KR20230142760A - Car t 세포 의약품의 제형 및 프로세스 - Google Patents

Abstract

세포 생존률을 개선하고, 의약품을 위해 제조된 제형화된 세포의 폐기물을 최소화할 수 있는 제형 및 의약품 프로세스가 본원에 제공된다.

Description

CAR T 세포 의약품의 제형 및 프로세스

관련 출원에 대한 상호 참조

본 출원은 2021년 2월 3일에 출원된 미국 가출원 제63/145,235호에 대한 우선권을 주장하며, 그 내용은 그 전체가 참조로서 본원에 통합된다.

기술분야

본 개시는 CAR T 세포 의약품을 포함하는, 세포 기반 의약품을 처리하기 위한 제형 및 방법에 관한 것이다.

CAR T 세포와 같은 조작된 면역 세포를 제조하는 최종 단계는 활성 약물 물질 세포를 하나 이상의 최종 용기에 제형화하고 충진하는 것, 또는 의약품 프로세스(DP 프로세스)이다. 예를 들어, 제조 후, 세포를 원심분리에 의해 배양 배지로부터 수확하고, 동결보존제(예컨대, 디메틸설폭시드, DMSO)를 함유할 수 있는 조성물로 제형화한다. 제형화된 세포는 적절한 용기 밀폐 시스템에 충진되고, 액체 질소(vLN2)의 기상에 보관되기 전에 동결될 수 있다.

DP 프로세스는, 예를 들어, 세포가 배양 배지 및 배양 조건으로부터 제거되기 때문에 잠재적으로 세포에 대해 스트레스를 줄 수 있고, 제형화는 보관을 위한 동결보존제(예를 들어, 디메틸설폭시드, DMSO)를 함유할 수 있다. DMSO는 시간 의존적 방식으로 세포에 부정적인 영향을 미칠 수 있는 강한 용매이다. 추가적인 스트레스의 원인은 세포의 물리적 쉐이킹, 혼합 및 펌핑, 및 실온 또는 다른 비-세포 배양 조건에 대한 세포의 노출로부터 기인할 수 있다. 의약품 프로세스는 배치 크기에 따라 몇 시간이 걸릴 수 있으며, DP 균질성을 보장하기 위해 세포를 건강하게 현탁 상태로 유지해야 한다. 따라서, 현장에서의 합의는 시간이 의약품 프로세스에서의 제한 인자이며, 동결 전에 다양한 스트레스 조건에 대한 세포의 노출 시간을 최소화하는 것이 중요하다는 것이다.

세포 생존률과 건강을 개선하고 최종 의약품의 낭비를 최소화할 수 있는 DP 프로세스가 필요하다. 이는 각 제조 배치에서 여러 용량의 세포를 대량으로 생산할 수 있는 동종 세포 의약품에 있어서 특히 중요하다.

세포 기반 요법에 사용하기 위한 세포의 생존률 및 건강을 개선할 수 있고 제조 및 의약품 프로세스에서 낭비를 최소화할 수 있는 시약 및 프로세스가 본원에 제공된다.

제형 및 충진 프로세스 동안 세포 생존률을 유지하는 것은 매우 중요하고 도전적이다. 제형 조성물 및 의약품 프로세스를 최적화하는 것은 전반적인 세포 건강 및 기능을 유지하는 데 중요하다. 본 개시는 개선된 제형 및/또는 프로세스를 제공하며, 이는 보다 양호한 세포 건강 및 생존률을 유지하고 의약품 프로세스를 완료하기에 충분한 시간을 허용한다. 전체 세포 건강과 생존률 및 투여량 함량의 균일성을 보장하면서, 낭비를 최소화하도록 의약품 프로세스에서 대량 배치로 생산될 수 있는 조작된 면역 세포와 같은 조작된 세포를 처리하는 데 특히 유리하다.

따라서, 일 양태에서, 본 개시는 세포의 건강 및/또는 균질성을 유지하는 의약품 프로세스를 제공한다. 특정 구현예에서, 본 개시는 조작된 면역 세포를 포함하는 의약품을 제조하는 의약품 프로세스를 제공하며, 상기 방법은 의약품을 형성하기 위해 동결보존제를 함유하는 조성물에서 조작된 면역 세포를 제형화하는 단계, 및 상기 의약품을 하나 이상의 용기에 혼합하고 충진하는 단계를 포함하되, 상기 의약품은 균질성을 유지한다. 특정 구현예에서, 상기 혼합 및 충진 단계는 적어도 약 2시간이 걸린다. 특정 구현예에서, 상기 혼합 및 충진 단계는 약 2시간, 약 3시간, 약 4시간, 약 5시간 또는 약 6시간이 걸린다. 특정 구현예에서, 상기 혼합은 간헐적인 혼합을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 혼합은 연속 혼합을 포함한다. 특정 구현예에서, 상기 간헐적 혼합은 쉐이커 플라스크 내에서 이루어진다. 특정 구현예에서, 상기 간헐적 혼합은 스피너 플라스크 내에서 이루어진다. 특정 구현예에서, 상기 간헐적 혼합은 약 1 내지 약 3분, 약 10 내지 약 40분마다 혼합하는 것을 포함한다. 특정 구현예에서, 상기 혼합은 스피너 플라스크에서의 연속 혼합을 포함한다. 특정 구현예에서, 상기 혼합은 약 2시간 동안 쉐이커 플라스크에서의 연속 혼합을 포함한다. 특정 구현예에서, 상기 혼합은 2시간 미만 동안 쉐이커 플라스크에의 연속 혼합을 포함한다. 특정 구현예에서, 상기 혼합은 2시간 미만 동안 쉐이커 플라스크에서의 연속 혼합을 포함한다.

특정 구현예에서, 상기 혼합 및 충진 단계는 약 4℃에서 이루어진다. 특정 구현예에서, 상기 혼합 및 충진 단계는 실온에서 이루어진다. 특정 구현예에서, 혼합 속도는 약 30 내지 약 85 rpm이다. 특정 실시예들에서, 상기 동결보존제는 DMSO 또는 글리세롤을 포함한다. 특정 구현예에서, 상기 동결보존제는 약 3% DMSO 내지 약 10% DMSO를 포함한다. 특정 구현예에서, 상기 동결보존제는 약 5% DMSO를 포함한다. 특정 구현예에서, 상기 조성물은 점도를 향상시키는 부형제를 더 포함한다. 특정 구현예에서, 상기 조작된 면역 세포는 T 세포, 염증성 T 림프구, 세포독성 T 림프구, 조절 T 림프구, 헬퍼 T 림프구, 효과기 T 림프구, 종양 침윤 림프구(TIL), NK 세포, NK-T 세포, TCR 발현 세포, TCR 녹아웃 T 세포, 수지상 세포, 대식세포, 살해 수지상 세포, 비만 세포, 또는 B 세포이다. 일부 구현예에서, 상기 조작된 면역 세포는 CAR T 세포이다. 일부 구현예에서, 상기 조작된 면역 세포는 동종 CAR T 세포이다. 특정 구현예에서, 상기 조작된 면역 세포는 자가 CAR T세포이다. 일부 구현예에서, 상기 조작된 면역 세포는 인간 세포이다.

또 다른 양태에서, 본 개시는 본원에 개시된 의약품 프로세스에 의해 제조된 조작된 면역 세포를 포함하는 의약품을 제공한다.

또 다른 양태에서, 본 개시는 치료를 필요로 하는 대상체를 치료하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 본원에 개시된 의약품을 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 특정 구현예에서, 대상체는 인간이다.

도 1은 의약품을 위한 조작된 세포의 최종 제조 단계의 예시적인 워크플로우를 보여준다.
도 2a~2b는 생존 세포 밀도(VCD) 및 세포 생존률에 대한 CAR T 세포 제형의 오비탈 쉐이커 혼합의 영향을 보여준다.
도 3a~3b는 오비탈 쉐이커 혼합 및 제형 유지 온도가 VCD 및 생존률에 미치는 영향을 보여준다.
도 4a~4b는 20E6/ml 또는 100E6/ml의 CAR T 세포를 함유하는 세포 제형에서 세포 침전에 대한 시간 경과 분석 결과를 보여준다.
도 5a~5b의 데이터는 동결 전 CAR T 의약품의 VCD와 생존율에 대한 연속 쉐이커 플라스크 혼합, 간헐적 쉐이커 플라스크 혼합과 연속 스피너 플라스크 혼합의 영향을 비교한다. 도 5c는 스피너 플라스크에서의 연속 혼합 또는 간헐적 혼합 후 동결 전 CAR T 세포 의약품의 VCD 및 생존률의 결과를 비교한다. 연속 쉐이커: 오비탈 쉐이커 플랫폼의 엘렌마이어(Erlenmeyer) 쉐이커 플라스크에서 제형화된 세포를 85 rpm으로 연속 혼합; 연속 스피너: 자기 교반 플레이트(magnetic stir plate)의 스피너 플라스크에서 제형화된 세포를 40 rpm으로 연속 혼합; 간헐적 쉐이커 10: 오비탈 쉐이커 플랫폼 상의 엘렌마이어 쉐이커 플라스크에서 제형화된 세포를 10분마다 2분 동안 85 rpm으로 혼합; 간헐적 쉐이커 30: 오비탈 쉐이커 플랫폼 상의 엘렌마이어 쉐이커 플라스크 에서 제형화된 세포를 30분마다 2분 동안 85 rpm으로 혼합; 및 간헐적 스피너: 자기 교반 플레이트 상의 스피너 플라스크에서 제형화된 세포를 10분마다 2분 동안 40 rpm으로 혼합. 샘플의 삼중체를 시험하였다.
도 6은 동결 전 CAR T 세포 또는 상이한 충진 프로세스를 거친 해동 후 CAR T 세포의 VCD 및 세포 생존률(%)의 결과를 충진 시간의 함수로서 나타내고 있다. 샘플의 삼중체를 시험하였다.
도 7a는 상이한 혼합 속도에서 연속 혼합을 거친 스피너 플라스크에서 CAR T 세포의 VCD 및 세포 생존률(%)를 보여준다. 도 7b는 50 rpm에서 연속 스피너 플라스크 혼합을 거친 300 ml 또는 600 ml의 시작 부피의 스피너 플라스크에서 CAR T 세포의 VCD 및 세포 생존률(%) 을 보여준다. 샘플의 삼중체를 시험하였다.
도 8a는 4시간의 동결 전 CAR T 세포의 과정에서 스피너 플라스크에서의 연속 혼합 및 쉐이커 플라스크에서의 간헐적 혼합의 결과를 비교한다. 도 8b는 연속적인 스피너 플라스크 혼합 또는 간헐적 쉐이커 플라스크 혼합에 의해 처리된 해동 후 세포의 VCD 및 생존률(%)를 보여준다. 샘플의 삼중체를 시험하였다.

일 양태에서, 본 개시는 의약품의 제조 및 충진을 위한 제형 및 방법을 제공한다. 일 양태에서, 본 개시는 세포 기반 치료제에 대한 의약품 프로세스를 제공하며, 상기 의약품 프로세스는 세포 생존률 및/또는 의약품 균질성을 유지하면서 제조 세포 기반 의약품의 충진 또는 처리를 완료하는 데 충분한 시간을 허용한다. 일부 구현예에서, 의약품은 GMP 의약품이고/이거나 대량으로 생산된다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "a" 및 "an"은 하나 이상의 의미로 사용된다. 예를 들어, "세포" 또는 "항체"에 대한 언급은 "하나 이상의 세포" 또는 "하나 이상의 항체"를 의미한다.

의약품은 하나 이상의 다른 성분과 관련하여 약물 물질을 일반적으로 함유하지만 반드시 그렇지는 않은 최종 투여 형태를 지칭한다.

의약품 프로세스는, 충진된 의약품을 예를 들어, 동결-보관을 위해, 액체 질소 보관을 위해, 4℃보관을 위해 또는 환자에게 직접 사용하기 위해 보내기 전에 GMP 제조의 최종 단계를 지칭한다.

의약품 프로세스는 세포 기반 치료제의 GMP 제조에 중요하다. 의약품 프로세스는 최적의 세포 배양 조건으로부터 제조된 세포를 수확하고 세포에 스트레스를 줄 수 있는 조건을 갖는 것을 포함한다. 현재 프로세스에서, 세포는 의약품 프로세스 동안 균일한 분포를 보장하기 위해 지속적으로 혼합된다. 세포의 스트레스 조건에 대한 노출을 최소화하여 세포 생존률 및 세포 생성물 균질성을 보장하여 품질 제어를 통과시키기 위한 단계를 취할 수 있다. 스트레스 조건에 대한 세포의 노출을 최소화하기 위해 의약품 충진 시간을 제어하는 것은 때때로 충진 시간 범위 내에서 처리될 수 없는 미충진된 의약품 및 불필요한 폐기물로 이어질 수 있다.

스트레스의 한 가지 원인은 의약품 프로세스 동안 세포 혼합이다. 세포를 현탁 상태로 유지하고 세포가 침전되는 것을 방지하기 위해, 제형화된 세포는 의약품 프로세스 동안 연속 혼합을 거치고 있다. 쉐이커 플라스크 혼합에서, 제형화된 세포를 쉐이커 플라스크, 예를 들어, 엘렌마이어 플라스크에 넣고, 그런 다음 혼합을 가능하게 하기 위해 쉐이커 또는 오비탈 쉐이커와 같은 쉐이커 플랫폼 상에 둔다. 대조적으로, 스피너 플라스크에는 혼합 장치, 예를 들어, 교반 막대가 장착된 상부 장착 임펠러 또는 패들이 구비되며, 이는 스피너 플라스크 내부에서 내용물의 혼합을 가능하게 한다. 스피너 플라스크 혼합은, 스피너 플라스크가 자기 교반 플레이트 상에 놓이고, 자기력에 의해 구동될 때 패들/교반 막대가 회전할 때 발생할 수 있다. 스피너 플라스크 혼합은 또한, 예를 들어, 임펠러를 기계적으로 회전시킴으로써 구동되는 다른 수단에 의해 발생할 수 있다. 예시적인 스피너 플라스크는, 제한 없이, Pyrex® ProCulture^TM　스피너 플라스크, Corning® 스피너 플라스크 등을 포함한다.

특히, 스피너 플라스크 내의 세포와는 달리, 쉐이커 플라스크 내의 세포는 패들과 같은 혼합 장치와 직접 접촉하지 않기 때문에, 쉐이커 플라스크 혼합은 스피너 플라스크 혼합보다 세포에 더 부드러운 것으로 일반적으로 여겨졌다. 본원에 개시된 바와 같이, 제형화된 세포는 연속 혼합이 교반 플라스크와 비교하여 스피너 플라스크에서 수행될 때 우수한 생존률 및 생존 세포 밀도를 유지한다는 것이 놀랍게도 발견되었다.

의약품 프로세스에서의 스트레스 조건은 세포 사멸로 이어질 수 있고, 추가로 세포 응집 및 응집체를 유발할 수 있으며, 이들 모두는 궁극적으로 의약품의 품질, 강도 및 효능에 영향을 미칠 수 있다. 따라서, 일부 구현예에서, 본 개시는 의약품을 제조하는 프로세스를 제공하며, 여기서 의약품은 세포 건강 및 균질성을 유지한다.

따라서, 일 양태에서, 본 개시는 조작된 면역 세포를 포함하는 의약품을 제조하는 방법을 제공하며, 상기 방법은, 의약품을 형성하기 위한 동결보존제를 함유하는 조성물에서 조작된 면역 세포를 제형화하는 단계, 및 상기 의약품을 하나 이상의 용기에 혼합하고 충진하는 단계를 포함하되, 상기 의약품의 세포 건강 및 균질성이 유지된다.

본원에서 사용되는 바와 같은 세포 기반 의약품의 균질성은 세포 침전, 뭉침 또는 응집 없이 조성물에서 제형화된 세포의 균질한 현탁액의 상태를 지칭한다. 세포 기반 의약품의 DP 프로세스 동안 균질성을 유지하는 것은 세포 생존률 및 투여량 농도에서 바이알-대-바이알 일관성을 보장하는 데 중요하다. 균질성은 육안 검사에 의해 평가될 수 있다. 균질성은 또한 충진된 세포 기반 의약품이 있는 각 용기에서 일관된 세포 농도를 측정하고 보장함으로써 확인할 수 있다.

일부 구현예에서, 상기 연속 혼합은 약 30~80 rpm에서 수행되고, 약 30~85 rpm, 약 25 내지 85 rpm, 약 35 내지 80 rpm, 약 35 내지 85 rpm, 약 40 내지 80 rpm, 약 40 내지 85 rpm, 약 45 내지 80 rpm, 약 45 내지 85 rpm, 약 50 내지 80 rpm, 약 50 내지 85 rpm, 약 55 내지 80 rpm, 약 55 내지 85 rpm, 약 60 내지 80 rpm, 약 60 내지 85 rpm, 약 65 내지 80 rpm, 약 65 내지 85 rpm, 약 70 내지 80 rpm, 약 70 내지 85 rpm, 약 75 내지 80 rpm, 약 75 내지 85 rpm, 약 25prm, 약 30 rpm, 약 35 rpm, 약 40 rpm, 약 45 rpm, 약 50 rpm, 약 55 rpm, 약 60 rpm, 약 65 rpm, 약 70 rpm, 약 75 rpm, 약 80 rpm, 또는 약 85 rpm에서 수행된다.

일부 구현예에서, 세포는 조작된 면역 세포이다. 일부 구현예에서, 면역 세포는 CAR T 세포이다. 일부 구현예에서, 면역 세포는 CAR NK 세포이다. 일부 구현예에서, 면역 세포는 동종 또는 자가 면역 세포이다. 일부 구현예에서, 면역 세포는 자가 또는 동종 CAR T 세포이다.

통상적으로, 의약품 프로세스 동안, 침전을 방지하기 위해 세포를 연속적으로 혼합할 필요가 있다고 여겨졌다. 본원에 개시된 바와 같이, 의약품 프로세스 동안 연속 혼합이 필요하지 않다는 것이 예기치 않게 발견되었다. 따라서, 일 양태에서, 본 개시는 세포의 간헐적 혼합 단계를 포함하는 의약품 프로세스를 제공한다. 일부 구현예에서, 간헐적 혼합은 쉐이커 플라스크에서 이루어진다. 특정 구현예에서, 상기 간헐적 혼합은 스피너 플라스크 내에서 이루어진다.

일부 구현예에서, 간헐적 혼합은 약 30~80 rpm, 약 30~85 rpm, 약 25 내지 85 rpm, 약 35 내지 80 rpm, 약 35 내지 85 rpm, 약 40 내지 80 rpm, 약 40 내지 85 rpm, 약 45 내지 80 rpm, 약 45 내지 85 rpm, 약 50 내지 80 rpm, 약 50 내지 85 rpm, 약 55 내지 80 rpm, 약 55 내지 85 rpm, 약 60 내지 80 rpm, 약 60 내지 85 rpm, 약 65 내지 80 rpm, 약 65 내지 85 rpm, 약 70 내지 80 rpm, 약 70 내지 85 rpm, 약 75 내지 80 rpm, 약 75 내지 85 rpm, 약 85 내지 100 rpm, 약 85 내지 110 rpm, 약 85 내지 120 rpm, 약 85 내지 130 rpm, 약 85 내지 140 rpm, 약 25rpm, 약 30 rpm, 약 35 rpm, 약 40 rpm, 약 45 rpm, 약 50 rpm, 약 55 rpm, 약 60 rpm, 약 65 rpm, 약 70 rpm, 약 75 rpm, 약 80 rpm, 약 85 rpm, 약 90 rpm, 약 95 rpm, 약 100 rpm, 약 105 rpm, 약 110 rpm, 약 115 rpm, 약 120 rpm, 약 125 rpm, 약 130 rpm, 약 135 rpm, 약 140 rpm, 또는 약 145 rpm에서 수행된다.

일부 구현예에서, 세포는 조작된 면역 세포이다. 일부 구현예에서, 면역 세포는 CAR T 세포이다.

일부 구현예에서, 간헐적 혼합은 약 1~5분, 1~4분, 1~3분, 1~2분, 1분, 또는 1분 미만 동안 수행된다. 일부 구현예에서, 간헐적 혼합은 약 10 내지 약 40분 간격으로 수행된다. 일부 구현예에서, 간헐적 혼합은 약 10분 내지 약 40분마다, 약 10분 내지 약 35분마다, 약 10분 내지 약 30분마다, 약 10분 내지 약 25분마다, 약 10분 내지 약 20분마다, 약 10분 내지 약 15분마다, 약 10분 내지 약 45분마다, 약 5분 내지 40분마다, 약 4분마다, 약 10분마다, 약 15분마다, 약 20분마다, 약 25분마다, 약 30분마다, 약 35분마다, 약 40분마다, 또는 약 45분마다 수행되었다.

일부 구현예에서, 하나 이상의 용기는 멸균 플라스틱 또는 유리 용기이다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 용기는 플라스틱 바이알이다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 용기는 유리 바이알이다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 용기는 플라스틱 백이다.

일부 구현예에서, 세포는 적어도 하나의 동결보존제(또는 동결보호제)를 포함하는 조성물로 제형화된다. 적절한 동결보존제는, 제한 없이, 디메틸설폭시드(DMSO), 프로필렌 글리콜(PG), 에틸렌 글리콜(EG), 글리세롤, 수크로오스, 및 트레할로스를 포함한다. 일부 구현예에서, 제형 또는 의약품에 존재하는 동결보존제는 약 3% 내지 약 10%, 약 4% 내지 약 10%, 약 5% 내지 약 10%, 약 6% 내지 약 10%, 약 7% 내지 약 10%, 약 8% 내지 약 10%, 약 9% 내지 약 10%, 약 3%, 약 4%, 약 5%, 약 6%, 약 7%, 약 8%, 약 9%, 또는 약 10%이다. 일부 구현예에서, 동결보존제는 DMSO이다. 일부 구현예에서, 동결보존제를 포함하는 조성물은, 예를 들어, Cryostor® CS10, CS2, CS5, CryoMACS DMSO 또는 2-8CELLsius^TM + DMSO이다.

일부 구현예에서, 제형은 점도(또는 점도 증강제)를 향상시키는 부형제를 더 포함한다. 수타블 점도 증강제는, 제한 없이, 셀룰로오스(예를 들어, 메틸셀룰로오스, 카르복시메틸 셀룰로오스, 히드록시메틸셀룰로오스, 히드록시엔틸셀룰로오스, 히드록시프로필메틸셀룰로오스), 펙틴, 고분자량 덱스트란(예를 들어, MW 약 40KDa 내지 약 100KDa 등), 젤라틴, 하이드록시에틸 전분, 알긴산, 폴리비닐 알코올, 폴리비닐피롤리돈, 및 기타 천연, 반합성 또는 합성 하이드로콜로이드를 포함한다. 일부 구현예에서, 점도 증강제는 약 0.1% 내지 약 10%, 약 0.1% 내지 약 9%, 약 0.1% 내지 약 8%, 약 0.1% 내지 약 7%, 약 0.1% 내지 약 6%, 약 0.1% 내지 약 5%, 약 0.1% 내지 약 4%, 약 0.1% 내지 약 3%, 약 0.1% 내지 약 2%, 또는 약 0.1% 내지 약 1% 의 농도로 제형에 존재한다. 일부 구현예에서, 제형은 약 2 내지 약 20 cps, 약 2 내지 약 19 cps, 약 2 내지 약 18 cps, 약 2 내지 약 17 cps, 약 2 내지 약 16 cps, 약 2 내지 약 15 cps, 약 2 내지 약 14 cps, 약 2 내지 약 13 cps, 약 2 내지 약 12 cps, 약 2 내지 약 11 cps, 약 2 내지 약 10 cps, 약 2 내지 약 9 cps, 약 2 내지 약 8 cps, 약 2 내지 약 7 cps, 약 2 내지 약 6 cps, 또는 약 2 내지 약 5 cps의 점도를 갖는다.

일부 구현예에서, 혼합 및 충진 단계는 약 2시간이 걸린다. 일부 구현예에서, 혼합 및 충진 단계는 약 2시간 미만이 걸린다. 일부 구현예에서, 혼합 및 충진 단계는 적어도 약 2시간이 걸린다. 일부 구현예에서, 혼합 및 충진 단계는 약 2시간보다 더 오래 걸린다. 일부 구현예에서, 혼합 및 충진 단계는 약 3시간, 3시간 이상, 약 4시간, 4시간 이상, 약 5시간, 약 6시간, 약 7시간, 약 8시간, 약 9시간, 약 10시간, 약 2시간 내지 약 3시간 사이, 약 2시간 내지 약 4시간 사이, 약 2시간 내지 약 5시간 사이, 약 2시간 내지 약 6시간 사이, 약 3시간 내지 약 6시간 사이, 약 6시간, 또는 약 4시간 내지 6시간 사이이다.

일부 구현예에서, 혼합 및 충진 단계는 실온에서 수행된다. 일부 구현예에서, 혼합 및 충진 단계는 약 15~20℃, 약 20~25℃, 약 20~27℃, 약 20~30℃, 또는 약 25~30℃에서 수행된다. 일부 구현예에서, 혼합 및 충진 단계는 약 2~8℃에서 수행된다. 일부 구현예에서, 혼합 및 충진 단계는 약 4~5℃에서 수행된다.

일부 구현예에서, 의약품 프로세스는 연속 쉐이커 플라스크에 의해 제형화된 세포를 혼합하는 단계를 포함하여, 실온에서 최대 약 2시간 동안 혼합한다. 일부 구현예에서, 의약품 프로세스는, 간헐적 교반 플라스크에 의해 제형화된 세포를 혼합하는 단계를 포함하여, 실온에서 최대 약 4시간 또는 약 6시간 동안 혼합한다. 일부 구현예에서, 연속적 또는 간헐적 쉐이커 플라스크 혼합에서의 속도는 약 85 rpm 미만이다. 일부 구현예에서, 간헐적 쉐이커 플라스크 혼합은 약 1~3분 동안 약 10~30분 간격으로 이루어진다. 일부 구현예에서, 의약품 프로세스는 연속 스피너 플라스크에 의해 제형화된 세포를 혼합하는 단계를 포함하여, 실온에서 최대 약 4시간 또는 약 6시간 동안 혼합한다. 일부 구현예에서, 의약품 프로세스는, 간헐적 스피너 플라스크에 의해 제형화된 세포를 혼합하는 단계를 포함하여, 실온에서 최대 약 4시간 또는 약 6시간 동안 혼합한다. 일부 구현예에서, 연속적 또는 간헐적 스피너 플라스크 혼합에서의 속도는 약 40 rpm의 속도이다. 일부 구현예에서, 연속적 또는 간헐적 스피너 플라스크 혼합에서의 속도는 약 40 rpm 미만의 속도이다. 일부 구현예에서, 간헐적 스피너 플라스크 혼합은 약 1~3분 동안 약 10~30분 간격으로 이루어진다.

일부 구현예에서, 세포는 조작된 면역 세포이다. 일부 구현예에서, 면역 세포는 CAR T 세포이다. 일부 구현예에서, 면역 세포는 CAR NK 세포이다. 일부 구현예에서, 면역 세포는 동종 또는 자가 면역 세포이다. 일부 구현예에서, 면역 세포는 자가 또는 동종 CAR T 세포이다.

면역 세포

본원에 기술된 방법 및/또는 시약과 함께 사용하기에 적합한 세포는 면역 세포를 포함한다.

시험관 내 조작 또는 유전적 변형(예를 들어, 본원에 기술된 바와 같음) 전에, 본원에 기술된 방법에 사용하기 위한 세포(예를 들어, 면역 세포)는 대상체로부터 수득될 수 있다. 세포는 말초 혈액 단핵 세포, 골수, 림프절 조직, 제대혈, 흉선 조직, 줄기 세포- 또는 iPSC-유래 면역 세포, 그리고 감염 부위, 복수, 흉막 삼출, 비장 조직 및 종양으로부터의 조직을 포함하는 다수의 비제한적인 공급원으로부터 수득될 수 있다. 일부 구현예에서, 당업자에게 이용 가능하고 공지된 임의의 수의 T 세포주가 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 세포는 건강한 공여자, 암으로 진단된 환자 또는 감염으로 진단된 환자로부터 유래될 수 있다. 일부 구현예에서, 세포는 상이한 표현형 특성을 나타내는 혼합된 세포 집단의 일부일 수 있다.

일부 구현예에서, 면역 세포는 궁극적으로 조작된 면역 세포를 받게 될 대상체로부터 수득된 자가 면역 세포이다. 일부 구현예에서, 면역 세포는 조작된 면역 세포를 받게 될 대상체와 상이한 개체인 공여자로부터 수득된 동종 면역 세포이다.

일부 구현예에서, 면역 세포는 T 세포를 포함한다. T 세포는 말초 혈액 단핵 세포(PBMC), 골수, 림프절 조직, 제대혈, 흉선 조직, 줄기 세포- 또는 iPSC-유래 T 세포, 그리고 감염 부위, 복수, 흉막 삼출, 비장 조직 및 종양으로부터의 조직을 포함하는 다수의 공급원으로부터 수득될 수 있다. 일부 구현예에서, T 세포는 FICOLL^TM 분리와 같은 당업자에게 공지된 임의의 수의 기술을 사용하여 대상체로부터 수집된 혈액량으로부터 수득될 수 있다.

세포는 성분채집술에 의해 개체의 순환 혈액으로부터 수득될 수 있다. 성분채집술 제품은 일반적으로 T 세포, 단핵구, 과립구, B 세포, 다른 유핵 백혈구, 적혈구 및 혈소판을 포함하는 림프구를 함유한다. 일부 구현예에서, 성분채집술에 의해 수집된 세포는 세척되어 혈장 분획을 제거하고, 후속 프로세스를 위해 적절한 완충액 또는 배지에 놓일 수 있다.

PBMC는 본원에 기술된 바와 같은 방법을 사용하여 면역 세포(예를 들어, CAR 또는 TCR)를 사용하는 유전적 변형에 직접 사용될 수 있다. 특정 구현예에서, PBMC를 단리한 후, T 림프구를 추가로 단리할 수 있고, 세포독성 및 헬퍼 T 림프구 둘 모두는 유전적 변형 및/또는 증식 전 또는 후에 미처리, 기억 및 효과기 T 세포 하위집단으로 분류될 수 있다.

특정 구현예에서, T 세포는, 예를 들어 PERCOLL^TM 구배를 통한 원심분리를 사용하여, 적혈구를 용해시키고 단핵구를 고갈시킴으로써 PBMC로부터 단리된다. CCR7+, CD95+, CD122, CD27+, CD69+, CD127+, CD28+, CD3+, CD4+, CD8+, CD25+, CD62L+, CD45RA+, 및 CD45RO+ T 세포와 같은 T 세포의 특정 하위집단은 당업계에 공지된 양성 또는 음성 선별 기술에 의해 추가로 단리될 수 있다. 예를 들어, 음성 선별에 의한 T 세포 집단의 농축은 음성으로 선별된 세포에 대해 고유한 표면 마커에 대한 항체의 조합으로 달성될 수 있다. 본원에서 사용하기 위한 하나의 방법은 음성 자기 면역 부착성 또는 유세포 계측법을 통한 세포 분류 및/또는 선택이며, 이는 음성으로 선택된 세포 상에 존재하는 세포 표면 마커를 대상으로 한 단클론 항체의 칵테일을 사용한다. 예를 들어, 음성 선택에 의해 CD4+ 세포를 풍부하게 하기 위해, 단클론 항체 칵테일은 일반적으로 CD14, CD20, CD11b, CD16, HLA-DR, 및 CD8에 대한 항체를 포함한다. 유세포 계측법 및 세포 분류는 또한 본 개시에 사용하기 위해 관심 세포 집단을 단리하는데 사용될 수 있다.

일부 구현예에서, T 세포 집단은 CD4+ 세포에 대해 농축된다.

일부 구현예에서, T 세포 집단은 CD8+ 세포에 대해 농축된다.

일부 구현예에서, CD8+ 세포는 이들 유형의 세포 각각과 연관된 세포 표면 항원을 식별함으로써 미처리, 중추 기억, 및 효과기 세포로 추가로 분류된다. 일부 구현예에서, 미처리 T 세포에 대한 표현형 마커의 발현은 CD45RA +, CD95-, IL2Rb -, CCR7+, 및 CD62L +를 포함한다. 일부 구현예에서, 줄기 세포 기억 T 세포에 대한 표현형 마커의 발현은 CD45RA +, CD95+, IL2Rb+ , CCR7+, 및 CD62L +를 포함한다. 일부 구현예에서, 중추 기억 T 세포에 대한 표현형 마커의 발현은 CD45RO+, CD95+, IL2Rb+, CCR7+, 및 CD62L+를 포함한다. 일부 구현예에서, 효과기 기억 T 세포에 대한 표현형 마커의 발현은 CD45RO+, CD95+, IL2Rb+, CCR7-, 및 CD62L-를 포함한다. 일부 구현예에서, T 효과기 세포에 대한 표현형 마커의 발현은 CD45RA+, CD95+, IL2Rb+, CCR7-, 및 CD62L-를 포함한다. 예를 들어, CD4+ 및/또는 CD8+ T 헬퍼 세포는 세포 표면 항원을 갖는 세포 집단을 확인함으로써 미처리, 줄기 세포 기억, 중추 기억, 효과기 기억 및 T 효과기 세포로 분류될 수 있다.

PBMC는 NK 세포 또는 NKT 세포와 같은 다른 세포독성 림프구를 추가로 포함할 수 있음을 이해할 것이다. 본원에 개시된 키메라 수용체의 코딩 서열을 운반하는 발현 벡터는 인간 공여자 T 세포, NK 세포 또는 NKT 세포의 집단에 도입될 수 있다. 표준 절차는 인간 대상체에서 사용하기 위한 보관 및/또는 준비를 위해 CAR을 발현하는 T 세포의 동결보존을 위해 사용된다. 일 구현예에서, T 세포의 시험관 내 형질도입, 배양 및/또는 증식은 태아 송아지 혈청 및 태아 소 혈청과 같은 비인간 동물 유래 산물의 부재 하에 수행된다. 다양한 구현예에서, 동결보존 배지는, 예를 들어, CryoStor® CS2, CS5, 또는 CS10 또는 DMSO를 포함하는 다른 배지, 또는 DMSO를 포함하지 않는 배지를 포함할 수 있다.

조작된 면역 세포

본 개시의 CAR을 발현하는 조작된 면역 세포(예를 들어, CAR-T 세포)가 본원에서 제공된다.

일부 구현예에서, 조작된 면역 세포는 CAR 집단을 포함하되, 각각의 CAR은 세포외 항원 결합 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 조작된 면역 세포는 CAR 집단을 포함하되, 각각의 CAR은 상이한 세포외 항원 결합 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 면역 세포는 CAR 집단을 포함하되, 각각의 CAR은 동일한 세포외 항원 결합 도메인을 포함한다.

조작된 면역 세포는 동종 또는 자가일 수 있다.

일부 구현예에서, 조작된 면역 세포는 T 세포(예를 들어, 염증성 T 림프구 세포독성 T 림프구, 조절 T 림프구, 헬퍼 T 림프구, 또는 종양 침윤 림프구(TIL)), NK 세포, NK-T 세포, TCR 발현 세포, 수지상 세포, 살상 수지상 세포, 비만 세포, 또는 B 세포이다. 일부 구현예에서, 세포는 CD4+ T 림프구 및 CD8+ T 림프구로 이루어진 군으로부터 유래될 수 있다. 일부 예시적인 구현예에서, 조작된 면역 세포는 T 세포이다. 일부 예시적인 구현예에서, 조작된 면역 세포는 알파 베타 T 세포이다. 일부 예시적인 구현예에서, 조작된 면역 세포는 감마 델타 T 세포이다. 일부 예시적인 구현예에서, 조작된 면역 세포는 대식세포이다. 일부 구현예에서, 상기 조작된 면역 세포는 인간 세포이다.

일부 구현예에서, 조작된 면역 세포는, 예를 들어 줄기 세포로부터 유래될 수 있지만, 이에 한정되지 않는다. 줄기 세포는 성체 줄기 세포, 비-인간 배아 줄기 세포, 보다 구체적으로, 비-인간 줄기 세포, 제대혈 줄기 세포, 전구 세포, 골수 줄기 세포, 유도된 다능성 줄기 세포 (iPSC), 전능성 줄기 세포 또는 조혈 줄기 세포일 수 있다. 줄기 세포는 CD34+ 또는 CD34-일 수 있다.

일부 구현예에서, 세포는 말초 혈액으로부터 수득되거나 제조된다. 일부 구현예에서, 세포는 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)로부터 수득되거나 제조된다. 일부 구현예에서, 세포는 골수로부터 수득되거나 제조된다. 일부 구현예에서, 세포는 제대혈로부터 수득되거나 제조된다. 일부 구현예에서, 세포는 인간 세포이다. 일부 구현예에서, 세포는 전기천공, 초음파형성, 바이오리스틱스(예를 들어, Gene Gun), 형질감염, 지질 형질감염, 중합체 형질감염, 나노입자, 바이러스 형질도입, 또는 바이러스 형질감염(예를 들어, 레트로바이러스, 렌티바이러스, AAV), 또는 다중총으로 이루어진 군으로부터 선택된 방법을 사용하여 핵산 벡터에 의해 형질감염되거나 형질도입된다. 일부 구현예에서, 세포는 비-T 세포로부터 재프로그래밍된 T 세포이다. 일부 구현예에서, 세포는 T 세포로부터 재프로그래밍된 T 세포이다.

결합제

일부 구현예에서, 개시된 방법은 항체 또는 항원 결합제 (예를 들어, 항원 결합 도메인을 포함하거나 항체 또는 이의 단편을 포함)의 사용을 포함한다. 이하에서 논의되는 바와 같이, 다양한 구현예에서, 조작된 면역 세포는 또한 결합제를 포함할 수 있다.

본원에서 사용되는 용어 "항체"는 특정 표적 항원에 특이적 결합을 부여하기에 충분한 정규 면역글로불린 서열 요소를 포함하는 폴리펩티드를 지칭한다. 당업계에 공지된 바와 같이, 자연에서 생산된 온전한 항체는 통상적으로 "Y-형상" 구조로서 지칭되는 것에 서로 연관되는 2개의 동일한 중쇄 폴리펩티드(각각 약 50 kD) 및 2개의 동일한 경쇄 폴리펩티드(각각 약 25 kD)로 이루어진 대략 150 kD의 사량체 제제이다. 각각의 중쇄는 적어도 4개의 도메인(각각 약 110개의 아미노산 길이)- 아미노-말단 가변(VH) 도메인(Y 구조의 선단부에 위치함)으로 구성되고, 이어서 3개의 불변 도메인: CHI, CH2, 및 카복시-말단 CH3(Y 줄기의 기저부에 위치함)으로 구성된다. "스위치"로 알려진 짧은 영역은 중쇄 가변 영역과 불변 영역을 연결한다. "힌지"는 CH2 및 CH3 도메인을 항체의 나머지 부분에 연결시킨다. 이러한 힌지 영역에서의 2개의 이황화 결합은 2개의 중쇄 폴리펩티드를 온전한 항체에서 서로 연결시킨다. 각각의 경쇄는 2개의 도메인 - 아미노-말단 가변(VL) 도메인으로 구성되고, 이어서 카복시-말단 불변(CL) 도메인으로 구성된다. 당업자는 항체 구조 및 서열 요소에 매우 익숙하고, 제공된 서열에서 "가변" 및 "불변" 영역을 인식하고, 동일한 항체 사슬 서열의 상이한 제시가, 예를 들어, 동일한 항체 사슬 서열의 상이한 제시에 대해 하나 또는 소수의 잔기가 이동된 위치에서 이러한 경계를 나타낼 수 있도록 이러한 도메인들 사이에 약간의 유연성이 정의될 수 있음을 이해할 것이다.

온전한 항체 사량체는 중쇄 및 경쇄가 단일 이황화 결합에 의해 서로 연결되는 2개의 중쇄-경쇄 이량체로 구성되며; 2개의 다른 이황화 결합은 이량체를 서로 연결시켜 사량체가 형성되도록 중쇄 힌지 영역을 서로 연결시킨다. 자연적으로 생산된 항체 또한 전형적으로 CH2 도메인 상에서 글리코실화된다. 천연 항체 내의 각각의 도메인은, 압축된 역평행 베타 배럴에서 서로에 대해 충진된 2개의 베타 시트(예를 들어, 3-, 4-, 또는 5-가닥 시트)로부터 형성된 "면역글로불린 접힘"을 특징으로 하는 구조를 갖는다. 각각의 가변 도메인은 "보체 결정 영역"(CDR1, CDR2, 및 CDR3)으로 알려진 3개의 초가변 루프 및 4개의 다소 불변인 "프레임워크" 영역(FR1, FR2, FR3, 및 FR4)을 함유한다. 천연 항체가 접힐 경우, FR 영역은 도메인에 대한 구조적 프레임워크를 제공하는 베타 시트를 형성하고, 중쇄 및 경쇄 둘 모두로부터의 CDR 루프 영역은 이들이 Y 구조의 선단에 위치한 단일 초가변 항원 결합 부위를 생성하도록 3차원 공간에서 합쳐진다. 자연 발생 항체의 Fc 영역은 보체 시스템의 요소에 결합하고, 예를 들어 세포독성을 매개하는 효과기 세포를 포함하는 효과기 세포 상의 수용체에 또한 결합한다. 당업계에 공지된 바와 같이, Fc 수용체에 대한 Fc 영역의 친화도 및/또는 다른 결합 속성은 글리코실화 또는 다른 변형을 통해 조절될 수 있다. 일부 구현예에서, 본 발명에 따라 생산되고/되거나 사용되는 항체는, 변형되거나 조작된 이러한 글리코실화를 갖는 Fc 도메인을 포함하는, 글리코실화된 Fc 도메인을 포함한다.

본 개시의 목적을 위해, 특정 구현예에서, 천연 항체에서 발견되는 바와 같은 충분한 면역글로불린 도메인 서열을 포함하는 폴리펩티드의 임의의 폴리펩티드 또는 복합체는, 이러한 폴리펩티드가 자연적으로 생산되는지(예를 들어, 항원에 반응하는 유기체에 의해 생성되는지), 또는 재조합 조작, 화학 합성 또는 다른 인공 시스템 또는 방법론에 의해 생산되는지의 여부에 상관없이, "항체"로서 지칭되고/ 지칭되거나 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 항체는 다클론성이고; 일부 구현예에서, 항체는 단클론성이다. 일부 구현예에서, 항체는 마우스, 토끼, 영장류 또는 인간 항체의 특징적인 불변 영역 서열을 갖는다. 일부 구현예에서, 항체 서열 요소는 당업계에 공지된 바와 같은 인간화, 영장류화, 키메라 등이다.

또한, 본원에서 사용되는 용어 "항체 제제"는 대안적인 제시에서 항체 구조적 및 기능적 특징을 이용하기 위한 당업계에 알려지거나 개발된 작제물 또는 포맷 중 임의의 것을 지칭하는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 본 개시의 방법에 따라 사용된 항체는, 온전한 IgA, IgG, IgE 또는 IgM 항체; 이중 특이적 항체 또는 다중 특이적 항체(예를 들어, Zybodies®, 등); Fab 단편, Fab 단편, F(ab)2 단편, Fd 단편, 및 단리된 CDR 또는 이의 세트와 같은 항체 단편; 단쇄 가변 조각 (scFVs); 폴리펩티드-Fc 융합물; 단일 도메인 항체(예를 들어, IgNAR 또는 이의 단편과 같은 상어 단일 도메인 항체); 낙타류 항체(본원에서는 나노바디 또는 VHH라고도 함);　상어 항체, 마스킹된 항체(예를 들어, 프로보디스®); Small Modular ImmunoPharmaceuticals("SMIPs??"); 단쇄 또는 직렬 디아바디(TandAb®); VHH; Anticalins®; Nanobody® 미니바디; BiTE®; 안키린 반복 단백질 또는 DARPIN®; Avimers®; DART; TCR-유사 항체; Adnectin®; Affilin®; Trans-body®; Affibody®; TrimerX®; MicroProtein; Fynomer®, Centyrin®; 및 KALBITOR®로부터 선택된 포맷이지만, 이에 한정되지 않는다. 일부 구현예에서, 항체는 자연적으로 생산될 경우 가질 수 있는 공유 변형(예를 들어, 글리칸의 부착)이 결여될 수 있다. 일부 구현예에서, 항체는 공유 변형(예를 들어, 글리칸, 페이로드의 부착(예를 들어, 검출 가능한 모이어티, 치료 모이어티, 촉매 모이어티 등의 부착)의 부착), 또는 다른 펜던트기(예를 들어, 폴리-에틸렌 글리콜 등)를 함유할 수 있다.

본원에서 사용되는 용어 "항체 제제"는 일반적으로 특정 항원에 특이적으로 결합하는 제제를 지칭한다. 일부 구현예에서, 이 용어는 특이적 결합을 부여하기에 충분한 면역글로불린 구조 요소를 포함하는 임의의 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 복합체를 포함한다. 예시적인 항체 제제는 단클론 항체 또는 다클론 항체를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 일부 구현예에서, 항체는 마우스, 토끼, 영장류 또는 인간 항체의 특징적인 하나 이상의 불변 영역 서열을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 항체 서열 요소는 당업계에 공지된 바와 같은 인간화, 영장류화, 키메라 등의 하나 이상의 서열 요소를 포함할 수 있다. 많은 구현예에서, 용어 "항체 제제"는 대안적인 제시에서 항체 구조적 및 기능적 특징을 이용하기 위한 당업계에 알려지거나 개발된 작제물 또는 포맷 중 하나 이상을 지칭하는 데 사용된다. 예를 들어, 본 발명에 따라 사용된 항체 제제는, 온전한 IgA, IgG, IgE 또는 IgM 항체; 이중 특이적 항체 또는 다중 특이적 항체(예를 들어, Zybodies®, 등); Fab 단편, Fab' 단편, F(ab')2 단편, Fd 단편, 및 단리된 CDR 또는 이의 세트와 같은 항체 단편; 단쇄 Fvs; 폴리펩티드-Fc 융합물; 단일 도메인 항체(예를 들어, IgNAR 또는 이의 단편과 같은 상어 단일 도메인 항체); 낙타류 항체; 마스킹된 항체(예를 들어, 프로보디스®); Small Modular ImmunoPharmaceuticals("SMIPs??"); 단쇄 또는 직렬 디아바디(TandAb®); VHH; Anticalins®; Nanobody® 미니바디; BiTE®; 안키린 반복 단백질 또는 DARPIN®; Avimers®; DART; TCR-유사 항체; Adnectin®; Affilin®; Trans-body®; Affibody®; TrimerX®; MicroProtein; Fynomer®, Centyrin®; 및 KALBITOR®로부터 선택된 포맷이지만, 이에 한정되지 않는다.

본 개시의 방법을 수행하는 데 사용되는 항체 또는 항체 제제는 단쇄 또는 이중쇄일 수 있다. 일부 구현예에서, 항체 또는 항원 결합 분자는 단쇄형이다. 특정 구현예에서, 항원 결합 분자는 scFv, Fab, Fab', Fv, F(ab')₂, dAb, 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.

항체 및 항체 제제는 항체 단편을 포함한다. 항체 단편은 온전한 항체의 일부, 예를 들어, 온전한 항체의 항원 결합 또는 가변 영역을 포함한다. 항체 단편은 Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')₂, Fv, 디아바디, 선형 항체, 항체 단편 항체 및 scFv 단편으로부터 형성된 다중특이적 항체, 및 다른 단편을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 항체는 또한 다클론 단클론, 키메라 dAb(도메인 항체), 단쇄, Fab, Fa, F(ab)₂ 단편, 및 scFv를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 항체는 전체 항체, 또는 면역글로불린, 또는 항체 단편일 수 있다. 항체 단편은 당업계에 공지된 바와 같이, 온전한 항체의 단백질분해 소화뿐만 아니라 재조합 숙주 세포(예를 들어, 대장균, 중국 햄스터 난소(CHO) 세포, 또는 파지(phage))에 의한 생산을 포함하지만 이에 한정되지 않는 다양한 기술에 의해 제조될 수 있다.

일부 구현예에서, 항체 또는 항체 제제는 키메라 항체일 수 있다(예를 들어, 미국 특허 제4,816,567호; 및 Morrison 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81 :6851-6855(1984) 참조). 키메라 항체는 중쇄 및/또는 경쇄의 일부가 특정 공급원 또는 종으로부터 유래되는 반면, 중쇄 및/또는 경쇄의 나머지는 상이한 공급원 또는 종으로부터 유래되는 항체일 수 있다. 일 실시예에서, 키메라 항체는 비인간 가변 영역(예를 들어, 마우스, 랫트, 햄스터, 토끼, 또는 원숭이와 같은 비인간 영장류로부터 유래된 가변 영역) 및 인간 불변 영역을 포함할 수 있다. 또 다른 실시예에서, 키메라 항체는, 부류 또는 하위부류가 모 항체의 것에서 변경된 "부류 전환" 항체일 수 있다. 키메라 항체는 이의 항원 결합 단편을 포함한다.

일부 구현예에서, 키메라 항체는 인간화 항체일 수 있다(예를 들어, Almagro 및 Fransson, Front. Biosci., 13: 1619-1633(2008); Riechmann 등, Nature, 332:323-329(1988); Queen 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 10029-10033(1989); 미국 특허 제5,821,337호, 제7,527,791호, 제6,982,321호, 및 제7,087,409호; Kashmiri 등, Methods 36:25-34(2005); Padlan, Mol. Immunol, 28:489-498(1991); Dall'Acqua 등, Methods, 36:43-60(2005); Osbourn 등, Methods, 36:61-68(2005); 및 Klimka 등, Br. J. Cancer, 83:252-260(2000) 참조). 인간화 항체는 비인간 초가변 영역으로부터의 아미노산 잔기 및 인간 FR로부터의 아미노산 잔기를 포함하는 키메라 항체이다. 특정 구현예에서, 인간화 항체는, 초가변 영역(예를 들어, CDR)의 전부 또는 실질적으로 전부가 비인간 항체의 초가변 영역에 상응하고, FR의 전부 또는 실질적으로 전부가 인간 항체의 프레임워크 영역(FR)에 상응하는, 적어도 하나, 및 통상적으로는 2개의 가변 도메인 모두를 실질적으로 포함할 것이다. 인간화 항체는 인간 항체로부터 유래된 항체 불변 영역의 적어도 일부를 임의로 포함할 수 있다.

일부 구현예에서, 본원에서 제공된 항체 또는 항체 제제는 인간 항체이다. 인간 항체는 당업계에 공지된 다양한 기술을 사용하여 생산될 수 있다(예를 들어, van Dijk 및 van de Winkel, Curr. Opin. Pharmacol, 5: 368-74(2001); 및 Lonberg, Curr. Opin. Immunol, 20:450-459(2008) 참조). 인간 항체는 인간 또는 인간 세포에 의해 생산되거나 인간 항체 레퍼토리 또는 다른 인간 항체 암호화 서열을 이용하는 비인간 공급원으로부터 유래된 항체의 아미노산 서열에 상응하는 아미노산 서열을 보유하는 것일 수 있다. 인간 항체의 이러한 정의는 비인간 항원 결합 잔기를 포함하는 인간화 항체를 특이적으로 배제한다. 인간 항체는 당업계에 잘 알려진 방법을 사용하여 제조될 수 있다.

키메라 항원 수용체

본원에서 사용되는 바와 같이, 키메라 항원 수용체(CAR)는 표적 항원(예를 들어, 암세포 상의 표적 항원)을 특이적으로 인식하는 단백질이다. 표적 항원에 결합될 경우, CAR은 면역 세포를 활성화시켜 그 항원(예를 들어, 암 세포)을 가진 세포를 공격하고 파괴할 수 있다. CAR은 또한 그들의 효능을 증가시키기 위해 공자극 또는 신호 전달 도메인을 포함할 수 있다. Krause 등, J. Exp. Med., Volume 188, No. 4, 619-626(1998); Finney 등, Journal of Immunology, 161: 2791-2797(1998), Song 등, Blood 119:696-706(2012); Kalos 등, Sci. Transl. Med. 3:95(2011); Porter 등, N. Engl. J. Med. 365:725-33(2011), 및 Gross 등, Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol., 56:59-83(2016); 미국 특허 제7,741,465호 및 제6,319,494호 참조.

본원에서 기술된 키메라 항원 수용체는 세포외 도메인, 막관통 도메인, 및 세포내 도메인을 포함하되, 세포외 도메인은 표적에 특이적으로 결합하는 항원 결합 도메인을 포함한다.

일부 구현예에서, 항원-특이적 CAR은 안전 스위치 및/또는 하나 이상의 단클론 항체 특이적 에피토프를 추가로 포함한다.

i. 항원 결합 도메인

전술한 바와 같이, 본원에서 기술된 CAR은 항원 결합 도메인을 포함한다. 본원에서 사용된 "항원 결합 도메인"은 특정 표적 항원에 결합하는 임의의 폴리펩티드를 의미한다. 일부 구현예에서, 항원 결합 도메인은 종양 세포 상의 항원에 결합한다. 일부 구현예에서, 항원 결합 도메인은 증식성 질환에 관여하는 세포 상의 항원에 결합한다.

일부 구현예에서, 항원 결합 도메인은 본원에서 기술된 가변 중쇄, 가변 경쇄, 및/또는 하나 이상의 CDR을 포함한다. 일부 구현예에서, 항원 결합 도메인은 경쇄 CDR CDR1, CDR2 및 CDR3, 및 중쇄 CDR CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 단쇄 가변 단편(scFv)이다.

항원 결합 도메인은 제2 표적에 결합하는 것보다 더 단단히 또는 높은 친화도로 하나의 표적에 결합할 때 "선택적"인 것으로 지칭된다.

CAR의 항원 결합 도메인은 암 항원을 선택적으로 표적화한다. 일부 구현예에서, 암 항원은 EGFRvIII, WT-1, CD20, CD23, CD30, CD38, CD33, CD133, MHC-WT1, TSPAN10, MHC-PRAME, Liv1, ADAM10, CHRNA2, LeY, NKGD2D, CS1, CD44v6, ROR1, Claudin-18.2, Muc17, FAP alpha, Ly6G6D, c6orf23, G6D, MEGT1, NG25, CD19, BCMA, FLT3, CD70, DLL3, CD52 또는 CD34에서 선택된다. 일부 구현예에서, CAR은 EGFRvIII, WT-1, CD20, CD23, CD30, CD38, CD33, CD133, MHC-WT1, TSPAN10, MHC-PRAME, Liv1, ADAM10, CHRNA2, LeY, NKGD2D, CS1, CD44v6, ROR1, Claudin-18.2, Muc17, FAP alpha, Ly6G6D, c6orf23, G6D, MEGT1, NG25, CD19, BCMA, FLT3, CD70, DLL3, CD52 또는　 CD34를 표적으로 하는 항원 결합 도메인을 포함한다.

일부 구현예에서, 암 항원은 탄산 탈수 효소 IX(CAIX), 암배아 항원(CEA), CDS, CD7, CDIO, CD19, CD20, CD22, CD30, CD33, CD34, CD38, CD41, CD44, CD49f, CD56, CD74, CD123, CD133, CD138, 거대세포바이러스(CMV) 감염 세포의 항원(예를 들어, 세포 표면 항원), 상피 당단백질(EGP 2), 상피 당단백질-40 (EGP-40), 상피 세포 부착 분자(EpCAM), 수용체 티로신-단백질 키나아제 erb- B2,3,4, 엽산 결합 단백질(FBP), 태아 아세틸콜린 수용체(AChR), 엽산 수용체, 강글리오시드 G2(GD2), 강글리오시드 G3(GD3), 인간 표피 성장 인자 수용체 2(HER-2), 인간 텔로머라아제 역전사효소(hTERT), 인터루킨-13 수용체 서브유닛 알파-2(IL-13Ra2), κ-경쇄, 키나아제 삽입 도메인 수용체(KDR), 루이스 A (CA19.9), , LI 세포 부착 분자(LICAM), 흑색종 항원 패밀리 A, 1 (MAGE-AI), 뮤신 16 (Muc-16), 뮤신 1(Muc-1), 메소텔린(MSLN), NKG2D 리간드, 암-고환 항원 NY-ESO-1, 종양태아 항원(h5T4), 전립선 줄기 세포 항원(PSCA), 전립선-특이적 막 항원(PSMA), 종양 관련 당단백질 72(TAG-72), 혈관 내피 성장 인자 R2(VEGF- R2), 및 윌름스 종양 단백질(WT-1)으로 이루어진 군으로부터 선택된다.

항원 결합 도메인(예를 들어, CDR, VH 및/또는 VL의 변이체), 예를 들어, 항원 결합 도메인 서열의 아미노산 서열과 각각 적어도 70 내지 80%, 80 내지 85%, 85 내지 90%, 90 내지 95%, 95 내지 97%, 97 내지 99%, 또는 99% 초과의 동일성을 갖는 가변 경쇄 및/또는 가변 중쇄 또한 본 개시의 범위 내에 있다. 일부 경우, 이러한 분자는 적어도 하나의 중쇄 및 하나의 경쇄를 포함하는 반면, 다른 경우, 변이체 형태는 2개의 가변 경쇄 및 2개의 가변 중쇄(또는 이의 하위 부분)를 함유한다. 당업자는 공지된 기술을 사용하여 본원에서 제시된 바와 같은 항원 결합 도메인의 적절한 변이체를 결정할 수 있을 것이다. 특정 구현예에서, 당업자는 활성에 중요한 것으로 여겨지지 않는 영역을 표적화함으로써 활성을 파괴하지 않고 변경될 수 있는 분자의 적절한 영역을 식별할 수 있다.

일부 구현예에서, 항원 결합 도메인의 폴리펩티드 구조는, 단클론 항체, 이중 특이적 항체, 미니바디, 도메인 항체, 합성 항체(본원에서 때때로 "항체 모방체"로 지칭됨), 키메라 항체, 인간화 항체, 인간 항체, 항체 융합체(본원에서 때때로 "항체 접합체"로 지칭됨), 및 이의 단편을 각각 포함하지만 이에 한정되지 않는 항체를 기반으로 한다. 일부 구현예에서, 항원 결합 도메인은 아비머를 포함하거나 이로 구성된다.

일부 구현예에서, 항원 결합 도메인은 scFv이다. 일부 구현예에서, 항원-선택적 CAR은 리더 또는 신호 펩티드를 포함한다.

다른 구현예에서, 본 개시는 본원에서 기술된 항원 결합 도메인 중 어느 하나를 암호화하는 단리된 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다. 일부 구현예에서, 본 개시는 CAR을 암호화하는 단리된 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다. 또한, 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터, 및 이를 제조하는 방법이 본원에서 제공된다.

다른 구현예에서, 본 개시는 본원에서 기술된 항원 결합 도메인 중 어느 하나를 암호화하는 단리된 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다. 일부 구현예에서, 본 개시는 CAR을 암호화하는 단리된 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다. 또한, 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터, 및 이를 제조하는 방법이 본원에서 제공된다.

일부 구현예에서, 본 개시의 방법을 실시함으로써 생성된 세포 집단의 성분을 형성할 수 있는 CAR-면역 세포(예: CAR-T 세포)는, 예를 들어 RQR8과 같은 안전 스위치 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 예를 들어, 그 전체가 참조로서 본원에 통합되는 WO2013153391A를 참조한다. 폴리뉴클레오티드를 포함하는 CAR-면역 세포(예를 들어, CAR-T 세포)에서, 안전 스위치 폴리펩티드는 CAR-면역 세포(예를 들어, CAR-T 세포)의 표면에서 발현될 수 있다.

ii. 힌지 도메인

본 개시의 CAR의 세포외 도메인은 "힌지" 도메인(또는 힌지 영역)을 포함할 수 있다. 이 용어는 통상적으로 CAR 내의 막관통 도메인을 CAR 내의 세포외 항원 결합 도메인에 연결시키는 기능을 하는 임의의 폴리펩티드를 지칭한다. 특히, 힌지 도메인은 세포외 항원 결합 도메인에 대한 더 많은 유연성 및 접근성을 제공하기 위해 사용될 수 있다.

힌지 도메인은 최대 300개의 아미노산을 포함할 수 있고, 일부 구현예에서는 10 내지 100개의 아미노산, 또는 일부 구현예에서는 25 내지 50개의 아미노산을 포함할 수 있다. 힌지 도메인은 자연적으로 발생하는 분자의 전부 또는 일부, 예를 들어, CD8, CD4, CD28, 4-1BB, 또는 IgG의 세포외 영역의 전부 또는 일부(특히, IgG의 힌지 영역; 힌지 영역은 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgD, IgE, IgM, 또는 이의 단편과 같은 면역글로불린 계통의 일부 또는 전부를 함유할 수 있음), 또는 항체 중쇄 불변 영역의 전부 또는 일부로부터 유래될 수 있다. 대안적으로, 힌지 도메인은 자연적으로 발생하는 힌지 서열에 상응하는 합성 서열일 수 있거나, 완전히 합성된 힌지 서열일 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 힌지 도메인은 인간 CD8α 사슬(예를 들어, NP_001139345.1)의 일부이다. 다른 구현예에서, 상기 힌지 및 막관통 도메인은 인간 CD8α 사슬의 일부를 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에서 기술된 CAR의 힌지 도메인은 CD8α, IgG1, IgG4, PD-1 또는 FcγRIIIα의 하위 서열, 특히 CD8α, IgG1, IgG4, PD-1 또는 FcγRIIIα 중 어느 하나의 힌지 영역을 포함한다. 일부 구현예에서, 힌지 도메인은 인간 CD8α 힌지, 인간 IgG1 힌지, 인간 IgG4, 인간 PD-1 또는 인간 FcγRIIIα 힌지를 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에서 개시된 CAR은 scFv, CD8α 인간 힌지 및 막관통 도메인, CD3ζ 신호 전달 도메인, 및 4-1BB 신호 전달 도메인을 포함한다.

iii. 막관통 도메인

본 개시의 CAR은 CAR의 세포외 도메인에 융합된 막관통 도메인으로 설계된다. 이는 유사하게 CAR의 세포내 도메인에 융합될 수 있다. 일부 경우, 막관통 도메인은, 수용체 복합체의 다른 구성원과의 상호작용을 최소화하도록 동일하거나 상이한 표면 막 단백질의 막관통 도메인에 대한 이러한 도메인의 결합을 피하기 위해 아미노산 치환에 의해 선택되거나 변형될 수 있다. 일부 구현예에서, 짧은 링커는 CAR의 세포외 도메인, 막관통 도메인, 및 세포내 도메인 중 어느 하나 또는 일부 사이에 결합을 형성할 수 있다.

본원에 개시된 CAR에 대한 적절한 막관통 도메인은 (a) 림프구 세포(예를 들어, 제한 없이, T 헬퍼(Th) 세포, 세포독성 T(Tc) 세포, T 조절(Treg) 세포, 또는 자연 살해(NK) 세포)와 같은 면역 세포의 표면에서 발현되고/되거나 (b) 표적 세포에 대한 면역 세포의 세포 반응을 유도하기 위해 세포외 항원 결합 도메인 및 세포내 신호 전달 도메인과 상호작용하는 능력을 갖는다.

막관통 도메인은 천연 또는 합성 공급원으로부터 유래될 수 있다. 공급원이 천연인 경우, 도메인은 임의의 막-결합 또는 막관통 단백질로부터 유래될 수 있다.

본 개시에서 특정적으로 사용되는 막관통 영역은, CD28, OX-40, 4-1BB/CD137, CD2, CD7, CD27, CD30, CD40, 예정사멸-1 (PD-1), 유도성 T 세포 공자극제(ICOS), 림프구 기능 연관 항원-1(LFA-1, CD1-1a/CD18), CD3 감마, CD3 델타, CD3 엡실론, CD247, CD276(B7-H3), LIGHT, (TNFSF14), NKG2C, Ig 알파(CD79a), DAP-10, Fc 감마 수용체, MHC 부류 1분자, TNF 수용체 단백질, 면역글로불린 단백질, 사이토카인 수용체, 인테그린, 신호 전달 림프구 활성화 분자(Signaling Lymphocytic Activation Molecules, SLAM 단백질), 활성 NK 세포 수용체, BTLA, Toll 리간드 수용체, ICAM-1, B7-H3, CDS, ICAM-1, GITR, BAFFR, LIGHT, HVEM(LIGHTR), KIRDS2, SLAMF7, NKp80(KLRF1), NKp44, NKp30, NKp46, CD19, CD4, CD8 알파, CD8 베타, IL-2R 베타, IL-2R 감마, IL-7R 알파, ITGA4, VLA1, CD49a, ITGA4, IA4, CD49D, ITGA6, VLA-6, CD49f, ITGAD, CD1 1d, ITGAE, CD103, ITGAL, CD1 1a, LFA-1, ITGAM, CD1 1b, ITGAX, CD1 1c, ITGB1, CD29, ITGB2, CD18, LFA-1, ITGB7, NKG2D, TNFR2, TRANCE/RANKL, DNAM1(CD226), SLAMF4(CD244, 2B4), CD84, CD96(Tactile), CEACAM1, CRT AM, Ly9(CD229), CD160(BY55), PSGL1, CD100(SEMA4D), CD69, SLAMF6(NTB-A, Ly108), SLAM(SLAMF1, CD150, IPO-3), BLAME(SLAMF8), SELPLG(CD162), LTBR, LAT, GADS, SLP-76, PAG/Cbp, CD19a, CD83과 특이적으로 결합하는 리간드, 또는 이들의 임의의 조합으로부터 유래될 수 있다(이들로 이루어지거나 이에 상응할 수 있다).

비제한적인 예로서, 막관통 영역은 α, β, γ 또는 δ와 같은 T 세포 수용체, CD3 복합체를 구성하는 폴리펩티드, IL-2 수용체 p55(α 사슬), p75(β 사슬) 또는 γ 사슬, Fc 수용체의 서브유닛 사슬, 특히 Fcγ 수용체 III 또는 CD 단백질로부터 유래되거나, 이의 일부일 수 있다. 대안적으로, 막관통 도메인은 합성 도메인일 수 있고, 류신 및 발린과 같은 소수성 잔기를 주로 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 막관통 도메인은 인간 CD8α 사슬(예를 들어, NP_001139345.1)로부터 유래된다.

일부 구현예에서, 본 개시의 CAR 내의 막관통 도메인은 CD8α 막관통 도메인이다.

일부 구현예에서, 본 개시의 CAR 내의 막관통 도메인은 CD28 막관통 도메인이다.

iv. 세포내 도메인

본 개시의 CAR의 세포내(세포질) 도메인은 CAR을 포함하는 면역 세포의 정상적인 효과기 기능 중 적어도 하나의 활성화를 제공할 수 있다. 예를 들어, T 세포의 효과기 기능은 사이토카인의 분비를 포함하는 세포 용해 활성 또는 헬퍼 활성을 나타낼 수 있다.

일부 구현예에서, CAR에 사용하기 위한 활성화 세포내 신호 전달 도메인은, 예를 들어, 제한 없이, 항원 수용체 결합 후 신호 전달을 개시하기 위해 함께 작용하는 T 세포 수용체 및 공수용체의 세포질 서열일 수 있고, 이들 서열의 임의의 유도체 또는 변이체 및 동일한 기능적 능력을 갖는 임의의 합성 서열일 수 있다.

적절한 (예를 들어, 활성화시키는) 세포내 도메인은, CD28, OX-40, 4-1BB/CD137, CD2, CD7, CD27, CD30, CD40, 예정사멸-1 (PD-1), 유도성 T 세포 공자극제(ICOS), 림프구 기능 연관 항원-1(LFA-1, CD1-1a/CD18), CD3 감마, CD3 델타, CD3 엡실론, CD247, CD276(B7-H3), LIGHT, (TNFSF14), NKG2C, Ig 알파(CD79a), DAP-10, Fc 감마 수용체, MHC 부류 1분자, TNF 수용체 단백질, 면역글로불린 단백질, 사이토카인 수용체, 인테그린, 신호 전달 림프구 활성화 분자(Signaling Lymphocytic Activation Molecules, SLAM 단백질), 활성 NK 세포 수용체, BTLA, Toll 리간드 수용체, ICAM-1, B7-H3, CDS, ICAM-1, GITR, BAFFR, LIGHT, HVEM(LIGHTR), KIRDS2, SLAMF7, NKp80(KLRF1), NKp44, NKp30, NKp46, CD19, CD4, CD8 알파, CD8 베타, IL-2R 베타, IL-2R 감마, IL-7R 알파, ITGA4, VLA1, CD49a, ITGA4, IA4, CD49D, ITGA6, VLA-6, CD49f, ITGAD, CD1 1d, ITGAE, CD103, ITGAL, CD1 1a, LFA-1, ITGAM, CD1 1b, ITGAX, CD1 1c, ITGB1, CD29, ITGB2, CD18, LFA-1, ITGB7, NKG2D, TNFR2, TRANCE/RANKL, DNAM1(CD226), SLAMF4(CD244, 2B4), CD84, CD96(Tactile), CEACAM1, CRT AM, Ly9(CD229), CD160(BY55), PSGL1, CD100(SEMA4D), CD69, SLAMF6(NTB-A, Ly108), SLAM(SLAMF1, CD150, IPO-3), BLAME(SLAMF8), SELPLG(CD162), LTBR, LAT, GADS, SLP-76, PAG/Cbp, CD19a, CD83과 특이적으로 결합하는 리간드, 또는 이들의 임의의 조합으로부터 유래된 (또는 이에 상응하는) 신호 전달 도메인을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다는 것이 이해될 것이다.

본 개시의 CAR의 세포내 도메인은, 전술한 활성화 도메인 이외에, 공자극 신호 전달 도메인(본원에서 공자극 분자로 상호 교환 가능하게 지칭됨)을 통합하여 이의 효능을 증가시킬 수 있다. 공자극 도메인은 본원에 기술된 바와 같은 활성화 분자에 의해 제공되는 일차 신호 이외의 추가적인 신호를 제공할 수 있다.

본 개시의 범위 내의 적절한 공자극 도메인은, 예를 들어, CD28, OX40, 4-1BB/CD137, CD2, CD3(알파, 베타, 델타, 엡실론, 감마, 제타), CD4, CD5, CD7, CD9, CD16, CD22, CD27, CD30, CD33, CD37, CD40, CD45, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137, CD154, PD-1, ICOS, 림프구 기능 연관 항원-1(LFA-1)(CD1 1a/CD18), CD247, CD276(B7-H3), LIGHT(종양 괴사 인자 슈퍼패밀리 구성원 14; TNFSF14), NKG2C, Ig 알파(CD79a), DAP-10, Fc 감마 수용체, MHC 부류 I 분자, TNFR, 인테그린, 신호 전달 림프구 활성화 분자, BTLA, Toll 리간드 수용체, ICAM-1, B7-H3, CDS, ICAM-1, GITR, BAFFR, LIGHT, HVEM(LIGHTR), KIRDS2, SLAMF7, NKp80(KLRF1), NKp44, NKp30, NKp46, CD19, CD4, CD8 알파, CD8 베타, IL-2R 베타, IL-2R 감마, IL-7R 알파, ITGA4, VLA1, CD49a, ITGA4, IA4, CD49D, ITGA6, VLA-6, CD49f, ITGAD, CD1-1d, ITGAE, CD103, ITGAL, CD1-1a, LFA-1, ITGAM, CD1-1b, ITGAX, CD1-1c, ITGB1, CD29, ITGB2, CD18, LFA-1, ITGB7, NKG2D, TNFR2, TRANCE/RANKL, DNAM1(CD226), SLAMF4(CD244, 2B4), CD84, CD96(Tactile), CEACAM1, CRT AM, Ly9(CD229), CD160(BY55), PSGL1, CD100(SEMA4D), CD69, SLAMF6(NTB-A, Ly108), SLAM(SLAMF1, CD150, IPO-3), BLAME(SLAMF8), SELPLG (CD162), LTBR, LAT, GADS, SLP-76, PAG/Cbp, CD19a, CD83 리간드, 또는 이의 단편, 또는 이의 조합으로부터 유래될 수 있다(또는 상응할 수 있다). 위에 열거되지 않은 추가적인 공자극 분자 또는 이의 단편 또한 본 개시의 범위 내에 있음을 이해할 것이다.

일부 구현예에서, CAR의 세포내/세포질 도메인은 4-1BB/CD137 도메인을 그 자체로서 포함하거나 본 개시의 CAR의 맥락에서 유용한 임의의 다른 목적하는 세포내 도메인(들)과 조합되도록 설계될 수 있다. 4-1BB/CD137의 완전한 천연 아미노산 서열은 NCBI 참조 서열: NP_001552.2에 기술되어 있다. 완전한 천연 4-1BB/CD137 핵산 서열은 NCBI 참조 서열: NM_001561.5에 기술되어 있다.

일부 구현예에서, CAR의 세포내/세포질 도메인은 CD28 도메인을 그 자체로서 포함하거나 본 개시의 CAR의 맥락에서 유용한 임의의 다른 목적하는 세포내 도메인(들)과 조합되도록 설계될 수 있다. 완전한 CD28의 천연 아미노산 서열은 NCBI 참조 서열: NP_006130.1에 기술되어 있다. 완전한 천연 CD28 핵산 서열은 NCBI 참조 서열: NM_006139.1에 기술되어 있다.

일부 구현예에서, CAR의 세포내/세포질 도메인은 CD3 제타 도메인을 그 자체로서 포함하거나 본 개시의 CAR의 맥락에서 유용한 임의의 다른 목적하는 세포내 도메인(들)과 조합되도록 설계될 수 있다.

예를 들어, CAR의 세포내 도메인은 CD3 제타 사슬 부분 및 공자극 신호전달 분자의 부분를 포함할 수 있다. 본 개시의 CAR의 세포내 신호 전달 부분 내의 세포내 신호 전달 서열은 무작위 또는 특정 순서로 서로 연결될 수 있다. 일부 구현예에서, 세포내 도메인은 CD3 제타의 활성화 도메인 및 CD28의 신호 전달 도메인을 포함하도록 설계된다. 일부 구현예에서, 세포내 도메인은 CD3 제타의 활성화 도메인 및 4-1BB의 신호 전달 도메인을 포함하도록 설계된다.

일부 구현예에서, 본 개시의 CAR의 세포내 신호 전달 도메인은 공자극 분자의 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 본 개시의 CAR의 세포내 신호 전달 도메인은 4-1BB(GenBank: AAA53133) 및 CD28(NP_006130.1)의 단편으로 이루어진 군으로부터 선택된 공자극 분자의 일부를 포함한다.

CAR T 세포의 유전적 변형

또한, 조작된 면역 세포 및 내인성 TCR을 발현하는 세포가 고갈된 CAR을 발현하는 조작된 면역 세포(예를 들어, CAR-T 세포 또는 CAR+ 세포)의 집단이 본원에 제공된다.

일부 구현예에서, 조작된 면역 세포는 CAR T 세포를 포함하며, 각각의 CAR T 세포는 세포외 항원 결합 도메인을 포함하고 내인성 TCR의 발현이 감소되거나 제거된다. 일부 구현예에서, 조작된 면역 세포의 집단은 CAR T 세포의 집단을 포함하며, 각각의 CAR T 세포는 2개 이상의 상이한 세포외 항원 결합 도메인을 포함하고 내인성 TCR의 발현이 감소되거나 제거된다. 일부 구현예에서, 면역 세포는 CAR T 세포를 포함하며, 각각의 CAR T 세포는 동일한 세포외 항원 결합 도메인을 포함하고 내인성 TCR의 발현이 감소되거나 제거된다.

일부 구현예에서, 본 개시에 따른 조작된 면역 세포는, CD52, DLL3, GR, PD-1, CTLA-4, LAG3, TIM3, BTLA, BY55, TIGIT, B7H5, LAIR1, SIGLEC10, 2B4, HLA, TCRα 및 TCRβ로 이루어진 군으로부터 선택된 하나의 파괴되거나 불활성화된 유전자를 포함하고/하거나, CAR, 다쇄 CAR 및/또는 pTα 이식유전자를 발현한다. 일부 구현예에서, 단리된 세포는 다쇄 CAR을 포함하는 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구현예에서, 본 개시에 따른 단리된 세포는, CD52 및 GR, CD52 및 TCRα, CDR52 및 TCRβ, DLL3 및 CD52, DLL3 및 TCRα, DLL3 및 TCRβ, GR 및 TCRα, GR 및 TCRβ, TCRα 및 TCRβ, PD-1 및 TCRα, PD-1 및 TCRβ, CTLA-4 및 TCRα, CTLA-4 및 TCRβ, LAG3 및 TCRα, LAG3 및 TCRβ, TIM3and TCRα, Tim3 및 TCRβ, BTLA 및 TCRα, BTLA 및 TCRβ, BY55 및 TCRα, BY55 및 TCRβ, TIGIT 및 TCRα, TIGIT 및 TCRβ, B7H5 및 TCRα, B7H5 및 TCRβ, LAIR1 및 TCRα, LAIR1 및 TCRβ, SIGLEC10 및 TCRα, SIGLEC10 및 TCRβ, 2B4 및 TCRα, 2B4 및 TCRβ로 이루어진 군으로부터 선택된 2개의 파괴되거나 불활성화된 유전자를 포함하고/하거나 CAR, 다쇄 CAR 및/또는 pTα 이식유전자를 발현한다. 일부 구현예에서, 방법은 선택적 DNA 절단에 의해 유전자를 선택적으로 불활성화시킬 수 있는 엔도뉴클레아제를 세포 내에 도입함으로써 하나 이상의 유전자를 파괴하거나 불활성화시키는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 엔도뉴클레아제는, 예를 들어, 아연 핑거 뉴클레아제(ZFN), 메가TAL 뉴클레아제, 메가뉴클레아제, 전사 활성화제-유사 효과기 뉴클레아제(TALE-뉴클레아제 또는 TALEN®), 또는 CRIPR(예를 들어, Cas9 또는 Cas12) 엔도뉴클레아제일 수 있다.

일부 구현예에서, TCR은 TCRα 유전자 및/또는 TCRβ 유전자(들)를 파괴하거나 불활성화시킴으로써 본 개시에 따른 세포에서 기능하지 않게 된다. 일부 구현예에서, 개체로부터 유래된 변형된 세포를 수득하는 방법이 제공되며, 여기에서 세포는 주요 조직적합성 복합체(MHC) 신호 전달 경로와 독립적으로 증식할 수 있다. MHC 신호 전달 경로와 독립적으로 증식할 수 있고, 이러한 방법에 의해 수득되기 용이한 변형된 세포는 본 개시의 범위에 포함된다. 본원에서 개시된 변형된 세포는, 숙주 대 이식편(HvG) 거부 반응 및 이식편 대 숙주 질환(GvHD)에 대한 치료를 이를 필요로 하는 환자의 치료에 사용될 수 있다; 따라서, 본 개시의 범위는 파괴되고나 불활성화된 TCRα 및/또는 TCRβ 유전자를 포함하는 변형된 세포의 유효량을 투여함으로써 상기 환자를 치료하는 단계를 포함하는, 숙주 대 이식편(HvG) 거부 반응 및 이식편 대 숙주 질환(GvHD)에 대한 치료가 필요한 환자를 치료하는 방법이다.

본 개시는 내인성 TCR 발현이 결여되거나 감소된 조작된 면역 세포의 집단의 순도를 결정하는 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, 조작된 면역 세포는 5.0% 미만, 4.0% 미만, 3.0% 미만의 TCR+ 세포, 2.0% 미만의 TCR+ 세포, 1.0% 미만의 TCR+ 세포, 0.9% 미만의 TCR+ 세포, 0.8% 미만의 TCR+ 세포, 0.7% 미만의 TCR+ 세포, 0.6% 미만의 TCR+ 세포, 0.5% 미만의 TCR+ 세포, 0.4% 미만의 TCR+ 세포, 0.3% 미만의 TCR+ 세포, 0.2% 미만의 TCR+ 세포, 또는 0.1% 미만의 TCR+ 세포를 포함한다. 이러한 집단은 개시된 방법의 산물일 수 있다.

일부 구현예에서, 본 개시에 따른 조작된 면역 세포는 하나 이상의 파괴되거나 불활성화된 유전자를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 표적 항원(예를 들어, EGFRvIII, Flt3, WT-1, CD20, CD23, CD30, CD38, CD33, CD133, MHC-WT1, TSPAN10, MHC-PRAME, Liv1, ADAM10, CHRNA2, LeY, NKGD2D, CS1, CD44v6, ROR1, Claudin-18.2, Muc17, FAP 알파, Ly6G6D, c6orf23, G6D, MEGT1, NG25, CD19, BCMA, FLT3, CD70, DLL3, 또는 CD34, CD70)의 유전자를 녹아웃시켜 동일한 항원(예를 들어, EGFRvIII, Flt3, WT-1, CD20, CD23, CD30, CD38, CD33, CD133, MHC-WT1, TSPAN10, MHC-PRAME, Liv1, ADAM10, CHRNA2, LeY, NKGD2D, CS1, CD44v6, ROR1, Claudin-18.2, Muc17, FAP 알파, Ly6G6D, c6orf23, G6D, MEGT1, NG25, CD19, BCMA, FLT3, CD70, DLL3, 또는 CD34, CD70 CAR)를 표적으로 하는 CAR을 도입하여 유도 CAR 활성화를 피한다. 본원에 기술된 바와 같이, 일부 구현예에서, 본 개시에 따른 조작된 면역 세포는 MHC1 (β2M), MHC2 (CIITA), EGFRvIII, Flt3, WT-1, CD20, CD23, CD30, CD38, CD33, CD133, MHC-WT1, TSPAN10, MHC-PRAME, Liv1, ADAM10, CHRNA2, LeY, NKGD2D, CS1, CD44v6, ROR1, Claudin-18.2, Muc17, FAP alpha, Ly6G6D, c6orf23, G6D, MEGT1, NG25, CD19, BCMA, FLT3, CD70, DLL3, 또는 CD34, CD70, TCRα 및 TCRβ 로 이루어진 군으로부터 선택된 하나의 파괴되거나 불활성화된 유전자를 포함하고/하거나 CAR 또는 다쇄 CAR를 발현한다. 일부 구현예에서, 세포는 다중 사슬 CAR을 포함한다. 일부 구현예에서, 단리된 세포는, CD52 및 TCRα, CDR52 및 TCRβ, PD-1 및 TCRα, PD-1 및 TCRβ, MHC-1 및 TCRα, MHC-1 및 TCRβ, MHC2 및 TCRα, MHC2 및 TCRβ 로 이루어진 군으로부터 선택된 두개의 파괴되거나 불활성화된 유전자를 포함하고/하거나 CAR 또는 다쇄 CAR를 발현한다.

조작된 면역 세포는 동종 또는 자가일 수 있다.

일부 구현예에서, 조작된 면역 세포 또는 조작된 면역 세포의 집단은 T 세포(예를 들어, 염증성 T 림프구 세포독성 T 림프구, 조절 T 림프구, 헬퍼 T 림프구, 종양 침윤 림프구(TIL)), NK 세포, NK-T 세포, TCR 발현 세포, 수지상 세포, 살상 수지상 세포, 비만 세포, 또는 B 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, T 세포는 CD4+ T 림프구, CD8+ T 림프구 또는 CD4+ 및 CD8+ T 세포의 조합을 포함하는 집단으로 이루어진 군으로부터 유래될 수 있다.

일부 구현예에서, 개시된 방법을 사용하여 생성된 조작된 면역 세포 또는 조작된 면역 세포의 집단은, 예를 들어 줄기 세포로부터 유래될 수 있지만, 이에 한정되지 않는다. 줄기 세포는 성체 줄기 세포, 비-인간 배아 줄기 세포, 보다 구체적으로, 비-인간 줄기 세포, 제대혈 줄기 세포, 전구 세포, 골수 줄기 세포, 유도된 다능성 줄기 세포, 전능성 줄기 세포 또는 조혈 줄기 세포일 수 있다.

일부 구현예에서, 개시된 방법을 사용하여 생성된 조작된 면역 세포 또는 면역 세포의 집단은 말초 혈액으로부터 수득되거나 제조된다. 일부 구현예에서, 조작된 면역 세포는 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)로부터 수득되거나 제조된다. 일부 구현예에서, 조작된 면역 세포는 골수로부터 수득되거나 제조된다. 일부 구현예에서, 조작된 면역 세포는 제대혈로부터 수득되거나 제조된다. 일부 구현예에서, 세포는 인간 세포이다. 일부 구현예에서, 세포는 전기천공, 초음파형성, 바이오리스틱스(예를 들어, Gene Gun), 지질 형질감염, 중합체 형질감염, 나노입자, 바이러스 형질감염(예를 들어, 레트로바이러스, 렌티바이러스, AAV), 또는 다중총으로 이루어진 군으로부터 선택된 방법을 사용하여 핵산 벡터에 의해 형질감염되거나 형질도입된다.

일부 구현예에서, 항원-특이적 CAR을 세포 표면 막에서 발현하는 조작된 면역 세포는, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 100%를 초과하는 줄기 세포 기억 및 중추 기억 세포의 백분율을 포함한다.

일부 구현예에서, 항원-특이적 CAR을 세포 표면 막에서 발현하는 조작된 면역 세포는, 약 10% 내지 약 60%, 약 10% 내지 약 50%, 약 10% 내지 약 40%, 약 15% 내지 약 50%, 약 15% 내지 약 40%, 약 20% 내지 약 60%, 또는 약 20% 내지 약 70%의 줄기 세포 기억 및 중추 기억 세포의 백분율을 포함한다.

일부 구현예에서, 항원-특이적 CAR을 세포 표면 막에서 발현하는 조작된 면역 세포는, 조작된 면역 세포가 적어도 약 60%, 65%, 70%, 75%, 또는 80%의 조합된 T_CM 및 T_SCM 세포를 포함하도록 T_CM 및/또는 T_SCM 세포에서 농축된다. 일부 구현예에서, 항원-특이적 CAR을 세포 표면 막에서 발현하는 조작된 면역 세포는, 조작된 면역 세포가 적어도 약 70%의 조합된 T_CM 및 T_SCM 세포를 포함하도록 T_CM 및/또는 T_SCM 세포에서 농축된다. 일부 구현예에서, 항원-특이적 CAR을 세포 표면 막에서 발현하는 조작된 면역 세포는, 조작된 면역 세포가 적어도 약 75%의 조합된 T_CM 및/또는 T_SCM 세포를 포함하도록 T_CM 및/또는 T_SCM 세포에서 농축된다.

일부 구현예에서, 조작된 면역 세포는 CAR을 발현하는 염증성 T 림프구이다. 일부 구현예에서, 조작된 면역 세포는 CAR을 발현하는 세포독성 T 림프구이다. 일부 구현예에서, 조작된 면역 세포는 CAR을 발현하는 조절 T 림프구이다. 일부 구현예에서, 조작된 면역 세포는 CAR을 발현하는 헬퍼 T 림프구이다.

일부 구현예에서, 면역 세포는 하나 이상의 화학요법 약물에 내성이 있도록 조작된다. 화학요법 약물은, 예를 들어, 퓨린 뉴클레오티드 유사체(PNA)일 수 있으므로, 면역 세포를 입양 면역요법과 화학요법을 병용하는 암 치료에 적합하게 한다. 예시적인 PNA는, 예를 들어, 클로파라빈, 플루다라빈, 시클로포스파미드, 및 시타라빈을 단독으로 또는 조합하여 포함한다. PNA는 데옥시시티딘 키나아제(dCK)에 의해 모노-, 디-, 및 트리-포스페이트 PNA로 대사된다. 이들의 삼인산 형태는 DNA 합성을 위해 ATP와 경쟁하고, 세포자멸-유도제로서 작용하며, 트리뉴클레오티드 생산에 관여하는 리보뉴클레오티드 환원효소(RNR)의 강력한 억제제이다.

일부 구현예에서, 본 개시의 단리된 세포 또는 세포주는 pTα 또는 이의 기능적 변이체를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 단리된 세포 또는 세포주는 TCRα 유전자를 파괴하거나 불활성화시킴으로써 추가로 유전적으로 변형될 수 있다.

본 개시는 또한 본원에서 기술된 CAR 폴리뉴클레오티드 중 어느 하나를 포함하는 조작된 면역 세포를 제공한다. 일부 구현예에서, CAR은 플라스미드 벡터를 통해 이식유전자로서 면역 세포 내에 도입될 수 있다. 일부 구현예에서, 플라스미드 벡터는, 예를 들어, 벡터를 수용한 세포의 식별 및/또는 선택을 제공하는 선택 마커를 함유할 수도 있다.

CAR 폴리펩티드는 CAR 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 세포 내로 도입한 후, 세포에서 실시간으로 합성될 수 있다. 대안적으로, CAR 폴리펩티드는 세포 외부에서 생산된 후, 세포 내로 도입될 수 있다. 폴리뉴클레오티드 작제물을 세포 내로 도입하는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 일부 구현예에서, (예를 들어, 렌티바이러스 벡터를 사용하는) 안정한 형질전환 방법이 폴리뉴클레오티드 작제물을 세포의 게놈 내로 통합하는데 사용될 수 있다. 다른 구현예에서, 일시적인 형질전환 방법은 폴리뉴클레오티드 작제물, 및 세포의 게놈 내에 통합되지 않은 폴리뉴클레오티드 작제물을 일시적으로 발현하는 데 사용될 수 있다. 다른 구현예에서, 바이러스 매개 방법이 사용될 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 예를 들어, 재조합 바이러스 벡터(예를 들어, 레트로바이러스, 아데노바이러스), 리포좀 등과 같은 임의의 적절한 수단에 의해 세포 내로 도입될 수 있다. 일시적 변환 방법은, 예를 들어, 제한 없이, 미세주입, 전기천공 또는 입자 충돌을 포함한다. 폴리뉴클레오티드는, 예를 들어 플라스미드 벡터 또는 바이러스 벡터와 같은 벡터에 포함될 수 있다.

일부 구현예에서, 항원 결합 도메인을 암호화하는 제1 폴리뉴클레오티드, 적어도 하나의 공자극 분자, 및 활성화 도메인에 작동 가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 단리된 핵산이 제공된다. 일부 구현예에서, 핵산 작제물은 바이러스 벡터 내에 포함된다. 일부 구현예에서, 바이러스 벡터는 레트로바이러스 벡터, 쥣과 백혈병 바이러스 벡터, SFG 벡터, 아데노바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터, 아데노-연관 바이러스(AAV) 벡터, 헤르페스 바이러스 벡터, 및 우두 바이러스 벡터로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 핵산은 플라스미드 내에 함유된다.

일부 구현예에서, 단리된 핵산 작제물은 바이러스 벡터 내에 함유되고, 무작위 통합, 예를 들어, 렌티바이러스- 또는 레트로바이러스-매개 무작위 통합에 의해 조작된 면역 세포의 게놈 내로 도입된다. 일부 구현예에서, 단리된 핵산 작제물은 바이러스 벡터 또는 비-바이러스 벡터에 함유되고, 부위 특이적 통합, 예를 들어, 아데노바이러스 매개 부위 특이적 통합에 의해 조작된 면역 세포의 게놈 내로 도입된다.

조작된 면역 세포의 제조

본 개시에 따른 폴리뉴클레오티드, 폴리펩티드, 벡터, 항원 결합 도메인, 면역 세포, 조성물 등을 제조하는 데에는 다양한 공지된 기술이 사용될 수 있다.

본원에서 기술된 면역 세포의 시험관 내 조작 또는 유전적 변형 전에, 세포는 대상체로부터 수득될 수 있다. CAR을 발현하는 세포는 동종 또는 자가 공급원으로부터 유래될 수 있고 본원에 기술된 내인성 TCR을 고갈시킬 수 있다.

a. 원재료

일부 구현예에서, 면역 세포는 T 세포를 포함한다. T 세포는 말초 혈액 단핵 세포(PBMC), 골수, 림프절 조직, 제대혈, 흉선 조직, 그리고 감염 부위, 복수, 흉막 삼출, 비장 조직 및 종양으로부터의 조직을 포함하는 다수의 공급원으로부터 수득될 수 있다. 일부 구현예에서, T 세포는 FICOLL^TM 분리와 같은 당업자에게 공지된 임의의 수의 기술을 사용하여 대상체로부터 수집된 혈액량으로부터 수득될 수 있다.

세포는 성분채집술에 의해 개체의 순환 혈액으로부터 수득될 수 있다. 성분채집술 제품은 일반적으로 T 세포, 단핵구, 과립구, B 세포, 다른 유핵 백혈구, 적혈구 및 혈소판을 포함하는 림프구를 함유한다. 일부 구현예에서, 성분채집술에 의해 수집된 세포는 세척되어 혈장 분획을 제거하고, 이어서 후속 프로세스를 위해 적절한 완충액 또는 배지에 놓일 수 있다.

일부 구현예에서, T 세포는, 예를 들어 PERCOLL^TM 구배를 통한 원심분리를 사용하여, 적혈구를 용해시키고 단핵구를 고갈시킴으로써 PBMC로부터 단리된다. T 세포(예를 들어, CD28+, CD4+, CD45RA?, 및 CD45RO+ T 세포 또는 CD28+, CD4+, CDS+, CD45RA?, CD45RO+, 및 CD62L+ T 세포)의 특이적 하위집단은 당업계에 공지된 양성 또는 음성 선별 기술에 의해 추가로 단리될 수 있다. 예를 들어, 음성 선별에 의한 T 세포 집단의 농축은 음성으로 선별된 세포에 대해 고유한 표면 마커에 대한 항체의 조합으로 달성될 수 있다. 본원에서 사용하기 위한 하나의 방법은 음성 자기 면역 부착성 또는 유세포 계측법을 통한 세포 분류 및/또는 선택이며, 이는 음성으로 선택된 세포 상에 존재하는 세포 표면 마커를 대상으로 한 단클론 항체의 칵테일을 사용한다. 예를 들어, 음성 선택에 의해 CD4+ 세포를 풍부하게 하기 위해, 단클론 항체 칵테일은 일반적으로 CD14, CD20, CD11b, CD16, HLA-DR, 및 CD8에 대한 항체를 포함한다. 유세포 계측법 및 세포 분류는 또한 본 개시에 사용하기 위해 관심 세포 집단을 단리하는데 사용될 수 있다.

PBMC는 본원에 기술된 바와 같은 방법을 사용하여 면역 세포(예를 들어, CAR 또는 TCR)를 사용하는 유전적 변형에 직접 사용될 수 있다. 특정 구현예에서, PBMC를 단리한 후, T 림프구를 추가로 단리할 수 있고, 세포독성 및 헬퍼 T 림프구 둘 모두는 유전적 변형 및/또는 증식 전 또는 후에 미처리, 기억 및 효과기 T 세포 하위집단으로 분류될 수 있다. 일부 구현예에서, CD8+ 세포는 이들 유형의 CD8+ 세포 각각과 연관된 세포 표면 항원을 식별함으로써 미처리, 줄기 세포 기억, 중추 기억, 및 효과기 세포로 추가로 분류된다. 일부 구현예에서, 중추 기억 T 세포의 표현형 마커의 발현은 CD27, CD45RA, CD45RO, CD62L, CCR7, CD28, CD3, 및 CD127을 포함하고, 그랜자임 B에 대해 음성이다. 일부 구현예에서, 줄기 세포 기억 T 세포는 CD45RO-, CD62L+, CD8+ T 세포이다. 일부 구현예에서, 중추 기억 T 세포는 CD45RO+, CD62L+, CD8+ T 세포이다. 일부 구현예에서, 효과기 T 세포는 CD62L, CCR7, CD28 및 CD127에 대해 음성이고, 그랜자임 B 및 퍼포린에 대해 양성이다. 일부 구현예에서, CD4+ T 세포는 하위집단으로 추가로 분류된다. 예를 들어, CD4+ T 헬퍼 세포는 세포 표면 항원을 갖는 세포 집단을 식별함으로써 미처리, 중추 기억, 및 효과기 세포로 분류될 수 있다.

b. 줄기 세포 유래 면역 세포

일부 구현예에서, 면역 세포는 배아 줄기(ES) 또는 유도된 다능성 줄기(iPS) 세포로부터 유래될 수 있다. 적절한 HSC, 간엽, iPS 세포 및 다른 유형의 줄기 세포는 불멸 세포주로부터 배양되거나 환자로부터 직접 단리될 수 있다. 줄기 세포를 단리, 발생 및/또는 배양하기 위한 다양한 방법이 당업계에 공지되어 있으며, 본 개시를 실시하는 데 사용될 수 있다.

일부 구현예에서, 면역 세포는 재프로그램화된 T 세포로부터 유래된 유도된 다능성 줄기 세포(iPSC)이다. 일부 구현예에서, 원재료는 T 세포 또는 비-T 세포로부터 유래된 유도된 다능성 줄기 세포(iPSC)일 수 있다. 일부 구현예에서, 면역 세포는 iPSC-유래 T 세포이다. 일부 구현예에서, 면역 세포는 iPSC-유래 NK 세포이다. 원재료는 배아 줄기 세포일 수 있다. 원재료는 B 세포, 또는 말초 혈액 단핵 세포 단리체, 조혈 전구 세포, 조혈 줄기 세포, 간엽 줄기 세포, 지방 줄기 세포, 또는 임의의 다른 체세포 유형 유래의 임의의 다른 세포일 수 있다.

c. 단리된 세포의 유전적 변형

T 세포와 같은 면역 세포는 공지된 방법을 사용하여 단리한 후 유전적으로 변형될 수 있거나, 면역 세포는 유전적으로 변형되기 전에 시험관 내에서 활성화되고 증식(또는 전구세포의 경우 분화)될 수 있다. 일부 구현예에서, 단리된 면역 세포는 내인성 TCRα 및/또는 CD52의 발현을 감소시키거나 제거하기 위해 유전적으로 변형된다. 일부 구현예에서, 세포는 내인성 단백질(예를 들어, TCRα 및/또는 CD52)의 발현을 감소시키거나 제거하기 위해 유전자 편집 기술(예를 들어, CRISPR/Cas9, CRISPR/Cas12a, 아연 핑거 뉴클레아제(ZFN), TALEN, MegaTAL, 메가뉴클레아제)을 사용하여 유전적으로 변형된다. 또 다른 구현예에서, T 세포와 같은 면역 세포는 본원에서 기술된 키메라 항원 수용체(예를 들어, CAR을 암호화하는 하나 이상의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 바이러스 벡터로 형질도입됨)로 유전적으로 변형된 후, 시험관 내에서 활성화되고/되거나 증식된다.

본 개시의 작제물 및 조작된 면역 세포를 제조하기 위한 특정 방법은 PCT 출원 PCT/US15/14520에 기술되어 있으며, 그 내용은 그 전체가 참조로서 본원에 통합된다.

PBMC는 NK 세포 또는 NKT 세포와 같은 다른 세포독성 림프구를 추가로 포함할 수 있음을 이해할 것이다. 본원에 개시된 키메라 수용체의 코딩 서열을 운반하는 발현 벡터는 인간 공여자 T 세포, NK 세포 또는 NKT 세포의 집단에 도입될 수 있다. 발현 벡터를 운반하는 성공적으로 형질도입된 T 세포는 유세포 계측법을 사용하여 분류되어 CD3 양성 T 세포를 단리한 후, 항-CD3 항체 및 IL-2 또는 본원의 다른 곳에 기술된 바와 같은 당업계에 공지된 다른 방법을 사용하여, 세포 활성화에 더하여 T 세포를 발현하는 이들 CAR의 수를 증가시키기 위해 추가로 증식될 수 있다. 표준 절차는 인간 대상체에서 사용하기 위한 보관 및/또는 준비를 위해 CAR을 발현하는 T 세포의 동결보존을 위해 사용된다. 일 구현예에서, T 세포의 시험관 내 형질도입, 배양 및/또는 증식은 태아 송아지 혈청 및 태아 소 혈청과 같은 비인간 동물 유래 산물의 부재 하에 수행된다.

폴리뉴클레오티드의 클로닝을 위해, 벡터를 숙주 세포(단리된 숙주 세포) 내로 도입하여 벡터 자체의 복제를 허용함으로써 그 안에 함유된 폴리뉴클레오티드의 복사를 증폭시킬 수 있다. 클로닝 벡터는 복제 기점, 프로모터 서열, 전사 개시 서열, 인핸서 서열, 및 선택성 마커를 포함하되 이에 한정되지 않는 서열 성분을 함유할 수 있다. 이들 요소는 당업자에 의해 적절히 선택될 수 있다. 예를 들어, 복제 기점은 숙주 세포에서 벡터의 자율 복제를 촉진하기 위해 선택될 수 있다.

일부 구현예에서, 본 개시는 본원에서 제공된 벡터를 함유하는 단리된 숙주 세포를 제공한다. 벡터를 함유하는 숙주 세포는 벡터에 함유된 폴리뉴클레오티드의 발현 또는 클로닝에 유용할 수 있다. 적절한 숙주 세포는 원핵 세포, 진균 세포, 효모 세포, 또는 포유류 세포, 특히 인간 세포와 같은 더 높은 진핵 세포를 포함할 수 있지만, 이에 한정되지 않는다.

벡터는, 제한 없이, DEAE-덱스트란 매개 전달, 인산칼슘 침전물 방법, 양이온성 지질 매개 전달, 리포좀 매개 형질감염, 전기천공, 미세투과성 충돌, 수용체 매개 유전자 전달, 폴리리신, 히스톤, 키토산, 및 펩티드에 의해 매개되는 전달을 포함하는, 당업계에 공지된 임의의 적절한 방법을 사용하여 숙주 세포에 도입될 수 있다. 관심 벡터의 발현에 대한 세포의 형질감염 및 형질전환을 위한 표준 방법은 당업계에 공지되어 있다. 추가의 구현예에서, 상이한 발현 벡터의 혼합물은 면역 효과기 세포의 공여자 집단을 유전적으로 변형시키는 데 사용될 수 있으며, 여기에서 각각의 벡터는 본원에 개시된 바와 같은 상이한 CAR을 암호화한다. 생성된 형질도입된 면역 효과기 세포는 조작된 세포의 혼합 집단을 형성하고, 조작된 세포의 비율은 둘 이상의 상이한 CAR을 발현한다.

일 구현예에서, 본 개시는 CAR 또는 TCR을 발현하는 유전적으로 조작된 세포를 보관하는 방법을 제공한다. 이는 해동 시 세포가 생존가능하게 유지되도록 면역 세포를 동결 보존하는 것을 포함한다. CAR을 발현하는 면역 세포의 일부는 악성 종양을 앓고 있는 환자의 향후 치료를 위한 이러한 세포의 영구적인 공급원을 제공하기 위해 당업계에 공지된 방법에 의해 동결 보존될 수 있다. 필요한 경우, 동결 보존된 형질전환된 면역 세포는 더 많은 이러한 세포를 위해 해동, 성장 및 증식될 수 있다.

일부 구현예에서, 세포는 먼저 배양 배지로부터 수확된 후, 치료 유효량으로 투여하기에 적합한 배지 및 용기 시스템("약학적으로 허용 가능한" 담체)에서 세척되고 농축됨으로써 제형화된다. 적절한 주입 매질은 임의의 등장성 매질 제형, 통상적으로 생리식염수, Normosol^TM R(Abbott) 또는 Plasma-Lyte^TM A(Baxter)일 수 있지만, 물 중 5% 덱스트로스 또는 링거 락트산이 또한 사용될 수 있다. 주입 매질은 인간 혈청 알부민으로 보충될 수 있다.

d. 동종 CAR T 세포

동종 CAR T 요법을 제조하는 프로세스는 건강한 공여자로부터 건강한, 선택된, 스크리닝되고 시험된 T 세포를 수득하는 단계를 포함한다. 다음으로, T 세포는 혈액 또는 고형 종양에서 발현되는 특정 세포 표면 단백질을 인식하는 CAR을 발현하도록 조작된다. 동종 T 세포는 이식편 대 숙주 질환(GvHD)의 위험을 감소시키고 동종 거부 반응을 예방하기 위한 유전자 편집물이다. T 세포 수용체 유전자(예를 들어, TCRα, TCRβ)를 녹아웃하여 GvHD를 회피한다. CD52 유전자는 CAR T 산물이 항-CD52 항체 치료에 내성을 갖도록 녹아웃될 수 있다. 따라서, 항-CD52 항체 치료는 숙주 면역계를 억제하고 CAR T가 생착된 상태로 유지되어 완전한 치료 효과를 달성하도록 하는 데 사용될 수 있다. 이어서, 조작된 T 세포는 정제 단계를 거치고, 궁극적으로 환자에게 전달하기 위해 바이알에 동결 보존된다.

e. 자가 CAR T 세포

자가 키메라 항원 수용체(CAR) T 세포 요법은, 환자 자신의 세포(예를 들어, T 세포를 포함하는 백혈구)를 수집하고, T 세포를 유전적으로 조작하여 하나 이상의 특정 암세포의 세포 표면에서 발현된 표적을 인식하고, 암세포를 죽이는 CAR을 발현하는 것을 포함한다. 이후, 조작된 세포를 동결 보존하고, 이어서 환자에게 투여한다.

약학적 조성물

일부 구현예에서, 세포는 먼저 배양 배지로부터 수확된 후, 치료 유효량으로 투여하기에 적합한 배지 및 용기 시스템("약학적으로 허용 가능한" 담체)에서 세척되고 농축됨으로써 제형화된다. 적절한 주입 매질은 임의의 등장성 매질 제형, 통상적으로 생리식염수, Normosol^TM R(Abbott) 또는 Plasma-Lyte^TM A(Baxter)일 수 있지만, 물 중 5% 덱스트로스 또는 링거 락트산이 또한 사용될 수 있다. 주입 매질은 인간 혈청 알부민으로 보충될 수 있다.

구현예에서, 조성물 중 세포의 원하는 치료량은, 대체적으로 적어도 2개의 세포(예를 들어, 적어도 1개의 CD8+ 중추 또는 줄기 세포 기억 T 세포 및 적어도 1개의 CD4+ 헬퍼 T 세포 서브 세트; 또는 2개 이상의 CD8+ 중추 또는 줄기 세포 기억 T 세포; 또는 2개 이상의 CD4+ 헬퍼 T 세포 서브 세트)이거나, 보다 일반적으로 10²개 세포보다 크고, 최대 10⁶개 세포까지 포함하고, 최대 10⁷, 10⁸ 또는 10⁹개 세포까지 포함하고, 10¹⁰개 초과의 세포를 포함할 수 있다. 세포의 수는 조성물이 의도되는 목적하는 용도, 및 그 안에 포함된 세포의 유형에 따라 달라질 것이다. 목적하는 세포의 밀도는 통상적으로 10⁶ 세포/ml 초과이며, 일반적으로 10⁷ 세포/ml 초과, 일반적으로 10⁸ 세포/ml 이상이다. 임상적으로 관련된 면역 세포의 수는 10⁵, 10⁶, 10⁷, 10⁸, 10⁹, 10¹⁰, 10¹¹, 또는 10¹²개의 세포와 누적적으로 동일하거나 이를 초과하는 다수의 주입으로 배분될 수 있다. 본 개시의 일부 양태에서, 특히 주입된 모든 세포가 특정 표적 항원으로 리디렉팅될 것이므로, 약 10⁵/킬로그램 내지 약 10⁶/킬로그램(환자당 10⁶ 내지 10¹¹개) 범위의 더 적은 수의 세포가 투여될 수 있다. CAR 치료는 이들 범위 내의 투여량으로 여러 번 투여될 수 있다. 세포는 치료를 받는 환자에 대해 자가, 동종, 또는 이종일 수 있다.

본 개시의 CAR 발현 세포 집단은 단독으로 투여되거나, 희석제 및/또는 IL-2 또는 다른 사이토카인 또는 세포 집단과 같은 다른 성분과 조합하여 약학적 조성물로서 투여될 수 있다. 본 개시의 약학적 조성물은, 하나 이상의 약학적으로 또는 생리학적으로 허용 가능한 담체, 희석제 또는 부형제와 조합하여 본원에서 기술된 바와 같은 T 세포와 같은 CAR 또는 TCR 발현 세포 집단을 포함할 수 있다. 이러한 조성물은, 중성 완충 식염수, 인산염 완충 식염수 등과 같은 완충제; 포도당, 만노오스, 수크로오스 또는 덱스트란, 만니톨과 같은 탄수화물; 단백질; 글리신; 항산화제와 같은 폴리펩티드 또는 아미노산; EDTA 또는 글루타티온과 같은 킬레이트제; 보조제(예를 들어, 수산화알루미늄); 및 보존제를 포함할 수 있다. 본 개시의 조성물은 바람직하게는 정맥 내 투여용으로 제형화될 수 있다.

약학적 조성물(용액, 현탁액 등)은 다음 중 하나 이상을 포함할 수 있다: 주사용수와 같은 멸균 희석제, 식염수, 링거 용액, 바람직하게는 등장성 염화나트륨과 같은 생리식염수, 용매 또는 현탁 매질로서 작용할 수 있는 합성 모노- 또는 디글리세리드와 같은 고정 오일, 폴리에틸렌 글리콜, 글리세린, 프로필렌 글리콜 또는 다른 용매; 벤질 알코올 또는 메틸 파라벤과 같은 항균제; 아스코르브산 또는 중아황산나트륨과 같은 항산화제; 에틸렌디아민테트라아세트산과 같은 킬레이트제; 아세테이트와 같은 완충제, 시트르산염 또는 인산염, 및 염화 나트륨 또는 덱스트로스와 같은 등장성 조절을 위한 제제. 비경구 제제는 유리 또는 플라스틱으로 만들어진 앰플, 일회용 주사기 또는 다회 투여 바이알에 봉입될 수 있다. 바람직하게는, 주사 가능한 약학적 조성물은 멸균된다.

치료 방법

본 개시는 환자의 질환(예를 들어, 암)을 치료하거나 예방하는 방법을 포함하며, 방법은 CAR 또는 본원에서 개시된 CAR을 포함하는 유전적으로 조작된 면역 세포의 유효량을 이를 필요로 하는 환자에게 투여하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, CAR T 세포 또는 조작된 면역 세포의 유효량은 본 개시에 기술된 방법에 따라 다양한 속성에 대해 분석되었다. 일부 구현예에서, 치료적 사용을 위한 CAR T 세포 의약품은 본 개시에 기술된 방법에 따라 효능 또는 다기능성과 같은 다양한 속성에 대해 분석되었다. 일부 구현예에서, CAR T 세포는 TCR- CAR T 세포이고, 치료적 사용을 위한 CAR T 의약품은 본 개시에 기술된 방법에 따라 잔여 TCR+ CAR T 세포의 양 또는 백분율 및/또는 효능 또는 다기능성과 같은 다양한 속성에 대해 분석되었다.

암을 포함하는 질환 또는 장애를 치료하기 위한 방법이 제공된다. 일부 구현예에서, 본 개시는 대상체에서 T 세포 매개 면역 반응을 생성하는 것에 관한 것으로서, 대상체에게 본 출원의 조작된 면역 세포의 유효량을 투여하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, T 세포 매개 면역 반응은 표적 세포 또는 세포들에 대해 유도된다. 일부 구현예에서, 조작된 면역 세포는 키메라 항원 수용체(CAR)를 포함한다. 일부 구현예에서, 표적 세포는 종양 세포이다. 일부 양태에서, 본 개시는 악성 종양을 치료하거나 예방하기 위한 방법을 포함하며, 상기 방법은 본원에서 기술된 적어도 하나의 단리된 항원 결합 도메인의 유효량을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 일부 양태에서, 본 개시는 악성 종양을 치료하거나 예방하기 위한 방법을 포함하며, 상기 방법은 본원에서 기술된 적어도 하나의 면역 세포의 유효량을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하며, 여기서 면역 세포는 본 명세서에 기술된 바와 같이 적어도 하나의 키메라 항원 수용체, T 세포 수용체 및/또는 분리된 항원 결합 도메인을 포함한다. 본 개시의 면역 세포를 함유하는 CAR은 바이오마커의 비정상적인 발현을 포함하는 악성 종양을 치료하는 데 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 본 개시의 면역 세포를 함유하는 CAR은 소세포 폐암, 흑색종, 저등급 신경교종, 교아세포종, 갑상선 수질암, 카르시노이드, 췌장, 방광 및 전립선의 분산된 신경내분비 종양, 고환암, 및 신경내분비 특징을 갖는 폐 선암종을 치료하는 데 사용될 수 있다. 예시적인 구현예에서, CAR 함유 면역 세포, 예를 들어, 본 개시의 CAR-T 세포는 소세포 폐암을 치료하는 데 사용된다.

또한, 대상체에서 종양의 크기를 감소시키는 방법이 제공되며, 방법은 본 개시의 조작된 세포를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하되, 세포는 항원 결합 도메인을 포함하는 키메라 항원 수용체를 포함하고 종양 상의 항원에 결합한다.

일부 구현예에서, 대상체는 고형 종양, 또는 림프종 또는 백혈병과 같은 혈액 악성 종양을 갖는다. 일부 구현예에서, 조작된 세포는 종양층으로 전달된다. 일부 구현예에서, 암은 대상체의 골수에 존재한다. 일부 구현예에서, 조작된 세포는 자가 면역 세포, 예를 들어, 자가 T 세포이다. 일부 구현예에서, 조작된 세포는 동종 면역 세포, 예를 들어, 동종 T 세포이다. 일부 구현예에서, 조작된 세포는 이종 면역 세포, 예를 들어, 이종 T 세포이다. 일부 구현예에서, 본 출원의 조작된 세포는 생체 내에서 형질감염되거나 형질도입된다. 다른 구현예에서, 조작된 세포는 생체 외에서 형질감염되거나 형질도입된다. 본원에서 사용되는 용어 "시험관 내 세포"는 생체 외에서 배양되는 임의의 세포를 지칭한다.

치료제(예를 들어, 조작된 CAR T 세포)의 "치료적 유효량", "유효 투여량", "유효량", 또는 "치료적 유효 투여량"은, 단독으로 사용되거나 다른 치료제와 병용될 경우, 질환의 발병으로부터 대상체를 보호하거나, 질환 증상의 중증도의 감소, 질환 증상이 없는 기간의 빈도 및 지속 시간의 증가로 입증되는 질환 퇴행을 촉진하거나, 질환으로 인한 장애 또는 손상을 예방하는 임의의 양이다. 질환 퇴행을 촉진하는 치료제의 능력은, 예를 들어, 임상 시험 동안 인간 대상체에서, 인간에서의 효능을 예측하는 동물 모델 시스템에서, 또는 시험관 내 분석에서 제제의 활성을 분석함으로써, 당업자에게 공지된 다양한 방법을 사용하여 평가될 수 있다.

용어 "환자" 및 "대상체"는 상호 교환적으로 사용되며, 인간 및 비인간 동물 대상체뿐만 아니라 공식적으로 진단된 장애를 가진 대상체, 공식적으로 인식된 장애를 갖지 않은 대상체, 의학적 치료를 받는 대상체, 장애를 발달시킬 위험이 있는 대상체 등을 포함한다.

용어 "치료하다" 및 "치료"는 치료적 처치, 예방적 치료, 및 대상체가 장애 또는 다른 위험 인자를 발생시킬 위험을 감소시키는 응용을 포함한다. 치료는 장애의 완전한 치유를 필요로 하지 않으며, 증상 또는 기저 위험 인자를 감소시키는 구현예를 포함한다. 용어 "예방"은 이벤트의 가능성을 100% 제거할 것을 요구하지 않는다. 오히려, 이는 화합물 또는 방법의 존재 시에 이벤트의 발생 가능성이 감소되었음을 나타낸다.

조성물 중 세포의 목적하는 치료량은 일반적으로 적어도 2개의 세포(예를 들어, 적어도 1개의 CD8+ 중심 기억 T 세포 및 적어도 1개의 CD4+ 헬퍼 T 세포 서브세트)이거나, 보다 일반적으로 10²개 세포보다 크고, 최대 10⁶개이며, 최대 10⁸개 또는 10⁹개 세포까지 포함되고, 10¹⁰개 세포를 초과할 수 있다. 세포의 수는 조성물이 의도되는 목적하는 용도, 및 그 안에 포함된 세포의 유형에 따라 달라질 것이다. 목적하는 세포의 밀도는 통상적으로 10⁶ 세포/ml 초과이며, 일반적으로 10⁷ 세포/ml 초과, 일반적으로 10⁸ 세포/ml 이상이다. 임상적으로 관련된 면역 세포의 수는 10⁵, 10⁶, 10⁷, 10⁸, 10⁹, 10¹⁰, 10¹¹, 또는 10¹²개의 세포와 누적적으로 동일하거나 이를 초과하는 다수의 주입으로 배분될 수 있다. 본 개시의 일부 양태에서, 특히 주입된 모든 세포가 특정 표적 항원으로 리디렉팅될 것이므로, 10⁶/킬로그램(환자당 10⁶ 내지 10¹¹개) 범위의 더 적은 수의 세포가 투여될 수 있다. CAR 치료는 이들 범위 내의 투여량으로 여러 번 투여될 수 있다. 세포는 치료를 받는 환자에 대해 자가, 동종, 또는 이종일 수 있다.

일부 구현예에서, CAR T 세포의 치료적 유효량은, 약 1 X 10⁵ 세포/kg, 약 2 X 10⁵ 세포/kg, 약 3 X 10⁵ 세포/kg, 약 4 X 10⁵ 세포/kg, 약 5 X 10⁵ 세포/kg, 약 6 X 10⁵ 세포/kg, 약 7 X 10⁵ 세포/kg, 약 8 X 10⁵ 세포/kg, 약 9 X 10⁵ 세포/kg, 2 X 10⁶ 세포/kg, 약 3 X 10⁶ 세포/kg, 약 4 X 10⁶ 세포/kg, 약 5 X 10⁶ 세포/kg, 약 6 X 10⁶ 세포/kg, 약 7 X 10⁶ 세포/kg, 약 8 X 10⁶ 세포/kg, 약 9 X 10⁶ 세포/kg, 약 1 X 10⁷ 세포/kg, 약 2 X 10⁷ 세포/kg, 약 3 X 10⁷ 세포/kg, 약 4 X 10⁷ 세포/kg, 약 5 X 10⁷ 세포/kg, 약 6 X 10⁷ 세포/kg, 약 7 X 10⁷ 세포/kg, 약 8 X 10⁷ 세포/kg, 또는 약 9 X 10⁷ 세포/kg이다.

일부 구현예에서, CAR+/CAR-T+/TCR+ 세포에 대한 표적 투여량은 1Х10⁶ 내지 2Х10⁸ 세포/kg의 범위, 예를 들어 2Х10⁶ 세포/kg이다. 이러한 범위의 초과 및 미만의 투여량이 특정 대상체에게 적절할 수 있고, 필요에 따라 의료 제공자에 의해 적절한 투여량 레벨이 결정될 수 있음을 이해할 것이다. 또한, 본 개시에 따라 세포의 다중 투여량이 제공될 수 있다.

일부 양태에서, 본 개시는 본원에 기술된 바와 같은 적어도 하나의 항원 결합 도메인을 포함하는 약학적 조성물 및 약학적으로 허용 가능한 부형제를 포함한다. 일부 구현예에서, 약학적 조성물은 추가적인 활성제를 더 포함한다.

본 개시의 CAR 발현 세포 집단은 단독으로 투여되거나, 희석제 및/또는 IL-2 또는 다른 사이토카인 또는 세포 집단과 같은 다른 성분과 조합하여 약학적 조성물로서 투여될 수 있다. 본 개시의 약학적 조성물은, 하나 이상의 약학적으로 또는 생리학적으로 허용 가능한 담체, 희석제 또는 부형제와 조합하여 본원에서 기술된 바와 같은 T 세포와 같은 CAR 또는 TCR 발현 세포 집단을 포함할 수 있다. 이러한 조성물은, 중성 완충 식염수, 인산염 완충 식염수 등과 같은 완충제; 포도당, 만노오스, 수크로오스 또는 덱스트란, 만니톨과 같은 탄수화물; 단백질; 글리신; 항산화제와 같은 폴리펩티드 또는 아미노산; EDTA 또는 글루타티온과 같은 킬레이트제; 보조제(예를 들어, 수산화알루미늄); 및 보존제를 포함할 수 있다. 본 개시의 조성물은 바람직하게는 정맥 내 투여용으로 제형화될 수 있다.

약학적 조성물(용액, 현탁액 등)은 다음 중 하나 이상을 포함할 수 있다: 주사용수와 같은 멸균 희석제, 식염수, 링거 용액, 바람직하게는 등장성 염화나트륨과 같은 생리식염수, 용매 또는 현탁 매질로서 작용할 수 있는 합성 모노- 또는 디글리세리드와 같은 고정 오일, 폴리에틸렌 글리콜, 글리세린, 프로필렌 글리콜 또는 다른 용매; 벤질 알코올 또는 메틸 파라벤과 같은 항균제; 아스코르브산 또는 중아황산나트륨과 같은 항산화제; 에틸렌디아민테트라아세트산과 같은 킬레이트제; 아세테이트와 같은 완충제, 시트르산염 또는 인산염, 및 염화 나트륨 또는 덱스트로스와 같은 등장성 조절을 위한 제제. 비경구 제제는 유리 또는 플라스틱으로 만들어진 앰플, 일회용 주사기 또는 다회 투여 바이알에 봉입될 수 있다. 바람직하게는, 주사 가능한 약학적 조성물은 멸균된다.

일부 구현예에서, 환자에게 투여 시, 본원에서 기술된 항원-특이적 CAR 중 어느 하나를 세포 표면에서 발현하는 조작된 면역 세포는 환자의 내인성 항원-발현 세포를 감소, 사멸 또는 용해시킬 수 있다. 일 구현예에서, 본원에서 기술된 항원-특이적 CAR 중 어느 하나를 발현하는 조작된 면역 세포에 의해 항원을 발현하는 세포주의 항원-발현 내인성 세포 또는 세포의 감소 또는 용해 백분율은 약 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95% 이상 또는 초과이다. 일 구현예에서, 항원-특이적 CAR을 발현하는 조작된 면역 세포에 의해 항원을 발현하는 세포주의 항원-발현 내인성 세포 또는 세포의 감소 또는 용해 백분율은 약 5% 내지 약 95%, 약 10% 내지 약 95%, 약 10% 내지 약 90%, 약 10% 내지 약 80%, 약 10% 내지 약 70%, 약 10% 내지 약 60%, 약 10% 내지 약 50%, 약 10% 내지 약 40%, 약 20% 내지 약 90%, 약 20% 내지 약 80%, 약 20% 내지 약 70%, 약 20% 내지 약 60%, 약 20% 내지 약 50%, 약 25% 내지 약 75%, 또는 약 25% 내지 약 60%이다. 일 구현예에서, 내인성 항원-발현 세포는 내인성 항원-발현 골수 세포이다.

일 구현예에서, 본 개시의 항원-특이적 CAR을 세포 표면 막에서 발현하는 조작된 면역 세포에 의해 항원을 발현하는 표적 세포, 예를 들어, 세포주의 감소 또는 용해 백분율은 본원에서 개시된 분석을 사용하여 측정될 수 있다.

방법은 하나 이상의 화학요법제를 투여하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 화학요법제는 림프고갈(전처치) 화학요법제이다. 예를 들어, T 세포 요법을 필요로 하는 환자를 조절하는 방법은 환자에게 시클로포스파미드의 특정 유용한 투여량(200 mg/m²/일 내지 2000 mg/m²/일, 약 100 mg/m²/일 내지 2000 mg/m²/일; 예를 들어, 약 100 mg/m²/일, 약 200 mg/m²/일, 약 300 mg/m²/일, 약 400 mg/m²/일, 약 500 mg/m²/일, 약 600 mg/m²/일, 약 700 mg/m²/일, 약 800 mg/m²/일, 약 900 mg/m²/일, 약 1000 mg/m²/일, 약 1500 mg/m²/일, 또는 약 2000 mg/m²/일) 및 플루다라빈의 특정 투여량(20 mg/m²/일 내지 900 mg/m²/일, 약 10 mg/m²/일 내지 약 900 mg/m²/일; 예를 들어, 약 10 mg/m²/일, 약 20 mg/m²/일, 약 30 mg/m²/일, 약 40 mg/m²/일, 약 40 mg/m²/일, 약 50 mg/m²/일, 약 60 mg/m²/일, 약 70 mg/m²/일, 약 80 mg/m²/일, 약 90 mg/m²/일, 약 100 mg/m²/일, 약 500 mg/m²/일, 또는 약 900 mg/m²/일)을 투여하는 단계를 포함한다. 바람직한 투여량 처방은 환자를 치료하는 단계를 포함하며, 조작된 T 세포의 치료적 유효량을 환자에게 투여하는 단계 이전에 약 300 mg/m²/일의 시클로포스파미드 및 약 30 mg/m²/일의 플루다라빈을 환자에게 3일 동안 매일 투여하는 단계를 포함한다.

일부 구현예에서, 림프고갈은 CD52 항체의 투여를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, CD52 항체는 알렘투주맙이다. 일부 구현예에서, CD52 항체는 약 13 mg/일 IV의 투여량으로 투여된다.

다른 구현예에서, 항원 결합 도메인, 형질도입된(또는 달리 조작된) 세포 및 화학요법제는 대상체에서 질환 또는 병태를 치료하기에 효과적인 양으로 각각 투여된다.

일부 구현예에서, 본원에서 개시된 CAR-발현 면역 효과기 세포를 포함하는 조성물은 임의의 순서로 투여될 수 있는 임의의 수의 화학요법제와 함께 투여될 수 있다. 화학요법제의 예는, 티오테파 및 시클로포스파미드(CYTOXAN??)와 같은 알킬화제; 부술판, 임프로술판 및 피포술판과 같은 알킬 술포네이트; 벤조도파, 카보쿠온, 메투레도파 및 우레도파와 같은 아지리딘; 알트레타민, 트리에틸렌멜라민, 트리에틸렌포스포르아미드, 트리에틸렌티오포스파오르아미드 및 트리메틸올로멜라민 계를 포함하는 에틸렌이민 및 메틸아멜라민; 클로람부실, 클로르나파진, 콜로포스파미드, 에스트라무스틴, 이포스파미드, 메클로레타민, 메클로레타민 옥사이드 염화물, 멜팔란, 노벰비친, 페네스테린, 프레드니무스틴, 트로포스파미드, 우라실 머스타드와 같은 질소 머스타드; 카르무스틴, 클로로조토신, 포테무스틴, 로무스틴, 니무스틴, 라니무스틴과 같은 니트로우레아; 아클라시노마이신, 악티노마이신, 아우트라마이신, 아자세린, 블레오마이신, 칵티노마이신, 칼리케아미신, 카라비신, 카미노마이신, 카지노필린, 크로모마이신, 닥티노마이신, 다우노루비신, 데토루비신, 6-디아조-5-옥소-L-노르류신 , 독소루비신, 에피루비신, 에소루비신, 이다루비신, 마르셀로마이신, 미토마이신, 미코페놀산, 노갈라마이신, 올리보마이신, 페플로마이신, 포트피로마이신, 퓨로마이신, 퀘라마이신, 로도루비신, 스트렙토니그린, 스트렙토조신, 투베르시딘, 우베니멕스, 지노스타틴, 조루비신과 같은 항생제; 메토트렉세이트 및 5-플루오로우라실(5-FU)과 같은 항대사물질; 데놉테린, 메토트렉세이트, 프테롭테린, 트리메트렉세이트와 같은 엽산 유사체; 플루다라빈, 6-메르캅토퓨린, 티아미프린, 티오구아닌과 같은 퓨린 유사체; 안시타빈, 아자시티딘, 6-아자우리딘, 카르모푸르, 시타라빈, 디데옥시우리딘, 독시플루리딘, 에노시타빈, 플록수리딘, 5-FU와 같은 피리미딘 유사체; 칼루스테론, 드로모스타놀론 프로피오네이트, 에피티오스타놀, 메피티오스탄, 테스토락톤과 같은 안드로겐; 아미노글루테티미드, 미토탄, 트리로스탄과 같은 항-부신제; 프롤린산과 같은 엽산 보충제; 아세글라톤; 알도포스파미드 글리코시드; 아미노레불린산; 암사크린; 베스트라부실; 비산트렌; 에다트락세이트; 데포파민; 데메콜신; 디아지쿠온; 엘포르미틴; 엘립티늄 아세테이트; 에토글루시드; 질산갈륨; 히드록시우레아; 렌티난; 로니다민; 미토구아존; 미톡산트론; 모피다몰; 니트라크린; 펜토스타틴; 페나멧; 피라루비신; 포도필린산; 2-에틸히드라지드; 프로카바진; PSK®; 라족산; 시조피란; 스피로게르마늄; 테누아존산; 트리아지쿠온; 2,2’,2”-트리클로로트리에틸아민; 우레탄; 빈데신; 다카르바진; 만노무스틴; 미토브로니톨; 미톨락톨; 피포브로만; 가시토신; 아라비노시드("Ara-C"); 시클로포스파미드; 티오테파; 탁소이드(예를 들어, 파클리탁셀(TAXOL??, Bristol-Myers Squibb) 및 독세탁셀(TAXOTERE®, Rhone-Poulenc Rorer)); 클로람부실; 젬시타빈; 6-티오구아닌; 메르캅토퓨린; 메토트렉세이트; 시스플라틴 및 카보플라틴과 같은 백금 유사체; 빈블라스틴; 백금; 에토포사이드(VP-16); 이포스파미드; 미토마이신 C; 미톡산트론; 빈크리스틴; 비노렐빈; 나벨빈; 노반트론; 테니포사이드; 다우노마이신; 아미노프테린; 젤로다; 이반드로네이트; CPT-11; 토포이소머라제 억제제 RF S2000; 디플루오로메틸오미틴(DMFO); Targretin??(벡사로텐), Panretin??, (알리트레티노인)과 같은 레티노산 유도체; ONTAK??(데닐류킨 디프티톡스); 에스페라미신; 카페시타빈; 및 전술한 것들 중 임의의 것의 약학적으로 허용 가능한 염, 산 또는 유도체를 포함한다. 또한, 본 정의에는, 예를 들어, 타목시펜, 랄록시펜, 아로마타제 억제 4(5)-이미다졸, 4-히드록시타목시펜, 트리옥시펜, 케옥시펜, LY117018, 오나프리스톤, 및 토레미펜(Fareston)을 포함하는 항-에스트로겐; 및 플루타미드, 닐루타미드, 비칼루타미드, 류프롤리드 및 고세렐린과 같은 항-안드로겐; 및 전술한 것들 중 임의의 것의 약학적으로 허용 가능한 염, 산 또는 유도체와 같은, 종양에 대한 호르몬 작용을 조절하거나 억제하는 작용을 하는 항-호르몬제가 포함된다. 적절한 경우, CHOP(즉, 시클로포스파미드(Cytoxan®)), 독소루비신(히드록시독소루비신), 빈크리스틴(Oncovin®), 및 프레드니손을 포함하되 이에 한정되지 않는 화학요법제의 조합이 또한 투여된다.

일부 구현예에서, 화학요법제는 조작된 세포, 폴리펩티드, 또는 핵산의 투여와 동시에 투여되거나 투여 후 1주일 이내에 투여된다. 다른 구현예에서, 화학요법제는 조작된 세포, 폴리펩티드 또는 핵산의 투여 후 1 내지 4주 또는 1주 내지 1개월, 1주 내지 2개월, 1주 내지 3개월, 1주 내지 6개월, 1주 내지 9개월, 또는 1주 내지 12개월에 투여된다. 다른 구현예에서, 화학요법제는 세포, 폴리펩티드 또는 핵산을 투여하기 적어도 1개월 전에 투여된다. 일부 구현예에서, 방법은 2개 이상의 화학요법제를 투여하는 단계를 추가로 포함한다.

다양한 추가적인 치료제가 본원에서 기술된 조성물과 함께 사용될 수 있다. 예를 들어, 잠재적으로 유용한 추가 치료제는 니볼루맙(Opdivo®), 펨브롤리주맙(Keytruda®), 펨브롤리주맙, 피딜리주맙, 및 아테졸리주맙(Tcentriq®)과 같은 PD-1 억제제를 포함한다.

본 개시와 조합하여 사용하기에 적합한 추가 치료제는, 이브루티닙(Imbruvica®), 오파투무맙(Arzerra®, 리툭시맙(Rituxan®), 베바시주맙(Avastin®), 트라스투주맙(Herceptin®), 트라스투주맙 엠탄신(KADCYLA®), 이마티닙(Gleevec®), 세툭시맙(Erbitux®, 파니투무맙)(Vectibix®), 카투막소맙, 이브리투모맙, 오파투무맙, 토시투모맙, 브렌툭시맙, 알렘투주맙, 겜투주맙, 엘로티닙, 게피티닙, 반데타닙, 아파티닙, 라파티닙, 네라티닙, 엑시티닙, 마시티닙, 파조파닙, 수니티닙, 소라페닙, 토세라닙, 레스타우르티닙, 엑시티닙, 세디라닙, 렌티바티닙, 닌테다닙, 파조파닙, 레고라페닙, 세막사닙, 소라페닙, 수니티닙, 티보자닙, 토세라닙, 반데타닙, 엔트렉티닙, 카보잔티닙, 이마티닙, 다사티닙, 닐로티닙, 포나티닙, 라도티닙, 보수티닙, 레스타우르티닙, 룩소리티닙, 파크리티닙, 코비메티닙, 셀루메티닙, 트라메티닙, 비니메티닙, 알렉티닙, 세리티닙, 크리조티닙, 애플리버셉트, 아디포티드, 데닐류킨 디프티톡스, 에베롤리무스 및 템시로리무스와 같은 mTOR 억제제, 소니데깁 및 비스모데깁과 같은 고슴도치 억제제, CDK 억제제(팔보시클립)와 같은 CDK 억제제를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.

일부 구현예에서, CAR 함유 면역 세포를 포함하는 조성물은 사이토카인 방출 증후군(CRS) 또는 신경독성을 예방하기 위한 치료 요법과 함께 투여될 수 있다. 사이토카인 방출 증후군(CRS) 또는 신경독성을 예방하기 위한 치료 요법은 렌질루맙, 토실리주맙, 심방 나트륨이뇨 펩티드(ANP), 아나킨라, iNOS 억제제(예를 들어, L-NIL 또는 1400W)를 포함할 수 있다. 추가의 구현예에서, CAR-함유 면역 세포를 포함하는 조성물은 항염증제와 함께 투여될 수 있다. 항염증제 또는 약물은 스테로이드 및 글루코코르티코이드(베타메타손, 부데소니드, 덱사메타손, 히드로코르티손 아세테이트, 히드로코르티손, 히드로코르티손, 메틸프레드니솔론, 프레드니솔론, 프레드니손, 트리암시놀론을 포함함), 아스피린, 이부프로펜, 나프록센, 메토트렉세이트, 술파살라진, 레플루노미드, 항-TNF 약물, 시클로포스파미드 및 미코페놀레이트를 포함하는 비스테로이드성 항염증제(NSAIDS)를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 예시적인 NSAID는 이부프로펜, 나프록센, 나프록센 나트륨, Cox-2 억제제, 및 시알레이트를 포함한다. 예시적인 진통제는 프로포르시펜 염산염의 아세트아미노펜, 옥시코돈, 트라마돌을 포함한다. 예시적인 글루코코르티코이드는 코르티손, 덱사메타손, 히드로코르티손, 메틸프레드니솔론, 프레드니솔론, 또는 프레드니손을 포함한다. 예시적인 생물학적 반응 조절제는 세포 표면 마커(예를 들어, CD4, CD5 등), TNF 길항제(예를 들어, 에타너셉트(ENBREL®), 아달리무맙(HUMIRA®) 및 인플릭시맙(REMICADE®))와 같은 사이토카인 억제제, 케모카인 억제제 및 접착 분자 억제제에 대해 유도되는 분자를 포함한다. 생물학적 반응 조절제는 단클론 항체뿐만 아니라 분자의 재조합 형태 또한 포함한다. 예시적인 DMARD는 아자티오프린, 시클로포스파미드, 시클로스포린, 메토트렉세이트, 페니실라민, 레플루노미드, 술파살라진, 히드록시클로로퀸, 금(경구(아우라노핀) 및 근육내) 및 미노시클린을 포함한다.

특정 구현예에서, 본원에서 기술된 조성물은 사이토카인과 함께 투여된다. 사이토카인의 예는 림포카인, 모노카인, 및 통상적인 폴리펩티드 호르몬이다. 사이토카인은, 인간 성장 호르몬, N-메티오닐 인간 성장 호르몬, 및 소 성장 호르몬과 같은 성장 호르몬; 부갑상선 호르몬; 티록신; 인슐린; 프로인슐린; 릴랙신; 프로렐락신; 난포 자극 호르몬(FSH), 갑상선 자극 호르몬(TSH), 및 황체형성 호르몬(LH)과 같은 당단백질 호르몬; 간 성장 인자(HGF); 섬유아세포 성장 인자(FGF); 프로락틴; 태반 락토겐; 뮐러관-억제 물질; 마우스 성선 자극 호르몬-연관 펩티드; 인히빈; 액티빈; 혈관 내피 성장 인자; 인테그린; 트롬보포이에틴(TPO); NGF-베타와 같은 신경 성장 인자(NGF); 혈소판 성장 인자; TGF-알파 및 TGF-베타와 같은 형질전환 성장 인자(TGF); 인슐린-유사 성장 인자 I 및 II; 에리트로포이에틴(EPO); 골유도 인자; 인터페론-알파, 베타, 및 감마와 같은 인터페론, 대식세포-CSF(M-CSF)와 같은 콜로니 자극 인자(CSF); 과립구-대식세포-CSF(GM-CSF); 및 과립구-CSF(G-CSF); IL-1, IL-1 알파, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12; IL-15, IL-21와 같은 인터루킨(IL); TNF-알파 또는 TNF-베타와 같은 종양 괴사 인자; 및 LIF 및 키트 리간드(KL)를 포함하는 다른 폴리펩티드 인자를 포함한다. 본원에서 사용되는 용어 사이토카인은 천연 공급원 또는 재조합 세포 배양으로부터의 단백질, 및 천연 서열 사이토카인의 생물학적으로 활성인 등가물을 포함한다.

다음의 예는 단지 예시를 위한 것이다. 실제로, 본원에 도시되고 설명된 것들에 더하여 본 발명의 다양한 변형은 전술한 설명으로부터 당업자에게 명백해질 것이다.

실시예

실시예 1 의약품 품질에 영향을 미치는 요인 식별

현장에서의 일반적인 합의는 제형화된 세포가 제형화 및 기타 스트레스 조건을 함유하는 동결보존제에 노출되는 시간을 최소화하기 위해 가능한 한 짧은 시간 내에 의약품을 완성하는 것이었다. 시간 제한은 제조 프로세스, 특히 동종 CAR T 의약품의 경우 제약을 추가한다. 제조 프로세스는 배치당 많은 수의 투여량을 생산하도록 설계되어 더 긴 의약품 처리 시간이 필요할 수 있다.

의약품 프로세스 동안 CAR T 세포에 영향을 미칠 수 있는 인자를 식별하기 위해 프로세스 개발 연구를 수행하였다. 도 1은 세포의 수확에서부터 의약품을 충진, 의약품을 동결시키는 것까지의 예시적인 워크플로우를 보여준다. 간략하게, CAR T 세포와 같은 조작된 세포를 비-DMSO 함유 기본 배지에 재현탁시켰다. 충진 프로세스를 시작하기 전에, 동일한 부피의 DMSO 함유 제형과 세포 현탁액을 최종 농도의 DMSO까지 5%까지 혼합하였다. 아래에 제시된 데이터는 예시적인 CD19 CAR T 세포를 사용하여 수득하였다.

충진 프로세스 동안, 동결 전 제형화된 CD19 CAR T 세포를 혼합하여 세포를 현탁 상태로 유지하고 생성물 균질성 및 투여량 균일성을 보장하였다. 달리 명시되지 않는 한, 세포를 오비탈 쉐이커 상에서 엘렌마이어 플라스크를 사용하여 혼합하였다. 혼합 속도는 85 rpm 내지 140 rpm 범위의 플라스크 내 제형화 부피에 따라 달라졌다. 세포 생존률에 대한 영향을 최소화하면서 충분한 혼합을 보장하기 위해 쉐이커 플라스크 혼합에서 다음 실험을 위해 더 낮은 범위의 속도를 채택하였다.

생존 세포 밀도(VCD) 및 세포 생존률은 혼합이 세포에 미치는 영향을 결정하기 위해 형광 염료 기반 방법 및 세포 이미저 NucleoCounter® NC-200^TM을 사용하여 측정되었다. NucleoCounter^®를 사용하여Via1-Cassette^TM에 미리 로딩된 2개의 형광 염료를 사용해 핵을 검출함으로써 세포를 계수하였다: 아크리딘 오렌지(AO)는 모든 세포를 녹색으로 염색하는 반면, DAPI(4',6-디아미디노-2-페닐인돌)는 죽은 세포를 청색으로 염색한다. 생존 세포 밀도(VCD)를 (총 세포 - 사멸 세포)/ml로서 계산하였고, 세포 생존률 %를 (총 세포 - 사멸 세포)/총 세포 x100으로서 계산하였다. 오비탈 쉐이커 혼합은 VCD에 영향을 미치는 것으로 밝혀졌다(도 2a) 및 세포의 생존률 %(도 2b)를 참고하고, 추가 혼합 없이 실온에서 5시간 동안 유지하였다.

쉐이커 플라스크를 혼합하는 동안 제형 유지 온도의 영향도 시험하였다. 데이터는, 쉐이커 플라스크 혼합 동안 제형화된 세포를 5℃에서 유지하는 것이, VCD 및 세포 생존률(%) 을 조사했을 때 쉐이커 플라스크 혼합 동안 실온에서 생성물을 유지하는 것보다 더 양호함을 보여준다(각각 도 3a 및 3b).

쉐이커 플라스크 혼합 최적화의 일부로서, 세포 침전 연구를 수행하여 연속 혼합에 대한 필요성을 평가하였다. 엘렌마이어 플라스크에서 20E +06 생존 세포/mL 및 100E +06 생존 세포/mL로 제형화된 세포를 사용해 세포 침전 연구를 수행하였다. 플라스크 내의 제형을 혼합하지 않고 일정 기간에 걸쳐 플라스크의 상단 및 하단에서 샘플링하였다. 결과는 시험된 두 세포 농도에 대해 적어도 40분 동안 세포 침전이 일어나지 않았음을 보여준다(도 4a~4b 참조).

세포 침전 데이터는 최종 제형화에서 세포가 즉시 침전되지 않기 때문에 제형화된 세포가 연속적으로 혼합될 필요가 없음을 나타낸다. 특이적 메커니즘에 구속되고자 함이 없이, 세포의 지연된 침전은 세포의 크기 및/또는 최종 형성의 더 높은 점도로 인한 것일 수 있다. 이러한 소견으로 인해 간헐적인 오비탈 쉐이커 플라스크 혼합을 평가하였다. 또한, 스피너 플라스크, 예를 들어 자기 교반 플레이트를 사용하는 상이한 유형의 혼합을 또한 평가하였다. 최종 제형에서 세포(예를 들어, 40 rpm)의 연속 스피너 플라스크 혼합 및 간헐적인 오비탈 쉐이커 혼합(예를 들어, 85 rpm의 속도로 10분 또는 30분마다 2분씩 혼합함) 모두는 85 rpm에서 연속 오비탈 쉐이커 혼합과 비교하여 시간 경과에 따라 더 양호한 생존 세포 밀도(도 5a) 및 세포 생존율(%) (도 5b)를 나타냈다.

쉐이커 플라스크 혼합은, 제형화된 세포를, 예를 들어, 설정 속도로 오비탈 쉐이커 플랫폼 상에, 엘렌마이어 쉐이커 플라스크와 같은 쉐이커 플라스크에 배치함으로써 달성된다. 패들과 같은 플라스크 내에서 움직이는 부품이 없으므로, 플라스크 내의 세포와 직접 접촉하면 잠재적으로 세포가 손상될 수 있다. 한편, 예를 들어, 세포와 수직 접촉하는 자기 교반 막대에 연결된 상부 장착 패들이 구비된 스피너 플라스크는 패들에서의 전단력으로 인해 세포에 영향을 미치는 것으로 여겨졌다. 따라서, 쉐이커 플라스크 혼합은 전단 응력을 덜 생성하고 세포에 대해 더 부드러운 것으로 추정되었다. 그러나, 도 5a 및 도 5b에 도시된 바와 같이, 스피너 플라스크에서 연속 쉐이킹한 후의 VCD 및 세포 생존률(%)은 둘 다 오비탈 쉐이커 플라스크에서 연속 쉐이킹한 것보다 상당히 양호하다. 또한, 쉐이커 플라스크를 사용하여 충진 프로세스를 수행했을 때, 간헐적인 쉐이킹의 결과는 연속적 쉐이킹보다 우수하다.

다음으로, 스피너 플라스크에서 간헐적인 쉐이킹(10분마다 40 rpm으로 2분 동안 혼합함)을 스피너 플라스크에서 연속 혼합하는 것과 비교하여 추가로 평가하였다(40 rpm). 도 5c의 결과는 스피너 플라스크에서 간헐적 혼합 및 연속 혼합의 결과가 유사하다는 것을 보여준다.

요약하면, 예기치 않게 의약품 프로세스 중에 세포 손상을 초래할 수 있는 DMSO 노출 시간(일반적으로 현장에서 생각하는 바와 같음)뿐만 아니라, 다른 처리 조건(예: 작동 온도, 혼합 방법)도 세포에 상당한 영향을 미칠 수 있음을 발견하였다. 예를 들어, 더 낮은 온도는 충진 프로세스 동안 실온 노출과 비교하여 세포 생존 능력을 개선하는 데 도움을 줄 수 있다. 또한, 데이터는 5% DMSO를 갖는 최종 제형에서의 세포 침전이 느린 프로세스임을 보여준다. 따라서, 충진 프로세스 동안 셀의 연속적인 혼합은 일반적으로 현장에서 생각되는 것과 대조적으로 필요하지 않을 수 있다. 혼합 시간 이외에, 놀랍게도 충진 프로세스 동안 사용된 혼합 유형이 상당한 효과를 미친다는 것도 밝혀졌다. 여기에 제시된 데이터는 스피너 플라스크 혼합이 연속 쉐이커 플라스크 혼합에 비해 상당히 높은 생존 세포를 초래하였음을 보여준다.

실시예 2 의약품 충진 시간 허용범위를 증가시키기 위한 프로세스 설계

상기 데이터는 세포 능력에 부정적인 영향을 미치지 않으면서 충진-완료 시간 허용범위를 증가시키는 것이 가능하다는 것을 시사한다. 다음 실험에서, 2시간, 4시간 또는 6시간 충진 프로세스 동안 상이한 혼합 조건 하에서 동결 전 CAR T 세포의 VCD 및 세포 생존률(%)을 조사하였다 (도 6). 각각의 충진 프로세스를 거친 세포를 동결시키고, 해동 후 세포에 대한 혼합 프로세스의 임의의 장기 효과도 조사하였다. 동결된 세포의 분취물을 해동하고, 실온에서 2시간 동안 유지시키고, VCD 및 세포 생존률(%) 을 도 6에 도시된 바와 같이 결정하였다. 도 6의 결과는, 예로서 동결 전 또는 해동 후 의약품을 사용하여, 쉐이커 플라스크에서의 연속 혼합 또는 쉐이커 플라스크에서의 간헐적 혼합이 쉐이커 플라스크에서의 연속 혼합보다 더 잘 수행되었음을 보여준다. VCD와 생존률은 충진 프로세스를 4시간을 거치더라도 크게 영향을 받지 않았다. 별도의 실험에서, 해동 후 조작된 CAR T 세포를 3일 동안 배양하여 세포가 생존 가능하고, 의약품 프로세스 및 동결 후 회복 및 확장될 수 있음을 확인하였다(데이터 미도시).

일반적으로 쉐이커 플라스크가 전단 응력의 관점에서 세포에 대해 더 부드러운 것으로 여겨지지만, 스피너 플라스크를 혼합하는 것이 충진 프로세스에서 쉐이커 플라스크를 혼합하는 것을 능가한다는 것을 발견하였다. 다음으로, 스피너 플라스크 혼합을 사용하여 혼합 속도가 동결 전 의약품에 미치는 효과를 조사하였다. 도 7a에 도시된 바와 같이, 스피너 플라스크 혼합 중 40~80 rpm의 혼합 속도는 4시간의 과정에서 의약품에 유의한 영향을 미치지 않았다. 스피너 플라스크에서 혼합된 세포에 미치는 영향이 제형화된 세포의 부피에 의해 영향을 받는지 여부를 추가로 조사하였다. 도 7b에 도시된 바와 같이, 50 rpm에서 연속 스피너 플라스크로 혼합한 300 ml 또는 600 ml 의약품의 시작 부피의 VCD 및 생존률(%)은 4시간 과정 동안 유사하다.

요약하면, 본원에 개시된 데이터는 간헐적 쉐이커 플라스크 혼합이 연속 쉐이커 플라스크 혼합을 능가함을 보여준다. 또한, 연속 혼합 또는 간헐적 혼합 중 어느 하나에서, 쉐이커 플라스크에서 스피너 플라스크로의 전환은, 특히 장기간에 걸쳐 연속 쉐이커 플라스크 혼합과 비교하여 개선된 VCD 및 세포 생존률을 나타냈다.

실시예 3 제품 품질 분석

의약품 프로세스 후, 충진된 바이알 또는 용기를 동결 보관하였다. 다음으로, 상이한 혼합/충진 프로세스에 의해 처리된 사후 해동된 의약품을 분석하여 사후 해동된 제형화 세포가 생존률을 유지하는지 여부를 결정하였다. 도 8A는, 스피너 플라스크에서 40 rpm으로 연속 혼합하거나 쉐이커 플라스크에서 2분 동안 30분마다 85 rpm으로 간헐적으로 혼합하는 것이 유사한 결과를 생성하였으며, 4시간의 과정에서 동결 전 의약품의 세포 생존 밀도 또는 생존률(%)에 유의한 영향을 미치지 않았음을 보여준다. 충진된 샘플은 추가 시험을 위해 세포를 해동하기 전에 2시간 또는 4시간 동안 보관하기 위해 동결되었다.

해동된 샘플을 2시간 동안 실온 유지시킨 후, 해동된 의약품이 환자에게 투여될 준비가 되기 전에 병원에서 필요할 수 있는 예상된 프로세스 시간을 고려하여 VCD 및 생존률(%)이 결정되었다. 도 8B는 해동 후 세포의 VCD 및 생존율이 이들 조건 하에서 동결 전 세포의 생존율과 유사함을 보여준다.

요약하면, 스피너 플라스크에서 연속 혼합하거나 쉐이커 플라스크 또는 스피너 플라스크에서 간헐적으로 쉐이킹하면 VCD 또는 세포 생존률에 영향을 미치지 않으면서 충진-완료 시간 허용범위를 적어도 4시간으로 연장할 수 있다. 연장된 충진-완료 시간 허용범위는 CAR T 세포를 포함하여, 제조되고 제형화된 조작된 면역 세포의 대규모 배치의 충진을 완료하는 데 더 많은 시간을 허용하고, 충진되지 않은 의약품의 낭비를 피할 것이다.

Claims (22)

1. 조작된 면역 세포를 포함하는 의약품을 제조하는 프로세스로서, 상기 방법은, 의약품을 형성하기 위해 동결보존제를 함유하는 조성물에서 조작된 면역 세포를 제형화하는 단계, 및 상기 의약품을 하나 이상의 용기에 혼합하고 충진하는 단계를 포함하되, 상기 의약품은 균질성을 유지하는, 프로세스.
2. 제1항에 있어서, 상기 혼합 및 충진 단계는 적어도 약 2시간이 걸리는, 프로세스.
3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 혼합 및 충진 단계는 약 2시간, 약 3시간, 약 4시간, 약 5시간 또는 약 6시간이 걸리는, 프로세스.
4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 혼합은 간헐적 혼합 또는 연속 혼합을 포함하는, 프로세스.
5. 제4항에 있어서, 상기 간헐적 혼합은 쉐이커 플라스크 내에서 이루어지는, 프로세스.
6. 제4항에 있어서, 간헐적 혼합은 스피너 플라스크 내에서 이루어지는, 프로세스.
7. 제4항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 간헐적 혼합은 약 1 내지 약 3분, 약 10 내지 약 40분마다 혼합하는 것을 포함하는, 프로세스.
8. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 혼합은 스피너 플라스크에서의 연속 혼합을 포함하는, 프로세스.
9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 혼합 및 충진 단계는 약 4℃ 에서 이루어지는, 프로세스.
10. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 혼합 및 충진 단계는 실온에서 이루어지는, 프로세스.
11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 혼합 속도는 약 30 내지 약 85 rpm인, 프로세스.
12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 동결보존제는 DMSO 또는 글리세롤을 포함하는, 프로세스.
13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 동결보존제는 약 3% DMSO 내지 약 10% DMSO를 포함하는, 프로세스.
14. 제13항에 있어서, 상기 동결보존제는 약 5% DMSO를 포함하는, 프로세스.
15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 점도를 향상시키는 부형제를 더 포함하는, 프로세스.
16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조작된 면역 세포는 T 세포, 염증성 T 림프구, 세포독성 T 림프구, 조절 T 림프구, 헬퍼 T 림프구, 효과기 T 림프구, 종양 침윤 림프구(TIL), NK 세포, NK-T 세포, TCR 발현 세포, TCR 녹아웃 T 세포, 수지상 세포, 대식세포, 살해 수지상 세포, 비만 세포, 또는 B 세포인, 프로세스.
17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조작된 면역 세포는 CAR T 세포인, 프로세스.
18. 제17항에 있어서, 상기 조작된 면역 세포는 동종 T 세포인, 프로세스.
19. 제17항에 있어서, 상기 조작된 면역 세포는 자가 CAR T 세포인, 프로세스.
20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조작된 면역 세포는 인간 세포인, 프로세스.
21. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항의 프로세스에 의해 제조된 조작된 면역 세포를 포함하는, 의약품.
22. 치료를 필요로 하는 대상체를 치료하는 방법으로서, 제21항의 의약품을 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.