CN117264903A - 一种促进car-t细胞的扩增和抗肿瘤能力的细胞外囊泡及制备方法和应用 - Google Patents

一种促进car-t细胞的扩增和抗肿瘤能力的细胞外囊泡及制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本申请涉及生物技术领域，尤其涉及一种促进CAR‑T细胞的扩增和抗肿瘤能力的细胞外囊泡及制备方法和应用；所述细胞外囊泡的膜表面携带有CD19蛋白，以利用细胞外囊泡直接激活CAR‑T细胞溶液中的CAR‑T细胞；所述方法包括：包装CD19蛋白过表达慢病毒质粒；向HEK293T中转染CD19蛋白过表达慢病毒质粒，并进行分选，得到细胞表面表达CD19蛋白的单克隆细胞系；收集所述单克隆细胞系培养的上清液进行离心过滤等得到细胞外囊泡；通过在细胞外囊泡的膜表面携带有CD19蛋白，CAR‑T细胞通过其表面scFv识别细胞外囊泡所携带的CD19蛋白而被激活，其增殖和功能性持续被有效增强。

Description

一种促进CAR-T细胞的扩增和抗肿瘤能力的细胞外囊泡及制 备方法和应用
技术领域
本申请涉及生物技术领域，尤其涉及一种促进CAR-T细胞的扩增和抗肿瘤能力的细胞外囊泡及制备方法和应用。
背景技术
嵌合抗原受体CAR-T细胞免疫疗法在某些白血病和淋巴瘤患者中在临床上获得的成功，且该疗法实现了高比例的持久完全缓解，但是，在一些患者中CAR-T细胞的不良增殖或持久性不足可能会导致疾病的进一步恶化，据报道，CAR-T细胞的高效增殖与较好的临床反应相关，并且而CAR-T细胞在活体内的功能持久性对于患者的长期缓解是必要的。另一方面，抗原表达不足会导致CAR-T细胞的低效增殖，而抗原阳性的复发与功能CAR-T细胞的迅速丧失有关。因此为了增强CAR-T细胞在体内的增殖和持久性，目前已有不同的策略来递送CAR靶抗原来刺激回输的CAR-T细胞，但是这些策略都需要抗原提呈细胞(APCs)的帮助，因此目前并无直接刺激CAR-T细胞的方法。
细胞外囊泡(EVs)作为纳米医学中一个快速发展的领域，已被开发为基于细胞膜的纳米囊泡递送系统。EVs被几乎所有的细胞释放，被认为是细胞间信号的重要调节因子，且最近的研究证实，EVs可以通过暴露在EVs膜表面的分子来影响T细胞的功能。此外，EVs携带的表面分子可以与CAR-T细胞上的受体相互作用，从而调节其功能，但是目前仍然缺乏EVs直接刺激CAR-T细胞的相关抗原，以实现CAR-T细胞增殖和持久性的增强，因此如何提供一种促进CAR-T细胞的扩增和抗肿瘤能力的细胞外囊泡，以实现对CAR-T细胞直接刺激并实现CAR-T细胞增殖和持久性的增强，是目前亟需解决的技术问题。
发明内容
本申请提供了一种促进CAR-T细胞的扩增和抗肿瘤能力的细胞外囊泡及制备方法和应用，以填补现有技术中EVs在直接激活CAR-T细胞并实现其增殖和持久性的增强上的空白。
第一方面，本申请提供了一种促进CAR-T细胞的扩增和抗肿瘤能力的细胞外囊泡，所述细胞外囊泡的膜表面携带有CD19蛋白，以利用细胞外囊泡直接激活CAR-T细胞溶液中的CAR-T细胞。
可选的，所述细胞外囊泡和所述CAR-T细胞溶液的质量体积比≥700μg/mL。
可选的，所述CAR-T细胞溶液中细胞浓度为0.5×106个/mL～2.5×106个/mL。
可选的，所述细胞外囊泡的直径为50nm～450nm。
第二方面，本申请提供了一种制备第一方面所述的细胞外囊泡的方法，所述方法包括：
包装CD19蛋白过表达慢病毒质粒；
向HEK293T中转染所述CD19蛋白过表达慢病毒质粒，并进行分选，得到细胞表面表达CD19蛋白的单克隆细胞系；
收集培养所述单克隆细胞系的上清液进行第一轮离心，并进行过滤，后进行第二轮离心，得到第一方面所述的细胞外囊泡。
可选的，所述转染的时间≥48h。
可选的，所述第一轮离心的离心力为450g～550g；和/或，
所述第一轮离心的时间为5min～15min。
可选的，所述第二轮离心的温度为0℃～10℃。
可选的，所述第二轮离心的离心力为13500g～14500g；和/或，
所述第二轮离心的时间为0.5h～1.5h。
第三方面，本申请提供了一种第一方面所述的细胞外囊泡的应用，所述应用包括：将第一方面所述的细胞外囊泡用于调节CAR-T细胞的功能状态中。
本申请实施例提供的上述技术方案与现有技术相比具有如下优点：
本申请实施例提供的一种促进CAR-T细胞的扩增和抗肿瘤能力的细胞外囊泡，通过在细胞外囊泡的膜表面携带有CD19蛋白，利用CAR-T细胞通过其表面scFv识别细胞外囊泡所携带的CD19蛋白而被激活，从而进一步激活CAR-T细胞的扩增，使得CAR-T细胞能够更高效地扩增，分泌更高水平的细胞因子，并提高CAR-T细胞的增殖效率，同时还能诱导CAR-T细胞向效应-记忆表型分化，免疫检查点表达增多，提高了CAR-T细胞的持久性，因此CAR-T细胞通过其表面scFv识别细胞外囊泡所携带的CD19蛋白而被激活，其增殖和功能性持续被有效增强。
附图说明
此处的附图被并入说明书中并构成本说明书的一部分，示出了符合本申请的实施例，并与说明书一起用于解释本申请的原理。
为了更清楚地说明本申请实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，对于本领域普通技术人员而言，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本申请实施例提供的方法的流程示意图。
图2为本申请实施例提供的对照EVs和携带有CD19蛋白的EVs的特征示意图，其中，图2A为在NTA监测下EVs的颗粒布朗运动示意图；图2B为在NTA监测下EVs的测量的粒径分布情况；图2C为WB检测EVs膜联蛋白A1和CD19蛋白的表达情况图；图2D为流式细胞术检测EVs表面CD19蛋白的表达情况图；图2E为流式细胞术检测EVs表面PD-L1蛋白的表达情况图。
图3为本申请实施例提供的携带有CD19蛋白的EVs对CAR-T细胞的激活具有剂量依赖性关系图，其中，图3A为CAR-T细胞和CD19蛋白的EVs共培养24h后，通过ELISA检测CAR-T细胞的细胞因子分泌情况示意图；图3B为CAR-T细胞和携带有CD19蛋白的EVs共培养72h后流式细胞术检测CAR-T细胞的比例示意图，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。
图4为本申请实施例提供的携带有CD19蛋白的EVs促进CAR-T细胞的扩增和功能成熟，其中，图4A为CAR-T细胞分别PBS、对照EVs、携带有CD19蛋白的EVs共培养72h后流式细胞术检测CAR-T细胞的整体比例；图4B为CAR-T细胞用CFSE染料标记后分别与PBS、对照EVs、携带有CD19蛋白的EVs共孵育，72h后流式细胞术检测各组CAR-T细胞扩增情况，代表流式图(右)及统计分析(左)；图4C为流式细胞术检测CAR-T细胞在PBS、对照EVs、携带有CD19蛋白的EVs刺激下的CD107a表达；图4D为CAR-T细胞在各组处理72h后与Raji细胞按照效靶比1:1混合后的CD107a表达情况图；图4E为CAR-T细胞(初始T细胞、效应T细胞、效应记忆T细胞、中央记忆T细胞)的亚群分布结果图；图4F为PD-1、TIGIT、LAG3等免疫检查点的表达情况示意图，ns无统计学差异，*P<0.05,**P<0.01。
图5为本申请实施例提供的携带有CD19蛋白的EVs可促进CD4+和CD8+CAR-T细胞的扩增和CAR表达的情况示意图，其中，图5A为CAR-T细胞分别PBS、对照EVs、携带有CD19蛋白的EVs共培养72h后，流式细胞术检测CD4+T细胞和CD8+T细胞中CAR-T细胞的比例示意图，图5B为CD4+CAR-T细胞和CD8+CAR-T细胞的CAR分子平均荧光强度统计分析示意图，ns，无统计学差异，*P<0.05，**P<0.01。
图6为本申请实施例提供的携带有CD19蛋白的EVs促进CAR-T细胞的CAR表达情况图，其中，图6A为流式细胞仪检测与PBS、对照EVs和携带有CD19蛋白的EVs共培养72h后CAR-T细胞的CAR MFI结果图；图6B为将PBS、对照EV和携带有CD19蛋白的EVs分别加入CFSE标记的CAR-T细胞72h后，再将CAR-T细胞低CAR-FI组和高CAR-MFI组各50％分为“低”组和“高”组，用流式细胞仪检测细胞增殖率的结果示意图；图6C为流式细胞术检测Raji wt和Rajidim表面的CD19抗原表达情况示意图；图6D为将CAR-T细胞分别与PBS、对照EV和携带有CD19蛋白的作用72h后与Raji细胞混合并孵育24h后，用PI(BD Pharmingen)法检测Raji细胞的死亡并用流式细胞仪进行分析的结果图，ns无统计学差异，*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001。
图7为本申请实施例提供的肿瘤抗原密度和CAR分子密度共同影响CAR-T细胞的脱颗粒水平，其中，将CAR表达水平低、中、高的CAR-T细胞分别与Raji wt、Raji dim以效靶比1:1进行混合，流式细胞术检测各组CD8+CAR-T细胞表面CD107a的表达情况图。
图8为本申请实施例提供的携带有CD19蛋白的EVs促进患者来源的CAR-T细胞的疗效，其中，图8A为流式细胞仪检测与PBS、对照EVs和携带有CD19蛋白的EVs共培养72h后CAR-T细胞的比例示意图；图8B为各组CAR-MFI的结果示意图，图8C为与PBS、对照EVs和携带有CD19蛋白的EVs共培养24h后，用ELISA法分析CART细胞分泌细胞因子的情况示意图，图8D)为流式细胞术检测患者来源的CAR-T细胞在PBS、对照EVs、携带有CD19蛋白的EVs刺激下的CD107a表达情况图，图8E为患者来源的CAR-T细胞与PBS、对照EVs、携带有CD19蛋白的EVs共培养72h后，分别与Raji细胞以效靶比1:1进行混合，流式细胞术检测各组CAR-T细胞表面CD107a的表达示意图；图8F为7例患者来源的CAR-T细胞在PBS、对照EVs、携带有CD19蛋白的EVs处理72h后，分别与Raji细胞以效靶比1:1的比例共孵育24h后流式细胞术测定各组中肿瘤细胞的凋亡比例示意图；图8G为携带有CD19蛋白的EVs诱导的图8F中CAR-T细胞的CARMFI变化，其中，彩色线条代表了三名患者，他们的CAR-T细胞的CAR表达和抗肿瘤活性无法通过携带有CD19蛋白的EVs增强；图8H为基于11例供者的CAR-T细胞中经携带有CD19蛋白的EVs处理后CAR表达的平均荧光强度相比PBS组的变化倍数和对应杀瘤能力变化倍数的回归分析，ns无统计学差异，*P<0.05，
**P<0.01,***P<0.001。
图9为本申请实施例提供的携带有CD19蛋白的EVs对从患者来源的T细胞制备的CAR-T细胞的影响情况图，其中，图9A为将CFSE标记的CAR-T细胞分别用PBS、对照EVs和CD19EVs处理72h，然后用流式细胞仪检测CAR-T细胞的增殖的情况图，三条线分别代表三个病人；图9B为黑线代表携带有CD19蛋白的EVs促进CAR-T细胞增殖的患者，红线代表携带有CD19蛋白的EVs无法促进CAR-T细胞增殖的患者；图9C为分别用PBS、对照EVs、携带有CD19蛋白的EVs处理7天后，用流式细胞仪检测CAR-T细胞亚群分布。
图10为本申请实施例提供的输注前预置CAR-T细胞的流式细胞术分析及预置CAR-T细胞处理的小鼠体重示意图，其中，图10A为用于体内实验的CAR-T细胞在回输前分别PBS、对照EVs、携带有CD19蛋白的EVs共培养72h后，流式细胞术检测CAR-T细胞占T细胞的比例及CAR分子的平均荧光强度示意图；图10B为CAR-T细胞回输7天后各组小鼠的肿瘤图片；图10C为CAR-T细胞回输9天后流式细胞术检测小鼠体内CAR-T细胞的亚群分布情况；图10D为CAR-T细胞回输9天后流式细胞术检测小鼠体内CAR-T细胞的免疫检查点表达情况；图10E为荷瘤后的小鼠在给予不同治疗后的体重变化情况示意图；**P<0.01。
图11为本申请实施例提供的携带有CD19蛋白的EVs预处理的CAR-T细胞在体内表现出增强的增殖和抗肿瘤活性情况图；其中，图11A为不同治疗情况下小鼠(n＝5只/组)的肿瘤体积变化情况图；图11B为不同治疗情况下小鼠的生存曲线；图11C为流式细胞术检测小鼠在回输CAR-T细胞day 9时外周血中CAR-T细胞占CD3+T细胞的比例情况图；图11D为数字PCR分析小鼠在回输CAR-T细胞day 9时外周血中CAR基因的拷贝数；图11E为ACT后第3天血清细胞因子水平情况图；在ACT后第4天，图11F为用流式细胞仪分析肿瘤组织中CAR-T细胞的比例情况图；图11G为各组CAR MFI的结果示意图；图11H为免疫组化检测CD3+T细胞在肿瘤中的浸润情况(每组3只动物)，标尺，50μm，ns，无统计学差异，*P<0.05，**P<0.01,***P<0.001。
图12为本申请实施例提供的体内应用携带有CD19蛋白的EVs促进CAR-T细胞的功能性持续结果图，其中，图12A小鼠模型中CART细胞、EVs治疗及荷瘤的时间线(n＝5只/组)(B)用式细胞术检测小鼠在不同处理情况下CAR-T细胞的扩增情况图；图12C为数字PCR检测小鼠在回输CAR-T细胞day 6时外周血中CAR基因的拷贝数情况图；图12D为不同治疗情况下小鼠的肿瘤体积变化情况图；图12E为不同治疗情况下小鼠的生存曲线示意图，图中，C代表CAR-T细胞的体内回输，E代表EVs的体内注射，T代表肿瘤细胞接种；ns无统计学差异，**P<0.01。
图13为本申请实施例提供的EVs的体内应用安全性评估结果图，其中，图13A为小鼠在给予不同治疗后的体重变化情况示意图；图13b为在回输CAR-T细胞后day 8时检测小鼠ALT、AST水平的结果图；图13C为在回输CAR-T细胞后day 8时检测小鼠CRE水平的结果图；图13D为在回输CAR-T细胞后day 8时检测小鼠并对重要脏器进行HE染色并在200x显微镜下观察其生理结构示意图，其中，比例尺为50μm。
图14为本申请和实施例提供的CD19 EVS对CAR-T细胞功能影响的结果示意图。
具体实施方式
为使本申请实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本申请实施例中的附图，对本申请实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本申请的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本申请保护的范围。
除非另有特别说明，本申请中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备等，均可通过市场购买得到或者可通过现有方法制备得到。
本申请的创造性思维为：
目前针对递送CAR 靶抗原来刺激回输的CAR-T细胞的策略主要有：编码CAR特异性抗原的RNA疫苗和携带CAR配体的多肽疫苗都可以修饰树突状细胞(DCs)以展示靶抗原来激活CAR-T细胞，从而显著促进其体内的扩增和持久性，并且在小鼠模型中，CAR-T细胞的抗肿瘤效果也得到了改善，这些研究验证了通过靶抗原激活CAR-T细胞来提高其疗效的可行性。然而，目前的方法需要抗原提呈细胞(APCs)的帮助，直接刺激CAR-T细胞的方法还有待探索。
第一方面，本申请提供了一种促进CAR-T细胞的扩增和抗肿瘤能力的细胞外囊泡，所述细胞外囊泡的膜表面携带有CD19蛋白，以利用细胞外囊泡直接激活CAR-T细胞溶液中的CAR-T细胞。
在一些可选的实施方式中，所述细胞外囊泡和所述CAR-T细胞溶液的质量体积比≥700μg/mL。
本申请实施例中，控制细胞外囊泡和CAR-T细胞溶液的质量体积比≥700μg/mL的积极效果是在该质量体积比的范围内，能保证CAR-T细胞被膜表面携带有CD19蛋白的细胞外囊泡充分激活，并进行扩增，从而有效的增强CAR-T细胞增殖和持久性。
在一些可选的实施方式中，所述CAR-T细胞溶液中细胞浓度为0.5×106个/mL～2.5×106个/mL。
本申请实施例中，限定具体的CAR-T细胞溶液中细胞浓度的积极效果是在该浓度范围内，能保证CAR-T细胞足够被携带有CD19蛋白的细胞外囊泡所激活，从而保证CAR-T细胞的增殖和分化，进而有效的增强CAR-T细胞增殖和持久性。
在一些可选的实施方式中，所述细胞外囊泡的直径为50nm～450nm。
本申请实施例中，控制细胞外囊泡的直径为50nm～450nm的积极效果是在该直径的范围内，能保证膜表面携带有CD19蛋白的细胞外囊泡的尺寸和典型的细胞外囊泡的大小相似，从而保证膜表面携带有CD19蛋白的细胞外囊泡能够替一般的细胞外囊泡参与进生理活动，进而使得CAR-T细胞被激活充分，从而有效的增强CAR-T细胞增殖和持久性。
如图1所示，基于一个总的发明构思，本申请实施例还提供一种促进CAR-T细胞的扩增和抗肿瘤能力的细胞外囊泡的制备方法，所述方法包括：
S1.包装CD19蛋白过表达慢病毒质粒；
S2.向HEK293T中转染所述CD19蛋白过表达慢病毒质粒，并进行分选，得到细胞表面表达CD19蛋白的单克隆细胞系；
S3.收集培养所述单克隆细胞系的上清液进行第一轮离心，并进行过滤，后进行第二轮离心，得到第一方面所述的细胞外囊泡。
本申请实施例中，通过设计CD19蛋白过表达慢病毒质粒，并进行转染和分选，保证传染后的HEK293T细胞中能分泌出足够的携带有CD19蛋白的胞外囊泡，最后通过两轮离心，保证最终得到预期的细胞外囊泡产品。
该方法是针对上述胞外囊泡的制备方法，该胞外囊泡的具体组成和结构可参照上述实施例，由于该方法采用了上述实施例的部分或全部技术方案，因此至少具有上述实施例的技术方案所带来的所有有益效果，在此不再一一赘述。
在一些可选的实施方式中，所述转染的时间≥48h。
本申请实施例中，限定转染的时间≥48h的积极效果是在该时间范围内，能保证重组慢病毒shRNA被传染进待传染细胞中，从而保证重组慢病毒shRNA的表达，进而促使膜表面带有CD19蛋白的胞外囊泡产生。
在一些可选的实施方式中，所述第一轮离心的离心力为450g～550g；和/或，
所述第一轮离心的时间为5min～15min。
本申请实施例中，限定第一轮离心的离心力为450g～550g以及限定第一轮离心的时间为5min～15min的积极效果是在该离心力大小内和该离心时间内，能保证将待传染细胞和传染成功的细胞分离出，并使得传染成功的细胞所分泌的胞外囊泡被离心出，从而保证后续过滤和第二轮离心的效果，提高得到的胞外囊泡的纯度。
在一些可选的实施方式中，所述第二轮离心的温度为0℃～10℃。
进一步的，所述第二轮离心的离心力为13500g～14500g；和/或，
所述第二轮离心的时间为0.5h～1.5h。
本申请实施例中，限定第二轮离心的温度为0℃～10℃、第二轮离心的离心力为13500g～14500g和第二轮离心的时间为0.5h～1.5h的积极效果是在该参数条件下，能保证通过第二轮离心将传染成功的细胞所分泌出的胞外囊泡进一步离心出，从而提高胞外囊泡的纯度。
基于一个总的发明构思，本申请实施例还提供一种促进CAR-T细胞的扩增和抗肿瘤能力的细胞外囊泡的应用，所述应用包括：将所述细胞外囊泡用于调节CAR-T细胞的功能状态中。
本申请实施例中，利用携带有CD19蛋白的胞外囊泡可直接激活CAR-T细胞这一原理，将其用于调节CAR-T细胞的功能状态中，可以为个体化细胞治疗提供潜在的调控工具。
该应用是基于上述胞外囊泡来实现，该胞外囊泡的具体组成和结构可参照上述实施例，由于该应用采用了上述实施例的部分或全部技术方案，因此至少具有上述实施例的技术方案所带来的所有有益效果，在此不再一一赘述。
下面结合具体的实施例，进一步阐述本申请。应理解，这些实施例仅用于说明本申请而不用于限制本申请的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照国家标准测定。若没有相应的国家标准，则按照通用的国际标准、常规条件、或按照制造厂商所建议的条件进行。
实施例1
1.细胞系及培养：选取人胚胎肾细胞系HEK293T、Burkitt淋巴瘤细胞系Raji和人慢性粒细胞白血病细胞系K562均来自ATCC。细胞在Dulbecco的改良Eagle培养液或RPMI1640+质量分数为10％胎牛血清(Gibco，NY，USA)中培养，温度为37℃，二氧化碳浓度为5％。
2.动物实验材料：雌性NCG小鼠(5～6周龄)购自GemPharmatech(中国)。所有研究均在无特定病原体(SPF)条件下进行，并经华中科技大学同济医学院附属同济医院实验动物中心批准(批准文件见同济医院(福)第TJH-202011005号)。
3.质粒制备：表达CD19的过表达慢病毒载体pCDH-CMV-CD19购自GeneCopeia。
实施例2
将实施例2和实施例1进行对比，实施例2和实施例1的区别在于：
抗CD19慢病毒载体的构建方法：
1.基因序列合成
抗人源CD19的单链可变区抗体(single chain variable fragment，scFv)序列基于WO 2014/184143专利，整体结构包括scFv、CD8α铰链、CD28跨膜结合区、细胞内信号传导区CD3ζ以及共刺激信号CD28和4-1BB，为第三代CAR结构。通过基因合成法得到DNA片段，片段的前端和后端分别加上EcoRI和BamHI酶切位点，再克隆到pUC57载体质粒中。
2.pUC57载体质粒和PLVX慢病毒质粒按表1所示的反应体系进行双酶切：
表1双酶切反应体系
试剂 体积
质粒 1μg
BamHI酶 1μL
EcoRI酶 1μL
NEB buffer 2μL
纯水 补至20μL
总体系体积为20μL，于37℃水浴12h，产物经2％的琼脂糖凝胶电泳，确定酶切后的条带大小是否符合目的条带。
3.回收目的条带：
Omega DNA胶回收试剂盒将上述凝胶切胶回收目的条带，Nanodrop定量DNA浓度及检测其纯度。
4.通过DNA连接酶将两者按如表2所示的体系连接：
表2连接体系
试剂 体积
CAR片段 1μL
PLVX慢病毒载体 1μL
T4连接酶 1μL
T4 DNA buffer 2μL
纯水 补至20μL
PCR仪条件：22℃，30min。
5.质粒转化：
(1)将50μL的Stbl3感受态细胞(-80℃储存，适用于慢病毒质粒的转化)于冰上融化至半固体。
(2)取5μL上述连接产物加入到上述半固体状态的感受态细胞中，轻轻弹EP管壁，在冰上放置30min。
(3)将上述混合物放入预加温至42℃水浴锅中，热激90s(时间要准确)，快速将EP管置于冰浴中2min。
(4)管中加入400μL的LB培养基(此时可能还未表达耐抗生素的蛋白，故不加抗生素)，37℃，150rpm振荡培养45min～60min，进行复苏。
(5)将产物倒入氨苄抗性的LB平板中，平板内放入5-10个玻璃珠，均匀涂布复苏的感受态细胞到平板表面。
(6)倒出玻璃珠，将平板置于室温直至液体被吸收，约30min左右。
(7)倒置平板，于37℃培养过夜后出现菌落。
(8)观察平板，挑取单克隆菌落至抗性LB液体培养基中摇菌，并送测序鉴定。
实施例3
将实施例3和和实施例2进行对比，实施例3和实施例2的区别在于：
制备敲除CD19的shrna质粒：
1.设计干扰CD19的shRNA：GGGCATTCTTCATCTTCAAAG(SEQ ID NO.1)。
2.设计并合成相应的oligo DNA引物，退火后形成双链连接到pLKO.1慢病毒载体中，得到重组慢病毒shRNA质粒。
3.质粒转化：同实施例1中的相应步骤。
实施例4
将实施例4和和实施例3进行对比，实施例4和实施例3的区别在于：
1.慢病毒的制备：通过PEI法将上述构建的三种慢病毒载体分别包装质粒转染HEK293T细胞，制备慢病毒颗粒，于转染48h后收集上清液，在4℃、3000g的温度下离心30min，去除细胞，然后通过0.45μm过滤器(Thermo Science)去除细胞碎片，得到的上清液在4℃、30000g的条件下进一步离心2.5h(Avanti J-26SXPI高性能离心机，BeckmanCoulter)，得到浓缩慢病毒，将浓缩慢病毒储存在-80℃下冷冻，备用。
HEK-293T细胞转染CD19过表达慢病毒病毒，转染72-96小时后检测转染效率，在Moflo XDP Flow Cytometer(Beckman Coulter)通过single cell模式分选CD19阳性的HEK-293T细胞。
Raji细胞转染重组慢病毒shRNA质粒，转染72-96小时后检测转染效率，在MofloXDP Flow Cytometer(Beckman Coulter)通过single cell模式分选CD19低表达的Raji细胞。
2.CAR-T细胞的制备：取自健康献血者和患者的外周血，用淋巴细胞分离液(Axis-Shield)分离离体的外周血单个核细胞(PBMCs)，并用CD3分选试剂盒(Miltenyi，130-097-043)从人PBMCs中分离人T细胞，用CD3/CD28dybeads(Thermo Science，11131D)在含有200IU mL.-1重组IL-2(PeproTech)的培养液(Gibco，A3021002)中活化24h，用抗CD19慢病毒以感染倍数为3的转染活化的T细胞，培养10d～14d，并每隔2～3天更新一次培养液，同时调整细胞浓度为0.5×106个
/mL～2.5×106个/mL。
3.流式细胞术：基于CFSE稀释试验，在CAR-T细胞在培养前用5μM CFSE(ThermoFisher Science)标记。用APC标记的CD107a抗体BioLegend对CAR-T细胞脱颗粒染色4h。过继T细胞转移(ACT)后第4天将小鼠肿瘤剥离，采用肿瘤分离试剂盒(Miltenyi，130-095-929)制成单细胞悬液。均用1：100抗体稀释度Fc块(Biolegend)进行细胞染色，用NovoCyteFlow Cytometer(ACEA Biosciences)或MACSQuant Analyzer 10FlowCytometer(MiltenyiBiotec)进行分析。对于EVs的流式检测是在CytoFLEX流式细胞仪(Beckman Coulter)上进行的。
各数据都利用FlowJo软件(Tree Star)进行数据分析。
4.EVs的制备：从HEK293T和HEK293T-CD19细胞的上清液中分离出对照EV和CD19EVs。即将将各自的上清液在500g中离心10min，然后通过0.45μm无菌注射器过滤器。将上清液在4℃下14000g离心1h以得到EVs。
为定量EVs，用含有蛋白酶抑制剂(瑞士罗氏)的RIPA裂解缓冲液(Beyotime，中国)裂解，并使用BCA检测试剂盒(Beyotime，中国)测定其蛋白质含量。
纳米颗粒跟踪分析(NTA)：EVs用PBS稀释后，在ZetaView多参数粒子跟踪分析仪上进行纳米颗粒跟踪分析，观察EVs的布朗运动并确定颗粒大小。
实施例5
将实施例5和实施例4进行对比，实施例5和实施例4的区别在于：
1.免疫印迹法：在EVs裂解和定量后，将样品与蛋白缓冲液混合并100℃加热10min。每个样品中的等量蛋白质(40μg)在SDS-PAGE凝胶上分离并转移到PVDF膜上(Millipore，美国)。用5％的脱脂牛奶在25℃下封闭膜1h，然后在4℃下，孵育抗Annexin A1抗体(Abcam，ab214486，1：2000)和抗CD19抗体(Abcam，ab245235，1：1000)，轻轻摇动过夜。将膜与HRP偶联的二抗在室温下孵育1h，用皮尔斯ECL试剂(Thermo Fisher，美国)进行化学发光来观察免疫印迹。
2.细胞因子检测：将CAR-T细胞以1×106个/mL的浓度重悬，将300μL悬液转移到48孔板上，与PBS或EVs共同孵育24h，离心收集上清分保存于-80℃冰箱。用细胞因子特异性ELISA试剂盒(新生物科学技术，中国)分析干扰素-γ、肿瘤坏死因子-α和IL-2的水平。
3.细胞毒作用检测：用1μM CellTraceTMCFSE或Violet(ThermoFisher)标记靶细胞，以效靶比(E：T)1：1与CAR-T细胞共培养24h，用PI(BD Pharmingen)染色确定死亡的靶细胞。用CellTrace标记的靶细胞死亡率来评价CAR-T细胞的细胞毒作用。
4.肿瘤细胞接种：将Raji细胞按5×106细胞(200μL PBS)接种于小鼠右侧皮下。每隔三到四天测量肿瘤体积大小(Width2x Long)/2。当小鼠出现疾病体征或肿瘤体积超过1500mm3时即行安乐死。CAR-T细胞的回输和EVs的体内应用：按照时间点通过尾静脉注射1×106个CAR-T细胞。CAR-T细胞回输后第1、5天尾静脉注射200μg CD19 EVs，以相同体积的对照EVs或PBS处理的小鼠为对照。
5.CD19 EVs体内应用的安全性分析：输注CAR-T细胞72h后提取血清。使用人Th1/Th2细胞因子细胞检测珠阵列盒(BDBiosciences)对血清细胞因子水平进行定量。每三到四天测量一次小鼠体重。为评价EVs对小鼠的肝肾毒性，在治疗后指定时间点采集肝、肾组织，用9倍体积的生理盐水研磨，制成10％组织匀浆并对丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)和肌酐(Cre)水平进行检测(BIOBASE，70911,70910,70927)。
6.数字PCR：用ddPCR检测小鼠外周血中CAR-T细胞的扩增，CAR-T细胞的引物序列如下：正向引物：5‘-CAGCAAAAATACGACCTCCTCACT-3’(SEQ ID NO：2)；反向引物：
5‘-TGGTGCTGCCTTTGATCTCA-3’(SEQ ID NO：3)；探针：5’-FAM-TTGGCGGAGGGACC-3’(SEQ ID NO：4)。
7.组织病理学分析与免疫组织化学：小鼠肿瘤组织和器官经福尔马林固定，石蜡包埋，切成3mm厚的切片。对器官切片进行HE染色。将固定的肿瘤切片与抗人CD3抗体(Abcam，Ab1669，1：100)在4℃下孵育过夜，以检测肿瘤中人T细胞的存在。然后用二抗处理切片，并用3，3‘-二氨基联苯胺显示，细胞核用苏木精染色。
8.数据分析：利用GraphPadPrism7.0软件对数据进行处理，使用one-wayANOVA、two-wayANOVA、Student’st检验进行差异分析。动物生存分析采用Log-rank(Mantel-Cox)检验。体外数据均至少重复三次，体内数据每组小鼠均为5只。P值<0.05被认为有统计学差异。
相关实验及效果数据：
1.本申请为了获得携带有CD19蛋白的EVs，建立了表达CD19蛋白的HEK293T单克隆细胞系，同时将对照载体转入了HEK293T细胞，制备出了对照EV。同时用NTA检测对照EVs和携带有CD19蛋白的EVs，并监测两种胞外囊泡的布朗运动和尺寸分布，结果如图2A和图2B所示，且观察得到对照EV和携带有CD19蛋白的EVs的颗粒尺寸都在50～450nm之间，与EV的典型颗粒尺寸一致，同时图2的数据表明，表达在EV膜表面的CD19蛋白对EVs的大小和运动状态等物理性质没有显著影响。同时根据所设计的第一轮离心和第二轮离心速度，所获得的EVs主要是一种直接从细胞膜上脱落的微泡，其特异性标记为Annexin A1，虽然AnnexinA1在两种类型的EVs中均有表达，但是由图2C可知CD19仅在CD19 EVs中显著表达，而图2D显示，通过流式细胞仪检测携带有CD19蛋白的EVs的膜表面有CD19蛋白的表达。
2.通过对来自健康供者的CD19蛋白的CAR-T细胞与携带有CD19蛋白的EVs共孵育后的特性变化进行了检测，并发现携带有CD19蛋白的EVs以剂量依赖的方式促进共培养的CAR-T细胞的细胞因子分泌和占比，如图3A和图3B所示，在携带有CD19蛋白的EVs的浓度为700μg/mL时达到峰值，同时在1350μg/mL浓度下，细胞因子分泌水平和CAR-T细胞百分率在达到较高水平后停滞，这可能是一个饱和阈值，提示CAR-T细胞在携带有CD19蛋白的EVs的浓度在700μg/mL时候，就能被足够的靶抗原充分激活。
将CAR-T细胞与PBS、对照EVs或携带有CD19蛋白的EVs共同孵育72h后，如图4A和图5A发现携带有CD19蛋白组的CAR-T细胞比例明显高于PBS组，进一步分析发现，无论是CD4+T细胞还是CD8+T细胞，CAR-T细胞比例均高于PBS组，而对照组EVS组的CAR-T细胞比例与PBS组无差异。如图4B所示，在携带有CD19蛋白的EVs存在的情况下，CAR-T细胞的增殖被促进，而缺乏抗原的对照EVs则不能诱导增殖。以上结果表明，携带有CD19蛋白的EVs可促进抗原特异性的CAR-T细胞的增殖，从而导致CAR-T细胞比例的升高。
为分析携带有CD19蛋白的EVs对CAR-T细胞功能成熟的影响，分析了脱颗粒程度，这可以通过CD107a(LAMP-1)的表面表达来评估。如图4C所示，在没有肿瘤细胞的情况下，PBS或对照EVs对CAR-T细胞脱颗粒的影响很小，而携带有CD19蛋白的EVs显著增强了脱颗粒水平，平均11.36％的CAR-T细胞表达CD107a。如图4D所示，在肿瘤细胞存在的情况下，携带有CD19蛋白的EVs处理的CAR-T细胞比其他组有更明显的脱颗粒变化。分析了携带有CD19蛋白的EVs对CAR-T细胞亚群和免疫检查点表达的影响。如图4E和图4F所示，携带有CD19蛋白的EVs诱导CAR-T细胞向效应-记忆表型分化，其中PD-1的表达水平高于其他组，TIGIT的表达无显著差异，LAG3的表达有所升高，但无统计学差异。PD-1表达的增加可能与CAR-T细胞的激活状态有关。这些数据表明，携带有CD19蛋白的EVs促进了抗原特异性的CAR-T细胞的扩增，并诱导了其功能成熟。
3.如图6A所示，携带有CD19蛋白的EVs不仅能诱导CAR-T细胞增殖，还能促进CAR-T细胞的CAR表达。如图5B携带有CD19蛋白的EVs处理组中的CAR-T细胞表面抗CD19蛋白CAR中位荧光强度(MFI)是对照组的2倍以上，且CD4+和CD8+CAR-T细胞的CARMFI均显著高于对照组。如图6B所示，为了阐明其可能的作用机制，分别检测了不同CAR表达水平的CAR-T细胞在EVs刺激下的增殖效率，发现高CAR MFI的CAR-T细胞在被携带有CD19蛋白的EVs激活时比低CAR MFI的CAR-T细胞有更强的扩增能力，导致新扩增的CAR-T细胞中有更多的CAR-T细胞具有高CAR MFI，而对照组CAR-T细胞的增殖不受CAR-MFI影响。这一发现表明，携带有CD19蛋白的EVs能够富集高CAR表达的T细胞。
CAR密度和靶抗原密度均可影响CAR-T细胞的细胞毒活性。为了进一步证实这一点，通过对CAR表达高、中、低程度的T细胞进行分选，并以CD19表达正常(Raji WT)和低CD19表达(Raji Dim)的Raji细胞为靶细胞，测定不同CAR表达的CAR-T细胞的脱颗粒水平。如图6C和图7所示，结果表明，CAR表达和抗原密度越高，CAR-T细胞脱颗粒程度越高。如图6D所示，为了确定携带有CD19蛋白EVs富集高表达CAR的T细胞是否具有增强细胞毒的作用，分别用PBS、对照EV和携带有CD19蛋白EV处理CAR-T细胞后分别与Raji细胞共同孵育，发现携带有CD19蛋白EVs显著增强CAR-T细胞对Raji WT和Raji Dim的杀瘤能力。CAR-T细胞对RajiDim的杀瘤能力低于其对Raji WT，这与以往的研究一致。上述结果提示携带有CD19蛋白EVs优先促进高表达CAR的CAR-T细胞的增殖，从而增强抗肿瘤活性。
4.为了进一步评估该策略的临床转化潜力，将携带有CD19蛋白的EVs应用于从B细胞恶性肿瘤患者分离出来的T细胞所制备的CAR-T细胞。如图8A和图9A所示，携带有CD19蛋白的EVs可促进大多数患者来源的CAR-T细胞的增殖和CAR-T表达，如图9B所示，约20％检测患者的CAR-T细胞对携带有CD19蛋白的EVs没有反应。如图8C至图8E经携带有CD19蛋白的EVs扩增的CAR-T细胞功能完整，细胞因子分泌和脱颗粒水平均增多。此外，如图9C所示，通过检查了三个患者来源的CAR-T细胞与CD19 EVs共培养后的亚群变化，CD19 EVs诱导效应记忆或中央记忆表型的细胞比例显著增加。如图8F所示，本申请证实了携带有CD19蛋白的EVs提高了CAR-T细胞的细胞毒活性。但是其中有3例未见明显增强。如图8G所示，进一步流式分析表明，携带有CD19蛋白的EVs对这3例患者的CAR-T细胞中CAR的表达没有促进作用，这意味着携带有CD19蛋白的EVs对CART细胞抗肿瘤活性的增强与CAR表达的增加密切相关。如图8H所示，线性回归分析显示，携带有CD19蛋白的EVs治疗后CARMFI的倍增变化与CAR-T细胞杀伤活性的倍增呈正相关，R2＝0.7079(P＝0.0012)，提示二者之间有很强的相关性。这说明携带有CD19蛋白的EVs诱导CAR-T细胞的CAR表达水平越高，抗肿瘤活性越强。综上所述，携带有CD19蛋白的EVs可以促进患者CAR-T细胞的增殖、细胞因子的分泌和脱颗粒，并增强CAR的表达和抗肿瘤能力。
5.为了探讨携带有CD19蛋白的EVs在体内对CAR-T细胞的影响，如图10A所示，给荷瘤小鼠静脉注射亚治疗剂量的经PBS、对照EVs、携带有CD19蛋白的EVs处理的Car-T细胞或Mock-T细胞。如图11A和图11B所示，PBS或对照组的肿瘤生长无法被完全抑制。而用CD19EVs处理的CART细胞在输注后第21天可以完全消除肿瘤，该组中位存活率显著高于对照组。如图11C和图11D所示，CD19EVs组的有效肿瘤控制与外周血中CAR-T细胞的高比例相关。此外，如图11F、图11G和图11H所示，通过流式细胞术和免疫组化检测了T细胞在小鼠肿瘤中的浸润程度。携带有CD19蛋白的EVs处理的CAR-T细胞在肿瘤中的浸润和CAR的表达有所增加，这可能也是携带有CD19蛋白的EVs组肿瘤加速消退的原因之一。因此，携带有CD19蛋白的EVs有助于CAR-T细胞的体内扩增，并使亚治疗剂量的CAR-T细胞能够有效控制肿瘤生长。
但是增强的CAR-T细胞扩增会导致细胞因子的过度分泌，即发生细胞因子释放综合征(CRS)。为了评估与携带有CD19蛋白的EVs暴露相关的全身细胞因子释放，如图11E所示，本申请还分析了干扰素-γ、IL-6和肿瘤坏死因子-α的血清浓度。除干扰素-γ有升高外，IL-6和肿瘤坏死因子-α水平均无明显变化。如图10B所示，各组小鼠外观正常，并显示出随时间推移有规律的体重增加。总之，携带有CD19蛋白的EVs刺激的CART细胞在体内表现出更好的增殖和抗肿瘤效应，且不会引起额外的不良反应，安全性良好。
6.根据先前的研究，CAR-T细胞的持久性差可能导致肿瘤复发。为了评估体内注射携带有CD19蛋白的EVs对CAR-T细胞功能的影响，如图12A所示，回输了CAR-T细胞的小鼠经尾静脉注射EVs后进行荷瘤。如图13A所示，所有小鼠都没有表现出行为异常或显著的体重变化。此外，如图13B和图13C所示，各组小鼠的肝肾功能指标均无显著差异，如图13D所示，重要器官的生理结构正常。这些结果表明，携带有CD19蛋白的EVs体内应用是可以耐受的。接受PBS或对照EV的小鼠中因没有抗原刺激，CAR-T细胞随着时间的推移在外周血中逐渐减少(如图12B所示)，而在接受携带有CD19蛋白的EVs治疗的小鼠中，CAR-T细胞在第一次携带有CD19蛋白的EVs处理后迅速扩增，第二次携带有CD19蛋白的EVs处理后再次强劲扩增并维持在较高水平。携带有CD19蛋白的EVs治疗组在CAR-T细胞转移后第6天检测到的CAR转基因拷贝数最高，约为对照组的两倍，这与流式细胞术分析一致(如图12C所示)。
为了明确携带有CD19蛋白的EVs的应用是否能促进CAR-T细胞的功能持久性，如图12D和图12E所示，在EV处理的小鼠上进行了肿瘤接种。反复接受携带有CD19蛋白的EVs注射的小鼠显著延迟了肿瘤的生长和延长了生存时间。以上结果表明，携带有CD19蛋白的EVs能促进CART细胞在体内的持续存在，携带有CD19蛋白的EVs维持的CAR-T细胞能有效发挥抗肿瘤作用。
本申请实施例中的一个或多个技术方案，至少还具有如下技术效果或优点：
(1)本申请实施例提供的一种促进CAR-T细胞的扩增和抗肿瘤能力的细胞外囊泡，制备了HEK293T来源的EVs，将CD19抗原作为CAR靶点。如图14所示，当CAR-T细胞表面scFv识别携带有CD19蛋白的EVs呈递的CD19抗原后，CAR-T细胞被激活，这导致细胞因子的分泌，增殖和CAR表达增加，有利于更好的细胞毒效应，利用EVs的抗原递送功能来增强CAR-T细胞的增殖和持久性，可能会提高临床疗效，而本申请提供了一种新的干预策略，利用EVs的抗原递送功能来增强CAR-T细胞的增殖和持久性，可能会提高临床疗效。
(2)本申请实施例提供的一种促进CAR-T细胞的扩增和抗肿瘤能力的细胞外囊泡，对比现有的策略，采用EVs作为传递抗原，激活CAR-T细胞的载体，主要有以下几个考量：首先，EVs是细胞来源的生物膜，是一种天然载体，其细胞毒性和免疫原性都更低，所以EV作为抗原递送载体是相对安全的。在目前正在进行的临床试验中，EVs正被用于诱导CD8+T细胞对不同肿瘤抗原的免疫反应，早期临床数据支持其在人类身上执行预期的作用模式。
(3)本申请实施例提供的一种促进CAR-T细胞的扩增和抗肿瘤能力的细胞外囊泡，本申请中使用的EVs是直接从细胞膜脱落的微泡，因此其表面分子与其衍生细胞系上的分子高度相似。基于该特症，理论上通过基因改造来源细胞系可以得到表达各种肿瘤抗原的EVs，用于激活任何抗原特异性的CAR-T细胞。
(4)本申请实施例提供的一种促进CAR-T细胞的扩增和抗肿瘤能力的细胞外囊泡，EVs可以快速、廉价地大规模生产，而临床级EVs的纯化和质量监控研究正在不断深入和完善中。因此，用靶抗原武装EVs提供了一种可行且通用的方案来增强针对任意靶点的CAR-T细胞。它们的时间和经济成本低非常有利于临床转化。
(5)本申请实施例提供的一种促进CAR-T细胞的扩增和抗肿瘤能力的细胞外囊泡，在本申请中，采用HEK293T细胞来源的EVs携带靶抗原。由于HEK293T细胞系来源于人胚胎肾细胞经常用于与EV相关的各种实验和研究。HEK293T细胞来源的EV对T细胞的作用很小，而本申请的结果表明，在体内接种HEK293T细胞来源的EV是安全和耐受的，这与以往的研究一致。这表明HEK293T细胞可以作为来源细胞系来制造具有靶抗原的EV，其他非肿瘤细胞，如间充质干细胞或T细胞，是否能够作为分泌EVs的来源细胞系将有待进一步研究。
(6)本申请实施例提供的一种促进CAR-T细胞的扩增和抗肿瘤能力的细胞外囊泡，携带有CD19蛋白的EVs治疗后CAR-T细胞在扩增速度加快的同时，其CAR-MFI也升高，可能是因为CAR高表达的CAR-T细胞对携带有CD19蛋白的EVs更敏感。而携带有CD19蛋白的EVs通过富集高CAR表达的T细胞来促进CAR-T细胞对CD19表达较弱的Raji细胞的杀伤，这说明本申请策略有助于清除因靶抗原密度低从而对CAR-T治疗耐药的肿瘤细胞。
(7)本申请实施例提供的一种促进CAR-T细胞的扩增和抗肿瘤能力的细胞外囊泡，携带有CD19蛋白的EVs激活的CAR-T细胞具有更好的扩增特性，这可能会减少体外培养所需的时间。此外，在活体内重复给药CD19 EVs可保持相对较高的循环CAR-T细胞水平，因此增加了治疗窗口，这可能有利于预防疾病复发，作为免疫监测。因此，携带靶抗原的EVs可以作为一个高度通用的平台，在体外和体内都可以调节CAR-T细胞的功能状态，从而为目前可用的CAR-T产品的个体化细胞治疗提供潜在的调控工具。
(8)本申请实施例提供的一种促进CAR-T细胞的扩增和抗肿瘤能力的细胞外囊泡的应用，可以携带靶抗原的EVs将作为CAR-T细胞免疫治疗的佐剂。
本申请的各种实施例可以以一个范围的形式存在；应当理解，以一范围形式的描述仅仅是因为方便及简洁，不应理解为对本申请范围的硬性限制；因此，应当认为所述的范围描述已经具体公开所有可能的子范围以及该范围内的单一数值。例如，应当认为从1到6的范围描述已经具体公开子范围，例如从1到3，从1到4，从1到5，从2到4，从2到6，从3到6等，以及所述范围内的单一数字，例如1、2、3、4、5及6，此不管范围为何皆适用。另外，每当在本文中指出数值范围，是指包括所指范围内的任何引用的数字(分数或整数)。
在本申请中，在未作相反说明的情况下，使用的方位词如“上”和“下”具体为附图中的图面方向。另外，在本申请说明书的描述中，术语“包括”“包含”等是指“包括但不限于”。在本文中，诸如“第一”和“第二”等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。在本文中，“和/或”，描述关联对象的关联关系，表示可以存在三种关系，例如，A和/或B，可以表示：单独存在A，同时存在A和B，单独存在B的情况。其中A，B可以是单数或者复数。在本文中，“至少一个”是指一个或者多个，“多个”是指两个或两个以上。“至少一种”、“以下至少一项(个)”或其类似表达，是指的这些项中的任意组合，包括单项(个)或复数项(个)的任意组合。例如，“a,b,或c中的至少一项(个)”，或，“a,b,和c中的至少一项(个)”，均可以表示：a,b,c,a-b(即a和b),a-c,b-c,或a-b-c，其中a,b,c分别可以是单个，也可以是多个。
以上所述仅是本申请的具体实施方式，使本领域技术人员能够理解或实现本申请。对这些实施例的多种修改对本领域的技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本申请的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本申请将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所申请的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

Claims (10)

1.一种促进CAR-T细胞的扩增和抗肿瘤能力的细胞外囊泡，其特征在于，所述细胞外囊泡的膜表面携带有CD19蛋白，以利用细胞外囊泡直接激活CAR-T细胞溶液中的CAR-T细胞。
2.根据权利要求1所述的细胞外囊泡，其特征在于，所述细胞外囊泡和所述CAR-T细胞溶液的质量体积比≥700μg/mL。
3.根据权利要求1或2所述的细胞外囊泡，其特征在于，所述CAR-T细胞溶液中细胞浓度为0.5×106个/mL～2.5×106个/mL。
4.根据权利要求1所述的细胞外囊泡，其特征在于，所述细胞外囊泡的直径为50nm～450nm。
5.一种制备如权利要求1-4任一项所述的细胞外囊泡的方法，其特征在于，所述方法包括：
包装CD19蛋白过表达慢病毒质粒；
向HEK293T中转染所述CD19蛋白过表达慢病毒质粒，并进行分选，得到细胞表面表达CD19蛋白的单克隆细胞系；
收集培养所述单克隆细胞系的上清液进行第一轮离心，并进行过滤，后进行第二轮离心，得到如权利要求1-4任一项所述的细胞外囊泡。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述转染的时间≥48h。
7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述第一轮离心的离心力为450g～550g；和/或，
所述第一轮离心的时间为5min～15min。
8.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述第二轮离心的温度为0℃～10℃。
9.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述第二轮离心的离心力为13500g～14500g；和/或，
所述第二轮离心的时间为0.5h～1.5h。
10.一种如权利要求1-4任一项所述的细胞外囊泡的应用，其特征在于，所述应用包括：将如权利要求1-4任一项所述的细胞外囊泡用于调节CAR-T细胞的功能状态中。
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