CN115678846A - 一种肿瘤特异性γδT细胞及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提出了一种肿瘤特异性γδT细胞及其制备方法，属于细胞免疫学技术领域，从外周血中获得人单个核细胞后，经过分离纯化后，在含有Daudi细胞培养液的培养液中，低频超声波处理条件下，得到经刺激的γδT细胞，继续加入含有扩增因子的培养液中初步扩增后，进一步加入地西他滨继续培养，得到肿瘤特异性γδT细胞。本发明方法与常规方法扩增的γδT细胞比较，杀伤肿瘤的细胞毒活性更强，对多种恶性肿瘤细胞均有较强的杀伤能力，细胞毒性增强。
Description
技术领域
本发明涉及细胞免疫学技术领域，具体涉及一种肿瘤特异性γδT细胞及其制备方法。
背景技术
γδT细胞是免疫系统的天然监视细胞，在人体中不断巡逻，识别和靶向肿瘤细胞。γδT细胞还发挥着桥接先天免疫系统和适应性免疫系统的作用，在癌症治疗中，靶向这类细胞蕴含着巨大的潜力。γδT细胞具有先天性和适应性(双重特异性)免疫系统的特性，能够作为这两个关键系统之间的功能桥梁来影响肿瘤杀伤。因此，γδT细胞不仅能够被激活以立即有效地杀死肿瘤细胞，而且它们还具有促进级联反应的潜力，通过细胞因子释放和抗原呈递触发先天性和适应性免疫细胞，产生免疫记忆，诱导有效且持久的抗肿瘤反应。
δT-细胞免疫治疗的临床发展建立在两种已确定的发现上。第一，在致力于实现Vγ9Vδ2T-细胞的体内扩增时，患有多样恶性肿瘤的患者已用ZA和低剂量IL-2治疗。在许多情况下，这些小研究已将循环Vγ9Vδ2T-细胞数目与延缓的疾病进展相联系。第二，离体扩增的Vγ9Vδ2T-细胞已在若干早期临床试验中作为自体过继性免疫治疗进行测试，这些临床试验涉及多样癌症，包括上皮性卵巢癌(EOC)。尽管这些研究已表明输注的γδT-细胞的安全性，但是临床功效是有限的(甚至当与ZA组合时仍是如此)。这突出了以高效率扩增这些细胞的更好系统的需要，从而产生表现出提高的抗肿瘤活性的细胞。
由于γδ-T细胞在血液中数量稀少且其增生能力因人而异，因此以γδ-T细胞进行细胞疗法的挑战在于是否能够于体外大量且快速的扩增并活化γδ-T细胞。近几年发现，使用唑来膦酸(Zoledronic acid)能使γδ-T细胞大量增殖，其技术也已经确立。唑来膦酸除了使用在培养γδ-T细胞之外，将唑来膦酸注射到癌症患者体内可以发现癌细胞更大量表现IPP，藉此可以提高γδ-T细胞对癌细胞的灵敏度。然而，唑来膦酸是一种治疗骨质疏松症的药物，用于培养细胞或注射至病患体内仍存在一定疑虑，因此仍极需要开发出一种方便、有效、安全的体外肿瘤特异性γδT细胞的制备方法。
发明内容
本发明的目的在于提出一种肿瘤特异性γδT细胞及其制备方法，与常规方法扩增的γδT细胞比较，杀伤肿瘤的细胞毒活性更强，对多种恶性肿瘤细胞均有较强的杀伤能力，细胞毒性增强，且本发明所提供的制备方法的制备成本低廉、工序简单、条件易控、易于规模化生产，具有广阔的应用前景。
本发明的技术方案是这样实现的：
本发明提供一种肿瘤特异性γδT细胞的制备方法，从外周血中获得人单个核细胞后，经过分离纯化后，在含有Daudi细胞培养液的培养液中，低频超声波处理条件下，得到经刺激的γδT细胞，继续加入含有扩增因子的培养液中初步扩增后，进一步加入地西他滨继续培养，得到肿瘤特异性γδT细胞。
作为本发明的进一步改进，包括以下步骤：
S1.培养液的配制：将刀豆球蛋白、白介素组合物、干扰素-γ和自体灭活血浆加入RPMI140培养液中，搅拌混合均匀，得到培养液；
S2.外周血人单个核细胞的制备：取外周血，肝素抗凝，采用淋巴细胞分离液密度梯度离心法分离人单个核细胞，用步骤S1制得的培养液洗涤，离心，获得外周血人单个核细胞；
S3.γδT细胞的分离纯化：将步骤S2得到的外周血人单个核细胞加入步骤S1制得的培养液中，培养1-2d后，加入Anti-human gamma-delta TCR-FITC抗体标记γδT细胞，离心，加入步骤S1制得的培养液，经流式细胞仪分离纯化γδT细胞；
S4.γδT细胞的刺激：将步骤S3中分离纯化的γδT细胞加入步骤S1制得的培养液中，加入Daudi细胞培养液，低频超声波处理，培养2-4d，离心，得到经刺激的γδT细胞；
S5.γδT细胞的扩增：将步骤S4中经刺激的γδT细胞加入步骤S1制得的培养液中，调整细胞密度在106-107个细胞/mL，加入扩增因子，继续培养，以后每2-3d根据细胞密度补液，保持细胞密度在106-107个细胞/mL，直至培养至5-6d时，加入地西他滨，继续培养10-12d，获得肿瘤特异性γδT细胞。
作为本发明的进一步改进，步骤S1中所述培养液中刀豆球蛋白含量为0.5-20μg/mL，白介素组合物800-2000IU/mL，干扰素-α1b 500-1200units，自体灭活血浆7-12wt％，余量为RPMI140培养液。
作为本发明的进一步改进，所述白介素组合物包括白介素-2、白介素-6、白介素-11，质量比为2-4:1-2:1-3。
作为本发明的进一步改进，所述离心的转速为3000-5000r/min，时间为15-20min。
作为本发明的进一步改进，步骤S4中所述Daudi细胞培养液为用含10％胎牛血清的RPMI1640培养液培养的述Daudi细胞，细胞浓度在104-105个细胞/mL。
作为本发明的进一步改进，步骤S4中所述低频超声波处理的条件为70-150W超声波。
作为本发明的进一步改进，步骤S5中所述扩增因子为唑来膦酸和干扰素-α1b的混合物，加入培养液后，唑来膦酸浓度为5-15mmol/mL，干扰素-α1b的浓度为700-1500units；所述地西他滨加入培养液后的浓度为2-7mmol/mL。
作为本发明的进一步改进，所述培养条件为36-38℃，CO2浓度为4-7％，氧气浓度为15-30％，余量为氮气，此处％为体积百分比。
本发明进一步保护一种上述的制备方法制得的肿瘤特异性γδT细胞。
本发明具有如下有益效果：本发明通过低频超声波处理和肿瘤细胞Daudi细胞刺激下，能增强γδT细胞的生理活性，与常规方法扩增的γδT细胞比较，杀伤肿瘤的细胞毒活性更强，对多种恶性肿瘤细胞均有较强的杀伤能力，细胞毒性增强，且本发明所提供的制备方法的制备成本低廉、工序简单、条件易控、易于规模化生产，具有广阔的应用前景。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
本实施例提供一种肿瘤特异性γδT细胞的制备方法，包括以下步骤：
S1.培养液的配制：刀豆球蛋白含量为0.5μg/mL，白介素组合物800IU/mL，干扰素-α1b 500units，自体灭活血浆7wt％，余量为RPMI140培养液；
白介素组合物包括白介素-2、白介素-6、白介素-11，质量比为2:1:1。
S2.外周血人单个核细胞的制备：取外周血，肝素抗凝，采用淋巴细胞分离液密度梯度离心法分离人单个核细胞，用步骤S1制得的培养液洗涤，3000r/min离心15min，获得外周血人单个核细胞；
S3.γδT细胞的分离纯化：将步骤S2得到的外周血人单个核细胞加入步骤S1制得的培养液中，调节细胞浓度为106个细胞/mL，培养1d后，加入Anti-human gamma-deltaTCR-FITC抗体标记γδT细胞，3000r/min离心15min，等体积加入步骤S1制得的培养液，经流式细胞仪分离纯化γδT细胞；
S4.γδT细胞的刺激：将步骤S3中分离纯化的γδT细胞加入步骤S1制得的培养液中，调节细胞浓度为106个细胞/mL，等体积加入Daudi细胞培养液(Daudi细胞培养液为用含10％胎牛血清的RPMI1640培养液培养的述Daudi细胞，细胞浓度在104个细胞/mL)，70W超声波处理，培养2d，3000r/min离心15min，得到经刺激的γδT细胞；
S5.γδT细胞的扩增：将步骤S4中经刺激的γδT细胞加入步骤S1制得的培养液中，调整细胞密度在106个细胞/mL，加入唑来膦酸和干扰素-α1b，加入培养液后，唑来膦酸浓度为5mmol/mL，干扰素-α1b的浓度为700units，继续培养，以后每2d根据细胞密度补液，保持细胞密度在106个细胞/mL，直至培养至5d时，加入地西他滨，加入培养液后的浓度为2mmol/mL，继续培养10d，获得肿瘤特异性γδT细胞；
所述培养条件为36℃，CO2浓度为4％，氧气浓度为15％，余量为氮气，此处％为体积百分比。
实施例2
本实施例提供一种肿瘤特异性γδT细胞的制备方法，包括以下步骤：
S1.培养液的配制：刀豆球蛋白含量为20μg/mL，白介素组合物2000IU/mL，干扰素-α1b 1200units，自体灭活血浆12wt％，余量为RPMI140培养液；
白介素组合物包括白介素-2、白介素-6、白介素-11，质量比为4:2:3。
S2.外周血人单个核细胞的制备：取外周血，肝素抗凝，采用淋巴细胞分离液密度梯度离心法分离人单个核细胞，用步骤S1制得的培养液洗涤，5000r/min离心20min，获得外周血人单个核细胞；
S3.γδT细胞的分离纯化：将步骤S2得到的外周血人单个核细胞加入步骤S1制得的培养液中，调节细胞浓度为106个细胞/mL，培养2d后，加入Anti-human gamma-deltaTCR-FITC抗体标记γδT细胞，5000r/min离心20min，等体积加入步骤S1制得的培养液，经流式细胞仪分离纯化γδT细胞；
S4.γδT细胞的刺激：将步骤S3中分离纯化的γδT细胞加入步骤S1制得的培养液中，调节细胞浓度为106个细胞/mL，等体积加入Daudi细胞培养液(Daudi细胞培养液为用含10％胎牛血清的RPMI1640培养液培养的述Daudi细胞，细胞浓度在105个细胞/mL)，150W超声波处理，培养4d，5000r/min离心20min，得到经刺激的γδT细胞；
S5.γδT细胞的扩增：将步骤S4中经刺激的γδT细胞加入步骤S1制得的培养液中，调整细胞密度在107个细胞/mL，加入唑来膦酸和干扰素-α1b，加入培养液后，唑来膦酸浓度为15mmol/mL，干扰素-α1b的浓度为1500units，继续培养，以后每3d根据细胞密度补液，保持细胞密度在107个细胞/mL，直至培养至6d时，加入地西他滨，加入培养液后的浓度为7mmol/mL，继续培养12d，获得肿瘤特异性γδT细胞；
所述培养条件为38℃，CO2浓度为7％，氧气浓度为30％，余量为氮气，此处％为体积百分比。
实施例3
本实施例提供一种肿瘤特异性γδT细胞的制备方法，包括以下步骤：
S1.培养液的配制：刀豆球蛋白含量为10μg/mL，白介素组合物1200IU/mL，干扰素-α1b 700units，自体灭活血浆10wt％，余量为RPMI140培养液；
白介素组合物包括白介素-2、白介素-6、白介素-11，质量比为3:1.5:2。
S2.外周血人单个核细胞的制备：取外周血，肝素抗凝，采用淋巴细胞分离液密度梯度离心法分离人单个核细胞，用步骤S1制得的培养液洗涤，4000r/min离心17min，获得外周血人单个核细胞；
S3.γδT细胞的分离纯化：将步骤S2得到的外周血人单个核细胞加入步骤S1制得的培养液中，调节细胞浓度为106个细胞/mL，培养1.5d后，加入Anti-human gamma-deltaTCR-FITC抗体标记γδT细胞，4000r/min离心17min，等体积加入步骤S1制得的培养液，经流式细胞仪分离纯化γδT细胞；
S4.γδT细胞的刺激：将步骤S3中分离纯化的γδT细胞加入步骤S1制得的培养液中，调节细胞浓度为106个细胞/mL，等体积加入Daudi细胞培养液(Daudi细胞培养液为用含10％胎牛血清的RPMI1640培养液培养的述Daudi细胞，细胞浓度在105个细胞/mL)，100W超声波处理，培养3d，4000r/min离心17min，得到经刺激的γδT细胞；
S5.γδT细胞的扩增：将步骤S4中经刺激的γδT细胞加入步骤S1制得的培养液中，调整细胞密度在106个细胞/mL，加入唑来膦酸和干扰素-α1b，加入培养液后，唑来膦酸浓度为10mmol/mL，干扰素-α1b的浓度为1000units，继续培养，以后每2d根据细胞密度补液，保持细胞密度在106个细胞/mL，直至培养至5.5d时，加入地西他滨，加入培养液后的浓度为5mmol/mL，继续培养11d，获得肿瘤特异性γδT细胞；
所述培养条件为37℃，CO2浓度为5％，氧气浓度为20％，余量为氮气，此处％为体积百分比。
实施例4
与实施例3相比，白介素组合物包括白介素-2、白介素-11，质量比为3:3.5，其他条件均不改变。
实施例5
与实施例3相比，白介素组合物包括白介素-2、白介素-6，质量比为3:3.5，其他条件均不改变。
对比例1
与实施例3相比，未进行步骤S4，其他条件均不改变。
对比例2
与实施例3相比，步骤S5中未添加地西他滨，其他条件均不改变。
测试例1
以CellCountingKit-8测定γδT细胞杀伤活性，以前列腺癌DU145细胞作为靶细胞，按效靶细胞比10:1的比例加入实施例1-5和对比例1-2制得的肿瘤特异性γδT细胞，以及市售γδT细胞，37℃、CO2浓度为5％，氧气浓度为20％，余量为氮气，此处％为体积百分比，在培养箱中过夜孵育16h，加入20μL/孔CCK-8在原条件孵育3h，酶标仪测定在450nm处的吸光度(A)值。
杀伤率(％)＝〔1-(实验组OD值－单独的效应细胞组OD值)/单独的靶细胞组OD值〕×100％
结果见表1。
表1对DU145细胞毒活性检测
| 组别 | 杀伤率(％) |
| 实施例1 | 87.5 |
| 实施例2 | 89.2 |
| 实施例3 | 91.4 |
| 实施例4 | 84.5 |
| 实施例5 | 85.2 |
| 对比例1 | 80.1 |
| 对比例2 | 82.2 |
| 市售 | 75.5 |
本发明实施例1-3制得的肿瘤特异性γδT细胞具有更高的杀伤率。本发明通过低频超声波处理和肿瘤细胞Daudi细胞刺激下，能增强γδT细胞的生理活性，与常规方法扩增的γδT细胞比较，杀伤肿瘤的细胞毒活性更强。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种肿瘤特异性γδT细胞的制备方法，其特征在于，从外周血中获得人单个核细胞后，经过分离纯化后，在含有Daudi细胞培养液的培养液中，低频超声波处理条件下，得到经刺激的γδT细胞，继续加入含有扩增因子的培养液中初步扩增后，进一步加入地西他滨继续培养，得到肿瘤特异性γδT细胞。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1.培养液的配制：将刀豆球蛋白、白介素组合物、干扰素-γ和自体灭活血浆加入RPMI140培养液中，搅拌混合均匀，得到培养液；
S2.外周血人单个核细胞的制备：取外周血，肝素抗凝，采用淋巴细胞分离液密度梯度离心法分离人单个核细胞，用步骤S1制得的培养液洗涤，离心，获得外周血人单个核细胞；
S3.γδT细胞的分离纯化：将步骤S2得到的外周血人单个核细胞加入步骤S1制得的培养液中，培养1-2d后，加入Anti-human gamma-delta TCR-FITC抗体标记γδT细胞，离心，加入步骤S1制得的培养液，经流式细胞仪分离纯化γδT细胞；
S4.γδT细胞的刺激：将步骤S3中分离纯化的γδT细胞加入步骤S1制得的培养液中，加入Daudi细胞培养液，低频超声波处理，培养2-4d，离心，得到经刺激的γδT细胞；
S5.γδT细胞的扩增：将步骤S4中经刺激的γδT细胞加入步骤S1制得的培养液中，调整细胞密度在106-107个细胞/mL，加入扩增因子，继续培养，以后每2-3d根据细胞密度补液，保持细胞密度在106-107个细胞/mL，直至培养至5-6d时，加入地西他滨，继续培养10-12d，获得肿瘤特异性γδT细胞。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤S1中所述培养液中刀豆球蛋白含量为0.5-20μg/mL，白介素组合物800-2000IU/mL，干扰素-α1b500-1200units，自体灭活血浆7-12wt％，余量为RPMI140培养液。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述白介素组合物包括白介素-2、白介素-6、白介素-11，质量比为2-4:1-2:1-3。
5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述离心的转速为3000-5000r/min，时间为15-20min。
6.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤S4中所述Daudi细胞培养液为用含10％胎牛血清的RPMI1640培养液培养的述Daudi细胞，细胞浓度在104-105个细胞/mL。
7.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤S4中所述低频超声波处理的条件为70-150W超声波，所述离心的转速为3000-5000r/min，时间为15-20min。
8.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤S5中所述扩增因子为唑来膦酸和干扰素-α1b的混合物，加入培养液后，唑来膦酸浓度为5-15mmol/mL，干扰素-α1b的浓度为700-1500units；所述地西他滨加入培养液后的浓度为2-7mmol/mL。
9.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述培养条件为36-38℃，CO2浓度为4-7％，氧气浓度为15-30％，余量为氮气，此处％为体积百分比。
10.一种如权利要求1-9任一项所述的制备方法制得的肿瘤特异性γδT细胞。
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