JPH10295368A - ガンマー・デルタｔ細胞の製造法及び免疫治療剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 採血直後の新鮮末梢血中に含まれる比較的少
量のリンパ球から、ガンマー・デルタＴ細胞を効率よく
増殖し、製造する方法及び癌等の治療法の１つである養
子免疫療法に有用は免疫治療剤を提供する。 【解決手段】 リンパ球からＣＤ１６陽性細胞を除いた
後、培養することを特徴とするガンマー・デルタＴ細胞
の製造法及びこの製造法により得られるガンマー・デル
タＴ細胞を含有してなる免疫治療剤。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、ガンマー・デルタ
Ｔ細胞の製造法及び免疫治療剤に関する。

【０００２】

【従来の技術】ガンマー・デルタＴ細胞は、Ｔ細胞受容
体ガンマー・デルタ鎖を有し、ほとんどがＣＤ３⁺ＣＤ
４^-ＣＤ８^-分化抗原（なお、＋は陽性、−は陰性を意味
する。以下同様。）を発現するＴ細胞である。ガンマー
・デルタＴ細胞は、末梢血中には全リンパ球の３〜５％
程度の少数が含まれるにすぎない。末梢血中のＴリンパ
球の大多数は、従来「ヘルパー／インデューサーＴ細
胞」といわれるＣＤ３⁺ＣＤ４⁺ＣＤ８^-抗原を有する細
胞、「キラー／サプレッサーＴ細胞」といわれるＣＤ３
⁺ＣＤ４^-ＣＤ８⁺抗原を有する細胞であり、Ｔ細胞受容
体アルファー・ベータ鎖を発現しているアルファー・ベ
ータＴ細胞である。

【０００３】ガンマー・デルタＴ細胞の機能の一つは、
強い腫瘍細胞障害性を有することである。普通、アルフ
ァー・ベータＴ細胞は、標的腫瘍細胞の標的抗原と組織
適合抗原（ＨＬＡ）を同時に認識して攻撃する（組織適
合抗原拘束性）。従って、何らかの理由により組織適合
性抗原を発現していない標的腫瘍細胞に対しては攻撃し
ない。一方、ガンマー・デルタＴ細胞は、組織適合性抗
原に関係なく標的腫瘍細胞の標的抗原を認識して攻撃す
る（組織適合抗原非拘束性）。しかも腫瘍浸潤性が強
い。従って、ガンマー・デルタＴ細胞は標的腫瘍細胞の
選択範囲が広く、免疫療法には有効な細胞であるといえ
る。このことから、ガンマー・デルタＴ細胞を出来るだ
け高濃度にして癌患者に投与すれば、強い抗腫瘍効果が
期待できる。

【０００４】また、ガンマー・デルタＴ細胞の機能のも
う一つは、細菌感染等に対する感染防御に働いているこ
とである。ガンマー・デルタＴ細胞の抗原認識機構は未
だ不明な部分が多いが、抗原提示細胞からの提示または
細菌表面の抗原を直接認識する可能性が考えられる。細
菌などが侵入すると、ガンマー・デルタＴ細胞がその抗
原を認識し、早期に増殖し、感染防御に当たる。この場
合は、特に感染部位に局所に存在するガンマー・デルタ
Ｔ細胞が主役となる。これらの事実から、本発明により
得られたガンマー・デルタＴ細胞は、感染防御、感染症
治療にも有用であることが類推される。

【０００５】しかしながら、ここで問題になるのは、前
述した通りガンマー・デルタＴ細胞は末梢血中に極少数
しか含まれていないことである。必要十分な数のガンマ
ー・デルタＴ細胞を得るには、大量の血液を必要とする
が、この方法では、まず患者自身の肉体的負担が大き
く、また、たとえ大量の血液が得られたとしても、Ｔ細
胞以外の例えば赤血球、単核球、血小板などの細胞が多
数含まれるため、ガンマー・デルタＴ細胞を単離するの
は大変困難である。

【０００６】ガンマ・デルタＴ細胞を増殖する方法とし
て、Jared L. Kleinら（Journal ofImmunology 156巻，
2754-2760頁,1996年）では、Herpesvirus samiriに感染
したヒト臍滞血由来単核球から、ＩＬ−２依存性に増殖
するガンマー・デルタＴ細胞株を樹立し、これを実験に
使用している。しかし、この細胞の表面抗原はＣＤ３⁺
ＣＤ４^-ＣＤ８⁺ＣＤ１６⁺であり、この細胞は健常人に
存在するガンマー・デルタＴ細胞とは明らかに性格が異
なるものである。従って、免疫療法のために癌患者に投
与するなどの臨床応用を考えた場合、この方法を使用す
ることはできない。

【０００７】その他、実験的に少量の末梢血からリンパ
球を分離し、各種抗原又はサイトカインなどの刺激物質
で刺激し、その後クローニングを行ってガンマー・デル
タＴ細胞を単離する方法がある。しかし、この方法は、
免疫療法のために癌患者等に投与するなどの臨床応用を
考えた場合、フィーダー細胞等のコンタミネーションな
どの質的な問題があり、また量的に必要な細胞を得るの
は不可能に近い。以上から明らかなように、現在まで、
健常人に正常に存在するガンマ・デルタＴ細胞を、充分
に効率的に充分な量迄増殖し、単離できる方法はないの
が現状である。

【０００８】

【発明が解決しようとする課題】請求項１及び２記載の
発明は、採血直後の新鮮末梢血中に含まれる比較的少量
のリンパ球から、ガンマー・デルタＴ細胞を効率よく増
殖し、製造する方法を提供するものである。請求項３記
載の発明は、癌等の治療法の１つである養子免疫療法に
有用は免疫治療剤を提供するものである。

【０００９】

【課題を解決するための手段】本発明は、リンパ球から
ＣＤ１６陽性細胞を除いた後、培養することを特徴とす
るガンマー・デルタＴ細胞の製造法に関する。また本発
明は、前記培養を、固相化した抗ＣＤ３抗体及びＴ細胞
増殖因子の存在下に培養する第１期培養工程、固相化し
た抗ＣＤ３抗体の不存在下かつＴ細胞増殖因子の存在下
に培養する第２期培養工程の各工程を含む方法で行う前
記のガンマー・デルタＴ細胞の製造法に関する。さらに
本発明は、前記の製造法により得られるガンマー・デル
タＴ細胞を含有してなる免疫治療剤に関する。

【００１０】

【発明の実施の形態】本発明で増殖するガンマー・デル
タＴ細胞とは、少なくともＣＤ３⁺ＣＤ１６^-の表面抗原
を有し、かつＴ細胞受容体ガンマー・デルタ鎖を発現し
ている細胞である。本発明の製造法における特徴は、リ
ンパ球から、ＣＤ１６陽性細胞を除いて、培養を開始す
る点にある。ここで除かれるＣＤ１６陽性細胞として
は、ＣＤ１６⁺ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、少量存
在するＣＤ３⁺ＣＤ１６⁺細胞などがある。ＣＤ１６⁺Ｎ
Ｋ細胞は、表面抗原にＣＤ１６分子を発現している細胞
で、標的細胞の組織適合抗原に拘束されること無く標的
細胞を攻撃する能力を有する細胞であるが、内皮細胞の
間を通り抜け患部局所に到達することができないため、
血管外の標的細胞には有効ではない。これに対して、血
管外の標的細胞にも到達するガンマー・デルタＴ細胞の
方が効果が高いといえる。

【００１１】ここで、リンパ球を増殖した後にのみガン
マー・デルタＴ細胞を単離すると、抗ＣＤ４抗体を用い
たＣＤ４陽性細胞の除去、抗ＣＤ８抗体を用いたＣＤ８
陽性細胞の除去及び抗ＣＤ１６抗体を用いたＣＤ１６陽
性細胞の除去の３段階の除去操作が必要となって、除去
操作が長時間に亘るため、せっかく増殖したガンマー・
デルタＴ細胞の活性等にダメージを与え、しかも、除去
工程において一部のガンマー・デルタＴ細胞が無駄に除
去されてしまう。

【００１２】ＣＤ１６陽性細胞以外の細胞は、ガンマー
・デルタＴ細胞の増殖に何らかの形で関与していると思
われるため、増殖前に除かないことが好ましい。その他
の細胞を除いたり、ガンマー・デルタＴ細胞のみを最初
に単離して培養すると、ガンマー・デルタＴ細胞が単独
では増殖の能力が大変弱いため、数日間で増殖を停止す
る傾向にある。なお、ガンマー・デルタＴ細胞の増殖に
関係のない細胞は除いてもよい。

【００１３】本発明の製造法において、出発物として用
いられるリンパ球としては、末梢血リンパ球、上皮性リ
ンパ球、腫瘍内浸潤リンパ球、癌性腹水胸水浸潤リンパ
球など生体に存在するあらゆるリンパ球が挙げられ、特
に制限はされないが、末梢血リンパ球、特に採血直後の
新鮮末梢血リンパ球が、採血患者への身体的負担、リン
パ球分離の簡便さ、分離後のリンパ球の生存率の良さ等
の点で好ましい。用いる細胞の数としては１×１０⁶〜
５０×１０⁶個程度であるのが、量的に問題なく培養で
きるので好ましく、血液量では、血中の細胞密度により
個人差があるが１０〜２０mlが採血時の患者への負担も
軽いので好ましい。

【００１４】採血直後の２０mlの新鮮末梢血中には普通
約１×１０⁷〜５×１０⁷個のリンパ球が含まれるが、そ
のうち、ＣＤ１６⁺ＮＫ細胞等のＣＤ１６陽性細胞は数
パーセント含まれている。ＣＤ１６陽性細胞の除去方法
としては、リンパ球を含む液と抗ＣＤ１６抗体を結合さ
せた固相担体とを接触させ、ＣＤ１６陽性細胞を結合さ
せた後、固相を分離する方法が、簡便でかつ残りの細胞
に対するダメージが少ないので好ましい。固相担体とし
ては、マイクロタイタープレート、プラスチックフラス
コ、ポリスチレンビーズ等の高分子ビーズ、磁気ビーズ
などが挙げられるが、操作が簡便で効率よくＣＤ１６陽
性細胞を除去できるので、磁気ビーズを使うことが好ま
しい。

【００１５】抗ＣＤ１６抗体としては、抗ヒトＣＤ１６
ポリクローナル抗体、抗ヒトＣＤ１６モノクローナル抗
体を用いることができるが、抗ヒトＣＤ１６モノクロー
ナル抗体が好ましい。抗ヒトＣＤ１６モノクローナル抗
体としては、ラット、マウス、ヒツジなどの動物種由来
のものがある。なお、これらは市販品を使用してもよ
い。

【００１６】磁気ビーズを用いる場合、抗ＣＤ１６抗体
を固相化する方法としては、磁気ビーズに上記抗ＣＤ１
６抗体を直接結合させる方法と、抗ＣＤ１６抗体に対し
て反応性を有する別の抗体が結合した抗体結合磁気ビー
ズと上記抗ＣＤ１６抗体を結合させる方法がある。後者
の方法において、「抗ＣＤ１６抗体に対して反応性を有
する抗体」としては、固相化しようとする抗ＣＤ１６抗
体の由来動物種に対する抗体が好ましい。例えば、抗ヒ
トＣＤ１６モノクローナル抗体がマウス由来の場合は、
抗マウスＩｇＧ結合磁気ビーズを用いることができる。
このような、抗体結合磁気ビーズは市販されているの
で、それらを使用することができる。

【００１７】抗ＣＤ１６抗体と、この抗体に反応性を有
する抗体が結合した抗体結合磁気ビーズとは、両者を混
合し、０〜４℃で１〜２４時間静置し反応させることが
好ましい。その混合量は、用いる磁気ビーズの種類によ
り異なるが、ビーズ１０⁸個に対して抗体量として１〜
１００μｇが好ましい。前記操作の終了後、洗浄するこ
とが好ましく、その条件としては、冷却したリン酸緩衝
液で３回以上洗浄することが好ましい。

【００１８】得られた抗ＣＤ１６抗体を結合させた固相
担体は、ついでリンパ球を含む液と混合する。ＣＤ１６
陽性細胞を反応させるには、１〜２時間０〜４℃で静置
することが好ましい。この操作で、ＣＤ１６陽性細胞が
抗ＣＤ１６抗体と結合する。固相担体が磁気ビーズの場
合、反応終了後、磁石により磁気ビーズを吸着させる
と、ＣＤ１６陽性細胞を除去することができる。

【００１９】ついでＣＤ１６陽性細胞が除去されたリン
パ球を培養する。培養には、各種の培養液を使用するこ
とができる。培養液は、Ｔ細胞の増殖に必要な栄養素を
含有するものであれば制限はなく、血清等の生物由来の
培養液、平衡塩類溶液にアミノ酸、ビタミン、核酸塩基
などを加え、さらに必要に応じてウシ胎児血清やウシ血
清アルブミンを加えた合成培地などが使用でき、ＲＰＭ
Ｉ−１６４０、ＡＩＭ−Ｖ、ＤＭＥＭ、ＩＭＤＭ等が具
体的に好ましいものとして挙げられ、ＲＰＭＩ−１６４
０が特に好ましい。これらの培地は市販品を用いること
ができる。

【００２０】また、培養液中にＴ細胞増殖因子を添加す
るのが好ましい。Ｔ細胞増殖因子としては、インターロ
イキン２（ＩＬ−２）、フィトヘマグルチニン（ＰＨ
Ａ）などを用いることが好ましく、ＩＬ−２を用いるこ
とが特に好ましい。さらに培養は、ＣＯ₂インキュベー
ター内で行なうことが好ましく、ＣＯ₂濃度は、１〜１
０％、特に５％が好ましい。培養の温度は３０〜４０℃
が好ましく、３７℃が特に好ましい。培養液の交換又は
添加は、培養液の劣化及びＴ細胞増殖因子の活性の低下
を防ぐために、１〜７日に一回行うことが好ましい。

【００２１】本発明において、培養は、固相化した抗Ｃ
Ｄ３抗体及びＴ細胞増殖因子の存在下に培養する第１期
培養工程、固相化した抗ＣＤ３抗体の不存在下かつＴ細
胞増殖因子の存在下に培養する第２期培養工程の各工程
を含む方法で行うのが、活性の高いガンマー・デルタＴ
細胞を大量に増殖させることができるので好ましい。Ｔ
細胞増殖因子としては、ＩＬ−２を用いることが特に好
ましい。

【００２２】ここでＣＤ３とは、Ｔリンパ球の細胞表面
に存在し、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）と共に標的抗原を認
識する際に重要な分子である。ＣＤ３分子を介して刺激
情報が細胞内に伝達されることにより、Ｔ細胞は増殖を
開始する。同様な現象が、ＣＤ３分子に対する特異的抗
体（抗ＣＤ３抗体）の刺激により起こる。Ｔリンパ球の
刺激に用いる抗ＣＤ３抗体は、精製したＣＤ３分子を用
いて動物又は細胞に産生させることもできるが、安定
性、コスト等に優れた市販品を用いることもできる。特
に抗ＣＤ３抗体としては、ＯＫＴ−３（オルソ社製）が
好ましい。抗ＣＤ３抗体の固相化には、抗体を滅菌した
リン酸緩衝液で１〜１０μg/mlの濃度に希釈して用いる
のが好ましい。抗体を固相化する器具としては、プラス
チック製の減菌済み細胞培養フラスコ等が好ましい。そ
の大きさは特に制限はない。固相化方法としては、前記
抗ＣＤ３抗体の希釈液を固相化する器具に加え、２〜２
４時間、４〜３７℃で静置する方法が好ましい。固相化
後、使用時まで冷蔵庫（４℃）で保存することが好まし
い。使用時には、液を除去し、好ましくは４℃のリン酸
緩衝液等で洗浄する。

【００２３】培養の際に、ＩＬ−２はリンパ球の刺激に
十分であることから１０〜２０００U/mlの濃度で用いる
のが好ましい。ＩＬ−２は市販されているものを用いる
ことができる。ＩＬ−２は、水、生理食塩液、リン酸緩
衝液、ＲＰＭＩ−１６４０、ＡＩＭ−Ｖ、ＤＭＥＭ、Ｉ
ＭＤＭ等の一般に広く用いられる細胞培養液等に溶解し
て使用することができる。一度溶解したものは、活性の
低下を防ぐため、冷蔵保存することが好ましい。

【００２４】この方法では、ＣＤ１６陽性細胞を除去し
たリンパ球は、ＩＬ−２を含む培養液に浮遊させ、抗Ｃ
Ｄ３抗体を固相化した培養容器に入れ培養を開始するの
が好ましい。ここで用いる培養液としては、リンパ球の
培養に適したものであれば特に制限されないが、ＲＰＭ
Ｉ−１６４０が好ましく、正常ヒト血清を加えたものが
増殖効果に優れ好ましい。培養は、一般的な細胞培養の
方法に従うことができる。例えば、ＣＯ₂インキュベー
タ内で行うことができる。ＣＯ₂濃度は１〜１０％、特
に５％が好ましく、温度は３０〜４０℃、特に３７℃が
好ましい。この培養は、日数に制限はないが、抗ＣＤ３
抗体の刺激情報が細胞に伝達されることが前提となるた
め、２〜２０日行うことが好ましく、３〜７日行うこと
がより好ましい。この培養期間内には、顕微鏡下で細胞
の状態を観察し、適宜細胞数を計測し、必要に応じてＩ
Ｌ−２を含む培養液を添加するのが好ましい。培養液の
添加量は、添加前の培養中の液量に対して０．１〜５倍
程度が好ましい。その添加割合は、培養液の劣化及びＩ
Ｌ−２活性の低下を防ぐために、１〜７日に一回行うこ
とが好ましい。

【００２５】本発明においては、上述の培養を第１期培
養工程の後、固相化した抗ＣＤ３抗体の不存在下かつＩ
Ｌ−２の存在下に培養する第２期培養工程を設けること
が、リンパ球を大量に増殖・維持できるので好ましい。
抗ＣＤ３抗体を固相化した培養容器で長期間培養を行う
と、リンパ球の増殖が抑制されることがある。第２期培
養に用いる培養容器としては、細胞培養用のプラスチッ
ク製フラスコ、ＣＯ₂ガス透過性のガス・パーミアブル
・バッグ等を使用することができるが、この工程ではリ
ンパ球が急速に大量に増殖してくるため、２〜４日毎に
培養器の数を増やしていくことが好ましい。細胞数の目
安としては、５×１０^５〜１０×１０⁵個／mlになるよ
うに培養液の追加又は培養器の数の増加を行っていくこ
とが好ましい。

【００２６】以上の方法で増殖したリンパ球細胞は、ほ
とんどがＣＤ３⁺ＣＤ４⁺細胞、ＣＤ３⁺ＣＤ８⁺細胞及び
ＣＤ３⁺ＣＤ４^-ＣＤ８^-ＣＤ１６^-のガンマー・デルタＴ
細胞となる。ここからガンマー・デルタＴ細胞を単離す
る場合には、ＣＤ３⁺ＣＤ４⁺細胞及びＣＤ３⁺ＣＤ８⁺細
胞を除去すればよい。除去の方法としては、抗ＣＤ１６
抗体の代わりに抗ＣＤ４抗体及び／又は抗ＣＤ８抗体を
用いること以外は、ＣＤ１６陽性細胞の除去において説
明した方法と同様の方法を用いることができる。具体的
には、抗ＣＤ４モノクローナル抗体及び／又は抗ＣＤ８
モノクローナル抗体を結合させた磁気ビーズを混合して
反応させ、ついで磁石を用いてこれらのビーズを除去す
ると、効率よく必要なガンマー・デルタＴ細胞を単離す
ることが出来るので好ましい。

【００２７】以上の操作によって、ガンマー・デルタＴ
細胞の純度を上げて単離することができ、例えば、９５
％以上の高純度まで精製して単離することができる。さ
らに高純度にガンマー・デルタＴ細胞の精製度をあげる
ことが必要な場合には、この時点で再度少量存在しうる
ＣＤ１６陽性細胞を除去することもできる。除去する方
法は、先に説明した方法と同様の方法を用いることがで
きる。この場合には、ＣＤ１６陽性細胞の含有率が低い
ため、無駄なく容易にＣＤ１６陽性細胞を除去すること
ができる。

【００２８】以上の方法で得られるガンマー・デルタＴ
細胞は、ＩＬ−２で刺激された場合、一般に増殖活性の
指標として用いられる³Ｈを標識したthymidineの細胞内
への取り込みを増加させ、また、末梢血を採取したと同
じドナー由来の腫瘍細胞（自己腫瘍細胞）に対して細胞
障害活性（cytotoxicity）を示す。従って、癌、各種感
染症等の治療に有用な養子免疫療法に用いる免疫治療剤
の有効成分とすることができる。また、研究用試薬とし
て、種々の研究用途に用いることができる。

【００２９】免疫治療剤の投与量は、１回あたり、本発
明により得られる細胞の量で１０⁶〜１０¹²個の細胞が
好ましい。投与形態としては、注射剤、点滴剤等の液体
が好ましく、前記細胞をヒト血清アルブミンを０．０１
〜５％となるように添加した生理食塩液に分散した注射
剤又は点滴剤がより好ましい。投与方法としては、静脈
への点滴又は静脈、動脈、局所等への注射が好ましい。
投与する液量は、投与方法、投与する場所等により異な
るが、５０〜５００ccとするのが好ましく、この液量に
前記の量の細胞が含まれるようにするのが好ましい。投
与頻度は１回／日〜１回／月とするのが好ましく、投与
回数は少なくとも１回、好ましくは５回以上である。

【００３０】

【実施例】

実施例１ （１） 抗ＣＤ３抗体固相化培養フラスコの調製 抗ＣＤ３抗体（ＯＫＴ３，オルソ ファーマシューティ
カル コーポレイション製）をリン酸緩衝食塩水溶液
（ＰＢＳ）で５μg/mlの濃度に希釈し、表面積２５cm²
のフラスコに５ml注入した。この溶液をフラスコの底面
にまんべんなく広げ、冷蔵庫（４℃）で一晩以上、使用
時まで静置した。溶液を注入したフラスコは、使用前に
４℃のＰＢＳで３回洗浄した。

【００３１】（２）末梢血からのリンパ球の分離 ヘパリン処理をした２０mlの注射器を用いて採血したヒ
ト末梢血全血２０mlに生理食塩液２０mlを加え２倍に希
釈し、密度勾配遠心分離の媒体であるFicoll-Paque（フ
ァルマシア社製）４mlに希釈血液１０mlを重層して３５
０×Ｇ、２５分、２０℃の条件で遠心を行いリンパ球層
を回収し、ＲＰＭＩ−１６４０培地で３回洗浄した。約
２×１０⁷個のリンパ球が得られた。

【００３２】（３）ＣＤ１６陽性細胞の除去 マウス抗ＣＤ１６抗体（濃度２００μg/ml、オンコジー
ン・サイエンス社製）０．０７mlと冷却したＰＢＳで洗
浄したヒツジ抗マウスＩｇＧ標識磁気ビーズ０．３ml
（１０⁸個ビーズ、ダイナール社製）を２時間氷中に静
置させ、抗ＣＤ１６抗体を磁気ビーズに結合させた。３
回冷却したＰＢＳにて洗浄の後、１０％（体積／体積）
不活化ヒト正常血清含有ＲＰＭＩ−１６４０培地０．５
mlに浮遊させた分離リンパ球と混合し、必要に応じ軽く
撹拌しながら２時間氷中に静置させた。抗ＣＤ１６抗体
結合磁気ビーズと結合したＣＤ１６陽性細胞は、磁石に
より除去し、磁気ビーズ非結合のリンパ球を回収し培養
用とした。

【００３３】（４）ＩＬ−２を含む培養液（培地）の調
整 ＲＰＭＩ−１６４０培地（シグマ社製）に、１０％（体
積／体積）ヒト正常血清（新鮮凍結血漿を３７℃で解凍
後、５６℃、３０分間加熱して不活化し、３７，０００
×Ｇ、６０分、４℃の遠心により沈殿物を除去し、さら
に０．２２μｍのフィルターで濾過したもの）、１００
U/mlペニシリン（萬有製薬株式会社製）、１００γ/ml
ストレプトマイシン（明治製菓株式会社製）及びＩＬ−
２（テセロイキン、塩野義製薬株式会社製）７００U/ml
を含むように調整した。

【００３４】（５）リンパ球の培養 ＣＤ１６陽性細胞を除去したリンパ球は、ＩＬ−２ ７
００U/mlを含む１０％（体積／体積）ヒト正常血清含有
ＲＰＭＩ−１６４０培地中に細胞密度約２×１０⁶個／m
lで懸濁させ、この細胞懸濁液約５mlを抗ＣＤ３抗体固
相化フラスコ中に入れて培養を開始した。翌日（培養１
日目）からＩＬ−２を含む培地を１ml添加し、この操作
を培養４日目まで繰り返した。培養５日目に抗ＣＤ３抗
体を固相化していない表面積７５cm²のフラスコに細胞
浮遊液を移し、ＩＬ−２を含む培地を約１０ml添加し
た。これ以後、フラスコ１本当たりの細胞浮遊液の量は
約３０mlを目安とし、培養液のオレンジ色から黄色の変
化、及び細胞数の増加（１〜１０×１０⁵個／mlを目
安）に応じて新しいフラスコに基本的に２分割して本数
を増やし、ＩＬ−２を含む培地を約１０ml添加した。

【００３５】（６）ガンマー・デルタＴ細胞の単離 固相化抗ＣＤ３抗体及びＩＬ−２により増殖させたリン
パ球を回収し、まず２mlのマウス抗ＣＤ４^-磁気ビー
ズ、続いて２mlのマウス抗ＣＤ８^-磁気ビーズ（いずれ
もダイナール社製）とそれぞれ３０分間氷中で混合し、
各磁気ビーズに結合したＣＤ４陽性及びＣＤ８陽性細胞
を磁石で除去した。適時ＦＡＣＳｃａｎ（ベクトン・デ
ィッキンソン社製）でガンマー・デルタＴ細胞の精製度
を確認した。この除去操作を２回繰り返し、精製度９５
％以上とした。また、培養により１．５％まで増殖して
きたＣＤ１６陽性細胞は、リンパ球からの除去と同じ方
法で除去した。

【００３６】（７）培養リンパ球の表現型の測定 上記により得られた培養リンパ５×１０⁵個を試験管に
分取し、ＲＰＭＩ−１６４０培地を加え１回遠心後上清
を除去して、直接染色の場合ＦＩＴＣ（フルオレセイン
イソチオシアネート）またはＰＥ（フィコエリスリン）
標識モノクローナル抗体１０μｌを、間接染色の場合非
標識モノクローナル抗体１μｇをそれぞれ加え良く撹拌
した。氷中で３０分間静置の後、ＲＰＭＩ−１６４０培
地で２回遠心洗浄した。間接染色の場合、次に適当に希
釈したＦＩＴＣ標識ヒツジ抗マウス抗体又は抗ラット抗
体（カッペル社製）１０μlを加え氷中で３０分間静置
の後、ＲＰＭＩ−１６４０培地で２回遠心洗浄した。最
後に０．５mlのＲＰＭＩ−１６４０培地を加え、良く撹
拌し、ＦＡＣＳｃａｎ（ベクトン・デッキンソン社）で
各抗体に反応した表面抗原を測定した。

【００３７】測定に用いたモノクローナル抗体は、直接
染色には、ＦＩＴＣ標識抗ＣＤ３抗体、ＦＩＴＣ標識抗
ＣＤ１６抗体、ＦＩＴＣ標識抗ＴＣＲ−α／β抗体、Ｆ
ＩＴＣ標識抗ＴＣＲ−γ／δ抗体、ＦＩＴＣ標識抗ＣＤ
４＋ＰＥ標識抗ＣＤ８抗体、ＰＥ標識抗ＣＤ５６抗体
（以上ベクトン・ディッキンソン社製）、間接染色に
は、ラット抗ＩＬ−２受容体α鎖抗体（抗ＣＤ２５、セ
ロテック社製）、マウス抗ＩＬ−２受容体β鎖抗体（Ｍ
ｉｋ−β１、ニチレイ(株)製）、マウス抗ＩＬ−２受容
体γ鎖抗体（ＡＧ１８４、ファーミンジェン社製）及び
マウス抗ＩＬ−１２受容体β１抗体（ホフマン・ラ・ロ
ッシュ社製）及びＦＩＴＣ標識抗ラットＩｇＧ又はＦＩ
ＴＣ標識抗マウスＩｇＧ（以上カッペル社製）を用い
た。結果を表１に示す。

【００３８】

【表１】

【００３９】この測定結果から、ガンマー・デルタＴ細
胞は９７．５％の高純度で含まれ、また、その他の表現
型はＣＤ２⁺ＣＤ３⁺ＣＤ４^-ＣＤ８^-ＣＤ１６^-であるこ
とが分かった。また、得られたガンマー・デルタＴ細胞
は標的細胞の認識に重要な接着分子であるＣＤ５６が約
５０％発現していた。さらに、単離したガンマー・デル
タＴ細胞は、ＩＬ−２受容体α、β、γ鎖に加えＩＬ−
１２受容体を８７．２％とという高い割合で発現してお
り、このことは、ガンマー・デルタＴ細胞がＩＬ−２以
外にＩＬ−１２によっても活性化されることが示され
た。よって、ＩＬ−２とＩＬ−１２との相加または相乗
効果が期待され、さらに、ＩＬ−２受容体の一部を供用
をしているＩＬ−４、ＩＬ−７、ＩＬ−９によっても活
性化される可能性も示唆された。

【００４０】（８）細胞増殖活性の測定 単離ガンマー・デルタＴ細胞を各濃度のＩＬ−２を含む
１０％（体積／体積）ヒト血清加ＲＰＭＩ−１６４０培
地に浮遊させ、１×１０⁵個／２００μｌを９６穴平底
プレート（ファルコン社製）に播種し、５％ＣＯ₂、３
７℃の条件下で７２時間培養した。培養終了６時間前に
３Ｈ−thymidine（ＩＣＮ社製）０．５μＣｉ／２０μ
ｌを添加し、セル・ハーベスター（ベルトールド社）で
細胞をガラス濾紙上に回収し、液体シンチレーション・
カウンター（ワラック社）でガラス濾紙上の細胞の放射
活性を測定した。結果を図１に示す。図１に示されるよ
うに、得られたガンマ・デルタＴ細胞はＩＬ−２によっ
て濃度依存的に増殖活性が増強された。

【００４１】（９）培養腫瘍細胞に対する障害活性の測
定 効果細胞として単離ガンマー・デルタＴ細胞２×１０⁶
個を各濃度のＩＬ−２を含む１０％（体積／体積）ヒト
血清加ＲＰＭＩ−１６４０培地に浮遊させ、５％Ｃ
Ｏ₂、３７℃の条件下で２４時間培養した。細胞は、１
０％（体積／体積）牛胎児血清（ＦＢＳ）添加ＲＰＭＩ
−１６４０培地で３回洗浄し、同じ培地に浮遊させ、細
胞数を数えた後９６穴Ｕ底プレート（ファルコン社製）
の最上段に２００μｌづつ播種し、以下２段目以降２倍
づつ希釈して希釈段階を作製した。続いて、⁵¹Ｃｒ（Ｉ
ＣＮ社製）を２時間標識した標的細胞（自己腫瘍細胞、
自己新鮮末梢血リンパ球及びＩＬ−２刺激自己末梢血リ
ンパ球）１×１０⁵個／mlを１００μｌ（１×１０⁴個）
づつ播種してガンマー・デルタＴ細胞と混合し、プレー
トを３５０×Ｇで、５分間遠心した後、５％ＣＯ₂、３
７℃で４時間培養した。ここでいう自己腫瘍細胞とは、
リンパ球を採取したと同じ患者由来の腫瘍細胞、自己新
鮮末梢血リンパ球とは、リンパ球を採取したと同じ患者
由来の分離直後のリンパ球、ＩＬ−２刺激自己末梢血リ
ンパ球とは、リンパ球を採取したと同じ患者由来のリン
パ球をＩＬ−２ ７００U/ml単独で３日間刺激したもの
をいう。培養終了後、上清１００μｌを採取し、ガンマ
ーカウンター（パッカード社製）で遊離した⁵¹Ｃｒの放
射活性（ｃｐｍ、試験遊離群）を測定した。細胞障害率
（％）は、以下の式で算出した。

【００４２】

【数１】 なお、⁵¹Ｃｒ標識腫瘍細胞に３％トリトンＸ−１００を
加え細胞を溶解したものを最大遊離群、⁵¹Ｃｒ標識腫瘍
細胞単独を自然遊離群とした。結果を図２に示す。

【００４３】図２〜図４に示したように自己腫瘍細胞を
標的細胞にした場合、ＩＬ−２の濃度依存的に明らかに
細胞障害活性は増強される。しかし、新鮮自己リンパ球
及びＩＬ−２刺激自己リンパ球に対しては、ＩＬ−２の
濃度を増やしても全く障害しない。従って、本方法によ
り単離したガンマー・デルタＴ細胞は、癌細胞を特異的
に標的にすることが明らかとなり、このことは、ガンマ
ー・デルタＴ細胞が養子免疫療法に用いる免疫治療剤の
有効成分とするための効果的な細胞であることを示すも
のである。

【００４４】比較例 比較例として、予めＣＤ１６陽性細胞を除去しない場合
について、同様に操作して増殖リンパ球を得た。表２
に、予めＣＤ１６陽性細胞を除去した場合（実施例１）
としない場合（比較例）での、培養１４日後のリンパ球
集団に含まれるＣＤ１６陽性細胞の陽性率を示す。

【００４５】

【表２】 表２の結果から示されるように、予めＣＤ１６陽性細胞
を除去して増殖させたリンパ球集団には、ＣＤ１６陽性
細胞は１．５％含まれていたにすぎないが、除去せずに
増殖した場合は、３３．８％まで増殖していた。

【００４６】実施例２ 免疫治療剤及びその使用方法を次に具体的に示す。 （１）免疫治療剤 上記の方法で癌患者由来のガンマー・デルタＴ細胞を製
造し、これを市販の分離剤（Lymphoprep,Nycomed社製）
を用いて、そのプロトコルに従って分離精製する。得ら
れる細胞２×１０⁹個を、ヒト血清アルブミン０．１％
を含む生理食塩液２００mlに懸濁して、点滴剤形態の免
疫治療剤とすることができる。 （２）免疫治療剤の使用方法 上記注射剤の全量を、癌患者に点滴静注する。この操作
を月１回の割合で繰り返すことにより、癌患者の癌を治
癒したり、症状の進行の停止又は鈍化を図ることができ
る。

【００４７】

【発明の効果】請求項１及び２記載の発明は、ガンマー
・デルタＴ細胞を簡便に効率よく製造することができる
ものである。請求項３記載の発明は、効果細胞として有
力なガンマー・デルタＴ細胞を含む免疫治療剤として、
癌、各種感染症等に有効な養子免疫療法に用いることが
でき、高い治療効果が期待できるものである。

【図面の簡単な説明】

【図１】増殖リンパ球から単離したガンマー・デルタＴ
細胞のＩＬ−２刺激に対する増殖反応（Proliferatio
n）を示したグラフである。

【図２】単離したガンマー・デルタＴ細胞（効果細胞）
のＩＬ−２刺激による自己腫瘍細胞（標的細胞）特異的
障害活性（Cytotoxicity）を示したグラフである。

【図３】単離したガンマー・デルタＴ細胞（効果細胞）
のＩＬ−２刺激による新鮮自己抹消血リンパ球（標的細
胞）特異的障害活性（Cytotoxicity）を示したグラフで
ある。

【図４】単離したガンマー・デルタＴ細胞（効果細胞）
のＩＬ−２刺激によるＩＬ−２刺激自己抹消血リンパ球
（標的細胞）特異的障害活性（Cytotoxicity）を示した
グラフである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (71)出願人 597056729 片倉 隆一 宮城県仙台市太白区長町南二丁目９番20号 (71)出願人 597056730 横山 純吉 宮城県仙台市青葉区柏木二丁目３番７号 朝日プラザ柏木319 (71)出願人 597056741 吉本 高志 宮城県仙台市青葉区角五郎一丁目12番２号 (72)発明者 山口 智宏 茨城県日立市東町四丁目13番１号 日立化 成工業株式会社医薬品研究所内 (72)発明者 藤宮 芳章 大阪府大阪市中央区北浜四丁目７番28号 住友林業株式会社内 (72)発明者 海老名 卓三郎 宮城県仙台市青葉区広瀬町二丁目12番地 (72)発明者 鈴木 洋一 宮城県仙台市宮城野区原町五丁目９番６号 (72)発明者 片倉 隆一 宮城県仙台市太白区長町南二丁目９番20号 (72)発明者 横山 純吉 宮城県仙台市青葉区柏木二丁目３番７号 朝日プラザ柏木319 (72)発明者 吉本 高志 宮城県仙台市青葉区角五郎一丁目12番２号

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 リンパ球からＣＤ１６陽性細胞を除いた
   後、培養することを特徴とするガンマー・デルタＴ細胞
   の製造法。
2. 【請求項２】 培養を、固相化した抗ＣＤ３抗体及びＴ
   細胞増殖因子の存在下に培養する第１期培養工程、固相
   化した抗ＣＤ３抗体の不存在下かつＴ細胞増殖因子の存
   在下に培養する第２期培養工程の各工程を含む方法で行
   う請求項１記載のガンマー・デルタＴ細胞の製造法。
3. 【請求項３】 請求項１又は２記載の製造法により得ら
   れるガンマー・デルタＴ細胞を含有してなる免疫治療
   剤。