JP7295243B2

JP7295243B2 - ヒトＶγ９Ｖδ２Ｔ細胞増殖培養方法及び培地

Info

Publication number: JP7295243B2
Application number: JP2021536329A
Authority: JP
Inventors: 芝南 ▲イン▼; ▲揚▼哲 ▲呉▼; ▲艶▼ 徐
Original assignee: Guangdong Gd Kongming Biotech LLC
Current assignee: Guangdong Gd Kongming Biotech LLC
Priority date: 2018-12-24
Filing date: 2019-02-19
Publication date: 2023-06-20
Anticipated expiration: 2039-02-19
Also published as: GB2595372A; CN109337870B; CN109337870A; KR20210091782A; GB2595372B; US20210332328A1; GB202109020D0; JP2022515791A; WO2020133643A1; EP3904506A4; AU2019411781B2; EP3904506A1; AU2019411781A1

Description

関係出願の相互参照
本出願は、２０１８年１２月２４日に中国専利局に提出された、出願番号が２０１８１１５８００４０．２であり、名称が「ヒトＶγ９Ｖδ２Ｔ細胞増殖方法及び培地」である中国出願に基づいて優先権を主張し、その全ての内容が、参照により本出願に組み込まれる。

［技術分野］
本開示は、細胞培養の技術分野に属し、殊に、ヒトＶγ９Ｖδ２Ｔ細胞増殖方法及び培地に関する。

免疫細胞治療は、世界範囲の医療分野でも難治性疾患（例えば悪性腫瘍）を治療する新たな重要医療手段となっており、例えば、ＣＡＲ－Ｔ細胞を利用するＢ細胞リンパ腫の治療が挙げられる。科学界と医療界にとって、安定性と信頼性の高い質及び優れる機能を持つ免疫細胞の獲得は、良好の臨床治療効果を得ることにとても重要である。

ヒトＶγ９Ｖδ２Ｔ細胞は、霊長類及びヒトのみに存在する、抗腫瘍、抗感染の機能を持つＴ細胞亜集団である。ヒトＶγ９Ｖδ２Ｔ細胞は、腫瘍、難治性伝染病及び免疫機能不均衡疾病にかかる人に対する免疫細胞治療又は免疫機能再建に用いることができる。

従来、ヒトＶγ９Ｖδ２Ｔ細胞の増殖方法は主に２種がある。

第１種の従来の増殖技術は、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣｓ）の培地にＩＬ－２及びＴＣＲのモノクローナル抗体を添加するものである。この方法は、末梢血の２種のγδＴ細胞（Ｖδ１細胞亜集団とＶδ２細胞亜集団）がともに増殖されるが、Ｖδ１細胞亜集団が免疫抑制機能をもっているので、免疫細胞治療に適しない欠点が主にある。

第２種の従来の増殖技術は、ＰＢＭＣｓの培地にＩＬ－２及び例えばゾレドロン酸であるリン酸塩小分子化合物を添加するものである。この方法は、純度の高いＶδ２亜集団のγδＴ細胞を得ることができるので、免疫細胞治療に適し、現在国内外のヒト末梢血のヒトＶγ９Ｖδ２Ｔ細胞を増殖する常用方法となっている。しかしながら、該方法は、細胞培養増殖の周期が約１４日であり、増殖して得たヒトＶγ９Ｖδ２Ｔ細胞の生存期間が比較的に短く（さらに約７日しか生存できない）、細胞の抗アポトーシス能力、腫瘍細胞に対する殺傷能力が高くない等の欠点がある。

本開示は、例えばヒトＶγ９Ｖδ２Ｔ細胞増殖方法と提供することを目的とする。該方法によれば、ヒトＶγ９Ｖδ２Ｔ細胞の増殖効率及び細胞の純度を高めることができ、培養できたヒトＶγ９Ｖδ２Ｔ細胞が比較的高い腫瘍殺傷能力及び抑制能力を持つとともに、抗アポトーシス能力がより高く、細胞の生存期間がより長い。

本開示は、例えばヒトＶγ９Ｖδ２Ｔ細胞の培地をさらに提供することを目的とする。

該培地を用いてヒトＶγ９Ｖδ２Ｔ細胞を培養すれば、ヒトＶγ９Ｖδ２Ｔ細胞の増殖効率及び細胞の純度を高めることができ、培養できたヒトＶγ９Ｖδ２Ｔ細胞が比較的高い腫瘍殺傷能力及び抑制能力を持つとともに、抗アポトーシス能力がより高く、細胞の生存期間がより長い。

本開示は、例えばヒトＶγ９Ｖδ２Ｔ細胞の刺激増殖培地をさらに提供することを目的とする。該培地によれば、末梢血単核細胞からヒトＶγ９Ｖδ２Ｔ細胞を選択的に増殖させることができ、増殖して得たヒトＶγ９Ｖδ２Ｔ細胞の純度が高く、殺傷能力及び抗アポトーシス能力がより高い。

本開示に係るＴ細胞増殖方法は、
Ｔ細胞を刺激可能な第１培地を用いてＴ細胞を含む組成物を培養して前記Ｔ細胞を刺激するステップＡと、
インターロイキン－２と、インターロイキン－１５と、ビタミンＣ又はビタミンＣ誘導体とが含まれた第２培地を用いて、刺激された前記Ｔ細胞を培養するステップＢとを含む。

１つ又はいくつかの実施形態では、前記Ｔ細胞は、Ｖγ９Ｖδ２Ｔ細胞を含む。

１つ又はいくつかの実施形態では、前記第１培地に、インターロイキン－２とホスホン酸系化合物とが含まれる。

１つ又はいくつかの実施形態では、前記第１培地に、インターロイキン－２と、ホスホン酸系化合物と、インターロイキン－２と、インターロイキン－１５と、ビタミンＣ又はビタミンＣ誘導体とが含まれる。

１つ又はいくつかの実施形態では、前記ビタミンＣ誘導体は、ビタミンＣエチル、ビタミンＣパルミチン酸エステル、ビタミンＣグルコシド、ビタミンＣリン酸アスコルビルマグネシウム、及びビタミンＣリン酸アスコルビルナトリウムから選択するものである。

１つ又はいくつかの実施形態では、前記第２培地は、インターロイキン－１５の濃度が１～１０００ｎｇ／ｍｌである。

１つ又はいくつかの実施形態では、前記第２培地は、ビタミンＣ又はビタミンＣ誘導体の濃度が１０μＭ～８００ｍＭである。

１つ又はいくつかの実施形態では、前記第２培地は、インターロイキン－２の濃度が１～１０００ｎｇ／ｍｌである。

１つ又はいくつかの実施形態では、前記Ｔ細胞を含む組成物は、ヒト末梢血から分離した末梢血単核細胞を含む。

１つ又はいくつかの実施形態では、ステップＡにおける前記培養の時間は、６０～１００時間である。

１つ又はいくつかの実施形態では、前記ホスホン酸系化合物は、ビスホスホネート系化合物を含み、好ましくは、ゾレドロン酸、エチドロン酸、イワンドロン酸、パミドロン酸、アレンドロン酸、リセドロン酸、ミノドロン酸及びこれらの組み合わせからなる群から選択するものであり、例えばゾレドロン酸である。

１つ又はいくつかの実施形態では、前記第２培地は、基礎培地と、インターロイキン－２と、インターロイキン－１５と、ビタミンＣ又はビタミンＣ誘導体とを含む。

１つ又はいくつかの実施形態では、前記基礎培地は、ＲＰＭＩ－１６４０培地、Ｄ－ＭＥＭ、ＭＥＭ、ＲＰＭＩ、Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ及びこれらの組み合わせからなる群から選択するものであり、例えばＲＰＭＩ－１６４０培地である。

本開示は、基礎培地と、インターロイキン－２と、インターロイキン－１５と、ビタミンＣ又はビタミンＣ誘導体とが含まれた培地をさらに提供する。

１つ又はいくつかの実施形態では、培地は、インターロイキン－２の濃度が１－１０００ｎｇ／ｍｌであり、インターロイキン－１５の濃度が１～１０００ｎｇ／ｍｌであり、ビタミンＣ又はビタミンＣ誘導体の濃度が１０μＭ～８００ｍＭである。

本開示は、本明細書に記載の増殖方法で増殖して得たＴ細胞と薬学的に許容可能な担体とを含む薬物組成物をさらに提供する。

本開示は、本明細書に記載の増殖方法で増殖して得たＶγ９Ｖδ２Ｔ細胞と薬学的に許容可能な担体とを含む薬物組成物をさらに提供する。

１つ又はいくつかの実施形態では、前記薬物組成物が細胞懸濁液である。

本開示は、本開示に係る増殖方法で増殖して得たＴ細胞又は本開示に係る薬物組成物の、伝染性疾病、自己免疫疾患又は悪性疾患を抑制、予防又は治療するための薬物の調製における用途をさらに提供する。

１つ又はいくつかの実施形態では、前記悪性疾患が、がんである。

１つ又はいくつかの実施形態では、前記悪性疾患が肺がんである。

本開示は、伝染性疾病、自己免疫疾患又は悪性疾患を抑制、予防又は治療するための方法をさらに提供し、該方法が、
（１）関係被験者の末梢血から末梢血単核細胞を分離すること、
（２）本開示に係る増殖方法で前記末梢血単核細胞を増殖すること、
（３）前記関係被験者に増殖できた産物を投与することと、を含む。

本開示は、本明細書に記載の増殖方法で増殖して得たＴ細胞又は本明細書に記載の薬物組成物の、伝染性疾病、自己免疫疾患又は悪性疾患を抑制、予防又は治療する用途をさらに提供する。

本開示は、本明細書に記載の培地の、Ｔ細胞を増殖する用途をさらに提供する。

１つ又はいくつかの実施形態では、前記Ｔ細胞がＶγ９Ｖδ２Ｔ細胞である。

本開示に係るヒトＶγ９Ｖδ２Ｔ細胞増殖方法は下記ステップを含む。

ステップ１は、ヒト末梢血から末梢血単核細胞を分離する。

ステップ２は、第１培地を提供し、前記第１培地を用いて前記末梢血単核細胞を再懸濁させて、細胞懸濁液を得る。

前記第１培地は第２培地とホスホン酸系化合物を含み、前記第２培地は基礎培地と、前記基礎培地に添加されたインターロイキン－２、インターロイキン－１５、及びビタミンＣ又はビタミンＣ誘導体を含む。

前記ステップ１とステップ２との順序が変更されてもよい。

ステップ３（又はステップＡ）は、前記細胞懸濁液を細胞培養容器に播種して６０－１００時間培養する。

ステップ４（又はステップＢ）は、前記第２培地を用いて培地交換を行い、その後の培養が前記第２培地を用いて行う。

１つ又はいくつかの実施形態では、前記基礎培地がＲＰＭＩ－１６４０培地であり、前記ホスホン酸系化合物が、ゾレドロン酸、エチドロン酸、イワンドロン酸、パミドロン酸、アレンドロン酸、リセドロン酸、ミノドロン酸のうちの１種又は複数種を含む。

１つ又はいくつかの実施形態では、前記ステップ２では、前記細胞懸濁液の細胞密度が３～４×１０^６個／ｍｌである。

１つ又はいくつかの実施形態では、前記ステップ２では、前記第１培地におけるホスホン酸系化合物の濃度が１～１０００μＭである。

前記第１培地及び前記第２培地は、インターロイキン－２の濃度が１～１０００ｎｇ／ｍｌであり、インターロイキン－１５の濃度が１～１０００ｎｇ／ｍｌであり、ビタミンＣ又はビタミンＣ誘導体の濃度が１０μＭ～８００ｍＭである。

１つ又はいくつかの実施形態では、前記細胞培養容器が、２４ウェルプレート、４８ウェルプレート又は９６ウェルプレートのものであり、前記ステップ３では、前記細胞懸濁液を細胞培養容器に播種して７２時間培養し、前記ステップ４の後の培養において、４８～７２時間毎に細胞に対して培地交換を行う。

本開示は、基礎培地と、前記基礎培地に添加したインターロイキン－２、インターロイキン－１５及びビタミンＣとが含まれた培地をさらに提供する。

１つ又はいくつかの実施形態では、前記基礎培地がＲＰＭＩ－１６４０培地である。

１つ又はいくつかの実施形態では、前記培地は、インターロイキン－２の濃度が１～１０００ｎｇ／ｍｌであり、インターロイキン－１５の濃度が１～１０００ｎｇ／ｍｌであり、ビタミンＣの濃度が１０μＭ～８００ｍＭである。

本開示は、第２培地とホスホン酸系化合物とを含む第１培地をさらに提供する。

１つ又はいくつかの実施形態では、前記第１培地は、ホスホン酸系化合物の濃度が１－１０００μＭである。

本開示は、下記の有益効果を有する。

（１）従来の増殖方法（第２種の増殖技術）と比べて、本開示に係る増殖方法によれば、ヒトＶγ９Ｖδ２Ｔ細胞の増殖効率がより高く、細胞の純度がより高く、（ステップ３から）１０～１２日培養した時点で、９０％の細胞純度を得ることができ、細胞増殖の比率が１０００倍以上（即ち、１０万個のヒトＶγ９Ｖδ２Ｔ細胞を少なくとも１億個のヒトＶγ９Ｖδ２Ｔ細胞まで増殖させることができる）に達し、ヒトＶγ９Ｖδ２Ｔ細胞の増殖培養周期を顕著に短縮させることができる。

（２）従来の増殖方法（第２種の増殖技術）で得たヒトＶγ９Ｖδ２Ｔ細胞と比べて、本開示により増殖して得たヒトＶγ９Ｖδ２Ｔ細胞は、腫瘍に対する殺傷及び抑制の能力がより高い。

（３）本開示により増殖して得たヒトＶγ９Ｖδ２Ｔ細胞は、抗アポトーシス能力がより高く、生存期間がより長く、そして、細胞増殖培養周期（ステップ３から１０～１２日）終了後、本開示により増殖して得たヒトＶγ９Ｖδ２Ｔ細胞がさらに約２０日生存できる。

本開示の実施例の技術案をより明瞭に説明するため、以下、実施例に用いられる図面を簡単に説明する。図面は、本開示のいくつの実施例を示すものにすぎないため、本開示の範囲を限定するものとみなすべきではない。
４種の異なる培地を用いてヒトＶγ９Ｖδ２Ｔ細胞を増殖培養した増殖効率の比較図である。４種の異なる培地を用いてヒトＶγ９Ｖδ２Ｔ細胞を増殖培養して得たヒトＶγ９Ｖδ２Ｔ細胞のうちのアポトーシス細胞の割合の比較図である。４種の異なる培地を用いてヒトＶγ９Ｖδ２Ｔ細胞を増殖培養して得たヒトＶγ９Ｖδ２Ｔ細胞の肝心な殺傷分子であるＮＫＧ２Ｄの発現レベルの比較図である。従来の増殖方法（ＩＬ２）で得たヒトＶγ９Ｖδ２Ｔ細胞を用いて肺がんの担がんヒト化マウスに対して細胞治療を行った後の腫瘍の大きさの模式図である。本開示に係る増殖方法（ＩＬ２＋ＩＬ１５＋ＶＣ）で得たヒトＶγ９Ｖδ２Ｔ細胞を用いて肺がんの担がんヒト化マウスに対して細胞治療を行った後の腫瘍の大きさの模式図である。未治療の肺がんの担がんヒト化マウスの腫瘍の大きさの模式図である。異なる治療による、肺がんの担がんヒト化マウスの腫瘍の体積変化の模式図である。異なる治療による、肺がんの担がんヒト化マウスの生存率の変化の模式図である。

［本明細書に記載の用語］
本明細書に使用する用語「基礎培地」は、哺乳類動物細胞の成長に栄養を供給する栄養素を含む溶液を意味する。基礎培地は、例えば亜鉛、鉄、マグネシウム、カルシウム、カリウムのような標準無機塩、ビタミン、ブドウ糖、緩衝系及び必須アミノ酸を提供する。例えば、基礎培地は、ＲＰＭＩ－１６４０培地、Ｄ－ＭＥＭ、ＭＥＭ、ＲＰＭＩ、Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ又はこれらの組み合わせである。

「・・・により調製される」と「包含」とは同意味である。本明細書に使用する用語「包含」、「含む」、「備える」、「有する」又は任意の他の変形は、非排他的な包含を網羅するように意図される。例えば、リストした要素を含む組成物、ステップ、方法、製品又は装置は、これらの要素に限定されず、明記されない他の要素又はこの組成物、ステップ、方法、製品又は装置の固有の要素を含んでもよい。

接続詞「・・・からなる」は、言及されない如何なる要素、ステップ又は成分を排除し、請求項に使用される場合、該当請求項が閉鎖式のものになり、関連する一般不純物を除き、説明した材料以外の材料を含まないようになる。用語「…からなる」は、主題につけるのではなく請求項の主体の文言に現れた場合、該文言に説明される要素だけを限定し、他の要素が該請求項全体から除外されない。

量、濃度、又は他の値やパラメータは、範囲、好ましい範囲、又は一連の好ましい上限値及び好ましい下限値で限定される範囲により表される場合、任意範囲の上限又は好ましい値と任意範囲の下限又は好ましい値とからなる範囲は、単独の開示があるかにも関わらず、上記の値を任意に組み合わせたすべての範囲が具体的に開示されたとみなすべきである。例えば、範囲「１～５」が開示された場合、説明する範囲が、範囲の「１～４」、「１～３」、「１～２」、「１～２と４～５」、「１～３と５」等を含むと解釈される。本明細書で説明される数値範囲は、特に断りがない限り、臨界値及び該範囲にある全ての整数と分数を含む。

「質量部」は、複数の成分の質量比例関係を示す基本的な計量単位である。１部とは、任意単位の質量を表すことが可能であり、例えば１ｇを表してもよく、２．６８９ｇ等を表してもよい。例えばＡ成分の質量部がａ部で、Ｂ成分の質量部がｂ部であるという場合、Ａ成分の質量とＢ成分の質量との比がａ：ｂであることを表す。又は、Ａ成分の質量がａＫであり、Ｂ成分の質量がｂＫ（Ｋは任意の数値であり、倍数因子を表す）であることを表す。要注意のは、質量分率と異なって、すべての成分の質量部の合計が１００部とは限らない。

「及び／又は」は、説明する内容のうちの１方又は両方とも発生可能であることを表し、例えば、Ａ及び／又はＢが（Ａ及びＢ）と（Ａ又はＢ）とを含む。

また、本開示における要素又は成分の前の用語「一」及び「１つの」は、要素又は成分の数（即ち出現回数）を制限するものではない。このため、「一」又は「１つの」は、１つ又は少なくとも１つを含むと解釈され、そして、言及する数が明確に単数に限定されない限り、単数形式の要素又は成分といっても複数形式のものも含む。

用語「ビタミンＣ誘導体」は、一般的にビタミンＣの２位の炭素原子に他の基を導入して還元型ビタミンＣを安定させるためのエンジオール構造を有する化合物である。ビタミンＣ誘導体の例として、例えばビタミンＣリン酸アスコルビルマグネシウム及びビタミンＣリン酸アスコルビルナトリウムのようなビタミンＣリン酸エステル、ビタミンＣパルミチン酸エステル、ビタミンＣエチル、例えばビタミンＣグルコシドのようなビタミンＣ糖類化合物等を含む。

「末梢血単核細胞」、「ＰＢＭＣｓ」又は「単核細胞」は、末梢血から分離した単核細胞といい、通常、抗がん免疫治療に利用される。例えば、フィコール－ハイパック密度勾配法（Ｆｉｃｏｌｌ－Ｈｙｐａｑｕｅｄｅｎｓｉｔｙｇｒａｄｉｅｎｔｍｅｔｈｏｄ）を利用すれば、収集されたヒト血液から末梢血単核細胞を獲得することができる。

「末梢血単核細胞」は、健常な人、疾患を患うリスクのある被験者又は患者から獲得することができる。ここで使用する末梢血単核細胞は、必ず自己由来のものを使用するとは限らなく、同種異体のものを使用してもよい。

用語「悪性疾患」は、本明細書で最も広義で使用され、細胞が異常に増殖する特徴を有する疾病である。副腎皮質がん、肛門がん、膀胱がん、上衣腫、神経芽細胞腫、乳癌、子宮頸がん、結腸がん、子宮内膜がん、食道がん、肝外胆管がん、眼腫瘍、胆嚢がん、胃がん、胚細胞腫瘍、性腺外腫瘍、頭頸部がん、下咽頭がん、膵島細胞がん、喉頭がん、白血病、急性リンパ性白血病、口腔がん、肝臓がん、肺がん等を含むが、これらに限定されない。

用語「自己免疫疾患」は、体の自己の組織に対する免疫応答に起因した疾病や病気を指し、長期間の炎症及びその後の組織破壊を引き起こす。自己免疫疾患の例として、円形脱毛症、１型糖尿病、ギラン・バレー症候群、多発性硬化症、関節リウマチ、硬皮症、多発性筋炎、白斑症及び全身性エリテマトーデスを含むが、これに限定されない。

用語「伝染性疾病」は、如何なる病原体に起因するものでも有り得る。その例として、例えばエイズ、Ｂ型肝炎及びＣ型肝炎のようなウイルス感染、細胞の感染、細菌感染、寄生虫及び真菌感染によるものを含むが、これに限定されない。

まず、本開示は、下記のステップを含むヒトＶγ９Ｖδ２Ｔ細胞増殖方法を提供する。

ステップ１は、ヒト末梢血から末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を分離する。
ステップ２は、第１培地を提供し、前記第１培地を用いて前記末梢血単核細胞を再懸濁させて、細胞懸濁液を得る。

前記第１培地は、第２培地とホスホン酸系化合物を含む。前記第２培地は、基礎培地と、前記基礎培地に添加されたインターロイキン－２（ＩＬ－２）、インターロイキン－１５（ＩＬ－１５）及びビタミンＣ（ＶｉｔａｍｉｎＣ）を含む。

ステップ３は、前記細胞懸濁液を細胞培養容器に播種して６０～１００時間培養する。

ステップ４は、前記第２培地を用いて培地交換を行い、その後の培養が前記第２培地を用いて行われる。

具体的に、前記ステップ１において、前記基礎培地は、ＲＰＭＩ－１６４０培地である。ＲＰＭＩは、ＲｏｓｗｅｌｌＰａｒｋＭｅｍｏｒｉａｌＩｎｓｔｉｔｕｔｅの略称であり、ロズウェルパーク記念研究所のことを指している。ここで、ＲＰＭＩは、該研究所が研究開発した一種類の細胞培地であり、１６４０は培地のコードネームである。該培地は、使用時に１０％のウシ胎児血清を加える。

任意選択で、前記ホスホン酸系化合物は、ゾレドロン酸（Ｚｏｌｅｄｒｏｎａｔｅ、ＺＯＬ）、エチドロン酸、イワンドロン酸、パミドロン酸、アレンドロン酸、リセドロン酸、ミノドロン酸のうちの１種又は複数種を含む。

本開示の一実施例では、前記ホスホン酸系化合物がゾレドロン酸である。

具体的に、前記ステップ２において、前記細胞懸濁液は、細胞密度が３～４×１０^６個／ｍｌである。

具体的に、前記ステップ２及びステップ３の目的として、ホスホン酸系化合物含有の第１培地を用いて前記末梢血単核細胞を培養することにより、前記末梢血単核細胞のうちのＶγ９Ｖδ２Ｔ細胞を選択的に増殖させるとともに、その他の細胞の増殖を抑制し、その他の細胞をアポトーシスに至らしめる。

任意選択で、前記細胞培養容器は、２４ウェルプレート、４８ウェルプレート又は９６ウェルプレートである。

前記ステップ４の目的として、前記ステップ３により選択的に増殖できた純度の高いＶγ９Ｖδ２Ｔ細胞をさらに増殖させて、Ｖγ９Ｖδ２Ｔ細胞数を増加させる。

具体的に、前記ステップ２において、前記第１培地では、ホスホン酸系化合物の濃度が１～１０００μＭである。

前記第１培地及び前記第２培地では、インターロイキン－２の濃度が１－１０００ｎｇ／ｍｌであり、インターロイキン－１５の濃度が１～１０００ｎｇ／ｍｌであり、ビタミンＣの濃度が１０μＭ～８００ｍＭである。

好ましくは、前記ステップ３において、前記細胞懸濁液を細胞培養容器に播種して７２時間培養する。

具体的に、前記ステップ４の後続の培養において、４８～７２時間毎に細胞に対して培地交換を行う。

具体的に、前記ステップ３とステップ４との培養合計時間を通常１０～１２日にし、この時点で細胞数が十分であるとともに殺傷能力が最も高く、細胞治療に特に適する。

本開示は、下記のステップを含むＴ細胞増殖方法を提供する。

ステップＡは、インターロイキン－２とホスホン酸系化合物を含有する第１培地を用いて、Ｔ細胞を含む組成物を培養して前記Ｔ細胞を刺激し、任意選択で、第１培地にインターロイキン－１５と、ビタミンＣ又はビタミンＣ誘導体とがさらに含まれる。

ステップＢは、インターロイキン－２と、インターロイキン－１５と、ビタミンＣ又はビタミンＣ誘導体とを含有する第２培地を用いて、刺激された前記Ｔ細胞を培養する。

本開示は、下記のステップを含むＶγ９Ｖδ２Ｔ細胞増殖方法を提供する。

ステップＡは、インターロイキン－２とホスホン酸系化合物を含有する培地を用いて、Ｔ細胞を含む組成物を培養して前記Ｔ細胞を刺激し、任意選択で、該培地にインターロイキン－１５と、ビタミンＣ又はビタミンＣ誘導体とがさらに含まれる。

ステップＢは、刺激した末梢血単核細胞からＶγ９Ｖδ２Ｔ細胞を選択分離する。

ステップＣは、インターロイキン－２と、インターロイキン－１５と、ビタミンＣ又はビタミンＣ誘導体とを含有する第２培地を用いて、選択分離したＶγ９Ｖδ２Ｔ細胞を培養する。

ステップＡは、末梢血から末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を分離する。

ステップＢは、Ｔ細胞を刺激可能な培地を用いて、Ｔ細胞を含む組成物を培養して前記Ｔ細胞を刺激する。

ステップＣは、刺激した末梢血単核細胞からＶγ９Ｖδ２Ｔ細胞を選択分離する。

ステップＤは、インターロイキン－２と、インターロイキン－１５と、ビタミンＣ又はビタミンＣ誘導体とを含有する第２培地を用いて、選択分離したＶγ９Ｖδ２Ｔ細胞を培養する。

本開示は、下記のステップを含む、伝染性疾病、自己免疫疾患又は悪性疾患を抑制、予防又は治療する方法を提供する。
（１）第１被験者の末梢血から末梢血単核細胞を分離する。
（２）インターロイキン－２とホスホン酸系化合物を含有する培地を用いて末梢血単核細胞を培養してＶγ９Ｖδ２Ｔ細胞を刺激し、任意選択で、該培地にインターロイキン－１５と、ビタミンＣ又はビタミンＣ誘導体とがさらに含まれる。
（３）インターロイキン－２と、インターロイキン－１５と、ビタミンＣ又はビタミンＣ誘導体とを含有する第２培地を用いて、刺激したＶγ９Ｖδ２Ｔ細胞を培養する。
（４）第２被験者に培養できた細胞を投与する。

好ましくは、第１被験者と第２被験者とは同一被験者である。任意選択で、第１被験者と第２被験者とは異なる被験者である。

なお、前記末梢血単核細胞は、前記Ｔ細胞を含む組成物であり、好ましくは、前記悪性疾患は、例えば肺がんのようながんである。

本開示に係るヒトＶγ９Ｖδ２Ｔ細胞増殖方法に、具体的な条件が明記されていない操作方法は、従来の条件（例えば『精編分子生物学試験指南』（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ、Ｒ．Ｅ．Ｋｉｎｇｓｔｏｎ、ｊ．Ｇ．Ｓｅｄｍａｎら／主編、馬学軍舒躍龍／訳、北京：科学出版社、２００４））での方法により行われる。

本開示における肝心な技術的特徴は、細胞培養におけるインターロイキン－１５及びビタミンＣの使用である。従来の増殖方法（第２種の増殖技術）と比べて、ヒトＶγ９Ｖδ２Ｔ細胞の増殖培養過程にインターロイキン－１５及びビタミンＣを添加することにより、ヒトＶγ９Ｖδ２Ｔ細胞の増殖効率及び細胞の純度を高めることができ、培養できたヒトＶγ９Ｖδ２Ｔ細胞は、抗アポトーシス能力がより高く、細胞の生存期間がより長く、そして、肝心な殺傷分子であるＮＫＧ２Ｄの発現レベルがより高くて、腫瘍細胞に対する殺傷能力がより高い。従来の第２種の増殖技術（背景技術の内容を参照）に対して、本開示によれば、例えば増殖効率及び純度が低い課題、得られた細胞の殺傷能力が強くない課題、及び得られた細胞の、生存期間が不十分で、老化やアポトーシスになりがち等の技術課題を解決できる。

上記のように、本開示に係るヒトＶγ９Ｖδ２Ｔ細胞増殖方法は、下記の有益な効果を有する。
（１）従来の増殖方法（第２種の増殖技術）と比べて、本開示に係る増殖方法によれば、ヒトＶγ９Ｖδ２Ｔ細胞の増殖効率がより高く、細胞の純度がより高く、（ステップ３から）１０－１２日培養した時点で、９０％の細胞純度を得ることができ、細胞増殖の比率が１０００倍以上（即ち、１０万個のヒトＶγ９Ｖδ２Ｔ細胞を少なくとも１億個のヒトＶγ９Ｖδ２Ｔ細胞まで増殖させることができる）に達し、ヒトＶγ９Ｖδ２Ｔ細胞の増殖培養周期を顕著に短縮させることができる。
（２）従来の増殖方法（第２種の増殖技術）で得たヒトＶγ９Ｖδ２Ｔ細胞と比べて、本開示により増殖して得たヒトＶγ９Ｖδ２Ｔ細胞は、腫瘍に対する殺傷及び抑制の能力がより高い。
（３）本開示により増殖して得たヒトＶγ９Ｖδ２Ｔ細胞は、抗アポトーシス能力がより高く、生存期間がより長く、そして、細胞増殖培養周期（ステップ３から１０～１２日）終了後、本開示により増殖して得たヒトＶγ９Ｖδ２Ｔ細胞がさらに約２０日生存できる。

上記のヒトＶγ９Ｖδ２Ｔ細胞増殖方法に基づいて、本開示は、基礎培地と、前記基礎培地に添加されたインターロイキン－２、インターロイキン－１５及びビタミンＣとが含まれたヒトＶγ９Ｖδ２Ｔ細胞培地（本明細書では第２培地ともいう）をさらに提供する。

１つ又は複数の実施形態では、前記基礎培地は、ＲＰＭＩ－１６４０培地である。

１つ又は複数の実施形態では、第１培地及び第２培地において、インターロイキン－２の濃度が１～１０００ｎｇ／ｍｌ、１～５００ｎｇ／ｍｌ、１～２００ｎｇ／ｍｌ、又は７０～１３０ｎｇ／ｍｌである。１つ又は複数の実施形態では、第２培地において、インターロイキン－１５の濃度が１～１０００ｎｇ／ｍｌ、１～５００ｎｇ／ｍｌ、１～２００ｎｇ／ｍｌ、又は７０～１３０ｎｇ／ｍｌである。１つ又は複数の実施形態では、第２培地において、ビタミンＣの濃度が１０μＭ～８００ｍＭ、２０μＭ～４００ｍＭ、又は５０μＭ－１００μＭである。

本開示は、例えば上記の第２培地及びホスホン酸系化合物が含まれたヒトＶγ９Ｖδ２Ｔ細胞刺激増殖培地（本明細書では第１培地ともいう）をさらに提供する。

任意選択で、前記第１培地において、ホスホン酸系化合物の濃度が１～１０００μＭである。

試験試薬と材料
試験に使用する主な試薬と材料は、表１に示すようになる。

実施例１：Ｖγ９Ｖδ２Ｔ細胞の増殖効果及び増殖できたＶγ９Ｖδ２Ｔ細胞の特性
末梢血中単核細胞の分離
（１）４ｍＬヒトリンパ球分離溶液を１５ｍＬコニカル遠心チューブに入れ、１×ＰＢＳ緩衝液を用いて等比例で末梢血を希釈し、均一に混合したあと、希釈した末梢血１０ｍＬを試験管壁に沿ってリンパ球分離溶液の表面に緩慢に展開させ、２５℃、６００ｇで２５分間遠心した。

（２）滅菌パスツールピペットにより中部の白色で綿毛状の細胞層をもう１つの滅菌ピペットに吸い取り、同体積のＰＢＳを加えて均一に混合したあと、１５００ｒｐｍで１０分間遠心した。

（３）上清を除去して、５～１０ｍＬの赤血球溶解バッファーを加えて細胞を再懸濁させ、常温で３～７分間溶解させる。５倍体積のＰＢＳを加えて溶解を終了させた。４０μｍの篩により濾過したあと、１５００ｒｐｍで１０分間遠心した。

（４）上清を除去して、１０ｍＬ無血清ＲＰＭＩ１６４０培地を加えて細胞を再懸濁させ、１５００ｒｐｍで１０分間遠心した。

（５）上清を除去して、ＲＰＭＩ１６４０完全培地（１０％のウシ胎児血清含有）を用いて試験管の底に沈殿した細胞を２ｍＬまで希釈させ、ゆっくりと均一に混合したあと、５μＬの細胞希釈液を吸い取って希釈し、適当な倍数まで希釈したあと、血球計算盤でカウントした。

Ｖγ９Ｖδ２Ｔ細胞の体外増殖
Ｆｉｃｏｌｌ分離溶液を用いて新鮮な血液の中のＰＢＭＣを分離して、１０％のＦＢＳ含有のＲＰＭＩ－１６４０完全培地により細胞密度を３～４×１０^６個／ｍＬに調整して２４ウェルプレートに播種し、４０ｎｇ／ｍＬのＩＬ－２と５０μＭのゾレドロン酸を加えて３日刺激した。その後、ゾレドロン酸を除去し、２～３日毎に培地を交換、継代し、濃度で１００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１５、１００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２、７０μＭのビタミンＣである細胞因子含有のＲＰＭＩ－１６４０培地を用いて、３７℃、５％のＣＯ_２、ＰＨ＝７．２－７．４、９５％の湿度の条件下、培養器で１０～１４日培養した。

Ｖγ９Ｖδ２Ｔ細胞の純度及び表現型の同定
１０日～１４日体外増殖したＶγ９Ｖδ２Ｔ細胞を集め、１．５ｍＬのＥＰ管内に入れ、小型遠心機（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ５４２４）を利用して３５００ｒｐｍで５分間遠心し、上清を除去して、４℃の予冷されたＰＢＳで２回洗浄した。細胞をコントロール、アイソタイプコントロール、試験群によって相応の試験管に入れ、各管に約５×１０^５個の細胞を入れた。コントールチューブと検出チューブは、抗体マニュアルに基づいて蛍光抗体染色液を調製した。蛍光抗体染色液は、抗ヒトＣＤ３－Ｖ５００、抗ヒトＴＣＲ－δ２－ＰＥ、抗ヒトＣＤ４５－ＰＥ－ｃｙ５、抗ヒトＣＤ２７－ＰＢ、ＮＫＧ２Ｄ－ＰＥ－ｃｙ７を含む。調製できた蛍光抗体染色液を用いて細胞を再懸濁させて、４℃の冷蔵庫又は氷に置いて、遮光で１５－２０分染色し、ＰＢＳで２回洗浄し、３５００ｒｐｍで５分間遠心し、上清を除去して、２００～３００μＬのＰＢＳを用いて再懸濁させ、フローサイトメーターによりＶγ９Ｖδ２Ｔ細胞の純度及び表型を測定した。

Ｖγ９Ｖδ２Ｔ細胞ｋｉ６７測定
１）收集７～１０×１０^５個の体外増殖した１０～１４日時点のＶγ９Ｖδ２Ｔ細胞を集め、１．５ｍＬのＥＰ管内に入れ、小型遠心機（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ５４２４）を利用して３５００ｒｐｍで５分間遠心し、上清を除去して、４℃の予冷されたＰＢＳで２回洗浄した。

２）１００μＬのＰＢＳを用いて沈殿細胞を再懸濁させ、表面染色したフローサイトメトリー用抗体のＣＤ３－ＦＩＴＣ、ＴＣＲ－δ２－ＰＥ、（１：２００希釈）を加え、コントールチューブに同色、同濃度のアイソタイプコントロール抗体を入れ、４℃、遮光で１５分間培養した。

３）染色終了後、ＰＢＳで２回洗浄し、３５００ｒｐｍで５分間遠心した。

４）Ｆｏｘｐ３ＳｔａｉｎｉｎｇＢｕｆｆｅｒＳｅｔで核内ｋｉ６７の発現レベルを測定した。Ｆｉｘａｔｉｏｎ＆ＰｅｒｍｅａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎＢｕｆｆｅｒを調製し、Ｆ＆ＰＣｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎとＦ＆ＰＤｉｌｕｅｎｔとを体積比１：３で均一に混合し、Ｆ＆ＰＢｕｆｆｅｒ５００μＬを用いて細胞を再懸濁させ、４℃の冷蔵庫又は氷に置いて、遮光で０．５～１８時間静置し、細胞に対して固定及び透過を行った。

５）１０×ＰｅｒｍｅａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎＢｕｆｆｅｒをｄｄＨ_２Ｏで１×のものに希釈した。固定完了後、１ｍＬの１×ＰｅｒｍｅａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎＢｕｆｆｅｒを加え、５５００ｒｐｍ、４℃で５分間遠心した。そして、２回洗浄した。

６）ＡＰＣ－Ｋｉ６７蛍光抗体を体積比１：２００で、１×ＰｅｒｍＢｕｆｆｅｒに希釈させ、均一に混合した。沈殿細胞を染色液で再懸濁させ、４℃の冷蔵庫又は氷に置いて、遮光で３０分間染色した。

７）１×ＰｅｒｍＢｕｆｆｅｒ溶液を加え、５５００ｒｐｍ、４℃で５分間遠心し、１×ＰｅｒｍＢｕｆｆｅｒ溶液で再懸濁させてさらに遠心して、未結合の蛍光抗体を洗浄した。２００～３００μＬのＰＢＳで細胞を再懸濁させ、体積を調製し、フローサイトメーターによりＫｉ６７の発現レベルを分析した。

図１は、まずゾレドロン酸含有の培地を用いて刺激し、そして４種の異なる細胞培地を用いてヒトＶγ９Ｖδ２Ｔ細胞を増殖培養した増殖効率の比較図である。

図１では、ＩＬ２が、増殖培養全過程に亘って、基礎培地をもとにＩＬ２を添加して得た培地を使用することを表している。

ＩＬ２＋ＶＣは、増殖培養全過程に亘って、基礎培地をもとにＩＬ２＋ＶＣを添加して得た培地を使用することを表している。

ＩＬ２＋ＩＬ１５は、増殖培養全過程に亘って、基礎培地をもとにＩＬ２＋ＩＬ１５を添加して得た培地を使用することを表している。

ＩＬ２＋ＩＬ１５＋ＶＣは、増殖培養全過程に亘って、基礎培地をもとにＩＬ２＋ＩＬ１５＋ＶＣを添加して得た培地を使用することを表している。

初期の刺激増殖段階で、上記の４種の培地の案は、いずれもＺＯＬ（ゾレドロン酸）とＩＬ＋２を添加した基礎培地を用いて細胞を刺激し、そして、図１における各培地成分の量が、本実施例における「Ｖγ９Ｖδ２Ｔ細胞の体外増殖」部分に記載した濃度であった。

図１に示すように、上記の４種の培地のそれぞれを用いてヒトＶγ９Ｖδ２Ｔ細胞を増殖培養して得たデータにより、ＩＬ１５の未添加の培地（ＩＬ２与ＩＬ２＋ＶＣ）による細胞増殖効率が比較的に低いことに対して、ＩＬ１５を添加した培地（ＩＬ２＋ＩＬ１５及びＩＬ２＋ＩＬ１５＋ＶＣ）による細胞増殖効率が比較的に高いことが示される。これによって、ＩＬ－１５の添加により、ヒトＶγ９Ｖδ２Ｔ細胞の増殖効率（Ｋｉ６７タンパク質の発現レベルの上昇）を顕著に向上させることができることがわかった。

図２は、４種の異なる培地を用いてヒトＶγ９Ｖδ２Ｔ細胞を増殖培養して得たヒトＶγ９Ｖδ２Ｔ細胞のうちのアポトーシス細胞の割合の比較図であり、図２におけるＩＬ２、ＩＬ２＋ＶＣ、ＩＬ２＋ＩＬ１５、ＩＬ２＋ＩＬ１５＋ＶＣが表すことについて、図１と同様である。

図２から分かるように、培地にＶＣを添加することにより細胞のアポトーシス比率及びアポトーシス速度を顕著に低減でき、そして、ＩＬ－１５とＶＣとの併用により細胞の抗アポトーシス能力をより顕著に高めることができる。

図３は、４種の異なる培地を用いてヒトＶγ９Ｖδ２Ｔ細胞を増殖培養して得たヒトＶγ９Ｖδ２Ｔ細胞の肝心な殺傷分子であるＮＫＧ２Ｄの発現レベルの比較図であり、図３におけるＩＬ２、ＩＬ２＋ＶＣ、ＩＬ２＋ＩＬ１５、ＩＬ２＋ＩＬ１５＋ＶＣが表すことについて、図１、図２と同様である。

図３から分かるように、ＩＬ－１５とビタミンＣとの併用することにより、ヒトＶγ９Ｖδ２Ｔ細胞の肝心な殺傷分子であるＮＫＧ２Ｄの高レベルの発現を継続に維持できるとともに、２１日培養した時点及びそのあとでも高レベルの発現に維持されている。つまり、ＩＬ－１５とＶＣとを併用する調製法（即ち本開示に係る技術案）により、ヒトＶγ９Ｖδ２Ｔ細胞の高い殺傷能力をより長い期間で維持することができる。

実施例２：増殖したＶγ９Ｖδ２Ｔ細胞の抗腫瘍効果
ヒト化マウス肺がんモデルの構築及び実験方法
１．実験動物
３～４週齡のＲａｇ２^－／－γｃ^－／－雌マウスは、Ｔａｃｏｎｉｃ社から購入したＳＰＦ級マウスであった。免疫不全マウスは、独立で通風のＩＶＣかごを使用する。各かごに、それぞれ５匹のマウスを飼う。各ｉｓｏｌａｔｏｒは、個別に換気を行うＨＥＰＡを有し、且つ２４時間の温湿度制御を行う。飼料、床敷材は、真空包装され、γ－放射線滅菌が行われて供給されるものである。さらに、動物飲用水として滅菌水を用い、該環境下で飼われる動物の包装も滅菌環境下で行われる。さらに、生物安全を確保できる運送箱により動物を運送する。これによって、飼養及び運送が同様な微生物状態に維持されることを確保し、動物の質を確保、維持する。なお、動物実験は、実験動物倫理委員会の承認を得た。

２．腫瘍の動物モデルの構築方法
Ｆｉｃｏｌｌ液密度勾配遠心法によりＰＢＭＣ（ｈｕＰＢＭＣ）を分離してヒト化マウスモデル（ｈｕＰＢＭＣｓｈｕｍａｎｉｚｅｄｍｉｃｅ）を構築した。その後の測定時に、再注入に利用されるγδＴ細胞とヒト化マウス自身のγδＴ細胞とを容易に区別するため、ヒト化マウスの構築に関わるＰＢＭＣのＨＬＡｔｙｐｅは、再注入に利用されるγδＴ細胞と異なって、通常ＨＬＡ－Ａ２＋／－にする。

そして、４～６週齡の健常のＲａｇ２^－／－γｃ^－／－マウスを選択し、亜致死量３００ｃＧｙの輻射処理を行って、腹腔内注射により３０×１０^６個のｈｕＰＢＭＣｓを注射した。４週間後、生存しているヒト化マウスは、これからの肺がんモデルの構築に利用できる。単層培養できたＡ５４９細胞を消化したあと、リン酸塩緩衝液（ＰｈｏｓｐｈａｔｅＢｕｆｆｅｒｅｄＳａｌｉｎｅ、ＰＢＳ）を用いてＡ５４９細胞の濃度を１×１０^７ｃｅｌｌｓ／ｍＬに調整するように細胞懸濁液を調製した。調製できた細胞懸濁液を、そけい部皮下注射の方式でヒト化マウスに接種し、投与量が１００μＬ／匹マウスであった。

３．増殖して得たＶγ９Ｖδ２Ｔ細胞を利用して動物モデルを処理する
１）５～７日腫瘍形成後、３日毎にマウス尾静脈より肺がんの担がんヒト化マウスモデルに５×１０^６個の、それぞれＩＬ－２、ＩＬ－２＋Ｖｃ、ＩＬ－２＋ＩＬ－１５、ＩＬ－２＋ＩＬ－１５＋Ｖｃを用いて培養できたγδＴ細胞を注射し、各群に５匹マウスあり、投与量が１００μＬ／匹マウスであった。ＰＢＳ注射群を治療の対照群とする。それぞれＩＬ－２、ＩＬ－２＋Ｖｃ、ＩＬ－２＋ＩＬ－１５、ＩＬ－２＋ＩＬ－１５＋Ｖｃを用いて培養できたγδＴ細胞は、実施例１における「Ｖγ９Ｖδ２Ｔ細胞の体外増殖」部分に記載した方法及びステップにより獲得するものであり、ＩＬ２、ＩＬ２＋ＶＣ、ＩＬ２＋ＩＬ１５、ＩＬ２＋ＩＬ１５＋Ｖｃが表すことが実施例１に用いられる図１における意味と同意味である。

２）３～４回治療後、６０日以上観察した。ノギスでマウスの腫瘍の短径（Ａ）及び長径（Ｂ）を毎週２回測定し、式のＶ＝１／２×Ａ^２×Ｂに基づいて腫瘍の体積を計算した。

３）再注入が終了するときに、末梢血を採取してマウス体内のγδＴ細胞の割合及び細胞活性を測定し、再注入が終了後、２週間毎に末梢血を採取してγδＴ細胞の割合、及びＮＫＧ２Ｄ、ＰＤ１、ＣＤ１０７ａ、Ｆａｓ、ＦａｓＬの細胞活性を測定した。

４）マウスを殺す前、マウス体内のγδＴ細胞の定着状況を測定した。また、ＧＦＰ信号を測定し、末梢血におけるＡ５４９腫瘍細胞の数及び割合を観察した。

４．実験結果
腫瘍治療実験の結果は、図４Ａ、図４Ｂ、図４Ｃ、図５及び図６に示すようになる。

図４Ａは、従来の増殖方法（ＩＬ２）で得たヒトＶγ９Ｖδ２Ｔ細胞を用いて肺がんの担がんヒト化マウスに対して細胞治療を行った後の腫瘍の大きさの模式図である。

前記従来の増殖方法（即ち第２種の増殖技術）は、基礎培地に常にＩＬ２を加えて培養し、培養の初期段階にＺＯＬを添加して刺激増殖を行う方法である。

図４Ｂは、本開示に係る増殖方法（ＩＬ２＋ＩＬ１５＋ＶＣ）で得たヒトＶγ９Ｖδ２Ｔ細胞を用いて肺がんの担がんヒト化マウスに対して細胞治療を行った後の腫瘍の大きさの模式図である。

図４Ｃは、未治療の肺がんの担がんヒト化マウスの腫瘍の大きさの模式図である。

図４Ａ、図４Ｂ、図４Ｃに関わる実験に使用された肺がんの担がんヒト化マウスは、同一の腫瘍タイプで、腫瘍の体積が基本的に同じであるマウスであり、そして、図４Ａ、図４Ｂ、図４Ｃに示される腫瘍の成長時間が同じである。

図４Ａと、図４Ｂと、図４Ｃとの比較により分かるように、本開示に係る増殖方法で得たヒトＶγ９Ｖδ２Ｔ細胞を用いて肺がんの担がんヒト化マウスに対して細胞治療を行った後、従来の増殖方法で得たヒトＶγ９Ｖδ２Ｔ細胞と比べて、本開示により増殖して得たヒトＶγ９Ｖδ２Ｔ細胞は、肺がん細胞の成長をより効果的に抑えることができ（腫瘍の体積が顕著に縮小した）、肺がんの担がんヒト化マウスの生存率を顕著に高めることができると証明できた。４２日目、従来の増殖方法で得たヒトＶγ９Ｖδ２Ｔ細胞を用いて細胞治療を行った肺がんの担がんヒト化マウス及び未治療の肺がんの担がんヒト化マウスが全部死亡したことに対して、本開示に係る増殖方法で得たヒトＶγ９Ｖδ２Ｔ細胞を用いて細胞治療を行った肺がんの担がんヒト化マウスが全部生存しており、生存率が１００％となり、そしてそのうちの一匹のマウスの腫瘍が完全に消失した（図４Ｂにおける枠に示すこと）。

図５は、異なる治療による、肺がんの担がんヒト化マウスの腫瘍の体積変化の模式図であり、従来の増殖方法（ＩＬ２）で得たヒトＶγ９Ｖδ２Ｔ細胞を用いる肺がんの担がんヒト化マウスに対する細胞治療を行った肺がんの担がんヒト化マウス、本開示に係る増殖方法（ＩＬ２＋ＩＬ１５＋ＶＣ）で得たヒトＶγ９Ｖδ２Ｔ細胞を用いる肺がんの担がんヒト化マウスに対する細胞治療を行った肺がんの担がんヒト化マウス、及び未治療の肺がんの担がんヒト化マウスのそれぞれの腫瘍の体積変化状況を示している。

これによって分かるように、時間が経つにつれて、従来の増殖方法（ＩＬ２）で得たヒトＶγ９Ｖδ２Ｔ細胞を用いて治療した肺がんの担がんヒト化マウス及び未治療の肺がんの担がんヒト化マウスの腫瘍の体積が増大し続けるとともに後期の腫瘍の体積増大速度が非常に速いことに対して、本開示に係る増殖方法（ＩＬ２＋ＩＬ１５＋ＶＣ）で得たヒトＶγ９Ｖδ２Ｔ細胞を用いて治療した肺がんの担がんヒト化マウスの腫瘍の体積増加速度が非常にゆっくりとあった。つまり、従来の増殖方法（ＩＬ２）で得たヒトＶγ９Ｖδ２Ｔ細胞と比べて、本開示に係る増殖方法（ＩＬ２＋ＩＬ１５＋ＶＣ）で得たヒトＶγ９Ｖδ２Ｔ細胞は、腫瘍の体内成長に対してより強い抑制効果を有し、腫瘍の体積をより小さくすることができる。

図６は、異なる治療による、肺がんの担がんヒト化マウスの生存率の変化の模式図であり、従来の増殖方法（ＩＬ２）で得たヒトＶγ９Ｖδ２Ｔ細胞を用いる肺がんの担がんヒト化マウスに対する細胞治療を行った肺がんの担がんヒト化マウス、本開示に係る増殖方法（ＩＬ２＋ＩＬ１５＋ＶＣ）で得たヒトＶγ９Ｖδ２Ｔ細胞を用いる肺がんの担がんヒト化マウスに対する細胞治療を行った肺がんの担がんヒト化マウス、及び未治療の肺がんの担がんヒト化マウスのそれぞれの生存率の変化状況を示している。

これによって分かるように、時間が経つにつれて、従来の増殖方法（ＩＬ２）で得たヒトＶγ９Ｖδ２Ｔ細胞を用いて治療した肺がんの担がんヒト化マウス及び未治療の肺がんの担がんヒト化マウスの生存率の低下が非常に速いことに対して、本開示に係る増殖方法（ＩＬ２＋ＩＬ１５＋ＶＣ）で得たヒトＶγ９Ｖδ２Ｔ細胞を用いて治療した肺がんの担がんヒト化マウスの生存率が常に１００％であった。つまり、本開示に係る増殖方法（ＩＬ２＋ＩＬ１５＋ＶＣ）で得たヒトＶγ９Ｖδ２Ｔ細胞は、肺がんの担がんヒト化マウスの生存率を顕著に高めることができる。

実施例３
該実施例３は、ＲＰＭＩ－１６４０培地と、前記ＲＰＭＩ－１６４０培地に添加されたインターロイキン－２、インターロイキン－１５及びビタミンＣとが含まれた第２培地を提供する。

前記第２培地は、インターロイキン－２の濃度が３００ｎｇ／ｍｌであり、インターロイキン－１５の濃度が５００ｎｇ／ｍｌであり、ビタミンＣの濃度が１００ｍＭである。

実施例４
該実施例４は、ＲＰＭＩ－１６４０培地と、前記ＲＰＭＩ－１６４０培地に添加されたインターロイキン－２、インターロイキン－１５及びビタミンＣとが含まれた第２培地を提供する。

前記第２培地は、インターロイキン－２の濃度が５００ｎｇ／ｍｌであり、インターロイキン－１５の濃度が７００ｎｇ／ｍｌであり、ビタミンＣの濃度が３００ｍＭである。

実施例５
該実施例５は、実施例３に記載された第２培地と、ゾレドロン酸とが含まれた第１培地を提供する。

前記第１培地は、ゾレドロン酸の濃度が３００μＭである。

実施例６
該実施例６は、実施例４に記載された第２培地と、ゾレドロン酸とが含まれた第１培地を提供する。

前記第１培地は、ゾレドロン酸の濃度が５００μＭである。

本開示に関わる各プロセスのパラメータの数値範囲は、上記の実施例で全てをリストすることが不可能であるが、当業者であれば上記の数値範囲内の任意の数値で本開示を実施することが可能であると想到できるので、数値範囲内の具体的な値の任意の組み合わせをいくつか含むことが明らかである。ここで、文章の長さを考慮して、１つ又は複数の数値範囲内の具体的な値の実施例を省略したが、本開示の技術案が十分に開示されなかったとみなすべきではない。

本開示は、上記の実施例により本開示に係る設備及びプロセスの詳細を説明したが、上記の設備及びプロセスの詳細に限定されなく、即ち、上記の設備及びプロセスの詳細に基づいて実施しかできないと意味しない。当業者にとって、本開示に対する如何なる改良、本開示に係る製品の各原料に対する均等置換や補助成分の添加、具体的な方式の選択等は、本開示の保護範囲内に属する。

従来の増殖方法（第２種の増殖技術）と比べて、本開示に係る増殖方法によるヒトＶγ９Ｖδ２Ｔ細胞の増殖効率及び細胞の純度がより高く、本開示に係る増殖方法によれば、ヒトＶγ９Ｖδ２Ｔ細胞の増殖培養周期を顕著に短縮することができる。従来の増殖方法（第２種の増殖技術）で得たヒトＶγ９Ｖδ２Ｔ細胞と比べて、本開示により増殖して得たヒトＶγ９Ｖδ２Ｔ細胞は、腫瘍に対する殺傷能力及び抑制能力がより高い。本開示により増殖して得たヒトＶγ９Ｖδ２Ｔ細胞は、抗アポトーシス能力がより高く、生存期間がより長い。

Claims

Ｖγ９Ｖδ２Ｔ細胞を刺激可能な、インターロイキン－２とゾレドロン酸とが含まれる第１培地を用いてＶγ９Ｖδ２Ｔ細胞を含む組成物を培養して前記Ｖγ９Ｖδ２Ｔ細胞を刺激するステップＡと、
インターロイキン－２と、インターロイキン－１５と、ビタミンＣ又はビタミンＣ誘導体とが含まれる第２培地を用いて、刺激された前記Ｖγ９Ｖδ２Ｔ細胞を培養するステップＢと、を含むＶγ９Ｖδ２Ｔ細胞増殖方法。
前記第１培地に、インターロイキン－１５と、ビタミンＣ又はビタミンＣ誘導体とがさらに含まれる、請求項１に記載の方法。
前記ビタミンＣ誘導体は、ビタミンＣエチル、ビタミンＣパルミチン酸エステル、ビタミンＣグルコシド、ビタミンＣリン酸アスコルビルマグネシウム、ビタミンＣリン酸アスコルビルナトリウム及びこれらの組み合わせからなる群から選択するものである、請求項１又は２に記載の方法。
前記第２培地は、インターロイキン－１５の濃度が１～１０００ｎｇ／ｍｌである、請求項１～３のいずれか１項に記載の方法。
前記第２培地は、ビタミンＣ又はビタミンＣ誘導体の濃度が１０μＭ～８００ｍＭである、請求項１～４のいずれか１項に記載の方法。
前記第２培地は、インターロイキン－２の濃度が１～１０００ｎｇ／ｍｌである、請求項１～５のいずれか１項に記載の方法。
前記Ｖγ９Ｖδ２Ｔ細胞を含む組成物は、ヒト末梢血から分離した末梢血単核細胞を含む、請求項１～６のいずれか１項に記載の方法。
ステップＡにおける前記培養の時間は、６０～１００時間である、請求項１～７のいずれか１項に記載の方法。
前記第２培地は、ＲＰＭＩ－１６４０培地、Ｄ－ＭＥＭ、ＭＥＭ、ＲＰＭＩ、Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ及びこれらの組み合わせからなる群から選択した基礎培地を含む、請求項１～８のいずれか１項に記載の方法。
前記第２培地は、ＲＰＭＩ－１６４０培地を含む、請求項９に記載の方法。
基礎培地と、
インターロイキン－２とゾレドロン酸とが含まれる第１培地と、
インターロイキン－２と、インターロイキン－１５と、ビタミンＣ又はビタミンＣ誘導体とが含まれる第２培地と、を含むＶγ９Ｖδ２Ｔ細胞増殖のための培地。
前記第２培地は、インターロイキン－２の濃度が１～１０００ｎｇ／ｍｌであり、インターロイキン－１５の濃度が１～１０００ｎｇ／ｍｌであり、ビタミンＣ又はビタミンＣ誘導体の濃度が１０μＭ～８００ｍＭである、請求項１１に記載の培地。