CN103937742B - 一种同时激活cd4+ & cd8+ t细胞的免疫细胞的培养方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于肿瘤生物治疗领域，涉及一种同时激活CD4⁺ & CD8⁺ T细胞的免疫细胞培养方法。将分离好的单个核细胞置于含有rhIL‑12、IL‑4配体、IL‑10配体的培养液中，培养8‑12小时后加入左旋咪唑继续培养8‑12小时，加入Anti‑CD3McAb和rhIL‑2，继续培养2‑3天，然后交替加入含有rhIL‑2的培养基和含Anti‑CD3McAb、rhIL‑2的培养基，中间的间隔培养时间为2‑3天。制备细胞因子化合物的方案为：从培养开始后第3‑14天收集细胞上清液、通过低温超速离心、超滤离心管超滤、微孔滤膜微滤，滤液为天然细胞因子混合物。本发明的培养方法，细胞可保持持续增殖，可达30天。NCM包含多种细胞因子，可刺激人体免疫细胞发挥自主免疫抗瘤活性。

Description

一种同时激活CD4+ & CD8+ T细胞的免疫细胞的培养方法

技术领域

本发明属于体外细胞培养领域，也属于肿瘤生物治疗领域，具体涉及一种同时激活CD4⁺ & CD8⁺ T细胞的免疫细胞培养方法和天然细胞因子混合物的诱导制备方法。

背景技术

肿瘤生物治疗是一类应用细胞生物学和分子生物学手段，对机体免疫系统或肿瘤的生长进行调节，从而抑制肿瘤生长或将之破坏的治疗方法，是肿瘤康复医学一种新兴的、具有显著疗效的治疗方法，具有靶向性强、无明显毒副作用等优势，已被视为继手术、放疗、化疗之后的第四种治疗方法。肿瘤生物治疗包括细胞因子治疗、免疫细胞治疗、干细胞治疗、基因治疗、分子靶向治疗等。

免疫细胞治疗是采集患者自身免疫细胞，经过体外培养，使其数量成千倍增多，增强其靶向杀伤性，然后再回输到患者体内杀灭血液及组织中的病原体、癌细胞、突变的细胞，打破免疫耐受，激活和增强机体的免疫机能，兼顾治疗和保健的双重功效。包括细胞因子诱导的杀伤细胞（Cytokine induced killer, CIK）疗法、树突状细胞（Dendritic Cells,DC）疗法、DC+CIK细胞疗法、自然杀伤细胞(Natural killer cell,NK)疗法等。

CIK细胞最初是指在正常人体外周血中只占1～5%的CD3⁺CD56⁺的T淋巴细胞目前国内外制备的用于过继免疫治疗的CIK细胞，实际上是体外扩增出的以CD3⁺CD56⁺CD3⁺CD8⁺为主的异质性细胞该细胞是在多种细胞因子如rhIL-2rhIFN-γ及某些单克隆抗体(Anti-CD3McAb)的刺激下，由从外周血骨髓或脐血中分离出来的单个核细胞在体外培养扩增而成，具有广泛的非MHC限制的极强的溶瘤活性

CIK的主要效应细胞CD3⁺CD56⁺T淋巴细胞在正常人体外周血中仅占1～5%，单个核细胞在体外经过培养扩增，CD3⁺CD56⁺T淋巴细胞可增殖1000倍以上。从患者体内抽取少量外周血，在GMP实验室里，分离单个核细胞，经过各种药品诱导和培养基培养，使其杀伤肿瘤细胞的能力增强，细胞数量增多，将这种细胞扩增到一定数量后再回输给患者，杀灭那些肉眼看不见的肿瘤细胞，从而预防肿瘤的复发和转移。

从八十年代Rosenberg等观察到在患非免疫系统肿瘤的动物中给予重组白细胞介素-2(rIL-2)，动物的淋巴细胞可以调节肿瘤的消退和转移以来，免疫细胞治疗的临床应用就迅速扩展开来，人们先后研究了淋巴因子激活的杀伤细胞(Lymphokine activated killer cells,LAK)，肿瘤浸润淋巴细胞(Tumor infiltrating lymphocyte,TIL)，CD3单抗激活的杀伤细胞(Anti-CD3 monoclonal antibody activated killer cells, CD3AK)，但是由于细胞来源困难、细胞扩增倍数低或者细胞毒力不高等原因，上述细胞的临床应用受到极大限制，为此，美国斯坦福大学医学院骨髓移植研究中心1991年报道了具有高增殖能力和高细胞毒性的细胞因子激活的杀伤(CIK)细胞（Schmidt-Wolf,et al.J.Exp.Med.1991;174 (1):139-149）。

T细胞，是由胸腺内的淋巴干细胞分化而成，是淋巴细胞中数量最多，功能最复杂的一类细胞。按其功能可分为三个亚：辅助性T细胞、抑制性T细胞和细胞毒性T细胞。T淋巴细胞根据发育过程中出现的分化抗原的不同，分为CD4⁺T和CD8⁺T细胞，CD4⁺T即辅助性T细胞（helper T cell)，简称Th细胞，能分泌多种细胞因子。据其分泌的细胞因子的不同可分为Th0、Th1、Th2 和Th3 四个亚型。Th1细胞主要分泌白细胞介素-2 (Interleukin-2,IL-2)、干扰素-γ(Interferon-γ,IFN-γ)、IFN-α、肿瘤坏死因子-β(Tumor necrosis factor-β,TNF-β)等，主要介导细胞毒性和局部炎症有关的免疫应答，辅助抗体生成，参与细胞免疫及迟发型超敏性炎症的发生，故称为炎症性T细胞，可被视为迟发型超敏反应T细胞。因而，Th1细胞在机体抗胞内病原体感染中发挥重要作用。Th2细胞主要分泌IL-4、IL-5、IL-6和IL-10等，主要功能为刺激B细胞增殖并产生免疫球蛋白IgG1和IgE，与体液免疫有关。少数Th细胞被称为Th3细胞，它除分泌大量的IL-4和IL-10外，主要高表达TGF-β，但是不分泌IL-2和IFN-γ。Th1、Th2和Th3细胞均由前体细胞Th0分化而来。未接触抗原的T细胞被称为Th细胞前体(Thcell precursor)，它们通过接触天然免疫细胞摄取的抗原而分化成一种不确定的状态，称为Th0细胞。Th0细胞既分泌Th1型细胞因子IL-2和IFN-γ，又分泌Th2型细胞因子IL-4，可在不同信号的刺激下分化为Th1或Th2细胞。

在过去的研究中，CD8⁺T细胞由于可直接杀伤肿瘤细胞而得到了广泛关注，而有关CD4⁺T细胞的研究相对较少，但近年来CD4⁺T细胞在抗肿瘤免疫中的作用越来越受到重视，目前认为CD4⁺T细胞在细胞毒性T淋巴细胞（Cytotoxic T lymphocyte,CTL）的启动、记忆性CD8⁺T细胞的生成和功能的维持等方面起着重要作用，并可直接杀伤肿瘤细胞，在多种肿瘤中，其抗肿瘤活性在一定程度上可能比CD8⁺T细胞更为有效。同时激活CD4⁺T细胞和CD8⁺T细胞是细胞免疫治疗的理想策略。

本发明中的EAIC是Expanded Activated Immune Cell（扩增活化的免疫细胞）的简称，是指通过采集人体50-100mL外周血，分离获得单个核细胞，经过体外诱导扩增培养，获得以CD3⁺T淋巴细胞为主，包含CD4⁺Th1细胞，CD8⁺CTL细胞，CD3⁺CD56⁺NKT细胞，CD3^-CD56⁺NK细胞的混合淋巴细胞。EAIC细胞中含有大量的CD4⁺Th1细胞，可表达分泌高含量的、天然活性的Th1细胞因子。

传统的CIK细胞由于以CD3⁺CD56⁺NKT细胞CD3⁺CD8⁺CTL细胞等细胞毒性T淋巴细胞为主要效应细胞，CD4⁺T细胞比例很少，使其功能与疗效受到了限制。一般的肿瘤患者发现时已属于中晚期，在经历了手术、放化疗等治疗手段后细胞免疫功能低下，体外培养不容易扩增，导致很难达到所需要的细胞数量与细胞质量，这也限制了CIK细胞疗法的疗效。

细胞因子是应用最广泛、疗效最明确的一类生物应答调节剂，随着基因工程技术在生物医学领域中大规模发展，绝大多数细胞因子可通过基因重组的方式获得。免疫细胞在培养过程中表达并分泌多种天然细胞因子于培养液中，包含IL-2、IFNs、TNF-α、GM-CSF、IL-1β、IL-6、IL-12、IL-15、IL-22等。这些细胞因子具有广泛的生物学活性，其作为细胞间信号传递分子，主要参与调解免疫应答、免疫细胞分化发育、组织修复、介导炎症反应、刺激造血功能等，可通过直接和间接的方式作用于肿瘤细胞，产生抗肿瘤活性。

传统的CIK细胞疗法在细胞培养阶段侧重于细胞的激活与扩增，未能高效刺激细胞表达分泌各种天然细胞因子；在细胞制剂制备阶段仅收集细胞，而未利用含有高含量高活性的多种天然细胞因子的培养基上清。CIK细胞等在体外离体培养过程中可以分泌多种高含量的细胞因子，在回输进入人体后，细胞由于受到人体免疫系统的调节和患者体内免疫抑制的影响，分泌细胞因子功能减弱，造成免疫细胞疗法的治疗效果减弱。

天然细胞因子混合物(Natural cytokine mixture,NCM)作为一种新型的生物治疗技术相较于重组细胞因子疗法具有无可比拟的优势。首先，NCM是天然细胞因子，相对于重组细胞因子来说活性更高，细胞毒性和免疫原性更低。其次，NCM包含多种细胞因子，是免疫细胞按最佳配比分泌的，可全方位、立体式的刺激人体免疫细胞发挥自主免疫抗瘤活性。最后，NCM疗法已被国外证实是一种安全有效的治疗方法，不但能够直接发挥抗肿瘤作用，而且还可通过信号活化途径激活和增强人体免疫系统，清除已发生转移的瘤细胞。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种同时激活CD4⁺ & CD8⁺ T细胞的免疫细胞的培养方法和天然细胞因子混合物的制备方法。

现有的方法中加入的重组人IFN-γ活性与效用不足，本发明的培养方法采用Th1细胞分化的关键因子白介素12（IL-12）去刺激细胞，诱导细胞分泌天然人IFN-γ以增强Th1细胞分化、增强NK和CD8⁺T细胞的细胞毒活性。

现有的方法中Th2细胞仍会不断分泌少量Th2细胞因子，Th2细胞因子会促进Th2细胞的增殖与活性、刺激Th2细胞分泌Th2细胞因子、拮抗Th1细胞的增殖与活性及分泌Th1细胞因子，本发明方法采取加入主要Th2细胞因子的天然配体或单克隆抗体（非天然配体）组合物的方式结合培养体系中Th2细胞分泌的Th2细胞因子，使培养初期Th2细胞分泌的Th2细胞因子不能发挥作用。进而使Th1细胞的增殖和分泌细胞因子功能得到进一步加强。

现有的方法培养肿瘤患者的免疫细胞存在增殖困难、细胞中CD4⁺/CD8⁺比值低的问题。左旋咪唑（Levamisole），分子式C₁₁H₁₂N₂S，分子量是204.29，CAS NO.14769-73-4，本发明在培养体系中加入左旋咪唑可以促进淋巴细胞对有丝分裂原的反应，主要使低反应细胞恢复正常，淋巴细胞转化率降低的患者的淋巴细胞在用左旋咪唑刺激后，半数以上反应恢复正常，对未成熟T细胞有促进成熟作用，还可以诱导白细胞分泌干扰素，可促进CD4⁺T细胞增殖，使CD4⁺/CD8⁺比值提高。

现有的方法中只添加一次Anti-CD3McAb，不能使细胞更好更快地增殖与分泌细胞因子，本发明在培养的过程中多次补充Anti-CD3McAb，能使细胞更好更快地增殖与分泌细胞因子。

现有的培养方法只收集细胞制备细胞制剂，未能充分诱导细胞因子的表达与分泌及制备天然细胞因子混合物制剂，本发明通过优化培养体系，促进CD4⁺T细胞增殖及分泌细胞因子，并通过一系列方法处理培养基上清以获得天然细胞因子混合物。

本发明的技术方案是：

将分离好的单个核细胞置于含有rhIL-12、IL-4配体、IL-10配体的培养液中，培养8-12小时后加入左旋咪唑继续培养8-12小时，加入Anti-CD3McAb和rhIL-2，使其在培养液中浓度分别200-600ng/mL和200-500IU/mL，继续培养2-3天，然后交替加入含有rhIL-2的培养基和含Anti-CD3McAb、rhIL-2的培养基，中间的间隔培养时间为2-3天。

培养液中：

所述的rhIL-12的浓度较佳为2-8ng/mL。

IL-4的配体包括天然配体CD124或非天然配体Anti-IL-4McAb。Anti-IL-4McAb的浓度较佳为5-20μg/mL，CD124的浓度较佳为2-8μg/mL。

IL-10配体包括天然配体CDw210或非天然配体Anti-IL-10McAb。Anti-IL-10McAb的浓度较佳为5-20μg/mL，CDw210的浓度较佳为1-5μg/mL。

rhIL-12与IL-4和IL-10的配体联合共同刺激单个核细胞8-12小时后往培养液中加入左旋咪唑，使其在培养液中浓度达到1-10μg /mL。

rhIL-12、IL-4和IL-10的配体与左旋咪唑联合共同刺激单个核细胞继续培养8-12小时，然后向培养体系中加入Anti-CD3McAb、rhIL-2，继续培养2-3天。

然后补充rhIL-2浓度为200-500IU/mL的培养基继续培养2-3天，然后补充Anti-CD3McAb 浓度为200-600ng/mL、rhIL-2浓度为 200-500IU/mL的培养基继续培养2-3天，然后补充rhIL-2浓度为200-500IU/mL的培养基继续培养2-3天，然后补充Anti-CD3McAb浓度为200-600ng/mL、rhIL-2浓度为200-500IU/mL的培养基继续培养2-3天，然后只补充rhIL-2浓度为200-500IU/mL的培养基继续培养下去，如此交替补充培养。

培养基选用无血清培养基，如GT-T551 H3，或者选用DMEM/F12培养基。通过反复多次地给予Anti-CD3McAb能使细胞更好的增殖扩增、提高细胞毒活性和分泌细胞因子。

左旋咪唑（Levamisole），分子式C₁₁H₁₂N₂S，分子量是204.29，CAS NO.14769-73-4，一种广谱驱肠虫药，左旋咪唑可以促进淋巴细胞对有丝分裂原的反应，主要使低反应细胞恢复正常，淋巴细胞转化率降低的患者的淋巴细胞在用左旋咪唑刺激后，半数以上反应恢复正常，对未成熟T细胞有促进成熟作用，还可以诱导白细胞分泌干扰素，可促进CD4⁺T细胞增殖，使CD4⁺/CD8⁺比值提高。

将Anti-CD3McAb溶解在培养液中，且在培养的过程中多次补充Anti-CD3McAb，能使细胞更好更快地增殖与分泌细胞因子，而不多次补充Anti-CD3McAb则无此效果。

本发明的培养方法，CD4⁺T得到激活和扩增，分泌了大量的Th1型细胞因子，这些细胞因子维持了CD8⁺T的持续、快速的增殖。

本发明还提供细胞制剂的制备方案：从培养开始后第12-14天开始每隔两天将部分细胞收获，置于离心管中，离心，弃上清，细胞沉淀用复方电解质注射液悬浮，再离心洗细胞一次，弃上清，将细胞沉淀用复方电解质注射液悬浮均匀，转移到玻璃瓶中，加入人血白蛋白，细胞制剂制备完成。

上述细胞制剂是依靠自然诱生的干扰素诱导细胞，细胞毒性比采用重组干扰素得到提高。

本发明还进一步提供一种天然细胞因子混合物的制备方案：从培养开始后第3-14天收集细胞上清液、通过低温超速离心、超滤离心管超滤、微孔滤膜微滤，滤液为天然细胞因子混合物。然后将此天然细胞因子混合物添加进上述细胞制剂中，或4℃短期保存备用，或-20℃长期保存备用，或无菌条件下将上清置于低硼硅玻璃管制注射剂瓶内，-20℃预冻上清液至凝固状态，将凝固的上清液抽真空，升华干燥，去除冰晶，塞入卤化丁基胶塞，加盖铝塑盖封口，制备成冻干粉制剂，于4℃保存冻干粉。

现有的培养方法所得到的CIK细胞存在CD3⁺CD4⁺Th1细胞比例低下，CD3⁺CD56⁺CD3⁺CD8⁺细胞比例过高、增殖能力低下、杀伤活性低的问题，本发明的EAIC免疫细胞制备方法，所得细胞中CD3⁺CD4⁺Th1细胞比例提高，CD3⁺CD56⁺CD3⁺CD8⁺细胞比例降低、CD4⁺/CD8⁺比值提高。

现有的培养方法侧重于细胞的激活与扩增，未能高效刺激细胞表达分泌各种天然细胞因子，本发明方法通过各种药品的优化组合与培养体系的优化，高效刺激细胞表达分泌各种天然细胞因子，获得可供临床使用的、含有多种高含量天然细胞因子的混合物，该混合物可以和免疫细胞一起使用，亦可单独使用。

本发明的有益效果在于：

本发明培养方法制备出的EAIC免疫细胞制剂中，各亚群比例因个体差异有一定变化范围，一般为T淋巴细胞（CD3⁺）为94-98%，自然杀伤细胞（CD3^-CD56⁺）为2-5%，CD3⁺CD4⁺细胞为50-60%，CD3⁺CD8⁺细胞为35-50%，CD3⁺CD56⁺细胞为20-30%。EAIC细胞中CD4⁺T细胞比例更高，辅助功能和直接杀伤功能更强，细胞因子分泌更多。同时激活CD4⁺ & CD8⁺ T细胞、增殖能力提高、杀伤活性增强，具有更好的肿瘤治疗效果。

本发明的培养方法，细胞可保持持续增殖，可达30天。更长的培养周期，可使得细胞的增殖倍数提高，在一个周期内可更多次收集细胞，从而使患者采集一次血液获得更多次的细胞回输治疗。

肿瘤患者的免疫细胞经本发明方法培养获得的细胞数量比传统的明显增加，体外培养14天后的扩增数是传统方法的3-5倍（见表一）。

本发明培养方法由于同时激活了CD4⁺、CD8⁺T细胞，在动物体内试验中，CD8⁺T细胞由于有更多的CD4⁺T细胞及Th1细胞因子的辅助与CD4⁺T细胞的直接杀伤作用，体内抗肿瘤作用更加强大。

NCM含有多种高含量高活性的天然结构细胞因子，包含IL-2、IFNs、TNF-α、GM-CSF、IL-1β、IL-6、IL-12、IL-15、IL-22等。NCM作为一种新型的生物治疗技术相较于重组细胞因子疗法具有无可比拟的优势。首先，NCM是天然细胞因子，相对于重组细胞因子来说活性更高，细胞毒性和免疫原性更低。其次，NCM包含多种细胞因子，是免疫细胞按最佳配比分泌的，可全方位、立体式的刺激人体免疫细胞发挥自主免疫抗瘤活性。

具体实施方式

下面用实施例来进一步说明本发明，但本发明并不受其限制。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，是按照常规实验方法与条件或者是按照生产厂家所建议的条件。

实施例1 本发明的免疫细胞EAIC与天然细胞因子混合物NCM的制备

（1）外周血单个核细胞（PBMC）的采集分离

无菌条件下用50mL注射器吸取肝素钠抗凝剂，用头皮针采集肿瘤患者外周血50mL。

在生物安全柜中用生理盐水1:1稀释肿瘤患者外周血。

往空的15mL离心管中加入5mL比重为1.077的淋巴细胞分离液（天津市灏洋生物制品科技有限责任公司产品，医用级），然后加入10mL稀释的血液，离心1500rpm/20min。

取白膜层细胞，用PBS液离心1000rpm/20min洗涤两次，用无血清培养基GT-T551 H3悬浮细胞并调整密度为1.0×10⁶细胞/mL。

（2）EAIC免疫细胞的诱导与扩增方法1

向细胞悬液中加入rhIL-12（终浓度为5ng/mL）、Anti-IL-4McAb（终浓度为15μg/mL）、Anti-IL-10McAb（终浓度为15μg/mL）。将细胞悬液置于175cm²培养瓶（丹麦NUNC公司产品）中联合共同刺激单个核细胞12小时。

向培养体系中加入左旋咪唑（终浓度为5μg/mL），刺激单个核细胞继续培养12小时。

向培养体系中加入Anti-CD3McAb（终浓度为200ng/mL）、rhIL-2（终浓度为300IU/mL），补充培养基继续培养2天。

补充rhIL-2浓度为300IU/mL的培养基继续培养2天。

将细胞完全转移至细胞培养袋（宝日医产品）中，补充含Anti-CD3McAb 浓度为200ng/mL、rhIL-2浓度为300IU/mL的培养基继续培养2天。

补充含rhIL-2浓度为300IU/mL的培养基继续培养2天。

补充含Anti-CD3McAb浓度为200ng/mL、rhIL-2浓度为300IU/mL的培养基继续培养2天。

每隔2天补充含rhIL-2浓度为300IU/mL的培养基继续培养至第30天。

（3）EAIC免疫细胞的诱导与扩增方法2

向细胞悬液中加入rhIL-12（终浓度为5ng/mL）、CD124（终浓度为6μg/mL）、CDw210（终浓度为3μg/mL），然后将细胞悬液置于175cm²培养瓶（丹麦NUNC公司产品）中联合共同刺激单个核细胞12小时。

向培养体系中加入左旋咪唑（终浓度为5μg/mL），刺激单个核细胞继续培养12小时。

向培养体系中加入Anti-CD3McAb（终浓度为200ng/mL）、rhIL-2（终浓度为300IU/mL），补充培养基继续培养2天。

补充含rhIL-2浓度为300IU/mL的培养基继续培养2天。

将细胞完全转移至细胞培养袋（宝日医产品）中，补充含Anti-CD3McAb浓度为200ng/mL、rhIL-2浓度为300IU/mL的培养基继续培养2天。

补充含rhIL-2浓度为300IU/mL的培养基继续培养2天。

补充含Anti-CD3McAb浓度为200ng/mL、rhIL-2浓度为300IU/mL的培养基继续培养2天

每隔2天补充含rhIL-2浓度为300IU/mL的培养基继续培养至第30天。

（4）天然细胞因子混合物NCM的制备

从第3-14天离心收集细胞上清液，将细胞返还细胞培养瓶或细胞培养袋中。

细胞上清通过4℃ 100,000 rpm/2h超速离心弃沉淀。

取上清用截留分子量为5KDa超滤离心管超滤。

用0.11μm微孔滤膜微滤。

或将此天然细胞因子混合物添加进细胞制剂中，或4℃短期保存备用，或-20℃长期保存备用，或无菌条件下将上清置于低硼硅玻璃管制注射剂瓶内，-20℃预冻上清液至凝固状态，将凝固的上清液抽真空，升华干燥，去除冰晶，塞入卤化丁基胶塞，加盖铝塑盖封口，于4℃保存冻干粉或运输。

（5）EAIC细胞制剂的制备

14天开始每隔两天将部分细胞收获，置于50mL离心管中，离心1200rpm/10min，弃上清。

细胞沉淀用复方电解质注射液悬浮离心1000rpm/10min洗细胞一次，弃上清。

将细胞沉淀用95mL复方电解质注射液悬浮均匀，转移到100mL玻璃瓶中，加入5mL 20%人血白蛋白，细胞制剂制备完成。

对比例1 传统CIK细胞的制备

参照Schmidt-Wolf的方法进行传统CIK细胞的制备。

分离人外周血单个核细胞（PBMC）。

将PBMC置于IFN-γ浓度为1000u/mL的培养基中，在37℃、5%CO₂条件下培养24小时。

加入Anti-CD3McAb（终浓度为50ng/mL）、IL-1α（终浓度为100u/mL）、IL-2（终浓度为300u/mL）进行激活。

每3天添加IL-2浓度为300u/mL的新鲜培养基，培养至第14天开始收获CIK细胞。

实施例2 本发明实施例1制备的EAIC细胞与NCM的检测

（1）无菌试验和热源检测

根据《中国药典2010 第三部》中无菌检查法、热源检查法检查实施例1所制备的EAIC细胞与NCM，结果均为阴性。

（2）细胞免疫表型分析

用流式细胞仪检测实施例1所制备的EAIC细胞免疫表型。细胞中各亚群比例因个体差异有一定变化范围，一般为T淋巴细胞（CD3⁺）为94-98%，自然杀伤细胞（CD3^-CD56⁺）为2-5%，CD3⁺CD4⁺细胞为50-60%，CD3⁺CD8⁺细胞为35-50%，CD3⁺CD56⁺细胞为20-30%。

（3）细胞存活率

检查方法为常规方法：从细胞制剂中吸取0.1mL细胞，用台盼蓝染料进行染色。正常的活细胞，胞膜结构完整，能够排斥台盼蓝，使之不能够进入胞内；而丧失活性或细胞膜不完整的细胞，胞膜的通透性增加，可被台盼蓝染成蓝色。在显微镜下计数500个细胞，看不被染色细胞的比例。

细胞存活率结果：97%。

（4）细胞生长情况测定

检查方法为常规方法：在细胞培养的第0、5、10、15、20天从细胞培养液中吸取0.1mL细胞，用台盼蓝染料进行染色，然后显微镜下计数。正常的活细胞，胞膜结构完整，能够排斥台盼蓝，使之不能够进入胞内；而丧失活性或细胞膜不完整的细胞，胞膜的通透性增加，可被台盼蓝染成蓝色。并同期计数对比例1传统CIK细胞的数量。

表一 传统CIK与EAIC细胞生长情况（×106个） ⁶

	0d	5d	10d	15d	20d
						传统CIK细胞	42	84	187	585	1216
EAIC细胞	42	119	890	2893	7783

（5）天然细胞因子混合物NCM的检测

天然细胞因子混合物的检测是通过各种细胞因子的定量分析酶联免疫检测试剂盒进行检测，方法和原理是一致的。以nhIFN-γ的含量检测为例，分析NCM中各种细胞因子的含量。

nhIFN-γ含量的ELISA检测：

采用人 IFN-γ定量分析酶联免疫检测试剂盒进行检测。

检测原理：

试剂盒采用双抗体夹心ELISA法检测样本中IFN-γ的浓度。IFN-γ捕获抗体已预包被于酶标板上，当加入标本或参考品时，其中的IFN-γ会与捕获抗体结合，其它游离的成分通过洗涤的过程被除去。当加入生物素化的抗人IFN-γ抗体后，抗人IFN-γ抗体与IFN-γ接合，形成夹心的免疫复合物，其它游离的成分通过洗涤的过程被除去。随后加入辣根过氧化物酶标记的亲合素。生物素与亲合素特异性结合，亲合素连接的酶就会与夹心的免疫复合物连接起来；其它游离的成分通过洗涤的过程被除去。最后加入显色剂，若样本中存在IFN-γ将会形成免疫复合物，辣根过氧化物酶会催化无色的显色剂氧化成蓝色物质，在加入终止液后呈黄色。通过酶标仪检测，读其450nm处的OD值，IFN-γ浓度与OD₄₅₀值之间呈正比，通过参考品绘制标准曲线，对照未知样本中OD值，即可算出标本中IFN-γ浓度。

表二 天然细胞因子混合物NCM各成分及浓度（pg/ml）

天数	IL-2	IFNs	TNF-α	GM-CSF	IL-1β
						0天	2.4±0.03	4.6±0.7	5.8±1.6	7.8±0.9	1.4±0.6
2天	443.8±63.7	13.6±2.0	10.8±1.8	23.1±4.6	15.7±4.4
						4天	1135.7±147.6	384.1±7.9	46.6±4.7	96.8±9.5	558.7±73.0
6天	3692.2±354.8	1233.2±108.9	109.3±26.0	209.2±10.4	1841.5±240.2
						8天	5454.3±665.9	1760.3±132.5	249.9±20.5	392.3±43.0	2893.5±303.9
10天	6018.8±685.0	1953.2±121.3	220.5±20.9	403.2±39.8	3470.9±202.3
						12天	5915.2±295.8	1820.0±392.0	197.3±29.0	350.3±40.2	3409.8±302.9
14天	4972.9±205.9	1638.4±194.0	160.8±30.2	307.3±31.0	2804.3±194.3
						16天	4818.5±240.3	1326.1±98.3	125.6±30.9	261.7±29.1	2204.7±495.5
18天	3366.4±300.1	978.9±49.2	67.4±9.8	174.9±30.5	1152.5±102.9
						20天	1543.7±98.5	509.4±79.3	34.1±2.7	107.8±20.4	895.3±99.2

表三 天然细胞因子混合物NCM各成分及浓度（pg/ml）

天数	IL-6	IL-12	IL-15	IL-22
					0天	9.8±0.1	3.9±0.2	1.7±0.3	1.9±0.3
2天	64.3±7.5	11.6±1.8	6.7±0.5	2.3±0.6
					4天	692.4±43.6	456.7±22.6	397.3±21.5	231.4±12.5
6天	1504.5±372.1	1732.6±110.4	1687.6±102.8	1832.2±502.1
					8天	2130.6±142.1	2798.5±98.0	2965.8±219.4	1965.8±309.8
10天	2023.4±198.3	3586.0±102.9	3687.3±198.3	3086.3±210.5
					12天	1834.5±110.1	4079.6±150.4	3799.0±327.5	2258.9±301.1
14天	1455.3±120.9	3108.3±204.1	2508.3±109.4	1398.4±205.3
					16天	886.3±93.0	2648.7±198.3	1148.7±161.2	878.7±304.1
18天	339.6±42.0	1053.8±87.7	453.8±23.0	93.8±8.1
					20天	79.8±2.1	903.4±102.1	63.4±3.9	13.7±2.3

实施例3 本发明实施例1制备的EAIC细胞与NCM的动物体内抑瘤检测

将30只体重、鼠龄相近的T和NK细胞免疫功能缺陷型—Beige裸鼠随机分成5组。

将1×10⁶个K562细胞分别腹腔注射入上述裸鼠体内，接种后均见肿瘤块生长。

在接种K562细胞后第4天、第6天、第8天、第10天、第12天共5次将生理盐水、传统CIK细胞、EAIC细胞、NCM、EAIC+NCM注射入上述荷瘤小鼠体内，细胞数量均为5×10⁶个，NCM量为0.2mL。

于第20天解剖各小鼠取瘤块、称重。结果见表四。

表四 EAIC、NCM与传统CIK动物体内抑瘤实验结果

疗法	瘤体重量g	肿瘤抑制率%
			生理盐水组	2.58±0.46
传统CIK细胞组	1.91±0.25	25.97
			EAIC细胞组	1.36±0.24	47.29
NCM组	1.41±0.27	45.35
			EAIC+NCM组	1.02±0.16	60.47

*P<0.01，具有显著性差异。

Claims (3)

1.一种同时激活CD4⁺ & CD8⁺ T细胞的免疫细胞的培养方法，其特征在于：

将分离好的单个核细胞置于含有5ng/mL rhIL-12、15μg/mL Anti-IL-4McAb、15μg/mL Anti-IL-10McAb的培养液中，培养12小时后加入终浓度为5μg/mL的左旋咪唑继续培养12小时，加入Anti-CD3McAb和rhIL-2，使其在培养液中浓度分别200ng/mL和300IU/mL，继续培养2天，然后交替加入含有300IU/mL rhIL-2的培养基和含200ng/mL Anti-CD3McAb、300IU/mL rhIL-2的培养基，中间的间隔培养时间为2天。

2.一种CIK细胞制剂的制备方法，其特征在于：

将分离好的单个核细胞置于含有5ng/mL rhIL-12、15μg/mL Anti-IL-4McAb、15μg/mL Anti-IL-10McAb的培养液中，培养12小时后加入终浓度为5μg/mL的左旋咪唑继续培养12小时，加入Anti-CD3McAb和rhIL-2，使其在培养液中浓度分别200ng/mL和300IU/mL，继续培养2天，然后交替加入含有300IU/mL rhIL-2的培养基和含200ng/mL Anti-CD3McAb、300IU/mL rhIL-2的培养基，中间的间隔培养时间为2天；

从培养开始后第12-14天开始每隔两天将部分细胞收获，置于50mL离心管中，离心1200rpm/10min，弃上清，细胞沉淀用复方电解质注射液悬浮离心1000rpm/10min洗细胞一次，弃上清，将细胞沉淀用95mL复方电解质注射液悬浮均匀，转移到100mL玻璃瓶中，加入5mL 20%人血白蛋白，细胞制剂制备完成。

3.一种天然细胞因子混合物的诱导制备方法，其特征在于：

将分离好的单个核细胞置于含有5ng/mL rhIL-12、15μg/mL Anti-IL-4McAb、15μg/mL Anti-IL-10McAb的培养液中，培养12小时后加入终浓度为5μg/mL的左旋咪唑继续培养12小时，加入Anti-CD3McAb和rhIL-2，使其在培养液中浓度分别200ng/mL和300IU/mL，继续培养2天，然后交替加入含有300IU/mL rhIL-2的培养基和含200ng/mL Anti-CD3McAb、300IU/mL rhIL-2的培养基，中间的间隔培养时间为2天；

从培养开始后第3-14天收集细胞上清液、通过低温超速离心、超滤离心管超滤、微孔滤膜微滤，滤液为天然细胞因子混合物。