CN111773249A - 一种组合物及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及医药领域，特别是涉及一种组合物及其制备方法。本发明提供的组合物在制备预防或治疗皮肤溃疡药物中的用途，所述组合物为单个核细胞经刺激活化时分泌获得的产物，所述用途为所述组合物在制备治疗难治型皮肤溃疡产品中的用途。本发明首次提供了一种单个核细胞与激活源共孵育后收获的具有生物活性的组合物可应用到皮肤溃疡特别是难治型皮肤溃疡，该组合物对不同类型难治型皮肤溃疡的病症具有很好的效果，并且使用方便，长期使用无毒、无刺激性，对于皮肤敏感者、婴幼儿、孕妇同样适用。

Description

一种组合物及其制备方法

技术领域

本发明涉及医药领域，特别是涉及一种组合物及其制备方法。

背景技术

皮肤溃疡是外科常见病、以长期不能愈合为临床特征，局部皮肤或黏膜坏死、崩解脱落所形成局限性缺损的一种体表疾病其形态、大小及深浅，可因病因和病情轻重而异。溃疡面常有浆液、脓液、血液或坏死组织。给患者造成了很大的心理压力和经济负担，严重影响患者的身体健康及生活质量。

皮肤溃疡一般是由外伤微生物感染、肿瘤循环障碍和神经功能障碍、免疫功能异常或先天皮肤缺损等引起的局限性皮肤组织缺损，外伤性溃疡经常因物理和化学因素直接作用于组织引起，微生物感染性疾病多由细菌、真菌螺旋体、病毒等引起组织破坏、结节或肿瘤破溃，免疫异常引起的血管炎性溃疡系因动脉或小动脉炎使组织发生坏死而形成，循环或神经功能障碍属营养障碍引起组织坏死如静脉曲张麻风溃疡等。普通的皮肤刮伤或者烧伤，短时间内能够愈合。但是对于一些特殊的烧伤，比如化学烧伤、电烧伤造成的伤口损伤很重，愈合困难。其他情况的溃疡或者溃烂是患者本身有某种全身性的疾病，或者有一些特殊原因导致伤口局部的血液供应不好，这些病人的伤口愈合会很困难，也称困难伤口。比如有些老年人本身身体有多种疾病，它的营养状态也很差，同样一个伤口在年轻人可能很快就好了，但是对于这些老年人伤口就很难愈合。还有一种是糖尿病的病人，糖尿病的病人发展到终末期，其肢端特别是下肢血液供应不好。糖尿病本身又是一个代谢性的疾病，如果人体代谢发生紊乱，伤口正常愈合的过程遭到破坏。所以糖尿病的病人很有可能一个小的伤口长期不愈合，甚至有些糖尿病的病人到了一定的阶段，他的脚会发生坏死，而且坏死伤口会长久不愈。其他的情况，比如有些人有偏瘫、截瘫，不管是外伤，还是由于中风造成的，偏瘫、截瘫以后肢体的一些部位没有神经支配，不知道冷热。这一类的病人一旦皮肤破溃，伤口会难以愈合。还有压疮，有些行动不便的人，身体不能翻身，睡觉时总是压迫在一定的部位，就容易导致受压迫的部位皮肤溃烂，而且这种溃烂伤口往往迁延不愈。所以溃疡这种慢性伤口，是一种困难伤口，这一类伤口愈合难度非常大。慢性伤口的种类多，很多复杂性的疾病也会导致病人的营养不良，伤口失去了自我修复的能力，这些伤口称之为困难伤口。血管性的慢性溃疡也是较常见的，有些病人的血管出了问题，不管是静脉出了问题，还是动脉出了问题，血管供氧的区域伤口愈合难度都非常大，比如最常见的下肢静脉曲张的病人，下肢静脉曲张，他的下肢血液供应就不好，血脉不畅很容易导致一个小伤口久治不愈，统称为血管性溃疡，也是常见的慢性伤口之一。还有其他很多种类的慢性伤口，有些病人甚至几十年都没有好。有些病人的伤口由于种种原因，比如全身代谢性疾病的原因而没有得到很好的治疗。伤口长期不愈也有可能出现皮肤癌变，最后造成瘢痕癌或者叫瘢痕皮肤癌，主要有以下临床疾病表现类型较多：如：皮肤疖肿、痈、蜂窝织炎、寻常狼疮、孢子丝菌病、生殖器疱疹、软下疳、雷诺症、褥疮、高血压性缺血性溃疡、糖尿病足溃疡、病毒性疱疹性溃疡、白塞病、恶性肿瘤并发症引起的溃疡。这些溃疡性疾病治疗不当易形成老烂腿、糖尿病足、脉管炎溃烂坏疽、化脓性骨髓炎，皮肤软组织化脓感染，分泌物稀薄，有恶臭，病人年久不愈，受尽折磨。给患者造成了很大的心理压力和经济损失，严重影响患者的身体健康及生活质量。

目前，采取的治疗方式主要为：

1.对因处理：如过敏性性(药疹)的要切断过敏源；糖尿病病足，要注意血糖的控制；物理化学的损伤，要注意远离致病源；职业病，尽量的消除致病的条件等。

2.支持治疗：包括良好的局部制动、抬高患部、良好的护理等，注意水电解质的平衡，给予高蛋白高能量和维生素的饮食。提高病人的免疫力。

3.药物的治疗：抗过敏药物，抗寄生虫药物，抗生素(抗感染，保护创面)，以及促进溃疡愈合的药物等。

4.手术处理：对于肿瘤引起的或是有皮肤的恶变、癌变等应及时处理。

使用的皮肤药物主要是含清热、消炎和含一定激素成分的药物的外用药，对难治型皮肤溃疡治疗和促进快速愈合和修复效果甚微，对于糖尿病患者病足皮肤溃疡、病毒性和细菌性口腔溃疡、毛囊炎引起的皮肤溃疡、湿疹引起的皮肤溃疡、带状疱疹、病毒性丘疹等引起的难治型皮肤溃疡，以及各种皮疹、水疱或食物、药物或接触性物质导致的皮肤炎性反应等几乎没有效果，且易复发、成本高、制备过程复杂。

发明内容

鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种组合物及其制备方法，用于解决现有技术中的问题。

为实现上述目的及其他相关目的，本发明提供一种组合物在制备预防或治疗皮肤溃疡或皮肤炎性反应疾病产品中的用途，所述组合物为单个核细胞经刺激活化后获得的产物。

在一种实施方式中，所述用途为所述组合物在制备治疗难治型皮肤溃疡产品中的用途。

本发明第二方面提供一种用于预防或治疗皮肤溃疡或皮肤炎性反应疾病的组合物的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：

1)向含有单个核细胞的液体中加入刺激蛋白、白细胞介素或刺激细胞中的一种或几种，孵育刺激4小时以上；

2)收集细胞刺激过程中的液体即为组合物的原液。

本发明第三方面提供用于预防或治疗皮肤溃疡或皮肤炎性反应疾病的组合物，所述组合物通过以上方法制备获得。

本发明第四方面提供一种产品，所述产品为膏状制剂，所述膏状制剂包括以下质量百分比的组分：所述组合物65.0-75.0％、二甲亚砜0.5-5.0％、单硬脂酸甘油酯和/或双硬脂酸甘油酯共6.0-20.0％、对羟基苯甲酸乙酯0.01-0.5％、硼砂0.08-0.5％、山梨酸1.0-10.0％。

本发明第五方面提供一种产品，所述产品为凝胶制剂，所述凝胶制剂包括以下质量百分比的组分：所述组合物85.0-95.0％、卡波姆1-2％，羟基纤维素钠3-10％，冰片1-3％，调节PH值至6-8。

本发明第六方面提供一种产品，所述产品为液体制剂，所述液体制剂包括以下质量百分比的组分：所述组合物80.0-95.0％、甘油1.0-5.0％、丙二醇0.5-5.0％、二甲亚砜1.0-10.0％，山茶油或低芥酸菜子油或茶油0.5-5％，硼砂0.05-0.08％。所述液体制剂包括喷雾剂和擦剂。

如上所述，本发明的组合物及其制备方法，具有以下有益效果：本发明首次提供了一种利用免疫相关单个核细胞与激活源共孵育后收获的具有生物活性的产物制成组合物，再进一步浓缩该组合物可应用到皮肤溃疡特别是难治型皮肤溃疡(如带状疱疹溃疡、湿疹溃疡等)。该组合物对于不同类型难治型皮肤溃疡的病症且具有很好的效果，并且使用方便，长期使用无毒、无刺激性，对于皮肤敏感者、婴幼儿、孕妇同样适用。

附图说明

图1显示为实施例3临床研究中带状疱疹溃疡病例1，从左至右依次为治疗前、治疗第3天、治疗第7天、治疗第8天的照片。

图2显示为实施例3临床研究中带状疱疹溃疡病例2，从左至右依次为：治疗前、治疗第5天、治疗第7天的照片。

图3显示为实施例3临床研究中湿疹反复性溃疡病例：从左至右依次为治疗前、治疗第2天、治疗第5天、治疗第8天、治疗第10天的照片。

具体实施方式

本发明第一方面提供一种组合物在制备预防或治疗皮肤溃疡或皮肤炎性反应疾病产品中的用途，所述组合物为单个核细胞经刺激活化后获得的产物。

在一种实施方式中，所述用途为所述组合物在制备治疗难治型皮肤溃疡药物中的用途。

具体的，所述皮肤溃疡为各类疾病或皮肤炎症及药物使用导致的溃疡。

皮肤溃疡的诊断标准为：皮损初起多为局限性水肿性红斑或丘疹，继之中心演变成淡灰色或灰褐色坏死，并于数天内破溃，绕以红晕。而后溃疡四周逐渐高出皮面。典型的溃疡多呈圆形，直径约2～5mm，表面畅游少量分泌物，或覆以灰黑色痂，周边为宽2～4mm的质地坚实的暗红色堤岸状隆起，使整个皮损状似鸟眼。恢复过程中炎症逐渐消退，溃疡变浅、缩小、愈合，最后堤岸状隆起逐渐变平，遗留轻度萎缩性疤痕。

具体的，所述难治型皮肤溃疡又称为慢性难治型皮肤溃疡，一般1个月内不能愈合。所述难治型皮肤溃疡包括血管性溃疡、压迫性溃疡、放射性溃疡及感染性溃疡。难治型皮肤溃疡从引起的疾病种类上分类包括糖尿病足溃疡(分为神经性、缺血性、混合型)、病毒性和细菌性口腔或表皮反复性溃疡、毛囊炎引起的皮肤溃疡、湿疹引起的皮肤溃疡、带状疱疹引起的皮肤溃疡、病毒性丘疹引起的皮肤溃疡，以及皮疹、水疱或食物、药物或接触性物质导致的皮肤溃疡。

所述皮肤炎性反应疾病是指由各种内、外部感染或非感染性因素导致的皮肤炎症性疾患。所述皮肤炎性反应疾病包括湿疹、毛囊炎。

所述单个核细胞包括外周血单个核细胞、胎盘单个核细胞、脐带血单个核细胞。

所述单个核细胞包括淋巴细胞和/或单核细胞。亦即，所述单个核细胞选自：淋巴细胞和单核细胞的混合细胞、单核细胞、单一细胞成分的淋巴细胞。所述单一细胞成分的淋巴细胞例如为：T细胞、NK细胞。

在一种实施方式中，用于刺激活化单个核细胞的物质包括刺激蛋白、白细胞介素或刺激细胞中的一种或几种。

所述刺激蛋白包括CD3抗体、CD16抗体、CD28抗体、胰岛素和植物蛋白。

所述刺激蛋白的使用终浓度为0.1-0.6mg/ml。

在一种实施方式中，所述CD3抗体选自CD3单克隆抗体；所述CD16抗体选自CD16单克隆抗体；CD28抗体选自CD28单克隆抗体；所述植物蛋白选自可激活细胞的植物蛋白，例如PMA、植物胰岛素。

在一种实施方式中，所述白细胞介素包括IL-2、IL-12、IL-10、IL-21、IL-18、IL-15中的一种或几种。

所述白细胞介素中IL-2的使用终浓度为1000-2000IU/ml。其它白细胞介素使用的终浓度为10-150ng/ml。

在一种实施方式中，所述刺激细胞选自肿瘤细胞株。所述肿瘤细胞株包括未经过人工修饰的肿瘤细胞、工程化肿瘤细胞、肿瘤组织来源的细胞。所述刺激细胞为灭活的细胞或具有增殖活性的细胞。灭活方式可选择常规的辐照灭活、丝裂霉素处理、超声、超速离心中的一种或几种。

所述灭活的细胞为不具有增殖功能，但是保留细胞的其他功能的细胞。所述具有增殖活性的细胞即未经过任何处理能正常生长繁殖的细胞。

所述灭活的细胞与单个核细胞的数量比为1：1-1：2。所述具有增殖活性的细胞与单个核细胞的数量比不小于1:5。

单个核细胞的密度为1.0×10⁵个细胞每毫升以上，优选为1.0×10⁶-3.0×10⁶个细胞每毫升。

所述单个核细胞的刺激活化的条件为：35-40℃，二氧化碳浓度5％-7％。其中二氧化碳浓度为体积分数。

具体的，所述产物包括细胞的分泌物、代谢物以及细胞培养基中的物质。所述分泌物中包括细胞因子和外泌体蛋白。

具体的，所述细胞因子包括促生长因子、MIP-1α、MIP-1β、RANTES、TNF-ɑ、IFN-γ、IL-4、IL-2。

具体的，所述外泌体蛋白包括hsa-miR-181a-2-3p、hsa-miR-181a-2-5p、hsa-miR-9502、hsa-miR-9609、hsa-miR-9773。

所述分泌物中还包括单核细胞趋化蛋白。

所述组合物治疗皮肤溃疡是通过含有的增免、抗炎、抗病毒、抑菌、促进创面愈合和血管生成、神经修复和促进皮肤再生等活性蛋白因子促进溃疡面血小板聚集，抗菌消炎，抑制病毒复制、清除病毒侵袭的受损细胞，进一步促进神经元再生和修复和皮肤愈合和快速结痂恢复。

本发明第二方面提供用于制备预防或治疗皮肤溃疡药物或皮肤炎性反应疾病的组合物的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：

1)向含有单个核细胞的液体中加入刺激蛋白、白细胞介素或刺激细胞中的一种或几种，孵育刺激4小时以上；

2)收集细胞刺激过程中的液体即为组合物的原液。

在一种实施方式中，步骤1)中还包括以下特征中的一项或几项：

a)所述刺激蛋白的使用终浓度为0.1-0.6mg/ml；

b)当包括IL-2时，所述白细胞介素中IL-2的使用终浓度为1000-2000IU/ml；当使用其他白介素时，各白细胞介素使用的终浓度分别为10-150ng/ml；

c)所述刺激细胞与单个核细胞的数量比为1：1-1：2。

所述制备方法中的物质浓度均以单个核细胞的液体总体积为基准计算。

在一种实施方式中，所述刺激蛋白包括CD3抗体、CD16抗体、CD28抗体、胰岛素或植物蛋白中的一种或几种。

在一种实施方式中，所述白细胞介素包括IL-2、IL-12、IL-10、IL-21、IL-18、IL-15中的一种或几种；

在一种实施方式中，所述刺激细胞选自肿瘤细胞；

在一种实施方式中，所述刺激细胞为灭活的细胞；

在一种实施方式中，步骤1)中单个核细胞的密度为1.0×10⁵个细胞每毫升以上，优选为1.0×10⁶-3.0×10⁶个细胞每毫升。

在一种实施方式中，所述单个核细胞的刺激条件为：35-40℃，二氧化碳浓度5％-7％。所述温度优选为36-38℃。孵育的装置需要为可恒温控温设备。具体设备可以根据孵育时间选择，72小时内可使用恒温孵箱，72小时以上可使用二样化碳培养箱。

孵育刺激时单个核细胞所用的液体为能维持细胞活力的溶液即可，不必然使细胞保持增殖。在一种实施方式中，所述液体选自含血清或无血清悬浮细胞培养基。优选的，所述培养基选自T561、X-VIVO15、RPMI 1640或α-MEM等中的一种或几种。

步骤1)中孵育刺激时间可根据需要的组合物的量来决定，需要量越多孵育时间越长。一般的，孵育时间为12-216小时。例如，孵育时间可以为12-24h、24-48h、48-72h、96-120h、120-144h、144-168h、168-192h、192-216h。孵育过程中可换液，收集合并保存更换的液体，孵育结束后集中纯化。

较佳的，还可以将步骤2)中获得的组合物的原液进行低温浓缩。

所述浓缩过程中还包括以下特征中的一项或几项特征：

a)先采用滤膜过滤；

b)采用10KD的超滤膜超滤浓缩；

c)浓缩至原液体积的1/3～1/5。

较佳的，超滤前可先进行离心。离心的目的是先去除一部分沉淀杂质。使用的离心力为500-700G。

步骤b)中使用10KD的超滤膜超滤时收集截留液；一般的，需要将步骤2)获得的原液或浓缩之后的浓缩液除菌。在一较佳实施例中，可通过0.22μm滤膜过滤除菌。

在一种实施方式中，所述产品中所含组合物的质量百分比为10.0-100.0％。具体的，所述组合物的质量百分比选自以下范围中的一个：10-30％，30-50％，50-70％，70-90％，90-100％。优选的，所述组合物的质量百分比为50-100％。当所述组合物的质量百分比不是100％时，所述产品还包括一种或多种药学上可接受的载体或辅料。

“药学上可接受的”是指当分子本体和组合物适当地给予动物或人时，它们不会产生不利的、过敏的或其它不良反应。

“药学上可接受的载体或辅料”应当与所述有效成分相容，即能与其共混而不会在通常情况下大幅度降低药物的效果。可作为药学上可接受的载体或辅料的一些物质的具体例子是糖类，如乳糖、葡萄糖和蔗糖；淀粉，如玉米淀粉和土豆淀粉；纤维素及其衍生物，如甲基纤维素钠、乙基纤维素和甲基纤维素；西黄蓍胶粉末；麦芽；明胶；滑石；固体润滑剂，如硬脂酸和硬脂酸镁；硫酸钙；植物油，如花生油、棉籽油、芝麻油、橄榄油、玉米油和可可油；多元醇，如丙二醇、甘油、山梨糖醇、甘露糖醇和聚乙二醇；海藻酸；乳化剂，如Tween；润湿剂，如月桂基硫酸钠；着色剂；调味剂；压片剂、稳定剂；抗氧化剂；防腐剂；无热原水；等渗盐溶液；和磷酸盐缓冲液等。这些物质根据需要用于帮助配方的稳定性或有助于提高活性或它的生物有效性或在口服的情况下产生可接受的口感或气味。

在一种实施方式中，所述产品为药物。所述药物为外用药物。

所述药物的形式无特殊限制，可以为固体、液体、凝胶、半流质、气雾等各种物质形式。

所述药物可以制成液体混悬剂、液体乳浊剂、喷雾制剂、凝胶制剂，流体膜制剂、粉剂、预制囊式固型贴剂或膏状制剂等。利用所述药物制成的以上外用制剂可大面积使用，也可局部使用。

本发明第三方面提供一种组合物，所述组合物通过第二方面的制备方法获得。所述组合物为单个核细胞经刺激活化后获得的产物。所述组合物可用于制备预防或治疗皮肤溃疡或皮肤炎性反应疾病产品。

本发明第四方面提供一种产品，所述产品为膏状制剂，所述膏状制剂包括以下质量百分比的组分：所述组合物65.0-75.0％、二甲亚砜0.5-5.0％，单硬脂酸甘油酯6.0-20.0％、对羟基苯甲酸乙酯0.01-0.5％、硼砂0.08-0.5％、山梨酸1.0-10.0％。其中单硬脂酸甘油酯可替换为双硬脂酸甘油酯或者单硬脂酸甘油酯和双硬脂酸甘油酯的混合物。所述产品能用于制备预防或治疗皮肤溃疡或皮肤炎性反应疾病产品中。

本发明第五方面提供一种产品，所述产品为凝胶制剂，所述凝胶制剂包括以下质量百分比的组分：所述组合物85.0-95.0％、卡波姆1-2％，羟基纤维素钠3-10％，冰片1.0-3％，调节PH值至6-8。所述产品能用于制备预防或治疗皮肤溃疡或皮肤炎性反应疾病产品中。

所述凝胶制剂可制成管式药膏，也可制成敷贴剂。

本发明第六方面提供一种产品，所述产品为液体制剂，所述液体制剂包括以下质量百分比的组分：所述组合物80.0-95.0％、甘油1.0-5.0％、丙二醇0.5-5.0％、二甲亚砜1-10％，山茶油或低芥酸菜子油或茶油0.5-5％，硼砂0.05-0.08％。所述液体制剂包括喷雾剂和擦剂。所述产品能用于制备预防或治疗皮肤溃疡或皮肤炎性反应疾病产品中。

以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。

在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围；在本发明说明书和权利要求书中，除非文中另外明确指出，单数形式“一个”、“一”和“这个”包括复数形式。

当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。

本申请所用的试剂等材料，如无特别说明，均为市售购买产品。胎盘来源、脐血、脐带单核细胞为上海赛笠生物科技有限公司赠送，外周血单个核细胞为澳赛尔斯生物技术(上海)有限公司赠送。RPMI Medium 1640basic(Gibco)，FBS(Nobimpex上海微科生物技术有限公司)，K562细胞(中科院细胞库)、IL-21-K562工程细胞(来源于江苏久腾医学科技有限公司)，CD16单克隆抗体、CD28单克隆抗体、CD3单克隆抗体、T561、X-VIVO15均为市售产品。

实施例1组合物的制备

外周血单个核细胞经38℃复苏。在3个T175培养瓶中分别加入5×10⁷个外周血单个核细胞和40ml X-VIVO15，并标记为A组、B组、C组。在孵箱或二氧化碳培养箱中孵育30分钟，在A组培养瓶中加入CD16单抗(100ng/ml)+CD28单抗(100ng/ml)+IL-2(1000IU/ml)，培养168h；在B组培养瓶中加入辐照灭活的K562细胞1×10⁶个，培养48h；在C组培养瓶中加入IL-2(2000IU/ml)，培养24h；在另一个T175培养瓶中加入5×10⁷个单个核细胞以及以下物质：50ml完全培养基(10％FBS+90％1640)、经辐照灭活的IL-21-K562工程细胞(5×10⁷个)、IL-2(500IU/ml)，培养216h，标记为D组。

最终四组分别获得540ml、105ml、120ml、900ml单个核细胞刺激活化液。使用500-700G离心，去除沉淀杂质，经0.45um的滤膜过滤，再使用10KD膜超滤至原先孵育体积的1/3-1/5，四组分别获得180ml、35ml、35ml、260ml组合物的浓缩液，再经0.22μm滤膜过滤除菌备用。

实施例2制剂的制备

1.膏状制剂的制备

将各原料按照以下质量百分比混合，观察能否形成膏状制剂，实施例1中组合物的浓缩液65.0％、二甲亚砜5.0％、单硬脂酸甘油酯19.0％、对羟基苯甲酸乙酯0.5％、硼砂0.5％、山梨酸10.0％。A组、B组、C组、D组组合物的浓缩液按照以上配比均可形成膏状制剂。

将各原料按照以下质量百分比混合，观察能否形成膏状制剂，实施例1中组合物的浓缩液75.0％、二甲亚砜5.0％、单硬脂酸甘油酯15.0％、对羟基苯甲酸乙酯0.5％、硼砂0.5％、山梨酸4％。A组、B组、C组、D组组合物的浓缩液按照以上配比均可形成膏状制剂。

2.凝胶制剂

将各原料按照以下质量百分比混合，观察能否形成凝胶制剂，实施例1中组合物的浓缩液95.0％、卡波姆1％、羟基纤维素钠3％，冰片1％，所述凝胶制剂的调节pH值至6。A组、B组、C组、D组组合物的浓缩液按照以上配比均可形成凝胶制剂。

将各原料按照以下质量百分比混合，观察能否形成凝胶制剂，取实施例1中组合物的浓缩液85.0％、卡波姆2％、羟基纤维素钠10％，冰片3％，所述凝胶制剂的调节pH值为6。A组、B组、C组、D组组合物的浓缩液可形成凝胶制剂。

3.液体制剂

将各原料按照以下质量百分比混合，观察能否形成液体制剂，取实施例1中组合物的浓缩液80.0％、甘油5.0％、丙二醇5.0％、二甲亚砜5.0％、山茶油4.95％、硼砂0.05％。A组、B组、C组、D组组合物的浓缩液可形成液体制剂。

将各原料按照以下质量百分比混合，观察能否形成液体制剂，取实施例1中组合物的浓缩液95.0％、甘油3.0％、丙二醇0.5％、二甲亚砜0.5％、低芥酸菜子油0.95％、硼砂0.05％。A组、B组、C组、D组组合物的浓缩液可形成液体制剂。

实施例3临床研究

将实施例1获得的组合物浓缩液制备成不同的制剂。将A组制备成喷雾剂(标记为1-1)和凝胶剂(标记为1-2)。将B组制备成凝胶剂(标记为2)。将C组制备成膏状剂(标记为3)。将D组制备成喷雾剂(标记为4-1)和膏状剂(标记为4-2)，以制剂的终质量为基准，以上制剂中各组成成分的质量百分比如下：

1-1：100％组合物的浓缩液

1-2：组合物浓缩液95.0％、卡波姆1％、羟基纤维素钠3％，冰片1％，所述凝胶制剂的调节pH值至8。

2：组合物的浓缩液88.0％、卡波姆2％，羟基纤维素钠9％，冰片1％，调节PH值至8。

3：组合物的浓缩液80.0％、二甲亚砜3.0％，单硬脂酸甘油酯15.0％、对羟基苯甲酸乙酯0.5％、硼砂0.5％、山梨酸1.0％。

4-1：组合物的浓缩液80.0％，甘油5.0％、丙二醇5.0％、二甲亚砜5.0％，山茶油或低芥酸菜子油或茶油4.95％，硼砂0.05％。

4-2：组合物的浓缩液70.0％、二甲亚砜5.0％、单硬脂酸甘油酯15.0％、对羟基苯甲酸乙酯0.5％、硼砂0.5％、山梨酸9.0％。

将以上1-1、1-2、2、3、4-1、4-2各组制剂以及对照药物按照表1的方案向不同种类的难治型皮肤溃疡给药，除带状疱疹的实验组病例数为8例外，其他每种制剂及对照药物的病例数均为10例。各种制剂以及对照药物每次给药量按照以下标准进行：喷雾的使用量为向患处喷雾直至肉眼可见患处均被液体覆盖；凝胶剂的使用量为用手或棉棒蘸取凝胶剂，在患处摊开薄薄一层，并且患处均被凝胶剂覆盖即可；膏状剂的使用量与凝胶剂的使用量相同。实验组和对照组病例的收录标准均为根据医院临床诊断的结果收录。为由表1中的治疗效果可看出，同一制剂形式，对应同一病症治疗，均可取得良好的治疗效果。D组制备的组合物，2种应用剂型应用效果优于A组方案制剂。工艺A组和D组组合物制备的制剂优于B组和C组组合物制备的制剂，可能由于使用浓度较工艺A组和D组低。仅从分泌的γ-干扰素含量看无显著差异，4种工艺方案制备的组合物及外用制剂对难治型溃疡和药物和治疗导致的炎性溃疡均有显著效果，治疗效果显著优于现在使用的外用现有的制剂。以上所有药物均无明显不良反应产生。

表1临床研究记录

以上的实施例是为了说明本发明公开的实施方案，并不能理解为对本发明的限制。此外，本文所列出的各种修改以及发明中方法的变化，在不脱离本发明的范围和精神的前提下对本领域内的技术人员来说是显而易见的。虽然已结合本发明的多种具体优选实施例对本发明进行了具体的描述，但应当理解，本发明不应仅限于这些具体实施例。事实上，各种如上所述的对本领域内的技术人员来说显而易见的修改来获取发明都应包括在本发明的范围内。

Claims (13)

1.一种组合物在制备预防或治疗皮肤溃疡或皮肤炎性反应疾病产品中的用途，其特征在于，所述组合物为单个核细胞经刺激活化后获得的产物。

2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述用途为所述组合物在制备治疗难治型皮肤溃疡产品中的用途，所述难治型皮肤溃疡优选的包括糖尿病足溃疡、口腔反复性溃疡、带状疱疹溃疡、湿疹反复性溃疡或药物导致的皮肤溃疡。

3.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述单个核细胞中包括淋巴细胞和/或单核细胞。

4.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，用于刺激活化单个核细胞的物质包括刺激蛋白、白细胞介素或刺激细胞中的一种或几种。

5.根据权利要求4所述的用途，其特征在于，还包括以下特征中的一个或几个：

1)所述刺激蛋白包括CD3抗体、CD16抗体、CD28抗体、胰岛素或植物蛋白中的一种或几种；

2)所述白细胞介素包括IL-2、IL-12、IL-10、IL-21、IL-18、IL-15中的一种或几种；

3)所述刺激细胞选自肿瘤细胞；

4)所述刺激细胞为灭活的细胞或具有增殖活性的细胞；

5)所述单个核细胞的刺激活化的条件为：35-40℃，二氧化碳浓度5％-7％。

6.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述产品中含所述组合物的质量百分比为50.0-100.0％。

7.根据权利要求1-6任一所述的用途，其特征在于，所述产品为药物，所述药物还包括一种或多种药学上可接受的载体或辅料，所述药物优选为外用药物。

8.一种用于制备预防或治疗皮肤溃疡或皮肤炎性反应疾病产品的组合物的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：

1)向含有单个核细胞的液体中加入刺激蛋白、白细胞介素或刺激细胞中的一种或几种，孵育4小时以上，获得单个核细胞刺激活化液；

2)去除单个核细胞刺激活化液中的细胞获得组合物的原液。

9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述制备方法还包括以下特征中的一项或几项：

a)所述刺激蛋白包括CD3抗体、CD16抗体、CD28抗体、胰岛素或植物蛋白中的一种或几种，以含有单个核细胞的液体总体积为基准，所述刺激蛋白的使用终浓度优选为0.1-0.6mg/ml；

b)所述白细胞介素包括IL-2、IL-12、IL-10、IL-21、IL-18、IL-15中的一种或几种，当包括IL-2时，以含有单个核细胞的液体总体积为基准，所述白细胞介素中IL-2的使用终浓度为1000-2000IU/ml；其它白细胞介素使用的终浓度分别为10-150ng/ml；

c)所述刺激细胞选自肿瘤细胞；

d)所述单个核细胞的孵育条件为：35-40℃，二氧化碳浓度5％-7％；

e)孵育刺激时单个核细胞所用的液体选自含血清或无血清悬浮细胞培养基；

f)将组合物的原液经浓缩至原液体积的1/3～1/5，得到组合物的浓缩液；

g)将所述组合物除菌。

10.一种组合物，其特征在于，所述组合物为通过权利要求8-9任一所述制备方法制备获得。

11.一种产品，所述产品为膏状制剂，其特征在于，以液体制剂的终质量为基准，所述膏状制剂包括以下质量百分比的组分：

12.一种产品，所述产品为凝胶制剂，其特征在于，以液体制剂的终质量为基准，所述凝胶制剂包括以下质量百分比的组分：

所述凝胶制剂的pH值为6-8。

13.一种产品，所述产品为液体制剂，其特征在于，以液体制剂的终质量为基准，所述液体制剂包括以下质量百分比的组分：

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