CN105296425A - 一种治疗肿瘤的多细胞免疫制剂及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
一种治疗肿瘤的多细胞免疫制剂及其制备方法，涉及一种免疫制剂及其制备方法。是要解决现有的免疫细胞制剂对于肿瘤的治疗较为局限，无法保证回输的安全性的问题。该制剂包括免疫细胞、人血白蛋白和复方电解质。方法：一、自体血浆的制备；二、外周血单个核细胞PBMC的分离；三、DC的制备；四、CIK的制备；五、NK细胞的制备；六、CD3AK的制备；七、γδT的制备；八、多细胞免疫制剂的制备。本发明免疫制剂对于肿瘤的治疗具有广谱性，免疫细胞来源于患者本身，没有引入胎牛血清和滋养层细胞等外源性物质，确保了回输的安全性。本发明用于肿瘤治疗领域。
Description
技术领域
本发明涉及一种免疫制剂及其制备方法。
背景技术
外周血单个核细胞(peripheralbloodmononuclearcell，PBMC)，即外周血中具有单个核的细胞，包括淋巴细胞、树突状细胞和其它少量细胞(造血干细胞等)。通过特定因子的诱导，PBMC在体外可以分化为多种免疫细胞，如现在广泛应用于生物治疗的细胞因子诱导的杀伤细胞(cytokineinducedkiller，CIK)，树突状细胞(dendriticcells，DCs)和自然杀伤细胞(naturekillercell，NK)等细胞。
肿瘤生物治疗是新兴的且具有显著疗效的肿瘤治疗模式，该治疗方法疗效显著，无毒副作用。该疗法融合了生物技术和生物制剂等技术手段，从患者体内采集免疫细胞，并在体外进行培养扩增再回输到患者体内，从而激发患者的自身免疫，并增强机体自身免疫，从而达到治疗的效果。
现应用的肿瘤生物治疗多为单一种类的免疫细胞制剂，如CIK细胞，NK细胞。其对于肿瘤的治疗较为局限。而且这类免疫细胞制剂常引入外源性物质，如胎牛血清和滋养层细胞等，无法保证回输的安全性。
发明内容
本发明是要解决现有的免疫细胞制剂对于肿瘤的治疗较为局限，无法保证回输的安全性的问题，提供一种治疗肿瘤的多细胞免疫制剂及其制备方法。
本发明治疗肿瘤的多细胞免疫制剂包括免疫细胞、人血白蛋白和复方电解质，所述免疫细胞包括DC细胞、CIK细胞、NK细胞、CD3AK细胞和γδT细胞。
其中免疫细胞浓度为1×107个细胞/ml～5×107个细胞/ml，人血白蛋白浓度为1～2g/100ml。
所述的人血白蛋白购买自上海莱士血液制品股份有限公司，复方电解质购买自四川科伦药业股份有限公司。
上述治疗肿瘤的多细胞免疫制剂的制备方法，按以下步骤进行：
一、自体血浆的制备：
①采集成人外周血，抗凝剂为枸橼酸钠，将采集到的血液转移至离心管中，2000rpm，离心15min，离心完毕后，收集血浆；
②将收集到的血浆进行灭活处理，56℃水浴30～50min，水浴完毕后，2000rpm离心15min，并收集上清液，即为自体血浆，待用；
二、外周血单个核细胞PBMC的分离：
①将Ficoll溶液分至离心管中，待用，将成人外周血血细胞与复方电解质按照体积比(1～2)：1混合均匀，得稀释后的细胞悬液，将稀释后的细胞悬液缓慢添加至装有Ficoll溶液的离心管中，细胞悬液与Ficoll溶液的体积比为(1.5～2.5)：1；
②小心将离心管转移至离心机，2000rpm，离心20min；
③收集白膜层细胞并用复方电解质离心洗涤两次，最终用复方电解质重悬细胞并计数备用，即得到外周血单个核细胞PBMC；
所述成人外周血血细胞是将成人外周血离心去掉上层血浆获得的血细胞；
三、DC的制备：
①将步骤二收集得到的PBMC用RPMI-1640培养基将浓度调整为1×106个/ml～3×106个/ml，接种于细胞培养瓶内，置于37℃，5％CO2培养箱中孵育2～4h，使DC细胞前体可以充分贴壁；
②然后收集悬浮细胞，平均分为4份，待用；
③向贴有DC细胞的培养瓶中加入适量GT-T551培养基，同时添加rhGM-CSF、rhIL-4和自体血浆上清，其中rhGM-CSF和rhIL-4的终浓度均为500～1000U/ml，自体血浆上清的体积为培养瓶中培养液体积的10％；
④每隔两天对细胞进行半量换液，同时补足细胞因子rhGM-CSF和rhIL-4至终浓度均为500～1000U/ml，并加入培养液体积2％的自体血浆上清；
⑤培养第6天时添加rhTNF-α至终浓度为500-1000U/ml；
⑥培养第8天时，收集树突状细胞DC，并留样进行流式检测，计数并将DC平均分为两份，一份浓缩至1ml用于皮下注射，一份冻存于-80℃冰箱内。并留样进行细菌、真菌、内毒素和流式检测。培养14天时，复苏DC；
其中要满足细菌和真菌检测结果为阴性，内毒素检测结果不高于0.25EU/ml，流式检测结果要求CD83+>40％，CD86+>50％，CD11c+>50％，HLA-DR+>60％；
四、CIK的制备：
①取步骤三中收集到的悬浮细胞1份，并离心收集细胞，接种于培养瓶内，添加IFN-γ和自体血浆上清，置于37℃，7.5％CO2培养箱中培养，培养液中IFN-γ的终浓度为1800-2500IU/ml，自体血浆上清的体积为培养液体积的10％；
②培养第1天加入启动因子rhIL-2至终浓度为4000IU/ml，再加入OKT3至终浓度为5-10μg/ml；
③培养时，对细胞密度进行检测，当细胞密度达到1.5×106个/ml-2×106个/ml时，添加GT-T551培养基并扩大培养，其中添加的培养基中含有1000-2000IU/ml的rhIL-2和自体血浆上清，自体血浆上清的体积为培养基体积的2％；
④培养14天时收集细胞并留样进行细菌、真菌、内毒素和流式检测，即得到CIK细胞；其中要满足细菌和真菌检测结果为阴性，内毒素检测结果不高于0.25EU/ml，流式检测结果要求CD3+CD8+>60％，CD3+CD56+>20％；
五、NK细胞的制备：
①取步骤三中收集到的悬浮细胞1份，并离心收集细胞，使用GT-T561培养基重悬细胞，添加rhIL-2和自体血浆上清，置于37℃，5％CO2培养箱中培养，其中培养液中rhIL-2的终浓度为500-1000IU/ml，自体血浆上清的体积为培养液体积的10％；
②培养时，对细胞密度进行检测，当细胞密度达到1.2×106个/ml-1.8×106个/ml时，添加GT-T561培养基并扩大培养，其中添加的培养基中含有500-1000IU/ml的rhIL-2和自体血浆上清，自体血浆上清的体积为培养基体积的2％；
③培养14天时收集细胞并留样进行细菌、真菌、内毒素和流式检测，即得到NK细胞；
其中要满足细菌和真菌检测结果为阴性，内毒素检测结果不高于0.25EU/ml，流式检测结果要求CD3-CD56+>80％；
六、CD3AK的制备：
①取步骤三中收集到的悬浮细胞1份，接种于培养瓶内，添加rhIL-2、OKT3和自体血浆上清，置于37℃，5％CO2培养箱中培养，其中rhIL-2的终浓度为1000-2000IU/ml，OKT3的终浓度为5-10μg/ml，自体血浆上清的体积为培养液体积的10％；
②培养时，对细胞密度进行检测，当细胞密度达到1.2×106个/ml-1.8×106个/ml时，添加RPMI-1640培养基并扩大培养，其中添加的培养基中含有500-1000IU/ml的rhIL-2和自体血浆上清，自体血浆上清的体积为培养基体积的2％；
③培养14天时收集细胞并留样进行细菌、真菌、内毒素和流式检测，即得到CD3AK细胞；其中要满足细菌和真菌检测结果为阴性，内毒素检测结果不高于0.25EU/ml，流式检测结果要求CD3+>50％，CD8+>30％，CD25+>20％，CD56+>20％；
七、γδT的制备：
①用RPMI-1640培养基将TCRγδ单克隆抗体稀释，终浓度为1μg/ml，包被培养瓶，37℃孵育2h，弃掉包被液，用RPMI-1640培养基小心清洗培养瓶，并取步骤三中收集到的悬浮细胞1份，接种至培养瓶内，添加rhIL-2和自体血浆上清，置于37℃，5％CO2培养箱中培养，其中rhIL-2的终浓度为200-500IU/ml，自体血浆上清的体积为培养液体积的10％；
②培养时，对细胞密度进行检测，当细胞密度达到1.2×106个/ml-1.8×106个/ml时，添加培养基并扩大培养，其中添加的培养基中含有500-1000IU/ml的rhIL-2和自体血浆上清，自体血浆上清的体积为培养基体积的2％；
③培养14天时收集细胞并留样进行细菌、真菌、内毒素和流式检测，即得到γδT细胞；
其中要满足细菌和真菌检测结果为阴性，内毒素检测结果不高于0.25EU/ml，流式检测结果要求CD4+>30％，CD25+>50％；
八、多细胞免疫制剂的制备：
①将冻存后复苏的DC细胞、CIK细胞、NK细胞、CD3AK细胞和γδT细胞分别进行洗涤：使用复方电解质对细胞进行离心洗涤，洗涤3次后用复方电解质重悬细胞，分别得到5种细胞悬液；
②然后使用200目的滤器过滤细胞悬液，并取样计数，计活，细胞活率不低于95％；
③将过滤后的细胞悬液混合得免疫细胞，将免疫细胞转移至回输袋中，并添加复方电解质和人血白蛋白，即得到治疗肿瘤的多细胞免疫制剂。
其中免疫细胞浓度为1×107个细胞/ml～5×107个细胞/ml，人血白蛋白浓度为1～2g/100ml，所述免疫细胞为DC细胞、CIK细胞、NK细胞、CD3AK细胞和γδT细胞。
机体本身具有免疫调节的功能，而免疫调节中起主要作用的为免疫细胞。随着机体年龄增大，机体免疫逐渐老化，因此患肿瘤疾病的机率也逐渐增大。已有研究表明，除基因水平等原因外，肿瘤患者罹患肿瘤疾病是因为机体内免疫系统产生的免疫细胞较少，无法及时清除体内突变的肿瘤细胞。通过免疫治疗的手段，可以先将患者体内的免疫细胞分离，在体外诱导并扩大培养后回输到患者体内，这也可以大大的增强患者的免疫功能。
本方法首先对人外周血进行分离纯化，培养所得的单个核细胞；对得到的单个核细胞进行诱导培养，添加相应生长因子以诱导细胞分化；收集细胞悬液及细胞洗涤液上清液，分别对其进行细菌、真菌、内毒素和细胞活率等指标的检测，指标合格后方可发出制剂用于回输；之后收集细胞并用多次洗涤，并留样进行免疫表型的检测，将细胞重悬于细胞保存液中，加入人血白蛋白和复方电解质，即可得到多细胞免疫制剂。
本发明的有益效果：
本发明在诱导单个核细胞分化为不同种类的免疫细胞过程中，添加人源重组白细胞介素-2、人源重组白细胞介素-4、干扰素γ、抗CD3单克隆抗体、TCRγδ单克隆抗体、人源粒细胞/巨噬细胞集落刺激因子和人源肿瘤坏死因子-α，能够诱导单个核细胞向不同的方向分化，同时添加灭活的患者血浆上清可以确保提供细胞增殖所需的大量营养成分。
本发明在在肿瘤的临床治疗中对除T细胞淋巴瘤以外的所有肿瘤均有显著的疗效，其中γδT细胞、CD3AK细胞在治疗肿瘤上更具有针对性；CD3AK细胞对乙肝、肝癌、宫颈癌、鼻咽癌、B细胞淋巴瘤等病毒性疾病具有重要的作用；而γδT细胞主要分布在粘膜，所以对于粘膜相关的肿瘤具有很好的治疗意义，本发明的多细胞免疫制剂对于肿瘤的治疗具有广谱性，如肺癌、胰腺癌、胃癌、喉癌、甲状腺癌及对恶性血液病等均具有非常好的疗效。
将CIK细胞和同源DC细胞共培养后，既可促进DC细胞的成熟，更能促进ClK的增殖，并加强其抗肿瘤活性。另外该免疫制剂中又添加了NK细胞、CD3AK细胞和γδT细胞，多种细胞相互作用，可使治疗后患者的生活质量明显提高，患者的生存期也大大延伸。
本发明的多细胞免疫制剂中含有人血白蛋白和复方电解质，二者可以保护细胞，通过维持渗透压，确保细胞的活性。同时此二者皆可直接用于静脉注射。
本发明的免疫细胞来源于患者本身，没有引入胎牛血清和滋养层细胞等外源性物质，确保了回输的安全性。
附图说明
图1为实施例1多细胞免疫制剂体外杀瘤性实验结果柱状图。
具体实施方式
本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式，还包括各具体实施方式间的任意组合。
具体实施方式一：本实施方式治疗肿瘤的多细胞免疫制剂包括免疫细胞、人血白蛋白和复方电解质，所述免疫细胞包括DC细胞、CIK细胞、NK细胞、CD3AK细胞和γδT细胞；其中免疫细胞浓度为1×107个细胞/ml～5×107个细胞/ml，人血白蛋白浓度为1～2g/100ml。
具体实施方式二：本实施方式与具体实施方式一不同的是：免疫细胞浓度为2×107个细胞/ml～4×107个细胞/ml。其它与具体实施方式一相同。
具体实施方式三：本实施方式治疗肿瘤的多细胞免疫制剂的制备方法，按以下步骤进行：
一、自体血浆的制备：
①采集成人外周血，抗凝剂为枸橼酸钠，将采集到的血液转移至离心管中，离心收集血浆；
②将收集到的血浆进行灭活处理，56℃水浴30～50min，水浴完毕后，离心收集上清液，即为自体血浆，待用；
二、外周血单个核细胞PBMC的分离：
①将Ficoll溶液分至离心管中，待用，将成人外周血血细胞与复方电解质按照体积比(1～2)：1混合均匀，得稀释后的细胞悬液，将稀释后的细胞悬液添加至装有Ficoll溶液的离心管中，细胞悬液与Ficoll溶液的体积比为(1.5～2.5)：1；
②将离心管转移至离心机，2000rpm，离心20～30min；
③收集白膜层细胞并用复方电解质离心洗涤两次，最终用复方电解质重悬细胞并计数备用，即得到外周血单个核细胞PBMC；
三、DC的制备：
①将步骤二收集得到的PBMC用RPMI-1640培养基将浓度调整为1×106个/ml～3×106个/ml，接种于细胞培养瓶内，置于37℃，5％CO2培养箱中孵育2～4h，使DC细胞前体贴壁；
②然后收集悬浮细胞，平均分为4份，待用；
③向贴有DC细胞的培养瓶中加入GT-T551培养基，同时向培养瓶的培养液中添加rhGM-CSF、rhIL-4和自体血浆上清；
④每隔两天对细胞进行半量换液，同时补足细胞因子rhGM-CSF和rhIL-4至终浓度均为500～1000U/ml，并加入培养液体积2％的自体血浆上清；
⑤培养第6天时添加rhTNF-α至终浓度为500-1000U/ml；
⑥培养第8天时，收集树突状细胞DC，并留样进行流式检测，计数，冻存于-80℃冰箱内，并留样进行细菌、真菌、内毒素和流式检测，培养14天时，复苏DC；
其中要满足细菌和真菌检测结果为阴性，内毒素检测结果不高于0.25EU/ml，流式检测结果要求CD83+>40％，CD86+>50％，CD11c+>50％，HLA-DR+>60％；
四、CIK的制备：
①取步骤三中收集到的悬浮细胞1份，并离心收集细胞，接种于培养瓶内，向培养瓶的培养液中添加IFN-γ和自体血浆上清，置于37℃，7.5％CO2培养箱中培养；
②培养第1天加入启动因子rhIL-2至终浓度为4000IU/ml，再加入OKT3至终浓度为5-10μg/ml；
③培养时，对细胞密度进行检测，当细胞密度达到1.5×106个/ml-2×106个/ml时，添加GT-T551培养基并扩大培养，其中添加的培养基中含有1000-2000IU/ml的rhIL-2和自体血浆上清，自体血浆上清的体积为培养基体积的2％；
④培养14天时收集细胞并留样进行细菌、真菌、内毒素和流式检测，即得到CIK细胞；其中要满足细菌和真菌检测结果为阴性，内毒素检测结果不高于0.25EU/ml，流式检测结果要求CD3+CD8+>60％，CD3+CD56+>20％；
五、NK细胞的制备：
①取步骤三中收集到的悬浮细胞1份，并离心收集细胞，接种于培养瓶内使用GT-T561培养基重悬细胞，向培养瓶的培养液中添加rhIL-2和自体血浆上清，置于37℃，5％CO2培养箱中培养；
②培养时，对细胞密度进行检测，当细胞密度达到1.2×106个/ml-1.8×106个/ml时，添加GT-T561培养基并扩大培养，其中添加的培养基中含有500-1000IU/ml的rhIL-2和自体血浆上清，自体血浆上清的体积为培养基体积的2％；
③培养14天时收集细胞并留样进行细菌、真菌、内毒素和流式检测，即得到NK细胞；
其中要满足细菌和真菌检测结果为阴性，内毒素检测结果不高于0.25EU/ml，流式检测结果要求CD3-CD56+>80％；
六、CD3AK的制备：
①取步骤三中收集到的悬浮细胞1份，接种于培养瓶内，向培养瓶的培养液中添加rhIL-2、OKT3和自体血浆上清，置于37℃，5％CO2培养箱中培养；
②培养时，对细胞密度进行检测，当细胞密度达到1.2×106个/ml-1.8×106个/ml时，添加RPMI-1640培养基并扩大培养，其中添加的培养基中含有500-1000IU/ml的rhIL-2和自体血浆上清，自体血浆上清的体积为培养基体积的2％；
③培养14天时收集细胞并留样进行细菌、真菌、内毒素和流式检测，即得到CD3AK细胞；其中要满足细菌和真菌检测结果为阴性，内毒素检测结果不高于0.25EU/ml，流式检测结果要求CD3+>50％，CD8+>30％，CD25+>20％，CD56+>20％；
七、γδT的制备：
①用RPMI-1640培养基将TCRγδ单克隆抗体稀释，终浓度为1μg/ml，包被培养瓶，37℃孵育2h，弃掉包被液，用RPMI-1640培养基清洗培养瓶，并取步骤三中收集到的悬浮细胞1份，接种至培养瓶内，向培养瓶的培养液中添加rhIL-2和自体血浆上清，置于37℃，5％CO2培养箱中培养；
②培养时，对细胞密度进行检测，当细胞密度达到1.2×106个/ml-1.8×106个/ml时，添加RPMI-1640培养基并扩大培养，其中添加的培养基中含有500-1000IU/ml的rhIL-2和自体血浆上清，自体血浆上清的体积为培养基体积的2％；
③培养14天时收集细胞并留样进行细菌、真菌、内毒素和流式检测，即得到γδT细胞；
其中要满足细菌和真菌检测结果为阴性，内毒素检测结果不高于0.25EU/ml，流式检测结果要求CD4+>30％，CD25+>50％；
八、多细胞免疫制剂的制备：
①将冻存后复苏的DC细胞、CIK细胞、NK细胞、CD3AK细胞和γδT细胞分别进行洗涤：使用复方电解质对细胞进行离心洗涤，洗涤3次后用复方电解质重悬细胞，分别得到5种细胞悬液；
②然后使用200目的滤器过滤细胞悬液，并取样计数，计活，细胞活率不低于95％；
③将过滤后的细胞悬液混合得免疫细胞，将免疫细胞转移至回输袋中，并添加复方电解质和人血白蛋白，即得到治疗肿瘤的多细胞免疫制剂。
其中细菌、真菌、内毒素和流式检测的结果符合以下标准方可使用：
细菌和真菌检测结果为阴性，内毒素检测结果不高于0.25EU/ml，流式检测结果要求CD3+CD8+>60％，CD3+CD56+>20％。
具体实施方式四：本实施方式与具体实施方式三不同的是：步骤一中离心的条件为2000rpm，离心15min。其它与具体实施方式三相同。
具体实施方式五：本实施方式与具体实施方式三或四不同的是：步骤三的第③步培养液中rhGM-CSF和rhIL-4的终浓度均为500～1000U/ml，自体血浆上清的体积为培养瓶中培养液体积的10％。其它与具体实施方式三或四相同。
具体实施方式六：本实施方式与具体实施方式三至五之一不同的是：步骤四的第①步培养液中IFN-γ的终浓度为1800-2500IU/ml，自体血浆上清的体积为培养液体积的10％。其它与具体实施方式三至五之一相同。
具体实施方式七：本实施方式与具体实施方式三至六之一不同的是：步骤五的第①步培养液中rhIL-2的终浓度为500-1000IU/ml，自体血浆上清的体积为培养液体积的10％。其它与具体实施方式三至六之一相同。
具体实施方式八：本实施方式与具体实施方式三至七之一不同的是：步骤六的第①步培养液中rhIL-2的终浓度为1000-2000IU/ml，OKT3的终浓度为5-10μg/ml，自体血浆上清的体积为培养液体积的10％。其它与具体实施方式三至七之一相同。
具体实施方式九：本实施方式与具体实施方式三至八之一不同的是：步骤七的第①步培养液中rhIL-2的终浓度为200-500IU/ml，自体血浆上清的体积为培养液体积的10％。其它与具体实施方式三至八之一相同。
具体实施方式十：本实施方式与具体实施方式三至九之一不同的是：步骤八的第③步多细胞免疫制剂中免疫细胞浓度为1×107个细胞/ml～5×107个细胞/ml，人血白蛋白浓度为1～2g/100ml。其它与具体实施方式三至九之一相同。
为验证本发明的有益效果进行以下试验：
一、自体血浆的制备：
采集成人外周血100ml，抗凝剂为枸橼酸钠。将采集到的血液转移至离心管中，2000rpm，离心15min。离心完毕后，收集血浆。
将收集到的血浆进行灭活处理，56℃水浴40min。水浴完毕后，2000rpm离心15min，并收集上清液，即为自体血浆，待用。
二、外周血单个核细胞PBMC的分离：
将Ficoll溶液分至离心管中，待用。将脐带血血细胞与复方电解质按照体积比1：1混合均匀，得稀释后的细胞悬液。将稀释后的细胞悬液缓慢添加至装有Ficoll溶液的离心管中，细胞悬液与Ficoll溶液的体积比为2：1。
小心将离心管转移至离心机，2000rpm，离心20min。
收集白膜层细胞并用复方电解质离心洗涤两次，最终用复方电解质重悬细胞并计数备用，即得到外周血单个核细胞PBMC。
所述脐带血血细胞是将脐带血离心去掉上层血浆获得的血细胞。
三、DC的制备：
将步骤二收集得到的PBMC用RPMI-1640培养基将浓度调整为1×106个/ml～3×106个/ml，接种于细胞培养瓶内，置于37℃，5％CO2培养箱中孵育2h，使DC细胞前体可以充分贴壁。
然后收集悬浮细胞，平均分为4份，待用。
向贴有DC细胞的培养瓶中加入适量GT-T551(购买自takara)培养基，同时添加rhGM-CSF、rhIL-4和自体血浆上清，其中rhGM-CSF和rhIL-4的终浓度均为500～1000U/ml，自体血浆上清的体积为培养瓶中培养液体积的10％。
每隔两天对细胞进行半量换液，同时补足细胞因子rhGM-CSF和rhIL-4至终浓度均为500～1000U/ml，并加入培养液体积2％的自体血浆上清。
培养第6天时添加rhTNF-α至终浓度为500-1000U/ml。
培养第8天时，收集树突状细胞DC，并留样进行流式检测，计数并将DC平均分为两份，一份浓缩至1ml用于皮下注射，一份冻存于-80℃冰箱内。并留样进行细菌、真菌、内毒素和流式检测。培养14天时，复苏DC。
其中细菌和真菌检测结果为阴性，内毒素检测结果不高于0.25EU/ml，流式检测结果要求CD83+>40％，CD86+>50％，CD11c+>50％，HLA-DR+>60％；
四、CIK的制备：
取步骤三中收集到的悬浮细胞1份，并离心收集细胞，接种于培养瓶内，添加IFN-γ至终浓度为1800-2500IU/ml，自体血浆上清10％。置于37℃，7.5％CO2培养箱中培养。
培养第1天加入启动因子rhIL-2至终浓度为4000IU/ml，加入OKT3至终浓度为5-10μg/ml。
培养时，对细胞密度进行检测，当细胞密度达到1.5×106个/ml-2×106个/ml时，添加3倍体积的GT-T551培养基并扩大培养，其中添加的培养基中含有1000-2000IU/ml的rhIL-2和自体血浆上清，自体血浆上清的体积为培养基体积的2％；
培养14天时收集细胞并留样进行细菌、真菌、内毒素和流式检测，即得到CIK细胞。
其中细菌和真菌检测结果为阴性，内毒素检测结果不高于0.25EU/ml，流式检测结果要求CD3+CD8+>60％，CD3+CD56+>20％；
五、NK细胞的制备：
取步骤三中收集到的悬浮细胞1份，并离心收集细胞，使用GT-T561培养基(购买自takara)重悬细胞，添加rhIL-2和自体血浆上清，其中培养液中rhIL-2的终浓度为500-1000IU/ml，自体血浆上清的体积为培养液体积的10％。置于37℃，5％CO2培养箱中培养。
培养时，对细胞密度进行检测，当细胞密度达到1.2×106个/ml-1.8×106个/ml时，添加3倍体积的GT-T561培养基并扩大培养，其中添加的培养基中含有500-1000IU/ml的rhIL-2和自体血浆上清，自体血浆上清的体积为培养基体积的2％；
培养14天时收集细胞并留样进行细菌、真菌、内毒素和流式检测，即得到NK细胞。
其中细菌和真菌检测结果为阴性，内毒素检测结果不高于0.25EU/ml，流式检测结果要求CD3-CD56+>80％。
六、CD3AK的制备：
取步骤三中收集到的悬浮细胞1份，接种于培养瓶内，添加rhIL-2、OKT3和自体血浆上清，rhIL-2的终浓度为1000-2000IU/ml，OKT3的终浓度为5-10μg/ml，自体血浆上清的体积为培养液体积的10％。置于37℃，5％CO2培养箱中培养。
培养时，对细胞密度进行检测，当细胞密度达到1.2×106个/ml-1.8×106个/ml时，添加3倍体积的RPMI-1640培养基并扩大培养，其中添加的培养基中含有500-1000IU/ml的rhIL-2和自体血浆上清，自体血浆上清的体积为培养基体积的2％；
培养14天时收集细胞并留样进行细菌、真菌、内毒素和流式检测，即得到CD3AK细胞。其中细菌和真菌检测结果为阴性，内毒素检测结果不高于0.25EU/ml，流式检测结果要求CD3+>50％，CD8+>30％，CD25+>20％，CD56+>20％。
七、γδT的制备：
用RPMI-1640培养基将TCRγδ单克隆抗体(为市售商品，可购买得到)稀释，终浓度为1μg/ml，包被培养瓶，37℃孵育2h。弃掉包被液，用RPMI-1640培养基小心清洗培养瓶，并取步骤三中收集到的悬浮细胞1份，接种至培养瓶内，添加rhIL-2和自体血浆上清，rhIL-2的终浓度为200-500IU/ml，自体血浆上清的体积为培养液体积的10％。置于37℃，5％CO2培养箱中培养。
培养时，对细胞密度进行检测，当细胞密度达到1.2×106个/ml-1.8×106个/ml时，添加3倍体积的RPMI-1640培养基并扩大培养，其中添加的培养基中含有500-1000IU/ml的rhIL-2和自体血浆上清，自体血浆上清的体积为培养基体积的2％；
培养14天时收集细胞并留样进行细菌、真菌、内毒素和流式检测，即得到γδT细胞。
其中细菌和真菌检测结果为阴性，内毒素检测结果不高于0.25EU/ml，流式检测结果要求CD4+>30％，CD25+>50％。
八、多细胞免疫制剂的制备：
①将冻存后复苏的DC细胞、CIK细胞、NK细胞、CD3AK细胞和γδT细胞分别进行洗涤：使用复方电解质对细胞进行离心洗涤，洗涤3次后用复方电解质重悬细胞，分别得到5种细胞悬液；
②然后使用200目的滤器过滤细胞悬液，并取样计数，计活，细胞活率不低于95％；
③将过滤后的细胞悬液混合得免疫细胞，将免疫细胞转移至回输袋中，并添加复方电解质和人血白蛋白，即得到治疗肿瘤的多细胞免疫制剂。多细胞免疫制剂的总体积为100ml，其中人血白蛋白的浓度为1g/100ml，免疫细胞浓度为3×107个细胞/ml。
其中细菌、真菌、内毒素和流式检测的结果符合以下标准方可使用：
细菌和真菌检测结果为阴性，内毒素检测结果不高于0.25EU/ml，流式检测结果要求CD3+CD8+>60％，CD3+CD56+>20％。
排除回输袋内气泡，用热合机封口。待回输。
为证明多细胞免疫制剂能够治疗肿瘤疾病的疗效，首先应用流式细胞仪检测五种细胞的免疫表型。其中DC检测CD11c、HLA-DR、CD83和CD86；CIK检测CD3、CD8和CD56；NK检测CD3、CD16和CD56；CD3AK检测CD3、CD8、CD25和CD56；γδT检测CD4和CD25(见表1-5)。其次应验证多细胞免疫制剂的杀瘤性。
(一)五种细胞的流式检测
表1DC流式检测结果
表2CIK流式检测结果
表3NK流式检测结果
表4CD3AK流式检测结果
表5γδT流式检测结果
流式结果表明，按上述培养方式培养获得的免疫细胞阳性标志物表达率较高，细胞纯度较好。
(二)本实施例多细胞免疫制剂体外杀瘤性实验：
多细胞免疫制剂体外杀瘤性实验的靶细胞为K562。K562的培养条件为5％FBS的RPMI-1640培养基，37℃，5％CO2。采集三份外周血样本，并按照前文所述实验方法进行细胞的培养和多细胞免疫制剂的制备，组别分别标记为a、b、c至f(见表6)。将K562接种于96孔板中，每孔接种细胞5×103个。4h后，待K562完全贴壁后，取制备好的细胞制剂，并离心获得细胞，采用5％FBS的RPMI-1640培养基将细胞沉淀重悬，并调整细胞密度为1×105(效应细胞：靶细胞＝20：1)个/ml，每个组别选择5个孔，并做好标注，弃掉其中的培养基，添加重悬好的免疫细胞悬液，每孔添加200μl。分别在1h、2h、3h和5h共4个时间点采用MTT测其吸光值(OD570nm)，并按照下述公式计算其杀瘤性：
杀伤率＝[(空白组OD值—实验组OD值)/空白组OD值]×100％
表6体外杀瘤性实验组别设计
实验结果见表7和图1，图中表示1h，表示2h，表示3h，表示5h。
表7多细胞免疫制剂体外杀瘤性实验
实验结果表明，本发明的多细胞免疫制剂是具有杀瘤性的，且多种免疫细胞的联合应用将会大幅度提高其杀瘤性。此外已有研究证明，NK和γδT的联合应用对于Jurkat细胞的杀伤作用也会显著增强。
(三)本实施例多细胞免疫制剂体外杀瘤性实验：
体内杀瘤性实验选用16只裸鼠，雌性，体重15-20g，4周龄。将K562细胞用生理盐水悬浮，调整细胞浓度为1×106/ml，每只裸鼠注射细胞体积为0.2ml，即2×105个细胞。在无菌条件下，将制备好的肿瘤细胞悬浮液接种于裸鼠左腋下。将裸鼠随机分为四组，标为A、B、C和D组(详见表8)。多细胞免疫制剂注射方式为尾缘静脉注射。小鼠培养至20天时进行解剖，获得肿瘤组织并称重。并按照下述公式计算其抑癌率：
抑癌率＝[(对照组肿瘤重量—实验组肿瘤重量)/对照组肿瘤重量]×100％
表8体内杀瘤性实验组别设定
实验结果见表9。
表9体内杀瘤性实验结果
实验结果表明，多细胞免疫制剂的应用对于体内杀瘤性具有显著效果。
上述多细胞免疫制剂在应用时可以通过静脉注射方式注入患者体内，通过免疫细胞本身的功能来识别并消灭肿瘤细胞。根据体外杀伤性实验可以看出，该制剂可以杀伤肿瘤细胞，且作用效果明显，该制剂可应用到肿瘤治疗的过程中。
Claims (10)
1.一种治疗肿瘤的多细胞免疫制剂，其特征在于该制剂包括免疫细胞、人血白蛋白和复方电解质，所述免疫细胞包括DC细胞、CIK细胞、NK细胞、CD3AK细胞和γδT细胞；其中免疫细胞浓度为1×107个细胞/ml～5×107个细胞/ml，人血白蛋白浓度为1～2g/100ml。
2.根据权利要求1所述的一种治疗肿瘤的多细胞免疫制剂，其特征在于免疫细胞浓度为2×107个细胞/ml～4×107个细胞/ml。
3.如权利要求1所述的一种治疗肿瘤的多细胞免疫制剂的制备方法，其特征在于该方法按以下步骤进行：
一、自体血浆的制备：
①采集成人外周血，抗凝剂为枸橼酸钠，将采集到的血液转移至离心管中，离心收集血浆；
②将收集到的血浆进行灭活处理，56℃水浴30～50min，水浴完毕后，离心收集上清液，即为自体血浆，待用；
二、外周血单个核细胞PBMC的分离：
①将Ficoll溶液分至离心管中，待用，将成人外周血血细胞与复方电解质按照体积比1～2：1混合均匀，得稀释后的细胞悬液，将稀释后的细胞悬液添加至装有Ficoll溶液的离心管中，细胞悬液与Ficoll溶液的体积比为1.5～2.5：1；
②将离心管转移至离心机，2000rpm，离心20～30min；
③收集白膜层细胞并用复方电解质离心洗涤两次，最终用复方电解质重悬细胞并计数备用，即得到外周血单个核细胞PBMC；
三、DC的制备：
①将步骤二收集得到的PBMC用RPMI-1640培养基将浓度调整为1×106个/ml～3×106个/ml，接种于细胞培养瓶内，置于37℃，5％CO2培养箱中孵育2～4h，使DC细胞前体贴壁；
②然后收集悬浮细胞，平均分为4份，待用；
③向贴有DC细胞的培养瓶中加入GT-T551培养基，同时向培养瓶的培养液中添加rhGM-CSF、rhIL-4和自体血浆上清；
④每隔两天对细胞进行半量换液，同时补足细胞因子rhGM-CSF和rhIL-4至终浓度均为500～1000U/ml，并加入培养液体积2％的自体血浆上清；
⑤培养第6天时添加rhTNF-α至终浓度为500-1000U/ml；
⑥培养第8天时，收集树突状细胞DC，并留样进行流式检测，计数，冻存于-80℃冰箱内，并留样进行细菌、真菌、内毒素和流式检测，培养14天时，复苏DC；
其中要满足细菌和真菌检测结果为阴性，内毒素检测结果不高于0.25EU/ml，流式检测结果要求CD83+>40％，CD86+>50％，CD11c+>50％，HLA-DR+>60％；
四、CIK的制备：
①取步骤三中收集到的悬浮细胞1份，并离心收集细胞，接种于培养瓶内，向培养瓶的培养液中添加IFN-γ和自体血浆上清，置于37℃，7.5％CO2培养箱中培养；
②培养第1天加入启动因子rhIL-2至终浓度为4000IU/ml，再加入OKT3至终浓度为5-10μg/ml；
③培养时，对细胞密度进行检测，当细胞密度达到1.5×106个/ml-2×106个/ml时，添加GT-T551培养基并扩大培养，其中添加的培养基中含有1000-2000IU/ml的rhIL-2和自体血浆上清，自体血浆上清的体积为培养基体积的2％；
④培养14天时收集细胞并留样进行细菌、真菌、内毒素和流式检测，即得到CIK细胞；其中要满足细菌和真菌检测结果为阴性，内毒素检测结果不高于0.25EU/ml，流式检测结果要求CD3+CD8+>60％，CD3+CD56+>20％；
五、NK细胞的制备：
①取步骤三中收集到的悬浮细胞1份，并离心收集细胞，接种于培养瓶内使用GT-T561培养基重悬细胞，向培养瓶的培养液中添加rhIL-2和自体血浆上清，置于37℃，5％CO2培养箱中培养；
②培养时，对细胞密度进行检测，当细胞密度达到1.2×106个/ml-1.8×106个/ml时，添加GT-T561培养基并扩大培养，其中添加的培养基中含有500-1000IU/ml的rhIL-2和自体血浆上清，自体血浆上清的体积为培养基体积的2％；
③培养14天时收集细胞并留样进行细菌、真菌、内毒素和流式检测，即得到NK细胞；
其中要满足细菌和真菌检测结果为阴性，内毒素检测结果不高于0.25EU/ml，流式检测结果要求CD3-CD56+>80％；
六、CD3AK的制备：
①取步骤三中收集到的悬浮细胞1份，接种于培养瓶内，向培养瓶的培养液中添加rhIL-2、OKT3和自体血浆上清，置于37℃，5％CO2培养箱中培养；
②培养时，对细胞密度进行检测，当细胞密度达到1.2×106个/ml-1.8×106个/ml时，添加RPMI-1640培养基并扩大培养，其中添加的培养基中含有500-1000IU/ml的rhIL-2和自体血浆上清，自体血浆上清的体积为培养基体积的2％；
③培养14天时收集细胞并留样进行细菌、真菌、内毒素和流式检测，即得到CD3AK细胞；其中要满足细菌和真菌检测结果为阴性，内毒素检测结果不高于0.25EU/ml，流式检测结果要求CD3+>50％，CD8+>30％，CD25+>20％，CD56+>20％；
七、γδT的制备：
①用RPMI-1640培养基将TCRγδ单克隆抗体稀释，终浓度为1μg/ml，包被培养瓶，37℃孵育2h，弃掉包被液，用RPMI-1640培养基清洗培养瓶，并取步骤三中收集到的悬浮细胞1份，接种至培养瓶内，向培养瓶的培养液中添加rhIL-2和自体血浆上清，置于37℃，5％CO2培养箱中培养；
②培养时，对细胞密度进行检测，当细胞密度达到1.2×106个/ml-1.8×106个/ml时，添加RPMI-1640培养基并扩大培养，其中添加的培养基中含有500-1000IU/ml的rhIL-2和自体血浆上清，自体血浆上清的体积为培养基体积的2％；
③培养14天时收集细胞并留样进行细菌、真菌、内毒素和流式检测，即得到γδT细胞；
其中要满足细细菌和真菌检测结果为阴性，内毒素检测结果不高于0.25EU/ml，流式检测结果要求CD4+>30％，CD25+>50％；
八、多细胞免疫制剂的制备：
①将冻存后复苏的DC细胞、CIK细胞、NK细胞、CD3AK细胞和γδT细胞分别进行洗涤：使用复方电解质对细胞进行离心洗涤，洗涤3次后用复方电解质重悬细胞，分别得到5种细胞悬液；
②然后使用200目的滤器过滤细胞悬液，并取样计数，计活，细胞活率不低于95％；
③将过滤后的细胞悬液混合得免疫细胞，将免疫细胞转移至回输袋中，并添加复方电解质和人血白蛋白，即得到治疗肿瘤的多细胞免疫制剂。
4.根据权利要求3所述的一种治疗肿瘤的多细胞免疫制剂的制备方法，其特征在于步骤一中离心的条件为2000rpm，离心15min。
5.根据权利要求3所述的一种治疗肿瘤的多细胞免疫制剂的制备方法，其特征在于步骤三的第③步培养液中rhGM-CSF和rhIL-4的终浓度均为500～1000U/ml，自体血浆上清的体积为培养瓶中培养液体积的10％。
6.根据权利要求3所述的一种治疗肿瘤的多细胞免疫制剂的制备方法，其特征在于步骤四的第①步培养液中IFN-γ的终浓度为1800-2500IU/ml，自体血浆上清的体积为培养液体积的10％。
7.根据权利要求3所述的一种治疗肿瘤的多细胞免疫制剂的制备方法，其特征在于步骤五的第①步培养液中rhIL-2的终浓度为500-1000IU/ml，自体血浆上清的体积为培养液体积的10％。
8.根据权利要求3所述的一种治疗肿瘤的多细胞免疫制剂的制备方法，其特征在于步骤六的第①步培养液中rhIL-2的终浓度为1000-2000IU/ml，OKT3的终浓度为5-10μg/ml，自体血浆上清的体积为培养液体积的10％。
9.根据权利要求3所述的一种治疗肿瘤的多细胞免疫制剂的制备方法，其特征在于步骤七的第①步培养液中rhIL-2的终浓度为200-500IU/ml，自体血浆上清的体积为培养液体积的10％。
10.根据权利要求3所述的一种治疗肿瘤的多细胞免疫制剂的制备方法，其特征在于步骤八的第③步多细胞免疫制剂中免疫细胞浓度为1×107个细胞/ml～5×107个细胞/ml，人血白蛋白浓度为1～2g/100ml。
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