JPH11127851A - 抗原特異的免疫抑制性細胞の誘導増殖方法およびこれに用いる培養器具 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 効率よく免疫抑制性細胞を誘導増殖し、免疫
系の異常亢進を伴う疾患の効率的で副作用の少ない治療
システムを提供すること。 【解決手段】 １種以上の抗原存在下で培養したヒト細
胞を、１種以上の蛋白質を固定化した培養器具で、さら
に培養することによる該抗原に特異的免疫抑制性細胞の
誘導増殖方法およびこれに用いる培養器具。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、免疫抑制性細胞、
特に抗原特異的な免疫抑制性細胞の誘導増殖方法および
これに用いる培養器具に関する。さらに詳しくは、予め
抗原と培養したヒト細胞を、抗体を固定化した培養器具
でさらに培養することによる該抗原に特異的免疫抑制性
細胞の誘導増殖方法およびこれに用いる培養器具に関す
る。

【０００２】

【従来の技術】自己免疫疾患および移植時の拒絶反応は
宿主の細胞が自己の細胞や移植された臓器を異物として
認識し、破壊することにより引き起こされる疾患であ
り、その破壊に関与する自己細胞あるいは移植臓器特異
的傷害性細胞を抑制する免疫抑制性細胞の量的あるいは
質的な異常がその原因であるとする例がいくつか知られ
ている（マッキントッシュ（Ｍａｃｉｎｔｏｓｈ）およ
びドラクマン（Ｄｒａｃｈｍａｎ）、サイエンス（Ｓｃ
ｉｅｎｃｅ）２３２巻、４０１頁（１９８６年）参
照）。バラショフ（Ｂａｌａｓｈｏｖ）らの報告（バラ
ショフら、ジャーナル・オブ・クリニカル・インベステ
ィゲーション（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａ
ｌ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ）９５巻、２７１１頁
（１９９５年）参照）では、ＭＳ（多発性硬化症）患者
においては自己混合リンパ球反応による免疫抑制性Ｔ細
胞の誘導効率に著しい低下がみられ、それが同疾患発症
の原因としている。したがってそのような患者の免疫抑
制性細胞、それも特に自己の細胞あるいは移植された臓
器を特異的に認識し、攻撃するＴ細胞を特異的に抑制す
る細胞（以下、抗原特異的免疫抑制性細胞と呼ぶ）を回
復させることはその治療法としてきわめて有効であると
考えられる。これまで、抗原特異的免疫抑制性Ｔ細胞の
誘導例としてはフレズノ（Ｆｒｅｓｎｏ）ら（フレズノ
ら、ジャーナル・オブ・エクスペリメンタル・メディシ
ン（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ
Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）１６３巻、１２４６頁（１９８０
年）参照）らの正常マウスでのインビボ誘導例、また実
際、疾患モデル動物を用いた系での抑制性細胞による治
療例としてハリソン（Ｈａｒｒｉｓｏｎ）ら（ハリソン
ら、ジャーナル・オブ・エクスペリメンタル・メディシ
ン（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ
Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）１８４巻、２１６７頁（１９９６
年）参照）等マウスなどの動物を用いた系でいくつか報
告されている。また、ヒトでの抗原特異的免疫抑制細胞
誘導例として、ダムル（Ｄａｍｌｅ）ら（ダムルら、ジ
ャーナル・オブ・イムノロジー（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ
Immunology）１３２巻、６４４頁（１９８４年）参
照）のＰＰＤ抗原特異的抑制細胞をインビトロで誘導し
ている例、あるいは、同じくダムルら（ダムルら、ジャ
ーナル・オブ・エクスペリメンタル・メディシン（Ｊｏ
ｕｒｎａｌ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｍｅｄ
ｉｃｉｎｅ）１５８巻、１５９頁（１９８３年）参照）
のアロ細胞特異的抑制性細胞をインビトロで誘導してい
る例がある。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】インビトロで抗原特異
的な免疫抑制性細胞を誘導することは自己免疫疾患治療
あるいは臓器移植の拒絶反応の抑制を行う時、その抑制
能、特異性を確認した上で治療に用いることができると
いう点で安全かつ効果的な方法であるといえる。ところ
が一般的にインビトロでの抗原特異的免疫抑制性細胞の
誘導は用いる抗原によってその効率にかなり差があり、
用いる抗原すべてについて効率的に誘導を行い、大量の
抑制性細胞を得ることは難しい。

【０００４】

【課題を解決するための手段】本発明者らは上記課題を
解決すべくＰＰＤをモデル抗原として効率的に抗原特異
的免疫抑制性細胞を作製する方法を鋭意検討した結果、
患者の血液細胞を体外に取り出し、抗原特異的免疫抑制
性細胞を誘導、増殖させ、再び戻すことにより、強い抗
原特異的免疫抑制能を保ったまま、大量の抗原特異的免
疫抑制性細胞を作製することに成功し、本発明を完成す
るに至った。

【０００５】即ち、本発明の第１は、１種以上の抗原存
在下で培養したヒト細胞を、１種以上の蛋白質を固定化
した培養器具で、さらに培養することによる該抗原に特
異的免疫抑制性細胞の誘導増殖方法に関する。また本発
明の第２は、１種以上の抗原存在下で培養したヒト細胞
を、１種以上の蛋白質を固定化した培養器具で、さらに
培養することによる該抗原に特異的免疫抑制性細胞の培
養器具に関する。

【０００６】

【発明の実施の形態】以下、本発明について詳述する。
本発明に用いる「ヒト細胞」とは、ヒトの体を構成する細
胞およびこれに由来する細胞であり、たとえばヒト末梢
血細胞、ヒト腹腔細胞、ヒト胸腺細胞、ヒト骨髄細胞、
ヒト株化Ｔ細胞などがあげられる。細胞移入という方法
で実際に患者の治療を行う場合、免疫の拒絶反応あるい
は抑制効果を考えてもその患者自身の細胞を用いること
が最も望ましく、そのなかでもヒト末梢血細胞が採取の
容易さの点で好ましい。末梢血細胞は、ヒトからの採血
により得た静脈血を５０ｍｌのポリスチレンチューブに
入れたフィコール（フィコールパック（Ｆｉｃｏｌｌ−
Ｐａｑｕｅ）：ファルマシア社製）の上に重層し、１分
間１５００回転で２０分間遠心することにより、境界面
に形成されるリンパ球、単球画分を分離し、ＲＰＭＩ−
１６４０培地で３回洗浄することにより得られる（フィ
コール遠心分離法）。Ｔ細胞は、こうして得られたヒト
末梢血細胞を培養液中に播種して一晩培養したのち、浮
遊細胞を集めることにより得られる。

【０００７】本発明に用いる「蛋白質」とは、細胞表面
抗原、細胞表面抗原やサイトカイン受容体に対する抗体
またはその誘導体、サイトカイン等があげられるが、効
率的な細胞増殖活性を誘導する点でヒト細胞の細胞表面
抗原に対する抗体、サイトカインが好ましい。これらの
蛋白質は、単独または二種以上を併用することができ
る。

【０００８】「細胞表面抗原に対する抗体」とは、細胞と
細胞の接着を媒介する機能を有する蛋白質に対する抗体
あるいは接着時に二次的に相手細胞上の分子との結合に
関与する蛋白質に対する抗体、そして種々のサイトカイ
ンに対する受容体に対する抗体をいうが、たとえば免疫
グロブリン・スーパー・ファミリー、インテグリン・ス
ーパーファミリー、カドヘリンなどに対する抗体あるい
はＩＬ−２受容体があげられる。好ましくは、免疫グロ
ブリン・スーパー・ファミリー、とくに好ましくは、ヒ
トＴ細胞のＣＤ２抗原あるいはＣＤ３抗原に対する親和
性を有する抗体およびその類似体である。

【０００９】ここで「ＣＤ２抗原に対する抗体（抗ＣＤ
２抗体）」としては、ＣＤ２抗原の種々のエピトープに
対するモノクローナル抗体あるいはＣＤ２抗原に対する
ポリクローナル抗体などがあげられるが、好ましくは抗
ＣＤ２抗体ＴＳ２／１８、抗ＣＤ２抗体３５．１があげ
られる。またこれらのＦ（ａｂ）２断片も使用可能であ
る。

【００１０】また「ＣＤ３抗原に対する抗体（抗ＣＤ３
抗体）」としては、同じくＣＤ３抗原を認識するモノク
ローナル抗体あるいはポリクローナル抗体などがあげら
れるが、好ましくは抗ＣＤ３抗体ＯＫＴ３があげられ
る。またこれらのＦ（ａｂ）２断片も使用可能である。
「ＣＤ２抗原の異なるエピトープを認識する抗体」とは、
ＣＤ２表面抗原分子の異なる部分を認識し、結合する抗
体を意味する。この抗体は、二種以上を併用することが
できる。１種では、細胞増殖効率が不充分な場合もある
からである。

【００１１】「サイトカイン」としては、ＩＬ−１，ＩＬ
−２，ＩＬ−３，ＩＬ−４，ＩＬ−５，ＩＬ−６，ＩＬ
−７、ＩＬ−８、ＩＬ−８レセプターファミリー、ＩＬ
−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１
３、ＩＬ−１３、ＩＬ−１５、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳ
Ｆ、ＴＧＦ−β、ＴＮＦ−α、ＴＮＦ−β、ＩＦＮ−
α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−γ、マクロファージ活性化因
子、マクロファージ遊走阻止因子等があげられるが、特
にＩＬ−２が好ましい。これらのサイトカインは、単独
または二種以上を併用することができる。ＩＬ−２は末
梢血から分離したものでも、また遺伝子組み替えにより
調製したものでもよい。

【００１２】本発明に用いる「抗原」とは、自己免疫疾
患の原因となる抗原、異種および同種の移植臓器由来の
抗原、結核菌抗原ＰＰＤ抗原（Purified Protein Deriv
ative）、破傷風抗原ＴＴ（Tetanus Toxid）等の免疫抑
制性細胞の誘導のためのモデル抗原などがあげられる。
これらの抗原は、単独または二種以上を併用することが
できる。

【００１３】「自己免疫疾患の原因となる抗原」として
は、インスリン依存型糖尿病、リウマチ、潰瘍性大腸
炎、橋本甲状腺炎、多発性硬化症などの原因抗原があげ
られる。「インスリン依存型糖尿病の原因抗原」として
は、インスリン、プロインスリン、ＧＡＤ、ＩＡ−２、
カルボキシペプチダーゼＨ、ウィルスなどがあげられ
る。

【００１４】「リウマチの原因抗原」としては、コラー
ゲン、ウィルスなどがあげられる。「異種および同種の
移植臓器由来の抗原」としては、該移植臓器の拒絶に関
与するところの抗原などがあげられる。本発明でいう
「免疫抑制性細胞」とは、免疫反応を抑制する能力を有す
る細胞をいう。この免疫応答抑制活性の測定は、たとえ
ば異なる２つあるいはそれ以上の数の個体から調製した
末梢血細胞を混合する反応系（ＭＬＲ）、あるいはある
抗原に対する反応性を持つＴ細胞（メモリーＴ細胞）を
持つ個体の末梢血細胞とその抗原を混合する反応系など
を用いて行うことができる。例えばインビトロにおいて
同一人から新たに得たヒト末梢血細胞（以下、ＰＢＬと
呼ぶ）に、免疫抑制性を有すると思われる細胞を加え、
さらにＰＰＤ（ピュアリファイド・プロテイン・デリバ
チブ（Ｐｕｒｉｆｉｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄｅｒｉｖ
ａｔｉｖｅ）日本ビーシージー社製）を加えて３７℃、
５％ＣＯ２の条件下で数日間培養したのち、[³H]チミジ
ンを添加し、さらに５〜１６時間培養したのち、細胞中
の放射活性をシンチレーションカウンターで測定するこ
とにより行うことができる。

【００１５】本発明でいう「抗原特異的な免疫抑制性細
胞」とは上記の免疫抑制性細胞に含まれるもので、免疫
抑制性細胞の中でも特にある抗原に対して特異的に活性
化される細胞のみを選択して抑制する細胞を指し、例と
して本明細書の実施例中のＰＰＤであらかじめ培養する
ことにより得られた細胞で、ＰＰＤで刺激することによ
る細胞の活性化の系に加え培養することによりこの活性
化を抑制する能力を持つ細胞をあげることができる。

【００１６】本発明における抗原特異的免疫抑制性細胞
の誘導増殖方法を以下に説明する。１−１０％のオート
ローガス血清を含む培地で調製したヒト細胞を培養プレ
ートに分注する。各ウェルに抗原を加え、３〜７日間培
養する。該細胞を血清を含まない培地で洗浄した後、１
−１０％のオートローガス血清を含む培地に懸濁し、抗
原特異的免疫抑制性細胞を誘導する。

【００１７】抗原の使用量は０．１〜１０μｇ／ｍｌが
好ましい。少なすぎる場合には充分量の抗原特異的免疫
抑制性細胞が誘導されない可能性があり、多すぎる場合
には用いる細胞量が律速となり上記の抗原使用量での誘
導以上の誘導は得られない可能性があるとともに細胞に
対する毒性を考慮する必要もあり好ましくない。ここで
用いることができる培地としては、たとえば動物培養用
培地、Ｄ−ＭＥＭやＲＰＭＩ−１６４０があげられる。
また、培地に血清を含有させてもよい。好ましくは自己
血清を用いる。自己血清とは、培養に用いるヒト細胞と
同じ個体よりえられた血清をいう。自己血清を用いると
細胞増殖性がよく、非特異的免役反応も起こりにくく、
最ものぞましい。血清の添加量はとくに限定されない
が、０．５〜１０ｖ／ｖ％が一般的である。

【００１８】次に１種以上の抗原存在下で培養すること
により誘導した抗原特異的免疫抑制性細胞を、前記の細
胞表面抗原、細胞表面抗原やサイトカイン受容体に対す
る抗体またはその誘導体、サイトカイン等の蛋白質を固
定化した培養器具で培養することにより、免疫抑制性細
胞が増殖できる。固定化する蛋白質の量は、用いる蛋白
質によって異なり、とくに限定されないが、０．１〜１
０μｇ／ｍｌが好ましい。少なすぎる場合には、免役抑
制活性の誘導が行われないおそれがあり、多すぎる場合
には、細胞に傷害を与える可能性がある。

【００１９】蛋白質の固定化方法としては、一般的に疎
水結合、イオン結合、共有結合を利用した方法が用いら
れ、簡便な方法として蛋白質に親和性を有する部材に疎
水結合を利用して固定化する方法、またより強固に固定
化する方法として固定化する蛋白質と親和性を有する部
材を共有結合させる方法があげられる。用いることがで
きる培地としては、たとえば動物培養用培地、Ｄ−ＭＥ
ＭやＲＰＭＩ−１６４０があげられる。また、培地に血
清を含有させてもよい。好ましくは自己血清を用いる。
自己血清とは、培養に用いるヒト細胞と同じ個体よりえ
られた血清をいう。自己血清を用いると細胞増殖性がよ
く、非特異的免役反応も起こりにくく、最ものぞまし
い。血清の添加量はとくに限定されないが、０．５〜１
０ｖ／ｖ％が一般的である。ヒト細胞をこのような培地
中で、通常３７℃、５％ＣＯ₂の条件下で好ましくは１
〜７日間、より好ましくは１〜７日間、特に好ましくは
１〜３日間培養することにより、免疫抑制性細胞が増殖
できる。

【００２０】本発明で用いる培養器具は細胞毒性のない
滅菌可能で蛋白質に親和性を持つ部材であればよく、一
般的にはプラスチック系あるいはガラス系の部材が好ま
しい。プラスチック系部材とは熱硬化性樹脂と熱可塑性
樹脂を意味し、成型性が優れているという理由でポリマ
ーがより好ましく、蛋白に対する親和性が高く、無色透
明であるという理由でポリスチレンがとくに好ましい。
ガラス系部材とはケイ酸塩、ホウ酸塩、リン酸塩などが
結晶することなく固化したもの（ガラス化という）を意
味し、ガラス化傾向が強いという理由でケイ酸塩ガラス
がより好ましく、成型性に富み、対衝撃性が高いという
理由でケイ酸塩ガラスを熱処理することによりつくる結
晶化ガラスが特に好ましい。また、培養器具に蛋白質に
対する親和性を付与するため、部材に蛋白質の吸着性を
高める処理を行ってもよい。通常細胞培養に用いられる
培養器具はコラーゲンなどの蛋白質で固定化されている
ので、蛋白質の吸着性を低下させており本発明に用いる
部材としては好ましくない。本発明に用いる細胞培養器
具において細胞が直接接着する部材面の形状的として
は、蛋白質の固定化を均一に行い、さらに細胞の接着を
均一に効率的に行う必要があるので、平板状あるいは球
状形が好ましい。さらに好ましくは培養器具は平板プレ
ート状閉鎖系容器または球状微粒子を充填した閉鎖系容
器である。平板状のものでは通常の培養フラスコ、培養
ディッシュ、培養プレートの形状をしたものまたは図１
−（ａ）〜（ｃ）に示したような多段式のプレートが使
用可能である。図１に示された多段式プレートは本発明
の培養器具の実施の一形態である。図１（ａ）に示すよ
うに、矢印の方向からヒト細胞１を含む細胞懸濁液２が
添加される。図１（ｂ）に示すように培養時は図１
（ａ）の器具を９０゜回転させる。培養時には通気性フ
ィルターをへて５％ＣＯ₂が送られ、誘導された免疫抑
制性細胞はやや強く振とうすることによってはがされ細
胞回収口から得られる。図１（ｃ）は図１（ｂ）を上か
ら見た図である。このような多段式プレートを用いる場
合、一度に多くの細胞を処理できるだけでなく、一度に
複数の異なる機能を有する細胞を誘導作製できる利点が
ある。たとえば固定化する抗体を変えることにより免疫
抑制性の細胞および免疫抑制機構を賦活する能力を有す
る細胞を同時に誘導することが可能である。部材が球状
形のものでは小型球形ビーズを図２に示したような容器
に入れ使用することが可能である。

【００２１】図２に示された容器は本発明の実施の別の
形態である。図２中、５％ＣＯ₂は通気性フィルター２
３をへて、ヒト細胞を含有する細胞懸濁液２２に送られ
る。球状微粒子２５は細胞懸濁液２２中に存在しヒト細
胞が接着している。誘導された免疫抑制性細胞は球状微
粒子に接着したままコック２６をあけて回収される。２
７は側壁を示す。そののち、生理食塩水などで洗浄する
ことにより、誘導された細胞が得られる。

【００２２】本発明では主にＥＬＩＳＡ反応に用いる平
板状のプラスチックプレートを器具として用いるのがと
くに好ましい。本発明で誘導増殖された抗原特異的免役
抑制性細胞の投与経路は限定されないが、カテーテルな
どの医療器具を用い、全身または局所に投与されるのが
望ましい。

【００２３】投与される細胞量としては、投与の目的、
すなわち疾病の種類および投与する患者の症状の程度に
よっても異なるが、成人一日あたり細胞数として１０⁶
〜５×１０⁸個、好ましくは１０⁶〜１０⁸個、特に好ま
しくは１０⁶個である。本発明の抗原特異的免疫抑制性
細胞の誘導増殖方法は、簡便にかつ効率的に抗原特異的
免疫抑制性細胞を誘導増殖する方法を提供するもので、
種々の自己免疫疾患や臓器移植の拒絶反応の抑制を目的
とした治療において、副作用が少なくかつ効率的な方法
を提供するものである。

【００２４】

【実施例】以下、実施例により本発明をさらに詳しく説
明するが、本発明はこれらの実施例により何ら限定され
るものではない。 実施例１ 抗原特異的免疫抑制性細胞の誘導 １０％のオートローガス血清を含むＲＰＭＩ−１６４０
（シグマ社製）で１×１０⁶／ｍｌの濃度に調製した健
常成人ヒト末梢血細胞を１２穴ウェル平底プレートに２
ｍｌずつ分注した。各ウェルに結核菌抗原ＰＰＤ（日本
ビーシージー社製）を終濃度１μｇ／ｍｌになるように
加え、７日間培養した。培養７日後の細胞数は８×１０
⁵／ｍｌであった。同細胞を血清を含まないＲＰＭＩ−
１６４０培地で３回洗浄した後に１０％オートローガス
血清を含むＲＰＭＩ−１６４０培地中に０．２５×１０
⁶／ｍｌになるように懸濁し、細胞懸濁液を得た。 実施例２ 抗体固定化プレートで処理したヒト末梢血細
胞の調製 あらかじめ抗ＣＤ３抗体ＯＫＴ３（オース・ダイアグノ
スティック・システム・インク（Ｏｒｔｈ Ｄｉａｇｎ
ｏｓｔｉｃ Ｓｙｓｔｅｍ Ｉｎｃ．）社製）と抗ＣＤ
２抗体ＴＳ２／１８（ＡＴＣＣ ＨＢ１９５）または抗
ＣＤ２抗体３５．１（ＡＴＣＣ ＨＢ２２２）を各１０
μｇ／ｍｌの濃度で４８穴プレート（コースター（Ｃｏ
ｓｔａｒ）社製）に各１００μｌずつ固定化（１晩４℃
で放置）したものをＰＢＳで洗浄した後に、実施例１で
ＰＰＤ処理した細胞懸濁液を各３００μｌ添加し、５％
ＣＯ₂インキュベーター中、３７℃で７日間培養した。
このとき比較コントロールとして、なにも固定化してい
ないウェル（ＰＰＤ処理のみ）およびＩＬ−２（ベクト
ン・ディッキンソン社製）を２００Ｕ／ｍｌ添加したも
のを用いた。７日間の培養後の細胞数は抗ＣＤ３抗体Ｏ
ＫＴ３と抗ＣＤ２抗体ＴＳ２／１８、抗ＣＤ３抗体ＯＫ
Ｔ３と抗ＣＤ２抗体３５．１、ＩＬ−２、なにも固定化
していないウェルで各々、１．４×１０⁶／ｍｌ、１．
０×１０⁶／ｍｌ、２．１×１０⁶／ｍｌ、０．４×１０
⁶／ｍｌで抗体処理あるいはＩＬ−２処理により顕著な
増殖がみられた（図３）。培養後、各穴の細胞を回収
し、３回ＰＢＳで洗浄した後に該細胞を１０％のオート
ローガス血清を含むＲＰＭＩ−１６４０培地１００μｌ
になるように懸濁し、細胞懸濁液を得た。 実施例３ 免疫抑制能の評価 正常なヒトから採取した末梢血から、１０％オートロー
ガス血清を含むＲＰＭＩ−１６４０培地を用いて１×１
０⁶／ｍｌの正常ヒト末梢血細胞懸濁液を調製し、９６
穴丸底プレート（コーニング社製）に１００μｌずつ分
注した。各ウェルにＰＰＤを終濃度１．０μｇ／ｍｌあ
るいは破傷風菌抗原ＴＴを加え、同時に実施例１、２で
得られた細胞をウェルあたり１×１０⁵個添加し、５％
ＣＯ₂インキュベーター中、３７℃で５日間培養した。
その後、１μＣｉの[³H]チミジンを各ウェルに添加し、
１５時間培養した後に細胞をセルハーベスター（ラボマ
ッシュ（ＬＡＢＯ ＭＡＳＨ）、ラボサイエンス（ＬＡ
ＢＯ ＳＣＩＥＮＣＥ）社製）を用いて集め、その細胞
中に取り込まれた[³H]の放射活性をシンチレーションカ
ウンターＬＳＣ−７００（アロカ（Ａｌｏｋａ）社製）
を用いて測定した。ポジティブコントロールとして、実
施例１の細胞を加えるかわりに、３０μｌの１０％のオ
ートローガス血清を含むＲＰＭＩ−１６４０培地を加え
たウェルを測定対象とした。

【００２５】その結果、図４及び図５に示すように、Ｐ
ＰＤ−Ｔ細胞活性化の系に供せられたヒト細胞に対し
て、等量の実施例１で処理した細胞を加えることによ
り、約４０％の抑制を示した（図４）。それに対して、
ＴＴ−Ｔ細胞活性化の系では等量の細胞数を加えてもま
ったく抑制が観察されず、逆に[³H]の取り込み増が観察
された（図５）。すなわち抗原、この場合はＰＰＤに対
して特異的な抑制性細胞が誘導されたことを示してい
る。つぎに図６に示すように、実施例２で抗体処理した
細胞を等量（３０μｌ／ウェル）添加したもの（抗ＣＤ
３抗体ＯＫＴ３と抗ＣＤ２抗体ＴＳ２／１８、抗ＣＤ３
抗体ＯＫＴ３と抗ＣＤ２抗体３５．１）でＰＰＤ−Ｔ細
胞活性化の系への影響を調べたところ共に９５％以上の
抑制を示した。それに対してＩＬ−２処理では約９０
％、PPD処理のみでは約３５％の抑制を示しただけであ
った。抗体等による増殖により抑制能の低下があるかど
うかを検討するために、単位細胞あたりの抑制能を算出
した。なお陽性対照としては、処理した細胞を加えずＰ
ＰＤのみを加えた場合のＴ細胞の[³H]の取り込み量を用
いた。

【００２６】その結果、図７に示すように、抗体処理、
特に抗ＣＤ３抗体ＯＫＴ３と抗ＣＤ２抗体３５．１の組
み合わせによる増殖後では単位細胞あたりの抑制能はコ
ントロールの無処理と比べ、まったく低下していなかっ
た。抗ＣＤ３抗体ＯＫＴ３と抗ＣＤ２抗体ＴＳ２／１８
との組み合わせでは２５％の低下、ＩＬ−２処理では約
半分に低下していることが観察された。これらから抗Ｃ
Ｄ３抗体ＯＫＴ３と抗ＣＤ２抗体３５．１の組み合わせ
が抗原特異的抑制能を保ったまま細胞を増殖させるため
に最も適したものであることがわかった。

【００２７】以上の結果は、抗原で処理することで誘導
した抗原特異的抑制性細胞を固定化した抗体で処理する
ことにより、その抑制能を失うことなく、増殖させるこ
とを可能にすることを示す例であり、実施例に含まれな
い抗ＣＤ３抗体ＯＫＴ３単独の系、異なるエピトープを
認識する２種類の抗ＣＤ２抗体の組み合わせでＴ細胞を
増殖させる系でも同様の効果が期待できる。

【００２８】

【発明の効果】本発明により、抗原存在下での培養で誘
導された抗原特異的免疫抑制性細胞を、抗体あるいはサ
イトカインを固定化した培養器具で効率的に増殖させる
ことで、免疫系の異常亢進を伴う疾患の効率的で副作用
の少ない治療システムを提供することができる。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明の培養器具の一実施例の説明図であっ
て、（ａ）はヒト細胞添加時の断面説明図、（ｂ）は培
養時（ａ）を９０゜回転させた断面説明図、および
（ｃ）は（ｂ）の上面説明図である。

【図２】本発明の培養器具の他の実施例の断面説明図で
ある。

【図３】本発明の実施例１により得られた抗原特異的免
疫抑制性細胞を実施例２で示すところの抗体あるいはＩ
Ｌ−２固定化培養器具で処理した後の細胞数を表す。

【図４】実施例１で得られた細胞のＰＰＤ抗原特異的活
性化反応に対する抑制能力を示す図である。

【図５】実施例２で得られた細胞のＴＴ抗原特異的活性
化反応に対する抑制能力を示す図である。

【図６】実施例２で得られた細胞を実施例３に記載した
条件、抗体あるいはＩＬ−２を固定化した培養器具で培
養した後の培養液単位体積あたりに含まれる細胞による
ＰＰＤ抗原特異的活性化反応の抑制能力を示す図であ
る。

【図７】実施例２で得られた細胞を実施例３に記載した
条件、抗体あるいはＩＬ−２を固定化した培養器具で培
養した後の培養液の単位細胞あたりのＰＰＤ抗原特異的
活性化反応の抑制能力（ＰＰＤ処理のみを１００とす
る）を示す図である。

【符号の説明】

１ ヒト細胞 ２、２２ 細胞懸濁液 ３、２３ 通気性フィルター ４ 細胞回収口 ２５ 球形微粒子 ２６ コック ２７ 側壁

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ａ６１Ｋ 38/28 ＡＢＧ Ｃ０７Ｋ 16/24 39/00 16/28 Ｃ０７Ｋ 16/24 Ｇ０１Ｎ 33/564 Ｂ 16/28 Ａ６１Ｋ 37/02 ＡＤＰ Ｇ０１Ｎ 33/564 37/26 ＡＢＧ

Claims (30)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 １種以上の抗原存在下で培養したヒト細
   胞を、１種以上の蛋白質を固定化した培養器具で、さら
   に培養することによる該抗原に特異的免疫抑制性細胞の
   誘導増殖方法。
2. 【請求項２】 固定化する蛋白質がヒト細胞の表面抗原
   に対する抗体である請求項１記載の誘導増殖方法。
3. 【請求項３】 固定化する抗体が抗ＣＤ２抗体および抗
   ＣＤ３抗体である請求項１記載の誘導増殖方法。
4. 【請求項４】 抗ＣＤ２抗体がＣＤ２抗原の異なるエピ
   トープを認識する２種以上の抗体である請求項３記載の
   誘導増殖方法。
5. 【請求項５】 固定化する抗体が抗ＣＤ３抗体ＯＫＴ３
   である請求項３記載の誘導増殖方法。
6. 【請求項６】 固定化する抗体が抗ＣＤ２抗体ＴＳ２／
   １８と抗ＣＤ３抗体ＯＫＴ３である請求項３記載の誘導
   増殖方法。
7. 【請求項７】 固定化する抗体が抗ＣＤ２抗体３５．１
   と抗ＣＤ３抗体ＯＫＴ３である請求項３記載の誘導増殖
   方法。
8. 【請求項８】 固定化する蛋白質が１種以上のサイトカ
   インである請求項１記載の誘導増殖方法。
9. 【請求項９】 サイトカインがＩＬ−２である第８項記
   載の誘導増殖方法。
10. 【請求項１０】 抗原が自己免疫疾患の原因となる抗原
    である請求項１記載の誘導増殖方法。
11. 【請求項１１】 自己免疫疾患がインスリン依存性糖尿
    病である請求項１０記載の誘導増殖方法。
12. 【請求項１２】 抗原がインスリン、プロインスリン、
    又はＧＡＤである請求項１０又は１１記載の誘導増殖方
    法。
13. 【請求項１３】 自己免疫疾患がリウマチである請求項
    １０記載の誘導増殖方法。
14. 【請求項１４】 抗原が異種および同種の移植臓器由来
    のものである請求項１記載の誘導増殖方法。
15. 【請求項１５】 抗原が異種および同種の移植臓器由来
    のもので、該移植臓器の拒絶に関与するところの抗原で
    ある請求項１記載の誘導増殖方法。
16. 【請求項１６】 １種以上の抗原存在下で培養したヒト
    細胞を、１種以上の蛋白質を固定化した培養器具で、さ
    らに培養することによる該抗原に特異的免疫抑制性細胞
    の培養器具。
17. 【請求項１７】 固定化する蛋白質がヒト細胞の表面抗
    原に対する抗体である請求項１６記載の培養器具。
18. 【請求項１８】 固定化する抗体が抗ＣＤ２抗体および
    抗ＣＤ３抗体である請求項１６記載の培養器具。
19. 【請求項１９】 抗ＣＤ２抗体がＣＤ２抗原の異なるエ
    ピトープを認識する２種以上の抗体である請求項１８記
    載の培養器具。
20. 【請求項２０】 固定化する抗体が抗ＣＤ３抗体ＯＫＴ
    ３である請求項１８記載の培養器具。
21. 【請求項２１】 固定化する抗体が抗ＣＤ２抗体ＴＳ２
    ／１８と抗ＣＤ３抗体ＯＫＴ３である請求項１８記載の
    培養器具。
22. 【請求項２２】 固定化する抗体が抗ＣＤ２抗体３５．
    １と抗ＣＤ３抗体ＯＫＴ３である請求項１８記載の培養
    器具。
23. 【請求項２３】 固定化する蛋白質が１種以上のサイト
    カインである請求項１６記載の培養器具。
24. 【請求項２４】 サイトカインがＩＬ−２である請求項
    ２３記載の培養器具。
25. 【請求項２５】 抗原が自己免疫疾患の原因となる抗原
    である請求項１６記載の培養器具。
26. 【請求項２６】 自己免疫疾患がインスリン依存性糖尿
    病である請求項２５記載の培養器具。
27. 【請求項２７】 抗原がインスリン、プロインスリン、
    又はＧＡＤである請求項２５又は２６記載の培養器具。
28. 【請求項２８】 自己免疫疾患がリウマチである請求項
    ２５項記載の培養器具。
29. 【請求項２９】 抗原が異種および同種の移植臓器由来
    のものである請求項１６記載の培養器具。
30. 【請求項３０】 抗原が異種および同種の移植臓器由来
    のもので、該移植臓器の拒絶に関与するところの抗原で
    ある請求項１６記載の培養器具。