CN110200996A - 一种细胞组合物在皮肤溃疡上的应用 - Google Patents

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程箫
刘丹
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Abstract

本发明公开了一种细胞组合物在皮肤溃疡上的应用，该细胞组合物为：γδT‑NK细胞、细胞刺激因子、0.5％甘油、无菌水；细胞组合物对皮肤溃疡的愈合具有良好的作用，极大缓解皮肤溃疡患者患处疼痛、促进溃疡处早日愈合，且有效降低皮肤溃疡复发，且使用方法简单，增加了治疗方法，对传统治疗方法效应小的患者可以采用此种方法。

Description

一种细胞组合物在皮肤溃疡上的应用
技术领域：
本发明涉及皮肤病治疗领域，具体涉及皮肤溃疡治疗，更具体涉及细胞组合物在皮肤溃疡上的应用和治疗。
背景技术：
皮肤溃疡一般是由外伤微生物感染肿瘤循环障碍和神经功能障碍、免疫功能异常或先天皮肤缺损等引起的局限性皮肤组织缺损，外伤性溃疡往往是由物理和化学因素直接作用于组织引起，微生物感染性疾病多由细菌、真菌螺旋体、病毒等引起组织破坏、结节或肿瘤破溃，免疫异常引起的血管炎性溃疡系因动脉或小动脉炎使组织发生坏死而形成，循环或神经功能障碍属营养障碍引起组织坏死如静脉曲张麻风溃疡等。
在现有临床上针对皮肤溃疡有以下治疗手段：
1.对因处理：如过敏性性(药疹)的要切断过敏源；糖尿病病足，要注意血糖的控制；物理化学的损伤，要注意远离致病源；职业病，尽量的消除致病的条件等。
2.支持治疗：包括良好的局部制动、抬高患部、良好的护理等，注意水电解质的平衡，给予高蛋白高能量和维生素的饮食。提高病人的免疫力。
3.药物的治疗：抗过敏药物，抗寄生虫药物，抗生素(抗感染，保护创面)，以及促进溃疡愈合的药物等。
4.手术处理：对于肿瘤引起的或是有皮肤的恶变、癌变等应及时处理。
但是在现有皮肤溃疡患者由于疮面难以愈合且消耗甚大，给患者造成了很大的心理压力和经济损失，严重影响患者的身体健康及生活质量。
γδT细胞是执行固有免疫功能的T细胞，其TCR由γ和δ链组成。γδT细胞所识别的抗原种类有限:①HSP；②感染细胞表面CD1分子提成的脂类抗原；③某些病毒蛋白或表达于感染细胞表面的病毒蛋白；④细菌裂解产物中的磷酸化抗原。
γδT细胞是一种既能杀伤癌细胞，肿瘤干细胞，又能识别癌抗原的免疫细胞，它的杀伤性较强，但肿瘤干细胞杀伤不如NK细胞。因此，它主要用于杀伤癌细胞与协助DC细胞识别发现癌细胞抗原，然后将这些抗原进行杀伤或是传递给其他细胞。同时，γδT细胞主要分布于皮肤和黏膜组织上，因此对于黏膜方面的癌症治疗效果突出，比如消化道、呼吸道、生殖系统方面的癌症效果显著。
目前，NK细胞免疫治疗受到越来越多的重视。NK细胞占人外周血淋巴细胞的5-15％，一般定义其表型为CD3-CD56+，NK细胞又可以进一步细分为两个主要的亚群：具有免疫调节功能的CD56highCD16-细胞和具有细胞毒活性的CD56dimCD16+细胞。NK细胞在抗病毒感染和抗肿瘤的早期免疫反应中发挥着重要的免疫监视功能，NK细胞不需要识别肿瘤特异性抗原，便可直接、快速的发挥细胞毒活性。
因此，发明开发一种高效、成本低、技术简单、可大量扩增、高活性的细胞组合物，且细胞组合物成为目前皮肤溃疡患者治疗的希望。
发明内容
针对上述所述问题，本发明提出了一种细胞组合物在皮肤溃疡上的应用，具体涉及γδT细胞和NK细胞组合物，该组合物在皮肤溃疡上的应用。
所述细胞组合物为：γδT-NK细胞、细胞刺激因子、0.5％甘油、无菌水。
所述γδT-NK细胞：0.5％甘油：无菌水比例为：1-10：0.05-0.5：5-20。
所述γδT细胞和NK细胞比例为1：0.5-5。
所述细胞刺激因子为：10～80ng/mL IL-15、10～80ng/mL IL-21、50～100U/mLIL-2。
上述细胞组合物在皮肤溃疡上的应用。
上述γδT-NK细胞获得方法：
1：γδT细胞的获得；
2：NK细胞的获得；
3：γδT细胞和NK细胞混合细胞物共培养；
4：15-20天γδT细胞和NK细胞混合细胞的获得。
其中所述γδT细胞的获得包括如下步骤：
(1)单个核细胞的制备：分离单个核细胞，用含体积百分比50％-100％的含10vt％FBS或自体血清的RMPI 1640和0％-50％X-vivo15的混合培养基重悬细胞，接种在培养瓶或培养袋中培养；
(2)γδT细胞的诱导：加入含浓度为1-100μM的唑来膦酸和500～3000U/mL IL-2的混合培养基体外刺激4天后加入含有10～500ng/mL anti-human CD3Ab、10～500ng/mLanti-human CD28Ab、10～200ng/mL IL-15、10～200ng/mL IL-21、500～3000U/mL IL-2的混合培养基进行半量换液，置于37℃、5％CO2培养箱中培养；
(3)培养2～3天，待γδT细胞生长状态良好待后续使用。
优选的，唑来膦酸浓度为5μM、anti-human CD3Ab浓度为50ng/mL、anti-humanCD28Ab浓度为50ng/mL、IL-15浓度为50ng/mL、IL-21浓度为50ng/mL、IL-2浓度为1000U/mL。
优选的，单个核细胞来源于外周血、脐带血、骨髓或诱导性多能干细胞(iPSC)。
在一个实施方案中也可以使用其他磷酸抗原代替唑来膦酸，包括异戊烯焦磷酸酯(IPP),(E)-4-羟基-3-甲基-丁-2-烯基焦磷酸酯(HMB-PP),焦磷酸乙酯(EPP)，焦磷酸法呢酯(FPP),二甲基烯丙基磷酸酯(DMAP),二甲基烯丙基焦磷酸酯(DMAPP),乙基-腺苷三磷酸酯(EPPPA)，牦牛儿焦磷酸酯(GPP),牦牛儿牦牛儿焦磷酸酯(GGPP),异戊烯-腺苷焦磷酸酯(IPPPA),磷酸一乙酯(MEP),焦磷酸一乙酯(MEPP)等含有氮的双磷酸酯。
优选的，在一个实施案例中混合培养基中含10vt％FBS或自体血清的RMPI 1640的比例为50vt％，X-vivo15培养基的比例为50vt％。
其中NK细胞的获得包括如下步骤：
(1)分离单个核细胞；
(2)通过免疫分选去除单个核细胞中的CD3+T淋巴细胞；
(3)加入NK细胞培养用无血清细胞培养基及终浓度为10-500ng/ml IL-15、10-500ng/ml IL-12、10-500ng/ml IL-21、10-500ng/ml IL-18和500-2000U/ml IL-2接种在细胞培养瓶体外培养2-5天后全换液，待细胞生长状态良好。
上述所述单个核细胞是通过肝素抗凝无菌一次性采血管静脉穿刺采集外周血后，通过Ficoll密度梯度离心获得或者通过单采机采集的单个核细胞；或者来自于脐带血、骨髓和iPSCs诱导分化得到的单个核细胞。
所述免疫分选去除单个核细胞中的CD3+T淋巴细胞可采用免疫磁珠、膜泡免疫分选和流式细胞仪免疫分选等方法。
所述去除CD3+T淋巴细胞后的单个核细胞的接种浓度为0.1-2×106cells/ml，优选为1×106cells/ml。
所述细胞因子组合中所用白介素-15的浓度优选为120-350ng/ml。
所述细胞因子组合中所用白介素-12的浓度优选为100-300ng/ml。
所述细胞因子组合中所用白介素-21的浓度优选为100-300ng/ml。
所述细胞因子组合中所用白介素-18的浓度优选为100-300ng/ml。
所述细胞因子组合中所用白介素-2的浓度优选为1000-1500U/ml。
所述NK细胞全换液天数优选为第4天，细胞浓度优选为1×106cells/ml。
所述NK细胞换液为通过补加含NK细胞扩增所需细胞因子的NK细胞无血清培养调整NK细胞浓度至1×106cells/ml。
γδT细胞和NK细胞混合细胞物共培养包括如下步骤：
(1)取上述生长状态良好的γδT细胞适量，并放置于培养瓶中；
(2)取上述生长状态良好的NK细胞适量，并放置于步骤1γδT细胞培养瓶中；
(3)向培养瓶中加入自体血清的RMPI 1640和X-vivo15培养基1-2天；RMPI 1640和X-vivo15的比例为1：0.5-5；
(4)2-3天向细胞培养瓶中加入10-500ng/ml IL-15、10-500ng/ml IL-12、10-500ng/ml IL-21、10-500ng/ml IL-18和500-2000U/ml IL-2的混合培养基进行半量换液，置于37℃、5％CO2培养箱中培养；
(5)培养第5天-第20天，每天观察细胞生长状态，补加含细胞因子的自体血清的RMPI1640和X-vivo15培养基，维持细胞浓度1×106cells/ml，置于饱和湿度、37℃、5.0％CO2培养箱继续培养，至达到所需细胞数量时收获细胞。期间，如果细胞体积超过240ml，则分瓶培养或转入细胞培养袋中传代培养。14-18天收获混合细胞培养物。
上述细胞混合物在皮肤溃疡上的应用。
本发明所用原料和试剂除有特殊说明外，均市售可得。
本发明的有益效果是：(1)本发明提供了一种细胞组合物及其该细胞组合物对皮肤溃疡的愈合具有良好的作用，极大缓解皮肤溃疡患者患处疼痛、促进溃疡处早日愈合，且有效降低皮肤溃疡复发，且使用方法简单；(2)培养过程细胞可相互促进刺激生长，且在刺激因子缺少的情况下，γδT细胞和NK细胞大量扩增，且混合细胞毒性/活性强；(3)皮肤溃疡采用细胞治疗方式，减少成本，简化治疗过程，增加了治疗方法，对传统治疗方法效应小的患者可以采用此种方法。
附图说明：
图1为扩增培养γδT细胞生长曲线。
图2为扩增培养γδT细胞在第7天、第14天和第21天的扩增倍数。
图3为扩增培养NK细胞生长曲线。
图4为扩增培养NK细胞在第7天、第14天和第21天的扩增倍数。
图5为扩增培养γδT细胞和NK细胞生长曲线。
图6为扩增培养γδT细胞和NK细胞在第7天、第14天和第21天的扩增倍数。
图7为γδT-NK细胞混合物溶液、莫匹罗星软膏、康复新液对皮肤溃疡的有效率统计。
具体实施方式：
下面结合具体的实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。应理解，所描述的实施例是本发明一部分实施例，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
为了使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。
实施例1 γδT细胞的获得
γδT细胞的获得从外周血中分离单个核细胞(PBMCs)并扩增γδT细胞：
(1)使用前30分钟开启生物安全柜；
(2)使用前从冰箱中取出D-PBS，室温放置30分钟；
(3)将30ml外周血液样品(肝素抗凝)转移到两个无菌50ml离心管，每管15ml，然后向每管加入22.5ml无菌D-PBS，反复颠倒离心管，充分混匀；
(4)另取两个50ml无菌离心管，分别加入15ml Ficoll-Paque Plus溶液，然后分别缓慢的加入24ml步骤3中稀释后的血液(由步骤3中两个无菌管中吸取)，形成分层，20℃，400×g,离心30分钟；
(5)将步骤4中的两个50ml离心管放入生物安全柜，然后使用10ml吸管吸掉15ml血清层，装入一个新的无菌50ml离心管中，56℃灭活30分钟待用(用于配制混合培养基)；
(6)吸取每一个50ml离心管中的白细胞层(PBMCs)，转入一个新的50ml无菌离心管；
(7)向步骤6装有PBMCs细胞悬液的离心管中加入其3倍体积的无菌PBS，并用无菌移液管混匀，20℃，400×g，离心10分钟；
(8)弃上清，加入50ml无菌PBS，缓慢重悬PBMC；
(9)20℃，400×g，离心10分钟；
(10)加入5ml 50vt％含步骤5自体血清的RMPI1640+50vt％X-vivo15的混合培养基，混匀，取10μl用于计数；
(11)由步骤10中取一半量的外周血单个核细胞(PBMCs),加入一定体积含有唑来膦酸的混合培养基调整细胞浓度至1×106cells/ml；另一半量的PBMCs加入含有唑来膦酸的RPMI 1640培养基，调整细胞浓度至1×106cells/ml；
(12)使用T-175培养瓶培养细胞；
(13)将细胞培养瓶放置于5％CO2、37℃细胞培养箱中进行细胞培养；
(14)在第4天时，将所有细胞转入50ml无菌离心管中(20℃，400×g,离心5分钟)，更换扩增培养基；取一半量含有所需扩增因子(anti-human CD3Ab,anti-human CD28Ab,IL-15，IL-21，和IL-2)组合物的混合培养基加入空的细胞培养瓶中，离心后的细胞培养基上清转移到50ml无菌离心管中，取一半量细胞培养基上清重悬细胞，分别将重悬后的细胞放入此步细胞培养瓶中，5％CO2、37℃继续培养；
(15)在第6、8、10、12、14、16和18天更换扩增培养基。
在培养第0、4、6、7、8、10、12、14、16、18和19天统计接种细胞数和扩增培养的细胞数，制作细胞生长曲线，如图1所示，接种3100万细胞，扩增19天，细胞总数可达约1000亿，完全满足临床应用需要。统计第0天、第7天、第14天和第19天，计算γδT细胞扩增倍数。
实施例2 NK细胞的获得
1、单核细胞的分离
1.1在生物安全柜正常工作状态下，50ml无菌离心管分别加入Ficoll-Paque Plus淋巴细胞分离液；
1.2将患者外周全血与DPBS按比例均匀稀释后缓慢注入于离心管中淋巴细胞分离液液面上层；
1.3 20℃，400×g，离心30分钟；
1.4使用无菌吸管吸取分离管中的血浆层，将血浆放入50ml无菌离心管中，56℃水浴30分钟灭活，800g×离心10分钟，将上层血浆转移至新的50ml无菌离心管中；
1.5吸取分离所得的单个核细胞层(PBMCs)装于50ml无菌离心管中；
1.6加入DPBS，混匀，20℃，400×g，离心10分钟，洗涤1次；
1.7弃上清液，再用DPBS将1.6步所有细胞重悬至一个50ml无菌离心管中，混匀，取20μl细胞悬液置于1.5ml EP管中计数。
2、NK细胞体外扩增-CD3+T细胞去除
2.1根据步骤1.7的计数结果，取出5×105细胞置于1.5ml EP管中，用于分选前表型检测，剩余细胞20℃，400×g，离心10分钟，再洗涤1次，弃上清液，用含0.5％人血白蛋白及1mM EDTA的DPBS(0.5％HSA，1mM EDTA，DPBS)将细胞浓度调整至1×108cells/ml，转移至5ml无菌流式管中，按150μl/ml样品加入EasysepTM Human CD3Positive Selection KitII中的Human CD3Positive Selection Cocktail II，混匀，室温放置3min；
2.2将EasysepTM Human CD3Positive Selection Kit II中的RapidSphereTM50100混匀，按90μl/ml样品加至步骤2.1的流式管中，混匀，室温放置3min；
2.3用含0.5％HSA，1mM EDTA，DPBS将步骤2.2中5ml无菌流式管中的细胞悬液的体积补齐至2.5ml，轻轻混匀；
2.4将上述5ml无菌流式管置于磁铁中室温静置3min，拿起磁铁，将细胞倒于15ml无菌离心管中，取20μl细胞悬液置于1.5ml EP管中计数。
3、NK细胞体外扩增-NK细胞培养
3.1根据2.4步计数结果，取出5×105细胞置于1.5ml EP管中，用于分选后表型检测，剩余细胞悬液用L500培养基将剩余细胞体积补至14ml，混匀，20℃，400×g，离心5min；
3.2弃上清，20℃，400×g，离心5min；
3.3吸弃上清，用含10％自体血清的SuperCultureTML500(L500)培养基将细胞浓度调整至1×106cells/ml，加入IL-2使其终浓度为1500IU/ml，另加入细胞因子(IL-15、Il-12、IL-21和IL-18终浓度均为200ng/ml)，混匀。
3.4将细胞置于37℃、饱和湿度、5.0％CO2培养箱中培养。
3.5培养第4天，将细胞吹匀，取20μl细胞悬液置于1.5ml EP管中，用于计数。剩余细胞转至50ml无菌离心管中，20℃，400×g，离心5min；
3.6弃上清，用新鲜配制的含10％自体血清的L500培养基重悬细胞，并调整细胞浓度至1×106cells/ml，同时加入IL-2使其终浓度为1500U/ml和另加入细胞因子(IL-15、Il-12、IL-21和IL-18终浓度均为200ng/ml)，混匀。
3.7将上述细胞置于37℃、饱和湿度、5.0％CO2培养箱中继续培养。
3.8培养第5天-第21天，每天观察细胞生长状态，补加含细胞因子的L500培养基(如有足够血浆，可继续维持10％自体血浆含量)，维持细胞浓度1×106cells/ml，置于饱和湿度、37℃、5.0％CO2培养箱继续培养，至达到所需细胞数量时收获细胞。期间，如果细胞体积超过240ml，则分瓶培养或转入细胞培养袋中传代培养。
在培养第0、4、5、6、7、8、10、11、13、14、15、16、17、18、19、20和21天统计接种细胞数和扩增培养的细胞数，制作细胞生长曲线，如图3所示，接种1560万细胞，扩增21天，细胞总数可达约1700亿，完全满足临床应用需要。统计第0天、第7天、第14天和第21天，计算NK细胞扩增倍数，可见采用本发明方法可以获得大量的NK细胞，结果参见图4。
实施例3 γδT细胞和NK细胞混合细胞物共培养
(1)取实施例1中培养3-10天生长状态良好的γδT细胞1-3ml，并放置于培养瓶中；
(2)取实施例2中培养3-10天生长状态良好的NK细胞1-3ml，并放置于步骤1γδT细胞培养瓶中；
(3)向培养瓶中加入自体血清的RMPI 1640和X-vivo15培养基1-2天；RMPI 1640和X-vivo15的比例为1：1；
(4)第2-3天向细胞培养瓶中加入1100ng/ml IL-15、100ng/ml IL-12、100ng/mlIL-21、80ng/ml IL-18和500U/ml IL-2的混合培养基进行半量换液，置于37℃、5％CO2培养箱中培养；
(5)培养第5天-第16天，每天观察细胞生长状态，补加含细胞因子的自体血清的RMPI1640和X-vivo15培养基，维持细胞浓度1×106cells/ml，置于饱和湿度、37℃、5.0％CO2培养箱继续培养，至达到所需细胞数量时收获细胞。期间，如果细胞体积超过240ml，则分瓶培养或转入细胞培养袋中传代培养吗，17-18天收获混合细胞培养物。
在培养第0、4、6、8、10、12、14、16和18天统计接种细胞数和扩增培养的细胞数，制作细胞生长曲线，如图5所示，NK细胞接种1500万细胞，扩增18天，细胞总数可达约1100亿；γδT接种2000万细胞，扩增18天，细胞总数可达约900亿，总细胞数目完全满足临床应用需要。如图6所示，统计第0天、第8天、第12天和第16天，计算γδT细胞和NK细胞扩增倍数。
实施例4 γδT细胞和NK细胞混合细胞物对皮肤溃疡的治疗
取γδT-NK混合细胞物：细胞刺激因子：0.5％甘油：无菌水按照6：0.1：10比例制备成细胞混合物溶液，待用。
其中细胞刺激因子为：20ng/mL IL-15、20ng/mL IL-21、50U/mL IL-2。
临床试验中选取外伤微生物感染肿瘤循环障碍和神经功能障碍、免疫功能异常或先天皮肤缺损等引起的局限性皮肤组织缺损病例进行药物治疗观察。
实验中选取抗生素(莫匹罗星软膏)或中药制剂(康复新液)、手术治疗作为对照，观察各种治疗方法对皮肤溃疡的治疗效果。
在临床治疗上分为4组进行，分别如下：
实验组1：选若干皮肤溃疡患者若干，肿瘤循环障碍皮肤溃疡8例、神经功能障碍皮肤溃疡8例、免疫功能异常皮肤溃疡5例、先天皮肤缺损皮肤溃疡3例，用上述制备完成的细胞组合物溶液对溃疡处涂抹或喷涂，每日3-4次，治疗期间观察治疗效果。
实验组2：选若干皮肤溃疡患者若干，肿瘤循环障碍皮肤溃疡6例、神经功能障碍皮肤溃疡8例、免疫功能异常皮肤溃疡5例、先天皮肤缺损皮肤溃疡2例，用莫匹罗星软膏对溃疡处涂抹，每日3-4次，治疗期间观察治疗效果。
实验组3：选若干皮肤溃疡患者若干，肿瘤循环障碍皮肤溃疡5例、神经功能障碍皮肤溃疡4例、免疫功能异常皮肤溃疡5例、先天皮肤缺损皮肤溃疡3例，用康复新液对溃疡处涂抹，每日3-4次，治疗期间观察治疗效果。
分别统计每组的疗效结果：
由上述实施例及初步实验组可以得出，γδT细胞与NK细胞分离后混合培养，两种细胞可以相互促进增殖生长，且细胞生长周期有所缩短，且在刺激因子缺少的情况下，γδT细胞和NK细胞大量扩增，且混合细胞毒性/活性强，此种培养方法降低培养成本，适用于大规模生产。且γδT-NK细胞组合物应用于皮肤性溃疡，对皮肤性溃疡有疗效，且作用效果比抗生素或中药制剂效果更佳，且对于外伤微生物感染肿瘤循环障碍和神经功能障碍、免疫功能异常或先天皮肤缺损等引起的局限性皮肤组织缺损可以起到预防作用，减少新生组织处的皮肤溃疡产生。
以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。

Claims (6)

1.一种细胞组合物，其特征在于：细胞组合物为：γδT-NK细胞、细胞刺激因子、0.5％甘油、无菌水。
2.根据权利要求1所述细胞组合物，其特征在于：所述γδT-NK细胞：0.5％甘油：无菌水比例为：1-10：0.05-0.5：5-20。
3.根据权利要求1所述细胞组合物，其特征在于：所述细胞刺激因子为：10～80ng/mLIL-15、10～80ng/mL IL-21、50～100U/mL IL-2。
4.根据权利要求1所述细胞组合物，其特征在于：所述γδT细胞和NK细胞比例为1：0.5-5。
5.一种细胞组合物在皮肤溃疡上的应用，其特征在于：采用权利要求1-4任一项所述细胞组合物用于皮肤溃疡上。
6.根据权利要求5所述细胞组合物在皮肤溃疡上的应用，其特征在于：细胞组合物溶液对溃疡处涂抹或喷涂，每日3-4次。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111773249A (zh) * 2020-07-31 2020-10-16 上海鸣大生物科技有限公司 一种组合物及其制备方法

Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105296425A (zh) * 2015-12-07 2016-02-03 黑龙江天晴干细胞股份有限公司 一种治疗肿瘤的多细胞免疫制剂及其制备方法
CN105708860A (zh) * 2016-01-26 2016-06-29 深圳爱生再生医学科技有限公司 用于修复皮肤溃疡的干细胞制剂
CN106265737A (zh) * 2016-11-11 2017-01-04 上海鸣大生物科技有限公司 一种用于治疗皮肤附属器及瘙痒性皮肤病的外用药物及其制备方法和应用
CN106389467A (zh) * 2016-11-11 2017-02-15 上海鸣大生物科技有限公司 一种用于治疗皮炎和湿疹类皮肤病的外用药物及其制备方法和应用
EP3208329A1 (en) * 2014-10-14 2017-08-23 St. Marianna University School of Medicine Method for producing gamma-delta t cells, and pharmaceutical
CN107475196A (zh) * 2017-10-09 2017-12-15 天津长和生物技术有限公司 自然杀伤细胞培养基质及自然杀伤细胞的扩增培养方法
CN109517793A (zh) * 2018-11-30 2019-03-26 广州长峰生物技术有限公司 一种NK细胞和γδT细胞共培养的建立方法

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3208329A1 (en) * 2014-10-14 2017-08-23 St. Marianna University School of Medicine Method for producing gamma-delta t cells, and pharmaceutical
CN105296425A (zh) * 2015-12-07 2016-02-03 黑龙江天晴干细胞股份有限公司 一种治疗肿瘤的多细胞免疫制剂及其制备方法
CN105708860A (zh) * 2016-01-26 2016-06-29 深圳爱生再生医学科技有限公司 用于修复皮肤溃疡的干细胞制剂
CN106265737A (zh) * 2016-11-11 2017-01-04 上海鸣大生物科技有限公司 一种用于治疗皮肤附属器及瘙痒性皮肤病的外用药物及其制备方法和应用
CN106389467A (zh) * 2016-11-11 2017-02-15 上海鸣大生物科技有限公司 一种用于治疗皮炎和湿疹类皮肤病的外用药物及其制备方法和应用
CN107475196A (zh) * 2017-10-09 2017-12-15 天津长和生物技术有限公司 自然杀伤细胞培养基质及自然杀伤细胞的扩增培养方法
CN109517793A (zh) * 2018-11-30 2019-03-26 广州长峰生物技术有限公司 一种NK细胞和γδT细胞共培养的建立方法

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
AMUDHAN MANIAR等: "Human γδ T lymphocytes induce robust NK cell–mediated antitumor cytotoxicity through CD137 engagement", 《J IMMUNOTHER》 *
关志宇: "《药物制剂辅料与包装材料》", 31 January 2017, 中国医药科技出版社 *
周忠海等: "IL-21增强γδT细胞体外抗肿瘤活性的实验研究", 《现代免疫学》 *
曲源等: "多种硒化酶缺失导致艾滋病毒变异与富硒纳米茶抗艾滋病的应用", 《中国粉体技术》 *
田松等: "γδT细胞在皮肤损伤中的作用研究进展", 《中国免疫学杂志》 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111773249A (zh) * 2020-07-31 2020-10-16 上海鸣大生物科技有限公司 一种组合物及其制备方法

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