞栓症・感染などの合併症、装置の耐久性の問題から患者QOLが非常に制限され、長期補助が困難である。
骨格筋に含まれる筋芽細胞は、筋肉が損傷を受けたとき分裂し修復を行う。心筋と骨格筋は構造、機能などに類似する部分が多く、そのため骨格筋由来の筋芽細胞は傷害心筋も修復し得ると考えられている。海外では自己骨格筋芽細胞の心筋への移植が臨床的に応用されつつある。
さらに、培養液には、抗酸化作用を目的としたセレンの添加が行われる場合がある。
しかし、これらの成分は臨床においてはレシピエントに対するアナフィラキシーショック等の副作用要因となり得ることが否定できない製造工程由来不純物であり、臨床への適用にあたっては排除すべき成分である。
さらに研究を続けたところ、培養液を非細胞増殖系とすることにより、細胞シートの作製において、骨格筋芽細胞の分化抑制のため添加するステロイド剤が不要となること、セレンが不要となること、また、異種血清の代わりにレシピエント由来の血清が利用可能であることなどを見出し、本発明を完成させた。
ここで含有するヒト血清は、高い安全性の確保という観点からレシピエント由来の血清を適用し、その濃度は10〜20%であることが望ましい。
これは、細胞培養液を非増殖系とすることで、同じ接着系細胞でありながら骨格筋芽細胞より増殖能が高い目的外細胞である線維芽細胞の増殖を抑える効果も示唆される結果となった。
これらの結果は、先に述べた細胞シートの作製において細胞増殖の考慮は不要とする仮定の裏付けとなる結果であり、そのため細胞分化抑制のためのステロイド剤も不要であることが明らかとなった。
したがって、成長因子やステロイド剤に加え、細胞シートの作製においてはセレン成分の添加も不要であることが示唆された。
表1にMCDB131培地とDMEM培地の組成を示す。
(1)実質的に増殖することなく細胞シートを形成し得る密度の細胞を、有効量の成長因子を含まない細胞培養液中で培養することを含む、細胞シートの製造方法。
(2)細胞が、単層の細胞シートを形成する、(1)の製造方法。
(3)培養期間中、細胞が未分化の状態に維持される、(1)または(2)の製造方法。
(4)細胞培養液が、ステロイド剤成分を実質的に含まない、(1)〜(3)の製造方法。
(5)細胞培養液が、異種血清成分を実質的に含まない、(1)〜(4)の製造方法。
(6)細胞培養液が、同種血清成分を含む、(1)〜(5)の製造方法。
(7)同種血清成分が、レシピエント由来である、(6)の製造方法。
(8)細胞培養液が、セレン成分を実質的に含まない、(1)〜(7)の製造方法。
(9)細胞培養液が、アミノ酸およびビタミン剤を成分とする基礎培地を含む、(1)〜(8)の製造方法。
(10)アミノ酸が、少なくともL−アルギニン、L−シスチン、L−グルタミン、グリシン、L−ヒスチジン、L−イソロイシン、L−ロイシン、L−リジン、L−メチオニン、L−フェニルアラニン、L−セリン、L−トレオニン、L−トリプトファン、L−チロシン、L−バリンを含む、(9)の製造方法。
(11)アミノ酸の濃度が、L−アルギニン:63.2〜84mg/L、L−シスチン:35〜63mg/L、L−グルタミン:4.4〜584mg/L、グリシン:2.3〜30mg/L、L−ヒスチジン:42mg/L、L−イソロイシン:66〜105mg/L、L−ロイシン:105〜131mg/L、L−リジン:146〜182mg/L、L−メチオニン:15〜30mg/L、L−フェニルアラニン:33〜66mg/L、L−セリン:32〜42mg/L、L−トレオニン:12〜95mg/L、L−トリプトファン:4.1〜16mg/L、L−チロシン:18.1〜104mg/L、L−バリン:94〜117mg/Lである、(10)の製造方法。
(12)ビタミン剤が、少なくともD−パントテン酸カルシウム、塩化コリン、葉酸、i−イノシトール、ナイアシンアミド、リボフラビン、チアミン、ピリドキシンを含む、(9)の製造方法。
(13)ビタミン剤の濃度が、D−パントテン酸カルシウム:4〜12mg/L、塩化コリン:4〜14mg/L、葉酸:0.6〜4mg/L、i−イノシトール:7.2mg/L、ナイアシンアミド:4〜6.1mg/L、リボフラビン:0.0038〜0.4mg/L、チアミン:3.4〜4mg/L、ピリドキシン:2.1〜4mg/Lである、(12)の製造方法。
(14)製造工程由来不純物を除去する工程を含まない、(1)〜(13)の製造方法。
(15)(1)〜(14)の製造方法で製造された細胞シート。
(16)疾病、傷病の治療に用いる細胞シートであって、成長因子、ステロイド剤、セレン成分を実質的に含まない細胞シート。
(17)異種血清成分を含有しない、(15)または(16)の細胞シート。
(18)アミノ酸およびビタミン剤を成分とする基礎培地、および同種血清は含むが、成長因子、ステロイド剤、セレン成分を実質的に含まない、細胞シート作製用培養液。
さらに、本発明の方法により、所望の大きさ・形状の細胞シートが短期間で製造できるため、細胞シートを利用した生体の処置をより柔軟かつ容易に行うことが可能となる。
本発明は、実質的に増殖することなく細胞シートを形成し得る密度の細胞を、有効量の成長因子を含まない細胞培養液中で培養することを含む、細胞シートの製造方法に関する。
本発明における細胞には、細胞シートを形成し得る任意の細胞が含まれる。かかる細胞の例としては、限定されずに、筋芽細胞(例えば、骨格筋芽細胞)、心筋細胞、線維芽細胞、滑膜細胞、上皮細胞、内皮細胞などが含まれる。これらのうち、本発明においては、単層の細胞シートを形成するもの、例えば、筋芽細胞が好ましい。細胞は、細胞シートによる治療が可能な任意の生物に由来し得る。かかる生物には、限定されずに、例えば、ヒト、非ヒト霊長類、イヌ、ネコ、ブタ、ウマ、ヤギ、ヒツジなどが含まれる。また、本発明の方法に用いる細胞は1種類のみであってもよいが、2種類以上の細胞を用いることもできる。本発明の好ましい態様において、細胞シートを形成する細胞が2種類以上ある場合、最も多い細胞の比率(純度)は、細胞シート製造終了時において、65%以上、好ましくは70%以上、より好ましくは75%以上である。
本発明の細胞シートは、好ましくはスキャフォールド(支持体)を含まない。スキャフォールドは、その表面上および/またはその内部に細胞を付着させ、細胞シートの物理的一体性を維持するために当該技術分野において用いられることがあり、例えば、ポリビニリデンジフルオリド(PVDF)製の膜等が知られているが、本発明の細胞シートは、かかるスキャフォールドがなくともその物理的一体性を維持することができる。また、本発明の細胞シートは、好ましくは、細胞シートを構成する細胞由来の物質のみからなり、それら以外の物質を含まない。
本発明において、「有効量の成長因子」とは、細胞の増殖を、成長因子がない場合に比べて、有意に促進する成長因子の量、または、便宜的に、当該技術分野において細胞の増殖を目的として通常添加する量を意味する。細胞増殖促進の有意性は、例えば、当該技術分野で知られた任意の統計学的手法、例えば、t検定などにより適宜評価することができ、また、通常の添加量は当該技術分野の種々の公知文献から知ることができる。具体的には、骨格筋芽細胞の培養におけるEGFの有効量は、例えば0.005μg/mL以上である。
ここで、「製造工程由来不純物」とは、典型的には、製造各工程に由来する以下に列挙するものが含まれる。すなわち、細胞基材に由来するもの(例えば、宿主細胞由来蛋白質、宿主細胞由来DNA)、細胞培養液に由来するもの(例えば、インデューサー、抗生物質、培地成分)、あるいは細胞培養以降の工程である目的物質の抽出、分離、加工、精製工程に由来するものなどである(例えば、医薬審発第571号参照)。
細胞シートの剥離法は、細胞シートが少なくとも部分的に、シート構造を保ったまま、足場となっている基材から剥離できれば特に限定されないが、典型的には、細胞を、温度によって表面の親水性が変化する温度反応性培養皿上で培養し、温度変化により、非酵素的に剥離する。
(1)対象から採取した組織または生体液から所望の細胞を単離する工程、
(2)単離した細胞を増殖させる工程、
(3)増殖した細胞を、実質的に増殖することなく細胞シートを形成し得る密度で、有効量の成長因子を含まない細胞培養液中で培養して、細胞シートを形成する工程、
(4)対象への適用のために、細胞シートを剥離する工程、
を含む、再生治療用細胞シートの製造方法にも関する。
本発明の細胞シートは、対象の疾病、傷病の治療に用いることができる。例えば、骨格筋芽細胞による細胞シートは、心疾患、例えば、心筋梗塞、拡張型心筋症などに用いることができる。
1.同種血清成分の検討
従来の方法では、ヒト用細胞シート作製にあたり、培養液中に公知のウシ胎仔由来血清などを加えていたが、こうした異種血清成分にはヒト感染性のウイルスなどが含まれる恐れがあるため、安全性に対する危険性が低いヒト血清成分の可能性を検討した。
播種後、37℃、5%CO2の条件で培養を行い40時間後に状態観察を実施した結果、全ての培養細胞において、三次元組織構造体としての細胞シート形成が可能であった。また、シート作製後の細胞回収率は83〜98%と、播種細胞数と比べてほぼ同一であり、細胞の増殖は実質的に認められなかった。
比較検証には、細胞生存率と純度を指標とした。
形成した細胞シートをトリプシン様蛋白分解酵素(TrypLE Select、Invitrogen製)で解離させた後、同量のTrypan Blue Stain0.4%液(Invitrogen製)を加え混和した。
混和後、細胞浮遊液を細胞が沈まないうちに10μLずつ採取し、血球計算盤(エルマ製)に注入した。注入後、直ちに倒立型光学顕微鏡(オリンパス製)にて、血球計算盤の2つのチャンバーの9mm2枠全体に観察される細胞数の計測を行った。
計測後、2つのチャンバーの生死細胞数の平均を求め、染色された細胞を含む全細胞数に対する無染色細胞の割合を算出した。
形成した細胞シートをトリプシン様蛋白分解酵素で解離させた後、遠心処理を行い上清を廃棄した。
これに0.5%BSA含PBS液を加え細胞をリンスした後、0.5%BSA含PBS液で10倍希釈した抗ヒトCD56抗体(ベクトン・ディッキンソン製)を添加し混和した。対照として0.5%BSA含PBS液で10倍希釈した陰性コントロール用抗体(ベクトン・ディッキンソン製)を添加混和したものを用意した。
各抗体を混和した後、直ちに冷暗所で約1時間反応させ0.5%BSA含PBS液を加え細胞をリンスした後、0.5%BSA含PBS液を加え解析に供した。
解析はフローサイトメーター(ベクトン・ディッキンソン製)を用い、各抗体を混和した細胞に含まれる抗体陽性細胞の割合を計測した。計測にあたっては、陰性コントロールの陽性率の補正を行い、細胞数5,000〜10,000個を解析した。
解析後、各抗体を混和した細胞の陽性細胞率の割合の差から純度を求めた。
細胞の増殖に対する成長因子の効果を確認するため、ヒト筋芽細胞3.5×104個(200個/cm2)を、0〜0.01μg/mL濃度の上皮成長因子(Invitrogen製)を添加した20%ウシ胎仔由来血清、4μg/mLリン酸デキサメタゾンナトリウム注射液(第一三共製薬製)を含有するMCDB131培地に播種し、培養10日後の細胞数を計測しその増殖能をみた。
播種後、37℃、5%CO2の条件で培養を行い40時間後に状態観察を実施した結果、いずれの細胞培養液においても、三次元組織構造体としての細胞シート形成が可能であった。
この結果から、φ3.5cm温度応答性培養皿に対し播種細胞数を3.0×106個、すなわち約3.0×105個/cm2以上にコントロールすることで、細胞増殖の考慮は不要となることが明らかとなった。
なお、使用する培養皿の有効面積に対する播種細胞数は1つの目安であり、ここに例示した培養皿有効面積と細胞数に限定されない。
外観上、細胞の形態に差が認められなかったことから、成長因子、ステロイド剤の排除に対する細胞への影響を検証した。検証には、細胞生存率と純度を指標とした。
形成した細胞シートをトリプシン様蛋白分解酵素で解離させた後、同量のTrypan Blue Stain0.4%液を加え混和した。
混和後、細胞浮遊液を細胞が沈まないうちに10μLずつ採取し、血球計算盤に注入した。注入後、直ちに倒立型光学顕微鏡にて、血球計算盤の2つのチャンバーの9mm2枠全体に観察される細胞数の計測を行った。
計測後、2つのチャンバーの生死細胞数の平均を求め、染色された細胞を含む全細胞数に対する無染色細胞の割合を算出した。
形成した細胞シートをトリプシン様蛋白分解酵素で解離させた後、遠心処理を行い上清を廃棄した。
これに0.5%BSA含PBS液を加え細胞をリンスした後、0.5%BSA含PBS液で10倍希釈した抗ヒトCD56抗体を添加し混和した。対照として0.5%BSA含PBS液で10倍希釈した陰性コントロール用抗体を添加混和したものを用意した。
各抗体を混和した後、直ちに冷暗所で約1時間反応させ0.5%BSA含PBS液を加え細胞をリンスした後、0.5%BSA含PBS液を加え解析に供した。
解析はフローサイトメーターを用い、各抗体を混和した細胞に含まれる抗体陽性細胞の割合を計測した。計測にあたっては、陰性コントロールの陽性率の補正を行い、細胞数5,000〜10,000個を解析した。
解析後、各抗体を混和した細胞の陽性細胞率の割合の差から純度を求めた。
これに対し、上皮成長因子、リン酸デキサメタゾンナトリウムを含有しない細胞培養液で作製した細胞シートでは、培養25時間後においても細胞の多核化は認められなかった。
20%ヒト血清を含有するDMEM培地(セレン成分を含まない培地)と、対照として20%ウシ胎仔由来血清、0.01μg/mL上皮成長因子、4μg/mLリン酸デキサメタゾンナトリウム注射液を含有するMCDB131培地を用意し、各々2mLあたりヒト筋芽細胞3.0×106個ずつ懸濁し、φ3.5cm温度応答性培養皿にそれぞれ播種した。
播種後、37℃、5%CO2の条件で培養を行い40時間後に状態観察を実施した結果、いずれの細胞培養液においても、三次元組織構造体としての細胞シート形成が可能であった。
形成した細胞シートをトリプシン様蛋白分解酵素で解離させた後、同量のTrypan Blue Stain0.4%液を加え混和した。
混和後、細胞浮遊液を細胞が沈まないうちに10μLずつ採取し、血球計算盤に注入した。注入後、直ちに倒立型光学顕微鏡にて、血球計算盤の2つのチャンバーの9mm2枠全体に観察される細胞数の計測を行った。
形成した細胞シートをトリプシン様蛋白分解酵素で解離させた後、遠心処理を行い上清を廃棄した。
解析後、各抗体を混和した細胞の陽性細胞率の割合の差から純度を求めた。
Claims (4)
- 心疾患の処置に用いるための細胞シートの製造方法であって、骨格筋芽細胞を、該細胞が実質的に増殖しない密度で播種する工程、および、骨格筋芽細胞を細胞培養液中で培養して細胞シートを形成させる工程を含み、前記密度が、前記骨格筋芽細胞がコンフルエントに達する密度またはそれ以上である、前記方法。
- 心疾患が心筋梗塞または拡張型心筋症である、請求項1に記載の方法。
- 細胞培養液が同種血清を含む、請求項1または2に記載の方法。
- 播種密度がコンフルエントに達する密度またはそれ以上の密度である数の骨格筋芽細胞と、同種血清と、培養容器とを含む、請求項3に記載の方法に用いるための組合せ。
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