JP7295243B2 - ヒトVγ9Vδ2T細胞増殖培養方法及び培地 - Google Patents
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Description
本出願は、2018年12月24日に中国専利局に提出された、出願番号が201811580040.2であり、名称が「ヒトVγ9Vδ2T細胞増殖方法及び培地」である中国出願に基づいて優先権を主張し、その全ての内容が、参照により本出願に組み込まれる。
本開示は、細胞培養の技術分野に属し、殊に、ヒトVγ9Vδ2T細胞増殖方法及び培地に関する。
T細胞を刺激可能な第1培地を用いてT細胞を含む組成物を培養して前記T細胞を刺激するステップAと、
インターロイキン-2と、インターロイキン-15と、ビタミンC又はビタミンC誘導体とが含まれた第2培地を用いて、刺激された前記T細胞を培養するステップBとを含む。
(1)関係被験者の末梢血から末梢血単核細胞を分離すること、
(2)本開示に係る増殖方法で前記末梢血単核細胞を増殖すること、
(3)前記関係被験者に増殖できた産物を投与することと、を含む。
本明細書に使用する用語「基礎培地」は、哺乳類動物細胞の成長に栄養を供給する栄養素を含む溶液を意味する。基礎培地は、例えば亜鉛、鉄、マグネシウム、カルシウム、カリウムのような標準無機塩、ビタミン、ブドウ糖、緩衝系及び必須アミノ酸を提供する。例えば、基礎培地は、RPMI-1640培地、D-MEM、MEM、RPMI、Opti-MEM又はこれらの組み合わせである。
ステップ2は、第1培地を提供し、前記第1培地を用いて前記末梢血単核細胞を再懸濁させて、細胞懸濁液を得る。
(1)第1被験者の末梢血から末梢血単核細胞を分離する。
(2)インターロイキン-2とホスホン酸系化合物を含有する培地を用いて末梢血単核細胞を培養してVγ9Vδ2T細胞を刺激し、任意選択で、該培地にインターロイキン-15と、ビタミンC又はビタミンC誘導体とがさらに含まれる。
(3)インターロイキン-2と、インターロイキン-15と、ビタミンC又はビタミンC誘導体とを含有する第2培地を用いて、刺激したVγ9Vδ2T細胞を培養する。
(4)第2被験者に培養できた細胞を投与する。
(1)従来の増殖方法(第2種の増殖技術)と比べて、本開示に係る増殖方法によれば、ヒトVγ9Vδ2T細胞の増殖効率がより高く、細胞の純度がより高く、(ステップ3から)10-12日培養した時点で、90%の細胞純度を得ることができ、細胞増殖の比率が1000倍以上(即ち、10万個のヒトVγ9Vδ2 T細胞を少なくとも1億個のヒトVγ9Vδ2 T細胞まで増殖させることができる)に達し、ヒトVγ9Vδ2 T細胞の増殖培養周期を顕著に短縮させることができる。
(2)従来の増殖方法(第2種の増殖技術)で得たヒトVγ9Vδ2 T細胞と比べて、本開示により増殖して得たヒトVγ9Vδ2 T細胞は、腫瘍に対する殺傷及び抑制の能力がより高い。
(3)本開示により増殖して得たヒトVγ9Vδ2 T細胞は、抗アポトーシス能力がより高く、生存期間がより長く、そして、細胞増殖培養周期(ステップ3から10~12日)終了後、本開示により増殖して得たヒトVγ9Vδ2 T細胞がさらに約20日生存できる。
末梢血中単核細胞の分離
(1)4mLヒトリンパ球分離溶液を15mLコニカル遠心チューブに入れ、1×PBS緩衝液を用いて等比例で末梢血を希釈し、均一に混合したあと、希釈した末梢血10mLを試験管壁に沿ってリンパ球分離溶液の表面に緩慢に展開させ、25℃、600gで25分間遠心した。
Ficoll分離溶液を用いて新鮮な血液の中のPBMCを分離して、10%のFBS含有のRPMI-1640完全培地により細胞密度を3~4×106個/mLに調整して24ウェルプレートに播種し、40ng/mLのIL-2と50μMのゾレドロン酸を加えて3日刺激した。その後、ゾレドロン酸を除去し、2~3日毎に培地を交換、継代し、濃度で100IU/mLのIL-15、100IU/mLのIL-2、70μMのビタミンCである細胞因子含有のRPMI-1640培地を用いて、37℃、5%のCO2、PH=7.2-7.4、95%の湿度の条件下、培養器で10~14日培養した。
10日~14日体外増殖したVγ9Vδ2 T細胞を集め、1.5mLのEP管内に入れ、小型遠心機(Eppendorf 5424)を利用して3500rpmで5分間遠心し、上清を除去して、4℃の予冷されたPBSで2回洗浄した。細胞をコントロール、アイソタイプコントロール、試験群によって相応の試験管に入れ、各管に約5×105個の細胞を入れた。コントールチューブと検出チューブは、抗体マニュアルに基づいて蛍光抗体染色液を調製した。蛍光抗体染色液は、抗ヒトCD3-V500、抗ヒトTCR-δ2-PE、抗ヒトCD45-PE-cy5、抗ヒトCD27-PB、NKG2D-PE-cy7を含む。調製できた蛍光抗体染色液を用いて細胞を再懸濁させて、4℃の冷蔵庫又は氷に置いて、遮光で15-20分染色し、PBSで2回洗浄し、3500rpmで5分間遠心し、上清を除去して、200~300μLのPBSを用いて再懸濁させ、フローサイトメーターによりVγ9Vδ2 T細胞の純度及び表型を測定した。
1)收集7~10×105個の体外増殖した10~14日時点のVγ9Vδ2 T細胞を集め、1.5mLのEP管内に入れ、小型遠心機(Eppendorf 5424)を利用して3500rpmで5分間遠心し、上清を除去して、4℃の予冷されたPBSで2回洗浄した。
ヒト化マウス肺がんモデルの構築及び実験方法
1.実験動物
3~4週齡のRag2-/-γc-/-雌マウスは、Taconic社から購入したSPF級マウスであった。免疫不全マウスは、独立で通風のIVCかごを使用する。各かごに、それぞれ5匹のマウスを飼う。各isolatorは、個別に換気を行うHEPAを有し、且つ24時間の温湿度制御を行う。飼料、床敷材は、真空包装され、γ-放射線滅菌が行われて供給されるものである。さらに、動物飲用水として滅菌水を用い、該環境下で飼われる動物の包装も滅菌環境下で行われる。さらに、生物安全を確保できる運送箱により動物を運送する。これによって、飼養及び運送が同様な微生物状態に維持されることを確保し、動物の質を確保、維持する。なお、動物実験は、実験動物倫理委員会の承認を得た。
Ficoll液密度勾配遠心法によりPBMC(huPBMC)を分離してヒト化マウスモデル(huPBMCs humanized mice)を構築した。その後の測定時に、再注入に利用されるγδT細胞とヒト化マウス自身のγδT細胞とを容易に区別するため、ヒト化マウスの構築に関わるPBMCのHLAtypeは、再注入に利用されるγδT細胞と異なって、通常HLA-A2+/-にする。
1)5~7日腫瘍形成後、3日毎にマウス尾静脈より肺がんの担がんヒト化マウスモデルに5×106個の、それぞれIL-2、IL-2+Vc、IL-2+IL-15、IL-2+IL-15+Vcを用いて培養できたγδT細胞を注射し、各群に5匹マウスあり、投与量が100μL/匹マウスであった。PBS注射群を治療の対照群とする。それぞれIL-2、IL-2+Vc、IL-2+IL-15、IL-2+IL-15+Vcを用いて培養できたγδT細胞は、実施例1における「Vγ9Vδ2 T細胞の体外増殖」部分に記載した方法及びステップにより獲得するものであり、IL2、IL2+VC、IL2+IL15、IL2+IL15+Vcが表すことが実施例1に用いられる図1における意味と同意味である。
腫瘍治療実験の結果は、図4A、図4B、図4C、図5及び図6に示すようになる。
該実施例3は、RPMI-1640培地と、前記RPMI-1640培地に添加されたインターロイキン-2、インターロイキン-15及びビタミンCとが含まれた第2培地を提供する。
該実施例4は、RPMI-1640培地と、前記RPMI-1640培地に添加されたインターロイキン-2、インターロイキン-15及びビタミンCとが含まれた第2培地を提供する。
該実施例5は、実施例3に記載された第2培地と、ゾレドロン酸とが含まれた第1培地を提供する。
該実施例6は、実施例4に記載された第2培地と、ゾレドロン酸とが含まれた第1培地を提供する。
Claims (12)
- Vγ9Vδ2T細胞を刺激可能な、インターロイキン-2とゾレドロン酸とが含まれる第1培地を用いてVγ9Vδ2T細胞を含む組成物を培養して前記Vγ9Vδ2T細胞を刺激するステップAと、
インターロイキン-2と、インターロイキン-15と、ビタミンC又はビタミンC誘導体とが含まれる第2培地を用いて、刺激された前記Vγ9Vδ2T細胞を培養するステップBと、を含むVγ9Vδ2T細胞増殖方法。 - 前記第1培地に、インターロイキン-15と、ビタミンC又はビタミンC誘導体とがさらに含まれる、請求項1に記載の方法。
- 前記ビタミンC誘導体は、ビタミンCエチル、ビタミンCパルミチン酸エステル、ビタミンCグルコシド、ビタミンCリン酸アスコルビルマグネシウム、ビタミンCリン酸アスコルビルナトリウム及びこれらの組み合わせからなる群から選択するものである、請求項1又は2に記載の方法。
- 前記第2培地は、インターロイキン-15の濃度が1~1000ng/mlである、請求項1~3のいずれか1項に記載の方法。
- 前記第2培地は、ビタミンC又はビタミンC誘導体の濃度が10μM~800mMである、請求項1~4のいずれか1項に記載の方法。
- 前記第2培地は、インターロイキン-2の濃度が1~1000ng/mlである、請求項1~5のいずれか1項に記載の方法。
- 前記Vγ9Vδ2T細胞を含む組成物は、ヒト末梢血から分離した末梢血単核細胞を含む、請求項1~6のいずれか1項に記載の方法。
- ステップAにおける前記培養の時間は、60~100時間である、請求項1~7のいずれか1項に記載の方法。
- 前記第2培地は、RPMI-1640培地、D-MEM、MEM、RPMI、Opti-MEM及びこれらの組み合わせからなる群から選択した基礎培地を含む、請求項1~8のいずれか1項に記載の方法。
- 前記第2培地は、RPMI-1640培地を含む、請求項9に記載の方法。
- 基礎培地と、
インターロイキン-2とゾレドロン酸とが含まれる第1培地と、
インターロイキン-2と、インターロイキン-15と、ビタミンC又はビタミンC誘導体とが含まれる第2培地と、を含むVγ9Vδ2T細胞増殖のための培地。 - 前記第2培地は、インターロイキン-2の濃度が1~1000ng/mlであり、インターロイキン-15の濃度が1~1000ng/mlであり、ビタミンC又はビタミンC誘導体の濃度が10μM~800mMである、請求項11に記載の培地。
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