CN106389467A - 一种用于治疗皮炎和湿疹类皮肤病的外用药物及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于治疗皮炎和湿疹类皮肤病的外用药物及其制备方法和应用,所述外用药物的主要成分为NK细胞原液,所述NK细胞原液是由NK细胞进行扩增培养获得的,将NK细胞原液与不同的药物辅料混合,可制成外用液体制剂或外用膏状制剂。与现有技术相比,该外用药物内含抗炎及高效活性因子,可确保药物活性成分安全有效地抵达病灶,清除病因。使用后,可形成皮肤保护膜,有利于损伤修复。对于皮炎和湿疹类皮肤病,炎症因子通过稳定细胞膜,抑制过敏反应物质、慢反应物质等的释放,达到止痒、消炎的目的,且长期使用无毒副作用,特别是对于皮肤敏感者、婴幼儿、孕妇、不适宜用其它种类药物、激素的特殊人群也同样适用。
Description
技术领域
本发明涉及的是一种药物制剂,尤其涉及一种用于治疗皮炎和湿疹类皮肤病的外用药物及其制备方法和应用。
背景技术
自身敏感性皮炎是由于患者对自身内部或皮肤组织所产生的某些物质而引起的湿疹样皮炎。一般根据皮疹的炎症、有无溃疡、有无化脓感染给予湿敷,氧化锌油外用。内用抗生素,必要时予以小量皮质类固醇激素能较快控制症状。但有时急性症状消退后,常有一段类似亚急性湿疹反复发作的过程。
接触性皮炎是皮肤粘膜由于接触外界物质,如化纤衣着,化妆品、药物等等而发生的炎性反应。其临床特点为在接触部位发生边缘鲜明的损害,轻者为水肿性红斑,较重者有丘疹、水疱甚至大疱,更严重者则可有表皮松解,甚至坏死。如能及早去除病因和作适当处理,可以速愈,否则可能转化为湿疹样皮炎。
湿疹是一种常见的由多种内外因素引起的表皮及真皮浅层的炎症性皮肤病,是一种过敏性炎症皮肤病。其临床表现具有对称性、渗出性、瘙痒性、多形性和复发性等特点。可发生于任何年龄任何部位,任何季节,但常在冬季复发或加剧有渗出倾向,慢性病程,易反复发作。湿疹是一种病因非常复杂与免疫有关的疾病,目前尚不能根治。市场上多采用外用和内用药物治疗,内用在于抗炎和止痒,常用抗组胺药物(氟雷他定、西替利嗪)、镇静安定药物、抗生素等;外用糖皮质激素霜剂、抗生素等。
对于以上皮炎和湿疹类皮肤病,市场上多采用内服和外用疗法,抗病毒药物如吗啉呱、阿糖胞苷、无环鸟苷等。有些皮肤病须使用激素类和抗生素,长期使用,产生毒副作用影响健康,部分皮肤病反复发作、难以达到较好的疗效。所以有必要开发一种效果显著、广谱性的药物治疗自身免疫性类的皮肤病。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足,提供了一种用于治疗皮炎和湿疹类皮肤病的外用药物及其制备方法和应用,以解决现有药物作用单一,疗效不够理想,部分皮肤病反复发作,无法根治,且毒副作用大等技术问题。
本发明是通过以下技术方案实现的:
本发明提供了一种用于治疗皮炎和湿疹类皮肤病的外用药物,所述外用药物包括质量百分比为20%-100%的NK细胞原液。
进一步地,所述外用药物为一种液体制剂,命名为SNK液,所述SNK液的组分及其质量百分比包括:NK细胞原液80.0-95.0%、甘油1.0-2.0%、硼砂0.05-0.08%、羟苯乙酯0.01-0.03%,溶剂为水。
进一步地,所述外用药物为一种膏状制剂,命名为SNK膏,所述SNK膏的组分及其质量百分比包括:NK细胞原液65.0-75.0%、单、双硬脂酸甘油酯3.0-10.0%、对羟基苯甲酸乙酯0.01-0.5%、硼砂0.08-0.5%、二甲亚砜0.5-5.0%、山梨酸1.0-10.0%,余量为水。
本发明还提供了上述治疗皮炎和湿疹类皮肤病的外用药物的制备方法,包括以下步骤:
(1)取NK细胞进行扩增培养,获得NK细胞原液;
(2)将NK细胞原液与外用药物辅料混合,制备获得所述外用药物。
进一步地,若所述药物为液体制剂时,所述NK细胞原液的质量百分比为80.0-95.0%,所述辅料及其质量百分比包括:甘油1.0-2.0%、硼砂0.05-0.08%、羟苯乙酯0.01-0.03%,溶剂为水;若所述药物为膏状制剂时,所述NK细胞原液的质量百分比为65.0-75.0%,所述辅料及其质量百分比包括:单、双硬脂酸甘油酯3.0-10.0%、对羟基苯甲酸乙酯0.01-0.5%、硼砂0.08-0.5%、二甲亚砜0.5-5.0%、山梨酸1.0-10.0%,余量为水。
进一步地,所述NK细胞扩增培养的方法,包括以下步骤:
步骤一:取新鲜血液,提取血液中的外周血单核细胞(以下简称PBMC);
步骤二:在RPMI-1640基础培养基中加入200U/ml的白介素IL-2、80U/ml的庆大霉素和10%重量百分比的胎牛血清,获得NK细胞培养液;
步骤三:取3.0×107-4.0×107个PBMC于一细胞培养瓶中,加入20-30ml的NK细胞培养液和2ml的浓度为1.0×107个/ml的NK扩增试剂,获得起始培养液;
步骤四:将NK细胞接种于起始培养液中培养1-2天,培养期间根据细胞生长状态添加NK细胞培养液;当培养至第3天时,将培养液离心,获得的细胞沉淀中加入NK细胞培养液继续培养;
步骤五:当NK细胞数量达1.5×108个/瓶以上时,加入2ml的NK扩增试剂和NK细胞培养液进行扩大培养,培养过程中根据细胞生长状态增加NK细胞培养液并进行分袋培养,使细胞浓度在1.0×106个/ml,当培养至第12天时,控制加液量,使细胞浓度为2.0×106个/ml;
步骤六:继续培养至第14天后,收集细胞培养液,获得NK细胞原液。
本发明还提供了上述外用药物在作为皮炎和湿疹类皮肤病治疗药物中的应用。
进一步地,将NK细胞原液与不同的外用药物辅料混合,制备获得外用液体制剂和外用膏状制剂,在使用上述外用药物治疗皮炎和湿疹类皮肤病时,先用外用液体制剂涂抹或喷液于患处,再用外用膏状制剂涂抹患处,进行混合使用治疗,可保持药效能够很好地让皮肤吸收,达到最佳治疗效果,混合治疗数次后,症状即可减轻或消失。
本发明的原理为:NK细胞(natural killer cell,自然杀伤细胞)是机体重要的免疫细胞,不仅与抗肿瘤、抗病毒感染和免疫调节有关,而且在某些情况下参与超敏反应和自身免疫性疾病的发生。本生物制剂采用NK细胞原液治疗病原体感染性皮肤病,NK细胞原液的主要成分是NK细胞分泌的生长因子,包括MIP-1α、MIP-1β、RANTES、单核细胞趋化蛋白、白介素、集落刺激因子、肿瘤坏死因子、干扰素以及穿孔素等。本生物制剂的治疗机理之一是NK细胞原液中内含抗炎抗病毒及高效活性因子,可迅速渗透皮肤抵达病灶,清除病因,同时,还可诱导机体产生体液免疫及细胞免疫反应,提高了皮肤自身的抵抗能力,形成皮肤保护膜,加快修复受损的组织和细胞,最终达到治疗的效果。
与现有技术相比,本发明提供了一种用于治疗皮炎和湿疹类皮肤病的外用药物及其制备方法和应用,该外用药物内含抗炎、抗病毒及高效活性因子,可确保药物活性成分安全有效地抵达病灶,清除病因,并可迅速止痛缓解症状。使用时,可形成皮肤保护膜,有利于损伤修复。对于皮痒、普通湿疹和婴儿湿疹皮肤病,炎症因子通过稳定细胞膜,抑制过敏反应物质、慢反应物质等的释放,达到止痒、消炎的目的。具有很好的效果,并且使用方便,长期使用无毒副作用,特别是对于皮肤敏感者、婴幼儿、孕妇等,不适宜用其它种类药物、激素的特殊人群也同样适用。
具体实施方式
实施例1
1、材料:
本实施例所用方法如无特别说明均为本领域的技术人员所知晓的常规方法,所用的试剂等材料,如无特别说明,均为市售购买产品。
2、方法
2.1制备NK细胞原液
步骤一:PBMC提取:
将新鲜血液于740g离心10分钟,获得上层淡黄色血浆和下层血细胞,将下层血细胞与生理盐水按照体积比1:1混合,取50ml离心管,将稀释的血细胞悬液铺在15ml淋巴细胞分离液上,400g离心30分钟。收集中间白色膜状细胞层,加入生理盐水洗涤,400g离心10分钟,弃上清液,重复洗涤一次。最后用适量培养液重悬细胞沉淀,即获得PBMC。
步骤二:NK细胞培养液的制备:
在Gibco RPMI Medium 1640basic培养液(购买于美国GIBCO公司)中加入200U/ml的白介素IL-2、80U/ml的庆大霉素和10%重量百分比的Gibco FBS(购买于美国GIBCO公司),获得NK细胞培养液。
步骤三:NK细胞起始培养液的制备:
取3.0×107-4.0×107个PBMC于一T75培养瓶中,加入20-30ml的NK细胞培养液和1支NK扩增试剂,其中,所述NK扩增试剂为一种CD8α-白介素21-CD137复合物(参见中国专利文献CN102154207A),可直接通过市场购买的方式获得,本发明使用的NK扩增试剂的产品规格为2ml/支,浓度为1×107个/ml。
步骤四:NK细胞起始培养:
将NK细胞接种于上述T75培养瓶中培养,其中:
第1、2天注意观察细胞。如果细胞状态良好可不处理。若培养液细胞密度明显加大,可加NK细胞培养液10ml。
第3天将培养液离心,获得的细胞沉淀转移至新的T75培养瓶中,并加入30ml的NK细胞培养液继续培养。
第4天观察细胞,若细胞状态良好,可不做处理,如果细胞密度过大,可酌情加NK细胞培养液。
第5天,若第4天未处理,且细胞状态良好,密度大,则加入NK细胞培养液20ml。
第6天观察细胞,根据细胞密度添加培养液30-50ml。
步骤五:NK细胞扩大培养:
第7天计数,若细胞数量大于1.5×108个/瓶,则加入2支NK扩增试剂,若细胞数量在30-60百万,则长至第8天再添加NK扩增试剂。然后添加NK细胞培养液,使总细胞浓度在1.0×106个/ml。随培养体积逐步增大,可转入T175培养方瓶扩大体积培养,培养液体积大于120ml或细胞数量大于1.5×108个/瓶时,则可以转移至培养袋培养。
第8-11天每天观察细胞,使得细胞浓度在1.0×106个/ml左右,通过计数添加培养液,使得细胞浓度在1.0×106个/ml。
第12-14天每天观察,当细胞数量大于3.0×109个/袋,并且体积大于1200ml时,将细胞分为2袋。
步骤六:收集NK细胞原液:
当细胞生长至所需数量时即可进行收集使用或冻存。一般情况下,14或15天收集细胞,因为此时细胞处于对数生长期,状态最好,越往后细胞状态会缓慢下滑,此时细胞可到3×109个以上,NK细胞(CD3-CD56+)纯度可达到80%以上。
2.2制备SNK液:
按重量计,取95.0%、甘油1.0%、硼砂0.05%、羟苯乙酯0.01%,充分溶解在无菌水中,混匀后灭菌分装,获得所述SNK液。
2.3制备SNK膏:
按重量计,取NK细胞原液75.0%、单、双硬脂酸甘油酯3.0%、对羟基苯甲酸乙酯0.01%、硼砂0.08%、二甲亚砜0.5%、山梨酸1.0%,余量为水,混匀后灭菌分装,获得所述SNK膏。
3、临床验证
将临床实验分成3组进行,具体为:
实验组1:选若干皮炎或湿疹类皮肤病的病人,包括:普通湿疹8例、接触性皮炎5例、婴儿湿疹5例、自身敏感性皮炎4例,用SNK液进行涂抹或喷液治疗,每天使用2-3次,统计临床治疗结果。
实验组2:选若干皮炎或湿疹类皮肤病的病人,包括:普通湿疹8例、接触性皮炎5例、婴儿湿疹5例、自身敏感性皮炎4例,用SNK膏进行涂抹治疗,每天使用2-3次,统计临床治疗结果。
实验组3:选若干皮炎或湿疹类皮肤病的病人,包括:普通湿疹8例、接触性皮炎5例、婴儿湿疹5例、自身敏感性皮炎4例,用SNK液及膏涂抹及喷液治疗,每天使用2-3次,统计临床治疗结果。
结果如下表1所示:
表1:SNK液和SNK膏临床实验结果统计表
临床实验可看出,本发明的NK细胞原液、SNK液和SNK膏均具有广谱抗病性,可迅速缓解皮炎或湿疹类皮肤病的症状,形成皮肤保护膜,有利于损修复。3组实验患者均未出现任何副作用,长期使用无毒副作用。其中:第一组和第二组分别为SNK液和SNK膏,SNK液和SNK膏中由于NK细胞原液的含量不同,疗效稍微有差别,SNK液比膏效果好。当SNK液和SNK膏一起使用时(先涂SNK液,再涂SNK膏),既可保证NK液中的活性因子高效和持久被皮肤所吸收,又可提高疗效,两者联合使用疗效最佳。
实施例2
本实施例提供了一种SNK液,按重量计,所述SNK液由NK细胞原液80.0%、甘油2.0%、硼砂0.08%、羟苯乙酯0.03%和适量水组成,其中,所述NK细胞原液的制备方法同实施例1。
选患有普通湿疹和接触性皮炎的患者各2例,利用上述SNK液进行喷液治疗,每天使用2-3次,统计治疗结果。
结果发现:上述SNK液对普通湿疹和接触性皮炎均具有一定效果,对于普通湿疹,患者连续使用10天后,症状明显好转;对于接触性皮炎,使用5天后可明显好转,其中1例轻度患者使用5天后痊愈。
实施例3
本实施例提供了一种SNK膏,按重量计,所述SNK膏由NK细胞原液65.0%、单、双硬脂酸甘油酯10.0%、对羟基苯甲酸乙酯0.5%、硼砂0.5%、二甲亚砜5.0%、山梨酸10.0%和适量水组成。
选婴儿湿疹和自身敏感性皮炎患者各2例,用所述SNK膏进行涂抹治疗,每天使用2-3次,统计治疗效果。
结果发现,该SNK膏对婴儿湿疹具有显著效果,其中1例轻度患者连续使用3天后痊愈,另一例连续使用5天后痊愈;对自身敏感性皮肤病也具有一定效果,使用7天后,2例患者症状均有显著改善。
实施例4
本实施例提供了一种SNK液,按重量计,所述SNK液由NK细胞原液20%,甘油5%和适量无菌水组成,利用上述SNK液治疗婴儿湿疹,结果3天症状即可减轻,7天症状可明显改善。
实施例5
本实施例提供了一种SNK液,按重量计,所述SNK液由NK细胞原液50%,甘油5%和适量无菌水组成,利用上述SNK液治疗接触性皮炎,7天后可痊愈。
实施例6
本实施例提供了一种SNK液,所述SNK液为100%的NK细胞原液,利用所述SNK液治疗自身敏感性皮炎7天,症状基本消失。
理论上,药物中的NK细胞原液的含量越高,活性因子含量越高,效果越好,但考虑到使用方便性和增加皮肤渗透性和保护性的情况下,需要在NK细胞原液基础上添加了一些辅助成分,实施例6中采用100%的NK细胞原液进行治疗,其临床实验结果与实施例1的SNK液及膏相比,在治疗效果上并无很大差别。
以上为本发明一种详细的实施方式和具体的操作过程,是以本发明技术方案为前提下进行实施,但本发明的保护范围不限于上述的实施例。
Claims (8)
1.一种用于治疗皮炎和湿疹类皮肤病的外用药物,其特征在于,所述外用药物包括质量百分比为20%-100%的NK细胞原液。
2.根据权利要求1所述的一种用于治疗皮炎和湿疹类皮肤病的外用药物,其特征在于,所述外用药物为一种液体制剂,其组分及其质量百分比包括:NK细胞原液80.0-95.0%、甘油1.0-2.0%、硼砂0.05-0.08%、羟苯乙酯0.01-0.03%,溶剂为水。
3.根据权利要求1所述的一种用于治疗皮炎和湿疹类皮肤病的外用药物,其特征在于,所述外用药物为一种膏状制剂,其组分及其质量百分比包括:NK细胞原液65.0-75.0%、单、双硬脂酸甘油酯3.0-10.0%、对羟基苯甲酸乙酯0.01-0.5%、硼砂0.08-0.5%、二甲亚砜0.5-5.0%、山梨酸1.0-10.0%,余量为水。
4.一种如权利要求1-3所述的用于治疗皮炎和湿疹类皮肤病的外用药物的制备方法,其特征在于,包括以下步骤:
(1)取NK细胞进行扩增培养,获得NK细胞原液;
(2)将NK细胞原液与外用药物辅料混合,制备获得所述外用药物。
5.根据权利要求4所述的一种用于治疗皮炎和湿疹类皮肤病的外用药物的制备方法,其特征在于,若所述药物为液体制剂时,所述NK细胞原液的质量百分比为80.0-95.0%,所述辅料及其质量百分比包括:甘油1.0-2.0%、硼砂0.05-0.08%、羟苯乙酯0.01-0.03%,溶剂为水;若所述药物为膏状制剂时,所述NK细胞原液的质量百分比为65.0-75.0%,所述辅料及其质量百分比包括:单、双硬脂酸甘油酯3.0-10.0%、对羟基苯甲酸乙酯0.01-0.5%、硼砂0.08-0.5%、二甲亚砜0.5-5.0%、山梨酸1.0-10.0%,余量为水。
6.根据权利要求4所述的一种用于治疗皮炎和湿疹类皮肤病的外用药物的制备方法,其特征在于,所述NK细胞扩增培养的方法,包括以下步骤:
步骤一:取新鲜血液,提取血液中的外周血单核细胞PBMC;
步骤二:在RPMI-1640基础培养基中加入200U/ml的白介素IL-2、80U/ml的庆大霉素和10%重量百分比的胎牛血清,获得NK细胞培养液;
步骤三:取3.0×107-4.0×107个PBMC于一细胞培养瓶中,加入20-30ml的NK细胞培养液和2ml的浓度为1.0×107个/ml的NK扩增试剂,获得起始培养液;
步骤四:将NK细胞接种于起始培养液中培养1-2天,培养期间根据细胞生长状态添加NK细胞培养液;当培养至第3天时,将培养液离心,获得的细胞沉淀中加入NK细胞培养液继续培养;
步骤五:当NK细胞数量达1.5×108个/瓶以上时,加入2支NK扩增试剂和NK细胞培养液进行扩大培养,培养过程中根据细胞生长状态增加NK细胞培养液并进行分袋培养,使细胞浓度在1.0×106个/ml,当培养至第12天时,控制加液量,使细胞浓度为2.0×106个/ml;
步骤六:继续培养至第14天后,收集细胞培养液,获得NK细胞原液。
7.一种如权利要求1-3所述的外用药物在作为皮炎和湿疹类皮肤病治疗药物中的应用。
8.根据权利要求7所述的一种外用药物在作为皮炎和湿疹类皮肤病治疗药物中的应用,其特征在于,将NK细胞原液与外用药物辅料混合,制备获得外用液体制剂和外用膏状制剂,使用时,先用外用液体制剂,再用外用膏状制剂进行混合治疗。
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