CN106399242B - 联合制备CAR-Vγ9Vδ2T细胞和CAR-NKT细胞的方法 - Google Patents

联合制备CAR-Vγ9Vδ2T细胞和CAR-NKT细胞的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种联合制备CAR‑Vγ9Vδ2T细胞和CAR‑NKT细胞的方法，该方法包括以下步骤：1)将外周血单个核细胞加入细胞培养基中，预活化其中的Vγ9Vδ2T细胞和NKT细胞，再选择性体外活化扩增Vγ9Vδ2T细胞和NKT细胞；2)用携带有嵌合抗原受体的基因序列的慢病毒载体转导步骤1)所得混合细胞。该方法使用健康供者的γδT可以进行标准化和批量化制备；另外本申请中Vγ9Vδ2T细胞和NKT细胞的纯度无需纯化即可分别达到60％和30％以上，因此可以避免预先纯化；使用该方法联合制备的CAR‑Vγ9Vδ2T细胞和CAR‑NKT细胞可通过临床用药来控制其在体内的活化增殖程度及存续时间。

Description

联合制备CAR-Vγ9Vδ2T细胞和CAR-NKT细胞的方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种联合制备CAR-Vγ9Vδ2T细胞和CAR-NKT细胞的方法。
背景技术
白血病是严重危害人类健康的最主要的血液系统恶性肿瘤，目前化疗是治疗白血病的主要手段，但化疗缺乏特异性并且有严重的毒副作用，多数患者最终复发死亡；造血干细胞移植也是治疗白血病的重要手段，但移植后肿瘤复发和移植物抗宿主病仍是目前难以克服的两大难题。
CAR-T治疗已在急性淋巴细胞白血病(B-ALL)和慢性淋巴细胞白血病(B-CLL)及B细胞淋巴瘤等的临床试验中显示出良好的靶向性、杀伤性和持久性，为B细胞白血病和淋巴瘤的免疫细胞治疗提供了新的解决方案，展示了巨大的发展潜力和应用前景。2013年ASH会议上Rosenberg团队报道了CAR-T细胞在淋巴瘤治疗中的应用，15例难治复发B细胞恶性肿瘤患者接受了CAR-T治疗，其中9例弥漫大B细胞淋巴瘤，4例慢性淋巴白血病，2例惰性淋巴瘤，15例患者中8例完全缓解，4例部分缓解，1例淋巴瘤稳定。2014年的ASH会议上诺华公布了B细胞肿瘤CAR-T免疫疗法CTL019治疗的最新研究数据，39例复发难治急性淋巴细胞白血病儿童接受CTL019治疗后有36例儿童(92％)达到了完全缓解，并且6个月后，70％的响应者仍处于缓解中，75％的儿童仍存活。
CAR-T技术全称是嵌合抗原受体T细胞免疫疗法，其中CAR表示Chimeric antigenreceptor，即嵌合抗原受体。该技术是将抗原受体的高亲和性和T淋巴细胞的杀伤作用相结合的技术，嵌合抗原受体基因转导T细胞获得的CAR-T细胞具有抗原特异性识别和激活效应性T细胞毒作用的双重性质。在临床应用中，CAR-T细胞的主要操作步骤是将含有CAR基因的载体在体外转导到自体T细胞中，然后应用现有的T细胞扩增技术，在体外大量扩增T细胞，再将扩增的T细胞回输给经预处理后的肿瘤患者，这个过程也叫做重新引导T细胞攻击肿瘤细胞。CAR-T技术通过基因重组技术在体外将CAR基因转入到自体T细胞内，使T细胞表面表达肿瘤相关抗原的受体，由于使用的是自体T淋巴细胞，因此不会引起移植物抗宿主病，对难治性和复发的B细胞恶性肿瘤治疗效果显著。嵌合抗原受体的结构包括胞外区、跨膜区和胞内区：胞外区主要是抗原特异性单克隆抗体单链可变区序列，包括重链可变区和轻链可变区，二者以铰链区连接；跨膜区是CD3、CD4、CD8、CD28等蛋白分子；胞内区主要是T细胞受体TCR/CD3复合物中的CD3ζ链、免疫球蛋白Fc受体FcεRIγ链，通常具有免疫受体酪氨酸活化基序(ITAMs)，负责信号转导。CAR胞外区为配体，肿瘤相关抗原(TAA)本身则为受体，CAR一旦与TAA结合，即可通过由CD3ζ或高亲和性受体FcεRIγ的胞内区使T细胞活化发挥效应功能。输入体内的CAR-T细胞CARs与TAA结合后引起CAR-T细胞活化，表现为CAR依赖的杀伤、增殖及细胞因子释放，输注的CAR-T细胞在患者体内持续存在与潜在的疗效相关。目前临床研究中所输注的CAR-T细胞多为第二代CAR-T细胞，在第二代CAR-T细胞中加入共刺激信号4-1BB可增强CAR-T细胞在体内的存活时间、以及抗肿瘤能力提高。
CD19的表达仅限于B细胞，并且持续表达在B系细胞分化的各个阶段，超过95％B系淋巴细胞白血病和非霍奇金淋巴瘤等均有CD19表达，并且在大多数的正常组织表面不表达CD19，多能造血干细胞也不表达CD19，这就意味着CD19是一个引发自体免疫疾病风险小、不可逆和骨髓毒性低的安全靶标，因此构建识别CD19的嵌合抗原受体即CAR19-T通过特异性识别CD19抗原来杀伤靶细胞，可以达到治疗绝大多数B系肿瘤的目的。目前开发的针对血液系统恶性肿瘤的CAR-T细胞即多以CD19为靶抗原。第二代CAR信号肽区由于添加了一个协同刺激分子，能够更好的为CAR-T细胞提供活化信号，这样CAR识别肿瘤细胞后能够同时活化协同刺激分子和胞内信号，实现双重活化，能明显提高T细胞增殖分泌能力和抗肿瘤效应。但正是由于这种强的增殖能力，持续的体内存在和高效的靶向杀伤作用，也大大提高了这种CAR-T细胞治疗的致死性毒副作用细胞因子风暴。另外，尽管CAR-T在当前的B细胞白血病及淋巴瘤的临床试验中显示出了显著的临床效果，但由于当前CAR-T制备主要采集患者自身T细胞，这是一种“个性化定制”的细胞产品，仅适用于患者自身，对于CAR-T细胞产品的商业化来说，产品质量的“标准化”和产品生产的“批量化”是亟待解决的两大瓶颈。并且CAR转导前往往需要用免疫磁珠或其它手段从外周血单个核细胞中对特定T细胞亚群进行纯化，不仅耗时费力且成本昂贵，如果不进行纯化则转导后目标CAR-T的纯度很低，CD4+CAR-T和CD8+CAR-T比例也无法确定，严重影响其疗效，甚至产生严重的副作用。
公开于该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不应当被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
发明内容
为了克服现有技术中CAR-αβT细胞需要个性化定制、制备过程中需要预先纯化获得αβT细胞亚群以及CAR-αβT回输体内后产生严重的细胞因子风暴的缺陷，本发明提供了一种新的联合制备CAR-Vγ9Vδ2T细胞和CAR-NKT细胞的方法，该方法采用具有普适性的免疫细胞γδT作为待转导的效应细胞，使用健康供者的γδT也可以进行“标准化”和“批量化”制备；另外该方法采用体外特异性活化技术使待转导的外周血PBMC中的Vγ9Vδ2T细胞和NKT细胞得到最大程度的优势扩增，不需要预先纯化获得特定的T细胞亚群，省时省力成本降低；并且使用该方法联合制备的CAR-Vγ9Vδ2T细胞和CAR-NKT细胞在体内存在的时间可通过药物来控制，不会像其他CAR-T那样持续长时间的存在，因此作用温和不会引起严重致死性的细胞因子风暴。使用该方法制备的CAR-NK/NKT细胞可用于B细胞白血病和淋巴瘤的靶向治疗。
本发明的具体技术方案为：
一种联合制备CAR-Vγ9Vδ2T细胞和CAR-NKT细胞的方法，包括以下步骤：
1)从患者的自体外周血、健康供者的外周血或婴儿脐带血中分离得到外周血单个核细胞(PBMC)；将所得外周血单个核细胞加入可用于淋巴细胞、树突状细胞或DC细胞的无血清细胞培养基中，再加入抗γδTCR单克隆抗体、含氮二膦酸盐类药物或帕米磷酸盐类药物预活化PBMC中的Vγ9Vδ2T细胞和NKT细胞，之后再加入rhIL-2或rhIL-15进行Vγ9Vδ2T细胞和NKT细胞的选择性体外活化扩增；
2)用携带有嵌合抗原受体的基因序列的慢病毒载体转导步骤1)所得包含Vγ9Vδ2T细胞和NKT细胞的混合细胞(以下简称Vγ9Vδ2T/NKT细胞)，即得包含CAR-Vγ9Vδ2T细胞和CAR-NKT细胞的混合细胞(以下简称CAR-Vγ9Vδ2T/NKT细胞)，其中嵌合抗原受体与靶向表面抗原可特异性结合。
上述方法在另一种实现方式中，采用人淋巴细胞分离液从患者的自体外周血、健康供者的外周血或婴儿脐带血中分离得到外周血单个核细胞，人淋巴细胞分离液可采用GE公司的Ficoll paque plus或Ficoll paque premium。
上述方法在另一种实现方式中，所述无血清细胞培养基选自德国Cellgenix公司的cellgrowSCGM，日本TAKARA公司的GT-T551H3，日本KOHJIN公司的KBM581，美国GIBCO公司的AIM-V、瑞士LONZA公司的X-Vivo15中的一种或几种。
上述方法在另一种实现方式中，将所得外周血单个核细胞加入可用于淋巴细胞、树突状细胞或DC细胞的无血清细胞培养基中，使外周血单个核细胞在无血清细胞培养基中的浓度为(1-9)×106个/ml。
上述方法在另一种实现方式中，预活化前所述无血清细胞培养基中还加入血浆，使血浆在无血清细胞培养基中的浓度为2-10％，且所述血浆与外周血单个核细胞来自于同一血液供体。即如果外周血单个核细胞来源于某一特定患者的外周血，血浆也来源于该特定患者的外周血；如果外周血单个核细胞来源于血库中某一健康供者的外周血，血浆也来源该健康供者的外周血；如果外周血单个核细胞来源于血库中某一婴儿脐带血，血浆也来源于该婴儿脐带血。本申请方法中使用的每份从血库获得的健康供者的外周血和从血库获得的婴儿脐带血都是采集单个供体的。
上述方法在另一种实现方式中，使用的抗γδTCR单克隆抗体、含氮二膦酸盐类药物或帕米磷酸盐类药物加入细胞培养基后的浓度为1-10μM。
上述方法在另一种实现方式中，所述含氮二膦酸盐类药物为唑来膦酸，即1-羟基-2-(咪唑-1-yl)-亚乙基-1,1-二磷酸一水化物，CAS号118072-93-8；所述帕米磷酸盐类药物为帕米膦酸二钠。
上述方法在另一种实现方式中，预活化后加入rhIL-2使其在细胞培养基中的浓度为300-1000U/ml或加入rhIL-15使其在细胞培养基中的浓度为5-50ng/ml。
上述方法在另一种实现方式中，Vγ9Vδ2T细胞和NKT细胞的选择性体外活化扩增中，每隔2-3天补充新鲜的所述无血清细胞培养基、血浆、rhIL-2和/或rhIL-15，以保证其在体系中的浓度。
上述方法在另一种实现方式中，所述预活化、选择性体外活化扩增的条件均为在37℃、5％二氧化碳的培养箱中进行。
上述方法在另一种实现方式中，预活化12-36h后加入rhIL-2或rhIL-15，选择性体外活化扩增Vγ9Vδ2T细胞和NKT细胞7天以上。当选择性体外活化扩增7天后，CD3+TCR-gamma-delta+Vγ9Vδ2T细胞纯度可达到60％以上，CD3+CD56+NKT细胞可达到30％以上。
上述方法在另一种实现方式中，所述携带有嵌合抗原受体的基因序列的慢病毒载体是通过以下步骤构建的：采用全基因合成的方法合成可与靶向表面抗原特异性结合的嵌合抗原受体的基因序列，将该嵌合抗原受体基因序列亚克隆到慢病毒表达载体中，载体经测序验证序列准确无突变后，得到携带有嵌合抗原受体的基因序列的慢病毒载体，即重组慢病毒载体。
上述方法在另一种实现方式中，所述靶向表面抗原为CD19，与CD19特异性结合的嵌合抗原受体的基因序列如SEQ ID:1所示，与CD19特异性结合的嵌合抗原受体的氨基酸序列如SEQ ID:2所示，氨基酸序列SEQ ID:2是基因序列SEQ ID:1经转录翻译所得。
上述方法在另一种实现方式中，所述慢病毒表达载体为美国SBI公司的pCDH载体，如:pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro。
上述方法在另一种实现方式中，重组慢病毒载体在进行转导前还需要进行扩增以方便转导中的大规模使用，重组慢病毒载体的扩增方法为：
包被病毒颗粒：1)在HEK293T新鲜培养基中培养HEK293T细胞，24h细胞密度达到90％左右；2)在100mm平板中，向上述HEK293T细胞中加入10μg所得重组慢病毒、5μg PLP1、5μg PLP2，5μg PLP/VSVG,75μl转染试剂Lipofectamine 2000，按照PLP1、PLP2和PLP/VSVG的说明书以及转染试剂Lipofectamine 2000的说明书进行操作；3)4hr后除去含转染试剂的HEK293T培养基，加入10ml HEK293T新鲜培养基；4)37℃孵育48h，收集含病毒颗粒的上清，并对上清进行4℃、2000×g的离心10min，除去细胞碎片，得到上清；
超速法浓缩病毒颗粒：1)超速离心“包被病毒颗粒”步骤所得上清，4℃、60000×g离心150min后弃上清，将离心管口倒置除去残留培养基；2)用普通培养基重悬病毒颗粒；3)操作完成后，将含病毒的离心管冰上放置3h；4)病毒上清以0.1～1ml体积进行分装，-80度冻存。
上述方法在另一种实现方式中，重组慢病毒载体转导步骤1)所得Vγ9Vδ2T/NKT细胞的具体步骤为：收集Vγ9Vδ2T/NKT细胞，调整Vγ9Vδ2T/NKT细胞的浓度至5×106个/ml，重组慢病毒载体和Vγ9Vδ2T/NKT细胞以1:4的体积比混合静置6-12h；收集细胞并用PBS缓冲液清洗，换可用于淋巴细胞、树突状细胞或DC细胞的新鲜无血清细胞培养基保持72小时。之后可以使用流式细胞免疫荧光染色，分析转导效率。
上述方法在另一种实现方式中，该方法还包括对CAR19-Vγ9Vδ2T/NKT细胞的体外抗肿瘤活性进行试验验证的步骤：以转导后所得CAR19-Vγ9Vδ2T/NKT细胞作为效应细胞，以表达CD19的Raji肿瘤细胞作为靶细胞进行毒杀伤试验验证，体外采用cytotox96试剂盒检测细胞毒杀伤效果，按照不同的效靶比，建立CAR-Vγ9Vδ2T/NKT细胞与靶向肿瘤细胞的共培养体系，检测培养基上清中由被裂解的肿瘤细胞释放的LDH含量，以此反应CAR-Vγ9Vδ2T/NKT细胞在体外杀伤肿瘤细胞的能力。当效靶比E:T＝3：1时，对CD19+Raji细胞杀伤效率＞70％为合格。
上述方法在另一种实现方式中，CAR19-Vγ9Vδ2T/NKT细胞的体外抗肿瘤活性验证合格后还包括将CAR19-Vγ9Vδ2T/NKT细胞在体外进一步扩增的步骤，当扩增到一定细胞数量时，即可回输给患者发挥抗肿瘤作用，CAR19-Vγ9Vδ2T/NKT细胞在体外进一步扩增的方法与步骤1)中选择性体外活化扩增的方法相同；如：加入到可用于淋巴细胞、树突状细胞或DC细胞的无血清细胞培养基中，调整细胞浓度为2×106个/ml，加入终浓度为1000U/ml的rhIL-2和终浓度为10％的血浆，于37℃和5％的二氧化碳培养箱中继续培养，每隔2-3天补充新鲜的无血清细胞培养基、IL-2和血浆，以保持其各自的浓度。
上述方法在另一种实现方式中，CAR19-Vγ9Vδ2T/NKT细胞在体外进一步扩增至细胞数量达到(1-20)×107个/ml时还包括进行细胞质控检测的步骤：细胞活力＞90％且细菌、真菌、支原体和内毒素检结果为阴性，视为合格。
上述方法在另一种实现方式中，细胞质控检测合格后还包括以下步骤：开始收集细胞，用生理盐水1500rpm×10min离心洗涤一次，弃掉上清，然后用100ml生理盐水悬浮细胞并加入终浓度为1％的人血白蛋白。
之后交给医护人员给患者回输到体内，回输到患者体内的CAR19-Vγ9Vδ2T/NKT细胞可以直接发挥抗肿瘤作用。CAR19-Vγ9Vδ2T/NKT细胞也可以在体外，在含氮二磷酸盐类药物、体内肿瘤裂解释放的磷酸抗原等或体内IL-2、IL-15等细胞因子作用下继续活化扩增持续具有抗肿瘤作用。
上述方法在另一种实现方式中，还包括使用流式细胞分析检测重组CAR-Vγ9Vδ2T/NKT细胞表面的嵌合抗原受体表达水平的步骤。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
1、本发明可同时制备CAR-Vγ9Vδ2T细胞和CAR-NKT细胞，Vγ9Vδ2T细胞和NKT细胞是自身固有免疫细胞而且是非MHC限制性的识别和杀伤肿瘤，不管是转导成功的CAR-Vγ9Vδ2T/NKT细胞还是小部分未转导成功的Vγ9Vδ2T细胞和NKT细胞，都不会像αβT那样因MHC限制性个体不同而产生免疫排斥反应，因此CAR-Vγ9Vδ2T/NKT细胞对不同个体的不同肿瘤类型均有普适性，可提前大规模制备并满足不同个体的需求；当然针对CD19制备获得的CAR19-Vγ9Vδ2T/NKT细胞还具有CAR-T对肿瘤杀伤的靶向性，对CD19+的恶性肿瘤杀伤更有效；
2、本发明不需要预先纯化T细胞亚群，采用体外特异性活化的技术使得Vγ9Vδ2T/NKT细胞的纯度可分别达到60％和30％以上；既简单又可节约昂贵的纯化成本，并且在此基础上通过特殊转导技术转导重组慢病毒载体，可大大提高转导效率；
3、针对CD19制备获得的CAR19-Vγ9Vδ2T/NKT在体内受肿瘤释放的抗原介导活化和增殖的能力很弱，可通过唑来膦酸和帕米膦酸二钠等来延长其在体内的活化增殖程度及存续时间，与其他CAR19-T相比作用相对温和，不会长期存在和大规模增殖，可大大降低细胞因子风暴的危险，安全有效。
附图说明
图1从上到下分别是实施例1中PBMC预活化前Vγ9Vδ2T细胞和NKT细胞的免疫表型分析，选择性体外活化扩增7天后Vγ9Vδ2T细胞和NKT细胞的免疫表型分析和重组慢病毒载体转导后所得CAR19-Vγ9Vδ2T细胞和CAR19-NKT细胞的免疫表型分析，同时具备CD3+和TCR-gamma-delta+为Vγ9Vδ2T细胞或CAR19-Vγ9Vδ2T细胞，同时具备CD3+和CD56+为NKT细胞或CAR19-NKT细胞；
图2从上到下分别是实施例2中PBMC预活化前Vγ9Vδ2T细胞和NKT细胞的免疫表型分析，选择性体外活化扩增7天后Vγ9Vδ2T细胞和NKT细胞的免疫表型分析，重组慢病毒载体转导后所得CAR19-Vγ9Vδ2T细胞和CAR19-NKT细胞的免疫表型分析，同时具备CD3+和TCR-gamma-delta+为Vγ9Vδ2T细胞或CAR19-Vγ9Vδ2T细胞，同时具备CD3+和CD56+为NKT细胞或CAR19-NKT细胞；
图3从上到下分别是实施例3中PBMC预活化前Vγ9Vδ2T细胞和NKT细胞的免疫表型分析，选择性体外活化扩增7天后Vγ9Vδ2T细胞和NKT细胞的免疫表型分析，重组慢病毒载体转导后所得CAR19-Vγ9Vδ2T细胞和CAR19-NKT细胞的免疫表型分析，同时具备CD3+和TCR-gamma-delta+为Vγ9Vδ2T细胞或CAR19-Vγ9Vδ2T细胞，同时具备CD3+和CD56+为NKT细胞或CAR19-NKT细胞；
图4是实施例1-3中所得CAR19-Vγ9Vδ2T/NKT细胞和Vγ9Vδ2T/NKT细胞对CD19+Raji细胞体外杀伤实验的效果对比图，图中每个实施例左边的柱状代表CAR19-Vγ9Vδ2T/NKT细胞的杀伤效果，每个实施例右边的柱状代表Vγ9Vδ2T/NKT细胞的杀伤效果。
具体实施方式
下面结合附图，对本发明的具体实施方式进行详细描述，但应当理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制。
实施例1
在GMP实验室的超净工作台内用人淋巴细胞分离液Ficoll paque plus(GE)从健康供者的80ml外周血中分离得到PBMC并进行计数，PBMC培养前取少量样品进行免疫表型分析，参见图1，将分离的PBMC悬浮后加入到含有10％血浆(血浆与外周血来自于同一健康供者)的无血清细胞培养基AIM-V(美国GIBCO公司)中，将细胞浓度用上述含有血浆的无血清细胞培养基调整至2×106个/ml，再加入注射用唑来膦酸(瑞士诺华)，使其在无血清细胞培养基中的浓度为2.5μM，于37℃、5％二氧化碳的培养箱中预活化培养Vγ9Vδ2T/NKT；预活化24h后加入rhIL-2使其在无血清细胞培养基中的浓度为1000U/ml，继续于37℃、5％二氧化碳的培养箱中选择性体外活化扩增Vγ9Vδ2T/NKT细胞，以后每隔2-3天补充一次上述新鲜培养基、血浆和rhIL-2使其保持浓度，经过7天的选择性体外活化扩增后Vγ9Vδ2T细胞比例达到64％，NKT细胞比例达到46.23％，参见图1；携带有可与CD19特异性结合的嵌合抗原受体的基因序列的慢病毒载体转导活化后的Vγ9Vδ2T/NKT细胞，Vγ9Vδ2T细胞和NKT细胞的转导效率分别为26.29％和15.61％，参见图1；CAR19-Vγ9Vδ2T/NKT细胞对CD19+靶细胞Raji细胞毒实验，当效靶比E:T＝3：1时，对靶细胞的杀伤为85％，如图4所示；CAR19-Vγ9Vδ2T/NKT细胞体外进一步扩增，即：将CAR19-Vγ9Vδ2T/NKT细胞加入到含有10％血浆(血浆与外周血来自于同一健康供者)的无血清细胞培养基AIM-V(美国GIBCO公司)中，将细胞浓度调整至2×106个/ml，加入终浓度为1000U/ml的rhIL-2，于37℃和5％的二氧化碳培养箱中继续培养，每隔2-3天补充新的无血清细胞培养基、rhIL-2及血浆使其保持浓度；当CAR19-Vγ9Vδ2T/NKT细胞数量达到一定数量(1-20)×107个/ml时；CAR19-Vγ9Vδ2T/NKT进行质控检测，细胞活力＞90％且细菌、真菌、支原体和内毒素检测皆为阴性为合格，离心洗涤收集细胞，用50ml氯化钠注射液和含有1％的人血白蛋白悬浮细胞装于输液袋中；CAR19-Vγ9Vδ2T/NKT细胞制品包装贴标签；回输前患者预处理和回输治疗及疗效监测和副作用处理。
实施例1：Vγ9Vδ2T/NKT活化扩增前后及重组慢病毒表达载体转导后的流式检测结果
实施例2
在GMP实验室的超净工作台内用人淋巴细胞分离液Ficoll paque plus(GE)从健康供者的80ml外周血中分离PBMC并进行计数，PBMC培养前取少量样品进行免疫表型分析，参见图2，将分离的PBMCs悬浮后加入到含有10％血浆(血浆与外周血来自于同一健康供者)的无血清细胞培养基AIM-V(美国GIBCO公司)中，将细胞浓度用上述含有血浆的无血清细胞培养基调整至2×106个/ml，加入注射用帕米膦酸二钠(深圳信立泰药业)，使其在无血清细胞培养基中的浓度为10μM，于37℃、5％二氧化碳的培养箱中预活化培养Vγ9Vδ2T/NKT细胞；预活化24h后加入rhIL-2使其在无血清细胞培养基中的浓度为1000U/ml的，继续于37℃、5％二氧化碳的培养箱中选择性体外活化扩增Vγ9Vδ2T/NKT细胞，以后每隔2-3天补充一次上述新鲜培养基、血浆和rhIL-2使其保持浓度，经过7天的选择性体外活化扩增Vγ9Vδ2T细胞比例可达到69.7％，NKT细胞比例达到35.93％，参见图2；携带有可与CD19特异性结合的嵌合抗原受体的基因序列的慢病毒载体转导活化后的Vγ9Vδ2T/NKT，两种细胞转导效率分别为38.27％和11.82％，参见图2；CAR19-Vγ9Vδ2T/NKT对CD19+靶细胞Raji细胞毒实验，当效靶比E:T＝3：1时，对靶细胞的杀伤为80％，如图4所示；CAR19-Vγ9Vδ2T/NKT细胞体外进一步扩增，即：将CAR19-Vγ9Vδ2T/NKT细胞加入到含有10％血浆(血浆与外周血来自于同一健康供者)的无血清细胞培养基AIM-V(美国GIBCO公司)中，将细胞浓度调整至2×106个/ml，加入终浓度为1000U/ml的rhIL-2，于37℃和5％的二氧化碳培养箱中继续培养，每隔2-3天补充新的无血清细胞培养基、rhIL-2及血浆使其保持浓度；当CAR19-Vγ9Vδ2T/NKT细胞数量达到一定数量(1-20)×107个/ml时；CAR19-Vγ9Vδ2T/NKT质控检测，细胞活力＞90％且细菌、真菌、支原体和内毒素皆为阴性为合格，离心洗涤收集细胞，用50ml氯化钠注射液和含有1％的人血白蛋白悬浮细胞装于输液袋中；CAR19-Vγ9Vδ2T/NKT细胞制品包装贴标签；回输前患者预处理和回输治疗及疗效监测和副作用处理。
实施例2：Vγ9Vδ2T/NKT活化扩增前后及重组慢病毒表达载体转导后的流式检测结果
实施例3
在GMP实验室的超净工作台内用人淋巴细胞分离液Ficoll paque premium(GE)从婴儿脐带血80ml中分离得到PBMC并进行计数，PBMCs培养前取少量样品进行免疫表型分析，参见图3，将分离的PBMC悬浮后加入到含有10％血浆(血浆与外周血来自于同一婴儿脐带血)的无血清细胞培养基AIM-V(美国GIBCO公司)中，将细胞浓度用上述含有血浆的无血清细胞培养基调整至2×106个/ml，然后转移至被1μg/ml抗γδTCR抗体(美国Immunotech)包被的培养瓶中，于37℃、5％二氧化碳的培养箱中预活化培养Vγ9Vδ2T/NKT；预活化24h后加入rhIL-2使其在无血清细胞培养基中的浓度为1000U/ml的，于37℃、5％二氧化碳培养箱中选择性体外活化扩增Vγ9Vδ2T/NKT细胞，每隔2-3天补充一次上述新鲜培养基、血浆和rhIL-2，经过7天的活化和扩增Vγ9Vδ2T细胞比例可达到59.27％，NKT细胞比例达到28.55％，参见图3；携带有可与CD19特异性结合的嵌合抗原受体的基因序列的慢病毒载体转导活化好的Vγ9Vδ2T/NKT细胞，两种细胞转导效率分别为34.06％和14.02％，参见图3；CAR19-Vγ9Vδ2T/NKT对CD19+靶细胞Raji细胞毒实验，当效靶比E:T＝3：1时，对靶细胞的杀伤为78％，如图4所示；CAR19-Vγ9Vδ2T/NKT体外进一步扩增，即：将CAR19-Vγ9Vδ2T/NKT细胞加入到含有10％血浆(血浆与外周血来自于同一婴儿脐带血)的无血清细胞培养基AIM-V(美国GIBCO公司)中，将细胞浓度调整至2×106个/ml，加入终浓度为1000U/ml的rhIL-2，于37℃和5％的二氧化碳培养箱中继续培养，每隔2-3天补充新的无血清细胞培养基、rhIL-2及血浆使其保持浓度；当CAR19-Vγ9Vδ2T/NKT细胞数量达到一定数量(1-20)×107个/ml时；CAR19-Vγ9Vδ2T/NKT细胞制品质控检测，细胞活力＞90％且细菌、真菌、支原体和内毒素皆为阴性为合格，离心洗涤收集细胞，用50ml氯化钠注射液和含有1％的人血白蛋白悬浮细胞装于输液袋中；CAR19-Vγ9Vδ2T/NKT细胞制品包装贴标签；回输前患者预处理；回输治疗及疗效监测和副作用处理。
实施例3：Vγ9Vδ2T/NKT活化扩增前后及重组慢病毒表达载体转导后的流式检测结果
实施例4
(1)实施例1-3中携带有可与CD19特异性结合的嵌合抗原受体的基因序列的慢病毒载体是通过以下步骤构建的：采用全基因合成的方法合成靶向表面抗原CD19对应的嵌合抗原受体基因，其基因序列如SEQ ID:1所示，其氨基酸序列如SEQ ID:2所示，将该嵌合抗原受体基因亚克隆到慢病毒表达载体pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro(SBI公司)中，载体经测序验证序列准确无突变后，得到携带有嵌合抗原受体基因的慢病毒表达载体，即重组慢病毒。
(2)实施例1-3中将上述所得重组慢病毒进行扩增以用于大量的转导实验，方法如下：
一、包被病毒颗粒：1)在HEK293T新鲜培养基中培养HEK293T细胞，24h细胞密度达到90％左右；2)在100mm平板中，向上述HEK293T细胞中加入10μg所得重组慢病毒、5μgPLP1、5μg PLP2，5μg PLP/VSVG,75μl转染试剂Lipofectamine 2000，按照PLP1、PLP2和PLP/VSVG的说明书以及转染试剂Lipofectamine 2000的说明书进行操作；3)4hr后除去含转染试剂的HEK293T培养基，加入10ml HEK293T新鲜培养基；4)37℃孵育48h，收集含病毒颗粒的上清，并对上清进行4℃、2000×g的离心10min，除去细胞碎片，得到上清；
二、超速法浓缩病毒颗粒：1)超速离心步骤一所得上清，4℃、60000×g离心150min后弃上清，将离心管口倒置除去残留培养基；2)用普通培养基重悬病毒颗粒；3)操作完成后，将含病毒的离心管冰上放置3h；4)病毒上清以0.5ml体积进行分装，-80度冻存。
(3)实施例1-3中重组慢病毒转导Vγ9Vδ2T/NKT细胞的方法为：收集Vγ9Vδ2T/NKT细胞，调整Vγ9Vδ2T/NKT细胞的浓度至5×106个/ml，扩增后的重组慢病毒和Vγ9Vδ2T/NKT细胞以1:4的体积比混合静置8h；收集细胞并用PBS缓冲液清洗，换可用于淋巴细胞、树突状细胞或DC细胞的新鲜细胞培养液后保持72小时。之后可以使用流式细胞免疫荧光染色，分析转导效率。
前述对本发明的具体示例性实施方案的描述是为了说明和例证的目的。这些描述并非想将本发明限定为所公开的精确形式，并且很显然，根据上述教导，可以进行很多改变和变化。对示例性实施例进行选择和描述的目的在于解释本发明的特定原理及其实际应用，从而使得本领域的技术人员能够实现并利用本发明的各种不同的示例性实施方案以及各种不同的选择和改变。本发明的范围意在由权利要求书及其等同形式所限定。

Claims (8)

1.一种联合制备CAR-Vγ9Vδ2T细胞和CAR-NKT细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)从患者的自体外周血、健康供者的外周血或婴儿脐带血中分离得到外周血单个核细胞；将所得外周血单个核细胞加入可用于淋巴细胞、树突状细胞或DC细胞的无血清细胞培养基中，再加入抗γδTCR单克隆抗体、含氮二膦酸盐类药物或帕米磷酸盐类药物预活化PBMC中的Vγ9Vδ2T细胞和NKT细胞，之后再加入rhIL-2或rhIL-15进行Vγ9Vδ2T细胞和NKT细胞的选择性体外活化扩增；
2)用携带有嵌合抗原受体的基因序列的慢病毒载体转导步骤1)所得包含Vγ9Vδ2T细胞和NKT细胞的混合细胞，即得包含CAR-Vγ9Vδ2T细胞和CAR-NKT细胞的混合细胞，其中嵌合抗原受体与靶向表面抗原可特异性结合；
其中，步骤1)中，使用的抗γδTCR单克隆抗体、含氮二膦酸盐类药物或帕米磷酸盐类药物加入细胞培养基后的浓度为1-10μM；所述含氮二膦酸盐类药物为帕米膦酸二钠；
所述预活化、选择性体外活化扩增的条件均为在37℃、5％二氧化碳的培养箱中进行；在预活化12-36h后加入rhIL-2或rhIL-15，选择性体外活化扩增Vγ9Vδ2T细胞和NKT细胞7天以上；
步骤2)中，携带有嵌合抗原受体的基因序列的慢病毒载体转导步骤1)所得包含Vγ9Vδ2T细胞和NKT细胞的混合细胞的具体步骤为：收集包含Vγ9Vδ2T细胞和NKT细胞的混合细胞，调整包含Vγ9Vδ2T细胞和NKT细胞的混合细胞的浓度至5×106个/ml，携带有嵌合抗原受体的基因序列的慢病毒载体和混合细胞以1:4的体积比混合静置6-12h；收集细胞并用PBS缓冲液清洗，换可用于淋巴细胞、树突状细胞或DC细胞的新鲜无血清细胞培养基保持72小时。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述无血清细胞培养基选自德国Cellgenix公司的cellgrowSCGM，日本TAKARA公司的GT-T551H3，日本KOHJIN公司的KBM581，美国GIBCO公司的AIM-V、瑞士LONZA公司的X-Vivo15中的一种或几种。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，将所得外周血单个核细胞加入可用于淋巴细胞、树突状细胞或DC细胞的无血清细胞培养基中，使外周血单个核细胞在无血清细胞培养基中的浓度为(1-9)×106个/ml。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，预活化前所述无血清细胞培养基中还加入血浆，使血浆在无血清细胞培养基中的浓度为2-10％，且所述血浆与外周血单个核细胞来自于同一血液供体。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，加入rhIL-2使其在细胞培养基中的浓度为300-1000U/ml或加入rhIL-15使其在细胞培养基中的浓度为5-50ng/ml。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述靶向表面抗原为CD19。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，可与CD19特异性结合的嵌合抗原受体的基因序列如SEQ ID:1所示。
8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，可与CD19特异性结合的嵌合抗原受体的氨基酸序列如SEQ ID:2所示。
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