CN117343906A - 表达重组抗原蛋白的饲养细胞及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种表达重组抗原蛋白的饲养细胞及其制备方法和应用。所述饲养细胞的表面表达可被效应细胞识别的所述重组抗原蛋白,从而激活所述效应细胞;所述饲养细胞为表达重组抗原蛋白的免疫细胞。本发明解决了效应细胞在低肿瘤靶细胞数量条件下反应差的问题,提供了一种表达重组抗原蛋白的饲养细胞,使效应细胞在低肿瘤靶细胞数量条件下仍能发挥优异的抗肿瘤活性。该策略为首创性的细胞产品应用策略,是目前临床上尚未出现过的策略,也是首次提出的预防性策略。
Description
技术领域
本发明属于生物医药领域,具体涉及一种表达重组抗原蛋白的饲养细胞及其制备方法和应用。
背景技术
过继细胞疗法是一种将细胞输入病人体内进行疾病治疗的治疗方法。这种输入病人体内的细胞可以是自体来源也可以是来自于供体,一般来源于免疫系统,输入病人体内以改善其免疫功能,达到治疗疾病的目的。嵌合抗原受体T细胞(Chimeric antigenreceptor T cells,CAR-T)疗法即属于此类免疫治疗。CAR-T是通过基因工程改造的用于免疫治疗的表达人工T细胞受体的T细胞。嵌合抗原受体(Chimeric antigen receptors,CARs)是一种经过改造的受体蛋白,使T细胞具有靶向特定蛋白的新能力。因其将抗原结合和T细胞激活功能结合在一个单一的受体上而被称为嵌合受体。当CAR-T细胞回输到病人体内后,它们就会成为对抗癌细胞的“活药”。CAR-T细胞在与肿瘤细胞上的目标抗原接触时,会与之结合并被激活,然后继续增殖并产生细胞毒性。CAR-T细胞可通过多种机制破坏肿瘤细胞,包括广泛刺激细胞增殖,增加它们对其他活细胞的毒性程度(细胞毒性),并通过增加可以影响其他细胞的因子分泌,如细胞因子,白细胞介素和生长因子等对肿瘤细胞行使杀伤功能。
目前靶向CD19的CAR-T细胞在治疗晚期难治、复发及移植后复发的急性淋巴细胞白血病(ALL)中,其CR率可达到93%,疗效显著。2017年美国FDA先后批准了CAR-T细胞治疗药物Kymriah和Yescarta用于复发难治ALL和淋巴瘤的治疗。目前国内已有近40项CAR-T细胞产品申报临床试验,其中20余项CAR-T细胞产品已获得临床批件。
尽管CAR-T疗效显著,但治疗后原发病复发及缓解期短仍是目前面临的主要障碍。纪念斯隆-凯特琳癌症中心研究数据显示,接受靶向CD19的CAR-T细胞治疗的复发难治性B淋巴母细胞白血病(B-ALL)患者中位生存期仅为12.9个月,约70%患者在治疗一年后出现复发。
目前报道的靶向CD19的CAR-T治疗复发难治B-ALL后复发或治疗无效的原因主要有:1.治疗过程中CD19抗原表位的丢失导致CD19阴性细胞成为优势克隆从而复发以及免疫抑制性微环境介导的CAR-T治疗失败;2.CAR-T细胞未能在体内持续扩增,细胞拷贝数目下降,维持时间缩短。Maude S等报道对于CAR-T治疗后桥接异基因造血干细胞移植(Allo-HSCT)的B-ALL患者,体内CAR-T细胞持续存在或B细胞再生障碍超过6个月者预后良好;既往研究提示缓解的患者输注CAR-T后扩增倍数不如复发患者高,不能形成有效的扩增高峰和维持较长的扩增周期,达不到清除微小残留病灶的目的,容易在将来复发。这可能与缓解后的患者体内没有足够数量的CD19阳性靶标细胞,无法有效的活化和刺激CAR-T细胞相关。多项研究表明,CAR-T细胞在患者体内得到有效的扩增是发挥其功效的关键。
CAR-T是个“活药”,其疗效不但取决于能精准识别肿瘤细胞表面的抗原,更取决于在体内激化和扩增的程度;CAR-T细胞在体内的激化和扩增主要取决于其暴露于抗原的量和时间。而处在微小残留病(minimal residual disease,MRD)情况下的ALL,肿瘤抗原的量明显降低,如前所述,CAR-T治疗复发难治B-ALL后复发的一个可能的重要原因是体内CD19阳性靶细胞不足。
发明内容
为了使效应细胞(比如CAR-T、CAR-NK、CAR-M等经过基因工程改造的免疫)获得更多暴露于靶细胞的机会,本发明设计使用能够表达特定抗原的免疫细胞对效应细胞产生激活扩增效应,即使用过表达抗原蛋白的表达载体(比如慢病毒表达载体)感染患者原代免疫细胞,得到表达抗原蛋白的细胞,这里将该细胞定义为饲养细胞(Feeding cell,FC)。饲养细胞、效应细胞和靶细胞之间的关系如图1所示。FC主要是起到模拟体内抗原阳性靶细胞的作用,对输注的效应细胞形成抗原刺激,可以通过输注FC实现效应细胞在缓解情况下的有效扩增,并维持一定的扩增持续时间,以达到进一步清除MRD的目的。当该原代免疫细胞为T细胞时,该饲养细胞即为饲养T细胞(Feeding T cell,FTC)。
一方面,本发明提供一种表达重组抗原蛋白的饲养细胞,所述饲养细胞的表面表达可被效应细胞识别的所述重组抗原蛋白,从而激活所述效应细胞;所述饲养细胞为表达重组抗原蛋白的免疫细胞。
在一些实施方案中,所述效应细胞包括天然的或经过基因工程修饰的免疫细胞。进一步地,所述效应细胞包括天然的或经过基因工程修饰的T细胞、B细胞、NK细胞、巨噬细胞中的一种或多种。
在一些实施方案中,所述饲养细胞的表面表达可被scFv或纳米抗体识别的所述重组抗原蛋白,从而激活所述scFv或纳米抗体所在的T细胞、B细胞、NK细胞或巨噬细胞;所述T细胞、B细胞、NK细胞或巨噬细胞的表面表达含有所述scFv或纳米抗体的嵌合抗原受体或T细胞受体。即所述效应细胞为表面表达含有所述scFv或纳米抗体的嵌合抗原受体或T细胞受体的T细胞、B细胞、NK细胞或巨噬细胞。
在一些实施方案中,所述重组抗原蛋白包括CD19蛋白、CD20蛋白、CD22蛋白、CD30蛋白、CD33蛋白、CD38蛋白、CD123蛋白、CD7蛋白、CLL-1蛋白、BCMA蛋白、Trop2蛋白、Claudin18.2蛋白中的一种或多种。
在一些实施方案中,所述重组抗原蛋白为CD19蛋白或CD20蛋白;所述CD19抗原蛋白包含SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列;所述CD20抗原蛋白包含SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。
在一些实施方案中,所述免疫细胞包括T细胞、B细胞、NK细胞、巨噬细胞中的一种或多种。
在一个实施方案中,所述效应细胞表示天然的或经过基因工程修饰的T细胞、B细胞、NK细胞、巨噬细胞等免疫细胞中的一种或多种。在一个实施方案中,所述经过基因工程修饰的免疫细胞表示CAR-T、CAR-NK、TCR-T等。在一个实施方案中,所述CAR-T的细胞的靶点选自CD19、CD20、CD22、CD30、CD33、CD38、CD123、CD7、CLL-1、BCMA、Trop2、Claudin18.2等中的一种或多种。在一个实施方案中,所述靶点为抗原;所述抗原是CD19、CD20、CD22、CD30、CD33、CD38、CD123、CD7、CLL-1、BCMA、Trop2、Claudin18.2等。与所述抗原特异性结合的氨基酸序列在本领域已知,或者可以使用本领域已知的方法制备;例子包括免疫球蛋白、免疫球蛋白的可变区(例如,可变片段(Fv)或二价可变片段(Fab))、单链抗体等。
在一个实施方案中,所述CAR-T细胞的种类为一种或者多种;同一种CAR-T细胞指T细胞上的CAR完全相同。在一个实施方案中,所述CAR-T细胞为第一代CAR修饰的T细胞、第二代CAR修饰的T细胞、第三代CAR修饰的T细胞和/或第四代CAR修饰的T细胞。
在一个实施方案中,靶细胞为表达能够被效应细胞特异性识别的细胞,包括肿瘤细胞和饲养细胞。在一个实施方案中肿瘤靶细胞表示Raji、Jurkat、K562等肿瘤细胞系细胞或表达效应细胞特异性识别抗原的原代肿瘤细胞;在一个实施方案中,饲养细胞表示表达了效应细胞能特异性识别的抗原的T细胞、B细胞、NK细胞、巨噬细胞等免疫细胞中的一种或多种。
第二方面,本发明还提供上述表达重组抗原蛋白的饲养细胞的制备方法,包括以下步骤:
S1、分选PBMC获得所述免疫细胞;所述免疫细胞包括T细胞、B细胞、NK细胞、巨噬细胞中的一种或多种;
S2、用携带有编码所述重组抗原蛋白的核苷酸片段的表达载体感染所述步骤S1得到的免疫细胞,获得所述表达重组抗原蛋白的饲养细胞。
在一些实施方案中,所述表达载体为慢病毒表达载体、逆转录病毒表达载体、腺病毒表达载体、腺相关病毒表达载体或质粒。
在一些实施方案中,所述慢病毒表达载体包括:用于质粒复制的原核复制子pUCOri序列,如SEQ ID NO:3所示;用于目的菌株大量扩增的含氨苄青霉素抗性基因AmpR序列,如SEQ ID NO:4所示;用于增强真核细胞内的复制的病毒复制子SV40 Ori序列,如SEQ IDNO:5所示;用于慢病毒包装的慢病毒包装顺式元件;用于抗原蛋白基因的真核转录的人EF1α启动子(hEF1α),如SEQ ID NO:6所示;用于表达所述重组抗原蛋白的编码基因(比如用于表达CD19抗原蛋白的编码基因,如SEQ ID NO:7所示;用于表达CD20抗原蛋白的编码基因,如SEQ ID NO:8所示);用于增强转基因的表达效率的eWPRE(WPRE)增强型土拨鼠乙肝病毒转录后调控元件,如SEQ ID NO:9所示。
在一些实施方案中,所述用于表达所述重组抗原蛋白的编码基因包括:用于表达CD19抗原蛋白的编码基因,如SEQ ID NO:7所示;和/或用于表达CD20抗原蛋白的编码基因,如SEQ ID NO:8所示。
在一些实施方案中,所述慢病毒包装顺式元件采用第三代慢病毒载体包括:如SEQID NO:10所示的慢病毒5terminal LTR(5’LTR)、如SEQ ID NO:11所示的慢病毒3terminalSelf-Inactivating LTR(3’LTR)、如SEQ ID NO:12所示的Gag顺式元件、如SEQ ID NO:13所示的RRE顺式元件、如SEQ ID NO:14所示的env顺式元件、如SEQ ID NO:15所示的cPPT顺式元件所述慢病毒包装顺式元件,以及如SEQ ID NO:16所示的RSV启动子。
第三方面,本发明还提供所述的表达重组抗原蛋白的饲养细胞在制备治疗肿瘤药物方面的应用。
在一些实施方案中,所述治疗肿瘤药物的活性药物成分包括所述表达重组抗原蛋白的饲养细胞,以及识别所述表达重组抗原蛋白的效应细胞;所述识别所述表达重组抗原蛋白的效应细胞为含有所述scFv或纳米抗体的嵌合抗原受体或T细胞受体的T细胞、NK细胞或巨噬细胞。
在一些实施方案中,所述肿瘤为所述重组抗原蛋白阳性表达的肿瘤。
在一些实施方案中,所述肿瘤为血液恶性肿瘤。
在一些实施方案中,所述肿瘤为实体瘤。
在一些实施方案中,所述肿瘤包括B淋巴细胞白血病、B淋巴细胞淋巴瘤、大B细胞非霍奇金淋巴瘤、多发性骨髓瘤中的一种或多种。
在一些实施方案中,所述肿瘤为B-ALL。
在一些实施方案中,所述肿瘤包括肝癌、肺癌、胃癌、结肠癌、胰腺癌、乳腺癌、神经胶质肿瘤、黑色素瘤等中的一种或多种。
第四方面,本发明还提供所述的表达重组抗原蛋白的饲养细胞在制备预防CAR-T治疗CD19阳性B-ALL后出现抗原阳性复发药物方面的应用;所述重组抗原蛋白包括CD19蛋白。
第五方面,本发明还提供所述的表达重组抗原蛋白的饲养细胞在制备预防CAR-T治疗CD20阳性淋巴瘤后出现抗原阳性复发药物方面的应用;所述重组抗原蛋白包括CD20蛋白。
第六方面,本发明还提供一种表达重组抗原蛋白的复制缺陷性重组慢病毒转基因载体,为如前所述的慢病毒表达载体。
如本文所用,术语“T细胞”除非在具体实施时特别指明为某一类的T细胞外,应理解为是广义上的T细胞,即包括但不限于αβT细胞和/或γδT细胞,还包括一些非典型T细胞,例如自然杀伤T(NKT)细胞、粘膜相关不变T(Mucosal AssociatedInvariant T,MAIT)细胞、细胞因子诱导的杀伤细胞(Cytokine-Induced Killer,CIK)等。这些非典型T细胞也作为T淋巴细胞的效应类型。T细胞的来源也不限于外周血,包括脐带血、干细胞、IPSC、细胞系等分化诱导转化而来的细胞,及其T细胞分化而成的其他的细胞类型。αβT和γδT细胞是根据TCR类型不同对典型T细胞的分类。
如本文所用,术语“单链可变片段”(single-chain fragment variable,scFv)由轻链的可变区(VL)、重链的可变区(VH)以及linker组成,重链和轻链可变区均包括3个互补决定区(CDR1、CDR2、CDR3)和4个框架区(FR1、FR2、FR3、FR4)。可与抗原结合。
如本文所用,术语“抗原特异性”是指被抗原结合分子选择性地识别的特定抗原或其表位。术语“治疗”或“医治”或“缓解”或“改善”在本文中可互换使用,并且是指获得有益或所需的结果(包括但不限于治疗益处和/或预防益处)的方法。如本文中所用,治疗益处通常是指根除或减轻所治疗的潜在病症的严重性。此外,通过根除、减轻严重性或减少与潜在病症相关的一种或多种生理症状的发生率,以使得在动物中观察到改善(尽管动物仍然可能受到潜在病症折磨)来实现治疗益处。对于预防益处,可降低处于发展特定疾病风险中动物的发病风险。如本文中所用,术语“治疗作用”通常包括如上所述的治疗益处和/或预防益处。预防作用包括延迟或消除疾病或病况的出现,延迟或消除疾病或病况的症状的发作,减缓、停止或逆转疾病或病况的进展,或其任何组合。
如本文中所用,术语“细胞增殖”通常是指细胞数目由于分裂而改变的现象。例如,细胞增殖可导致细胞数目的增加。该术语还包括细胞形态通过其已发生改变(例如,尺寸增加)的细胞生长,其与增殖信号一致。如本文中所用,术语“增殖抑制”或“抑制细胞增殖”通常是指癌细胞的生长速率和/或增殖速率的降低。例如,这可包括癌细胞的死亡(例如通过凋亡)。在一些实施方案中,该术语还可指抑制实体瘤的生长和/或增殖和/或诱导肿瘤的尺寸减小或消除。
本申请使用的术语“受试者”或“个体”或“动物”或“患者”是指需要诊断、预后、缓解、预防和/或治疗疾病或病症的人或非人动物,包含哺乳动物或灵长类。哺乳类受试者包含人、畜养动物、农场动物,以及动物园、体育或宠物动物,如狗、猫、豚鼠、兔、大鼠、小鼠、马、猪、牛、熊等等。
如本文中所用,术语“体内”通常是指在动物体内发生的事件。
如本文中所用,术语“体外”通常是指发生在动物体外的事件。例如,体外细胞功能试验或任何动物体外测定。体外测定包括其中使用死细胞或活细胞的基于细胞的测定。体外测定还包括其中不使用完整细胞的无细胞测定。
如本文所用,术语“施用”是指将治疗有效量的包含本发明的重组蛋白或融合蛋白的药物组合物递送至受试者。施用可以全身施用也可以局部施用。施用可以通过施用装置进行,例如注射器。施用方式包括但不限于包埋、鼻吸、喷雾、注射等。施用途径包括吸入、鼻内、口服、静脉内、皮下或肌内施用等。
本发明解决了效应细胞在低肿瘤靶细胞数量条件下反应差的问题,提供了一种表达重组抗原蛋白的饲养细胞,使效应细胞在低肿瘤靶细胞数量条件下仍能发挥优异的抗肿瘤活性。该策略为首创性的细胞产品应用策略,是目前临床上尚未出现过的策略,也是首次提出的预防性策略,可预防CAR-T治疗CD19阳性B-ALL后出现抗原阳性复发、预防CAR-T治疗CD20阳性淋巴瘤后出现抗原阳性复发,以及根据本发明公开的原理的基础上本领域技术人员可以不通过创造性劳动知悉本发明的策略可预防其他疾病出现抗原阳性复发。
CAR-T治疗的本质是靶细胞上的特异性抗原对CAR-T细胞特异性激活后所引发的细胞免疫反应,因此靶细胞数量的多少,会对CAR-T细胞刺激的程度产生影响,从而影响产生的免疫反应的强烈程度。理论上,当靶细胞数量低至一定水平时,CAR-T细胞会出现反应效果差的现象。除CAR-T外,其他效应细胞(天然的或经过基因工程修饰的T细胞、B细胞、NK细胞、巨噬细胞等免疫细胞中的一种或多种)也同样存在类似问题。因此,本发明的饲养细胞旨在当肿瘤靶细胞(如Raji细胞等)数量较少时,能够代替肿瘤靶细胞充当靶细胞,调动效应细胞的活性,使其处于较好的激活状态,对靶细胞(肿瘤靶细胞和饲养细胞)进行有效地清除,达到深度清除肿瘤靶细胞的目的。
以下将结合附图对本发明的构思、具体结构及产生的技术效果作进一步说明,以充分地了解本发明的目的、特征和效果。
附图说明
图1是本发明的饲养细胞工作原理的结构示意图。
图2是质粒载体ssCART-19图谱。
图3是CD19-FTC质粒载体图谱。
图4是CD20-FTC质粒载体图谱。
图5是CD19-FTC质粒测序结果概览。
图6是CD20-FTC质粒测序结果概览。
图7是不同靶细胞刺激下抗CD19 CAR-T细胞的激活结果。
图8是不同靶细胞刺激下抗CD19 CAR-T细胞CFSE扩增结果。
图9是不同靶细胞刺激下抗CD20 CAR-T细胞CFSE扩增结果。
图10是抗CD19 CAR-T细胞流式杀伤结果图。
图11是抗CD20 CAR-T细胞流式杀伤结果图。
图12是不同靶细胞刺激下抗CD19 CAR-T细胞的CD107a杀伤结果。
图13是不同效靶比条件下显微镜观察细胞数量及状态图。
图14是不同效靶比条件下细胞状态结果。
图15是不同效靶比条件下抗CD19 CAR-T细胞亚型分布情况。
图16是不同效靶比条件下抗CD19 CAR-T细胞的耗竭情况。
图17是不同效靶比条件下抗CD19 CAR-T细胞的激活情况。
图18是不同效靶比条件下抗CD19 CAR-T细胞CFSE扩增结果。
图19是不同效靶比条件下抗CD20 CAR-T细胞CFSE扩增结果。
图20是不同效靶比条件下抗CD19 CAR-T细胞的CD107a杀伤结果。
图21是加入CD19-FTC后不同效靶比条件下显微镜观察细胞数量及状态图。
图22是加入CD19-FTC后不同效靶比条件下细胞状态结果。
图23是加入CD19-FCT后不同效靶比条件下抗CD19 CAR-T细胞亚型分布情况。
图24是加入CD19-FTC后抗CD19 CAR-T细胞的耗竭情况。
图25是加入CD19-FTC后不同效靶比条件下抗CD19 CAR-T细胞的激活情况。
图26是加入CD19-FTC后不同效靶比条件下抗CD19 CAR-T细胞的CFSE扩增结果。
图27是加入CD20-FTC后不同效靶比条件下抗CD20 CAR-T细胞CFSE扩增结果。注:右侧比例表示抗CD20 CAR-T细胞与Raji细胞的比例。不足1的部分全部由FTC补充,则除了Blank组以外,各组的抗CD20 CAR-T细胞与靶细胞(Raji+FTC)的比例均为1:1。
图28是加入CD19-FTC后不同效靶比条件下抗CD19 CAR-T细胞的CD107a杀伤结果。
图29是FTC小鼠活体成像荧光图。
具体实施方式
为了使发明实现的技术手段、创造特征、达成目的和功效易于明白了解,下结合具体图示,进一步阐述本发明。但本发明不仅限于以下实施的案例。
以下实施例用到的工具细胞有阴性对照T细胞(Negative Control T cell,NC-T,是与CAR-T相同来源的T细胞,未经过任何改造,用来作为CAR-T或者饲养T的阴性对照),Jurkat细胞和Raji细胞。其中NC-T来源于供者,是原代T细胞。其余细胞均购买自美国模式培养物集存库(ATCC)。
实施例1、饲养T细胞质粒载体构建
使用BamHI和EcoRI酶双切质粒载体ssCART-19(携带有完整编码抗CD19CAR的核苷酸序列,来自优卡迪)(图2),分别与CD19抗原蛋白序列进行无缝克隆,获得CD19-FTC的质粒载体(图3);与CD20抗原蛋白序列进行无缝克隆,获得CD20-FTC的质粒载体(图4)。并通过测序确认了载体构建成功(图5和图6)。
实施例2、饲养T细胞慢病毒载体制备
复苏工具细胞293T,培养细胞至数量达到可转染数量后,采用四质粒包装系统(三个包装质粒分别与实施例1中的质粒),使用钙转法将转染复合物转染至293T细胞内表达慢病毒载体颗粒并收集上清,然后通过纯化浓缩获得慢病毒载体。最后感染293T细胞并使用qPCR方法检测滴度。最终获得的CD19-FTC慢病毒载体滴度为3.77×109IU/ml,CD20-FTC慢病毒载体滴度为2.32×1010IU/ml。
实施例3、CAR-T细胞及饲养T细胞制备
CD19-FTC、CD20-FTC和CAR-T细胞的制备及实验研究流程一般分为以下几个部分:1)从病人(或健康供体)体内获取单采血;2)对单采血进行分离处理,获得外周血单个核细胞(Peripheral blood mononuclear cell,PBMC);3)分选PBMC获得T细胞;4)使用慢病毒载体感染T细胞,获得CD19-FTC或CD20-FTC或CAR-T;5)FTC或CAR-T的体外培养与扩增;6)FTC或CAR-T细胞的保存。
实施例4、饲养T细胞对效应细胞的激活和杀伤刺激效果研究
a)抗原特异性激活效应细胞
分别取足量NC-T细胞、抗CD19 CAR-T细胞、CD19-FTC细胞和Raji细胞于不同的离心管中,1500rpm,5min离心,弃上清,使用PBS洗涤细胞沉淀2遍。使用台盼蓝染色法进行细胞计数,并将细胞调整至所需密度。其中NC-T细胞和抗CD19 CAR-T细胞为效应细胞,CD19-FTC细胞和Raji细胞为靶细胞。取2组等量的抗CD19 CAR-T细胞,一组与CD19-FTC细胞共孵育,一组与Raji细胞共孵育。而每组抗CD19 CAR-T细胞再等量分成4份细胞,将效应细胞的CAR+细胞与靶细胞的CD19+细胞按效靶比为10:20、10:10、10:5、10:2.5进行共孵育,1mL孵育体系。共孵育18h后,使用CD25抗体标记细胞,并使用流式细胞术进行检测CAR-T细胞的CD25表达情况,用于表征CAR-T细胞被CD19抗原阳性靶细胞的激活程度。
将结果汇总分析后如图7所示,空白对照组(Blank组)的CD25表达在20%左右,相对较低的水平。而效靶比共孵育组相对于Blank组,CD25表达显著升高,且在相同效靶比的情况下,抗CD19 CAR-T细胞受Raji激活的程度与CD19-FTC基本一致,没有明显差异。PD-1的Blank组表达量不足5%,经Raji细胞刺激后表达量提高到30%左右,FTC刺激后表达量提高到20%左右,有明显的提高。但CD69的Raji细胞和FTC细胞刺激组与Blank组的结果相当,但CD19-FTC与Raji细胞的结果更为接近。说明在这些激活指标上,CD19-FTC对抗CD19 CAR-T细胞的激活效果与Raji细胞相当,可以作为靶细胞使用。Blank组以NC-T为研究对象。
b)CFSE细胞增殖检测
分别取足量NC-T细胞、抗CD19 CAR-T细胞、CD19-FTC细胞和Raji细胞于不同的离心管中,1500rpm,5min离心,弃上清,使用PBS洗涤细胞沉淀2遍。使用台盼蓝染色法进行细胞计数,将NC-T和抗CD19 CAR-T细胞调整密度至1×107个/mL,加入0.5nM浓度的共荧光增强液(Co-Fluorescence Enhancement Solution,CFES)后吹打混匀。将细胞置于37℃温度下避光孵育3-5min。孵育结束后加入染色终止液(5% FBS的PBS)终止染色。使用PBS洗涤细胞3次后,用实验培养基重悬计数,调整至所需密度。固定抗CD19 CAR-T细胞的CAR+数为1×105个,按效靶比为10:20、10:10、10:5、10:2.5的比例,将抗CD19 CAR-T细胞分别与CD19抗原阳性的靶细胞Raji和CD19-FTC共孵育,1mL孵育体系。分别在共孵育后1、3、5天取细胞,使用流式细胞仪检测抗CD19 CAR-T细胞的CFSE荧光强度,用以表征细胞增殖情况。CFSE荧光峰左移程度越大,细胞增殖代次越多。
分别取足量NC-T细胞、抗CD20 CAR-T细胞、CD20-FTC细胞和Raji细胞于不同的离心管中,1500rpm,5min离心,弃上清,使用PBS洗涤细胞沉淀2遍。使用台盼蓝染色法进行细胞计数,将NC-T和抗CD20 CAR-T细胞调整密度至1×107个/mL,加入0.5nM浓度的CFSE后吹打混匀。将细胞置于37℃温度下避光孵育3-5min。孵育结束后加入染色终止液(5% FBS的PBS)终止染色。使用PBS洗涤细胞3次后,用实验培养基重悬计数,调整至所需密度。固定抗CD20 CAR-T细胞的CAR+数为1×105个,按效靶比为1:1的比例,将抗CD20 CAR-T细胞分别与CD20抗原阳性的靶细胞Raji和CD20-FTC共孵育,1mL孵育体系。分别在共孵育后1、3、5天取细胞,使用流式细胞仪检测抗CD20 CAR-T细胞的CFSE荧光强度,用以表征细胞增殖情况。CFSE荧光峰左移程度越大,细胞增殖代次越多。
汇总抗CD19 CAR-T的CFSE结果如图8所示,Blank组(未加靶细胞组)的荧光峰在最右边,而其他共孵育组相比于Blank组,荧光峰均有不同程度的向左偏移,有增殖峰的出现。尤其是效靶(CD19-FTC)比在10:2.5以上,偏移程度更大,说明随着靶细胞的数量越多,抗CD19 CAR-T细胞受到CD19抗原刺激后增殖能力越强,同时也说明CD19-FTC可有效刺激抗CD19 CAR-T细胞进行增殖,效果与Raji细胞相当。
汇总抗CD20 CAR-T细胞的CFSE结果如图9所示,Blank组的荧光峰在最右边,而其他共孵育组相比于Blank组,荧光峰均有不同程度地向左偏移,有增殖峰的出现。并且CD20-FTC组左移程度与Raji组相当,说明CD20-FTC可有效刺激抗CD20 CAR-T细胞进行增殖,效果与Raji细胞相当。
c)流式杀伤检测
分别取足量NC-T细胞、抗CD19 CAR-T细胞、CD19-FTC细胞、Raji细胞和Jurkat细胞(人急性T淋巴细胞白血病细胞系,CD3阳性,对CD19阳性靶细胞无杀伤作用)于不同的离心管中,1500rpm,5min离心,弃上清,使用PBS洗涤细胞沉淀2遍。用台盼蓝染色法进行细胞计数,并将细胞调整至所需密度。固定抗CD19 CAR-T细胞数为5×104个,按效靶比为10:20、10:10、10:5、10:2.5将分别与靶细胞孵育,1mL孵育体系。共孵育18h后,使用CD19抗体标记各组细胞,使用流式细胞仪检测CD19+细胞比例。
分别取足量NC-T细胞、抗CD20 CAR-T细胞、CD20-FTC细胞、Raji细胞和Jurkat细胞(人急性T淋巴细胞白血病细胞系,CD3阳性,对CD20阳性靶细胞无杀伤作用)于不同的离心管中,1500rpm,5min离心,弃上清,使用PBS洗涤细胞沉淀2遍。用台盼蓝染色法进行细胞计数,并将细胞调整至所需密度。固定抗CD20 CAR-T细胞数为5×104个,按效靶比为1:1分别与肿瘤靶细胞和CD20-FTC孵育,1mL孵育体系。共孵育18h后,使用CD20抗体标记各组细胞,使用流式细胞仪检测CD20+细胞比例。
汇总抗CD19 CAR-T细胞的流式结果图10,NC-T的实验组与Jurkat的实验组结果基本一致,均随着靶细胞的比例增加,CD19+细胞百分比也在增加。说明NC-T对靶细胞并没有杀伤功能,与预期结果一致。而抗CD19 CAR-T细胞的实验组中CD19+细胞比例极低,即使效靶比为10:20的实验组中,CD19+细胞的比例也仅为3%左右,间接反映了抗CD19 CAR-T细胞能特异性识别CD19抗原阳性的靶细胞,且杀伤功能较强。
汇总抗CD20 CAR-T细胞的流式结果如图11,NC-T的实验组与Jurkat的实验组结果基本一致,均有很大一部分CD20+的靶细胞存在。说明NC-T对靶细胞并没有杀伤功能,与预期结果一致。而抗CD20 CAR-T细胞的实验组中CD20+细胞比例极低,无论靶细胞是Raji还是CD20-FTC,CD20+细胞的比例均<1%,间接反映了抗CD20 CAR-T细胞能特异性识别CD20抗原阳性的靶细胞,且杀伤功能较强。
d)CD107a
配制试剂:CD107a实验试剂:200μL孵育体系,stimulate cocktail(500×)每孔加0.4μL;Golgistop cocktail(500×)每孔加0.4μL。stimulate cocktail(500×)和Golgistop cocktail(500×)来自Invitrogen。
分别取足量NC-T细胞、抗CD19 CAR-T细胞、CD19-FTC细胞和Raji细胞于不同的离心管中,1500rpm,5min离心,弃上清,使用PBS洗涤细胞沉淀2遍。使用台盼蓝染色法进行细胞计数,并将细胞调整至所需密度。固定抗CD19CAR-T细胞数为2.5×104个,按效靶比为10:20、10:10、10:5、10:2.5的比例,分别与靶细胞共孵育,同时混合上述CD107a实验试剂,孵育体系为200μL。共孵育6h后,取各组细胞,使用PBS洗涤2次后,每组细胞中加入CD3-PE/CY7抗体(厂家是Biolegend)、Protein L-FITC(厂家是ACRO)和CD107a-APC抗体(厂家是BD)各1μL,4℃避光孵育45min后,再用PBS洗涤细胞2遍,于流式细胞仪上检测CD107a的表达。
汇总结果如图12,Blank组(未共孵育靶细胞的效应细胞)的CD107a表达量很低,基本没有。相比于Blank组,共孵育Raji的抗CD19 CAR-T细胞和共孵育FTC的抗CD19 CAR-T细胞均高表达CD107a,说明抗CD19 CAR-T细胞能特异性识别CD19抗原阳性的靶细胞,并杀伤靶细胞,同时说明FTC可作为靶细胞调动抗CD19 CAR-T细胞的杀伤功能对其进行杀伤。从结果上看,CD19-FTC的杀伤效果与Raji细胞有一定的差异,这可能与CD19-FTC表面CD19抗原表达丰度有关。
实施例5、效应细胞的激活和杀伤刺激的靶抗原细胞剂量依赖性研究
a)效应细胞与靶细胞共孵育培养部分
分别取足量的NC-T细胞、经带抗CD19 CAR慢病毒载体转导的T细胞(包含抗CD19CAR-T细胞和NC-T细胞,两者的比例根据转化的CAR-T细胞阳性率计算)和Raji细胞于不同的离心管中,1500rpm,5min离心,弃上清,使用PBS洗涤细胞沉淀2遍。用台盼蓝染色法进行细胞计数,并将细胞调整至所需密度。
分组规则:抗CD19 CAR-T细胞为效应细胞,Raji细胞为靶细胞。固定抗CD19 CAR-T细胞数,按效靶比为10:10、10:2.5、10:0.625、10:0.156、10:0.039、10:0.01和10:0.00的比例将抗CD19 CAR-T细胞分别与Raji细胞进行共孵育,每组控制孵育体系中总细胞量,用NC-T细胞进行填充,使每组细胞总量与10:10组的一致。另取一份经带抗CD19 CAR慢病毒载体转导的T细胞,使得其抗CD19 CAR-T细胞数目与效靶比中效应细胞数(即固定的抗CD19CAR-T细胞数)一样,作为Blank组。Blank组和10:0组对比,没有额外补充的NC-T细胞,可用于说明额外补充NC-T对CAR-T细胞是否存在影响(后续的实验结果表明无影响)。
分别取足量的NC-T细胞、抗CD20 CAR-T细胞和Raji细胞于不同的离心管中,1500rpm,5min离心,弃上清,使用PBS洗涤细胞沉淀2遍。用台盼蓝染色法进行细胞计数,并将细胞调整至所需密度。其中NC-T细胞和抗CD20CAR-T细胞为效应细胞,Raji细胞为靶细胞。固定抗CD20 CAR-T细胞数,按效靶比为1:1、1:0.1、1:0.01和10:0.001的比例分别与靶细胞进行共孵育,每组控制孵育体系中总细胞量,用NC-T细胞进行填充,使每组细胞总量与1:1组的一致。另取一份与效靶比中效应细胞数一样的抗CD20 CAR-T细胞作为Blank组。
b)细胞状态、活性和扩增的检测
共孵育后于第5天取出细胞,观察培养板中每组培养基颜色差异,并拍照记录。在倒置显微镜下仔细观察每组细胞数量和细胞状态的差异后,将细胞放入生物安全柜中。使用移液枪取每组细胞分别使用台盼蓝染色法进行细胞计数,并计算得到细胞数与细胞活率。
为了间接检测细胞扩增情况,共孵育后于第5天取每组培养基,分别点到葡萄糖试纸上,并用血糖仪检测培养基中葡萄糖的含量。检测培养基中的葡萄糖含量表征细胞生长过程中对培养基中营养物质的消耗从而反映细胞生长差异。
汇总孵育5天后各组细胞的照片如图13,经对比发现,在固定总细胞数一样的前提下,靶细胞比例越多的实验组中细胞状态越好,且细胞量也相对Blank组和10:0组的更多。体现了抗CD19 CAR-T细胞扩增对靶细胞数量的依赖性。
根据葡萄糖的消耗情况可以看出,随着效靶比降低,抗CD19 CAR-T细胞消耗葡萄糖的水平也在降低,反映出抗CD19 CAR-T细胞的生长状态存在对肿瘤靶细胞的剂量依赖性(图14A)。
从抗CD19 CAR-T细胞的扩增倍数数据可以看出其扩增情况存在明显的肿瘤靶细胞剂量依赖性(图14B)。
以上观察指标的结果,均能反映出抗CD19 CAR-T细胞扩增及细胞状态有明显的肿瘤靶细胞剂量依赖性。
c)T细胞分化及状态评估
在共孵育后的第三天进行T细胞亚型检测,包括耗竭指标,分化指标和调节T细胞(Treg细胞)。将每组细胞分别平均2份,每份约1×106个细胞,将一管标记为P1-效靶比,另一管标记为P2-效靶比。将所有细胞经1500rpm,3min离心后弃上清,每管加入1mL 1×PBS重悬细胞,使用相同离心条件离心清洗。重复洗涤细胞2次后,每管使用0.1mL的1x PBS重悬细胞沉淀,向所有组的P1管中加入1μL耦联了AF700荧光素的CD4抗体(试剂来源于eBioscience公司)、1μL耦联了APC-Cy7荧光素的CD8抗体(试剂来源于Biolegend公司)、2μL耦联了FITC荧光素的CD25抗体(试剂来源于Biolegend公司)、2μL耦联了PE-Cy7荧光素的CD127抗体(试剂来源于eBioscience公司)、2μL耦联了PerCP-Cy5.5荧光素的CD45RA抗体(试剂来源于Biolegend公司)和2μL耦联了PE荧光素的CCR7抗体(试剂来源于Biolegend公司),向所有组的P2管中加入1μL耦联了AF700荧光素的CD4抗体、1μL耦联了APC-Cy7荧光素的CD8抗体、2μL耦联了FITC荧光素的LAG3抗体(试剂来源于eBioscience公司)、2μL耦联了PE-Cy7荧光素的CTLA-4抗体(试剂来源于eBioscience公司)、2μL耦联了PerCP-Cy5.5荧光素的PD-1抗体(试剂来源于Biolegend公司)和2μL耦联了PE荧光素的TIM3抗体(试剂来源于BD公司),吹打混匀后于室温避光孵育20min。完成孵育后,使用1×PBS将每管细胞洗涤两次,并用流式细胞仪检测T细胞分化及其状态。
结果显示(如图15),Tscm、Tcm和Tem这几种T细胞亚型的分布情况未发现明显的靶细胞剂量依赖性。当效靶比大于10:0.625时,Teff和Treg亚型分布发生明显变化,其占比与Blank相当,表现出靶细胞剂量依赖性。
在细胞状态的数据图中(图16),CTLA-4、LAG3、PD-1和TIM3的表达量均表现出明显的靶细胞剂量依赖性。其中CTLA-4、LAG3和PD-1均在效靶比为10:0.625出现转折,当效靶比低于10:0.625时,CTLA-4、LAG3和PD-1的表达情况均与Blank组相当。TIM3也体现出了一定的靶细胞剂量依赖性,但趋势不及CTLA-4、LAG3和PD-1明显。
这些结果均表现出了抗CD19 CAR-T细胞行使功能的肿瘤靶细胞剂量依赖性。
d)抗原特异性激活效应细胞
在效应细胞与靶细胞共孵育18h后,取各组细胞于不同的离心管中,经1500rpm,3min离心后弃上清,每管加入1ml 1×PBS重悬细胞,使用相同离心条件离心清洗。重复洗涤细胞2次后,每管使用0.1mL的1×PBS重悬细胞沉淀,向每管中加入CD3、CD25、CD69、PD-1和Protein L抗体各1μL,吹打混匀后于室温避光孵育20min。完成孵育后,使用1×PBS将每管细胞洗涤两次,并用流式细胞仪检测抗CD19 CAR-T细胞的CD25,CD69以及PD-1的表达情况表征抗CD19 CAR-T细胞被CD19抗原阳性靶细胞的激活程度。
我们将抗CD19 CAR-T细胞与Raji细胞按不同效靶比共孵育,16h后检测CD25的表达情况,验证CD25表达与不同效靶比之间的关系。如图17结果显示,随着效靶比降低,CD25表达量也在降低,说明随着靶细胞数量降低,抗CD19 CAR-T细胞越不容易受到激活。甚至效靶比低至10:0.625以下时,CD25的表达量与效靶比为10:0组和Blank组基本一致,说明靶细胞低于10:0.156,抗CD19 CAR-T细胞不能被靶细胞激活或激活效果差。PD-1的结果与CD25的结果基本一致。CD69的结果虽未获得与Blank组同样的效果,但是整体趋势与CD25和PD-1一致,有明显的剂量依赖性。
总体来看,从CD25、PD-1和CD69的结果可以看出抗CD19 CAR-T细胞的激活情况有明显的靶细胞剂量依赖性。
e)CFSE细胞增殖检测
分别取足量NC-T细胞、经带抗CD19 CAR慢病毒载体转导的T细胞(包含抗CD19CAR-T细胞和NC-T细胞,两者的比例根据转化的CAR-T细胞阳性率计算)和Raji细胞于不同的离心管中,1500rpm,5min离心,弃上清,使用PBS洗涤细胞沉淀2遍。使用台盼蓝染色法进行细胞计数,将NC-T和抗CD19 CAR-T细胞调整密度至1×107个/mL,加入0.5nM浓度的CFSE后吹打混匀。将细胞置于37℃温度下避光孵育3-5min。孵育结束后加入染色终止液(5%FBS的PBS)终止染色。使用PBS洗涤细胞3次后,用实验培养基重悬计数,调整至所需密度。
按照实施例3的a)中的分组规则进行分组后,分别在共孵育1、3、5天取细胞,使用流式细胞术检测抗CD19 CAR-T细胞CFSE荧光强度,用以表征细胞增殖情况。CFSE荧光封左移程度越大,细胞增殖代次越多。
分别取足量NC-T细胞、经带抗CD20 CAR慢病毒载体转导的T细胞(包含抗CD20CAR-T细胞和NC-T细胞,两者的比例根据转化的CAR-T细胞阳性率计算)和Raji细胞于不同的离心管中,1500rpm,5min离心,弃上清,使用PBS洗涤细胞沉淀2遍。使用台盼蓝染色法进行细胞计数,将NC-T和抗CD20 CAR-T细胞调整密度至1×107个/mL,加入0.5nM浓度的CFSE后吹打混匀。将细胞置于37℃温度下避光孵育3-5min。孵育结束后加入染色终止液(5%FBS的PBS)终止染色。使用PBS洗涤细胞3次后,用实验培养基重悬计数,调整至所需密度。
固定抗CD20 CAR-T细胞数,按效靶比为1:1、1:0.1、1:0.01和1:0.001的比例分别与靶细胞(这里为Raji细胞)进行共孵育,每组控制孵育体系中总细胞量,用NC-T细胞进行填充,使每组细胞总量与1:1组的一致。另取一份经带抗CD20 CAR慢病毒载体转导的T细胞,使得其抗CD20 CAR-T细胞数目与效靶比固定的抗CD20 CAR-T细胞数一样,作为Blank组。分别在共孵育1、3、5天取细胞,使用流式细胞术检测抗CD20 CAR-T细胞CFSE荧光强度,用以表征细胞增殖情况。CFSE荧光封左移程度越大,细胞增殖代次越多。
实验结果显示(图18),效靶比大于10:0.156以上的抗CD19 CAR-T细胞均出现荧光峰左移的情况,效靶比为10:2.5的增殖峰最为明显。而效靶比低于10:0.156的荧光峰均与Blank组一致,无对应的增殖峰出现。说明效靶比大于10:0.156以上,靶细胞对能刺激抗CD19 CAR-T细胞,使抗CD19 CAR-T细胞有增殖能力。从CFSE的检测结果上也能体现出抗CD19 CAR-T细胞扩增的靶细胞剂量依赖性。
实验结果显示(图19),效靶比≥1:0.01时抗CD20 CAR-T细胞均出现荧光峰左移的情况。而效靶比低于1:0.1时的荧光峰均与Blank组一致,无对应的增殖峰出现。说明效靶比≥1:0.1,靶细胞对能刺激抗CD20 CAR-T细胞,使抗CD20 CAR-T细胞有增殖能力。从CFSE的检测结果上也能体现出抗CD20 CAR-T细胞扩增的靶细胞剂量依赖性。
f)CD107a
配制试剂:CD107a实验试剂:200μL孵育体系,stimulate cocktail(500×)每孔加0.4μL;Golgistop cocktail(500×)每孔加0.4μL;
分别取足量NC-T细胞、抗CD19 CAR-T细胞和Raji细胞于不同的离心管中,1500rpm,5min离心,弃上清,使用PBS洗涤细胞沉淀2遍。使用台盼蓝染色法进行细胞计数,并将细胞调整至所需密度。
固定抗CD19 CAR-T细胞数,按效靶比为10:10、10:2.5、10:0.625、10:0.156、10:0.039、10:0.01和10:0.00的比例分别与靶细胞进行共孵育,每组控制孵育体系中总细胞量,用NC-T细胞进行填充,使每组细胞总量与10:10组的一致。另取一份与效靶比中效应细胞数一样的抗CD19 CAR-T细胞作为Blank组。共孵育6h后使用流式细胞术进行检测CD3/CAR/CD107a的细胞比例。
将抗CD19 CAR-T细胞与不同数量的靶细胞共孵育培养6h后,通过流式检测细胞CD3+CAR+细胞表面上的CD107a表达水平。结果显示,效靶比为10:10组的CD107a表达量最高,有60%多,随着效靶比的降低,CD107a表达也随之降低。在效靶比低于10:0.039时,其CD107a表达与Blank组基本一致,说明效靶比低于10:0.039时,抗CD19 CAR-T细胞不能被靶细胞特异性刺激并启动杀伤功能,体现出了抗CD19 CAR-T细胞行使杀伤功能的靶细胞剂量依赖性(如图20)。
实施例6、饲养细胞对效应细胞的激活和杀伤刺激效果的增强效果研究
a)效应细胞与靶细胞共孵育培养部分
分别取足量的NC-T细胞、经带抗CD19 CAR慢病毒载体转导的T细胞(包含抗CD19CAR-T细胞和NC-T细胞,两者的比例根据转化的CAR-T细胞阳性率计算)、经带CD19慢病毒载体转导的T细胞(包含CD19-FTC细胞和NC-T细胞,两者的比例根据转化的FTC细胞阳性率计算)和Raji细胞于不同的离心管中,1500rpm,5min离心,弃上清,使用PBS洗涤细胞沉淀2遍。用台盼蓝染色法进行细胞计数,并将细胞调整至所需密度。其中抗CD19 CAR-T细胞为效应细胞,Raji细胞和CD19-FTC为靶细胞。固定抗CD19 CAR-T细胞数,按效靶比为10:10、10:2.5、10:0.625、10:0.156、10:0.039、10:0.01和10:0.00的比例分别与Raji靶细胞进行共孵育,同时补充CD19-FTC,使最终效靶比均为10:10。每组控制孵育体系中总细胞量,用NC-T细胞进行填充,使每组细胞总量与10:0.00组的一致。另取一份经带抗CD19 CAR慢病毒载体转导的T细胞,使得其抗CD19 CAR-T细胞数目与效靶比中效应细胞数一样,作为Blank组。
分别取足量的NC-T细胞、经带抗CD20 CAR慢病毒载体转导的T细胞(包含抗CD20CAR-T细胞和NC-T细胞,两者的比例根据转化的CAR-T细胞阳性率计算)、经带CD20慢病毒载体转导的T细胞(包含CD20-FTC细胞和NC-T细胞,两者的比例根据转化的FTC细胞阳性率计算)和Raji细胞于不同的离心管中,1500rpm,5min离心,弃上清,使用PBS洗涤细胞沉淀2遍。用台盼蓝染色法进行细胞计数,并将细胞调整至所需密度。抗CD20 CAR-T细胞为效应细胞,Raji细胞和CD20-FTC为靶细胞。固定抗CD20 CAR-T细胞数,按效靶比为1:1、1:0.1、1:0.01和1:0.001的比例将抗CD20 CAR-T细胞分别与Raji靶细胞进行共孵育,同时补充CD20-FTC,使最终效靶比均为1:1。每组控制孵育体系中总细胞量,用NC-T细胞进行填充,使每组细胞总量与1:0.001组的一致。另取一份经带抗CD20 CAR慢病毒载体转导的T细胞,使得其抗CD20CAR-T细胞数目与效靶比中效应细胞数(即固定的抗CD20 CAR-T细胞数)一样,作为Blank组。
b)细胞状态、活性和扩增的检测
共孵育后于第5天取出细胞,观察培养板中每组培养基颜色差异,并拍照记录。在倒置显微镜下仔细观察每组细胞数量和细胞状态的差异后,将细胞放入生物安全柜中。使用移液枪取每组细胞分别使用台盼蓝染色法进行细胞计数,并计算得到细胞数与细胞活率。
为了间接检测细胞扩增情况,共孵育后于第5天取每组培养基,分别点到葡萄糖试纸上,并用血糖仪检测培养基中葡萄糖的含量。检测培养基中的葡萄糖含量表征细胞生长过程中对培养基中营养物质的消耗从而反映细胞生长差异。
汇总孵育5天后各组细胞的照片(图21),经对比发现,在固定总细胞数一样的前提下,不同效靶比组的细胞状态相比于Blank组都很好,细胞形态均一,且有成团细胞,而Blank组细胞状态较差,有明显的死细胞,且细胞量也很少。说明在缺少肿瘤靶细胞Raji细胞的情况下,CD19-FTC能够代替肿瘤靶细胞刺激抗CD19 CAR-T细胞增殖,并且获得了与效靶比10:10组相当的增殖效果。
根据葡萄糖浓度结果(图22A)可以看出加入CD19-FTC后,各效靶比组葡萄糖消耗水平相当,消耗量均大于Blank组,说明各效靶比组抗CD19 CAR-T细胞生长状态相近。
根据抗CD19 CAR-T细胞的扩增倍数数据可以看出(图22B),虽然加入CD19-FTC后不同效靶比实验组的抗CD19 CAR-T细胞的扩增倍数存在波动,但是均高于Blank组,说明在CD19-FTC的作用下,即使是在不同的肿瘤靶细胞剂量下,抗CD19 CAR-T细胞都能够有效扩增。
综上,说明CD19-FTC可以在肿瘤靶细胞剂量较低的情况下,依然能够有效地刺激抗CD19 CAR-T细胞进行增殖,可明显增强抗CD19 CAR-T细胞在低肿瘤细胞数量条件下的增殖能力。
c)T细胞分化及状态评估
在共孵育后的第三天进行T细胞亚型检测,包括耗竭指标,分化指标和调节T细胞(Treg细胞)。将每组细胞分别平均2份,每份约1×106个细胞,将一管标记为P1-效靶比,另一管标记为P2-效靶比。将所有细胞经1500rpm,3min离心后弃上清,每管加入1mL 1×PBS重悬细胞,使用相同离心条件离心清洗。重复洗涤细胞2次后,每管使用0.1mL的1×PBS重悬细胞沉淀,向所有组的P1管中加入1μL耦联了AF700荧光素的CD4抗体、1μL耦联了APC-Cy7荧光素的CD8抗体、1μL耦联了FITC荧光素的CD25抗体、1μL耦联了PE-Cy7荧光素的CD127抗体、1μL耦联了PerCP-Cy5.5荧光素的CD45RA抗体和1μL耦联了PE荧光素的CCR7抗体,向所有组的P2管中加入1μL耦联了AF700荧光素的CD4抗体、1μL耦联了APC-Cy7荧光素的CD8抗体、1μL耦联了FITC荧光素的LAG3抗体、1μL耦联了PE-Cy7荧光素的CTLA-4抗体、1μL耦联了PerCP-Cy5.5荧光素的PD-1抗体和1μL耦联了PE荧光素的TIM3抗体,吹打混匀后于室温避光孵育20min。完成孵育后,使用1×PBS将每管细胞洗涤两次,并用流式细胞仪检测T细胞分化及其状态。
抗CD19 CAR-T细胞的亚型分布情况和耗竭情况并不对CD19-FTC敏感(图23和图24),说明CD19-FTC在激活抗CD19 CAR-T细胞使其行使杀伤功能的同时,并不会像肿瘤靶细胞一样容易使其耗竭,进而从侧面反映出CD19-FTC对抗CD19 CAR-T细胞的激活和杀伤刺激效果的增强作用。
d)抗原特异性激活效应细胞
在效应细胞与靶细胞共孵育18h后,取各组细胞于不同的离心管中,经1500rpm,3min离心后弃上清,每管加入1mL 1×PBS重悬细胞,使用相同离心条件离心清洗。重复洗涤细胞2次后,每管使用0.1mL的1×PBS重悬细胞沉淀,向每管中加入CD3、CD25、CD69、PD-1和Protein L抗体各1μL,吹打混匀后于室温避光孵育20min。完成孵育后,使用1×PBS将每管细胞洗涤两次,并用流式细胞仪检测抗CD19 CAR-T细胞的CD25,CD69以及PD-1的表达情况表征抗CD19 CAR-T细胞被CD19抗原阳性靶细胞的激活程度。
如图25显示,所有不同组效靶比的CD25和CD69表达量基本一致,尤其是10:0组(靶细胞只有CD19-FTC细胞)和10:10组(靶细胞只有Raji细胞)结果基本一致,与靶细胞剂量依赖性实验章节结果形成鲜明对比。说明CD19-FTC能够在效靶比较低的情况下,有效激活抗CD19 CAR-T细胞,并且能够达到效靶比10:10组的效果。PD-1的结果略有不同,除了效靶比10:10组比较高以外,所有加入CD19-FTC的实验组均低于效靶比10:10组,且相互之间基本一致,但都明显高于Blank组。对于此结果,猜测PD-1的表达可能不仅与抗CD19 CAR-T细胞激活有关,还与耗竭相关,即Raji细胞作为肿瘤靶细胞,能够使抗CD19 CAR-T细胞在与其接触后出现耗竭的状态,而CD19-FTC由于是原代的正常细胞,不存在使抗CD19 CAR-T细胞耗竭的能力,因此在激活抗CD19 CAR-T细胞的同时,不会使其PD-1表达量过高。同时也从侧面反映了CD19-FTC作为靶细胞替代肿瘤靶细胞刺激抗CD19 CAR-T细胞的优势。
通过本实验,证明了CD19-FTC可以显著增强抗CD19 CAR-T细胞在肿瘤细胞数量较少情况下的激活状态。
e)CFSE细胞增殖检测
分别取足量NC-T细胞、抗CD19 CAR-T细胞、CD19-FTC细胞和Raji细胞于不同的离心管中,1500rpm,5min离心,弃上清,使用PBS洗涤细胞沉淀2遍。使用台盼蓝染色法进行细胞计数,将NC-T和抗CD19 CAR-T细胞调整密度至1×107个/mL,加入0.5nM浓度的CFSE后吹打混匀。将细胞置于37℃温度下避光孵育3-5min。孵育结束后加入染色终止液(5% FBS的PBS)终止染色。使用PBS洗涤细胞3次后,用实验培养基重悬计数,调整至所需密度。
固定抗CD19 CAR-T细胞数,按效靶比为10:10、10:2.5、10:0.625、10:0.156、10:0.039、10:0.01和10:0.00的比例分别与Raji靶细胞进行共孵育,同时补充CD19-FTC,使最终效靶比均为10:10。每组控制孵育体系中总细胞量,用NC-T细胞进行填充,使每组细胞总量与10:10组的一致。另取一份与效靶比中效应细胞数一样的抗CD19 CAR-T细胞作为Blank组。分别在共孵育1、3、5天取细胞,使用流式细胞术检测CAR-T细胞CFSE荧光强度,用以表征细胞增殖情况。CFSE荧光封左移程度越大,细胞增殖代次越多。
分别取足量NC-T细胞、抗CD20 CAR-T细胞、CD20-FTC细胞和Raji细胞于不同的离心管中,1500rpm,5min离心,弃上清,使用PBS洗涤细胞沉淀2遍。使用台盼蓝染色法进行细胞计数,将NC-T和抗CD20 CAR-T细胞调整密度至1×107个/mL,加入0.5nM浓度的CFSE后吹打混匀。将细胞置于37℃温度下避光孵育3-5min。孵育结束后加入染色终止液(5% FBS的PBS)终止染色。使用PBS洗涤细胞3次后,用实验培养基重悬计数,调整至所需密度。
固定抗CD20 CAR-T细胞数,按效靶比为1:1、1:0.1、1:0.01和1:0.001的比例分别与Raji靶细胞进行共孵育,同时补充CD20-FTC,使最终效靶比均为1:1。每组控制孵育体系中总细胞量,用NC-T细胞进行填充,使每组细胞总量与1:1组的一致。另取一份与效靶比中效应细胞数一样的抗CD20 CAR-T细胞作为Blank组。分别在共孵育1、3、5天取细胞,使用流式细胞术检测CAR-T细胞CFSE荧光强度,用以表征细胞增殖情况。CFSE荧光封左移程度越大,细胞增殖代次越多。
实验结果显示(图26),抗CD19 CAR-T细胞与靶细胞共孵育的实验组相比于Blank组均出现了荧光峰左移的情况,均有增殖峰。且其他效靶比的增殖峰位置与10:10基本一致,尤其是10:0组(靶细胞只有CD19-FTC细胞)和10:10组(靶细胞只有Raji细胞)结果基本一致,与靶细胞剂量依赖性实验章节结果形成了鲜明对比。说明CD19-FTC细胞能够特异性激活抗CD19 CAR-T细胞,其促使抗CD19 CAR-T细胞增殖的能力与Raji细胞基本一致。说明CD19-FTC可以显著增强抗CD19 CAR-T细胞在肿瘤靶细胞较少的情况下的增殖能力。
实验结果显示(图27),抗CD20 CAR-T细胞与靶细胞共孵育的实验组相比于Blank组均出现了荧光峰左移的情况,均有增殖峰。且其他效靶比的增殖峰位置与1:1基本一致,尤其是1:0.001组(靶细胞几乎都是CD20-FTC细胞)和1:1组(靶细胞只有Raji细胞)结果基本一致,与靶细胞剂量依赖性实验章节结果形成了鲜明对比(图19)。说明CD20-FTC细胞能够特异性激活抗CD20 CAR-T细胞,其促使抗CD20 CAR-T细胞增殖的能力与Raji细胞基本一致。说明CD20-FTC可以显著增强抗CD20 CAR-T细胞在肿瘤靶细胞较少的情况下的增殖能力。
f)CD107a
配制试剂:CD107a实验试剂:200μL孵育体系,stimulate cocktail(500×)每孔加0.4μL;Golgistop cocktail(500×)每孔加0.4μL;
分别取足量NC-T细胞、抗CD19 CAR-T细胞、FTC细胞和Raji细胞于不同的离心管中,1500rpm,5min离心,弃上清,使用PBS洗涤细胞沉淀2遍。使用台盼蓝染色法进行细胞计数,并将细胞调整至所需密度。
固定抗CD19 CAR-T细胞数,按效靶比为10:10、10:2.5、10:0.625、10:0.156、10:0.039、10:0.01和10:0.00的比例分别与Raji靶细胞进行共孵育,同时补充FTC,使最终效靶比均为10:10。每组控制孵育体系中总细胞量,用NC-T细胞进行填充,使每组细胞总量与10:10组的一致。另取一份与效靶比中效应细胞数一样的抗CD19 CAR-T细胞作为Blank组。共孵育6h后使用流式细胞术进行检测CD3/CAR/CD107a的细胞比例。
根据结果显示(图28),所有不同组效靶比的CD107a表达量基本一致,尤其是10:0组(靶细胞只有CD19-FTC细胞)和10:10组(靶细胞只有Raji细胞)结果一致,与靶细胞剂量依赖性实验章节结果形成鲜明对比。说明FTC能够在肿瘤靶细胞剂量较低的情况下,调动抗CD19 CAR-T细胞的杀伤能力,使其对靶细胞(CD19-FTC或Raji细胞)进行有效杀伤。提示,在MRD情况下,FTC有望调动抗CD19 CAR-T细胞的杀伤能力,使其对MRD级别的肿瘤细胞进行深度清除。
实施例7、饲养细胞体内研究
本研究选用B-NDG(NOD-Prkdcscid IL2rgtm1/Bcgen)小鼠,该品系小鼠缺乏成熟的T、B和NK细胞,免疫缺陷程度高,比较适合进行人源细胞或组织的研究。肿瘤细胞系选择人B淋巴细胞肿瘤细胞系Raji细胞。该细胞表面高表达多种肿瘤相关抗原,包括CD19、CD20等,适合用于CD19-FTC和CD20-FTC体内研究模型建立。该细胞来源于ATCC。
通过MRD模型摸索,确定MRD条件下CAR-T失效的动物模型,并开展CD19-FTC和CD20-FCT的体内研究。MRD条件下CAR-T失效模型造模后第1天(D1)尾静脉注射单次给药。按照5.0×104个CD19-FTC/只、1.0×105个CD19-FTC/只、2.0×105个CD19-FTC/只、5.0×104个CD20-FTC/只的剂量给小鼠回输FTC。给药体积200μL/只。采用活体成像法评估小鼠存活情况。具体操作如下述。
活体成像法:静脉注射Raji-Luc细胞后使用活体成像仪对注射后小鼠体内荧光素光强及分布进行检测,检测步骤如下:1)每只动物在检测前经腹腔注射3mg荧光素(给药体积为100μL/只),等待5分钟后经后异氟烷吸入麻醉;2)注射荧光素9分钟后将动物放入活体成像仪的箱体内,并在9至19分钟内自动曝光成像,检测荧光强度;3)成像及拍照结束后,记录荧光强度。
结果见图29,当无FTC时,小鼠在第35天观察是已经死亡;当给予5.0×104个CD19-FTC/只、1.0×105个CD19-FTC/只、2.0×105个CD19-FTC/只或5.0×104个CD20-FTC/只时,小鼠生存效果得到了显著改善。从体内研究结果可以看出,无论是CD19-FTC还是CD20-FTC,只要在FTC存在的条件下,均可以有效防止肿瘤的复发。
以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解,本领域的普通技术无需创造性劳动就可以根据本发明的构思作出诸多修改和变化。因此,凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案,皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。
Claims (12)
1.一种表达重组抗原蛋白的饲养细胞,其特征在于,所述饲养细胞的表面表达可被效应细胞识别的所述重组抗原蛋白,从而激活所述效应细胞;所述饲养细胞为表达重组抗原蛋白的免疫细胞。
2.根据权利要求1所述的表达重组抗原蛋白的饲养细胞,其特征在于,所述饲养细胞的表面表达可被scFv或纳米抗体识别的所述重组抗原蛋白,从而激活所述scFv或纳米抗体所在的T细胞、B细胞、NK细胞或巨噬细胞;所述T细胞、B细胞、NK细胞或巨噬细胞的表面表达含有所述scFv或纳米抗体的嵌合抗原受体或T细胞受体。
3.根据权利要求1所述的表达重组抗原蛋白的饲养细胞,其特征在于,所述重组抗原蛋白包括CD19蛋白、CD20蛋白、CD22蛋白、CD30蛋白、CD33蛋白、CD38蛋白、CD123蛋白、CD7蛋白、CLL-1蛋白、BCMA蛋白、Trop2蛋白、Claudin18.2蛋白中的一种或多种。
4.根据权利要求3所述的表达重组抗原蛋白的饲养细胞,其特征在于,所述重组抗原蛋白为CD19蛋白或CD20蛋白;所述CD19抗原蛋白包含SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列;所述CD20抗原蛋白包含SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。
5.根据权利要求1所述的表达重组抗原蛋白的饲养细胞,其特征在于,所述免疫细胞包括T细胞、B细胞、NK细胞、巨噬细胞中的一种或多种。
6.根据权利要求1-5任一项所述的表达重组抗原蛋白的饲养细胞的制备方法,其特征在于,包括以下步骤:
S1、分选PBMC获得所述免疫细胞;所述免疫细胞包括T细胞、B细胞、NK细胞、巨噬细胞中的一种或多种;
S2、用携带有编码所述重组抗原蛋白的核苷酸片段的表达载体感染所述步骤S1得到的免疫细胞,获得所述表达重组抗原蛋白的饲养细胞。
7.根据权利要求6所述的制备方法,其特征在于,所述表达载体为慢病毒表达载体、逆转录病毒表达载体、腺病毒表达载体、腺相关病毒表达载体或质粒。
8.根据权利要求7所述的制备方法,其特征在于,所述慢病毒表达载体包括:用于质粒复制的原核复制子pUC Ori序列,如SEQ ID NO:3所示;用于目的菌株大量扩增的含氨苄青霉素抗性基因AmpR序列,如SEQ ID NO:4所示;用于增强真核细胞内的复制的病毒复制子SV40 Ori序列,如SEQ ID NO:5所示;用于慢病毒包装的慢病毒包装顺式元件;用于抗原蛋白基因的真核转录的人EF1α启动子,如SEQ ID NO:6所示;用于表达所述重组抗原蛋白的编码基因;用于增强转基因的表达效率的eWPRE增强型土拨鼠乙肝病毒转录后调控元件,如SEQ ID NO:9所示。
9.根据权利要求8所述的制备方法,其特征在于,所述慢病毒包装顺式元件采用第三代慢病毒载体包括:如SEQ ID NO:10所示的慢病毒5terminal LTR、如SEQ ID NO:11所示的慢病毒3terminal Self-Inactivating LTR、如SEQ ID NO:12所示的Gag顺式元件、如SEQ IDNO:13所示的RRE顺式元件、如SEQ ID NO:14所示的env顺式元件、如SEQ ID NO:15所示的cPPT顺式元件所述慢病毒包装顺式元件,以及如SEQ ID NO:16所示的RSV启动子。
10.根据权利要求1-5任一项所述的表达重组抗原蛋白的饲养细胞在制备治疗肿瘤药物方面的应用。
11.根据权利要求10所述的应用,其特征在于,所述治疗肿瘤药物的活性药物成分包括所述表达重组抗原蛋白的饲养细胞,以及识别所述表达重组抗原蛋白的效应细胞;所述识别所述表达重组抗原蛋白的效应细胞为含有所述scFv或纳米抗体的嵌合抗原受体或T细胞受体的T细胞、NK细胞或巨噬细胞。
12.一种表达重组抗原蛋白的复制缺陷性重组慢病毒转基因载体,其特征在于,为根据权利要求8或9所述的慢病毒表达载体。
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