CN115161280B - 一种γδT细胞培养液及γδT细胞扩增培养方法 - Google Patents

一种γδT细胞培养液及γδT细胞扩增培养方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种γδT细胞培养液及γδT细胞扩增培养方法；该培养液包括RPMI1640培养基，在该培养基中添加浓度为1~100μM/ml的唑来膦酸、浓度为100~2000U/ml的IL‑2、浓度为100~1000μM的维生素C以及浓度为0.1~5uM的咪喹莫特。培养液中的咪喹莫特能诱导体内包括INF‑α在内的细胞因子而产生抗病毒活性；同时咪喹莫特能抑制αβT细胞，促进γδT的IL17A分泌，由此增强T细胞的肿瘤杀伤活性。

Description

一种γδT细胞培养液及γδT细胞扩增培养方法
技术领域
本发明涉及免疫细胞的体外培养技术，尤其涉及一种γδT细胞培养液及γδT细胞扩增培养方法。
背景技术
人外周血中，T淋巴细胞占淋巴细胞总数的65％~75％，具有极其重要的机体免疫防御功能，T淋巴细胞分为TCRαβT细胞（简称αβT细胞）和TCRγδT细胞（简称γδT细胞）。γδT细胞是机体内执行固有免疫功能的T细胞，其TCR（T Cell Receptor)由γ和δ链组成，γδT细胞具有无主要组织相容性复合物(Major histocompatibility complex，MHC)限制性的方式直接识别并结合抗原分子，并通过IFN-γ分泌、穿孔素-颗粒酶、TNF相关凋亡诱导配体受体以及Fas/FasL等途径杀伤肿瘤细胞及病毒感染细胞。γδT细胞分泌的IFN-γ等细胞因子可以活化其他免疫细胞，因而具有极其重要的免疫功能。γδT细胞表面能表达TCRγδ和NKG2D受体，正是这两个受体发挥着肿瘤细胞的杀伤作用。γδT细胞在机体抵御肿瘤或感染时快速被TCRγδ和NKG2D活化，活化后的γδT细胞即可发挥其对抗肿瘤的杀伤作用或抗感染作用。γδT细胞对黏膜方面的癌症治疗效果显著，如呼吸道、消化道、生殖系统方面的癌症效果突出。γδT细胞由于在杀伤肿瘤细胞时是无MHC限制性的，γδT细胞对自体、异体的多种肿瘤细胞均表现出显著的杀伤活性，因此γδT细胞在肿瘤过继免疫治疗的候选细胞中备受关注。
由于γδT细胞约占成人外周血T淋巴细胞总数的0.5~5％，要获得大量纯度高活性好的γδT细胞非常困难，目前，市面上仍然没有高效经济的γδT细胞扩增方案，从而限制了其临床应用。虽然已有技术采用非肽膦酸类抗原或抗TCRγδ抗体获得大量γδT细胞，但费用相对昂贵或对肿瘤细胞的杀伤活性不佳而未得到广泛应用。
发明内容
基于上述问题，本发明所要解决的问题在于提供一种简单经济高效，杀伤活性好的γδT细胞培养液及γδT细胞培扩增培养方法，可为γδT细胞生物学特性的研究和临床的肿瘤过继性免疫治疗等提供细胞来源。
本发明的技术方案之一如下：
一种γδT细胞培养液，包括RPMI1640无血清培养基，在该培养基中添加浓度为1~100μM/ml的唑来膦酸、浓度为100~2000U/ml的IL-2、浓度为100~1000μM的维生素C（以下简称Vc）以及浓度为0.1~5uM的咪喹莫特。
一实施例，所述γδT细胞培养液中，所述培养基中添加浓度为65μM/ml的唑来膦酸、浓度为1150U/ml的IL-2、浓度为600μM的维生素C以及浓度为2.5uM的咪喹莫特。
一实施例，所述γδT细胞培养液中，所述培养基中还添加浓度为1~10 v/v％的自体血清；优选，浓度为6v/v％的自体血清。
本发明的技术方案之二如下：
一种γδT细胞的扩增培养方法；包括如下步骤：
第0天，从外周血或脐带血中分离出单个核细胞，并将分离出的单个核细胞加入培养瓶中，往培养瓶中加入培养液；所述培养液中包含有RPMI1640无血清培养基，且在该培养基中还添加浓度为1~100μM/ml的唑来膦酸、浓度为100~2000U/ml的IL-2、浓度为100~1000μM的维生素C以及0.3~3uM咪喹莫特；
第3天，更换培养液且培养液中包含有RPMI1640培养基，且在该培养基中还添加浓度为1~100μM/ml的唑来膦酸、浓度为100~2000U/ml的IL-2、浓度为100~1000μM的维生素C；
第5天，更换培养液且培养液中包含有RPMI1640培养基，且在该培养基中还添加浓度为1~100μM/ml的唑来膦酸、浓度为100~2000U/ml的IL-2、浓度为100~1000μM的维生素C以及0.1~5uM咪喹莫特；
第7天至第14天，每隔2天或3天更换培养液，所述培养液中包含有RPMI1640培养基，且在该培养基中还添加浓度为1~100μM/ml的唑来膦酸、浓度为100~2000U/ml的IL-2、浓度为100~1000μM的维生素C，获得所述γδT细胞。
一实施例，所述扩增培养方法中，所述步骤中：
第0天，在所述培养基中还添加浓度为65μM/ml的唑来膦酸、浓度为1150U/ml的IL-2、浓度为600μM的维生素C以及2.5uM咪喹莫特；或者
第3天，在所述培养基中添加浓度为65μM/ml的唑来膦酸、浓度为1150U/ml的IL-2、浓度为600μM的维生素C；或者
第5天，在所述培养基中添加浓度为65μM/ml的唑来膦酸、浓度为1150U/ml的IL-2、浓度为600μM的维生素C以及4uM咪喹莫特；或者
第7天至第14天，所述培养基中添加浓度为65μM/ml的唑来膦酸、浓度为1150U/ml的IL-2、浓度为600μM的维生素C。
一实施例，所述扩增培养方法中，包括如下步骤：所述培养基中还添加浓度为1~10v/v％的自体血清；优选浓度为6v/v％的自体血清。
与现有技术相比，本发明具有如下有点：
1）γδT细胞培养液中添加的咪喹莫特组分，能诱导体内包括INF-α在内的细胞因子产生抗病毒活性；同时咪喹莫特能抑制αβT细胞，促进γδT的IL17A分泌，高达43.01%，是对比例IL17A分泌量（11.86%）的3.6倍左右；由此说明，咪喹莫特组分能增强T细胞的肿瘤杀伤活性；
2）咪喹莫特组分能有效提高γδT细胞的扩增数量及纯度，大大降低了细胞培养成本；扩增倍数可达到3200倍左右；
3）咪喹莫特组分对γδT细胞的活率有一定影响，能提高γδT细胞活率；
4）咪喹莫特组分可以提高低效靶比下γδT细胞对肿瘤细胞的杀伤活性，从而可大大提高其临床应用的效果。
5）γδT细胞培养工艺中，第0天初始接种的培养基中加入咪喹莫特组分，可以诱导PBMC中的单个核细胞中的γδT细胞的扩增生长；而在第5天更换液时培养基中添加咪喹莫特组分，一方面可以进一步刺激γδT细胞的扩增生长，另一方面又对γδT细胞的活度起到一定抑制作用，确保γδT细胞活度维持相对平衡。
附图说明
图1为实施例1至3及对比例1中γδT细胞培养增殖曲线图；
图2为第0天PBMC诱导前流式检测细胞中γδT细胞含量图；
图3为实施例1中第14天PBMC经诱导后流式检测细胞中γδT细胞含量图；
图4为实施例2中第14天PBMC经诱导后流式检测细胞中γδT细胞含量图；
图5为实施例3中第14天PBMC经诱导后流式检测细胞中γδT细胞含量图；
图6为对比例1中第14天PBMC经诱导后流式检测细胞中γδT细胞含量图；
图7为实施例1中γδT细胞培养第14天表达IL17A的流式检测图；其中，横坐标为IL17A，纵坐标为CD3,矩形门内为表达IL17A的γδT细胞；
图8为实施例2中γδT细胞培养第14天表达IL17A的流式检测图；其中，横坐标为IL17A，纵坐标为CD3,矩形门内为表达IL17A的γδT细胞；
图9为实施例3中γδT细胞培养第14天表达IL17A的流式检测图；其中，横坐标为IL17A，纵坐标为CD3,矩形门内为表达IL17A的γδT细胞；
图10为对比例1中γδT细胞培养第14天表达IL17A的流式检测图；其中，横坐标为IL17A，纵坐标为CD3,矩形门内为表达IL17A的γδT细胞；
图11为实施例1至3及对比例1中γδT细胞对K562细胞的杀伤活性检测曲线图。
具体实施方式
下面结合附图，对本发明的较佳实施例作进一步详细说明。
本发明提供的一种γδT细胞培养液，包括RPMI1640无血清培养基，在该培养基中添加浓度为1~100μM/ml的唑来膦酸、浓度为100~2000U/ml的IL-2、浓度为100~1000μM的维生素C以及浓度为0.1~5uM的咪喹莫特；较好地，还培养基中还添加浓度为1~10％的自体血清。其中，培养基中的细胞因子组分唑来膦酸、IL-2、维生素C，为现有γδT细胞培养所必须有的基础添加组分。
在一实施例中，较好地，该培养基中添加浓度为20~80μM/ml的唑来膦酸、浓度为300~1500U/ml的IL-2、浓度为300~800μM的维生素C以及浓度为0.3~3uM的咪喹莫特；较好地，还培养基中还添加浓度为2~8v/v％的自体血清。
在一实施例中，更好地，上述培养基中添加浓度为65μM/ml的唑来膦酸、浓度为1150U/ml的IL-2、浓度为600μM的维生素C以及浓度为2.5uM的咪喹莫特；进一步地，培养基中还添加浓度为6v/v％的自体血清。
在一些实施例中，培养基中添加唑来膦酸的浓度可以为1~100μM/ml 之间的任一浓度值，如，1μM/ml、15μM/ml、20μM/ml、35μM/ml、38μM/ml、42μM/ml、49μM/ml、58μM/ml、65μM/ml、71μM/ml、80μM/ml等。
在一些实施例中，培养基中添加IL-2的浓度为可以为100~2000U/ml 之间得到任意浓度值，如，100U/ml、210U/ml、300U/ml、350U/ml、400U/ml、520U/ml、600U/ml、750U/ml、930U/ml、1250U/ml、1400U/ml、1500U/ml、1640U/ml、1760U/ml、2000U/ml等。
在一些实施例中，培养基中添加维生素C的浓度为可以为100~1000μM之间的任意浓度值，如，100μM、220μM、300μM、380μM、460μM、550μM、600μM、710μM、800μM、1000μM等. 维生素C组分具有抗氧化、延缓细胞衰老、维持细胞密度，促进γδT细胞特异性扩增及激活T细胞功能。
在一些实施例中，培养基中添加咪喹莫特的浓度为可以为0.1~5uM之间的任意浓度值；如，0.1uM、0.15、0.2uM、0.3M、0.5M、0.6M、0.8M、0.9M、1uM、1.5uM、2uM、3uM、3.5uM、4.2uM、5uM等。小分子免疫调节因子咪喹莫特，其能诱导体内包括INF-α在内的细胞因子而产生抗病毒活性；同时咪喹莫特能抑制αβT细胞，促进γδT的IL17A分泌，IL17A是一种促炎因子，介导的下游途径诱导炎症分子、趋化因子、抗微生物肽和重塑蛋白的产生，由此增强T细胞的肿瘤杀伤活性。
本发明还提供一种γδT细胞的扩增培养方法；包括如下步骤：
第0天，从外周血或脐带血中分离出单个核细胞，并将分离出的单个核细胞加入培养瓶中，往培养瓶中加入培养液中静置培养；所述培养液中包含有RPMI1640培养基，且在该培养基中还添加浓度为1~100μM/ml的唑来膦酸、浓度为100~2000U/ml的IL-2、浓度为100~1000μM的维生素C以及0.3~3uM咪喹莫特；
第3天，更换培养液且培养液中包含有RPMI1640培养基，且在该培养基中还添加浓度为1~100μM/ml的唑来膦酸、浓度为100~2000U/ml的IL-2、浓度为100~1000μM的维生素C；
第5天，更换培养液且培养液中包含有RPMI1640培养基，且在该培养基中还添加浓度为1~100μM/ml的唑来膦酸、浓度为100~2000U/ml的IL-2、浓度为100~1000μM的维生素C以及0.1~5uM咪喹莫特；
第7天至第14天，每隔2天或3天更换培养液，所述培养液中包含有RPMI1640培养基，且在该培养基中还添加浓度为1~100μM/ml的唑来膦酸、浓度为100~2000U/ml的IL-2、浓度为100~1000μM的维生素C，获得所述γδT细胞。
一实施例，所述扩增培养方法中，所述步骤中：
第0天，在所述培养基中还添加浓度为65μM/ml的唑来膦酸、浓度为1150U/ml的IL-2、浓度为600μM的维生素C以及2.5uM咪喹莫特；或者
第3天，在所述培养基中添加浓度为65μM/ml的唑来膦酸、浓度为1150U/ml的IL-2、浓度为600μM的维生素C；或者
第5天，在所述培养基中添加浓度为65μM/ml的唑来膦酸、浓度为1150U/ml的IL-2、浓度为600μM的维生素C以及4uM咪喹莫特；或者
第7天至第14天，所述培养基中添加浓度为65μM/ml的唑来膦酸、浓度为1150U/ml的IL-2、浓度为600μM的维生素C。
一实施例，所述扩增培养方法中，所述RPMI1640培养基为无血清培养基。
一实施例，所述扩增培养方法中，包括如下步骤：所述培养基中还添加浓度为1~10v/v％的自体血清；优选6v/v％的自体血清。
一、γδT细胞培养
实施例1
取外周血50ml，通过密度梯度离心获得外周血单个核细胞；
第0天，将获得的外周血单个核细胞采用γδT细胞培养液50mL重悬至1×106/ml，转入T175培养瓶中，将培养瓶置于37℃、5％CO2的孵育箱中静置培养；其中，γδT细胞培养液包括RPMI1640培养基(购自美国Gibco公司，货号：31800-105)，且培养基中添加浓度为65μM/ml的唑来膦酸、浓度为1150U/ml的IL-2、浓度为600μM的维生素C、浓度为6v/v％的自体血清以及浓度为浓度为2.5uM的咪喹莫特；
第3天，更换培养液，加入100mL培养液且培养液中包含有RPMI1640培养基，且培养基中添加浓度为65μM/ml的唑来膦酸、浓度为1150U/ml的IL-2、浓度为600μM的维生素C、浓度为6v/v％的自体血清；
第5天，更换培养液，加入200mL培养液且培养液中包含有RPMI1640培养基，且培养基中添加浓度为65μM/ml的唑来膦酸、浓度为1150U/ml的IL-2、浓度为600μM的维生素C、浓度为6v/v％的自体血清以及浓度为3uM咪喹莫特；
第7天，将γδT细胞转入细胞培养袋中，加入500mL培养液且培养液中包含有RPMI1640培养基，且培养基中添加浓度为65μM/ml的唑来膦酸、浓度为1150U/ml的IL-2、浓度为600μM的维生素C及浓度为6v/v％的自体血清；
第9天，更换培养液，加入500mL培养液且培养液中包含有RPMI1640培养基，且培养基中添加浓度为65μM/ml的唑来膦酸、浓度为1150U/ml的IL-2、浓度为600μM的维生素C及浓度为6v/v％的自体血清；
第11天，更换培养液，加入1000mL培养液且培养液中包含有RPMI1640培养基，且培养基中添加浓度为65μM/ml的唑来膦酸、浓度为1150U/ml的IL-2、浓度为600μM的维生素C及浓度为6v/v％的自体血清；
第14天，停止培养，收集γδT细胞。
实施例2
取外周血50ml，通过密度梯度离心获得外周血单个核细胞；
第0天，将获得的外周血单个核细胞采用γδT细胞培养液50mL重悬至1×106/ml，转入T175培养瓶中，将培养瓶置于37℃、5％CO2的孵育箱中静置培养；其中，γδT细胞培养液包括RPMI1640培养基(购自美国Gibco公司，货号：31800-105)，且培养基中添加浓度为1μM/ml的唑来膦酸、浓度为100U/ml的IL-2、浓度为100μM的维生素C、浓度为10v/v％的自体血清以及浓度为0.1uM的咪喹莫特；
第3天，更换培养液，加入100mL培养液且培养液中包含有RPMI1640培养基，且培养基中添加1μM/ml的唑来膦酸、浓度为100U/ml的IL-2、浓度为100μM的维生素C、浓度为10v/v％的自体血清；
第5天，更换培养液，加入200mL培养液且培养液中包含有RPMI1640培养基，且培养基中添加浓度为1μM/ml的唑来膦酸、浓度为100U/ml的IL-2、浓度为100μM的维生素C、浓度为10v/v％的自体血清以及浓度为5uM咪喹莫特；
第7天，将γδT细胞转入细胞培养袋中，加入500mL培养液且培养液中包含有RPMI1640培养基，且培养基中添加浓度1μM/ml的唑来膦酸、浓度为100U/ml的IL-2、浓度为100μM的维生素C及浓度为10v/v％的自体血清；
第9天，更换培养液，加入500mL培养液且培养液中包含有RPMI1640培养基，且培养基中添加浓度1μM/ml的唑来膦酸、浓度为100U/ml的IL-2、浓度为100μM的维生素C及浓度为10v/v％的自体血清；
第11天，更换培养液，加入1000mL培养液且培养液中包含有RPMI1640培养基，且培养基中添加浓度1μM/ml的唑来膦酸、浓度为100U/ml的IL-2、浓度为100μM的维生素C及浓度为10v/v％的自体血清；
第14天，停止培养，收集γδT细胞。
实施例3
取外周血50ml，通过密度梯度离心获得外周血单个核细胞；
第0天，将获得的外周血单个核细胞采用γδT细胞培养液50mL重悬至1×106/ml，转入T175培养瓶中，将培养瓶置于37℃、5％CO2的孵育箱中静置培养；其中，γδT细胞培养液包括RPMI1640培养基(购自美国Gibco公司，货号：31800-105)，且培养基中添加浓度为100μM/ml的唑来膦酸、浓度为2000U/ml的IL-2、浓度为1000μM的维生素C、浓度为1v/v％的自体血清以及浓度为0.3uM的咪喹莫特；
第3天，更换培养液，加入100mL培养液且培养液中包含有RPMI1640培养基，且培养基中加浓度为100μM/ml的唑来膦酸、浓度为2000U/ml的IL-2、浓度为1000μM的维生素C、浓度为1v/v％的自体血清；
第5天，更换培养液, 加入200mL培养液且培养液中包含有RPMI1640培养基，且培养基中添加浓度为100μM/ml的唑来膦酸、浓度为2000U/ml的IL-2、浓度为1000μM的维生素C、浓度为1v/v％的自体血清以及浓度为3uM咪喹莫特；
第7天，将γδT细胞转入细胞培养袋中，加入500mL培养液且培养液中包含有RPMI1640培养基，且培养基中添加浓度为100μM/ml的唑来膦酸、浓度为2000U/ml的IL-2、浓度为1000μM的维生素C及浓度为1v/v％的自体血清;
第9天，更换培养液，加入500mL培养液且培养液中包含有RPMI1640培养基，且培养基中添加浓度为100μM/ml的唑来膦酸、浓度为2000U/ml的IL-2、浓度为1000μM的维生素C及浓度为1v/v％的自体血清；
第11天，更换培养液，加入1000mL培养液且培养液中包含有RPMI1640培养基，且培养基中添加浓度为100μM/ml的唑来膦酸、浓度为2000U/ml的IL-2、浓度为1000μM的维生素C及浓度为1v/v％的自体血清；
第14天，停止培养，收集γδT细胞。
对比例1（不含咪喹莫特）
取外周血50ml，通过密度梯度离心获得外周血单个核细胞；
第0天，将获得的外周血单个核细胞采用γδT细胞培养液50mL重悬至1×106/ml，转入T175培养瓶中，将培养瓶置于37℃、5％CO2的孵育箱中静置培养；其中，γδT细胞培养液包括RPMI1640培养基(购自美国Gibco公司，货号：31800-105)，且培养基中添加浓度为20μM/ml的唑来膦酸、浓度为350U/ml的IL-2、浓度为300μM的维生素C及浓度为5v/v％的自体血清；
第3天，更换培养液，加入100mL培养液且培养液中包含有RPMI1640培养基，且培养基中添加浓度为20μM/ml的唑来膦酸、浓度为350U/ml的IL-2、浓度为300μM的维生素C、浓度为5v/v％的自体血清；
第5天，更换培养液, 加入100mL培养液且培养液中包含有RPMI1640培养基，且培养基中添加浓度为20μM/ml的唑来膦酸、浓度为350U/ml的IL-2、浓度为300μM的维生素C及浓度为5v/v％的自体血清；
第7天，将γδT细胞转入细胞培养袋中，加入500mL培养液且培养液中包含有RPMI1640培养基，且培养基中添加浓度为20μM/ml的唑来膦酸、浓度为350U/ml的IL-2、浓度为300μM的维生素C及浓度为5v/v％的自体血清；
第9天，更换培养液，加入500mL培养液且培养液中包含有RPMI1640培养基，且培养基中添加浓度为20μM/ml的唑来膦酸、浓度为350U/ml的IL-2、浓度为300μM的维生素C及浓度为5v/v％的自体血清；
第11天，更换培养液，加入1000mL培养液且培养液中包含有RPMI1640培养基，且培养基中添加浓度为20μM/ml的唑来膦酸、浓度为350U/ml的IL-2、浓度为300μM的维生素C及浓度为5v/v％的自体血清；
第14天，停止培养，收集γδT细胞。
二、γδT细胞检测试验
（一）、γδT细胞扩增生长检测
根据细胞的生长状况，分别在第0、3、5、7、9、11、13、14天对γδT细胞进行细胞计数及相关分析和检测。检测结果如表1和图1所示；其中，表1中数值为图1中对应γδT细胞扩增数量。实施例1至3中，细胞培养液中添加有咪喹莫特组分，对比例1中培养液中未添加咪喹莫特组分。
表1 γδT细胞培养生长扩增数量计数表，（×108细胞）
Figure 132576DEST_PATH_IMAGE001
如图1和表1所示，检测结果表明，γδT细胞培养14天，实施例1至3中，γδT细胞数量分别为7.92×109细胞、7.75×109细胞、7.5×109细胞，显著高于对比例1（3.1×109细胞）（P<0.05），都为对比例1的2倍以上。说明γδT细胞培养液中，组分咪喹莫特能促进γδT细胞快速生长。
（二）、γδT细胞活率检测
γδT培养过程中，分别在第7天和14天时,根据γδT细胞总数量，对细胞活率进行了检测，检测结果如表2所示。实施例1至3中，细胞培养液中添加有咪喹莫特组分，对比例1中培养液中未添加咪喹莫特组分。
表2 γδT细胞培养活率表
Figure 849996DEST_PATH_IMAGE002
由表2可知，实施例1至3及对比例1中，在细胞培养前期，细胞活率差别不大，如，培养至第7天，各自活率分别为97.53%、98.31%、97.88%、95.96%；但是，在细胞培养至第14天后，各自活率分别为98.26%、97.93%、98.22%、91.66%。由此说明，添加了咪喹莫特组分的实施例1至3，第7天和第14天的细胞活率基本上保持相对稳定；而未添加了咪喹莫特组分的对比例1，第7天和第14天的细胞活率则稍微有所下降。
（三）、γδT细胞含量流式检测
对于实施例1至3及对比例1中培养的γδT细胞，用离心管收集第0天和14天的γδT细胞，每管5×105细胞，分别300g离心3min,用PBS洗涤2次，弃去上清，重悬细胞，每支离心管分别加入PE-conjugated anti-CD3单克隆抗体和FITC-conjugated anti-γδTCR单克隆抗体各5μl，充分混匀，4℃避光孵育30分钟，再300g离心3min,用PBS洗涤2次，弃去上清，加入400μl PBS重悬细胞，流式细胞仪上机检测，检测结果如图2至7所示。
其中，图2为第0天对照样PBMC诱导前流式检测细胞中γδT细胞含量图；图3为实施例1中第14天PBMC经诱导后流式检测细胞中γδT细胞含量图；图4为实施例2中第14天PBMC经诱导后流式检测细胞中γδT细胞含量图；图5为实施例3中第14天PBMC经诱导后流式检测细胞中γδT细胞含量图；图6为对比例1中第14天PBMC经诱导后流式检测细胞中γδT细胞含量图。
培养第0天，分离得到的单个核细胞中γδT细胞所占的比例为4.47%。培养第14天时，实施例1中流式检测细胞中γδT细胞的比例达到90.26%，实施例2中流式检测细胞中γδT细胞的比例达到85.54%；实施例3中流式检测细胞中γδT细胞的比例达到82.94%；对比例1中流式检测细胞中γδT细胞的比例达到61.08%。
流式检测结果表明：实施例1至3及对比例1中γδT细胞培养到第14天，本发明培养液可使γδT细胞的绝对数量增加可以达到3198.5倍；对比例1中，γδT细胞的绝对数量增加可以达到847.2倍；因此，培养液中组分咪喹莫特能促进γδT细胞有效扩增。
其计算如下：
有效细胞的扩增倍数计数公式：（收集细胞数量*收集流式）/（初始细胞数量*初始流式）；
实施例1计算：（79.2*108*90.26%）/（0.5*108*4.47%）≈3198.5；
对比例1计算：（31*108*61.08%）/（0.5*108*4.47%）≈847.2。
（四）、流式检测表达IL17A的γδT细胞含量
如图7至10所示；其中，图7为实施例1中γδT细胞培养第14天表达IL17A的流式检测图；图8为实施例2中γδT细胞培养第14天表达IL17A的流式检测图；图9为实施例3中γδT细胞培养第14天表达IL17A的流式检测图；图10为对比例1中γδT细胞培养第14天表达IL17A的流式检测图；其中，各附图中，横坐标为IL17A，纵坐标为CD3,矩形门内为表达IL17A的γδT细胞。
由图7至10所示，实施例1至3及对比例1中，γδT细胞培养第14天表达IL17A的γδT细胞含量分别是43.01%、36.79%、25.55%以及11.86%。流式检测结果说明，本发明培养液及培养方法，可以有效提升表达IL17A的γδT细胞含量；这是因为添加了小分子免疫调节因子咪喹莫特，其能诱导体内包括INF-α在内的细胞因子而产生抗病毒活性；同时咪喹莫特能抑制αβT细胞，促进γδT的IL17A分泌；而IL17A是一种促炎因子，介导的下游途径诱导炎症分子、趋化因子、抗微生物肽和重塑蛋白的产生，由此说明，咪喹莫特组分增强T细胞的肿瘤杀伤活性。
（五）、γδT细胞肿瘤杀伤试验
用K562细胞作为γδT细胞体外杀伤实验的靶细胞，将培养15天的γδT细胞作效应细胞，按1：1、5：1、10：1、20：1的效靶比在96孔板中进行实验，每孔加入靶细胞和效应细胞各100ul(细胞浓度为2×106.mL-1)，设3个复孔，同时设立阴性对照。置于37℃、5％C02饱和湿度的培养箱内培养24h后，每孔加入10μl的CCK-8试剂，共孵育3h，然后用酶标仪于450nm波长处测定吸光度(OD)值。根据如下公式计算杀瘤率：杀瘤率(％)＝[1-(实验组OD值-效应细胞组OD值)]/(效应细胞组OD值)×100％，计算杀瘤效率。其中，公式中各OD值均为减去空白对照组OD值后的值，如图11和表3所示；其中，表3中数据与图11中对应数据相一致。
表3 肿瘤杀伤率统计表
Figure 182888DEST_PATH_IMAGE003
实验结果表明：本发明扩增的γδT细胞具有良好的肿瘤杀伤活性，在效靶比为E:T=1：1、5：1、10：1、20：1时，实施例1至3的肿瘤杀伤率优于对比例1的肿瘤杀伤率,尤其是低效靶比（E:T=1：1）的肿瘤杀伤率效果显著（P<0.05）。因此说明，本发明培养液组分咪喹莫特能有效提高细胞杀肿瘤活性，尤其是提高低效靶比下γδT细胞对肿瘤细胞的杀伤活性，从而增强了γδT细胞的临床应用价值。
应当理解的是，上述针对本发明较佳实施例的表述较为详细，并不能因此而认为是对本发明专利保护范围的限制，本发明的专利保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (8)

1.一种γδT细胞培养液，其特征在于，该培养液由RPMI1640无血清培养基、浓度为1~100μM/ml的唑来膦酸、浓度为100~2000U/ml的IL-2、浓度为100~1000μM的维生素C、浓度为1~10v/v％的自体血清以及浓度为0.1~5uM的咪喹莫特组成。
2.根据权利要求1所述的γδT细胞培养液，其特征在于，该培养液由RPMI1640无血清培养基、浓度为20~80μM/ml的唑来膦酸、浓度为300~1500U/ml的IL-2、浓度为300~800μM的维生素C、浓度为1~10v/v％的自体血清以及浓度为0.3~3uM的咪喹莫特组成。
3.根据权利要求1所述的γδT细胞培养液，其特征在于，该培养液由RPMI1640无血清培养基、浓度为65μM/ml的唑来膦酸、浓度为1150U/ml的IL-2、浓度为600μM的维生素C、浓度为1~10v/v％的自体血清以及浓度为2.5uM的咪喹莫特组成。
4.根据权利要求1至3任一所述的γδT细胞培养液，其特征在于，所述培养液中添加浓度为2~8v/v％的自体血清。
5.一种γδT细胞的扩增培养方法；其特征在于，包括如下步骤：
第0天，从外周血或脐带血中分离出单个核细胞，并将分离出的单个核细胞加入培养瓶中，往培养瓶中加入培养液，所述培养液由RPMI1640无血清培养基、浓度为1~100μM/ml的唑来膦酸、浓度为100~2000U/ml的IL-2、浓度为100~1000μM的维生素C、浓度为1~10v/v％的自体血清以及0.3~3uM咪喹莫特组成；
第3天，更换培养液且培养液由RPMI1640培养基、浓度为1~100μM/ml的唑来膦酸、浓度为100~2000U/ml的IL-2、浓度为100~1000μM的维生素C及浓度为1~10v/v％的自体血清组成；
第5天，更换培养液且培养液由RPMI1640培养基、浓度为1~100μM/ml的唑来膦酸、浓度为100~2000U/ml的IL-2、浓度为100~1000μM的维生素C、浓度为1~10v/v％的自体血清以及0.1~5uM咪喹莫特组成；
第7天至第14天，每隔2天或3天更换培养液，所述培养液由RPMI1640培养基、浓度为1~100μM/ml的唑来膦酸、浓度为100~2000U/ml的IL-2、浓度为100~1000μM的维生素C及浓度为1~10v/v％的自体血清组成，获得所述γδT细胞。
6.根据权利要求5所述的扩增培养方法，其特征在于，所述步骤中：
第0天，所述培养液由RPMI1640无血清培养基、浓度为20~80μM/ml的唑来膦酸、浓度为300~1500U/ml的IL-2、浓度为300~800μM的维生素C、浓度为1~10v/v％的自体血清以及浓度为0.3~3uM的咪喹莫特组成；或者
第3天，所述培养液由RPMI1640无血清培养基、浓度为20~80μM/ml的唑来膦酸、浓度为300~1500U/ml的IL-2、浓度为300~800μM的维生素C及浓度为1~10v/v％的自体血清组成；或者
第5天，所述培养液由RPMI1640无血清培养基、浓度为20~80μM/ml的唑来膦酸、浓度为300~1500U/ml的IL-2、浓度为300~800μM的维生素C、浓度为1~10v/v％的自体血清以及0.3~3uM咪喹莫特组成；或者
第7天至第14天，所述培养液由RPMI1640无血清培养基、浓度为20~80μM/ml的唑来膦酸、浓度为300~1500U/ml的IL-2、浓度为300~800μM的维生素C及浓度为1~10v/v％的自体血清组成。
7.根据权利要求5所述的扩增培养方法，其特征在于，所述步骤中：
第0天，所述培养液由RPMI1640无血清培养基、浓度为65μM/ml的唑来膦酸、浓度为1150U/ml的IL-2、浓度为600μM的维生素C、浓度为1~10v/v％的自体血清以及2.5uM咪喹莫特组成；或者
第3天，所述培养液由RPMI1640无血清培养基、浓度为65μM/ml的唑来膦酸、浓度为1150U/ml的IL-2、浓度为600μM的维生素C及浓度为1~10v/v％的自体血清组成；或者
第5天，所述培养液由RPMI1640无血清培养基、浓度为65μM/ml的唑来膦酸、浓度为1150U/ml的IL-2、浓度为600μM的维生素C、浓度为1~10v/v％的自体血清以及4uM咪喹莫特组成；或者
第7天至第14天，所述培养液由RPMI1640无血清培养基、浓度为65μM/ml的唑来膦酸、浓度为1150U/ml的IL-2、浓度为600μM的维生素C及浓度为1~10v/v％的自体血清组成。
8.根据权利要求5至7任一所述的扩增培养方法，其特征在于，包括如下步骤：所述培养液中添加浓度为2~8v/v％的自体血清。
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