CN116761893A - 转导免疫细胞的方法 - Google Patents

Abstract

本文提供用逆转录病毒载体转导免疫细胞，例如T细胞以表达外源基因产物，例如嵌合抗原受体(CAR)的改进方法。本文提供增加转导效率，由此增加群体中表达外源基因产物的免疫细胞的百分比的方法。本文还提供相关细胞、细胞群体、组合物和使用方法。

Description

转导免疫细胞的方法

相关申请交叉引用

本申请主张2021年1月28申请的美国临时申请第63/142,730号；和2022年1月24日申请的美国临时申请第63/302,225号的优先权，所述两个临时申请的内容以全文引用的方式并入本文中。

技术领域

本公开涉及用逆转录病毒载体转导免疫细胞，例如T细胞以表达基因产物，例如嵌合抗原受体(CAR)基因产物的方法。

背景技术

在过继性细胞疗法中，自体和同种异体免疫细胞可以经遗传修饰以表达使得细胞能够执行新治疗功能的合成蛋白质。免疫细胞可以经基因工程改造以表达嵌合抗原受体(“CAR”)，即包含抗原识别部分和T细胞活化结构域的融合蛋白。含有CAR的经工程改造的免疫细胞，例如CAR-T细胞(“CAR-T”)具有抗原特异性和保持或增强的识别并杀伤靶细胞，例如癌细胞的能力。免疫细胞可通过转导进行工程改造，其中将编码CAR的核酸经由病毒载体引入免疫细胞中。先前的为了CAR T免疫疗法转导免疫细胞，特别是以制造规模转导同种异体免疫细胞的方法可能会效率低下，产生不一致的结果且通常使用提高加工成本和复杂性的试剂。

因此，仍需要一种产生CAR-T细胞的方法，其中免疫细胞转导效率稳定且一致，并且比当前方法更简单且更便宜。

发明内容

本文描述用病毒载体转导免疫细胞从而提供经遗传修饰的免疫细胞群体的改进方法，所述经遗传修饰的免疫细胞群体具有较高百分比的表达外源基因产物的细胞；包含较高百分比的外源基因产物阳性细胞的细胞群体；和采用由所公开的方法制备的细胞群体的治疗方法。另外，所描述的方法提供了表达外源基因产物的细胞的百分比在每次生产操作之间更一致的经遗传修饰的细胞群体，和/或更便宜和更简单的转导方法。举例来说，本文描述特别适于T细胞逆转录病毒载体转导的方法，所述方法可用于制造适用于采用嵌合抗原受体的同种异体细胞疗法(例如同种异体CAR-T细胞疗法)中的细胞。

在一个方面中，提供一种用逆转录病毒载体转导细胞群体的方法，其中所述载体包含对于所述细胞为外源性的核酸，所述方法包含：a)选择所述细胞群体，其中所选择的细胞群体包含T淋巴细胞、辅助T细胞、肿瘤细胞、记忆T细胞、细胞毒性T细胞、自然杀伤T细胞、外周血淋巴细胞、外周血单核细胞、树突状细胞或自然杀伤细胞，或其混合物；和b)在细胞培养基中，在7.0至7.9的起始pH范围内的起始pH下将所选择的细胞群体与所述逆转录病毒载体一起培养，并在转导培养步骤的至少第一个小时内将所述起始pH维持在所述起始pH范围内，以产生经转导细胞群体，所述经转导细胞群体包含表达由所述外源性核酸编码的基因产物的细胞。

在一个实施例中，将所述转导方法的起始pH维持在7.0至7.9的起始pH范围内，保持至少1、2、4、6、8、10、12、16、18、20、22或24小时。在一些实施例中，将所述起始pH维持在所述起始pH范围内，保持至少约1、约2、约4、约6、约8、约10、约12、约14、约16、约18、约20、约22、约24、约36、约48、约72或约96小时至不超过约168小时。

在一些实施例中，将所述起始pH维持在所述起始pH范围内，直至转导培养步骤结束。在一些实施例中，转导培养步骤进行至少1、2、4、6、8、12、14、16、18、20、22、24、36、48、72或96小时。在一些实施例中，pH被动地控制。在一些实施例中，pH用生物反应器主动地控制。

在一些实施例中，本公开的转导方法包含以约0.25、约0.5、约1、约5、约10、约15、约20、约25、约30、约35、约40、约45、约或约50至约55、约60、约65、约70、约75、约80、约85、约90、约95、约100、约125、约150、约175、约200、约225或约250的MOI培养所选择的细胞群体。在一些实施例中，MOI是转导程序中功能性病毒粒子与靶细胞的总数的比率。在一些实施例中，待添加至转导程序中的功能性病毒粒子的滴度通过qPCR测定。

在本公开的一些实施例中，所述外源性核酸编码嵌合抗原受体(CAR)。在一些实施例中，所述外源性核酸编码对单克隆抗体具有特异性的表位、自杀多肽、诱导性“开启(on)”或“加速剂(accelerator)”开关或控制开关，例如二聚化结构域。

在一些实施例中，所选择的细胞群体在容器中培养，其中所述容器是细胞培养板、细胞培养深孔板、细胞培养室(cell stack)、受控生物反应器、摇瓶或透气袋。在一些实施例中，转导培养步骤包含在约0.75升体积至约250升体积的细胞培养基中将所选择的细胞群体与所述逆转录病毒载体一起培养。在一些实施例中，转导培养步骤包含在约0.5升体积至约10升体积的细胞培养基中将所选择的细胞群体与所述逆转录病毒载体一起培养。

在一些实施例中，本公开的方法中使用的逆转录病毒载体是慢病毒载体。

在一些实施例中，在转导培养步骤起始之后3至18天，至少35％至95％、40％至95％、50％至95％、60％至95％、70％至95％的经转导细胞群体表达外源性核酸基因产物。在一些实施例中，在转导培养步骤起始之后7至18天，至少35％至95％、40％至95％、50％至95％、60％至95％、70％至95％的经转导细胞群体表达外源性核酸基因产物。

在一些实施例中，所述细胞培养基在转导培养步骤期间任选地包含共定位剂，例如在转导培养步骤期间包含纤维连接蛋白、纤维连接蛋白衍生物、聚凝胺或试剂。

在一些实施例中，所述细胞培养基在转导培养步骤期间不包含共定位剂，例如纤维连接蛋白或纤维连接蛋白衍生物，例如试剂。

在一些实施例中，所述细胞培养基在转导培养步骤期间不包含共定位剂。

在一些实施例中，在转导之前或期间没有向所述细胞培养基中添加聚阳离子，例如聚凝胺、硫酸鱼精蛋白或DEAE-葡聚糖。

在一些实施例中，所选择的细胞群体为同种异体细胞群体。在一些实施例中，所选择的细胞群体为自体细胞群体。

在一个方面中，提供一种转导第一和第二细胞群体的方法，其中所述第一和第二细胞群体通过本公开的相同方法转导且由此第一与第二经转导细胞群体中表达外源性核酸基因产物的经转导细胞群体的百分比不会相差超过2％至5％、5％至10％、10％至20％或20％至30％。

在一些实施例中，本公开的方法提供一种经转导细胞群体，其中经转导细胞群体的细胞包含与通过本公开的相同方法转导的细胞相比减少的载体拷贝数，其中所述相同方法的转导培养步骤的起始pH小于7.0。

在本公开的一个方面中，提供一种用逆转录病毒载体转导细胞毒性T细胞群体的方法，所述载体包含对于所述细胞毒性T细胞为外源性的核酸，所述方法包含在细胞培养基中，在7.0至7.9的起始pH范围内的起始pH下将所述细胞毒性T细胞群体与所述逆转录病毒载体一起培养，并在转导培养步骤的至少第一个小时内将所述起始pH维持在所述起始pH范围内，以产生经转导细胞毒性T细胞群体，所述经转导细胞毒性T细胞群体包含表达由所述外源性核酸编码的基因产物的细胞，且其中所述细胞培养基不包含共定位剂。

在本公开这个方面的一些实施例中，将所述起始pH维持在7.0至7.9的起始pH范围内，保持至少1、2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22或24小时。在一些实施例中，将细胞毒性T细胞培养基的起始pH维持在所述起始pH范围内，保持至少约1、约2、约4、约6、约8、约10、约12、约14、约16、约18、约20、约22、约24、约36、约48、约72或约96小时至不超过约168小时。

在这个方面的一些实施例中，将所述细胞毒性T细胞培养基的起始pH维持在所述起始pH范围内，直至转导培养步骤结束。在一些实施例中，转导培养步骤进行至少1、2、4、6、8、12、14、16、18、20、22、24、36、48、72或96小时。

在本公开这个方面的一些实施例中，pH被动地控制。在一些实施例中，pH主动地控制。

在一些实施例中，所述细胞毒性T细胞培养基在转导培养步骤期间不包含共定位剂，例如纤维连接蛋白或纤维连接蛋白衍生物，例如

在一些实施例中，在转导之前或期间没有向所述细胞毒性T细胞培养基中添加聚阳离子，例如聚凝胺、硫酸鱼精蛋白或DEAE-葡聚糖。

在本公开这个方面的一些实施例中，所述细胞毒性T细胞群体以约0.25、约0.5、约1、约5、约10、约15、约20、约25、约30、约35、约40、约45、约或约50至约55、约60、约65、约70、约75、约80、约85、约90、约95、约100、约125、约150、约175、约200、约225或约250的MOI培养。在一些实施例中，MOI是转导程序中功能性病毒粒子与细胞毒性T细胞的总数的比率。

在本公开这个方面的一些实施例中，所述外源性核酸编码嵌合抗原受体。在一些实施例中，所述外源性核酸编码对单克隆抗体具有特异性的表位、自杀多肽、诱导性“开启”或“加速剂”开关或控制开关，例如二聚化结构域。

在本公开这个方面的一些实施例中，所述细胞毒性T细胞群体在容器中培养，其中所述容器是细胞培养板、细胞培养深孔板、细胞培养室、受控生物反应器、摇瓶或透气袋。在一些实施例中，转导培养步骤包含在约0.75升体积至约250升体积的细胞培养基中将所述细胞毒性T细胞群体与所述逆转录病毒载体一起培养。

在一些实施例中，用于本公开的方法中的逆转录病毒载体是慢病毒载体。

在本公开这个方面的一些实施例中，在转导培养步骤起始之后3至18天，至少40％至95％、50％至95％、60％至95％、70％至95％的经转导细胞毒性T细胞群体表达外源性核酸基因产物。在一些实施例中，在转导培养步骤起始之后7至18天，至少40％至95％、50％至95％、60％至95％、70％至95％的经转导细胞毒性T细胞群体表达外源性核酸基因产物。

在一些实施例中，待转导的细胞毒性T细胞群体为同种异体细胞毒性T细胞群体。在一些实施例中，待转导的细胞毒性T细胞群体为自体细胞毒性T细胞群体。

在本公开的一个方面中，提供一种转导第一和第二细胞毒性T细胞群体的方法，其中所述第一和第二细胞毒性T细胞群体通过本公开的相同方法转导，由此第一与第二经转导细胞毒性T细胞群体中表达外源性核酸基因产物的经转导细胞毒性T细胞群体的百分比不会相差超过2％至5％、5％至10％、10％至20％或20％至30％

在本公开的一个方面中，提供一种用逆转录病毒载体转导外周血单核细胞群体的方法，所述载体包含对于所述外周血单核细胞为外源性的核酸，所述方法包含在细胞培养基中，在7.0至7.9的起始pH范围内的起始pH下将所述外周血单核细胞群体与所述逆转录病毒载体一起培养，并在转导培养步骤的至少第一个小时内将所述起始pH维持在所述起始pH范围内，以产生经转导外周血单核细胞群体，所述经转导外周血单核细胞群体包含表达由所述外源性核酸编码的基因产物的细胞，且其中所述细胞培养基不包含共定位剂。

在本公开这个方面的一些实施例中，将所述起始pH维持在7.0至7.9的起始pH范围内，保持至少1、2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22或24小时。在一些实施例中，将所述起始pH维持在所述起始pH范围内，保持至少约1、约2、约4、约6、约8、约10、约12、约14、约16、约18、约20、约22、约24、约36、约48、约72或约96小时至不超过约168小时。

在这个方面的一些实施例中，将所述起始pH维持在所述起始pH范围内，直至转导培养步骤结束。在一些实施例中，转导培养步骤进行至少1、2、4、6、8、12、14、16、18、20、22、24、36、48、72或96小时。

在本公开这个方面的一些实施例中，pH被动地控制。在一些实施例中，pH主动地控制。

在一些实施例中，所述外周血单核细胞培养基在转导培养步骤期间不包含共定位剂，例如纤维连接蛋白或纤维连接蛋白衍生物，例如

在一些实施例中，在转导之前或期间没有向所述外周血单核细胞培养基中添加聚阳离子，例如聚凝胺、硫酸鱼精蛋白或DEAE-葡聚糖。

在本公开这个方面的一些实施例中，所述外周血单核细胞群体以约0.25、约0.5、约1、约5、约10、约15、约20、约25、约30、约35、约40、约45、约或约50至约55、约60、约65、约70、约75、约80、约85、约90、约95、约100、约125、约150、约175、约200、约225或约250的MOI培养。在一些实施例中，MOI是转导程序中功能性病毒粒子与外周血单核细胞的总数的比率。

在本公开这个方面的一些实施例中，所述外源性核酸编码嵌合抗原受体。在一些实施例中，所述外源性核酸编码对单克隆抗体具有特异性的表位、自杀多肽、诱导性“开启”或“加速剂”开关或控制开关，例如二聚化结构域。

在本公开这个方面的一些实施例中，所述外周血单核细胞群体在容器中培养，其中所述容器是细胞培养板、细胞培养深孔板、细胞培养室、受控生物反应器、摇瓶或透气袋。在一些实施例中，转导培养步骤包含在约0.75升体积至约250升体积的细胞培养基中将所述外周血单核细胞群体与所述逆转录病毒载体一起培养。

在一些实施例中，用于本公开这个方面的方法中的逆转录病毒载体是慢病毒载体。

在本公开这个方面的一些实施例中，在转导培养步骤起始之后3至18天，至少40％至95％、50％至95％、60％至95％、70％至95％的经转导外周血单核细胞群体表达外源性核酸基因产物。在一些实施例中，在转导培养步骤起始之后7至18天，至少40％至95％、50％至95％、60％至95％、70％至95％的经转导外周血单核细胞群体表达外源性核酸基因产物。

在一些实施例中，待转导的外周血单核细胞群体为同种异体外周血单核细胞群体。在一些实施例中，待转导的外周血单核细胞群体为自体外周血单核细胞群体。

在本公开的一个方面中，提供一种转导第一和第二外周血单核细胞群体的方法，其中所述第一和第二外周血单核细胞群体通过本公开的相同方法转导，由此第一和第二经转导外周血单核细胞群体中表达外源性核酸基因产物的经转导外周血单核细胞群体的百分比不会相差超过2％至5％、5％至10％、10％至20％或20％至30％。

在本公开的一个方面中，提供一种用逆转录病毒载体转导衍生自诱导性多能干细胞的T细胞群体的方法，所述载体包含对于衍生T细胞为外源性的核酸，所述方法包含在细胞培养基中，在7.0至7.9的起始pH范围内的起始pH下将衍生T细胞群体与所述逆转录病毒载体一起培养，并在转导培养步骤的至少第一个小时内将所述起始pH维持在所述起始pH范围内，以产生经转导的衍生T细胞群体，所述经转导的衍生T细胞群体包含表达由所述外源性核酸编码的基因产物的细胞，且其中所述细胞培养基不包含共定位剂。

在本公开这个方面的一些实施例中，将所述起始pH维持在7.0至7.9的起始pH范围内，保持至少1、2、4、6、8、10、12、16、18、20、22或24小时。在一些实施例中，将衍生自诱导性多能干细胞的T细胞群体的培养基的起始pH维持在所述起始pH范围内，保持至少约1、约2、约4、约6、约8、约10、约12、约14、约16、约18、约20、约22、约24、约36、约48、约72或约96小时至不超过约168小时。

在这个方面的一些实施例中，将衍生T细胞培养基的起始pH维持在所述起始pH范围内，直至转导培养步骤结束。在一些实施例中，转导培养步骤进行至少1、2、4、6、8、12、14、16、18、20、22、24、36、48、72或96小时。

在本公开这个方面的一些实施例中，衍生T细胞培养基的pH被动地控制。在一些实施例中，pH主动地控制。

在本发明这个方面的一些实施例中，衍生T细胞培养基在转导培养步骤期间不包含共定位剂，例如纤维连接蛋白或纤维连接蛋白衍生物，例如

在一些实施例中，在转导之前或期间没有向衍生T细胞培养基中添加聚阳离子，例如聚凝胺、硫酸鱼精蛋白或DEAE-葡聚糖。

在本公开这个方面的一些实施例中，衍生T细胞群体以约0.25、约0.5、约1、约5、约10、约15、约20、约25、约30、约35、约40、约45、约或约50至约55、约60、约65、约70、约75、约80、约85、约90、约95、约100、约125、约150、约175、约200、约225或约250的MOI培养。在一些实施例中，MOI是转导程序中功能性病毒粒子与衍生自诱导性多能干细胞的T细胞的总数的比率。

在本公开这个方面的一些实施例中，所述外源性核酸编码嵌合抗原受体。在一些实施例中，所述外源性核酸编码对单克隆抗体具有特异性的表位、自杀多肽、诱导性“开启”或“加速剂”开关或控制开关，例如二聚化结构域。

在本公开这个方面的一些实施例中，衍生T细胞群体在容器中培养，其中所述容器是细胞培养板、细胞培养深孔板、细胞培养室、受控生物反应器、摇瓶或透气袋。在一些实施例中，转导培养步骤包含在约0.5升体积至约10升体积的细胞培养基中将衍生T细胞群体与所述逆转录病毒载体一起培养。

在一些实施例中，用于本公开的方法中的逆转录病毒载体是慢病毒载体。

在本公开这个方面的一些实施例中，在转导培养步骤起始之后3至18天，35％至约95％、约40％至约95％、约50％至约95％、约60％至约95％或约70％至约95％的经转导的衍生T细胞群体表达外源性核酸基因产物。在一些实施例中，在转导培养步骤起始之后7至18天，约35％至约95％、约40％至约95％、约50％至约95％、约60％至约95％或约70％至约95％的经转导的衍生T细胞群体表达外源性核酸基因产物。

在一些实施例中，待转导的衍生T细胞群体为同种异体衍生T细胞群体。在一些实施例中，待转导的衍生T细胞群体为自体衍生T细胞群体。

在本公开的一个方面中，提供一种转导第一和第二衍生T细胞群体的方法，其中所述第一和第二衍生T细胞群体通过本公开的相同方法转导，由此第一与第二经转导的衍生T细胞群体中表达外源性核酸基因产物的经转导的衍生T细胞群体的百分比不会超过2％至5％、5％至10％、10％至20％或20％至30％。

在本发明的一些实施例中，提供一种通过本公开的方法产生的经遗传修饰的细胞。在本发明的另一个实施例中，提供一种通过本公开的方法产生的经遗传修饰的细胞群体。在另一个实施例中，提供一种治疗组合物，其包含通过本发明的方法产生的细胞或细胞群体。在另一个实施例中，提供一种治疗方法，其包含向有需要的受试者施用治疗有效量的通过本发明的方法产生的细胞、细胞群体或治疗组合物。

附图说明

图1显示用于分离PBMC，活化、转导、转染、扩增和收获经分离PBMC中的T细胞的示范性方案。

图2A和2B显示，经通过ANOVA分析所测定，在研究第11天，活CAR+T细胞的平均百分比当在pH 7.1下转导细胞时(图2A)为81.28587或当在pH 6.6下转导时(图2B)为23.0387。

图2C显示pH、慢病毒载体％(v/v)(以LVV指示)、试剂浓度(μg/mL)(以RN指示)和容器类型对活CAR+T细胞百分比的主要影响和双因素相互作用的p值。

图3显示在研究第7天和第14天，在pH 7.2±0.1下进行1、2、4、6和8小时转导时间(水平轴)对CAR+T细胞百分比(垂直轴)的影响。

具体实施方式

本文提供转导免疫细胞，特别是T细胞的改进方法，所述改进方法增加转导效率和/或改进每次生产操作之间外源性核酸表达量的一致性，同时降低加工成本和复杂性。

本文所提供的说明性方法，典型地为离体方法，包括用逆转录病毒载体(retrovirus vector)或逆转录病毒载体(retroviral vector)转导活化T细胞以产生经遗传修饰的T细胞。在说明性实施例中，转导步骤可在无共定位剂情况下进行。在其它说明性实施例中，转导步骤可在6.9至7.8的pH或7.0至7.9的pH下进行。典型地，此类方法可包括富集外周血单核细胞(PBMC)以分离出包含可用于活化步骤中的T细胞的PBMC。此外，在说明性实施例中，所述方法可包括扩增经遗传修饰的T细胞。在其它说明性实施例中，本文所提供的方法可进一步包含破坏T细胞中的内源基因。在本文所提供的方法的说明性实施例中，T细胞可经活化、转导且典型地扩增。说明性实施例中的此类T细胞可经遗传修饰以表达CAR。

定义

尽管本公开中使用的术语是本领域内的标准术语，但某些术语的定义提供于本文中以确保权利要求书含义的清晰度和明确性。单位、前缀和符号可以其SI公认的形式表示。如本文中所述的，任何浓度范围、百分比范围、比率范围或整数范围应当理解为包括在所述范围内的任何整数的值，并且在适当时，包括其分数(例如整数的十分之一和百分之一)，除非另外指出。在此使用的小节标题仅是为了编排的目的并且不应该被解释为对所述主题进行限制。

如在本公开中使用的，除非本文另有明确规定，否则以下术语中的每一个应具有下文所述的含义。贯穿本公开内容阐述了另外的定义。

除非另外指出，否则术语“a(一/一种)”或“an(一/一种)”应理解为意指“中的至少一个或多个”。

如在整个说明书中权利要求书所使用的术语“约”表示本领域的技术人员熟悉且可接受的准确性间隔。一般来说，此准确性间隔为加或减15％。

术语“活化”或“活化的”表示免疫细胞(例如T细胞)的状态，其已被充分刺激以诱导可检测的细胞增殖。活化还可以与诱导的细胞因子产生和可检测的效应子功能有关。术语“活化的T细胞”尤其表示正在经历细胞分裂的T细胞。T细胞活化的特征在于一种或多种生物标志物的T细胞表达增加，包括、但不限于，CD57、PD1、CD107a、CD25、CD137、CD69和/或CD71。

“施用”是指使用本领域技术人员已知的各种方法和递送系统中的任何一种将药剂物理引入至受试者。通过本文公开的方法制备的T细胞的示范性施用途径包括静脉内、肌肉内、皮下、腹膜内、脊柱或其它肠胃外施用途径，例如通过注射或输注。如本文所用，短语“肠胃外施用”意指除了肠内施用和局部施用之外的、通常通过注射进行的施用模式，且包括但不限于静脉内、肌内、动脉内、鞘内、淋巴管内、病灶内、囊内、眼眶内、心内、皮内、腹膜内、经气管、皮下、表皮下、关节内、囊下、蛛网膜下、脊柱内、硬膜外以及胸骨内注射和输注，以及体内电穿孔。还可以执行施用，例如，一次、多次，和/或在一个或多个延长的时间段中。

术语“同种异体的”表示源自一个个体的任何材料，然后将其引入同一物种的另一个个体，例如，同种异体的T细胞移植或疗法。

术语“抗体”(Ab)包括、但不限于特异性地结合抗原的免疫球蛋白。一般而言，抗体可以包含通过二硫键互连的至少两条重(H)链和两条轻(L)链。每条H链包含重链可变区(在本文中缩写为VH)和重链恒定区。重链恒定区可以包含三个或四个恒定结构域CH1、CH2 CH3和/或CH4。每条轻链包含轻链可变区(在本文中缩写为VL)和轻链恒定区。轻链恒定区可以包含一个恒定结构域CL。VH和VL区域可以进一步细分为被称为互补性决定区(CDR)的高变异性区域，其散布有更保守的被称为框架区(FR)的区域。每个VH和VL包含三个CDR和四个FR，从氨基端至羧基端按照以下顺序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重链和轻链的可变区含有与抗原相互作用的结合结构域。术语“抗体”包括例如天然存在和非天然存在的Ab；单克隆和多克隆Ab；双特异性抗体；微型抗体；结构域抗体；嵌合和人源化Ab；人类或非人类Ab；完全合成的Ab(有时称为“抗体模拟物”)；骆驼抗体；抗体融合物(有时称为“抗体结合物”)；和单链Ab。非人类Ab可以通过重组方法进行人源化，以降低其在人体内的免疫原性。

如本文所使用的“免疫球蛋白”可以来源于任何通常已知的同种型，其包括但不限于IgA、分泌性IgA、IgG和IgM。IgG亚类也是本领域技术人员众所周知的，并且包括、但不限于人IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。“同种型”表示由重链恒定区基因编码的Ab类别或亚类(例如，IgM或IgG1)。

术语“自体”表示源自随后将重新引入该材料的相同个体的任何材料。例如，经工程改造的自体细胞疗法(eACT^TM)涉及从供体(例如患者)收集淋巴细胞，然后将其工程改造以表达例如CAR构筑体，并接着再施用回同一供体，例如患者。

如本文所使用，术语“共定位剂”是指促进例如逆转录病毒或慢病毒粒子的病毒载体或粒子与例如免疫细胞如T细胞的靶细胞共定位的试剂，且可包括例如纤维连接蛋白或纤维连接蛋白衍生物，例如试剂。

如本文所用，术语“制造规模转导体积”是指500mL至5升的体积。

术语“感染倍率”(在下文中为“MOI”)是指在例如转导程序的程序的培养基中，例如病毒粒子的感染物与例如细胞的感染目标的比率。在一些实施例中，MOI可等于在转导程序期间添加至靶细胞的总数中的功能性病毒粒子的数目。在一些实施例中，添加至转导程序中的功能性病毒粒子的数目通过确定所述功能性病毒粒子的滴度测定。在一些实施例中，功能性病毒粒子的滴度通过使用qPCR测定在使用本领域中已知的技术稳定转导的标准细胞系中每个细胞整合的核酸病毒拷贝的数目来测定。例如参见Paugh,B.S.等人,SciRep11,389(2021)，以全文引用的方式并入本文中。在一些实施例中，病毒粒子为逆转录病毒粒子。在一些实施例中，病毒粒子为慢病毒粒子。

如本文所使用，pH控制可为主动的，例如其中细胞培养物pH在具有pH反馈控制的生物反应器中连续地控制；或为被动的，例如其中细胞培养物pH在培养起始时，通过在组织培养恒温箱中调整缓冲细胞培养基和CO₂％以达成预先确定的pH来控制且不进行进一步控制。

术语“选择性”或“特异性”和相关衍生词在本文中可互换地使用。当一个分子，例如抗原结合结构域与一个目标的结合比其与另一目标的结合要紧密时，认为其具有选择性或特异性。

如本文所使用，术语载体拷贝数(“VCN”)是指每个细胞中载体拷贝，例如病毒载体拷贝的数目。

术语“病毒载体”与“逆转录病毒载体”在本文中可互换地使用，表示衍生自逆转录病毒的任何形式的核酸且用于将遗传物质经由转导转移至细胞中。所述术语涵盖病毒载体核酸，例如DNA和RNA；这些核酸的囊封形式；和病毒载体核酸已经包装的病毒粒子。

免疫细胞

在对本文所述的免疫细胞进行体外操纵或遗传修饰之前，可从受试者获得细胞。免疫细胞可以获自同种异体或自体源受试者(即，获自健康供体或患者)。

免疫细胞可从多个来源获得，包括外周血单核细胞、骨髓、淋巴结组织、脐带血、胸腺组织、来自感染部位的组织、腹水、胸腔积液、脾组织和肿瘤。在一些实施例中，可使用任何数目的所属领域的技术人员可获得的并已知的T细胞系。在一些实施例中，细胞可以来源于健康供体、来源于诊断患有癌症的患者或来源于诊断患有感染的患者。在一些实施例中，细胞可为展现不同表型特征的混合细胞群体的部分。

在一些实施例中，免疫细胞包含T细胞。T细胞可从多个来源获得，包括外周血单核细胞(PBMC)、骨髓、淋巴结组织、脐血、胸腺组织、来自感染部位的组织、腹水、胸腔积液、脾组织和肿瘤。在某些实施例中，可使用技术人员已知的任何数目的技术，如FICOLL^TM分离，从收集于受试者的血液中获得T细胞。

在一些实施例中，免疫细胞可衍生自干细胞，例如祖细胞、骨髓干细胞、诱导性多能干细胞、iPSC、造血干细胞和间充质干细胞。iPS细胞和其它类型的干细胞可为经培养的永生细胞系或自患者直接分离。在一些实施例中，免疫细胞为衍生自诱导性多能干细胞的T细胞。用于分离、发育和/或培养干细胞的各种方法为所属领域中已知且可用于实践本公开。

在一些实施例中，免疫细胞为衍生自再编程T细胞的诱导性多能干细胞(iPSC)。在一些实施例中，源材料可为衍生自T细胞或非T细胞的诱导性多能干细胞(iPSC)。或者，源材料可为B细胞，或来自外周血单核细胞分离株、造血祖细胞、造血干细胞、间充质干细胞、脂肪干细胞或任何其它体细胞类型的任何其它细胞。

血液收集

在一些实施例中，待工程改造的T细胞获自PBMC。在一些实施例中，PBMC可通过所属领域中已知的任何适合方法自受试者收集或获得。举例来说，在一些实施例中，可通过静脉穿刺或用于收集血液和/或PBMC样品的任何其它血液收集方法来收集血液。

在一些实施例中，PBMC可通过单采血液成分术自受试者的循环血液获得。单采血液成分术产物通常含有淋巴细胞，包括T细胞、单核细胞、粒细胞、B细胞、其它有核白细胞、红细胞和血小板。在某些实施例中，通过单采血液成分术，特别是白细胞去除术收集的细胞可经洗涤以去除血浆部分，且放置于适当缓冲液或培养基中以进行后续加工。

T细胞富集

在某些实施例中，例如，使用经由PERCOLL^TM梯度的离心，通过裂解红细胞和消耗单核细胞，从PBMC中分离T细胞。特定T细胞亚群(例如CD28+、CD4+、CDS+、CD45RA-、CD45RO+、CDS+、CD62-、CD95-、CD95+、IL2R+、IL2R-、CCR7+、CCR7-、CDL-、CD62L+和其组合)可通过所属领域中已知的阳性或阴性选择技术进一步分离。在一个实例中，T细胞亚群为CD45RA+、CD95-、IL-2R-、CCR7+、CD62L+。在一个实例中，T细胞亚群为CD45RA+、CD95+、IL-2R+、CCR7+、CD62L+。在一个实例中，T细胞亚群为CD45RO+、CD95+、IL-2R+、CCR7+、CD62L+。在一个实例中，T细胞亚群为CD45RO+、CD95+、IL-2R+、CCR7-、CD62L-。在一个实例中，T细胞亚群为CD45RA+、CD95+、IL-2R+、CCR7-、CD62L-。例如，T细胞群体通过阴性选择的富集可用针对对于阴性选择的细胞独特的表面标记的抗体的组合实现。本文使用的方法之一是通过负磁免疫粘附或流式细胞术进行细胞分选和/或选择，所述负磁免疫粘附或流式细胞术使用针对在阴性选择的细胞上存在的细胞表面标记的单克隆抗体混合物。举例来说，为了通过阴性选择富集CD4+细胞，单克隆抗体混合液典型地包括针对CD14、CD20、CDI lb、CD16、HLA DR和CD8的抗体。流式细胞术和细胞分选还可用于分离用于本公开的方法和实施例中的所关注的细胞群体。

PBMC可使用如本文所描述的方法直接用于遗传修饰，例如引入CAR。应了解，PBMC还可包括其它细胞毒性淋巴细胞，如NK细胞或NKT细胞。可将携带如本文所公开的嵌合抗原受体的编码序列的表达载体引入人类供体T细胞、NK细胞或NKT细胞的群体中。可使用流式细胞术将携带表达载体的成功转导的T细胞分选以分离CD3阳性T细胞，并接着进一步增殖以增加除使用抗CD3抗体和IL-2或所属领域中已知的如本文中其它地方所述的其它方法的细胞活化之外的这些CAR表达T细胞的数目。

在某些实施例中，在分离PBMC之后，可进一步分离T淋巴细胞，并且在遗传修饰和/或扩增之前或之后，可将细胞毒性和辅助T淋巴细胞两者分选为原生、记忆和效应T细胞亚群。

在一些实施例中，CD8+细胞通过鉴别与这些类型的CD8+细胞中的每一种相关的特有细胞表面抗原而进一步分选成原初细胞、干细胞记忆细胞、中央记忆细胞和效应细胞。在一些实施例中，中央记忆T细胞的表型标记的表达包括CD45RO、CD62L、CCR 7、CD28、CD3和CD127，且对于颗粒酶B呈阴性。在一些实施例中，干细胞记忆T细胞为CD45RO-、CD62L+、CD8+T细胞。在一些实施例中，中央记忆T细胞是CD45RO+、CD62L+、CD8+T细胞。在一些实施例中，效应T细胞对于CD62L、CCR 7、CD28和CD127呈阴性且对于颗粒酶B和穿孔素(perforin)呈阳性。

在某些实施例中，CD4+T细胞进一步分选成亚群。例如，通过鉴定具有特有细胞表面抗原的细胞群体，CD4+T辅助性细胞可以分选为原初细胞、中央记忆细胞和效应细胞。

细胞活化和扩增

本公开的免疫细胞可以在免疫细胞的遗传修饰之前或之后活化和扩增。图1显示本公开的可用于活化、转导、转染和扩增免疫细胞的示范性方案。在一个实施例中，T细胞的体外转导、转染、培养和/或扩增是在不存在非人动物衍生的产物(如小牛血清和胎牛血清)的情况下进行的。

一般来说，本公开的经工程改造的免疫细胞可例如通过与刺激T细胞表面上的CD3TCR复合物和共刺激分子的药剂接触以产生T细胞的活化信号来扩增。例如，如钙离子载体A23187、佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯(PMA)或促有丝分裂凝集素样植物血凝素(PHA)的化学物质可用于产生T细胞的活化信号。

在一些实施例中，T细胞群体可在体外通过与例如固定在表面上的抗CD3抗体(例如OKT3抗体)或其抗原结合片段、或抗CD2抗体接触，或通过与蛋白激酶C活化剂(例如苔藓虫素)以和钙离子载体接触来刺激。为了在T细胞的表面上共刺激辅助分子，使用与辅助分子结合的配体。举例来说，T细胞群体可与抗CD3抗体(例如OKT3抗体)和抗CD28抗体在适于刺激T细胞增殖的条件下接触。抗CD3抗体和抗CD28抗体可安置于珠粒，例如塑料或磁珠上，或板或其它衬底上。适合T细胞培养的条件包括适当培养基(例如最小必需培养基或RPMI培养基1640或X-vivo 15(Lonza))，所述培养基含有增殖和存活力所需的因子，包括血清(例如胎牛血清或人类血清)、介白素-2(IL-2)、胰岛素、IFN-y、IL-4、IL-7、GM-CSF、IL-10、IL-2、IL-15、TGFb和TNF，或所属领域的技术人员已知的供细胞生长的任何其它添加剂。用于细胞生长的其它添加剂包括(但不限于)表面活性剂、血浆蛋白剂(plasmanate)和还原剂，如N-乙酰基-半胱氨酸和2-巯基乙醇。培养基可包括RPMI 1640、AlM-V、DMEM、MEM、a-MEM、F-12、X-Vivo 15和X-Vivo 20、Optimizer，其中添加有氨基酸、丙酮酸钠和维生素，无血清或补充有适量血清(或血浆)或确定的一组激素，和/或足以供T细胞生长和扩增的量的一种或多种细胞因子(例如IL-7和/或IL-15)。抗生素(例如，青霉素和链霉素)仅在实验培养时包括，而在培养待注入受试者体内的细胞时不包括。靶细胞维持在支持生长所需的条件下，例如适当温度(例如37℃)和大气(例如空气加5％ CO2)。已暴露于不同刺激时间的T细胞可展现不同特征。在一些实施例中，本公开的细胞可通过与组织或细胞共培养来扩增。在将细胞施用受试者之后，细胞还可以在体内，例如在受试者的血液中扩增。

适合T细胞培养的条件包括适当培养基(例如最小必需培养基或RPMI培养基1640或X-vivo 15(Lonza))，所述培养基含有增殖和存活力所需的因子，包括血清(例如胎牛血清或人类血清)、介白素-2(IL-2)、胰岛素、IFN-y、IL-4、IL-7、GM-CSF、IL-10、IL-2、IL-15、TGFb和TNF，或所属领域的技术人员已知的供细胞生长的任何其它添加剂。用于细胞生长的其它添加剂包括(但不限于)表面活性剂、血浆蛋白剂(plasmanate)和还原剂，如N-乙酰基-半胱氨酸和2-巯基乙醇。培养基可包括RPMI 1640、AIM-V、DMEM、MEM、a-MEM、F-12、X-Vivo15和X-Vivo 20、Optimizer，其中添加有氨基酸、丙酮酸钠和维生素，无血清或补充有适量血清(或血浆)或确定的一组激素，和/或足以供T细胞生长和扩增的量的一种或多种细胞因子(例如IL-7和/或IL-15)。抗生素(例如，青霉素和链霉素)仅在实验培养时包括，而在培养待注入受试者体内的细胞时不包括。靶细胞维持在支持生长所需的条件下，例如适当温度(例如37℃)和大气(例如空气加5％ CO2)。已暴露于不同刺激时间的T细胞可展现不同特征。在一些实施例中，本公开的细胞可通过与组织或细胞共培养来扩增。在将细胞施用受试者之后，细胞还可以在体内，例如在受试者的血液中扩增。

用于活化和扩增T细胞的方法是本领域已知的，并且例如描述于美国专利第6,905,874号；美国专利第6,867,041号；美国专利第6,797,514号；以及WO2012/079000中，所述专利的内容特此以全文引用的方式并入本文中。一般来说，所述方法包括在含适当细胞因子例如IL-2的培养基中，使PBMC或经分离的T细胞与一般附接至塑料或磁珠或其它表面的刺激分子和共刺激分子，例如抗CD3和抗CD28抗体接触。附接至同一珠粒的抗CD3和抗CD28抗体充当“替代”抗原呈现细胞(APC)。一个实例为系统，所述系统是一种用于人类T细胞的生理性活化的CD3/CD28活化剂/刺激剂系统。在其它实施例中，可使用如美国专利第6,040,177号；美国专利第5,827,642号；以及WO2012129514中描述的那些方法用饲养细胞和适当抗体以及细胞因子活化并且刺激T细胞以增殖，所述专利的内容特此以全文引用的方式并入本文中。在另一个实施例中，细胞用如Miltenyi Biotec Inc(Auburn,California)所提供的抗CD3/28纳米规模基质作为TransAct^TMT细胞试剂(参见例如目录号200-076-202MACS GMP T Cell Transact-CRR，目录号130-019-011MACS GMP TCell Transact，供研究用)进行活化和扩增，所述基质包含结合CD3和CD 28的抗体和/或其片段。

转导

本文提供用于遗传修饰免疫细胞的方法，所述免疫细胞包括通过本公开的方法产生的PBMC和T细胞。在本文所公开的方法和组合物的一些实施例中，使T细胞与无复制能力的逆转录病毒载体离体接触以对T细胞进行遗传修饰以使其表达外源基因产物。在一些实施例中，外源基因产物为CAR。

在一些实施例中，外源基因产物是对单克隆抗体具有特异性(即，被单克隆抗体特异性识别)的表位、自杀多肽、诱导性“开启”或“加速剂”开关，例如诱导性半胱天冬蛋白酶-9(美国申请2011/0286980)或胸苷激酶或“关闭(off)”开关。在国际专利公开第WO 2016/120216号中公开了示范性mAb特异性表位，其以全文引用的方式并入本文中。在一些实施例中，外源基因产物为R表位，如RQR8。参见例如WO2013153391A，所述文献以全文引用的方式特此并入。R表位当在CAR免疫细胞的表面上表达时，利妥昔单抗(Rituximab)可结合所述R表位，使CAR免疫细胞溶解。在一些实施例中，外源基因产物是控制开关，例如二聚化结构域。

在一些实施例中，转导可在与执行活化步骤相同的容器中执行，无需去除任何培养基。举例来说，自所收集的血液样品富集和分离的血细胞，例如PBMC，可在透气袋中活化接着与逆转录病毒粒子在同一透气袋中接触。在说明性实施例中，血细胞在与逆转录病毒载体接触之前自包括嗜中性粒细胞在内的粒细胞分开、分离和/或纯化。逆转录病毒载体在其它示范性实施例中可为无复制能力的重组慢病毒粒子，其可被引入含有经活化PBMC的相同透气袋中以形成转导反应混合物。在一些实施例中，逆转录病毒载体在活化步骤期间添加至转导反应混合物中。在一些实施例中，逆转录病毒载体在活化步骤之后添加至转导反应混合物中。在一些实施例中，活化步骤在转导步骤之前抑或同时进行不超过12、24、36、48、60、72、84、96、108、120、132、144或156小时。图1示出示范性CAR T细胞产生方案中的潜在转导时间点。培养基典型地在转导期间存在，例如所属领域中已知的用于离体培养T细胞的培养基，包括基础培养基和补充剂，包括细胞因子，例如本文中更详细地公开，参见例如以上活化和扩增描述。

转导反应在一些实施例中在将逆转录病毒载体添加至T细胞中时开始，所述反应可在23与39℃之间，且在一些示范性实施例中在37℃下孵育。在一些实施例中，转导反应可在37-39℃下进行。在一些实施例中，转导反应在0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0和10.0％ CO₂下孵育。转导反应可孵育至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、24、25、24、36、48小时，至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、72或96小时。在说明性实施例中，转导反应可在起始pH范围内的pH下孵育在1至2、1至3、1至4、1至5、1至6、1至7、1至8、1至9、1至10、4至12、4至14、4至16、4至18、4至20、4至24、4至26、4至28、4至30、4至32、4至36、4至38、4至40、4至42、4至44、4至46、4至48或4至72小时之间的时间。在一些实施例中，转导反应pH例如通过在培养起始时调整培养基缓冲(例如碳酸氢钠和/或HEPES)和孵育箱pCO2以允许所需pH(例如超过7.0的pH)被动地控制，以达到目标pH，例如7.0或更高。在一些实施例中，转导反应pH例如通过使用具有在线pH测量和pH反馈控制回路的生物反应器主动地控制，所述pH反馈控制回路通过添加CO₂气体连续地(主动地)调节培养物pH来维持pH。

在一些实施例中，T细胞可在不同的逆转录病毒或慢病毒粒子比细胞比率下转导，所述比率称为感染倍率(MOI)。在一些实施例中，T细胞使用在0.25、0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、50、100、150、200、250、300、350、400、450至500之间的MOI(空斑形成单位/细胞)转导。在一些实施例中，T细胞以在0.25、0.50、1.0、5、10、15、20、25或30至50、75、100、125、150、175或200之间的MOI转导。在一些实施例中，T细胞以约1至10、15、20、25、30、35、40、45或50的MOI转导。在一些实施例中，T细胞以1至20的MOI转导。

在本文所公开的方法和组合物的一些实施例中，在25％与90％之间的T细胞表达外源基因产物，在一些实施例中，在25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％或85％至90％之间的经转导T细胞表达外源基因产物。

在一些实施例中，表达外源基因产物的经转导T细胞的百分比可为至少30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％或90％，更特定地为至少40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％或80％且更特定地为至少60％、65％、70％、75％或80％。在一些实施例中，指定外源基因产物表达量是在逆转录病毒载体于转导反应期间首次与细胞接触之后1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20天，特别是3-10天实现。

在一些实施例中，转导反应在0.25至250、0.25至7.5、0.375至7.5、0.5至5或0.7至4.0升体积的转导培养基中发生。在一些实施例中，转导反应在至少0.25、0.50、0.75、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0、50、100、150、200或250升体积的转导培养基中发生。在一些实施例中，转导反应在约0.25、约0.50、约0.60或约0.75至约0.8、约1.0、约1.5、约2.0、约2.5、约3.0、约3.5、约4.0、约4.5、约5.0、约7.5、约8.0或约10.0升体积的转导培养基中发生。

在一些实施例中，细胞通过包含细胞外源性核酸的病毒载体转导。在一些实施例中，外源性核酸编码CAR。在一些实施例中，病毒载体为逆转录病毒、慢病毒或AAV载体。

待转导以表达CAR的细胞可衍生自同种异体或自体来源。在一个实施例中，在不存在非人类动物衍生产物，如胎牛血清(fetal calf serum)/胎牛血清(fetal bovineserum)的情况下进行T细胞的体外转导、培养和/或扩增。

在一些实施例中，转导反应细胞群体在起始pH范围内且等于或低于7.8或等于或低于7.9的pH下与编码CAR的逆转录病毒载体一起以至少5、10、20、30、50、100、150或200的MOI孵育1小时至2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、24或48小时，且其中在逆转录病毒载体于转导反应期间首次与细胞接触之后至少第3天、第4天、第5天、第6天、第7天、第8天、第9天或第10天，至少40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％或85％的T细胞表达CAR。

基因破坏

用于制造同种异体CAR T疗法或AlloCARs^TM的方法包括从健康供体收集健康的、经选择的、经筛选的和经测试的T细胞。对同种异体T细胞进行基因编辑以降低移植物抗宿主疾病(GvHD)风险且预防同种异体排斥反应。在一些实施例中，对所选择的T细胞受体基因(例如TCRa或TCRb)进行基因敲除以避免GvHD。也可敲除CD52基因以使得CART产物对抗CD52抗体治疗具有抗性。抗CD52抗体治疗因此可用于使宿主免疫系统的淋巴细胞耗竭并且允许CART细胞保持植入以实现完全治疗作用。在一个实例中，抗CD52抗体可包含阿仑单抗(alemtuzumab)(CHEMBL 1201587,ChemIDplus:216503-57-0；DB00087；还参见US 5,846,534，出于所有目的，其两者均以全文引用的方式并入本文中)。接着，对T细胞进行工程改造以表达CAR，所述CAR识别在血液或实体肿瘤中表达的某些细胞表面蛋白质。经工程改造的T细胞接着经历纯化步骤且最终在小瓶中低温保存。

用于制造自体嵌合抗原受体(CAR)T细胞疗法的方法涉及收集患者自身的细胞(例如白细胞，包括T细胞)并对所述T细胞进行基因工程改造以表达识别细胞表面上表达的目标抗原，例如癌细胞抗原的CAR。经工程改造的细胞接着经低温保存且随后施用至被取出细胞进行工程改造的患者。

在一些实施例中，经分离免疫细胞经遗传修饰以减少或消除内源TCRa和/或CD52的表达。在一些实施例中，将细胞使用基因编辑技术(例如CRISPR/Cas9、CRISPR/CAS12、锌指核酸酶(ZFN)、MegaTAL、大范围核酸酶(meganuclease))遗传修饰以减少或消除内源蛋白质(例如TCRa和/或CD52)的表达。在一些实施例中，所述方法包含通过将核酸内切酶引入细胞中使一种或多种基因破坏或失活，所述核酸内切酶能够通过DNA裂解使靶基因失活。在一些实施例中，核酸内切酶可以是例如锌指核酸酶(ZFN)、megaTAL核酸酶、大范围核酸酶、转录活化剂样效应核酸酶(TALE-核酸酶/TALEN)或CRIPR(例如，Cas9、Cas12或CAS14)核酸内切酶。

在一些实施例中，免疫细胞使用电穿孔、声致穿孔、基因枪(biolistics)(例如基因枪(Gene Gun))、脂质转染、聚合物转染、纳米粒子或聚合复合物(polyplex)通过核酸载体转染。在一些实施例中，经分离免疫细胞经遗传修饰以减少或消除内源TCRa和/或CD52的表达。

扩增和耗竭

在本文所公开的方法的说明性实施例中，经转导T细胞可在收获之前，如以上活化和扩增描述中大体上描述进行扩增。在一些实施例中，经转导细胞进一步经转染以敲除目标内源基因。在一些实施例中，经转导细胞耗竭非所需细胞类型，例如表达TCRαβ的细胞。如图1中所指示，在一些实施例中，经转导细胞可在耗竭之前或耗竭之后扩增。

流式细胞术可用于耗竭细胞群体内的特定细胞类型，例如T细胞受体阳性细胞。一般来说，流式细胞术是一种用于主要通过光学手段对细胞的组分或结构特征进行定量的方法。由于可以通过定量结构特征来区分不同的细胞类型，因此流式细胞术和细胞分选可以用于对混合物中不同表型的细胞进行计数和分选。

流式细胞术分析涉及两个主要步骤：1)用一种或多种经标记的标记物来标记所选细胞类型，和2)测定相对于所述群体中的细胞总数的经标记细胞的数目。在一些实施例中，标记细胞类型的方法包括使经标记的抗体结合至由特定细胞类型，例如T细胞受体表达的标记物。抗体可直接标记有荧光化合物或使用例如，识别第一抗体的荧光标记的第二抗体间接标记。

在一些实施例中，用于对表达CAR的T细胞进行分选的方法为磁性激活细胞分选(MACS)。磁性激活细胞分选(MACS)是一种取决于细胞群体表面抗原(CD分子)，通过使用超顺磁纳米粒子和柱分离多种细胞群体的方法。MACS可用于获得纯细胞群体。

单细胞悬浮液中的细胞可用微珠磁性标记。将样品施加于由铁磁性球体构成的柱，其覆盖有允许快速和平缓分离细胞的细胞友好型涂层。未经标记的细胞会通过而磁标记的细胞保留在柱中。流过物可收集作为未标记的细胞部分。洗涤步骤之后，从分离器去除所述柱，并使磁标记的细胞从柱洗脱。

用于纯化特定细胞群体(如T细胞)的详细方案可见于Basu S等人,(2010)(BasuS,Campbell HM,Dittel BN,Ray A.Purification of specific cell population byfluorescence activated cell sorting(FACS).J Vis Exp.(41):1546)，其以全文引用的方式并入本文中。

调配和低温保存

在一些实施例中，经工程改造的免疫细胞通过以下方式以治疗有效量调配：首先自其介质收获所述细胞，接着在适合施用的培养基和容器系统(“药学上可接受”的载剂)中洗涤并浓缩细胞。合适的输注介质可以是任何等渗培养基制剂，通常是生理盐水Normosol^TMR(Abbott)或Plasma-Lyte^TMA(Baxter)，但也可以使用5％的右旋糖水溶液或林格乳酸盐(Ringer's lactate)。输注介质可补充有人类血清白蛋白。

在另一个实施例中，收获经工程改造的免疫细胞，例如表达CAR的T细胞，进行洗涤并浓缩，接着在合适的低温保存培养基，例如CSl0、/>CS2或CS5(BioLife Solutions)中以预先确定的细胞浓度低温保存。使用标准程序进行经工程改造的免疫细胞，例如表达CAR的T细胞的低温保存，以存储和/或准备用于人类受试者。需要时，低温保存的经工程改造的免疫细胞可经解冻、生长和扩增以产生更多此类细胞。

嵌合抗原受体

如本文所使用，嵌合抗原受体(CAR)是特异性识别目标抗原(例如癌细胞上的目标抗原)的蛋白质。当结合于目标抗原时，CAR可活化免疫细胞以攻击和破坏携带所述抗原的细胞(例如癌细胞)。CAR还可并有共刺激或信号传导结构域以增加其效力。参见例如Finney等人,Journal of Immunology,1998,161:2791-2797；Song等人,Blood 119:696-706(2012)；Kala等人,Sci.Transl.Med.3:95(2011)；Porter等人,N.Engl.J.Med.365:725-33(2011)和Gross等人,Annu.Rev.Pharmacol.Toxicol.56:59-83(2016)；美国专利第7,741,465号和第6,319,494号。

本文所述的嵌合抗原受体包含细胞外结构域、跨膜结构域和细胞内结构域，其中所述细胞外结构域包含抗原结合结构域。在一些实施例中，抗原特异性CAR从5'到3'包含以下元件：信号序列、抗原结合结构域、铰链和跨膜区域以及一个或多个连续信号传导结构域。

在一些实施例中，CAR进一步包含安全开关和/或单克隆抗体特异性表位。参见例如WO2016/120216。

抗原结合结构域

如上文所论述，本文所述的CAR包含抗原结合结构域。如本文所使用，“抗原结合结构域”意指结合指定目标抗原的任何多肽。在某些实施例中，抗原结合结构域的多肽结构是基于抗体。抗原结合结构域包括(但不限于)为免疫功能性片段的抗体结合区。抗原结合结构域的术语“免疫功能性片段”(或“片段”)是抗原结合结构域的物种，其包含抗体的一部分(无论如何获得或合成所述部分)，所述部分缺少全长链中存在的至少一些氨基酸，但仍然能够特异性结合于目标抗原。此类片段是生物活性的，因为其结合于目标抗原，并且可以与其它抗原结合结构域，包括完整抗体竞争结合于给定表位。免疫功能性片段包括但不限于scFv片段、Fab片段(Fab'、F(ab')2等)、一个或多个互补决定区(“CDR”)、双功能抗体(重链可变结构域在与轻链可变结构域相同的多肽上，经由短肽连接子连接，所述肽连接子太短而不允许同一链上的两个结构域之间配对)、结构域抗体、二价抗原结合结构域(包含两个抗原结合位点)、多特异性抗原结合结构域和单链抗体。这些片段可以源自任何哺乳动物，包括但不限于人、小鼠、大鼠、骆驼科动物或兔类。

在一些实施例中，抗原结合结构域包含存在于抗体的全长轻链或重链中的一个或多个互补结合区(CDR)，并且在一些实施例中包含单链和/或轻链或其部分。这些片段可以通过重组DNA技术产生或可以通过抗原结合结构域(包括完整抗体)的酶或化学裂解产生。

在一些实施例中，抗原结合结构域是其片段的抗体，包括其互补决定区(CDR)中一个或多个CDR。在一些实施例中，抗原结合结构域是单链可变片段(scFv)，所述单链可变片段包含轻链CDR CDR1、CDR2和CDR3，以及重链CDR CDR1、CDR2和CDR3。

通常，框架、CDR和可变结构域中的每一个的氨基酸的分配通常符合Kabat编号的编号方案(参见例如，Kabat等人,Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版,NIH出版号91-3242,Bethesda Md.1991)、Chothia编号(参见例如，Chothia和Lesk,(1987),J Mol Biol 196:901-917；Al-Lazikani等人,(1997)J Mol Biol 273:927-948；Chothia等人,(1992)J Mol Biol 227:799-817；Tramontano等人,(1990)J Mol Biol 215(1):175-82；以及美国专利第7,709,226号)、联络编号或AbM方案(抗体建模程序，OxfordMolecular)。

抗原结合结构域的变体(例如CDR的变体、VH和/或VL)也在本公开的范围内，例如各自具有与抗原结合结构域序列的氨基酸序列至少70-80％、80-85％、85-90％、90-95％、95-97％、97-99％或高于99％一致性的可变轻链和/或可变重链。在一些情况下，此类分子包括至少一个重链和一个轻链，而在其它情况下，变体形式含有两个可变轻链和两个可变重链(或其子部分)。所属领域的技术人员将能够使用众所周知的技术确定如本文所阐述的抗原结合结构域的合适的变体。在某些实施例中，所属领域的技术人员可以鉴别分子的合适区域，其可以在不破坏活性的情况下通过靶向未被认为对活性重要的区域而改变。

在一些实施例中，抗原结合结构域为scFv。在一些实施例中，抗原选择性CAR包含前导或信号肽。如所属领域的技术人员将了解，抗原结合结构域可以包括非蛋白质组分。

适用于本公开的方法和组合物中的CAR中的抗原结合结构域可具有多种抗原结合特异性。在一些实施例中，抗原结合结构域对由靶细胞表达(合成)的抗原上存在的表位具有特异性。在一个实例中，靶细胞为癌细胞相关抗原。癌细胞相关的抗原可为与以下相关的抗原：例如乳腺癌细胞、B细胞淋巴瘤、霍奇金(Hodgkin)淋巴瘤细胞、卵巢癌细胞、前列腺癌细胞、间皮瘤、肺癌细胞(例如，小细胞肺癌细胞)、非霍奇金B细胞淋巴瘤(B-NHL)细胞、卵巢癌细胞、前列腺癌细胞、间皮瘤细胞、肺癌细胞(例如，小细胞肺癌细胞)、黑色素瘤细胞、慢性淋巴细胞白血病细胞、急性淋巴细胞白血病细胞、神经母细胞瘤细胞、神经胶质瘤、胶质母细胞瘤、髓母细胞瘤、结直肠癌细胞等。癌细胞相关抗原还可以由非癌细胞表达。

嵌合结合抗原可结合的抗原的非限制性实例包括例如CD19、CD20、CD38、CD30、ERBB2、CA125、MUC-1、前列腺特异性膜抗原(PSMA)、CD44表面粘附分子、间皮素、癌胚抗原(CEA)、表皮生长因子受体(EGFR)、EGFRvIII、血管内皮生长因子受体-2(VEGFR2)、高分子量黑色素瘤相关抗原(HMW-MAA)、MAGE-A1、IL-13R-a2、GD2、Ax1、Ror2、BCMA、紧密连接蛋白(Claudin)和其同种型等。

铰链结构域

本公开的CAR的细胞外结构域可包含“铰链”结构域(或铰链区)。所述术语包含用以将CAR中的跨膜结构域连接到CAR中的细胞外抗原结合结构域的作用的任何多肽。具体地，铰链结构域可以用于为细胞外抗原结合结构域提供更大的灵活性和可及性。

铰链结构域可包含至多300个氨基酸，在一些实施例中包含10至100个氨基酸，或在一些实施例中包含25至50个氨基酸。铰链结构域可衍生自天然存在的分子的全部或一部分，如衍生自CD8、CD4、CD28、4-lBB或IgG的细胞外区的全部或一部分(确切地说，IgG的铰链区；应了解，铰链区可含有免疫球蛋白家族的成员中的一些或全部，如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgD、IgE、IgM或其片段)，或衍生自抗体重链恒定区的全部或一部分。

或者，铰链结构域可为对应于天然产生的序列的合成序列或可为完全合成的序列。在一些实施例中，铰链结构域为人类CD8a链的一部分(例如，NP_001139345.1)。在另一个特定实施例中，所述铰链和跨膜结构域包含人类CD8a链的一部分。在一些实施例中，本文所述的CAR的铰链结构域包含CD8a、CD28、IgGl、IgG4、PD-1或FcyRIIIa分子的子序列，确切地说，CD8a、CD28、IgGl、IgG4、PD-1或FcyRIIIa分子中的任一个的铰链区。在一些实施例中，铰链结构域包含人类CD8a铰链、人类IgGl铰链、人类IgG4铰链、人类PD-1铰链或人类FcyRIIIa铰链。在一些实施例中，本文所公开的CAR包含scFv、CD8a人类铰链和跨膜结构域。

跨膜结构域

本公开的CAR设计为具有与CAR的细胞外结构域融合的跨膜结构域。其可类似地与CAR的细胞内结构域融合。在一些情况下，跨膜结构域可通过氨基酸取代来选择或修饰的，以避免此类结构域与相同或不同表面膜蛋白的跨膜结构域结合，从而使与受体复合物的其它成员的相互作用最小化。在一些实施例中，短连接子可在CAR的细胞外、跨膜和细胞内结构域中的任一个或一些之间形成键联。适合用于本文所公开的CAR的跨膜结构域具有以下能力：(a)在免疫细胞表面表达，所述免疫细胞例如但不限于淋巴细胞，例如CD4+细胞如T辅助(Th)细胞、CD8+细胞如细胞毒性T(Tc)细胞、T调节(Treg)细胞或自然杀伤(NK)细胞；和/或(b)与细胞外抗原结合结构域和细胞内信号传导结构域相互作用，以引导免疫细胞针对靶细胞的细胞反应。

跨膜结构域可衍生自天然来源或合成来源。当来源是天然的时，所述结构域可衍生自任何膜结合或跨膜蛋白。特别适用于本公开的跨膜区可衍生自(包含或对应于)CD28、CD8、OX-40、4-1BB/CD137、CD2、CD7、CD27、CD30、CD40、程序性死亡-I(PD-1)、诱导型T细胞共刺激分子(ICOS)、淋巴细胞功能相关抗原-I(LFA-1、CD1-la/CD18)、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD247、CD276(B7-H3)、LIGHT(TNFSF14)、NKG2C、lgα(CD79a)、DAP-10、Feγ受体、MHC 1类分子、TNF受体蛋白、免疫球蛋白、细胞因子受体、整合素、信号传导淋巴细胞活化分子(SLAM蛋白)、活化NK细胞受体、BTLA、铎(Toll)配体受体、ICAM-1、B7-H3、CDS、ICAM-1、GITR、BAFFR、LIGHT、HVEM(LIGHTR)、KIRDS2、SLAMF7、NKp80(KLRFl)、NKp44、NKp30、NKp46、CD19、CD4、CD8α、CD8β、IL-2Rβ、IL-2Rγ、IL-7Rα、ITGA4、VLAl、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CDI ld、ITGAE、CD103、ITGAL、CDI la、LFA-1、ITGAM、CDI lb、ITGAX、CDI le、ITGBl、CD29、ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、NKG2D、TNFR2、TRANCE/RANKL、DNAMl(CD226)、SLAMF4(CD244、2B4)、CD84、CD96(Tactile)、CEACAMl、CRT AM、Ly9(CD229)、CD160(BY55)、PSGLl、CDl00(SEMA4D)、CD69、SLAMF6(NTB-A、Lyl08)、SLAM(SLAMFl、CD150、IPO-3)、BLAME(SLAMF8)、SELPLG(CD162)、LTBR、LAT、GADS、SLP-76、PAG/Cbp、CD19a、与CD83特异性结合的配体，或其任何组合。

作为非限制性实例，跨膜区可衍生自T细胞受体、构成CD3复合物的多肽、IL-2受体、p55(a链)、p75(P链)或y链、Fe受体的亚单位链，特别是Fey受体III或CD蛋白质，或为其一部分。可替代地，跨膜结构域可以是合成的并且可以主要包含疏水残基，如亮氨酸和缬氨酸。在一些实施例中，所述跨膜结构域衍生自人类CD8a链(例如NP_001139345.1)。

细胞内结构域

本公开的CAR的细胞内(细胞质)结构域可提供对包含所述CAR的免疫细胞的至少一种正常效应功能的活化，例如信号I/活化和/或信号2/共刺激。例如，T细胞的效应功能可指细胞裂解活性或辅助细胞活性，包括细胞因子的分泌。在一些实施例中，供用于CAR中的活化胞内信号传导结构域可为例如(但不限于)T细胞受体和在抗原受体结合后协调作用以发起信号转导的共受体的细胞质序列，以及这些序列和具有相同功能性能力的任何合成序列的任何衍生物或变体。

应了解，合适的(例如活化)细胞内结构域包括(但不限于)衍生自(或对应于)以下的信号传导结构域：CD3ζ、CD28、OX-40、4-1BB/CD137、CD2、CD7、CD27、CD30、CD40、程序性死亡-I(PD-1)、诱导型T细胞共刺激分子(ICOS)、淋巴细胞功能相关抗原-I(LFA-1、CD1-la/CD18)、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD247、CD276(B7-H3)、LIGHT(TNFSF14)、NKG2C、lgα(CD79a)、DAP-10、Feγ受体、MHC 1类分子、TNF受体蛋白、免疫球蛋白、细胞因子受体、整合素、信号传导淋巴细胞活化分子(SLAM蛋白)、活化NK细胞受体、BTLA、铎配体受体、ICAM-1、B7-H3、CDS、ICAM-1、GITR、BAFFR、LIGHT、HVEM(LIGHTR)、KIRDS2、SLAMF7、NKp80(KLRFl)、NKp44、NKp30、NKp46、CD19、CD4、CD8α、CD8β、IL-2Rβ、IL-2Rγ、IL-7Rα、ITGA4、VLAl、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CDI ld、ITGAE、CD103、ITGAL、CDI la、LFA-1、ITGAM、CDIlb、ITGAX、CDI le、ITGBl、CD29、ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、NKG2D、TNFR2、TRANCE/RANKL、DNAMl(CD226)、SLAMF4(CD244、2B4)、CD84、CD96(Tactile)、CEACAMl、CRT AM、Ly9(CD229)、CD160(BY55)、PSGLl、CDl00(SEMA4D)、CD69、SLAMF6(NTB-A、Lyl08)、SLAM(SLAMFl、CD150、IPO-3)、BLAME(SLAMF8)、SELPLG(CD162)、LTBR、LAT、GADS、SLP-76、PAG/Cbp、CD19a、与CD83特异性结合的配体，或其任何组合。

除了上述活化结构域之外，细胞内结构域还可并入共刺激信号传导结构域(在本文中可互换地称为共刺激分子)以增加其效力。共刺激结构域可提供除如本文所述的活化分子所提供的初级信号之外的信号。

应了解，本公开的范围内的合适的共刺激结构域可衍生自(或对应于)例如CD28、OX40、4-1BB/CD137、CD2、CD3(α、β、δ、ε、γ、ζ)、CD4、CDS、CD7、CD9、CD16、CD22、CD27、CD30、CD33、CD37、CD40、CD 45、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154、PD-1、ICOS、淋巴细胞功能相关抗原-I(LFA-1(CDI la/CD18)、CD247、CD276(B7-H3)、LIGHT(肿瘤坏死因子超家族成员14；TNFSF14)、NKG2C、lgα(CD79a)、DAP-10、Feγ受体、MHC I类分子、TNFR、整合素、信号传导淋巴细胞活化分子、BTLA、铎配体受体、ICAM-1、B7-H3、CDS、ICAM-1、GITR、BAFFR、LIGHT、HVEM(LIGHTR)、KIRDS2、SLAMF7、NKp80(KLRFl)、NKp44、NKp30、NKp46、CD19、CD4、CD8α、CD8β、IL-2Rβ、IL-2Rγ、IL-7Rα、ITGA4、VLAl、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CDl-ld、ITGAE、CD103、ITGAL、CDl-la、LFA-1、ITGAM、CDl-lb、ITGAX、CDl-lc、ITGBl、CD29、ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、NKG2D、TNFR2、TRANCE/RANKL、DNAMl(CD226)、SLAMF4(CD244、2B4)、CD84、CD96(Tactile)、CEACAMl、CRT AM、Ly9(CD229)、CD160(BY55)、PSGLl、CDl00(SEMA4D)、CD69、SLAMF6(NTB-A、Lyl08)、SLAM(SLAMFl、CD150、IPO-3)、BLAME(SLAMF8)、SELPLG(CD162)、LTBR、LAT、GADS、SLP-76、PAG/Cbp、CD19a、CD83配体，或片段或其组合。应了解，上文未列出的额外共刺激分子或其片段在本公开的范围内。

在一些实施例中，CAR的细胞内/细胞质结构域可设计成自身包含4-1BB/CD137结构域或与适用于CAR的情形的任何其它所需细胞内结构域组合。4-1BB/CD137的完整天然氨基酸序列描述于NCBI参考序列：NP_001552.2。完整的天然4-1BB/CD137核酸序列描述于NCBI参考序列：NM_001561.5中。

在一些实施例中，CAR的细胞内/细胞质结构域可设计成自身包含CD28结构域或与适用于CAR的情形的任何其它所需细胞内结构域组合。CD28的完整天然氨基酸序列描述于NCBI参考序列：NP_006130.1。完整的天然CD28核酸序列描述于NCBI参考序列：NM_006139.l。

在一些实施例中，CAR的细胞内/细胞质结构域可设计成自身包含CD3ζ结构域或与适用于CAR的情形的任何其它所需细胞内结构域组合。在一些实施例中，CAR的细胞内信号传导结构域可包含CD31信号传导结构域。例如，CAR的细胞内结构域可包含CD3ζ链部分和共刺激信号传导分子的一部分。CAR的细胞内信号传导部分内的细胞内信号传导序列可随机或以指定顺序彼此连接。

核酸和表达载体制备

本文提供制备编码CAR的核酸和包含编码CAR的核酸的载体的方法。

可在制备根据本公开的多核苷酸和载体时利用多种已知技术。举例来说，用于制造本公开的构筑体和经工程改造的免疫细胞的某些方法在公开案WO2015/120096中描述，所述公开案的全文特此以引用的方式并入。

编码CAR的核苷酸序列可存在于表达载体中。在CAR包括两个单独多肽的情况下，可将编码两个多肽的核苷酸序列克隆于相同或单独的载体中。表达载体可以包括可选标记、复制起点和提供对载体的复制和/或维持的其它特征。合适的表达载体包括例如质粒、病毒载体等。

为了克隆多核苷酸，可将表达载体引入宿主细胞(经分离的宿主细胞)以允许载体本身的复制，并且由此扩增其中所含的多核苷酸的拷贝。克隆载体可含有序列组分，通常包括但不限于复制起点、启动子序列、转录起始序列、增强子序列和可选标记。这些元件可由所属领域的普通技术人员酌情选择。例如，可以选择复制起点以促进载体在宿主细胞中的自主复制。

在其它实施例中，本公开涉及编码本文所述的抗原结合结构域中的任一者的分离的多核苷酸。在一些实施例中，本公开涉及编码CAR的经分离的多核苷酸。本文还提供包含多核苷酸的载体和其制备方法。

在某些实施例中，本公开提供含有本文所提供的表达载体的经分离的宿主细胞。含有载体的宿主细胞可用于载体中所含的多核苷酸的表达或克隆。合适的宿主细胞可包括但不限于原核细胞、真菌细胞、酵母细胞或较高真核细胞，如哺乳动物细胞，且更确切地说为人类细胞。

载体可使用所属领域中已知的任何合适的方法引入到宿主细胞，包括(但不限于)DEAE-葡聚糖介导的递送、磷酸钙沉淀方法、阳离子脂质介导的递送、脂质体介导的转染、电穿孔、微弹轰击(microprojectile bombardment)、受体介导的基因递送、由聚赖氨酸、组蛋白、壳聚糖和肽介导的递送。用于病毒转染和转化细胞以用于表达所关注的载体的标准方法在所属领域中是众所周知的。在另一实施例中，不同表达载体的混合物可用于遗传修饰免疫效应细胞的供体群体，其中每个载体编码如本文所公开的不同CAR。所得转导免疫效应细胞形成经工程改造的细胞的混合群体，其中一定比例的经工程改造的细胞表达超过一个不同CAR。

逆转录病毒粒子制备

在本文所公开的说明性实施例中，转导方法可包括以下步骤：用包含一个或多个核酸的复制缺陷型重组逆转录病毒粒子转导免疫细胞，例如T细胞，以产生经转导、经工程改造的免疫细胞，例如经工程改造的T细胞。在一些实施例中，一种或多种核酸可编码一种或多种蛋白质，其接着在经转导的T细胞中表达，例如嵌合抗原受体(CAR)。用于在本文所提供的方法中转导T细胞和/或NK细胞的逆转录病毒粒子可根据所属领域中已知的方法制备。如本文所公开，逆转录病毒粒子为用于基因递送的常见工具(Miller,《自然》(1992)357:455-460)。在一些实施例中，复制缺陷型重组逆转录病毒粒子可衍生自α逆转录病毒属(Alpharetrovirus genus)、β逆转录病毒属(Betaretrovirus genus)、γ逆转录病毒属(Gammaretrovirus genus)、δ逆转录病毒属(Deltaretrovirus genus)、ε逆转录病毒属(Epsilonretrovirus genus)、慢病毒属或泡沫病毒属。存在许多种适用于本文中所公开的方法的逆转录病毒。逆转录病毒的详细列表可以在Coffin等人(“Retroviruses”，1997ColdSpring Harbor Laboratory Press编辑：J M Coffin,S M Hughes,H E Varmus，第758-763页)中找到。可以在本领域中找到关于一些逆转录病毒的基因组结构的细节。举例来说，可以从NCBI Genbank(即基因组(Genome)登录号AF033819)中找到关于HIV的细节。

在说明性实施例中，逆转录病毒粒子可衍生自来自慢病毒属的重组逆转录病毒并且可为复制缺陷型重组慢病毒粒子。在一些实施例中，重组逆转录病毒可衍生自HIV、SIV或FIV。在其它说明性实施例中，重组逆转录病毒可衍生自慢病毒属中的人类免疫缺陷病毒(HIV)。

在一些实施例中，复制缺陷型重组逆转录病毒粒子可在对复制缺陷型重组逆转录病毒粒子制造具有特异性的培养基中的培养物中生长。用于生长复制缺陷型重组逆转录病毒粒子的任何适合生长培养基和/或补充剂可以根据本文所描述的方法用于复制缺陷型重组逆转录病毒粒子接种物。根据一些方面，可随后在转导期间将逆转录病毒粒子添加到培养基中。

复制缺陷型重组逆转录病毒粒子可以根据本领域中已知的方法使用哺乳动物细胞系产生。合适的哺乳动物细胞包括原代细胞及永生化细胞系。合适的哺乳动物细胞系可包括人类细胞系。合适的哺乳动物细胞系包括但不限于HeLa细胞(例如，美国典型培养物保藏中心(ATCC)编号CCL-2)、CHO细胞(例如，ATCC编号CRL9618、CCL61、CRL9096)、293细胞(例如，ATCC编号CRL-1573)、Vero细胞、NIH 3T3细胞(例如，ATCC编号CRL-1658)、Huh-7细胞、BHK细胞(例如，ATCC编号CCL1O)、PC12细胞(ATCC编号CRL1721)、COS细胞、COS-7细胞(ATCC编号CRL1651)、人类胚胎肾(HEK)细胞(ATCC编号CRL1573)、HLHepG2细胞、Hut-78、Jurkat、HL-60、NK细胞系(例如，NKL、NK92和YTS)等。在一些情况下，细胞并非永生化细胞系，而是自个体获得的细胞或离体细胞(例如，原代细胞)。举例来说，在一些实施例中，细胞为自个体获得的免疫细胞。作为另一实例，细胞为自个体获得的干细胞或祖细胞。

经工程改造的免疫细胞

本公开的经工程改造的免疫细胞可为同种异体或自体的。

在一些实施例中，经工程改造的免疫细胞是T细胞(例如发炎性T淋巴细胞、细胞毒性T淋巴细胞、调节T淋巴细胞(Treg)、辅助T淋巴细胞、肿瘤浸润淋巴细胞(TIL))、自然杀伤T细胞(NKT)、表达TCR的细胞、树突状细胞、杀伤树突状细胞、肥大细胞、自然杀伤细胞或B细胞。在一些实施例中，细胞可衍生自包含CD4+T淋巴细胞和CD8+T淋巴细胞中的一种或两种的群组。在一些示范性实施例中，经工程改造的免疫细胞为T细胞。在一些示范性实施例中，经工程改造的免疫细胞为为γδT细胞。在一些示范性实施例中，经工程改造的免疫细胞为巨噬细胞。在一些示范性实施例中，经工程改造的免疫细胞为自然杀伤(NK)细胞。

如上文所描述，在一些实施例中，经工程改造的免疫细胞可衍生自例如(但不限于)干细胞。干细胞可以是成体干细胞、非人类胚胎干细胞、更确切地说，非人类干细胞、脐血干细胞、祖细胞、骨髓干细胞、诱导性多能干细胞、全能干细胞或造血干细胞。在一些实施例中，细胞获自外周血或由其制备。在一些实施例中，细胞获自外周血单核细胞(PBMC)或由其制备。在一些实施例中，细胞获自骨髓或由其制备。在一些实施例中，细胞获自脐血或由其制备。在一些实施例中，细胞是人类细胞。

在一些实施例中，免疫细胞为表达由本文所描述的方法产生的CAR的T淋巴细胞。在一些实施例中，免疫细胞为表达由本文所描述的方法产生的CAR的细胞毒性T淋巴细胞。在一些实施例中，免疫细胞为表达由本文所描述的方法产生的CAR的调节T淋巴细胞。在一些实施例中，免疫细胞是表达由本文所描述的方法产生的CAR的辅助T淋巴细胞。在一些实施例中，本公开的经工程改造的免疫细胞包含CAR群体，每个CAR包含不同的细胞外抗原结合结构域。在一些实施例中，免疫细胞包含CAR群体，每个CAR包含相同的细胞外抗原结合结构域。

本文还提供根据上述方法中的任一种由转化的免疫细胞(例如，T细胞)获得的细胞系。本文还提供对免疫抑制治疗具有抗性的修饰细胞。在一些实施例中，根据本公开的分离细胞包含编码CAR的多核苷酸。在一些实施例中，经工程改造的免疫细胞包含CAR群体，每个CAR包含细胞外抗原结合结构域。在一些实施例中，免疫细胞包含CAR群体，每个CAR包含相同的细胞外抗原结合结构域。

在一些实施例中，根据本公开的经工程改造的免疫细胞可包含一种或多种破坏或失活的基因。在一些实施例中，根据本公开的经工程改造的免疫细胞包含一种破坏或失活的基因，其选自由以下组成的群组：CD52、DLL3、GR、PD-1、CTLA-4、LAG3、TIM3、BTLA、BY55、TIGIT、B7H5、LAIR1、SIGLECl0、2B4、HLA、TCRa和TCRb；和/或表达CAR、多链CAR和/或pTa转基因。在一些实施例中，分离细胞包含编码包含多链CAR的多肽的多核苷酸。在一些实施例中，根据本公开的分离细胞包含两个破坏或失活的基因，所述基因选自由以下组成的群组：CD52和GR、CD52和TCRa、CDR52和TCRb、GR和TCRa、GR和TCRb、TCRa和TCRb、PD-1和TCRa、PD-1和TCRb、CTLA-4和TCRa、CTLA-4和TCRb、LAG3和TCRa、LAG3和TCRb、TIM3和TCRa、Tim3和TCRb、BTLA和TCRa、BTLA和TCRb、BY55和TCRa、BY55和TCRb、TIGIT和TCRa、TIGIT和TCRb、B7H5和TCRa、B7H5和TCRb、和TCRb、SIGLEC l0和TCRa、SIGLEC l0和TCRb、2B4和TCRa、2B4和TCRb和/或表达CAR、多链CAR和pTa转基因。

在一些实施例中，通过使TCRa基因和/或TCRP基因破坏或失活，使TCR在根据本公开的细胞中呈现为非功能性的。在一些实施例中，提供一种获得衍生自个体的修饰细胞的方法，其中所述细胞可独立于主要组织相容性复合体(MHC)信号传导路径增殖。可通过此方法获得的修饰细胞涵盖在本公开的范围内，所述修饰细胞可独立于MHC信号传导路径进行增殖。

在一些实施例中，免疫细胞经工程改造而对一种或多种化疗药物具有抗性。所述化疗药物可为例如，嘌呤核苷酸类似物(PNA)，由此使得免疫细胞适用于进行结合过继免疫治疗和化疗的癌症治疗。示范性PNA包括例如氯法拉滨(clofarabine)、氟达拉滨(fludarabine)和环磷酰胺以及阿糖胞苷，其呈单独或组合形式。PNA是通过脱氧胞苷激酶(dCK)代谢成单、二和三磷酸酯PNA。其三磷酸酯形式与ATP竞争DNA合成，充当促细胞凋亡剂，并为参与三核苷酸生产的核糖核苷酸还原酶(RNR)的有效抑制剂。

在一些实施例中，本公开的分离细胞或细胞系可包含pTa或其功能性变体。在一些实施例中，分离细胞或细胞系可通过使TCRa基因破坏或失活而进一步进行遗传修饰。

如上文所描述，本公开还提供包含CAR多核苷酸的经工程改造的免疫细胞。在一些实施例中，CAR可以作为转基因通过质粒载体被引入到免疫细胞中。在一些实施例中，质粒载体也可含有例如选择标记，其提供对接受载体的细胞的鉴别和/或选择。

在一些实施例中，使用选自由以下组成的群组的方法用本公开的核酸载体转染细胞：电穿孔、声致穿孔、基因枪(biolistics)(例如基因枪(Gene Gun))、脂质转染、聚合物转染、纳米粒子或聚合复合物。在一些实施例中，细胞用本公开的病毒载体(例如逆转录病毒载体，确切地说慢病毒载体)转导。

治疗方法

提供用于治疗包括癌症的疾病或病症的方法。在一些实施例中，本公开涉及在受试者中产生T细胞介导的免疫反应，其包含向所述受试者施用有效量的本公开的经工程改造的免疫细胞。在一些实施例中，T细胞介导的免疫应答针对靶细胞或细胞。在一些实施例中，工程改造免疫细胞包含嵌合抗原受体(CAR)。在一些实施例中，靶细胞是肿瘤细胞。在一些方面，本公开包含一种用于治疗或预防恶性肿瘤的方法，所述方法包含向有需要的受试者施用有效量的至少一种本文所述的分离抗原结合结构域。在一些方面，本公开包含一种用于治疗或预防恶性肿瘤的方法，所述方法包含向有需要的受试者施用有效量的至少一种免疫细胞，其中所述免疫细胞包含至少一种如本文所述的嵌合抗原受体和/或分离抗原结合结构域。

在一些实施例中，受试者患有实体瘤或血液恶性肿瘤，如淋巴瘤或白血病。在一些实施例中，癌症存在于受试者的骨髓中。在一些实施例中，经工程改造的细胞为自体免疫细胞，例如自体T细胞。在一些实施例中，经工程改造的细胞为同种异体免疫细胞，例如同种异体T细胞。在一些实施例中，经工程改造的细胞为异源免疫细胞，例如异源T细胞。在一些实施例中，离体转染和/或转导经工程改造的细胞。如本文所用，术语“体外细胞”是指离体培养的任何细胞。治疗剂，例如，经工程改造的CART细胞的“治疗有效量”、“有效剂量”、“有效量”，或“治疗有效剂量”，是任何量，当单独使用或与另一种治疗剂组合使用时，保护受试者免于疾病发作或促进疾病消退，所述疾病消退由疾病症状的严重程度降低，无疾病症状期的频率和持续时间增加，或预防疾病病痛导致的障碍或残疾来证明。治疗剂促进疾病消退的能力可使用熟练从业者(例如医师或临床医师)已知的多种方法，例如在临床试验期间在人类受试者中、在预测于人体中的功效的动物模型系统中或通过分析所述药剂在体外分析中的活性来评价。

术语“患者”和“受试者”可互换使用，并且包括人类受试者以及患有正式诊断的病症的那些受试者、未患经正式识别的病症的那些受试者、接受医学观察的那些受试者、处于发病风险的那些受试者等。

术语“治疗(treat)”和“治疗(treatment)”包括治疗性治疗、预防性治疗和其中一个降低受试者将发展病症的风险或其它风险因素的公开内容。治疗不需要完全治愈病症并且涵盖其中一个减少症状或潜在风险因素的实施例。术语“预防”不需要100％消除事件发生的可能性。确切地说，其表示在化合物或方法存在下事件的发生的可能性已降低。

组合物中所需的治疗总细胞量包含至少2个细胞(例如至少一个CD8+T细胞和至少一个CD4+T细胞，或两个CD8+T细胞或两个CD4+T细胞)或更典型地超过10²个细胞且至多10⁶个，至多且包括10⁸或10⁹个细胞，且可为10¹⁰或10¹²个或更多个细胞。细胞的数目将取决于组合物的预期用途和其中所包括的细胞的类型。所需细胞的密度通常超过10⁶个细胞/毫升，并且通常超过10⁷个细胞/毫升，通常为10⁸个细胞/ml或更高。临床上相关数量的免疫细胞可分成多次输注，其累积量等于或超过10⁵、10⁶、10⁷、10⁸、10⁹、10¹⁰、10¹¹或10¹²个细胞。在本公开的一些方面中，特别是由于所有输注细胞将重定向至特定目标抗原，因此可施用在10⁶个/千克(每名患者10⁶-10¹¹个)范围内的较低数目的细胞。CAR治疗可在这些范围内的剂量下多次施用。

细胞对进行治疗的患者可以是自体、同种异体或异源的。

在一些实施例中，CAR T细胞的治疗有效量为约1×105个细胞/千克、约2×10⁵个细胞/千克、约3×10⁵个细胞/千克、约4×105个细胞/千克、约5×105个细胞/千克、约6×105个细胞/千克、约7×105个细胞/千克、约8×105个细胞/千克、约9×105个细胞/千克、2×106个细胞/千克、约3×106个细胞/千克、约4×106个细胞/千克、约5×106个细胞/千克、约6×106个细胞/千克、约7×106个细胞/千克、约8×106个细胞/千克、约9×106个细胞/千克、约1×107个细胞/千克、约2×107个细胞/千克、约3×107个细胞/千克、约4×107个细胞/千克、约5×107个细胞/千克、约6×107个细胞/千克、约7×107个细胞/千克、约8×107个细胞/千克或约9×107个细胞/千克。

在一些实施例中，CAR+/CAR-T+细胞的目标剂量在约1×10⁶至约1×10¹⁰个细胞/千克范围内，例如为约1×10⁶个细胞/千克、约1×107个细胞/千克、约1×108个细胞/千克、约1×10⁹个细胞/千克或约1×10¹⁰个细胞/千克。应了解，高于和低于此范围的给药可适合于某些受试者，并且可按需要由保健提供者确定适当的给药水平。另外，可根据本公开提供多个剂量的细胞。

在一些方面，本公开包含药物组合物，其包含至少一种如本文所述的抗原结合结构域和药学上可接受的赋形剂。在一些实施例中，药物组合物还包含额外活性剂。

本公开的CAR表达细胞群体可以单独或以与稀释剂和/或与其它组分(如IL-2或其它细胞因子或细胞群体)组合的药物组合物形式一起施用。本公开的药物组合物可包含与一种或多种药学上或生理学上可接受的载剂、稀释剂或赋形剂组合的表达CAR的细胞群体，如本文所述的T细胞。此类组合物可包含缓冲液，如中性缓冲盐水、磷酸盐缓冲盐水等；碳水化合物，如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚糖，甘露醇；蛋白质；多肽或氨基酸，如甘氨酸；抗氧化剂；螯合剂，如EDTA或谷胱甘肽；佐剂(例如，氢氧化铝)；以及防腐剂。本公开组合物优选调配用于静脉内施用。

药物组合物(溶液、悬浮液等)可包括以下中的一种或多种：无菌稀释剂，如注射用水、盐水溶液(优选为生理盐水)、林格氏溶液、等渗氯化钠；不挥发性油，如可以充当溶剂或悬浮介质的合成单或二甘油酯；聚乙二醇、甘油、丙二醇或其它溶剂；抗菌剂，如苄醇或对羟基苯甲酸甲酯；抗氧化剂，如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合剂，如乙二胺四乙酸(EDTA)；缓冲液，如乙酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐和用于调节张力的试剂，如氯化钠或右旋糖。可以将肠胃外调配物密封在由玻璃或塑料制成的安瓿、一次性注射器或多剂量小瓶中。对于治疗性公开，可注射药物组合物优选地是无菌的。

所述方法可进一步包含在施用本文所提供的经工程改造的细胞之前向患者施用一种或多种化学治疗剂。在某些实施例中，化学治疗剂为淋巴细胞消耗(预处理)化学治疗剂。举例来说，调节需要T细胞疗法的患者的方法包含向所述患者施用指定有益剂量的环磷酰胺(在每天200mg/m2与每天2000mg/m2之间、在每天约100mg/m2与每天约2000mg/m2之间；例如为每天约100mg/m2、每天约200mg/m2、每天约300mg/m2、每天约400mg/m2、每天约500mg/m2、每天约600mg/m2、每天约700mg/m2、每天约800mg/m2、每天约900mg/m2、每天约1000mg/m2、每天约1500mg/m2或每天约2000mg/m2)和指定剂量的氟达拉滨(在每天20mg/m2与每天900mg/m2之间、在每天约10mg/m2与每天约900mg/m2之间；例如为每天约10mg/m2、每天约20mg/m2、每天约30mg/m2、每天约40mg/m2、每天约40mg/m2、每天约50mg/m2、每天约60mg/m2、每天约70mg/m2、每天约80mg/m2、每天约9020mg/m2、每天约100mg/m2、每天约500mg/m2或每天约900mg/m2)。示范性给药方案涉及治疗患者，其包含在向患者施用治疗有效量的经工程改造的T细胞三天前，以组合方式或在每天施用约30mg/m2氟达拉滨之前或之后，每天向所述患者施用每天约300mg/m2环磷酰胺。

在一些实施例中，特别是在本文所提供的工程改造细胞已被基因编辑以消除或最小化CD52的表面表达的情况下，淋巴细胞清除进一步包含施用抗CD52抗体，如阿仑单抗。在一些实施例中，CD52抗体以每天约1-20mg的剂量IV施用，例如以每天约13mg IV施用1、2、3、4、5、6、7天或更多天。

抗体可以与淋巴细胞耗竭方案的其它要素(例如，环磷酰胺和/或氟达拉滨)组合施用、在施用所述其它要素之前或之后施用。

在其它实施例中，抗原结合结构域、转导(或以其它方式工程改造的)细胞和化学治疗剂各自以有效治疗受试者的疾病或病况的量施用。

在某些实施例中，包含本文所公开的表达CAR的免疫效应细胞的组合物可以与任何数目的化学治疗剂联合施用。化学治疗剂的实例包括烷基化剂，如噻替派(thiotepa)和环磷酰胺(CYTOXAN^TM)；烷基磺酸盐，例如白消安(busulfan)、英丙舒凡(improsulfan)和哌泊舒凡(piposulfan)；氮丙啶，例如苯佐替派(benzodopa)、卡波醌(carboquone)、米特替派(meturedopa)和乌瑞替派(uredopa)；乙烯亚胺和甲基三聚氰胺，包括六甲蜜胺、三乙烯三聚氰胺、三乙烯磷酰胺、三乙烯硫代磷酰胺和三羟甲基三聚氰胺；氮芥，例如苯丁酸氮芥、萘氮芥、氯磷酰胺、雌莫司汀(estramustine)、异环磷酰胺、二氯甲二乙胺、二氯甲二乙胺氧化物盐酸盐、美法仑(melphalan)、新恩比兴(novembichin)、苯芥胆甾醇(phenesterine)、泼尼莫司汀(prednimustine)、曲磷胺(trofosfamide)、尿嘧啶芥末；亚硝基脲，例如卡莫司汀(carmustine)、氯脲菌素、福莫司汀(fotemustine)、洛莫司汀(lomustine)、尼莫司汀(nimustine)、雷莫司汀(ranimustine)；抗生素，例如阿克拉霉素(aclacinomysin)、放线菌素(actinomycin)、安曲霉素(authramycin)、偶氮丝氨酸(azaserine)、博来霉素(bleomycin)、放线菌素C、卡奇霉素(calicheamicin)、卡柔比星(carabicin)、洋红霉素(carminomycin)、嗜癌霉素(carzinophilin)、色霉素(chromomycin)、更生霉素(dactinomycin)、柔红霉素(daunorubicin)、地托比星(detorubicin)、6-重氮-5-氧代-L-正亮氨酸、多柔比星(doxorubicin)、表柔比星(epirubicin)、依索比星(esorubicin)、伊达比星(idarubicin)、麻西罗霉素(marcellomycin)、丝裂霉素(mitomycin)、霉酚酸(mycophenolic acid)、诺加霉素(nogalamycin)、橄榄霉素(olivomycin)、培洛霉素(peplomycin)、泼非霉素(potfiromycin)、嘌呤霉素(puromycin)、三铁阿霉素(quelamycin)、罗多比星(rodorubicin)、链黑霉素(streptonigrin)、链脲霉素(streptozocin)、杀结核菌素(tubercidin)、乌苯美司(ubenimex)、净司他丁(zinostatin)、佐柔比星(zorubicin)；抗代谢物，例如甲氨蝶呤和5-氟尿嘧啶(5-FU)；叶酸类似物，例如二甲叶酸(denopterin)、甲氨蝶呤、蝶罗呤(pteropterin)、三甲曲沙(trimetrexate)；嘌呤类似物，例如氟达拉滨、6-巯基嘌呤、噻咪嘌呤、硫鸟嘌呤；嘧啶类似物，例如安西他滨、阿扎胞苷、6-氮杂尿苷、卡莫氟(carmofur)、阿糖胞苷、双脱氧尿苷、去氧氟尿苷、依诺他滨(enocitabine)、氟尿苷、5-FU；雄激素，例如卡普睾酮(calusterone)、丙酸屈他雄酮(dromostanolone propionate)、环硫雄醇(epitiostanol)、美雄烷(mepitiostane)、睾内酯；抗肾上腺，例如氨鲁米特(aminoglutethimide)、米托坦(mitotane)、曲洛司坦(trilostane)；叶酸补充剂，例如亚叶酸(frolinic acid)；醋葡醛内酯；醛磷酰胺糖苷；氨基乙酰丙酸；安吖啶(amsacrine)；倍思塔布(bestrabucil)；比生群(bisantrene)；依达曲沙(edatraxate)；地磷酰胺(defofamine)；地美可辛(demecolcine)；地吖醌(diaziquone)；依氟鸟氨酸(elformithine)；依利醋铵(elliptinium acetate)；依托格鲁(etoglucid)；硝酸镓；羟基脲；香菇多糖；氯尼达明(lonidamine)；米托胍腙(mitoguazone)；米托蒽醌；莫哌达醇(mopidamol)；二胺硝吖啶(nitracrine)；喷司他丁(pentostatin)；蛋氨氮芥(phenamet)；吡柔比星(pirarubicin)；鬼臼酸；2-乙酰肼；甲基苄肼(procarbazine)；雷佐生(razoxane)；西佐喃(sizofiran)；锗螺胺(spirogermanium)；细交链孢菌酮酸(tenuazonic acid)；三亚胺醌(triaziquone)；2,2',2”-三氯三乙胺；氨基甲酸乙酯(urethan)；长春地辛(vindesine)；达卡巴嗪(dacarbazine)；甘露醇氮芥(mannomustine)；二溴甘露醇(mitobronitol)；二溴卫矛醇(mitolactol)；哌泊溴烷(pipobroman)；加西托肽(gacytosine)；阿拉伯糖苷(“Ara-C”)；环磷酰胺；噻替派(thiotepa)；类紫杉醇，例如太平洋紫杉醇(TAXOL^TM，Bristol-MyersSquibb)和多西他赛(/>Rhne-Poulenc Rorer)；苯丁酸氮芥；吉西他滨；6-硫鸟嘌呤；巯基嘌呤；甲氨蝶呤；铂类似物，例如顺铂和卡铂；长春碱；铂；依托泊苷(etoposide)(VP-16)；异环磷酰胺；丝裂霉素C；米托蒽醌；长春新碱；长春瑞滨；诺维本(navelbine)；诺安托(novantrone)；替尼泊苷(teniposide)；道诺霉素；氨基喋呤；希罗达(xeloda)；伊班膦酸盐(ibandronate)；CPT-11；拓扑异构酶抑制剂RFS2000；二氟甲基鸟氨酸(DMFO)；视黄酸衍生物，例如Targretin^TM(贝沙罗汀(bexarotene))、Panretin^TM(阿利维A酸(alitretinoin))；ONTAK^TM(地尼白介素(denileukin diftitox))；埃斯波霉素(esperamicins)；卡培他滨(capecitabine)；以及以上中的任何一种的药学上可接受的盐、酸或衍生物。此定义还包括用于调节或抑制对肿瘤的激素作用的抗激素剂，如抗雌激素，包括例如他莫昔芬(tamoxifen)、雷洛昔芬(raloxifene)、芳香酶抑制4(5)-咪唑、4-羟基他莫昔芬、曲沃昔芬(trioxifene)、雷洛西芬(keoxifene)、LYl17018、奥那司酮(onapristone)和托瑞米芬(toremifene，法乐通(Fareston))；和抗雄激素，如氟他胺(flutamide)、尼鲁米特(nilutamide)、比卡鲁胺(bicalutamide)、亮丙瑞林(leuprolide)和戈舍瑞林(goserelin)；以及以上中的任何一种的药学上可接受的盐、酸或衍生物。化学治疗剂的组合也在适当时施用，包括但不限于CHOP，即环磷酰胺/>多柔比星(Doxorubicin)(羟基多柔比星)、长春新碱/>和泼尼松(Prednisone)。

在一些实施例中，在施用经工程改造的细胞、多肽或核酸之后同时或一周内施用化学治疗剂。在其它实施例中，化学治疗剂是在施用经工程改造的细胞、多肽或核酸之后约1-7天、约1至约4周或约1周至约1个月、约1周至约2个月、约1周至约3个月、约1周至约6个月、约1周至约9个月或约1周至约12个月进行施用。在其它实施例中，在施用细胞、多肽或核酸之前至少1个月施用化学治疗剂。在一些实施例中，所述方法还包含施用两种或更多种化学治疗剂。

多种额外治疗剂可与本文所述的组合物结合使用。例如，潜在有用的额外治疗剂包括PD-1抑制剂，如纳武单抗(nivolumab)帕博利珠单抗(pembrolizumab)帕博利珠单抗、匹利珠单抗(pidilizumab)和阿特珠单抗(atezolizumab)。适合与本公开组合使用的额外治疗剂包括(但不限于)：依鲁替尼(ibrutinib)/>奥法木单抗(ofatumumab)/>利妥昔单抗(rituximab)/>贝伐珠单抗(bevacizumab)/>曲妥珠单抗(trastuzumab)/>恩美曲妥珠单抗(trastuzumab emtansine)伊马替尼(imatinib)/>西妥昔单抗(cetuximab)帕尼单抗(panitumumab)/>卡妥索单抗(catumaxomab)、替伊莫单抗(ibritumomab)、奥法木单抗、托西莫单抗(tositumomab)、本妥昔单抗(brentuximab)、阿仑单抗(alemtuzumab)、吉妥单抗(gemtuzumab)、厄洛替尼(erlotinib)、吉非替尼(gefitinib)、凡德他尼(vandetanib)、阿法替尼(afatinib)、拉帕替尼(lapatinib)、来那替尼(neratinib)、阿西替尼(axitinib)、马赛替尼(masitinib)、帕唑帕尼(pazopanib)、舒尼替尼(sunitinib)、索拉非尼(sorafenib)、托西尼布(toceranib)、来他替尼(lestaurtinib)、阿西替尼(axitinib)、西地尼布(cediranib)、乐伐替尼(lenvatinib)、尼达尼布(nintedanib)、帕唑帕尼、瑞格非尼(regorafenib)、司马沙尼(semaxanib)、索拉非尼、舒尼替尼、替沃扎尼(tivozanib)、托西尼布、凡德他尼、恩曲替尼(entrectinib)、卡博替尼(cabozantinib)、伊马替尼、达沙替尼(dasatinib)、尼洛替尼(nilotinib)、普纳替尼(ponatinib)、拉多替尼(radotinib)、伯舒替尼(bosutinib)、来他替尼、芦可替尼(ruxolitinib)、帕瑞替尼(pacritinib)、考比替尼(cobimetinib)、司美替尼(selumetinib)、曲美替尼(trametinib)、贝美替尼(binimetinib)、阿来替尼(alectinib)、色瑞替尼(ceritinib)、克唑替尼(crizotinib)、阿柏西普(aflibercept)、阿替泊(adipotide)、地尼白介素(denileukin diftitox)；mTOR抑制剂，如依维莫司(Everolimus)和坦罗莫司(Temsirolimus)；hedgehog抑制剂，如索尼德吉(sonidegib)和维莫德吉(vismodegib)；CDK抑制剂，如CDK抑制剂(帕博西尼(palbociclib))。

在一些实施例中，包含表达CAR的免疫细胞的组合物可与治疗方案一起施用以预防细胞因子释放综合征(CRS)或神经毒性。预防细胞因子释放综合征(CRS)或神经毒性的治疗方案可包括仑兹鲁单抗(lenzilumab)、托珠单抗(tocilizumab)、心房利钠肽(atrialnatriuretic peptide，ANP)、阿那白滞素(anakinra)、iNOS抑制剂(例如L-NIL或1400W)。在额外实施例中，包含含CAR的免疫细胞的组合物可与抗炎剂一起施用。抗炎剂或药物包括(但不限于)类固醇和糖皮质激素(包括倍他米松(betamethasone)、布地奈德(budesonide)、地塞米松(dexamethasone)、乙酸氢化可的松(hydrocortisone acetate)、氢化可的松(hydrocortisone)、氢化可的松、乙基泼尼松龙(ethylprednisolone)、泼尼松龙(prednisolone)、泼尼松、曲安西龙(triamcinolone))；非类固醇消炎药物(NSAIDS)，包括阿司匹林(aspirin)、布洛芬(ibuprofen)、萘普生(naproxen)、甲氨蝶呤、柳氮磺胺吡啶(sulfasalazine)、来氟米特(leflunomide)、抗TNF药剂、环磷酰胺和霉酚酸酯(mycophenolate)。示范性的NSAID包括布洛芬、萘普生、萘普生钠(naproxen sodium)、Cox-2抑制剂和唾液酸盐。示范性镇痛剂包括乙酰胺苯酚、羟考酮、盐酸丙氧吩的曲马多。示范性糖皮质激素包括可的松(cortisone)、地塞米松、氢化可的松、甲基泼尼松龙(methylprednisolone)、泼尼松龙或泼尼松。示范性生物反应修饰剂包括针对细胞表面标记(例如CD4、CDS等)的分子、细胞因子抑制剂(如TNF拮抗剂(例如依那西普(etanercept)阿达木单抗(adalimumab)/>和英夫利昔单抗(infliximab)))、趋化因子抑制剂和粘附分子抑制剂。生物反应修饰剂包括单克隆抗体以及重组形式的分子。示范性DMARD包括硫唑嘌呤、环磷酰胺、环孢菌素、甲氨蝶呤、青霉胺、来氟米特、柳氮磺胺吡啶、羟氯喹(hydroxychloroquine)、戈尔德(Gold)(口服(金诺芬(auranofin))和肌内)和米诺环素(minocycline)。

在某些实施例中，本文所述的组合物与细胞因子结合施用。细胞因子的实例是淋巴因子、单核因子和传统多肽激素。细胞因子包括生长激素，如人类生长激素、N-蛋氨酰人类生长激素和牛生长激素；甲状旁腺激素(parathyroid hormone)；甲状腺素；胰岛素；胰岛素原；松弛素；松弛素原；糖蛋白激素，例如促卵泡激素(FSH)、促甲状腺激素(TSH)和促黄体激素(LH)；肝生长因子(HGF)；成纤维细胞生长因子(FGF)；催乳素；胎盘催乳素；苗勒氏(mullerian)抑制物质；小鼠促性腺激素相关肽；抑制素；活化素；血管内皮生长因子；整合素；血小板生成素(TPO)；神经生长因子(NGF)，如NGF-β；血小板生长因子；转化生长因子(TGF)，如TGF-α和TGF-β；胰岛素样生长因子-I和II；促红细胞生成素(EPO)；骨诱导因子；干扰素，例如干扰素-α、β和γ；集落刺激因子(CSF)，如巨噬细胞-CSF(M-CSF)、粒细胞-巨噬细胞-CSF(GM-CSF)和粒细胞-CSF(G-CSF)；白介素(IL)，如IL-1、IL-lα、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-15、IL-21；肿瘤坏死因子，如TNF-α或TNF-β；和其它多肽因子，包括LIF和kit配体(KL)。如本文所使用，术语细胞因子包括来自天然来源或来自重组细胞培养物的蛋白质，和天然序列细胞因子的生物活性等效物。

试剂盒和制品

本公开提供了试剂盒，其包含使用本文所提供的方法得到的表达CAR的免疫细胞中的任一种，和其药物组合物。在试剂盒的一个实施例中，经工程改造的CAR细胞在合适的培养基，例如CS10、/>CS2或/>CS5(BioLife Solutions)中冷冻。

在一些示范性实施例中，本公开的试剂盒包含表达CAR的同种异体T细胞和作为淋巴细胞耗竭方案和CAR-T方案的一种组分向受试者施用的CD52抗体。本公开还提供包含本文所述的治疗组合物或试剂盒中的任一者的制品。制品的实例包括小瓶(例如，包含表达CAR的免疫细胞的密封小瓶)。

实例

实例1：过程因素对免疫细胞转导效率的影响

A.MOI、生长培养基pH、浓度和培养容器对活CAR 1+免疫细胞的百分比的影响

PBMC收集

收集供体血液并通过单采血液成分术分离成其组成部分。接着，经GE(密度1.077g/mL)阶段梯度富集PBMC并在包含5％ DMSO的缓冲液中低温保存。

活化

第0天，将经分离的冷冻人类PBMC解冻并用包含X-VIVO^TM 15培养基(Lonza Biosciences)加10％人类血清(Gemini Bio Products,Sacramento,CA)的洗涤培养基洗涤一次。接着，将细胞在包含X-VIVO^TM 15培养基(Lonza Biosciences)和5％人类血清(Gemini Bio Products,Sacramento,CA)的培养基(在本文中又称为生长培养基)中培养并在标准加湿组织培养恒温箱中在37℃和5％ CO₂下孵育过夜。第1天，将细胞用洗涤培养基洗涤，计数并使其以每毫升1.5×10⁶个的细胞密度再悬浮于培养基中，且与T细胞TransAct^TM聚合物纳米基质(Miltenyi Biotec)以1:10的体积稀释度混合。添加重组人类IL-2(Miltenyi Biotec)达到100U/mL的最终浓度。接着，将T细胞在标准加湿组织培养恒温箱中在37℃和5％ CO₂下孵育直至第4天。

转导和扩增

第4天，洗涤细胞并使其以每毫升1×10⁶个的细胞密度再悬浮于含有重组人类IL-2(Miltenyi Biotec)的培养基中。在下表1中所描述的测试条件下用编码CAR 1(1560个核苷酸)的慢病毒载体(LVV#1831P,Lentigen Technology,Inc.,Gaithersburg,Maryland)转导细胞并在标准加湿组织培养恒温箱中在37℃和5％ CO₂下孵育直至第6天。第6天，对经转导细胞进行培养以扩增细胞群体。

表1：

*培养袋是MACS细胞分化袋-100(Miltenyi Biotec)

**板是6孔培养板(Corning,Inc.)

***根据第二列％LVV(v/v)计算

转导效率评估

第8天和第11天，通过流式细胞术确认转导效率和细胞活力。在转导之前、转导期间或转导之后没有添加聚凝胺、硫酸鱼精蛋白或DEAE-葡聚糖。对于每个测试组，对细胞样品进行洗涤并将其再悬浮于达尔伯克氏磷酸盐缓冲盐水(dulbecco's phosphatebuffered saline，“DPBS”)中。使用可商购的抗体/染色剂组合制备两种抗体/染色剂混合液，其各自包含一组不同的抗体。

将约1×10⁶个来自各测试组样品的细胞以及其中一种抗体/染色剂混合液的等分试样添加至FACS管中。接着，将FACS管在25℃下于暗处孵育25±5分钟。将样品洗涤两次且使其再悬浮于1％多聚甲醛(“PFA”)中，接着通过LSRFortessa细胞计数器(BDBiosciences,Franklin Lakes,New Jersey)处理并使用FlowJo软件第10版(FlowJo,LLC.,Ashland,Oregon)分析所得数据。

下表2提供在研究第8天和第11天每个测试组的活CAR+T细胞的百分比。

表2：

测试组	第8天	第11天
			1	22.6	42.9
2	46.7	73.4
			3	48.0	76.4
4	10.8	32.7
			5	42.6	75.8
6	56.1	66.0
			7	13.4	25.7
8	12.7	21.6
			9	52.7	69.6
10	26.2	43.8
			11	52.0	65.6
12	53.6	65.3
			13	14.8	22.7
14	10.0	18.3

以下制造过程因素对转导效率的影响绘示于图2中：慢病毒载体％(v/v)、生长培养基pH、试剂浓度和培养容器。主要影响和相互作用的显著性通过方差分析(ANOVA)，使用/>14软件(SAS Institute,Inc.,Cary,N.C.)，在设定为＜0.05的概率值(p值)阈值下测定。相较于在较低pH下转导细胞产生较低百分比的活CAR+细胞(参见图2B)，在7.0和更高pH下转导细胞产生较高百分比的活CAR+细胞(参见图2A)。主要影响和双因素相互作用的p值示于图2C中。

如图2中所示，出人意料地，试剂(Takara Bio USA)浓度对CAR转导效率无显著影响。实际上，在测试的所有因素中pH对转导效率具有最显著的影响，MOI和转导容器也有助于转导效率。

B.生长培养基pH和浓度对活CAR-2+免疫细胞的百分比的影响

收集PBMC，活化并在部分因子实验(使用14软件，最优选D型设计)中通过以上实例1A中所描述的方法转导CAR-2(约1500个核苷酸)以评估pH和/>浓度对活CAR-2+T细胞的百分比的影响。

转导效率评估

在第15天，如以上实例1A中所描述，通过流式细胞术确认转导效率和细胞活力。主要影响和相互作用的显著性通过方差分析(ANOVA)，使用14软件(SAS Institute,Inc.,Cary,N.C.)，在设定为＜0.05的概率值(p值)阈值下测定并建模。使用/>14ANOVA软件以48的MOI模拟活CAR+T细胞％结果以评估在表3中指定的/>浓度和培养基pH下，/>和培养基pH对活CAR+T细胞％的主要影响。结果展示于表3的最右一列中。

表3：

表3显示，相较于在6.7的较低pH以及存在和不存在试剂的情况下转导细胞，在pH 7.3下以及存在或不存在/>试剂的情况下转导T细胞产生较高百分比的活CAR+细胞。出人意料地，/>试剂浓度对CAR转导效率的影响并不是最大的。转导期间的培养基pH对转导效率的影响是最大的。

实例2：载体整合转导时程

在第0天，将PBMC(如以上实例1中所描述那样收集)在2L透气袋(Xuri^TMCellbag^TM,GE Lifesciences,Inc.)中解冻。通过以1:10的体积稀释度添加TransAct^TM聚合物纳米基质(Miltenyi Biotec)，对另外包含5％人类血清(Gemini Bio Products,Sacramento,CA)、IL-2和谷氨酰胺的X-VIVO^TM 15培养基(Lonza Biosciences)中的浓度为1.5×10⁶个细胞/毫升的细胞进行活化。在37℃下将细胞在波浪作用生物反应器(wave actionbioreactor)中培养。

在第2天，将编码CAR-2(1500个核苷酸)的1％(v/v)慢病毒载体(LVV#1831P,Lentigen Technology,Inc.,Gaithersburg,Maryland)添加至pH为7.2±0.1的细胞培养物中。将所得的转导反应混合物在37℃下培养8小时。在转导期间没有使用另外在转导之前、转导期间或转导之后没有添加聚凝胺、硫酸鱼精蛋白或DEAE-葡聚糖。

在将慢病毒载体引入到细胞后1、2、4、6和8小时，从培养基获得细胞样品。对每个细胞样品离心，洗涤并使其以1×10⁶个细胞/毫升的细胞密度再悬浮于培养基中，且根据制造商的说明书，在40mL体积的细胞培养系统(Wilson Wolf Corporation,SaintPaul,Minnesota)中培养14天。

如以上实例1中所描述，在第7天和第14天通过流式细胞术测定CAR+细胞百分比。

结果绘示于图3中。如图所示，相较于第7天，在第14天每一转导时间点的CAR+细胞％更高。另外，在第14天，CAR+细胞％的增加在转导4小时之后开始减慢且在转导6至8小时开始趋于平稳。

实例3：制造规模免疫细胞转导

对表达CAR-1的T细胞进行十四轮制造规模操作。第7-14轮操作如下所描述进行。第1-6轮操作如下所描述进行，但一个例外是转导步骤在小于7.2的pH下进行。

PBMC收集、活化和转导

在透气袋中将PBMC(如以上实例1中所描述那样收集)在包含人类血清的培养基中解冻，并在37℃和5％ CO₂下孵育过夜。

接着，对PBMC进行洗涤，使其再悬浮于包含5％人类血清、IL-2、谷氨酰胺、CD3和CD28刺激试剂的培养基中并在37℃和5％ CO₂下孵育。

将活化细胞用培养基洗涤以去除活化试剂，并使其再悬浮于培养基中。培养基包含5％人类血清、IL-2和谷氨酰胺。在将细胞引入培养基中之前，将CO₂自培养基去除以达到7.2或更高的pH。在透气袋中，将细胞以1×10⁶个细胞/毫升的细胞密度再悬浮于制造规模体积的培养基(制造规模转导体积)中。将编码CAR-1的慢病毒载体(LVV#1831P,LentigenTechnology,Inc.,Gaithersburg,Maryland)以10％ LVV(V/V)添加至细胞悬浮液中。将所得的转导反应混合物在37℃和5％ CO²下培养48小时。在转导期间没有使用另外没有向转导中添加聚凝胺、硫酸鱼精蛋白或DEAE-葡聚糖。

扩增

对细胞进一步进行电穿孔以破坏靶基因，随后使其在灌注波生物反应器(perfusion wave bioreactor)中的1升总体积的培养基中扩增。第18天，对T细胞执行富集以选出基因表达被破坏的T细胞。

CAR表达和细胞活力

第19天，如以上实例1A中所描述，通过流式细胞术评估CAR表达和细胞活力，且描述于下表4中。

表4：

*标准差

表4显示，相较于在小于7.1的pH下转导的细胞，在大于7.1的pH下转导的细胞具有更高百分比的表达CAR的活细胞。此外，所述表显示，相对于在小于7.1的pH下转导的细胞，在大于7.1的pH下转导细胞在每轮操作间产生更一致百分比的表达CAR的活细胞。

Claims (82)

1.一种用逆转录病毒载体转导细胞群体的方法，所述载体包含对于所述细胞为外源性的核酸，所述方法包含：

a)选择所述细胞群体，其中所选择的细胞群体包含T淋巴细胞、辅助T细胞、肿瘤细胞、记忆T细胞、细胞毒性T细胞、自然杀伤T细胞、外周血淋巴细胞、外周血单核细胞、树突状细胞或自然杀伤细胞或其混合物；和

b)在细胞培养基中，在7.0至7.9的起始pH范围内的起始pH下将所选择的细胞群体与所述逆转录病毒载体一起培养，并在转导培养步骤的至少第一个小时内将所述起始pH维持在所述起始pH范围内，以产生经转导细胞群体，所述经转导细胞群体包含表达由所述外源性核酸编码的基因产物的细胞。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述起始pH维持在所述起始pH范围内，保持至少约1、约2、约4、约6、约8、约10、约12、约14、约16、约18、约20、约22、约24、约36、约48、约72或约96小时至不超过约168小时。

3.根据权利要求1所述的方法，其中将所述起始pH维持在高于约7.0，直至转导培养步骤结束。

4.根据权利要求3所述的方法，其中转导培养步骤进行至少约1、约2、约4、约6、约8、约12、约14、约16、约18、约20、约22、约24、约36、约48、约72或约96小时。

5.根据前述权利要求中任一权利要求所述的方法，其中所述细胞培养基不包含共定位剂。

6.根据前述权利要求中任一权利要求所述的方法，其中所述细胞培养基不包含纤维连接蛋白或纤维连接蛋白衍生物。

7.根据前述权利要求中任一权利要求所述的方法，其中所选择的细胞群体以约0.25、约0.5、约1、约5、约10、约15、约20、约25、约30、约35、约40、约45、约或约50至约55、约60、约65、约70、约75、约80、约85、约90、约95、约100、约125、约150、约175、约200、约225或约250的MOI培养。

8.根据前述权利要求中任一权利要求所述的方法，其中所述外源性核酸编码嵌合抗原受体。

9.根据前述权利要求中任一权利要求所述的方法，其中所选择的细胞群体在容器中培养，其中所述容器是细胞培养板、细胞培养深孔板、细胞培养室(cell stack)、受控生物反应器、摇瓶或透气袋。

10.根据前述权利要求中任一权利要求所述的方法，其中所述逆转录病毒载体是慢病毒载体。

11.根据前述权利要求中任一权利要求所述的方法，其中转导培养步骤包含在约0.5升体积至约10升体积的细胞培养基中将所选择的细胞群体与所述逆转录病毒载体一起培养。

12.根据前述权利要求中任一权利要求所述的方法，其中在转导培养步骤起始之后约3至约18天，至少约35％至约95％、约40％至约95％、约50％至约95％、约60％至约95％或约70％至约95％的经转导细胞群体表达外源性核酸基因产物。

13.根据前述权利要求中任一权利要求所述的方法，其中在转导培养步骤起始之后约7至约18天，至少约35％至约95％、约40％至约95％、约50％至约95％、约60％至约95％或约70％至约95％的经转导细胞群体表达外源性核酸基因产物。

14.根据前述权利要求中任一权利要求所述的方法，其中所述起始pH范围被动地维持。

15.根据权利要求1至13中任一权利要求所述的方法，其中所述起始pH范围主动地维持。

16.根据前述权利要求中任一权利要求所述的方法，其中所选择的细胞群体为同种异体细胞群体。

17.根据权利要求1至15中任一权利要求所述的方法，其中所选择的细胞群体为自体细胞群体。

18.一种转导第一和第二细胞群体的方法，其中所述第一和第二细胞群体通过根据前述权利要求中任一权利要求所述的相同方法转导，由此第一和第二经转导细胞群体中表达外源性核酸基因产物的经转导细胞群体的百分比不会相差超过约2％至约5％、约5％至约10％、约10％至约20％或约20％至约30％。

19.根据前述权利要求中任一权利要求所述的方法，其中没有向所述细胞培养基中添加聚阳离子。

20.根据前述权利要求中任一权利要求所述的方法，其中没有向所述培养基中添加聚凝胺、硫酸鱼精蛋白或DEAE-葡聚糖。

21.一种用逆转录病毒载体转导细胞毒性T细胞群体的方法，所述载体包含对于所述细胞毒性T细胞为外源性的核酸，所述方法包含在细胞培养基中，在7.0至7.9的起始pH范围内的起始pH下将所述细胞毒性T细胞群体与所述逆转录病毒载体一起培养，并在转导培养步骤的至少第一个小时内将所述起始pH维持在所述起始pH范围内，以产生经转导细胞毒性T细胞群体，所述经转导细胞毒性T细胞群体包含表达由所述外源性核酸编码的基因产物的细胞，且其中所述细胞培养基不包含共定位剂。

22.根据权利要求21所述的方法，其中所述起始pH维持在7.0至7.9的起始pH范围内，保持至少约1、约2、约6、约8、约10、约12、约14、约16、约18、约20、约22、约24、约36、约48、约72或约96小时至不超过约168小时。

23.根据权利要求21所述的方法，其中将所述起始pH维持在所述起始pH范围内，直至转导培养步骤结束。

24.根据权利要求23所述的方法，其中转导培养步骤进行至少约1、约2、约4、约6、约8、约12、约14、约16、约18、约20、约22、约24、约36、约48、约72或约96小时。

25.根据前述权利要求21至24中任一权利要求所述的方法，其中所述共定位剂为纤维连接蛋白或纤维连接蛋白衍生物。

26.根据前述权利要求21至25中任一权利要求所述的方法，其中所述细胞毒性T细胞群体以约0.25、约0.5、约1、约5、约10、约15、约20、约25、约30、约35、约40、约45、约或约50至约55、约60、约65、约70、约75、约80、约85、约90、约95、约100、约125、约150、约175、约200、约225或约250的MOI培养。

27.根据前述权利要求21至26中任一权利要求所述的方法，其中所述外源性核酸编码嵌合抗原受体。

28.根据前述权利要求21至27中任一权利要求所述的方法，其中所述细胞毒性T细胞群体在容器中培养，其中所述容器是细胞培养板、细胞培养深孔板、细胞培养室、受控生物反应器、摇瓶或透气袋。

29.根据前述权利要求21至28中任一权利要求所述的方法，其中所述逆转录病毒载体是慢病毒载体。

30.根据前述权利要求21至29中任一权利要求所述的方法，其中转导培养步骤包含在约0.5升体积至约10升体积的细胞培养基中将所述细胞毒性T细胞群体与所述逆转录病毒载体一起培养。

31.根据前述权利要求21至30中任一权利要求所述的方法，其中在转导培养步骤起始之后3至18天，35％至约95％、约40％至约95％、约50％至约95％、约60％至约95％或约70％至约95％的经转导细胞毒性T细胞群体表达外源性核酸基因产物。

32.根据前述权利要求21至31中任一权利要求所述的方法，其中在转导培养步骤起始之后7至18天，35％至约95％、约40％至约95％、约50％至约95％、约60％至约95％或约70％至约95％的经转导细胞毒性T细胞群体表达外源性核酸基因产物。

33.根据前述权利要求21至32中任一权利要求所述的方法，其中所述起始pH范围被动地维持。

34.根据权利要求21至32中任一权利要求所述的方法，其中所述起始pH范围主动地维持。

35.根据前述权利要求21至34中任一权利要求所述的方法，其中所述细胞毒性T细胞群体为同种异体细胞毒性T细胞群体。

36.根据权利要求21至34中任一权利要求所述的方法，其中所述细胞毒性T细胞群体为自体细胞毒性T细胞群体。

37.一种转导第一和第二细胞毒性T细胞群体的方法，其中所述第一和第二细胞毒性T细胞群体通过根据前述权利要求21至36中任一权利要求所述的方法转导，由此第一和第二经转导细胞毒性T细胞群体中表达外源性核酸基因产物的经转导细胞毒性T细胞群体的百分比不会相差超过约2％至约5％、约5％至约10％、约10％至约20％或约20％至约30％。

38.根据前述权利要求21至37中任一权利要求所述的方法，其中没有向所述细胞培养基中添加聚阳离子。

39.根据前述权利要求21至38中任一权利要求所述的方法，其中没有向所述培养基中添加聚凝胺、硫酸鱼精蛋白或DEAE-葡聚糖。

40.一种用逆转录病毒载体转导外周血单核细胞群体的方法，所述载体包含对于所述外周血单核细胞为外源性的核酸，所述方法包含在细胞培养基中，在7.0至7.9的起始pH范围内的起始pH下将所述外周血单核细胞群体与所述逆转录病毒载体一起培养，并在转导培养步骤的至少第一个小时内将所述起始pH维持在所述起始pH范围内，以产生经转导外周血单核细胞群体，所述经转导外周血单核细胞群体包含表达由所述外源性核酸编码的基因产物的细胞，且其中所述细胞培养基不包含共定位剂。

41.根据权利要求40所述的方法，其中所述起始pH维持在7.0至7.9的起始pH范围内，保持至少约1、约2、约4、约6、约8、约10、约12、约14、约16、约18、约20、约22、约24小时、约36、约48、约72或约96小时至不超过约168小时。

42.根据权利要求40所述的方法，其中将所述起始pH维持在所述起始pH范围内，直至转导培养步骤结束。

43.根据权利要求42所述的方法，其中转导培养步骤进行至少约1、约2、约4、约6、约8、约12、约14、约16、约18、约20、约22、约24、约36、约48、约72或约96小时。

44.根据前述权利要求40至43中任一权利要求所述的方法，其中所述共定位剂为纤维连接蛋白或纤维连接蛋白衍生物。

45.根据前述权利要求40至44中任一权利要求所述的方法，其中所述外周血单核细胞群体以约0.25、约0.5、约1、约5、约10、约15、约20、约25、约30、约35、约40、约45、约或约50至约55、约60、约65、约70、约75、约80、约85、约90、约95、约100、约125、约150、约175、约200、约225或约250的MOI培养。

46.根据前述权利要求40至45中任一权利要求所述的方法，其中所述外源性核酸编码嵌合抗原受体。

47.根据前述权利要求40至46中任一权利要求所述的方法，其中所述外周血单核细胞群体在容器中培养，其中所述容器是细胞培养板、细胞培养深孔板、细胞培养室、受控生物反应器、摇瓶或透气袋。

48.根据前述权利要求40至47中任一权利要求所述的方法，其中所述逆转录病毒载体是慢病毒载体。

49.根据前述权利要求40至48中任一权利要求所述的方法，其中转导培养步骤包含在约0.5升体积至约10升体积的细胞培养基中将所述外周血单核细胞群体与所述逆转录病毒载体一起培养。

50.根据前述权利要求40至49中任一权利要求所述的方法，其中在转导培养步骤起始之后3至18天，至少约35％至约95％、约40％至约95％、约50％至约95％、约60％至约95％、约70％至约95％的所述经转导外周血单核细胞群体表达外源性核酸基因产物。

51.根据前述权利要求40至50中任一权利要求所述的方法，其中在转导培养步骤起始之后7至18天，至少约35％至约95％、约40％至约95％、约50％至约95％、约60％至约95％、约70％至约95％的所述经转导外周血单核细胞群体表达外源性核酸基因产物。

52.根据前述权利要求40至51中任一权利要求所述的方法，其中所述起始pH范围被动地维持。

53.根据权利要求40至52中任一权利要求所述的方法，其中所述起始pH范围主动地维持。

54.根据前述权利要求40至53中任一权利要求所述的方法，其中所述外周血单核细胞群体为同种异体外周血单核细胞群体。

55.根据权利要求40至54中任一权利要求所述的方法，其中所述外周血单核细胞群体为自体外周血单核细胞群体。

56.一种转导第一和第二外周血单核细胞群体的方法，其中所述第一和第二外周血单核细胞群体通过根据前述权利要求40至55中任一权利要求所述的相同方法转导，由此第一和第二经转导外周血单核细胞群体中表达外源性核酸基因产物的经转导外周血单核细胞群体的百分比不会相差超过约2％至约5％、约5％至约10％、约10％至约20％或约20％至约30％。

57.根据前述权利要求40至56中任一权利要求所述的方法，其中没有向所述细胞培养基中添加聚阳离子。

58.根据前述权利要求40至57中任一权利要求所述的方法，其中没有向所述培养基中添加聚凝胺、硫酸鱼精蛋白或DEAE-葡聚糖。

59.一种用逆转录病毒载体转导衍生自诱导性多能干细胞的T细胞群体的方法，所述载体包含对于衍生T细胞为外源性的核酸，所述方法包含在细胞培养基中，在7.0至7.9的起始pH范围内的起始pH下将衍生T细胞群体与所述逆转录病毒载体一起培养，并在转导培养步骤的至少第一个小时内将所述起始pH维持在所述起始pH范围内，以产生经转导的衍生T细胞群体，所述经转导的衍生T细胞群体包含表达由所述外源性核酸编码的基因产物的细胞，且其中所述细胞培养基不包含共定位剂。

60.根据权利要求59所述的方法，其中所述起始pH维持在7.0至7.9的起始pH范围内，保持至少约1、约2、约6、约8、约10、约12、约14、约16、约18、约20、约22、约24、约36、约48、约72或约96小时至不超过约168小时。

61.根据权利要求59所述的方法，其中将所述起始pH维持在所述起始pH范围内，直至转导培养步骤结束。

62.根据权利要求61所述的方法，其中转导培养步骤进行至少约1、约2、约4、约6、约8、约12、约14、约16、约18、约20、约22、约24、约36、约48、约72或约96小时。

63.根据前述权利要求59至62中任一权利要求所述的方法，其中所述共定位剂为纤维连接蛋白或纤维连接蛋白衍生物。

64.根据前述权利要求59至63中任一权利要求所述的方法，其中衍生T细胞群体以约0.25、约0.5、约1、约5、约10、约15、约20、约25、约30、约35、约40、约45、约或约50至约55、约60、约65、约70、约75、约80、约85、约90、约95、约100、约125、约150、约175、约200、约225或约250的MOI培养。

65.根据前述权利要求59至64中任一权利要求所述的方法，其中所述外源性核酸编码嵌合抗原受体。

66.根据前述权利要求59至65中任一权利要求所述的方法，其中衍生T细胞群体在容器中培养，其中所述容器是细胞培养板、细胞培养深孔板、细胞培养室、受控生物反应器、摇瓶或透气袋。

67.根据前述权利要求59至66中任一权利要求所述的方法，其中所述逆转录病毒载体是慢病毒载体。

68.根据前述权利要求59至67中任一权利要求所述的方法，其中转导培养步骤包含在约0.5升体积至约10升体积的细胞培养基中将衍生T细胞群体与所述逆转录病毒载体一起培养。

69.根据前述权利要求59至68中任一权利要求所述的方法，其中在转导培养步骤起始之后3至18天，至少约35％至约95％、约40％至约95％、约50％至约95％、约60％至约95％、约70％至约95％的经转导的衍生T细胞群体表达外源性核酸基因产物。

70.根据前述权利要求59至69中任一权利要求所述的方法，其中在转导培养步骤起始之后7至18天，至少约35％至约95％、约40％至约95％、约50％至约95％、约60％至约95％、约70％至约95％的经转导的衍生T细胞群体表达外源性核酸基因产物。

71.根据前述权利要求59至70中任一权利要求所述的方法，其中所述起始pH范围被动地维持。

72.根据权利要求59至70中任一权利要求所述的方法，其中所述起始pH范围主动地维持。

73.根据前述权利要求59至72中任一权利要求所述的方法，其中衍生T细胞群体为同种异体衍生T细胞群体。

74.根据权利要求59至72中任一权利要求所述的方法，其中衍生T细胞群体为自体衍生T细胞群体。

75.一种转导第一和第二衍生T细胞群体的方法，其中所述第一和第二衍生T细胞群体通过根据前述权利要求59至74中任一权利要求所述的相同方法转导，由此第一和第二经转导的衍生T细胞群体中表达外源性核酸基因产物的经转导的衍生T细胞群体的百分比不会相差超过2％至5％、5％至10％、10％至20％或20％至30％。

76.根据前述权利要求59至75中任一权利要求所述的方法，其中没有向所述细胞培养基中添加聚阳离子。

77.根据前述权利要求59至76中任一权利要求所述的方法，其中没有向所述培养基中添加聚凝胺、硫酸鱼精蛋白或DEAE-葡聚糖。

78.一种经遗传修饰的细胞，其通过根据前述权利要求中任一权利要求所述的方法产生。

79.一种经遗传修饰的细胞群体，其通过根据前述权利要求中任一权利要求所述的方法产生。

80.一种治疗组合物，其包含根据权利要求78或79所述的细胞或细胞群体。

81.一种治疗受试者的疾病的方法，其包含向有需要的所述受试者施用治疗有效量的由根据权利要求1至77中任一权利要求所述的方法产生的细胞。

82.一种治疗受试者的疾病的方法，其包含向有需要的所述受试者施用治疗有效量的根据权利要求80所述的治疗组合物。