KR20190101979A - 합성 면역 수용체 및 이의 사용 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 합성 면역 수용체 (SIR), SIR을 인코딩하는 핵산, SIR을 제조하는 방법 및 예를 들면 입양 세포요법에서 이를 사용하는 방법을 제공한다.
Description
관련 출원에 대한 교차 참조
본 출원은 본원에 이들의 발명이 참고문헌으로 통합되는, 2016년 12월 2일자로 제출된 미국 특허출원 일련번호 62/429,619 및 2016년 12월 2일자로 제출된 미국 가특허출원 62/429,597에 대한 우선권을 35 U.S.C. §119 하에 주장하고 있다.
기술분야
본 발명은 합성 면역 수용체 (SIR) 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드, 발현 구조물 및 합성 면역 수용체 (SIR)를 발현하도록 조작된 면역 효과기 세포 (예로, T 세포, NKT 세포) 및 줄기 세포의 용도에 관한 것이다. 본 발명은 또한 이에 제한되는 것은 아니지만, 암, 감염성 질환, 알레르기 질환, 자가면역 질환, 퇴행성 질환 또는 상기의 조합을 포함하는 질환 및 장애를 치료하는데 이러한 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드, 발현 구조물 및 재조합 세포를 사용하는 방법을 제공한다.
서열 목록의 참고문헌으로의 통합
본 출원은 2017년 12월 2일자로 작성되고, IBM-PC, MS-윈도우 작동 시스템 상에서 포맷팅된 기계, 데이타의 77,085,242 바이트를 갖는 "Sequence_ST25.txt"라고 명명된 서열 목록을 첨부하고 있다.
면역 세포를 활성화하여 종양을 선택적으로 인식하고 파괴하는 전략, 즉 암 면역요법은 암 요법에 대한 강력한 접근법을 제공한다. 종양-특이적 T 세포 및 키메라 항원 수용체 (CAR) 변형된 T 세포 (CAR-T 세포)를 사용한 면역요법은 전이암을 갖는 일부 환자에서 지속가능하고 완벽한 질환의 퇴행을 매개한다.
CAR-T 세포로의 성공에도 불구하고, 이러한 접근법에는 여러 제한이 존재한다. 조작된 CAR-T 세포에 반응하는 대부분의 환자에서, 전염증성 사이토카인의 과다 방출은 열, 고혈압, 저혈압, 심장 기능장애, 신부전 및 전해질 이상을 포함하는, 종합적으로 "사이토카인 방출 증후군 (CRS)"라고 명명된 증상을 유발한다. 일부 경우에, CAR 요법은 진전, 간질을 포함한 신경학적 증상을 유발할 수 있고, 치명적일 수 있다. CRS에 대항하는 전략은 면역억제제 및 사이토카인에 대한 항체로의 치료를 포함하여 사이토카인 방출을 차단한다.
또한, 성공적인 암 면역요법의 가장 중요한 도전 하나는 유전적으로 변형된 T 세포가 전달 이후에 수 개월 동안 유지되는 것이다. 이것은 CAT 유전자로 변형된 T 세포의 경우에 더 큰 도전인 것으로 입증되어 왔다.
보조자극 도메인 CD28 또는 41BB을 포함하도록 CAR 구조물의 최근 분자적 조작은 개선된 유지를 유도하였다. 그러나, CAR 구조물에서 보조자극 도메인의 포함은 수용체를 통한 비-생리학적 신호전달을 유도한다. 일부 CAR은 긴장성 항원-비의존성 신호전달을 나타내고, 이는 제한되지 않는 세포 활성화를 야기하고, 궁극적으로 세포사멸, 동족체 항원과는 독립적인 과다 사이토카인 방출 및 면역학적 소모를 유발한다. CD28 및 CD3z 일렬 신호전달 도메인을 포함하는 일부 CAR의 발현은 열등한 생체내 효능과 관련된 형질전환된 원발성 인간 T 세포의 기본 구성 (constitutive) 활성화 및 증식을 유도한다 (Frigault et al., 2015). 연속적인 T-세포 증식을 갖는 CAR 표현형을 유도하는 것으로 밝혀진 기작 하나는 세포 표면에서 CAR의 높은 밀도이었다 (Frigault et al., 2015).
T 세포 수용체 (TCR)는 T 세포의 표면 상에서 발현된다. 인간에서, 이들 수용체는 인간 백혈구 항원 (HLA) 분자 및 항원성 펩티드 사이에 형성된 복합체를 인식한다. 이들 펩티드의 인식은 T 세포의 면역 기능의 활성화를 유도한다.
대부분의 T 세포에서, TCR은 알파 (α) 및 베타 (β) 사슬의 이종이량체이다. β사슬은 두 개의 이소형: Cβ2 (인간 T 세포의 80%) 및 Cβ1 (인간 T 세포의 20%)을 갖는다. TCR의 각각의 사슬은 N-말단 면역글로불린 (Ig)-유사 가변 (V) 도메인 및 Ig-유사 불변 (C) 도메인을 포함하고, 이는 다시 막통과 영역 및 C-말단에서 짧은 세포질 미단을 포함한다.
본 발명은 적어도 하나의 합성 면역 수용체 (SIR)를 인코딩하는 적어도 하나의 재조합 폴리뉴클레오티드를 제공하고, 적어도 하나의 SIR은 (a) (i) 서열번호 3010과 적어도 98% 동일하고, 48, 61, 91, 92, 93, 및/또는 94번 위치에서 하나 이상의 돌연변이를 갖으며, 조건부 부속 모듈을 포함할 수 있는 아미노산 서열; (ii) 서열번호 3024와 적어도 98% 동일하고, 18, 22, 57, 79, 133, 136 및/또는 139번 위치에서 하나 이상의 돌연변이를 갖으며, 조건부 부속 모듈을 포함할 수 있는 아미노산 서열; (iii) 서열번호 3025와 적어도 98% 동일하고, 18, 22, 57, 79, 133, 136 및/또는 139번 위치에서 하나 이상의 돌연변이를 갖으며, 조건부 부속 모듈을 포함할 수 있는 아미노산 서열; (iv) 서열번호 3046, 3047 또는 3048과 적어도 98% 동일하고, 조건부 부속 모듈을 포함할 수 있는 아미노산 서열; (v) 서열번호 3049와 적어도 98% 동일하고, 조건부 부속 모듈을 포함할 수 있는 아미노산 서열; (vi) 서열번호 3051 또는 3052와 적어도 98% 동일하고, 조건부 부속 모듈을 포함할 수 있는 아미노산 서열; 및 (vii) (i) 및 (ii), (i) 및 (iii), (iv) 및 (ii), (iv) 및 (iii), 그리고 (v) 및 (vi)로부터 선택된 두 개의 TCR 불변 사슬의 이량체 조합:으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 T 세포 수용체 (TCR) 불변 사슬; (b) 조건부 링커: 및 (c) (1) 항체; (2) 항체 단편 (예로, Fv, Fab, (Fab')2); (3) 항체 (vH 도메인) 또는 이의 단편의 중쇄 가변 영역; (4) 항체 (vL 도메인) 또는 이의 단편의 경쇄 가변 영역; (5) 단일 사슬 가변 단편 (scFv) 또는 이의 단편; (6) 단일 도메인 항체 (SDAB) 또는 이의 단편; (7) 카멜리드 VHH 도메인 또는 이의 단편; (8) 항체의 단량체 가변 영역; (9) 다르핀 (DARPIN), 어피바디, 어필린, 어드넥틴, 어피틴, 오바디, 레페바디, 파이노머, 알파바디, 어비머, 아트리머, 센티린, 프로넥틴, 안티칼린, 쿠니츠 도메인, 아미딜로 반복서열 단백질 또는 이들의 단편과 같은 비-면역글로불린 항원 결합 스캐폴드; (10) 수용체 또는 이의 단편; (11) 리간드 또는 이의 단편; (12) 이중특이적 -항체, -항체 단편, -scFV, -vHH, -SDAB, -비-면역글로불린 항원 결합 스캐폴드, -수용체 또는 -리간드; 및 (13) 자가항원 또는 이의 단편:으로 이루어진 군으로부터 선택된 (a)에 연결된 하나 이상의 비-천연 TCR 항원 결합 도메인(들)을 포함하고, (a)(i) 내지 (a)(iii)의 돌연변이 및 (a)(vii)의 이량체는 항원 결합 도메인의 표적 도메인에 대한 다양한 결합 친화도를 제공하고, 이는 동일한 결합 도메인을 갖는 cTCR의 결합 친화도보다 적어도 5% 더 높고, 합성 면역 수용체가 림프구에서 발현 시, 하나 이상의 연속적 사슬로 항원 결합 도메인 및 T 세포 수용체 불변 사슬 둘 다를 림프구의 표면 상에 발현하여, 발현된 항원 결합 도메인이 이의 항원에 결합할 때 림프구가 활성화하고/거나, 증식하고/거나, 사이토카인을 분비하고/거나, 표적 세포의 살상을 조정 (유도 또는 억압)하도록 촉발되고, MHC-제한 및 MHC-비-제한된 항체-유형 특이성을 갖는다. (a)(vii)의 TCR 불변 사슬을 포함하는 일 구현예에서, 비-천연 TCR 결합 도메인은 발현될 때 항체 또는 이의 단편의 하나의 중쇄 및 경쇄가 상기 T 세포 불변 영역의 상기 (a)(vii)의 두 개 사슬 중 하나에 부착되고, 항체 또는 이의 단편의 나머지의 중쇄 및 경쇄는 T 세포 불변 영역의 두 개 사슬 중 나머지에 부착되도록, 사전 정의된 표적 항원에 특이적인 항체 또는 이의 단편의 중쇄 및 경쇄의 가변 영역; 발현될 때 scFv 중 하나가 상기 T 세포 불변 영역의 상기 (a)(vii)의 두 개 사슬 중 하나에 부착되고, scFv 중 나머지는 상기 T 세포 불변 영역의 상기 두 개 사슬 중 나머지에 부착되도록, 하나 이상의 사전 정의된 표적 항원에 특이적인 두 개의 단일 사슬 가변 단편 (scFv); 발현될 때 항체 단편 중 하나가 상기 T 세포 불변 영역의 상기 (a)(vii)의 두 개 사슬 중 하나에 부착되고, 항체 단편 중 나머지는 상기 T 세포 불변 영역의 상기 두 개 사슬 중 나머지에 부착되도록, 하나 이상의 사전 정의된 표적 항원에 특이적인 두 개의 항체 단편; 발현될 때 SDAB 단편 중 하나가 상기 T 세포 불변 영역의 상기 (a)(vii)의 두 개 사슬 중 하나에 부착되고, SDAB 단편 중 나머지는 상기 T 세포 불변 영역의 상기 두 개 사슬 중 나머지에 부착되도록, 하나 이상의 사전 정의된 표적 항원에 특이적인 두 개의 단일 도메인 항체 (SDAB); 발현될 때 vHH 도메인 중 하나가 상기 T 세포 불변 영역의 상기 (a)(vii)의 두 개 사슬 중 하나에 부착되고, vHH 도메인 중 나머지는 상기 T 세포 불변 영역의 상기 두 개 사슬 중 나머지에 부착되도록, 하나 이상의 사전 정의된 표적 항원에 특이적인 두 개의 카멜리드 vHH 도메인; 발현될 때 비-면역글로불린 항원 결합 스캐폴드 중 하나가 상기 T 세포 불변 영역의 상기 (a)(vii)의 두 개 사슬 중 하나에 부착되고, 비-면역글로불린 항원 결합 스캐폴드 중 나머지는 상기 T 세포 불변 영역의 상기 두 개 사슬 중 나머지에 부착되도록, 하나 이상의 사전 정의된 표적 항원에 특이적인 두 개의 비-면역글로불린 항원 결합 스캐폴드; 발현될 때 수용체 또는 이의 단편 중 하나가 상기 T 세포 불변 영역의 상기 (a)(vii)의 두 개 사슬 중 하나에 부착되고, 수용체 또는 이의 단편의 나머지는 상기 T 세포 불변 영역의 상기 두 개 사슬 중 나머지에 부착되도록, 하나 이상의 사전 정의된 표적 항원에 특이적인 두 개의 수용체 또는 이의 단편; 발현될 때 리간드 또는 이의 단편 중 하나가 상기 T 세포 불변 영역의 상기 (a)(vii)의 두 개 사슬 중 하나에 부착되고, 리간드 또는 이의 단편의 나머지는 상기 T 세포 불변 영역의 상기 두 개 사슬 중 나머지에 부착되도록, 하나 이상의 사전 정의된 표적 항원에 특이적인 두 개의 리간드 또는 이의 단편; 발현될 때 항원 결합 단편 중 하나가 상기 T 세포 불변 영역의 상기 (a)(vii)의 두 개 사슬 중 하나에 부착되고, 항원 결합 단편의 나머지는 상기 T 세포 불변 영역의 상기 두 개 사슬 중 나머지에 부착되도록, 하나 이상의 사전 정의된 표적 항원에 특이적인 두 개의 구조적으로 구별된 항원 결합 단편; 발현될 때 항원 결합 단편 중 하나가 상기 T 세포 불변 영역의 상기 (a)(vii)의 두 개 사슬 중 하나에 부착되고, 항원 결합 단편의 나머지는 상기 T 세포 불변 영역의 상기 두 개 사슬 중 나머지에 부착되도록, 하나 또는 둘 다가 이중특이적 또는 다중특이적인 두 개의 결합 단편; 발현될 때 자가항원 또는 이의 단편 중 하나가 상기 T 세포 불변 영역의 상기 (a)(vii)의 두 개 사슬 중 하나에 부착되고, 자가항원 또는 이의 단편의 나머지는 상기 T 세포 불변 영역의 상기 두 개 사슬 중 나머지에 부착되도록, 두 개의 자가항원 또는 이의 단편; 발현될 때 vL 또는 이의 단편 중 하나가 상기 T 세포 불변 영역의 상기 (a)(vii)의 두 개 사슬 중 하나에 부착되고, vL 또는 이의 단편의 나머지는 상기 T 세포 불변 영역의 상기 두 개 사슬 중 나머지에 부착되도록, 두 개의 vL 또는 이의 단편; 및 발현될 때 vH 또는 이의 단편 중 하나가 상기 T 세포 불변 영역의 상기 (a)(vii)의 두 개 사슬 중 하나에 부착되고, vH 또는 이의 단편의 나머지는 상기 T 세포 불변 영역의 상기 두 개 사슬 중 나머지에 부착되도록, 두 개의 vH 또는 이의 단편으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 임의의 전술한 발명의 또 다른 또는 추가의 구현예에서, (a)(iv)의 TCR 불변 사슬은, 사전 정의된 표적 항원에 특이적인 항체 또는 이의 단편의 중쇄 (vH)의 가변 영역; 사전 정의된 표적 항원에 특이적인 항체 또는 이의 단편의 경쇄 (vL)의 가변 영역; 사전 정의된 표적 항원에 특이적인 단일 사슬 가변 단편 (scFv) 또는 이의 단편; 사전 정의된 표적 항원에 특이적인 항체 단편 (예로, Fv, Fab, (Fab')2); 사전 정의된 표적 항원에 특이적인 단일 도메인 항체 (SDAB); 사전 정의된 표적 항원에 특이적인 카멜리드 vHH 도메인; 사전 정의된 표적 항원에 특이적인 비-면역글로불린 항원 결합 스캐폴드; 사전 정의된 표적 항원에 특이적인 수용체 또는 이의 단편; 사전 정의된 표적 항원에 특이적인 리간드 또는 이의 단편; 하나 이상의 사전 정의된 표적 항원에 특이적인 이중특이적 -항체, -항체 단편, -scFV, -vHH, -SDAB, -비-면역글로불린 항원 결합 스캐폴드, -수용체 또는 -리간드; 및 자가항원 또는 이의 단편으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 비-천연 TCR 결합 도메인을 갖는다. 또한 또 다른 구현예에서, (i), (ii), (iii), (iv), (v) 또는 (vi)을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드는 사전 정의된 표적 항원에 특이적인 항체 또는 이의 단편의 중쇄 (vH)의 가변 영역; 사전 정의된 표적 항원에 특이적인 항체 또는 이의 단편의 경쇄 (vL)의 가변 영역; 사전 정의된 표적 항원에 특이적인 단일 사슬 가변 단편 (scFv) 또는 이의 단편; 사전 정의된 표적 항원에 특이적인 항체 단편 (예로, Fv, Fab, (Fab')2); 사전 정의된 표적 항원에 특이적인 단일 도메인 항체 (SDAB); 사전 정의된 표적 항원에 특이적인 카멜리드 vHH 도메인; 사전 정의된 표적 항원에 특이적인 비-면역글로불린 항원 결합 스캐폴드; 사전 정의된 표적 항원에 특이적인 수용체 또는 이의 단편; 사전 정의된 표적 항원에 특이적인 리간드 또는 이의 단편; 하나 이상의 사전 정의된 표적 항원에 특이적인 이중특이적 -항체, -항체 단편, -scFV, -vHH, -SDAB, -비-면역글로불린 항원 결합 스캐폴드, -수용체 또는 -리간드; 및 자가항원 또는 이의 단편으로 이루어진 군으로부터 선택되는 비-천연 TCR 결합 도메인을 갖는다. 임의의 전술한 발명의 또 다른 또는 추가의 구현예에서, TCR 불변 사슬을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드는 코돈-최적화된 서열이다. 임의의 전술한 발명의 또 다른 또는 추가의 구현예에서, TCR 불변 사슬을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드는 TCR 불변 사슬의 발현 및/또는 쌍 형성을 증진하고, 이들의 내인성 세포 수용체 사슬과의 쌍 형성을 감소시키는 돌연변이를 포함하는 TCR 불변 사슬(들)을 인코딩한다. 임의의 전술한 발명의 또 다른 또는 추가의 구현예에서, (a)의 TCR 불변 사슬을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 730 내지 743의 핵산 서열의 1 내지 40개 변형의 핵산 서열 또는 서열번호 730 내지 743의 핵산 서열과 적어도 70% 동일성을 갖는 서열을 포함하고, TCRβ1 또는 TCRβ2 사슬과 이중합할 수 있다. 임의의 전술한 발명의 또 다른 또는 추가의 구현예에서, (b) 또는 (c)의 TCR 불변 사슬을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 744 내지 765의 핵산 서열의 1 내지 40개 변형의 핵산 서열 또는 서열번호 744 내지 765의 핵산 서열과 적어도 70% 동일성을 갖는 서열을 포함하고, TCRα 사슬과 이중합할 수 있다. 임의의 전술한 발명의 또 다른 또는 추가의 구현예에서, (b) 또는 (c)의 TCR 불변 사슬을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 744 내지 765의 핵산 서열의 1 내지 40개 변형의 핵산 서열 또는 서열번호 744 내지 765의 핵산 서열과 적어도 70% 동일성을 갖는 서열을 포함하고, TCRα 사슬과 이중합할 수 있다. 임의의 전술한 발명의 또 다른 또는 추가의 구현예에서, (v)의 TCR 불변 사슬을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 769 또는 770의 핵산 서열의 1 내지 40개 변형의 핵산 서열 또는 서열번호 769 또는 770의 핵산 서열과 적어도 70% 동일성을 갖는 서열을 포함하고, TCRδ 사슬과 이중합할 수 있다. 임의의 전술한 발명의 또 다른 또는 추가의 구현예에서, (vi)의 TCR 불변 사슬을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 771 또는 772의 핵산 서열의 1 내지 40개 변형의 핵산 서열 또는 서열번호 771 또는 772의 핵산 서열과 적어도 70% 동일성을 갖는 서열을 포함하고, TCRγ 사슬과 이중합할 수 있다. 임의의 전술한 발명의 또 다른 또는 추가의 구현예에서, (a)의 TCR 불변 사슬을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 766 내지 768의 핵산 서열의 1 내지 40개 변형의 핵산 서열 또는 서열번호 766 내지 768의 핵산 서열과 적어도 70% 동일성을 갖는 서열을 포함하고, TCRβ1 또는 TCRβ2 사슬과 이중합할 수 있다. 임의의 전술한 발명의 또 다른 또는 추가의 구현예에서, 상기 하나 이상의 비-천연 항원 결합 도메인(들)은 CD19; CD123; CD22; CD30; CD171; CS-1 (CD2 하위집합 1, CRACC, SLAMF7, CD319 및 19A24라고도 지칭됨); C형 렉틴-유사 분자-1 (CLL-1 또는 CLECL1); CD33; 표피 성장인자 수용체 변이체 Ⅲ (EGFRvⅢ); 갱글리오시드 G2 (GD2); 갱글리오시드 GD3 (aNeu5Ac(2-8)aNeu5Ac(2-3)bDGalp(l-4)bDGlcp(l-l)Cer); TNF 수용체 패밀리 구성원 B 세포 성숙 (BCMA); Tn 항원 ((Tn Ag) 또는 (GalNAcα-Ser/Thr)); 전립선-특이적 막 항원 (PSMA); 수용체 타이로신 키나제-유사 고아 수용체 1 (ROR1); Fms 유사 타이로신 키나제 3 (FLT3); 종양-관련 당당백질 72 (TAG72); CD38; CD44v6; 급성 백혈병 또는 림프종 상에서 발현되지만 조혈 전구세포 상에서는 발현되지 않는 글리코실화된 CD43 에피토프; 비-조혈성 암 상에서 발현된 글리코실화된 CD43 에피토프; 암배아 항원 (CEA); 상피세포 부착 분자 (EPCAM); B7H3 (CD276); KIT (CD117); 인터루킨-13 수용체 소단위체 알파-2 (IL-13Ra2 또는 CD213A2); 메소틸린; 인터루킨 11 수용체 알파 (IL-llRa); 전립선 줄기 세포 항원 (PSCA); 프로테아제 세린 21 (테스티신 또는 PRSS21); 혈관 내피 성장인자 수용체 2 (VEGFR2); 루이스 (Y) 항원; CD24; 혈소판-유래 성장인자 수용체 베타 (PDGFR-베타); 단계-특이적 배아 항원-4 (SSEA-4); CD20; 폴레이트 수용체 알파; 수용체 타이로신-단백질 키나제 ERBB2 (Her2/neu); 세포 표면 연관된 뮤신 1 (MUC1); 상피 성장인자 수용체 (EGFR); 신경 세포 부착 분자 (NCAM); 프로스타제; 전립샘 산 포스파타제 (PAP); 변이된 신장인자 2 (ELF2M); 에프린 B2; 섬유모세포 활성화 단백질 알파 (FAP); 인슐린-유사 성장인자 1 수용체 (IGF-I 수용체); 탄산 무수화제 Ⅸ (CAⅨ); 프로테오좀 (프로좀, 마크로페인) 소단위체 베타형, 9 (LMP2); 당단백질 100 (gpl00); 절단점 클러스터 영역 (BCR)으로 구성된 종양원 유전자 융합 단백질 및 아벨슨 마우스 백혈병 바이러스 종양원 유전자 상동체 1 (Abl) (bcr-abl); 티로시나제; 에프린 A형 수용체 2 (EphA2); 퓨코실 GM1; 시아릴 루이스 부착 분자 (sLe); 갱글리오시드 GM3 (aNeu5Ac(2-3)bDClalp(l-4)bDGlcp(l-1)Cer); 글루타민 전이효소 5 (TGS5); 고분자량 흑색종 관련된 항원 (HMWMAA); o-아세틸-GD2 갱글리오시드 (OAcGD2); 종양 내피 마커 1 (TEM1/CD248); 관련된 종양 내피 마커 7 (TEM7R); 클라우딘 6 (CLDN6); 갑상샘 자극호르몬 수용체 (TSHR); G 단백질 연결된 수용체 클래스 C 그룹 5, 구성원 D (GPRC5D); 염색체 X 오픈 리딩 프레임 61 (CXORF61); CD97; CD179a; 역형성 림프종 키나제 (ALK); 폴리시알산; 태반-특이적 항원 1 (PLAC1); 글로보H 글리코세라미드의 육당질 부분 (글로보H); 유샘 분화 항원 (NY-BR-1); 유로플라킨 2 (UPK2); A형 간염 바이러스 세포 수용체 1 (HAVCR1); 아드레노셉터 베타 3 (ADRB3); 패넥신 3 (PANX3); G 단백질-연결된 수용체 20 (GPR20); 림프구 항원 6 복합체, 좌위 K 9 (LY6K); 후각 수용체 51E2 (OR51E2); TCR 감마 교대 리딩 프레임 단백질 (TARP); 윌름 종양 단백질 (WT1); 암/고환 항원 1 (NY-ES0-1); 암/고환 항원 2 (LAGE-1a); 흑색종-관련 항원 1 (MAGE-A1); 염색체 12p 상에 위치한 ETS 전위 변이체 유전자 6 (ETV6-AML); 정자 단백질 17 (SPA17); X 항원 패밀리, 구성원 lA (XAGEl); 안지오포이에틴-결합 세포 표면 수용체 2 (타이 2); 흑색종 암 고환 항원-1 (MAD-CT-1); 흑색종 암 고환 항원-2 (MAD-CT-2); Fos-관련된 항원 1; 종양 단백질 p53 (p53); p53 돌연변이체; 프로스테인; 서바이빈; 텔로머라제; 전립선 암종 종양 항원-1 (PCT A-1 또는 갈렉틴 8); T 세포에 의해 인식되는 흑색종 항원 1 (MelanA 또는 MARTI); 래트 육종 (Ras) 돌연변이체; 인간 텔로머라제 역전사효소 (hTERT); 육종 전위 절단점; 흑색종의 세포사멸 저해제 (ML-IAP); ERG (막통과 프로테아제, 세린 2 (TMPRSS2) ETS 융합 유전자); N-아세틸 글루코사미닐-전이효소 V (NA17); 쌍 형성된 박스 단백질 Pax-3 (PAX3); 안드로겐 수용체; 사이클린 Bl; v-myc 조류 백혈병 바이러스 종양원 유전자 신경모세포종 유래된 상동체 (MYCN); Ras 상동체 패밀리 구성원 C (RhoC); 티로시나제-관련 단백질 2 (TRP-2); 사이토크롬 P450 lB 1 (CYPlB 1); CCCTC-결합 인자 (아연 핑거 단백질)-유사 (BORIS 또는 각인 부위의 조절인자의 형제), T 세포에 의해 인식되는 편평세포 암종 항원 3 (SART3); 쌍 형성된 박스 단백질 Pax-5 (PAX5); 프로아크로신 결합 단백질 sp32 (OY-TESl); 림프구-특이적 단백질 타이로신 키나제 (LCK); 키나제 고정 단백질 4 (AKAP-4); 활액 육종 X 절단점 2 (SSX2); 진행된 당화 말단 산물의 수용체 (RAGE-1); 신장 유비퀴터스 1 (RUl); 신장 유비퀴터스 2 (RU2); 레구마인; 인간 파필로마 바이러스 E6 (HPV E6); 인간 파필로마 바이러스 E7 (HPV E7); 장내 카르복실 에스테라제; 변이된 열 충격 단백질 70-2 (hsp70-2); CD79a; CD79b; CD72; 백혈구-관련된 면역글로불린-유사 수용체 1 (LAIRl); IgA 수용체의 Fc 단편 (FCAR 또는 CD89); 백혈구 면역글로불린-유사 수용체 서브패밀리 A 구성원 2 (LILRA2); CD300 분자-유사 패밀리 구성원 f (CD300LF); C형 렉틴 도메인 패밀리 12 구성원 A (CLEC12A); 골수 간질 세포 항원 2 (BST2); EGF-유사 모듈-포함 뮤신-유사 호르몬 수용체-유사 항원 2 (EMR2); 림프구 항원 75 (LY75); 글리피칸-3 (GPC3); Fc 수용체-유사 5 (FCRL5); 면역글로불린 람다-유사 폴리펩티드 1 (IGLLl); MPL; 바이오틴; c-MYC 에피토프 태그; CD34; LAMP1; TROP2;, GFRα4; CDH17; CDH6; NYBR1; CDH19; CD200R; Slea (CA19.9; 시아릴 루이스 항원); 퓨코실-GM1; PTK7; gpNMB; CDH1-CD324; DLL3; CD276/B7H3; IL-11Ra; IL-13Ra2; CD179b-IGLl1; ALK TCRγ-δ; NKG2D; CD32 (FCGR2A); Tn 항원; CSPG4-HMW-MAA; Tim1-/HVCR1; CSF2RA (GM-CSFR-알파); TGFβR2; VEGFR2/KDR; 루이스 항원; TCR-β1 사슬; TCR-β2 사슬, TCR-γ 사슬, TCR-δ 사슬; FITC; 황체형성 호르몬 수용체 (LHR); 난포 자극 호르몬 수용체 (FSHR); 융모생식샘 자극호르몬 수용체 (CGHR); CCR4; GD3; SLAMF6; SLAMF4; HIV1 외투 당단백질; HTLV1-Tax; CMV pp65; EBV-EBNA3c; 인플루엔자 A 헤마글루티닌 (HA); GAD; PDL1; 구아니릴 사이클라제 C (GCC); KSHV-K8.1 단백질; KSHV-gH 단백질; 데스모글레인 3 (Dsg3)에 대한 자가항체; 데스모글레인 1 (Dsg1)에 대한 자가항체; HLA, HLA-A, HLA-A2, HLA-B, HLA-C, HLA-DP, HLA-DM, HLA-DOA, HLA-DOB, HLA-DQ, HLA-DR, HLA-G; IGE; CD99; RAS; G12V; 조직 인자 1 (TF1); AFP; GPRC5D; 클라우딘18.2 (CLD18A2 또는 CLDN18A.2)); P-당단백질; STEAP1; LIV1; 넥틴-4; CRIPTO; GPA33; BST1/CD157; 저전도도 염화물 통로; 및 TNT 항체에 의해 인식되는 항원으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 질환 관련 항원에 결합한다. 임의의 전술한 발명의 또 다른 또는 추가의 구현예에서, 상기 하나 이상의 비-천연 TCR 항원 결합 도메인(들)은 항체, 항체 단편, scFv, Fv, Fab, (Fab')2, 단일 도메인 항체 (SDAB), vH 또는 vL 도메인, 카멜리드 VHH 도메인, 다르핀, 어피바디, 어필린, 어드넥틴, 어피틴, 오바디, 레페바디, 파이노머, 알파바디, 어비머, 아트리머, 센티린, 프로넥틴, 안티칼린, 쿠니츠 도메인, 아미딜로 반복서열 단백질과 같은 비-면역글로불린 항원 결합 스캐폴드, 수용체 또는 리간드를 포함한다. 임의의 전술한 발명의 또 다른 또는 추가의 구현예에서, 상기 하나 이상의 비-천연 TCR 항원 결합 도메인(들)은 (i) 서열번호 226 내지 400 또는 10203 내지 10321 중 어느 하나의 서열 또는 이와 적어도 98% 동일성을 갖고, 이의 항원에 결합하는 폴리펩티드를 인코딩하는 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드에 의해 인코딩되는, 중쇄 가변 영역 (vH); (ii) 서열번호 16 내지 191 또는 10085 내지 10202 중 어느 하나의 서열 또는 이와 적어도 98% 동일성을 갖고, 이의 항원에 결합하는 폴리펩티드를 인코딩하는 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드에 의해 인코딩되는, 경쇄 가변 영역 (vL); (iii) 서열번호 488 657, 10346 내지 10400 또는 18098 내지 18160 중 어느 하나의 서열 또는 이와 적어도 98% 동일성을 갖고, 이의 항원에 결합하는 폴리펩티드를 인코딩하는 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드에 의해 인코딩되는, 단일 사슬 가변 단편 (scFv); (iv) 서열번호 421 내지 445 또는 10322 내지 10337 중 어느 하나의 서열 또는 이와 적어도 98% 동일성을 갖고, 이의 항원에 결합하는 폴리펩티드를 인코딩하는 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드에 의해 인코딩되는, 카멜리드 VHH 도메인; (v) 서열번호 439 내지 443 중 어느 하나의 서열 또는 이와 적어도 98% 동일성을 갖고, 이의 항원에 결합하는 폴리펩티드를 인코딩하는 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드에 의해 인코딩되는, 비-면역글로불린 스캐폴드; (vi) 서열번호 456 내지 468 중 어느 하나의 서열 또는 이와 적어도 98% 동일성을 갖고, 이의 동족체에 결합하는 폴리펩티드를 인코딩하는 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드에 의해 인코딩되는, 수용체; 및 (vii) 서열번호 476 내지 486 또는 10402 내지 10404 중 어느 하나의 서열 또는 이와 적어도 98% 동일성을 갖고, 이의 동족체에 결합하는 폴리펩티드를 인코딩하는 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드에 의해 인코딩되는, 리간드로 이루어진 군으로부터 선택된다. 임의의 전술한 발명의 또 다른 또는 추가의 구현예에서, 상기 하나 이상의 비-천연 TCR 항원 결합 도메인(들)은 임의의 서열번호 13999 내지 14879 또는 14880에 나타낸 바와 같은 선택된 표적 항원에 대한 하나 이상의 경쇄 상보성 결정 영역 및/또는 임의의 서열번호 14881 내지 15761 또는 15762에 나타낸 바와 같은 선택된 표적 항원에 대한 하나 이상의 중쇄 상보성 결정 영역을 포함한다. 임의의 전술한 발명의 또 다른 또는 추가의 구현예에서, 상기 하나 이상의 비-천연 TCR 항원 결합 도메인(들)은 최대 10개의 보존적 아미노산 치환을 갖는 임의의 서열번호 2307 내지 2482 또는 12042 내지 12159의 서열을 포함하는 가변 경쇄 (vL) 도메인 및/또는 최대 10개의 보존적 아미노산 치환을 갖는 임의의 서열번호 2506 내지 2580 또는 12160 내지 12278의 서열을 포함하는 가변 중쇄 (vH) 도메인을 포함한다. 임의의 전술한 발명의 또 다른 또는 추가의 구현예에서, 상기 하나 이상의 비-천연 TCR 항원 결합 도메인(들)은 최대 10개의 보존적 아미노산 치환을 갖는 임의의 서열번호 2701 내지 2725 또는 12279 내지 12294에 나타낸 바와 같은 선택된 항원에 대한 하나 이상의 카멜리드 vHH 상보성 결정 영역을 포함한다. 임의의 전술한 발명의 또 다른 또는 추가의 구현예에서, 상기 하나 이상의 비-천연 TCR 항원 결합 도메인(들)은 임의의 서열번호 2728 내지 2732 또는 12296 내지 12301에 나타낸 바와 같은 서열을 갖고, 최대 10개의 보존적 아미노산 치환을 갖는 비-면역글로불린 항원 결합 도메인을 포함한다. 임의의 전술한 발명의 또 다른 또는 추가의 구현예에서, 상기 하나 이상의 비-천연 TCR 항원 결합 도메인(들)은 서열번호 2307 내지 2482 또는 12042 내지 12159 중 어느 하나의 서열을 포함하는 하나 이상의 경쇄 상보성 결정 영역 (vL) 도메인 및/또는 서열번호 2506 내지 2680 또는 12160 내지 12278의 서열을 포함하는 하나 이상의 중쇄 상보성 결정 영역 (vH) 도메인을 포함한다. 임의의 전술한 발명의 또 다른 또는 추가의 구현예에서, 상기 하나 이상의 비-천연 TCR 항원 결합 도메인(들)은 각각이 최대 10개의 보존적 아미노산 치환을 갖는 서열번호 2770 내지 2939, 12303 내지 12357 또는 18162 내지 18224로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 갖는 scFv 단편을 포함한다. 임의의 전술한 발명의 또 다른 또는 추가의 구현예에서, 상기 하나 이상의 비-천연 TCR 항원 결합 도메인(들)은 각각이 최대 10개의 보존적 아미노산 치환을 갖는 임의의 서열번호 2736 내지 2748의 아미노산 서열을 포함하는 하나 이상의 수용체를 포함한다. 임의의 전술한 발명의 또 다른 또는 추가의 구현예에서, 상기 하나 이상의 비-천연 TCR 항원 결합 도메인(들)은 최대 10개의 보존적 아미노산 치환을 갖는 임의의 서열번호 2758 내지 2768 또는 12359 내지 12361의 서열을 포함하는 하나 이상의 수용체를 포함한다. 임의의 전술한 발명의 또 다른 또는 추가의 구현예에서, 상기 하나 이상의 비-천연 TCR 항원 결합 도메인(들)은 CD16A, NKG2D, CD4, PD1, 데스모글레인 3 (Dsg3) 또는 CD4-DC-SIGN의 세포외 도메인을 포함한다. 임의의 전술한 발명의 또 다른 또는 추가의 구현예에서, 상기 하나 이상의 비-천연 TCR 항원 결합 도메인(들)은 hTPO, mTPO, CGHα 사슬, CGHβ 사슬, FHβ 사슬, LHβ 사슬, TSHβ 사슬, APRIL 또는 이들의 조합 중 하나 이상의 세포외 도메인을 포함한다. 임의의 전술한 발명의 또 다른 또는 추가의 구현예에서, 상기 하나 이상의 비-천연 TCR 항원 결합 도메인(들)은 임의의 서열번호 2770 내지 2939, 12303 내지 12357 또는 18162 내지 18224의 서열을 포함하고, 최대 10개의 보존적 아미노산 치환을 갖는 임의의 단일 사슬 가변 단편 (scFv), 및 (a) 최대 10개의 보존적 아미노산 치환을 갖는 임의의 서열번호 2701 내지 2725 또는 12279 내지 12294에 나타낸 바와 같은 임의의 카멜리드 vHH; 또는 (b) 임의의 서열번호 2728 내지 2732 또는 12296 내지 12301에 나타낸 바와 같은 서열을 갖고, 최대 10개의 보존적 아미노산 치환을 갖는 임의의 비-면역글로불린 항원 결합 도메인; 또는 (c) 최대 10개의 보존적 아미노산 치환을 갖는 임의의 서열번호 2736 내지 2748의 아미노산 서열을 포함하는 수용체의 임의의 세포외 도메인; 또는 (d) 최대 10개의 보존적 아미노산 치환을 갖는 임의의 서열번호 2758 내지 2768 또는 12359 내지 12361의 서열을 포함하는 리간드의 임의의 세포외 도메인을 포함한다. 임의의 전술한 발명의 또 다른 또는 추가의 구현예에서, 상기 하나 이상의 비-천연 TCR 항원 결합 도메인(들)은 최대 10개의 보존적 아미노산 치환을 갖는 임의의 서열번호 2701 내지 2725 또는 12279 내지 12294에 나타낸 바와 같은 카멜리드 vHH 및 (a) 임의의 서열번호 2770 내지 2939, 12303 내지 12357 또는 18162 내지 18224의 서열을 포함하고, 최대 10개의 보존적 아미노산 치환을 갖는 임의의 단일 사슬 가변 단편 (scFv); 또는 (b) 임의의 서열번호 2728 내지 2732 또는 12296 내지 12301에 나타낸 바와 같은 서열을 갖고, 최대 10개의 보존적 아미노산 치환을 갖는 임의의 비-면역글로불린 항원 결합 도메인; 또는 (c) 최대 10개의 보존적 아미노산 치환을 갖는 임의의 서열번호 2736 내지 2748의 아미노산 서열을 포함하는 수용체의 임의의 세포외 도메인; 또는 (d) 최대 10개의 보존적 아미노산 치환을 갖는 임의의 서열번호 2758 내지 2768 또는 12359 내지 12361의 서열을 포함하는 리간드의 임의의 세포외 도메인을 포함한다. 임의의 전술한 발명의 또 다른 또는 추가의 구현예에서, 상기 하나 이상의 비-천연 TCR 항원 결합 도메인(들)은 선택적으로 링커 영역에 의해 TCR 불변 영역 사슬 각각에 연결되고, 상기 링커 영역 핵산은 서열번호 2981 내지 2992 및 이들의 임의의 조합 또는 이와 적어도 98% 동일성을 갖는 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 인코딩하거나, 상기 링커가 서열번호 701 내지 714 또는 이와 적어도 98% 동일성을 갖는 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 핵산 서열에 의해 인코딩된다. 임의의 전술한 발명의 또 다른 또는 추가의 구현예에서, 상기 하나 이상의 비-천연 TCR 항원 결합 도메인(들)은 이것이 획득된 항체보다 적어도 5배 낮은 이의 표적 항원에 대한 결합 친화도를 갖는다. 임의의 전술한 발명의 또 다른 또는 추가의 구현예에서, SIR을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드는 각각의 사슬의 N-말단에 존재하고, 서열번호 1 내지 9 및 10으로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함하는 리더 서열 또는 신호 펩티드를 추가로 포함한다. 임의의 전술한 발명의 또 다른 또는 추가의 구현예에서, SIR을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드는 각각의 사슬의 N-말단에 존재하는 리더 서열 또는 신호 펩티드를 추가로 포함하고, 서열번호 1 내지 9 및 10으로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함한다. 임의의 전술한 발명의 또 다른 또는 추가의 구현예에서, 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드는 두 개의 SIR을 인코딩한다. 임의의 전술한 발명의 또 다른 또는 추가의 구현예에서, 폴리뉴클레오티드는 절단가능한 링커를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열에 의해 연결된 두 개의 SIR을 인코딩한다. 임의의 전술한 발명의 또 다른 또는 추가의 구현예에서, 절단가능한 링커는 자가-절단하는 절단가능한 링커이다. 임의의 전술한 발명의 또 다른 또는 추가의 구현예에서, 절단가능한 링커는 2A 링커, 2A-유사 링커 또는 이들의 기능적 등가물 중 임의의 하나 이상이다. 임의의 전술한 발명의 또 다른 또는 추가의 구현예에서, 절단가능한 링커는 T2A 링커, P2A, F2A, E2A 링커 또는 이들의 기능적 등가물 중 임의의 하나 이상이다. 임의의 전술한 발명의 또 다른 또는 추가의 구현예에서, 절단가능한 링커는 서열번호 780 내지 785 중 임의의 하나 이상의 서열을 포함한다. 임의의 전술한 발명의 또 다른 또는 추가의 구현예에서, 절단가능한 링커를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드는 선택적으로 퓨린 (furine) 절단 부위 또는 퓨린 유사 절단 부위 또는 이들의 기능적 등가물을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열이 선행한다. 임의의 전술한 발명의 또 다른 또는 추가의 구현예에서, 절단가능한 링커를 선행하는 퓨린 절단 부위는 서열번호 788 내지 790 중 임의의 하나 이상의 서열을 포함한다. 임의의 전술한 발명의 또 다른 또는 추가의 구현예에서, 절단가능한 링커를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열은 가요성 링커를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열이 선행한다. 임의의 전술한 발명의 또 다른 또는 추가의 구현예에서, 절단가능한 링커를 선행하는 가요성 링커는 Ser-Gly 링커, Ser-Gly-Ser-Gly 링커 또는 이들의 기능적 등가물 중 하나 이상을 인코딩한다. 임의의 전술한 발명의 또 다른 또는 추가의 구현예에서, 절단가능한 링커를 선행하는 가요성 링커는 서열번호 786 또는 787의 서열을 포함한다. 임의의 전술한 발명의 또 다른 또는 추가의 구현예에서, 퓨린 절단 부위를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열은 가요성 링커를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드가 선행하고, 이는 절단가능한 링커를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드가 선행하여 퓨린 절단 부위 - 가요성 링커 - 절단가능한 링커 순서가 된다. 임의의 전술한 발명의 또 다른 또는 추가의 구현예에서, 절단가능한 링커를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열은 제 2 SIR을 인코딩하는 리더 서열 (신호 펩티드)를 인코딩하는 서열 이전에 존재한다. 임의의 전술한 발명의 또 다른 또는 추가의 구현예에서, SIR은 선택된 항원에 대한 다양한 결합 친화도를 갖도록 설계될 수 있다. 임의의 전술한 발명의 또 다른 또는 추가의 구현예에서, SIR은 부속 모듈을 포함한다. 임의의 전술한 발명의 또 다른 또는 추가의 구현예에서, 부속 모듈은 CD3z 도메인을 포함한다. 임의의 전술한 발명의 또 다른 또는 추가의 구현예에서, TCR 불변 사슬은 (viii) 서열번호 12401, 12402, 12403, 12408 또는 12409와 적어도 98% 동일한 아미노산 서열; (ix) 서열번호 12421, 12422, 12423, 12427 또는 12428과 적어도 98% 동일한 아미노산 서열; (x) 상기 (viii) 및 (ix)의 두 개 TCR 불변 사슬의 이량체 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 임의의 전술한 발명의 또 다른 또는 추가의 구현예에서, 상기 하나 이상의 비-천연 TCR 항원 결합 도메인(들)은 CD19에 결합한다. 임의의 전술한 발명의 또 다른 또는 추가의 구현예에서, 하나 이상의 비-천연 TCR 항원 결합 도메인(들)은 서열번호 2318 내지 2324, 12060 내지 12068, 12108, 12127 또는 12156 중 어느 하나와 적어도 98% 동일한 서열을 포함하는 폴리펩티드 또는 전술한 임의의 폴리펩티드에 포함된 임의의 상보성 결정 영역 (CDR); 서열번호 2517 내지 2523, 12178 내지 12186, 1227, 12246 또는 12275 중 어느 하나와 적어도 98% 동일한 서열을 포함하는 폴리펩티드 또는 전술한 임의의 폴리펩티드에 포함된 임의의 상보성 결정 영역 (CDR); 서열번호 12288과 적어도 98% 동일한 서열을 포함하는 폴리펩티드; 및 서열번호 2770 내지 2774, 12325, 12308, 18162 내지 18170 또는 12354 중 어느 하나와 적어도 98% 동일한 서열을 포함하는 폴리펩티드로 이루어진 군으로부터 선택된다. 임의의 전술한 발명의 또 다른 또는 추가의 구현예에서, 재조합 폴리뉴클레오티드는 서열번호 3135 내지 3235, 3250 내지 3346, 3396, 3401 내지 3403, 3406, 3429 내지 3432, 3435 내지 3439, 3540, 3855 내지 3859, 12431 내지 12489, 12491 내지 12493, 12495 내지 12530, 12534, 13195 내지 13203, 13250, 13267, 13289, 13429 내지 13437, 13483, 13501 및 13523으로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함하는 폴리펩티드를 인코딩한다. 임의의 전술한 발명의 또 다른 또는 추가의 구현예에서, 상기 하나 이상의 비-천연 TCR 항원 결합 도메인(들)은 CD20에 결합한다. 임의의 전술한 발명의 또 다른 또는 추가의 구현예에서, 하나 이상의 비-천연 TCR 항원 결합 도메인(들)은 서열번호 2325 내지 2326, 12069 내지 12077 또는 12078 중 어느 하나와 적어도 98% 동일한 서열을 포함하는 폴리펩티드 또는 전술한 임의의 폴리펩티드에 포함된 임의의 상보성 결정 영역 (CDR); 서열번호 2524 내지 2525, 12187 내지 12195 또는 12196 중 어느 하나와 적어도 98% 동일한 서열을 포함하는 폴리펩티드 또는 전술한 임의의 폴리펩티드에 포함된 임의의 상보성 결정 영역 (CDR); 서열번호 12289와 적어도 98% 동일한 서열을 포함하는 폴리펩티드; 및 서열번호 2787 내지 2788, 18177 내지 18186 또는 18187 중 어느 하나와 적어도 98% 동일한 서열을 포함하는 폴리펩티드로 이루어진 군으로부터 선택된다. 임의의 전술한 발명의 또 다른 또는 추가의 구현예에서, 재조합 폴리뉴클레오티드는 서열번호 3263, 3348, 3456 내지 3457, 3876 내지 3877, 12464 내지 12465, 12477 내지 12482, 12492, 12534, 13204 내지 13213, 13438 내지 13446 및 13447로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함하는 폴리펩티드를 인코딩한다. 임의의 전술한 발명의 또 다른 또는 추가의 구현예에서, 상기 하나 이상의 비-천연 TCR 항원 결합 도메인(들)은 CD22에 결합한다. 임의의 전술한 발명의 또 다른 또는 추가의 구현예에서, 하나 이상의 비-천연 TCR 항원 결합 도메인(들)은 서열번호 2327 내지 2329, 12122 내지 12126 또는 12132 중 어느 하나와 적어도 98% 동일한 서열을 포함하는 폴리펩티드 또는 전술한 임의의 폴리펩티드에 포함된 임의의 상보성 결정 영역 (CDR); 서열번호 2526 내지 2528, 12241 내지 12245 또는 12251 중 어느 하나와 적어도 98% 동일한 서열을 포함하는 폴리펩티드 또는 전술한 임의의 폴리펩티드에 포함된 임의의 상보성 결정 영역 (CDR); 및 서열번호 2789 내지 2791, 12320 내지 12330 또는 18188 중 어느 하나와 적어도 98% 동일한 서열을 포함하는 폴리펩티드로 이루어진 군으로부터 선택된다. 임의의 전술한 발명의 또 다른 또는 추가의 구현예에서, 재조합 폴리뉴클레오티드는 서열번호 3332, 3433, 3458 내지 3460, 3878 내지 3880, 12483, 12485, 12488 내지 12490, 13241 내지 13245, 13268, 13475 내지 13479 및 13502로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함하는 폴리펩티드를 인코딩한다. 임의의 전술한 발명의 또 다른 또는 추가의 구현예에서, 상기 하나 이상의 비-천연 TCR 항원 결합 도메인(들)은 BCMA에 결합한다. 임의의 전술한 발명의 또 다른 또는 추가의 구현예에서, 하나 이상의 비-천연 TCR 항원 결합 도메인(들)은 서열번호 2310 내지 2313, 12046 내지 12048, 12118 내지 12119, 12139 내지 12145 또는 12146 중 어느 하나와 적어도 98% 동일한 서열을 포함하는 폴리펩티드 또는 전술한 임의의 폴리펩티드에 포함된 임의의 상보성 결정 영역 (CDR); 서열번호 2509 내지 2512, 12164 내지 12166, 12237 내지 12238, 12258 내지 12264 또는 12265 중 어느 하나와 적어도 98% 동일한 서열을 포함하는 폴리펩티드 또는 전술한 임의의 폴리펩티드에 포함된 임의의 상보성 결정 영역 (CDR); 서열번호 12279 내지 12281, 12283 내지 12285, 12287, 12291 내지 12292, 12293 또는 12294 중 어느 하나와 적어도 98% 동일한 서열을 포함하는 폴리펩티드; 및 서열번호 2780 내지 2783, 12237 내지 12344, 18174 내지 18175 또는 18176 중 어느 하나와 적어도 98% 동일한 서열을 포함하는 폴리펩티드로 이루어진 군으로부터 선택된다. 임의의 전술한 발명의 또 다른 또는 추가의 구현예에서, 재조합 폴리뉴클레오티드는 서열번호 3445 내지 3449, 3866 내지 3869, 12463, 12533, 12535 내지 12536, 13181 내지 13183, 13261 내지 13262, 13277 내지 13284, 13415 내지 13417, 13495 내지 13496, 13511 내지 13517 및 13518로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함하는 폴리펩티드를 인코딩한다. 임의의 전술한 발명의 또 다른 또는 추가의 구현예에서, 상기 하나 이상의 비-천연 TCR 항원 결합 도메인(들)은 MPL에 결합한다. 임의의 전술한 발명의 또 다른 또는 추가의 구현예에서, 하나 이상의 비-천연 TCR 항원 결합 도메인(들)은 서열번호 2414 내지 2421, 12120, 12128 또는 12129 중 어느 하나와 적어도 98% 동일한 서열을 포함하는 폴리펩티드 또는 전술한 임의의 폴리펩티드에 포함된 임의의 상보성 결정 영역 (CDR); 서열번호 2611 내지 2618, 12239, 12247 또는 12248 중 어느 하나와 적어도 98% 동일한 서열을 포함하는 폴리펩티드 또는 전술한 임의의 폴리펩티드에 포함된 임의의 상보성 결정 영역 (CDR); 및 서열번호 2871 내지 2878, 12326 내지 12327 및 12318 중 어느 하나와 적어도 98% 동일한 서열을 포함하는 폴리펩티드로 이루어진 군으로부터 선택된다. 임의의 전술한 발명의 또 다른 또는 추가의 구현예에서, 재조합 폴리뉴클레오티드는 서열번호 33347, 3373, 3427 내지 3428, 3495, 3556 내지 3562, 3979 내지 3985, 4025, 12454, 12456, 12458, 12462, 12532, 13259, 13265 내지 13266, 13493, 13499 및 13500으로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함하는 폴리펩티드를 인코딩한다. 임의의 전술한 발명의 또 다른 또는 추가의 구현예에서, 상기 하나 이상의 비-천연 TCR 항원 결합 도메인(들)은 CS1에 결합한다. 임의의 전술한 발명의 또 다른 또는 추가의 구현예에서, 하나 이상의 비-천연 TCR 항원 결합 도메인(들)은 서열번호 2355 내지 2358, 12090 내지 12094 또는 12095 중 어느 하나와 적어도 98% 동일한 서열을 포함하는 폴리펩티드 또는 전술한 임의의 폴리펩티드에 포함된 임의의 상보성 결정 영역 (CDR); 서열번호 2553 내지 2555, 12209 내지 12213 또는 12214 중 어느 하나와 적어도 98% 동일한 서열을 포함하는 폴리펩티드 또는 전술한 임의의 폴리펩티드에 포함된 임의의 상보성 결정 영역 (CDR); 및 서열번호 2817 내지 2819, 18211 내지 18215 또는 18216 중 어느 하나와 적어도 98% 동일한 서열을 포함하는 폴리펩티드로 이루어진 군으로부터 선택된다. 임의의 전술한 발명의 또 다른 또는 추가의 구현예에서, 재조합 폴리뉴클레오티드는 서열번호 3376, 3487 내지 3489, 3907 내지 3909, 12455, 12457, 12459, 12461, 12476, 13226 내지 13231, 13460 내지 13464 및 13465로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함하는 폴리펩티드를 인코딩한다. 임의의 전술한 발명의 또 다른 또는 추가의 구현예에서, 상기 하나 이상의 비-천연 TCR 항원 결합 도메인(들)은 CD33에 결합한다. 임의의 전술한 발명의 또 다른 또는 추가의 구현예에서, 하나 이상의 비-천연 TCR 항원 결합 도메인(들)은 서열번호 2336 내지 2337, 12079 내지 12084 또는 12085 중 어느 하나와 적어도 98% 동일한 서열을 포함하는 폴리펩티드 또는 전술한 임의의 폴리펩티드에 포함된 임의의 상보성 결정 영역 (CDR); 서열번호 2535 내지 2536, 12197 내지 12202 또는 12203 중 어느 하나와 적어도 98% 동일한 서열을 포함하는 폴리펩티드 또는 전술한 임의의 폴리펩티드에 포함된 임의의 상보성 결정 영역 (CDR); 및 서열번호 2795 내지 2796, 18189 내지 18193 또는 18194 중 어느 하나와 적어도 98% 동일한 서열을 포함하는 폴리펩티드로 이루어진 군으로부터 선택된다. 임의의 전술한 발명의 또 다른 또는 추가의 구현예에서, 재조합 폴리뉴클레오티드는 서열번호 3464 내지 3465, 3884 내지 3885, 12460, 12473, 12479, 13214 내지 13220, 13448 내지 13453 및 13454로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함하는 폴리펩티드를 인코딩한다. 임의의 전술한 발명의 또 다른 또는 추가의 구현예에서, 상기 하나 이상의 비-천연 TCR 항원 결합 도메인(들)은 CD123에 결합한다. 임의의 전술한 발명의 또 다른 또는 추가의 구현예에서, 하나 이상의 비-천연 TCR 항원 결합 도메인(들)은 서열번호 2315, 2472, 12049 내지 12058 또는 12059 중 어느 하나와 적어도 98% 동일한 서열을 포함하는 폴리펩티드 또는 전술한 임의의 폴리펩티드에 포함된 임의의 상보성 결정 영역 (CDR); 서열번호 2514, 2670, 12167 내지 12176 또는 12177 중 어느 하나와 적어도 98% 동일한 서열을 포함하는 폴리펩티드 또는 전술한 임의의 폴리펩티드에 포함된 임의의 상보성 결정 영역 (CDR); 서열번호 2716 또는 2717과 적어도 98% 동일한 서열을 포함하는 폴리펩티드; 및 서열번호 2801, 2929, 18196 내지 18205 또는 18206 중 어느 하나와 적어도 98% 동일한 서열을 포함하는 폴리펩티드로 이루어진 군으로부터 선택된다. 임의의 전술한 발명의 또 다른 또는 추가의 구현예에서, 재조합 폴리뉴클레오티드는 서열번호 3266 내지 3267, 3366 내지 3368, 3375, 3378, 3405, 3409, 3434, 3470, 3492 내지 3497, 3617, 3890, 3912 내지 3913, 4041, 12480, 13184 내지 13194, 13418 내지 13427 및 13428로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함하는 폴리펩티드를 인코딩한다. 임의의 전술한 발명의 또 다른 또는 추가의 구현예에서, 상기 하나 이상의 비-천연 TCR 항원 결합 도메인(들)은 폴레이트 수용체 1에 결합한다. 임의의 전술한 발명의 또 다른 또는 추가의 구현예에서, 하나 이상의 비-천연 TCR 항원 결합 도메인(들)은 서열번호 2373과 적어도 98% 동일한 서열을 포함하는 폴리펩티드 또는 이에 포함된 임의의 상보성 결정 영역 (CDR); 서열번호 2570과 적어도 98% 동일한 서열을 포함하는 폴리펩티드 또는 이에 포함된 임의의 상보성 결정 영역 (CDR); 및 서열번호 2833과 적어도 98% 동일한 서열을 포함하는 폴리펩티드로 이루어진 군으로부터 선택된다. 임의의 전술한 발명의 또 다른 또는 추가의 구현예에서, 재조합 폴리뉴클레오티드는 서열번호 3511 및 3928로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함하는 폴리펩티드를 인코딩한다. 임의의 전술한 발명의 또 다른 또는 추가의 구현예에서, 상기 하나 이상의 비-천연 TCR 항원 결합 도메인(들)은 메소틸린에 결합한다. 임의의 전술한 발명의 또 다른 또는 추가의 구현예에서, 하나 이상의 비-천연 TCR 항원 결합 도메인(들)은 서열번호 2413, 12154 또는 12155 중 어느 하나와 적어도 98% 동일한 서열을 포함하는 폴리펩티드 또는 전술한 임의의 폴리펩티드에 포함된 임의의 상보성 결정 영역 (CDR); 서열번호 2609 내지 2610, 12273 또는 12274 중 어느 하나와 적어도 98% 동일한 서열을 포함하는 폴리펩티드 또는 전술한 임의의 폴리펩티드에 포함된 임의의 상보성 결정 영역 (CDR); 서열번호 2713 내지 2714 또는 2725 중 어느 하나와 적어도 98% 동일한 서열을 포함하는 폴리펩티드; 및 서열번호 2870, 2899, 12352 또는 12353 중 어느 하나와 적어도 98% 동일한 서열을 포함하는 폴리펩티드로 이루어진 군으로부터 선택된다. 임의의 전술한 발명의 또 다른 또는 추가의 구현예에서, 재조합 폴리뉴클레오티드는 서열번호 3414, 3419, 3554, 3585, 3976, 4008, 13287 내지 13288, 13521 및 13522로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함하는 폴리펩티드를 인코딩한다. 임의의 전술한 발명의 또 다른 또는 추가의 구현예에서, 상기 하나 이상의 비-천연 TCR 항원 결합 도메인(들)은 IL-13Rα2에 결합한다. 임의의 전술한 발명의 또 다른 또는 추가의 구현예에서, 하나 이상의 비-천연 TCR 항원 결합 도메인(들)은 서열번호 2399 또는 2400 중 어느 하나와 적어도 98% 동일한 서열을 포함하는 폴리펩티드 또는 전술한 임의의 폴리펩티드에 포함된 임의의 상보성 결정 영역 (CDR); 서열번호 2595 또는 2596 중 어느 하나와 적어도 98% 동일한 서열을 포함하는 폴리펩티드 또는 전술한 임의의 폴리펩티드에 포함된 임의의 상보성 결정 영역 (CDR); 및 서열번호 2858 또는 2859 중 어느 하나와 적어도 98% 동일한 서열을 포함하는 폴리펩티드로 이루어진 군으로부터 선택된다. 임의의 전술한 발명의 또 다른 또는 추가의 구현예에서, 재조합 폴리뉴클레오티드는 서열번호 3541 내지 3542, 3963 및 3964로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함하는 폴리펩티드를 인코딩한다. 임의의 전술한 발명의 또 다른 또는 추가의 구현예에서, 상기 하나 이상의 비-천연 TCR 항원 결합 도메인(들)은 CD138에 결합한다. 임의의 전술한 발명의 또 다른 또는 추가의 구현예에서, 하나 이상의 비-천연 TCR 항원 결합 도메인(들)은 서열번호 2316과 적어도 98% 동일한 서열을 포함하는 폴리펩티드 또는 이에 포함된 임의의 상보성 결정 영역 (CDR); 서열번호 2515와 적어도 98% 동일한 서열을 포함하는 폴리펩티드 또는 이에 포함된 임의의 상보성 결정 영역 (CDR); 및 서열번호 2802와 적어도 98% 동일한 서열을 포함하는 폴리펩티드로 이루어진 군으로부터 선택된다. 임의의 전술한 발명의 또 다른 또는 추가의 구현예에서, 재조합 폴리뉴클레오티드는 서열번호 3268, 3374, 3404, 3471 및 3891로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함하는 폴리펩티드를 인코딩한다. 임의의 전술한 발명의 또 다른 또는 추가의 구현예에서, 상기 하나 이상의 비-천연 TCR 항원 결합 도메인(들)은 TCRgd에 결합한다. 임의의 전술한 발명의 또 다른 또는 추가의 구현예에서, 하나 이상의 비-천연 TCR 항원 결합 도메인(들)은 서열번호 2449와 적어도 98% 동일한 서열을 포함하는 폴리펩티드 또는 이에 포함된 임의의 상보성 결정 영역 (CDR); 서열번호 2646과 적어도 98% 동일한 서열을 포함하는 폴리펩티드 또는 이에 포함된 임의의 상보성 결정 영역 (CDR); 및 서열번호 2907과 적어도 98% 동일한 서열을 포함하는 폴리펩티드로 이루어진 군으로부터 선택된다. 임의의 전술한 발명의 또 다른 또는 추가의 구현예에서, 재조합 폴리뉴클레오티드는 서열번호 3594 및 4017로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함하는 폴리펩티드를 인코딩한다. 임의의 전술한 발명의 또 다른 또는 추가의 구현예에서, 상기 하나 이상의 비-천연 TCR 항원 결합 도메인(들)은 TCRB1에 결합한다. 임의의 전술한 발명의 또 다른 또는 추가의 구현예에서, 하나 이상의 비-천연 TCR 항원 결합 도메인(들)은 서열번호 2445 또는 2446 중 어느 하나와 적어도 98% 동일한 서열을 포함하는 폴리펩티드 또는 전술한 임의의 폴리펩티드에 포함된 임의의 상보성 결정 영역 (CDR); 서열번호 2642 또는 2643 중 어느 하나와 적어도 98% 동일한 서열을 포함하는 폴리펩티드 또는 전술한 임의의 폴리펩티드에 포함된 임의의 상보성 결정 영역 (CDR); 및 서열번호 2903 또는 2904 중 어느 하나와 적어도 98% 동일한 서열을 포함하는 폴리펩티드로 이루어진 군으로부터 선택된다. 임의의 전술한 발명의 또 다른 또는 추가의 구현예에서, 재조합 폴리뉴클레오티드는 서열번호 3590 내지 3591, 4013 및 4014로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함하는 폴리펩티드를 인코딩한다. 임의의 전술한 발명의 또 다른 또는 추가의 구현예에서, 상기 하나 이상의 비-천연 TCR 항원 결합 도메인(들)은 TCRB2에 결합한다. 임의의 전술한 발명의 또 다른 또는 추가의 구현예에서, 하나 이상의 비-천연 TCR 항원 결합 도메인(들)은 서열번호 2447 또는 2448 중 어느 하나와 적어도 98% 동일한 서열을 포함하는 폴리펩티드 또는 전술한 임의의 폴리펩티드에 포함된 임의의 상보성 결정 영역 (CDR); 서열번호 2644 또는 2645 중 어느 하나와 적어도 98% 동일한 서열을 포함하는 폴리펩티드 또는 전술한 임의의 폴리펩티드에 포함된 임의의 상보성 결정 영역 (CDR); 및 서열번호 2905 또는 2906 중 어느 하나와 적어도 98% 동일한 서열을 포함하는 폴리펩티드로 이루어진 군으로부터 선택된다. 임의의 전술한 발명의 또 다른 또는 추가의 구현예에서, 재조합 폴리뉴클레오티드는 서열번호 3353 내지 3364, 3592 내지 3593, 4015 및 4016로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함하는 폴리펩티드를 인코딩한다.
본 발명은 또한 본원 및 상기에 기술된 임의의 재조합 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 발현 시스템을 제공하고, 이는 치료제 대조군과 함께 공동발현되고, 치료제 대조군은 절단된 표피 성장인자 수용체 (tEGFR), 절단된 표피 성장인자 수용체 viii (tEGFRvⅢ), 절단된 CD30 (tCD30), 절단된 BCMA (tBCMA), 절단된 CD19 (tCD19), CD34, 티미딘 키나제, 사이토신 탈아미나제, 니트로환원효소, 잔틴-구아닌 포스포리보실 전이효소, 인간 캐스파제 8, 인간 캐스파제 9, 유도성 캐스파제 9 (i캐스파제 9), 퓨린 뉴클레오시드 포스포릴라제, 리나마라제/리나마린/포도당 옥시다제, 데옥시리보뉴클레오시드 키나제, 호스래디쉬 퍼옥시다제 (HRP)/인돌-3-아세트산 (IAA), 감마-글루타밀시스테인 합성효소, CD20/알파CD20, CD34/키메라 티미딘 키나제, dox-의존성 캐스파제-2, 티미딘 키나제 변이체 (HSV-TKSR39), AP1903/Fas 시스템, 키메라 사이토카인 수용체 (CCR), 선별 마커 및 이들의 조합로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일 구현예에서, tEGFR 및 tEGFRvⅢ은 EGFR-특이적 siRNA, 소분자, 항-EGFR 항체 또는 이의 단편 또는 이들의 조합 중 임의의 하나 이상에 결합한다. 또 다른 구현예에서, tCD30은 CD30-특이적 siRNA, 소분자, 항-CD30 항체 또는 이의 단편 또는 이들의 조합 중 임의의 하나 이상에 결합한다. 또한 또 다른 구현예에서, tCD19는 CD19-특이적 siRNA, 소분자, 항-CD19 항체 또는 이의 단편 또는 이들의 조합 중 임의의 하나 이상에 결합한다. 또 다른 구현예에서, tCD34는 CD34-특이적 siRNA, 소분자, 항-CD34 항체 또는 이의 단편 또는 이들의 조합 중 임의의 하나 이상에 결합한다. 또한 또 다른 구현예에서, 선별 마커는 디하이드로폴레이트 수용체 (DHFR), 변이체 DHFR, 메틸화된-DNA-단백질-시스테인 메틸전이효소, 이노신 모노포스페이트 탈수소화효소 Ⅱ (IMDHP2), 퓨로마이신 아세틸전이효소 (PAC), 블라스티시딘-저항성 유전자, 변이체 칼시뉴린 a/b (Can/b), CNa12, CNb30 또는 이들의 조합 중 임의의 하나 이상을 포함한다. 또 다른 구현예에서, CCR은 (i) IL-7 사이토카인-링커-IL 7Ra, (ii) IL-2Rβ의 IL-7Ra 세포질 도메인의 IL-7Ra-막통과 도메인의 IL-7 사이토카인-링커-세포외 도메인, (iii) IL-7 사이토카인-링커-IL-2Rβ 및 이들의 조합 중 임의의 하나 이상을 포함한다. 임의의 전술한 발명의 또 다른 또는 추가의 구현예에서, 재조합 발현 시스템은 부속 모듈과 함께 공동발현되는 본 발명의 재조합 폴리뉴클레오티드를 포함하고, 부속 모듈은 41BBL, CD40L, K13, MC159, cFLIP-L/MRITα, cFLIP-p22, HTLV1 Tax, HTLV2 Tax, HTLV2 Tax-RS 변이체, FKBPx2-K13, FKBPx2-HTLV2-Tax, FKBPx2-HTLV2-Tax-RS, IL6R-304-vHH-Alb8-vHH, IL12f, PD1-4H1 scFV, PD1-5C4 scFV, PD1-4H1-Alb8-vHH, PD1-5C4-Alb8-vHH, CTLA4-이필리무맙-scFv, CTLA4-이필리무맙-Alb8-vHH, IL6-19A-scFV, IL6-19A-scFV-Alb8-vHH, sHVEM, sHVEM-Alb8-vHH, hTERT, Fx06, CD3z, CD3z-GGGS-41BB, CD3-BBz, CD3-CD28z, CD3-CD28-Lck 융합 단백질, Brd4 표적화 shRNA, 키메라 항원 수용체 (CAR), hTERT, 헤파리나제, CAR, 억제성 CAR 및 이들의 조합로 이루어진 군으로부터 선택된다. 임의의 전술한 발명의 또 다른 또는 추가의 구현예에서, SIR을 인코딩하는 재조합 폴리뉴클레오티드 및 하나 이상의 치료제 대조군 및/또는 하나 이상의 부속 모듈은 절단가능한 링커를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열에 의해 연결된다. 추가의 구현예에서, 절단가능한 링커는 자가-절단하는 절단가능한 링커이다. 임의의 전술한 발명의 또 다른 또는 추가의 구현예에서, 절단가능한 링커를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드는 퓨린 절단 부위 또는 퓨린 유사 절단 부위 또는 이들의 기능적 등가물을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열이 선행한다. 임의의 전술한 발명의 또 다른 또는 추가의 구현예에서, 절단가능한 링커를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열은 선택적으로 가요성 링커를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열이 선행한다.
본 발명은 또한 본원 및 상기에 기술된 바와 같은 재조합 폴리뉴클레오티드를 포함하는 적어도 하나의 벡터를 제공하고, 벡터는 DNA 벡터, RNA 벡터, 플라스미드, 렌티바이러스 벡터, 아데노바이러스성 벡터, 레트로바이러스 벡터, 배큘로바이러스 벡터, 슬리핑 뷰티 트랜스포존 벡터 및 피기백 트랜스포존 벡터로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일 구현예에서, 벡터 골격은 서열번호 870 내지 875 및 876로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 갖는다. 또 다른 구현예에서, 벡터는 EF-1 프로모터, CMV IE 유전자 프로모터, EF-1a 프로모터, 유비퀴틴 C 프로모터, MSCV LTR 프로모터 또는 포스포글리세레이트 키나제 (PGK) 프로모터로부터 선택된 프로모터를 포함한다. 추가의 구현예에서, EF-1 프로모터는 서열번호 877의 서열 또는 이와 80 내지 99% 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 임의의 전술한 발명의 또 다른 또는 추가의 구현예에서, 벡터는 시험관내에서 전사된 벡터이거나, 벡터는 폴리(A) 미단 또는 3'UTR을 추가로 포함한다.
본 발명은 본 발명의 재조합 폴리뉴클레오티드 중 적어도 하나에 의해 인코딩된 적어도 하나의 폴리펩티드를 제공한다.
본 발명은 또한 본원 및 상기에 기술된 바와 같은 재조합 폴리뉴클레오티드 중 적어도 하나를 발현하는 재조합 세포를 제공한다.
본 발명은 또한 단리된 합성 면역 수용체 (SIR) 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 이종이량체를 제공하고, 이는 (a) (i) 서열번호 3010과 적어도 98% 동일하고, 48, 61, 91, 92, 93, 및/또는 94번 위치에서 하나 이상의 돌연변이를 갖으며, 조건부 부속 모듈을 포함할 수 있는 아미노산 서열; (ii) 서열번호 3024와 적어도 98% 동일하고, 18, 22, 57, 79, 133, 136 및/또는 139번 위치에서 하나 이상의 돌연변이를 갖으며, 조건부 부속 모듈을 포함할 수 있는 아미노산 서열; (iii) 서열번호 3025와 적어도 98% 동일하고, 18, 22, 57, 79, 133, 136 및/또는 139번 위치에서 하나 이상의 돌연변이를 갖으며, 조건부 부속 모듈을 포함할 수 있는 아미노산 서열; (iv) 서열번호 3046, 3047 또는 3048과 적어도 98% 동일하고, 조건부 부속 모듈을 포함할 수 있는 아미노산 서열; (v) 서열번호 3049와 적어도 98% 동일하고, 조건부 부속 모듈을 포함할 수 있는 아미노산 서열; (vi) 서열번호 3051 또는 3052와 적어도 98% 동일하고, 조건부 부속 모듈을 포함할 수 있는 아미노산 서열; 및 (vii) (i) 및 (ii), (i) 및 (iii), (iv) 및 (ii), (iv) 및 (iii), 그리고 (v) 및 (vi)으로부터 선택된 두 개의 TCR 불변 사슬의 이량체 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 T 세포 수용체 (TCR) 불변 사슬; (b) 조건부 링커; 및 (c) (1) 항체; (2) 항체 단편 (예로, Fv, Fab, (Fab')2); (3) 항체 (vH 도메인) 또는 이의 단편의 중쇄 가변 영역; (4) 항체 (vL 도메인) 또는 이의 단편의 경쇄 가변 영역; (5) 단일 사슬 가변 단편 (scFv) 또는 이의 단편; (6) 단일 도메인 항체 (SDAB) 또는 이의 단편; (7) 카멜리드 VHH 도메인 또는 이의 단편; (8) 항체의 단량체 가변 영역; (9) 다르핀 (DARPIN), 어피바디, 어필린, 어드넥틴, 어피틴, 오바디, 레페바디, 파이노머, 알파바디, 어비머, 아트리머, 센티린, 프로넥틴, 안티칼린, 쿠니츠 도메인, 아미딜로 반복서열 단백질 또는 이들의 단편과 같은 비-면역글로불린 항원 결합 스캐폴드; (10) 수용체 또는 이의 단편; (11) 리간드 또는 이의 단편; (12) 이중특이적 -항체, -항체 단편, -scFV, -vHH, -SDAB, -비-면역글로불린 항원 결합 스캐폴드, -수용체 또는 -리간드; 및 (13) 자가항원 또는 이의 단편으로 이루어진 군으로부터 선택된 (a)에 연결된 하나 이상의 비-천연 TCR 항원 결합 도메인(들)을 포함하고, (a)(i) 내지 (a)(iii)의 돌연변이는 항원 결합 도메인의 표적 도메인에 대한 다양한 결합 친화도를 제공하고, 합성 면역 수용체는 림프구에서 발현 시, 하나 이상의 연속적 사슬로 상기 항원 결합 도메인 및 상기 T 세포 수용체 불변 사슬 둘 다를 림프구의 표면 상에 발현하여, 상기 발현된 항원 결합 도메인이 이의 항원에 결합할 때 림프구가 활성화하고/거나, 증식하고/거나, 사이토카인을 분비하고/거나, 표적 세포의 살상을 조정 (유도 또는 억압)하도록 촉발되고, MHC-제한 및 MHC-비-제한된 항체-유형 특이성을 갖는다. 임의의 전술한 발명의 또 다른 또는 추가의 구현예에서, (a)(vii)의 TCR 불변 사슬은 비-천연 TCR 결합 도메인을 포함하고, 이는 발현될 때 항체 또는 이의 단편의 하나의 중쇄 및 경쇄가 상기 T 세포 불변 영역의 상기 (a)(vii)의 두 개 사슬 중 하나에 부착되고, 항체 또는 이의 단편의 나머지의 중쇄 및 경쇄는 상기 T 세포 불변 영역의 상기 두 개 사슬 중 나머지에 부착되도록, 사전 정의된 표적 항원에 특이적인 항체 또는 이의 단편의 중쇄 및 경쇄의 가변 영역; 발현될 때 scFv 중 하나가 상기 T 세포 불변 영역의 상기 (a)(vii)의 두 개 사슬 중 하나에 부착되고, scFv 중 나머지는 상기 T 세포 불변 영역의 상기 두 개 사슬 중 나머지에 부착되도록, 하나 이상의 사전 정의된 표적 항원에 특이적인 두 개의 단일 사슬 가변 단편 (scFv); 발현될 때 항체 단편 중 하나가 상기 T 세포 불변 영역의 상기 (a)(vii)의 두 개 사슬 중 하나에 부착되고, 항체 단편 중 나머지는 상기 T 세포 불변 영역의 상기 두 개 사슬 중 나머지에 부착되도록, 하나 이상의 사전 정의된 표적 항원에 특이적인 두 개의 항체 단편; 발현될 때 SDAB 단편 중 하나가 상기 T 세포 불변 영역의 상기 (a)(vii)의 두 개 사슬 중 하나에 부착되고, SDAB 단편 중 나머지는 상기 T 세포 불변 영역의 상기 두 개 사슬 중 나머지에 부착되도록, 하나 이상의 사전 정의된 표적 항원에 특이적인 두 개의 단일 도메인 항체 (SDAB); 발현될 때 vHH 도메인 중 하나가 상기 T 세포 불변 영역의 상기 (a)(vii)의 두 개 사슬 중 하나에 부착되고, vHH 도메인 중 나머지는 상기 T 세포 불변 영역의 상기 두 개 사슬 중 나머지에 부착되도록, 하나 이상의 사전 정의된 표적 항원에 특이적인 두 개의 카멜리드 vHH 도메인; 발현될 때 비-면역글로불린 항원 결합 스캐폴드 중 하나가 상기 T 세포 불변 영역의 상기 (a)(vii)의 두 개 사슬 중 하나에 부착되고, 비-면역글로불린 항원 결합 스캐폴드 중 나머지는 상기 T 세포 불변 영역의 상기 두 개 사슬 중 나머지에 부착되도록, 하나 이상의 사전 정의된 표적 항원에 특이적인 두 개의 비-면역글로불린 항원 결합 스캐폴드; 발현될 때 수용체 또는 이의 단편 중 하나가 상기 T 세포 불변 영역의 상기 (a)(vii)의 두 개 사슬 중 하나에 부착되고, 수용체 또는 이의 단편의 나머지는 상기 T 세포 불변 영역의 상기 두 개 사슬 중 나머지에 부착되도록, 하나 이상의 사전 정의된 표적 항원에 특이적인 두 개의 수용체 또는 이의 단편; 발현될 때 리간드 또는 이의 단편 중 하나가 상기 T 세포 불변 영역의 상기 (a)(vii)의 두 개 사슬 중 하나에 부착되고, 리간드 또는 이의 단편의 나머지는 상기 T 세포 불변 영역의 상기 두 개 사슬 중 나머지에 부착되도록, 하나 이상의 사전 정의된 표적 항원에 특이적인 두 개의 리간드 또는 이의 단편; 발현될 때 항원 결합 단편 중 하나가 상기 T 세포 불변 영역의 상기 (a)(vii)의 두 개 사슬 중 하나에 부착되고, 항원 결합 단편의 나머지는 상기 T 세포 불변 영역의 상기 두 개 사슬 중 나머지에 부착되도록, 하나 이상의 사전 정의된 표적 항원에 특이적인 두 개의 구조적으로 구별된 항원 결합 단편; 발현될 때 항원 결합 단편 중 하나가 상기 T 세포 불변 영역의 상기 (a)(vii)의 두 개 사슬 중 하나에 부착되고, 항원 결합 단편의 나머지는 상기 T 세포 불변 영역의 두 개 사슬 중 나머지에 부착되도록, 하나 또는 둘 다가 이중특이적 또는 다중특이적인 두 개의 결합 단편; 발현될 때 자가항원 또는 이의 단편 중 하나가 상기 T 세포 불변 영역의 (a)(vii)의 두 개 사슬 중 하나에 부착되고, 자가항원 또는 이의 단편의 나머지는 상기 T 세포 불변 영역의 두 개 사슬 중 나머지에 부착되도록, 두 개의 자가항원 또는 이의 단편; 발현될 때 vL 또는 이의 단편 중 하나가 상기 T 세포 불변 영역의 상기 (a)(vii)의 두 개 사슬 중 하나에 부착되고, vL 또는 이의 단편의 나머지는 상기 T 세포 불변 영역의 상기 두 개 사슬 중 나머지에 부착되도록, 두 개의 vL 또는 이의 단편; 및 발현될 때 vH 또는 이의 단편 중 하나가 상기 T 세포 불변 영역의 (a)(vii)의 두 개 사슬 중 하나에 부착되고, vH 또는 이의 단편의 나머지는 T 세포 불변 영역의 두 개 사슬 중 나머지에 부착되도록, 두 개의 vH 또는 이의 단편으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 임의의 전술한 발명의 또 다른 또는 추가의 구현예에서, (a)(iv)의 TCR 불변 사슬은 비-천연 TCR 결합 도메인을 포함하고, 이는 사전 정의된 표적 항원에 특이적인 항체 또는 이의 단편의 중쇄 (vH)의 가변 영역; 사전 정의된 표적 항원에 특이적인 항체 또는 이의 단편의 경쇄 (vL)의 가변 영역; 사전 정의된 표적 항원에 특이적인 단일 사슬 가변 단편 (scFv) 또는 이의 단편; 사전 정의된 표적 항원에 특이적인 항체 단편 (예로, Fv, Fab, (Fab')2); 사전 정의된 표적 항원에 특이적인 단일 도메인 항체 (SDAB); 사전 정의된 표적 항원에 특이적인 카멜리드 vHH 도메인; 사전 정의된 표적 항원에 특이적인 비-면역글로불린 항원 결합 스캐폴드; 사전 정의된 표적 항원에 특이적인 수용체 또는 이의 단편; 사전 정의된 표적 항원에 특이적인 리간드 또는 이의 단편; 하나 이상의 사전 정의된 표적 항원에 특이적인 이중특이적 -항체, -항체 단편, -scFV, -vHH, -SDAB, -비-면역글로불린 항원 결합 스캐폴드, -수용체 또는 -리간드; 및 자가항원 또는 이의 단편으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 임의의 전술한 발명의 또 다른 또는 추가의 구현예에서, (i), (ii), (iii), (iv), (v) 또는 (vi)의 TCR 불변 도메인은 비-천연 TCR 결합 도메인을 포함하고, 이는 사전 정의된 표적 항원에 특이적인 항체 또는 이의 단편의 중쇄 (vH)의 가변 영역; 사전 정의된 표적 항원에 특이적인 항체 또는 이의 단편의 경쇄 (vL)의 가변 영역; 사전 정의된 표적 항원에 특이적인 단일 사슬 가변 단편 (scFv) 또는 이의 단편; 사전 정의된 표적 항원에 특이적인 항체 단편 (예로, Fv, Fab, (Fab')2); 사전 정의된 표적 항원에 특이적인 단일 도메인 항체 (SDAB); 사전 정의된 표적 항원에 특이적인 카멜리드 vHH 도메인; 사전 정의된 표적 항원에 특이적인 비-면역글로불린 항원 결합 스캐폴드; 사전 정의된 표적 항원에 특이적인 수용체 또는 이의 단편; 사전 정의된 표적 항원에 특이적인 리간드 또는 이의 단편; 하나 이상의 사전 정의된 표적 항원에 특이적인 이중특이적 -항체, -항체 단편, -scFV, -vHH, -SDAB, -비-면역글로불린 항원 결합 스캐폴드, -수용체 또는 -리간드; 및 자가항원 또는 이의 단편으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 임의의 전술한 발명의 또 다른 또는 추가의 구현예에서, TCR 불변 사슬(들)은 TCR 불변 사슬의 발현 및/또는 쌍 형성을 증진하고, 이들의 내인성 세포 수용체 사슬과의 쌍 형성을 감소시키는 돌연변이를 포함한다. 임의의 전술한 발명의 또 다른 또는 추가의 구현예에서, TCR의 불변 영역은 서열번호 3010 내지 3023로 이루어진 군으로부터 선택된 서열 또는 서열번호 3010 내지 3023로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 98% 동일한 서열에서 1 내지 40개의 아미노산 치환 또는 돌연변이를 갖는 아미노산 서열을 포함하는 TCR 수용체 α 사슬 (Cα)이다. 임의의 전술한 발명의 또 다른 또는 추가의 구현예에서, TCR의 불변 영역은 서열번호 3024 내지 3044로 이루어진 군으로부터 선택된 서열 또는 서열번호 3024 내지 3044로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 98% 동일한 서열에서 1 내지 40개의 아미노산 치환 또는 돌연변이를 갖는 아미노산 서열을 포함하는 TCR 수용체 β 사슬 (Cβ)이다. 임의의 전술한 발명의 또 다른 또는 추가의 구현예에서, TCR의 불변 영역은 서열번호 3049 또는 3050으로 이루어진 군으로부터 선택된 서열 또는 서열번호 3049 또는 3050으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 98% 동일한 서열에서 1 내지 40개의 아미노산 치환 또는 돌연변이를 갖는 아미노산 서열을 포함하는 TCR 수용체 γ 사슬 (Cγ)이다. 임의의 전술한 발명의 또 다른 또는 추가의 구현예에서, TCR의 불변 영역은 서열번호 3051 또는 3052로 이루어진 군으로부터 선택된 서열 또는 서열번호 3051 또는 3052로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 98% 동일한 서열에서 1 내지 40개의 아미노산 치환 또는 돌연변이를 갖는 아미노산 서열을 포함하는 TCR 수용체 δ 사슬 (Cδ)이다. 임의의 전술한 발명의 또 다른 또는 추가의 구현예에서, TCR의 불변 영역은 서열번호 3046 내지 3048로 이루어진 군으로부터 선택된 서열 또는 서열번호 3046 내지 3048로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 98% 동일한 서열에서 1 내지 40개의 아미노산 치환 또는 돌연변이를 갖는 아미노산 서열을 포함하는 전구 TCR 수용체 α 사슬 (preCα)이다. 임의의 전술한 발명의 또 다른 또는 추가의 구현예에서, 하나 이상의 비-천연 항원 결합 도메인(들)은 하나 이상의 질환 관련 항원에 결합하고, 이는 CD19; CD123; CD22; CD30; CD171; CS-1 (CD2 하위집합 1, CRACC, SLAMF7, CD319 및 19A24라고도 지칭됨); C형 렉틴-유사 분자-1 (CLL-1 또는 CLECL1); CD33; 표피 성장인자 수용체 변이체 Ⅲ (EGFRvⅢ); 갱글리오시드 G2 (GD2); 갱글리오시드 GD3 (aNeu5Ac(2-8)aNeu5Ac(2-3)bDGalp(l-4)bDGlcp(l-l)Cer); TNF 수용체 패밀리 구성원 B 세포 성숙 (BCMA); Tn 항원 ((Tn Ag) 또는 (GalNAcα-Ser/Thr)); 전립선-특이적 막 항원 (PSMA); 수용체 타이로신 키나제-유사 고아 수용체 1 (ROR1); Fms 유사 타이로신 키나제 3 (FLT3); 종양-관련 당당백질 72 (TAG72); CD38; CD44v6; 급성 백혈병 또는 림프종 상에서 발현되지만 조혈 전구세포 상에서는 발현되지 않는 글리코실화된 CD43 에피토프; 비-조혈성 암 상에서 발현된 글리코실화된 CD43 에피토프; 암배아 항원 (CEA); 상피세포 부착 분자 (EPCAM); B7H3 (CD276); KIT (CD117); 인터루킨-13 수용체 소단위체 알파-2 (IL-13Ra2 또는 CD213A2); 메소틸린; 인터루킨 11 수용체 알파 (IL-llRa); 전립선 줄기 세포 항원 (PSCA); 프로테아제 세린 21 (테스티신 또는 PRSS21); 혈관 내피 성장인자 수용체 2 (VEGFR2); 루이스 (Y) 항원; CD24; 혈소판-유래 성장인자 수용체 베타 (PDGFR-베타); 단계-특이적 배아 항원-4 (SSEA-4); CD20; 폴레이트 수용체 알파; 수용체 타이로신-단백질 키나제 ERBB2 (Her2/neu); 세포 표면 연관된 뮤신 1 (MUC1); 상피 성장인자 수용체 (EGFR); 신경 세포 부착 분자 (NCAM); 프로스타제; 전립샘 산 포스파타제 (PAP); 변이된 신장인자 2 (ELF2M); 에프린 B2; 섬유모세포 활성화 단백질 알파 (FAP); 인슐린-유사 성장인자 1 수용체 (IGF-I 수용체); 탄산 무수화제 Ⅸ (CAⅨ); 프로테오좀 (프로좀, 마크로페인) 소단위체 베타형, 9 (LMP2); 당단백질 100 (gpl00); 절단점 클러스터 영역 (BCR)으로 구성된 종양원 유전자 융합 단백질 및 아벨슨 마우스 백혈병 바이러스 종양원 유전자 상동체 1 (Abl) (bcr-abl); 티로시나제; 에프린 A형 수용체 2 (EphA2); 퓨코실 GM1; 시아릴 루이스 부착 분자 (sLe); 갱글리오시드 GM3 (aNeu5Ac(2-3)bDClalp(l-4)bDGlcp(l-1)Cer); 글루타민 전이효소 5 (TGS5); 고분자량 흑색종 관련된 항원 (HMWMAA); o-아세틸-GD2 갱글리오시드 (OAcGD2); 종양 내피 마커 1 (TEM1/CD248); 관련된 종양 내피 마커 7 (TEM7R); 클라우딘 6 (CLDN6); 갑상샘 자극호르몬 수용체 (TSHR); G 단백질 연결된 수용체 클래스 C 그룹 5, 구성원 D (GPRC5D); 염색체 X 오픈 리딩 프레임 61 (CXORF61); CD97; CD179a; 역형성 림프종 키나제 (ALK); 폴리시알산; 태반-특이적 항원 1 (PLAC1); 글로보H 글리코세라미드의 육당질 부분 (글로보H); 유샘 분화 항원 (NY-BR-1); 유로플라킨 2 (UPK2); A형 간염 바이러스 세포 수용체 1 (HAVCR1); 아드레노셉터 베타 3 (ADRB3); 패넥신 3 (PANX3); G 단백질-연결된 수용체 20 (GPR20); 림프구 항원 6 복합체, 좌위 K 9 (LY6K); 후각 수용체 51E2 (OR51E2); TCR 감마 교대 리딩 프레임 단백질 (TARP); 윌름 종양 단백질 (WT1); 암/고환 항원 1 (NY-ES0-1); 암/고환 항원 2 (LAGE-1a); 흑색종-관련 항원 1 (MAGE-A1); 염색체 12p 상에 위치한 ETS 전위 변이체 유전자 6 (ETV6-AML); 정자 단백질 17 (SPA17); X 항원 패밀리, 구성원 lA (XAGEl); 안지오포이에틴-결합 세포 표면 수용체 2 (타이 2); 흑색종 암 고환 항원-1 (MAD-CT-1); 흑색종 암 고환 항원-2 (MAD-CT-2); Fos-관련된 항원 1; 종양 단백질 p53 (p53); p53 돌연변이체; 프로스테인; 서바이빈; 텔로머라제; 전립선 암종 종양 항원-1 (PCT A-1 또는 갈렉틴 8); T 세포에 의해 인식되는 흑색종 항원 1 (MelanA 또는 MARTI); 래트 육종 (Ras) 돌연변이체; 인간 텔로머라제 역전사효소 (hTERT); 육종 전위 절단점; 흑색종의 세포사멸 저해제 (ML-IAP); ERG (막통과 프로테아제, 세린 2 (TMPRSS2) ETS 융합 유전자); N-아세틸 글루코사미닐-전이효소 V (NA17); 쌍 형성된 박스 단백질 Pax-3 (PAX3); 안드로겐 수용체; 사이클린 Bl; v-myc 조류 백혈병 바이러스 종양원 유전자 신경모세포종 유래된 상동체 (MYCN); Ras 상동체 패밀리 구성원 C (RhoC); 티로시나제-관련 단백질 2 (TRP-2); 사이토크롬 P450 lB 1 (CYPlB 1); CCCTC-결합 인자 (아연 핑거 단백질)-유사 (BORIS 또는 각인 부위의 조절인자의 형제), T 세포에 의해 인식되는 편평세포 암종 항원 3 (SART3); 쌍 형성된 박스 단백질 Pax-5 (PAX5); 프로아크로신 결합 단백질 sp32 (OY-TESl); 림프구-특이적 단백질 타이로신 키나제 (LCK); 키나제 고정 단백질 4 (AKAP-4); 활액 육종 X 절단점 2 (SSX2); 진행된 당화 말단 산물의 수용체 (RAGE-1); 신장 유비퀴터스 1 (RUl); 신장 유비퀴터스 2 (RU2); 레구마인; 인간 파필로마 바이러스 E6 (HPV E6); 인간 파필로마 바이러스 E7 (HPV E7); 장내 카르복실 에스테라제; 변이된 열 충격 단백질 70-2 (hsp70-2); CD79a; CD79b; CD72; 백혈구-관련된 면역글로불린-유사 수용체 1 (LAIRl); IgA 수용체의 Fc 단편 (FCAR 또는 CD89); 백혈구 면역글로불린-유사 수용체 서브패밀리 A 구성원 2 (LILRA2); CD300 분자-유사 패밀리 구성원 f (CD300LF); C형 렉틴 도메인 패밀리 12 구성원 A (CLEC12A); 골수 간질 세포 항원 2 (BST2); EGF-유사 모듈-포함 뮤신-유사 호르몬 수용체-유사 항원 2 (EMR2); 림프구 항원 75 (LY75); 글리피칸-3 (GPC3); Fc 수용체-유사 5 (FCRL5); 면역글로불린 람다-유사 폴리펩티드 1 (IGLLl); MPL; 바이오틴; c-MYC 에피토프 태그; CD34; LAMP1; TROP2;, GFRα4; CDH17; CDH6; NYBR1; CDH19; CD200R; Slea (CA19.9; 시아릴 루이스 항원); 퓨코실-GM1; PTK7; gpNMB; CDH1-CD324; DLL3; CD276/B7H3; IL-11Ra; IL-13Ra2; CD179b-IGLl1; ALK TCRγ-δ; NKG2D; CD32 (FCGR2A); Tn 항원; CSPG4-HMW-MAA; Tim1-/HVCR1; CSF2RA (GM-CSFR-알파); TGFβR2; VEGFR2/KDR; 루이스 항원; TCR-β1 사슬; TCR-β2 사슬, TCR-γ 사슬, TCR-δ 사슬; FITC; 황체형성 호르몬 수용체 (LHR); 난포 자극 호르몬 수용체 (FSHR); 융모생식샘 자극호르몬 수용체 (CGHR); CCR4; GD3; SLAMF6; SLAMF4; HIV1 외투 당단백질; HTLV1-Tax; CMV pp65; EBV-EBNA3c; 인플루엔자 A 헤마글루티닌 (HA); GAD; PDL1; 구아니릴 사이클라제 C (GCC); KSHV-K8.1 단백질; KSHV-gH 단백질; 데스모글레인 3 (Dsg3)에 대한 자가항체; 데스모글레인 1 (Dsg1)에 대한 자가항체; HLA, HLA-A, HLA-A2, HLA-B, HLA-C, HLA-DP, HLA-DM, HLA-DOA, HLA-DOB, HLA-DQ, HLA-DR, HLA-G; IGE; CD99; RAS; G12V; 조직 인자 1 (TF1); AFP; GPRC5D; 클라우딘18.2 (CLD18A2 또는 CLDN18A.2)); P-당단백질; STEAP1; LIV1; 넥틴-4; CRIPTO; GPA33; BST1/CD157; 저전도도 염화물 통로; 및 TNT 항체에 의해 인식되는 항원으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 임의의 전술한 발명의 또 다른 또는 추가의 구현예에서, 하나 이상의 비-천연 TCR 항원 결합 도메인(들)은 항체, 항체 단편, scFv, Fv, Fab, (Fab')2, 단일 도메인 항체 (SDAB), vH 또는 vL 도메인, 카멜리드 VHH 도메인, 다르핀, 어피바디, 어필린, 어드넥틴, 어피틴, 오바디, 레페바디, 파이노머, 알파바디, 어비머, 아트리머, 센티린, 프로넥틴, 안티칼린, 쿠니츠 도메인, 아미딜로 반복서열 단백질과 같은 비-면역글로불린 항원 결합 스캐폴드, 수용체 또는 리간드를 포함한다. 임의의 전술한 발명의 또 다른 또는 추가의 구현예에서, 하나 이상의 비-천연 TCR 항원 결합 도메인(들)은 (i) 임의의 서열번호 2506 내지 2680 또는 12160 내지 12278에 나타낸 바와 같은 서열 또는 이와 적어도 98% 동일성을 갖고, 이의 항원에 결합하는 폴리펩티드를 인코딩하는 서열을 포함하는, 중쇄 가변 영역 (vH); (ii) 임의의 서열번호 2307 내지 2482 또는 12042 내지 12159에 나타낸 바와 같은 서열 또는 이와 적어도 98% 동일성을 갖고, 이의 항원에 결합하는 폴리펩티드를 인코딩하는 서열을 포함하는, 경쇄 가변 영역 (vL); (iii) 서열번호 2770 내지 2939, 12303 내지 12357 또는 18162 내지 18224 중 어느 하나에 나타낸 바와 같은 서열 또는 이와 적어도 98% 동일성을 갖고, 이의 항원에 결합하는 폴리펩티드를 인코딩하는 서열을 포함하는, 단일 사슬 가변 단편 (scFv); (iv) 서열번호 2701 내지 2725 또는 12279 내지 12294 중 어느 하나에 나타낸 바와 같은 서열 또는 이와 적어도 98% 동일성을 갖고, 이의 항원에 결합하는 폴리펩티드를 인코딩하는 서열을 포함하는, 카멜리드 VHH 도메인; (v) 서열번호 439 내지 443 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 또는 이와 적어도 98% 동일성을 갖고, 이의 항원에 결합하는 폴리펩티드를 인코딩하는 서열에 의해 인코딩되는, 비-면역글로불린 스캐폴드; (vi) 서열번호 2736 내지 2748 중 어느 하나에 나타낸 바와 같은 서열 또는 이와 적어도 98% 동일성을 갖고, 이의 동족체에 결합하는 폴리펩티드를 인코딩하는 서열을 포함하는, 수용체; 및 (vii) 서열번호 2758 내지 2768 또는 12359 내지 12361 중 어느 하나에 나타낸 바와 같은 서열 또는 이와 적어도 98% 동일성을 갖고, 이의 동족체에 결합하는 폴리펩티드를 인코딩하는 서열을 포함하는, 리간드로 이루어진 군으로부터 선택된다. 임의의 전술한 발명의 또 다른 또는 추가의 구현예에서, 하나 이상의 비-천연 TCR 항원 결합 도메인(들)은 임의의 서열번호 13999 내지 14879 또는 14880에 나타낸 바와 같은 선택된 표적 항원에 대한 하나 이상의 경쇄 상보성 결정 영역 및/또는 임의의 서열번호 14881 내지 15761 또는 15762에 나타낸 바와 같은 선택된 표적 항원에 대한 하나 이상의 중쇄 상보성 결정 영역을 포함한다. 임의의 전술한 발명의 또 다른 또는 추가의 구현예에서, 하나 이상의 비-천연 TCR 항원 결합 도메인(들)은 최대 10개의 보존적 아미노산 치환을 갖는 임의의 서열번호 2307 내지 2482 또는 12042 내지 12159의 서열을 포함하는 가변 경쇄 (vL) 도메인 및/또는 최대 10개의 보존적 아미노산 치환을 갖는 임의의 서열번호 2506 내지 2680 또는 12160 내지 12278의 서열을 포함하는 가변 중쇄 (vH) 도메인을 포함한다. 임의의 전술한 발명의 또 다른 또는 추가의 구현예에서, 하나 이상의 비-천연 TCR 항원 결합 도메인(들)은 최대 10개의 보존적 아미노산 치환을 갖는 임의의 서열번호 2701 내지 2725 또는 12279 내지 12294에 나타낸 바와 같은 선택된 항원에 대한 하나 이상의 카멜리드 vHH 상보성 결정 영역을 포함한다. 임의의 전술한 발명의 또 다른 또는 추가의 구현예에서, 하나 이상의 비-천연 TCR 항원 결합 도메인(들)은 임의의 서열번호 2728 내지 2732 또는 12296 내지 12301에 나타낸 바와 같은 서열을 갖고, 최대 10개의 보존적 아미노산 치환을 갖는 비-면역글로불린 항원 결합 도메인을 포함한다. 임의의 전술한 발명의 또 다른 또는 추가의 구현예에서, 하나 이상의 비-천연 TCR 항원 결합 도메인(들)은 서열번호 2307 내지 2482 또는 12042 내지 12159 중 어느 하나의 서열을 포함하는 하나 이상의 경쇄 상보성 결정 영역 (vL) 도메인 및/또는 서열번호 2506 내지 2680 또는 12160 내지 12278의 서열을 포함하는 하나 이상의 중쇄 상보성 결정 영역 (vH) 도메인을 포함한다. 임의의 전술한 발명의 또 다른 또는 추가의 구현예에서, 하나 이상의 비-천연 TCR 항원 결합 도메인(들)은 각각이 최대 10개의 보존적 아미노산 치환을 갖는 서열번호 2770 내지 2939, 12303 내지 12357 또는 18162 내지 18224로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 갖는 scFv 단편을 포함한다. 임의의 전술한 발명의 또 다른 또는 추가의 구현예에서, 하나 이상의 비-천연 TCR 항원 결합 도메인(들)은 각각이 최대 10개의 보존적 아미노산 치환을 갖는 임의의 서열번호 2736 내지 2748의 아미노산 서열을 포함하는 하나 이상의 수용체를 포함한다. 임의의 전술한 발명의 또 다른 또는 추가의 구현예에서, 하나 이상의 비-천연 TCR 항원 결합 도메인(들)은 최대 10개의 보존적 아미노산 치환을 갖는 임의의 서열번호 2758 내지 2768 또는 12359 내지 12361의 서열을 포함하는 하나 이상의 수용체를 포함한다. 임의의 전술한 발명의 또 다른 또는 추가의 구현예에서, 하나 이상의 비-천연 TCR 항원 결합 도메인(들)은 CD16A, NKG2D, CD4, PD1, 데스모글레인 3 (Dsg3) 또는 CD4-DC-SIGN의 세포외 도메인을 포함한다. 임의의 전술한 발명의 또 다른 또는 추가의 구현예에서, 하나 이상의 비-천연 TCR 항원 결합 도메인(들)은 hTPO, mTPO, CGHα 사슬, CGHβ 사슬, FHβ 사슬, LHβ 사슬, TSHβ 사슬, APRIL 또는 이들의 조합 중 하나 이상의 세포외 도메인을 포함한다. 임의의 전술한 발명의 또 다른 또는 추가의 구현예에서, 하나 이상의 비-천연 TCR 항원 결합 도메인(들)은 임의의 서열번호 2770 내지 2939, 12303 내지 12357 또는 18162 내지 18224의 서열을 포함하고, 최대 10개의 보존적 아미노산 치환을 갖는 임의의 단일 사슬 가변 단편 (scFv), 및 (a) 최대 10개의 보존적 아미노산 치환을 갖는 임의의 서열번호 2701 내지 2725 또는 12279 내지 12294에 나타낸 바와 같은 임의의 카멜리드 vHH; 또는 (b) 임의의 서열번호 2728 내지 2732 또는 12296 내지 12301에 나타낸 바와 같은 서열을 갖고, 최대 10개의 보존적 아미노산 치환을 갖는 임의의 비-면역글로불린 항원 결합 도메인; 또는 (c) 최대 10개의 보존적 아미노산 치환을 갖는 임의의 서열번호 2736 내지 2748의 아미노산 서열을 포함하는 수용체의 임의의 세포외 도메인; 또는 (d) 최대 10개의 보존적 아미노산 치환을 갖는 임의의 서열번호 2758 내지 2768 또는 12359 내지 12361의 서열을 포함하는 리간드의 임의의 세포외 도메인을 포함한다. 임의의 전술한 발명의 또 다른 또는 추가의 구현예에서, 하나 이상의 비-천연 TCR 항원 결합 도메인(들)은 최대 10개의 보존적 아미노산 치환을 갖는 임의의 서열번호 2701 내지 2725 또는 12279 내지 12294에 나타낸 바와 같은 카멜리드 vHH, 및 (a) 임의의 서열번호 2770 내지 2939, 12303 내지 12357 또는 18162 내지 18224의 서열을 포함하고, 최대 10개의 보존적 아미노산 치환을 갖는 임의의 단일 사슬 가변 단편 (scFv); 또는 (b) 임의의 서열번호 2728 내지 2732 또는 12296 내지 12301에 나타낸 바와 같은 서열을 갖고, 최대 10개의 보존적 아미노산 치환을 갖는 임의의 비-면역글로불린 항원 결합 도메인; 또는 (c) 최대 10개의 보존적 아미노산 치환을 갖는 임의의 서열번호 2736 내지 2748의 아미노산 서열을 포함하는 수용체의 임의의 세포외 도메인; 또는 (d) 최대 10개의 보존적 아미노산 치환을 갖는 임의의 서열번호 2758 내지 2768 또는 12359 내지 12361의 서열을 포함하는 리간드의 임의의 세포외 도메인을 포함한다. 임의의 전술한 발명의 또 다른 또는 추가의 구현예에서, 하나 이상의 비-천연 TCR 항원 결합 도메인(들)은 선택적으로 링커 영역에 의해 TCR 불변 영역 사슬 각각에 연결되고, 링커 영역 핵산은 서열번호 2981 내지 2992 및 이들의 임의의 조합 또는 이와 적어도 98% 동일성을 갖는 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 인코딩하거나, 링커가 서열번호 701 내지 714 또는 이와 적어도 98% 동일성을 갖는 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 핵산 서열에 의해 인코딩된다. 임의의 전술한 발명의 또 다른 또는 추가의 구현예에서, 하나 이상의 비-천연 TCR 항원 결합 도메인(들)은 이것이 획득된 항체보다 적어도 5배 낮은 이의 표적 항원에 대한 결합 친화도를 갖는다. 임의의 전술한 발명의 또 다른 또는 추가의 구현예에서, SIR을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드는 각각의 사슬의 N-말단에 존재하는 리더 서열 또는 신호 펩티드를 추가로 포함하고, 서열번호 1 내지 9 및 10으로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함한다. 임의의 전술한 발명의 또 다른 또는 추가의 구현예에서, SIR은 SIR 이종이량체를 포함한다. 임의의 전술한 발명의 또 다른 또는 추가의 구현예에서, 폴리펩티드는 절단가능한 링커에 의해 연결된 두 개의 SIR을 포함한다. 추가의 구현예에서, 절단가능한 링커는 자가-절단하는 절단가능한 링커이다. 추가의 구현예에서, 절단가능한 링커는 2A 링커, 2A-유사 링커 또는 이들의 기능적 등가물 중 임의의 하나 이상이다. 또한 추가의 구현예에서, 절단가능한 링커는 T2A 링커, P2A, F2A, E2A 링커 또는 이들의 기능적 등가물 중 임의의 하나 이상이다. 또한 추가의 구현예에서, 절단가능한 링커는 서열번호 780 내지 785 중 임의의 하나 이상의 서열을 포함한다. 추가의 구현예에서, 절단가능한 링커는 선택적으로 퓨린 절단 부위 또는 퓨린 유사 절단 부위 또는 이들의 기능적 등가물이 선행한다. 또한 추가의 구현예에서, 절단가능한 링커를 선행하는 퓨린 절단 부위는 서열번호 788 내지 790 중 임의의 하나 이상의 서열을 포함한다. 임의의 전술한 구현예에서, 절단가능한 링커는 가요성 링커가 선행한다. 추가의 구현예에서, 절단가능한 링커를 선행하는 가요성 링커는 Ser-Gly 링커, Ser-Gly-Ser-Gly 링커 또는 이들의 기능적 등가물 중 하나 이상을 인코딩한다. 또한 추가의 구현예에서, 절단가능한 링커를 선행하는 가요성 링커는 서열번호 786 또는 787의 서열을 포함한다. 또한 추가의 구현예에서, 퓨린 절단 부위는 가요성 링커가 선행하고, 이는 절단가능한 링커가 선행하여 퓨린 절단 부위 - 가요성 링커 - 절단가능한 링커의 순서가 된다. 임의의 전술한 발명의 또 다른 또는 추가의 구현예에서, SIR은 선택된 항원에 대한 바람직한 결합 친화도를 갖도록 설계된다.
본 발명은 또한 본원 및 상기에 기술된 바와 같은 폴리펩티드 또는 헤테로이량체 중 적어도 하나를 포함하는 면역 효과기 세포 또는 줄기 세포를 제공한다.
본 발명은 또한 본원 및 상기에 기술된 바와 같은 재조합 폴리뉴클레오티드 중 적어도 하나를 포함하는 면역 효과기 세포 또는 줄기 세포를 제공한다.
본 발명은 또한 본원 및 상기에 기술된 바와 같은 벡터 중 적어도 하나를 포함하는 면역 효과기 세포 또는 줄기 세포를 제공한다.
임의의 전술한 발명의 또 다른 또는 추가의 구현예에서, 임의의 면역 세포 또는 줄기 세포는 다수의 SIR 폴리펩티드를 포함한다. 임의의 전술한 발명의 또 다른 또는 추가의 구현예에서, 다수의 SIR 폴리펩티드 중 적어도 하나의 SIR 폴리펩티드는 적어도 하나의 다른 SIR 폴리펩티드가 아닌 상이한 항원을 표적한다. 임의의 전술한 발명의 또 다른 또는 추가의 구현예에서, 다수의 SIR 폴리펩티드 중 적어도 하나의 SIR 폴리펩티드는 동일한 항원을 표적한다. 임의의 전술한 발명의 또 다른 또는 추가의 구현예에서, 다수의 SIR 폴리펩티드 중 적어도 하나의 SIR 폴리펩티드는 적어도 하나의 다른 SIR 폴리펩티드가 아닌 항원에 대한 상이한 결합 친화도를 포함한다. 임의의 전술한 발명의 또 다른 또는 추가의 구현예에서, 면역 세포는 적어도 하나의 키메라 항원 수용체 (CAR) 폴리펩티드를 추가로 포함한다. 임의의 전술한 발명의 또 다른 또는 추가의 구현예에서, SIR 폴리펩티드의 항원 결합 도메인은 CAR 폴리펩티드의 항원 결합 도메인이 아닌 상이한 항원을 표적한다. 임의의 전술한 발명의 또 다른 또는 추가의 구현예에서, CAR 폴리펩티드는 보조자극 신호전달 도메인을 포함하는 세포내 신호전달 도메인을 포함하지만 일차 신호전달 도메인은 포함하지 않거나, 일차 신호전달 도메인을 포함하는 세포내 신호전달 도메인을 포함하지만 보조자극 신호전달 도메인은 포함하지 않는다. 임의의 전술한 발명의 또 다른 또는 추가의 구현예에서, CAR 폴리펩티드는 4-lBB, CD28, CD27 또는 OX-40로 이루어진 군으로부터 선택된 기능적 신호전달 도메인을 포함하는 보조자극 신호전달 도메인을 포함하거나, CAR 폴리펩티드는 CD3 제타의 기능적 신호전달 도메인을 포함하는 일차 신호전달 도메인을 포함한다. 임의의 전술한 발명의 또 다른 또는 추가의 구현예에서, CAR 폴리펩티드는 억제성 CAR 폴리펩티드이고, 억제성 CAR 폴리펩티드는 항원 결합 도메인, 막통과 도메인 및 억제성 분자의 세포내 도메인을 포함하고, 억제성 분자는 PDl, PD-Ll, CTLA4, TIM3, LAG3, VISTA, BTLA, TIGIT, LAIRl, CD160, 2B4, TGFRβ, CEACAM-1, CEACAM-3 및 CEACAM-5로 이루어진 군으로부터 선택된다. 임의의 전술한 발명의 또 다른 또는 추가의 구현예에서, CAR 폴리펩티드는 일차 신호전달 도메인 및/또는 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 세포내 신호전달 도메인을 추가로 포함하고, 세포내 신호전달 도메인은 CD3 제타의 기능적 신호전달 도메인을 포함하는 일차 신호전달 도메인 및 4-lBB 또는 CD28 또는 둘 다의 기능적 도메인을 포함하는 보조자극 신호전달 도메인을 포함한다. 임의의 전술한 발명의 또 다른 또는 추가의 구현예에서, CAR 폴리펩티드는 서열번호 3077 내지 3083의 아미노산 서열을 포함한다. 임의의 전술한 발명의 또 다른 또는 추가의 구현예에서, 면역 효과기 세포는 인간 T 세포, 인간 NKT 세포 또는 면역 효과기 세포를 유도할 수 있는 합성 T 세포 또는 줄기 세포이고, 선택적으로 T 세포는 디아글리세롤 키나제 (DGK) 및/또는 이카로스 결핍 및/또는 Brd4 결핍이다.
본 발명은 SIR 발현하는 면역 효과기 세포를 제조하는 방법으로서, 본 발명의 벡터 중 적어도 하나 또는 본 발명의 재조합 폴리뉴클레오티드 중 적어도 하나를 SIR 폴리펩티드가 발현되는 조건 하에 면역 효과기 세포 또는 면역 효과기 세포를 유도할 수 있는 조혈 줄기 세포 또는 전구 세포 내로 도입하는 단계를 포함하는, 방법을 제공한다. 임의의 전술한 발명의 또 다른 또는 추가의 구현예에서, 방법은 a) 면역 효과기 세포의 집단을 제공하는 단계; 및 b) 집단으로부터 T 조절 세포를 제거하고, 이로써 T 조절-고갈된 세포의 집단을 제공하는 단계:를 추가로 포함하고, 여기서 단계 a) 및 b)는 SIR을 인코딩하는 벡터 또는 재조합 폴리뉴클레오티드를 집단 내로 도입하기 이전에 수행된다. 임의의 전술한 발명의 또 다른 또는 추가의 구현예에서, T 조절 세포는 항-CD25 항체 또는 항-GITR 항체를 사용하여 세포 집단으로부터 제거된다. 임의의 전술한 발명의 또 다른 또는 추가의 구현예에서, 방법은 a) 면역 효과기 세포의 집단을 제공하는 단계; 및 b) 세포 집단으로부터 P-당단백질 (P-gp 또는 Pgp; MDR1, ABCB1, CD243)-양성 세포를 농축시키고, 이로써 P-당단백질 (P-gp 또는 Pgp; MDR1, ABCB1, CD243)-농축된 세포의 집단을 제공하는 단계:를 추가로 포함하고, 여기서 단계 a) 및 b)는 SIR을 인코딩하는 벡터 또는 재조합 폴리뉴클레오티드를 도입하기 이전 또는 이후에 수행된다. 임의의 전술한 발명의 또 다른 또는 추가의 구현예에서, P-당단백질 양성 세포는 i) P-당단백질 특이적 항체 중 하나 또는 이의 칵테일을 사용한 면역선별 방법; ii) P-당단백질의 기질인 형광 염료, 테트라메틸로다민 메틸 에스테르 (TMRM), 아드리아마이신 및 액티노마이신-D 중 하나 이상으로 P-당단백질이 펌프로서 활성을 갖는 조건 하에 염색하여, 염료로 덜 염색되는 세포를 농축시키는 방법; iii) TH9402, 2-(4,5-디브로모-6-아미노-3-이미노-3H-잔텐-9-일)-벤조산 메틸 에스테르 염화물, 2-(4,5-디브로모-6-아미노-3-이미노-3H-잔텐-9-일)-벤조산 에틸 에스테르 염화물, 2-(4,5-디브로모-6-아미노-3-이미노-3H-잔텐-9-일)-벤조산 메틸 옥틸 에스테르 염화물, 2-(4,5-디브로모-6-아미노-3-이미노-3H-잔텐-9-일)-벤조산 n-부틸 에스테르 염화물, 2-(6-에틸 아미노-3-에틸 이미노-3H-잔텐-9-일)-벤조산 메틸 n-부틸 에스테르 염화물 또는 이들의 유도체 또는 이들의 조합 중 임의의 하나 이상과 같은 P-당단백질의 기질인, 광 독성 화합물에 저항성을 갖는 세포의 선별 방법; 및 iv) 빈크리스틴, 빈블라스틴, 택솔, 파크리탁셀, 미토잔트론, 에토포시드, 아드리아마이신, 다우노루비신 및 액티노마이신-D와 같은 P-당단백질의 기질은 세포 독성 화합물에 저항성을 갖는 세포의 선별 방법로 이루어진 군으로부터 선택된 임의의 하나 이상의 방법을 사용하여 농축된다.
본 발명은 RNA-조작된 세포의 집단을 생성하는 방법으로서, 시험관내에서 전사된 RNA 또는 RNA들 또는 합성 RNA 또는 RNA들을 세포 또는 세포의 집단 내에 도입하는 단계를 포함하는 방법을 제공하고, 여기서 RNA 또는 RNA들은 본원 및 상기에 기술된 바와 같은 재조합 폴리뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
본 발명은 피험자에서 항-질환 면역을 제공하는 방법으로서, 본 발명의 면역 효과기 세포 또는 면역 효과기 세포를 유도할 수 있는 줄기 세포의 유효량을 피험자에게 투여하는 것을 포함하고, 여기서 세포는 자가유래 T 세포 또는 동종유래 T 세포, 또는 자가유래 NKT 세포 또는 동종유래 NKT 세포, 또는 면역 효과기 세포를 유도할 수 있는 자가유래 또는 동종유래 조혈 줄기 세포이다. 일 구현예에서, 동종유래 T 세포 또는 동종유래 NKT 세포 기능적 TCR 또는 기능적 HLA의 발현이 결여되거나 이의 낮은 발현을 갖는다.
본 발명은 또한 면역 효과기 세포 또는 면역 효과기 세포를 생성할 수 있는 줄기 세포를 포함하는 조성물로서, 질환 관련 항원의 발현과 연관된 질환을 갖는 피험자의 치료 및 질환 관련 항원의 발현과 관련된 질환의 위험성이 증가된 피험자에서 질환의 예방에서 면역 효과기 세포의 효능을 증가시키는 제제와 조합하여 사용되는 하나 이상의 합성 면역 수용체 (SIR)을 포함하는 조성물을 제공하고, 여기서 (i) SIR 분자는 질환과 관련된 질환 관련 항원에 결합하는 하나 이상의 항원 결합 도메인에 조건부 링커를 통해 연결되는 하나 이상의 T 세포 수용체 불변 사슬을 포함하고, 질환 관련 항원은 CD5; CD19; CD123; CD22; CD30; CD171; CS-1 (CD2 하위집합 1, CRACC, SLAMF7, CD319 및 19A24라고도 지칭됨); C형 렉틴-유사 분자-1 (CLL-1 또는 CLECL1); CD33; 표피 성장인자 수용체 변이체 Ⅲ (EGFRvⅢ); 갱글리오시드 G2 (GD2); 갱글리오시드 GD3 (aNeu5Ac(2-8)aNeu5Ac(2-3)bDGalp(l-4)bDGlcp(l-l)Cer); TNF 수용체 패밀리 구성원 B 세포 성숙 (BCMA); Tn 항원 ((Tn Ag) 또는 (GalNAcα-Ser/Thr)); 전립선-특이적 막 항원 (PSMA); 수용체 타이로신 키나제-유사 고아 수용체 1 (ROR1); Fms 유사 타이로신 키나제 3 (FLT3); 종양-관련 당당백질 72 (TAG72); CD38; CD44v6; 급성 백혈병 또는 림프종 상에서 발현되지만 조혈 전구세포 상에서는 발현되지 않는 글리코실화된 CD43 에피토프; 비-조혈성 암 상에서 발현된 글리코실화된 CD43 에피토프; 암배아 항원 (CEA); 상피세포 부착 분자 (EPCAM); B7H3 (CD276); KIT (CD117); 인터루킨-13 수용체 소단위체 알파-2 (IL-13Ra2 또는 CD213A2); 메소틸린; 인터루킨 11 수용체 알파 (IL-llRa); 전립선 줄기 세포 항원 (PSCA); 프로테아제 세린 21 (테스티신 또는 PRSS21); 혈관 내피 성장인자 수용체 2 (VEGFR2); 루이스 (Y) 항원; CD24; 혈소판-유래 성장인자 수용체 베타 (PDGFR-베타); 단계-특이적 배아 항원-4 (SSEA-4); CD20; 폴레이트 수용체 알파; 수용체 타이로신-단백질 키나제 ERBB2 (Her2/neu); 세포 표면 연관된 뮤신 1 (MUC1); 상피 성장인자 수용체 (EGFR); 신경 세포 부착 분자 (NCAM); 프로스타제; 전립샘 산 포스파타제 (PAP); 변이된 신장인자 2 (ELF2M); 에프린 B2; 섬유모세포 활성화 단백질 알파 (FAP); 인슐린-유사 성장인자 1 수용체 (IGF-I 수용체); 탄산 무수화제 Ⅸ (CAⅨ); 프로테오좀 (프로좀, 마크로페인) 소단위체 베타형, 9 (LMP2); 당단백질 100 (gpl00); 절단점 클러스터 영역 (BCR)으로 구성된 종양원 유전자 융합 단백질 및 아벨슨 마우스 백혈병 바이러스 종양원 유전자 상동체 1 (Abl) (bcr-abl); 티로시나제; 에프린 A형 수용체 2 (EphA2); 퓨코실 GM1; 시아릴 루이스 부착 분자 (sLe); 갱글리오시드 GM3 (aNeu5Ac(2-3)bDClalp(l-4)bDGlcp(l-1)Cer); 글루타민 전이효소 5 (TGS5); 고분자량 흑색종 관련된 항원 (HMWMAA); o-아세틸-GD2 갱글리오시드 (OAcGD2); 종양 내피 마커 1 (TEM1/CD248); 관련된 종양 내피 마커 7 (TEM7R); 클라우딘 6 (CLDN6); 갑상샘 자극호르몬 수용체 (TSHR); G 단백질 연결된 수용체 클래스 C 그룹 5, 구성원 D (GPRC5D); 염색체 X 오픈 리딩 프레임 61 (CXORF61); CD97; CD179a; 역형성 림프종 키나제 (ALK); 폴리시알산; 태반-특이적 항원 1 (PLAC1); 글로보H 글리코세라미드의 육당질 부분 (글로보H); 유샘 분화 항원 (NY-BR-1); 유로플라킨 2 (UPK2); A형 간염 바이러스 세포 수용체 1 (HAVCR1); 아드레노셉터 베타 3 (ADRB3); 패넥신 3 (PANX3); G 단백질-연결된 수용체 20 (GPR20); 림프구 항원 6 복합체, 좌위 K 9 (LY6K); 후각 수용체 51E2 (OR51E2); TCR 감마 교대 리딩 프레임 단백질 (TARP); 윌름 종양 단백질 (WT1); 암/고환 항원 1 (NY-ES0-1); 암/고환 항원 2 (LAGE-1a); 흑색종-관련 항원 1 (MAGE-A1); 염색체 12p 상에 위치한 ETS 전위 변이체 유전자 6 (ETV6-AML); 정자 단백질 17 (SPA17); X 항원 패밀리, 구성원 lA (XAGEl); 안지오포이에틴-결합 세포 표면 수용체 2 (타이 2); 흑색종 암 고환 항원-1 (MAD-CT-1); 흑색종 암 고환 항원-2 (MAD-CT-2); Fos-관련된 항원 1; 종양 단백질 p53 (p53); p53 돌연변이체; 프로스테인; 서바이빈; 텔로머라제; 전립선 암종 종양 항원-1 (PCT A-1 또는 갈렉틴 8); T 세포에 의해 인식되는 흑색종 항원 1 (MelanA 또는 MARTI); 래트 육종 (Ras) 돌연변이체; 인간 텔로머라제 역전사효소 (hTERT); 육종 전위 절단점; 흑색종의 세포사멸 저해제 (ML-IAP); ERG (막통과 프로테아제, 세린 2 (TMPRSS2) ETS 융합 유전자); N-아세틸 글루코사미닐-전이효소 V (NA17); 쌍 형성된 박스 단백질 Pax-3 (PAX3); 안드로겐 수용체; 사이클린 Bl; v-myc 조류 백혈병 바이러스 종양원 유전자 신경모세포종 유래된 상동체 (MYCN); Ras 상동체 패밀리 구성원 C (RhoC); 티로시나제-관련 단백질 2 (TRP-2); 사이토크롬 P450 lB 1 (CYPlB 1); CCCTC-결합 인자 (아연 핑거 단백질)-유사 (BORIS 또는 각인 부위의 조절인자의 형제), T 세포에 의해 인식되는 편평세포 암종 항원 3 (SART3); 쌍 형성된 박스 단백질 Pax-5 (PAX5); 프로아크로신 결합 단백질 sp32 (OY-TESl); 림프구-특이적 단백질 타이로신 키나제 (LCK); 키나제 고정 단백질 4 (AKAP-4); 활액 육종 X 절단점 2 (SSX2); 진행된 당화 말단 산물의 수용체 (RAGE-1); 신장 유비퀴터스 1 (RUl); 신장 유비퀴터스 2 (RU2); 레구마인; 인간 파필로마 바이러스 E6 (HPV E6); 인간 파필로마 바이러스 E7 (HPV E7); 장내 카르복실 에스테라제; 변이된 열 충격 단백질 70-2 (hsp70-2); CD79a; CD79b; CD72; 백혈구-관련된 면역글로불린-유사 수용체 1 (LAIRl); IgA 수용체의 Fc 단편 (FCAR 또는 CD89); 백혈구 면역글로불린-유사 수용체 서브패밀리 A 구성원 2 (LILRA2); CD300 분자-유사 패밀리 구성원 f (CD300LF); C형 렉틴 도메인 패밀리 12 구성원 A (CLEC12A); 골수 간질 세포 항원 2 (BST2); EGF-유사 모듈-포함 뮤신-유사 호르몬 수용체-유사 항원 2 (EMR2); 림프구 항원 75 (LY75); 글리피칸-3 (GPC3); Fc 수용체-유사 5 (FCRL5); 면역글로불린 람다-유사 폴리펩티드 1 (IGLLl); MPL; 바이오틴; c-MYC 에피토프 태그; CD34; LAMP1; TROP2;, GFRα4; CDH17; CDH6; NYBR1; CDH19; CD200R; Slea (CA19.9; 시아릴 루이스 항원); 퓨코실-GM1; PTK7; gpNMB; CDH1-CD324; DLL3; CD276/B7H3; IL-11Ra; IL-13Ra2; CD179b-IGLl1; ALK TCRγ-δ; NKG2D; CD32 (FCGR2A); Tn 항원; CSPG4-HMW-MAA; Tim1-/HVCR1; CSF2RA (GM-CSFR-알파); TGFβR2; VEGFR2/KDR; 루이스 항원; TCR-β1 사슬; TCR-β2 사슬, TCR-γ 사슬, TCR-δ 사슬; FITC; 황체형성 호르몬 수용체 (LHR); 난포 자극 호르몬 수용체 (FSHR); 융모생식샘 자극호르몬 수용체 (CGHR); CCR4; GD3; SLAMF6; SLAMF4; HIV1 외투 당단백질; HTLV1-Tax; CMV pp65; EBV-EBNA3c; 인플루엔자 A 헤마글루티닌 (HA); GAD; PDL1; 구아니릴 사이클라제 C (GCC); KSHV-K8.1 단백질; KSHV-gH 단백질; 데스모글레인 3 (Dsg3)에 대한 자가항체; 데스모글레인 1 (Dsg1)에 대한 자가항체; HLA, HLA-A, HLA-A2, HLA-B, HLA-C, HLA-DP, HLA-DM, HLA-DOA, HLA-DOB, HLA-DQ, HLA-DR, HLA-G; IGE; CD99; RAS; G12V; 조직 인자 1 (TF1); AFP; GPRC5D; 클라우딘18.2 (CLD18A2 또는 CLDN18A.2)); P-당단백질; STEAP1; LIV1; 넥틴-4; CRIPTO; GPA33; BST1/CD157; 저전도도 염화물 통로; 및 TNT 항체에 의해 인식되는 항원으로 이루어진 군으로부터 선택되고, (ii) 상기 면역 세포의 효능을 증가시키는 제제는 단백질 포스파타제 저해제; 키나제 저해제 (예로, PI3K/AKT 저해제, mTOR 저해제, LCK 저해제 또는 BTK 저해제); 사이토카인; 면역 억제성 분자의 저해제; TREG 세포의 수준 또는 활성을 감소시키는 제제; SIR-변형된 세포의 증식 및/또는 유지를 증가시키는 제제; 케모카인; SIR의 발현을 증가시키는 제제; SIR의 발현 또는 활성의 조절을 허용하는 제제; SIR-변형된 세포의 증식 및/또는 유지 동안 통제를 허용하는 제제; SIR-변형된 세포의 부작용을 통제하는 제제; Brd4 저해제; 치료제 (예로, sHVEM) 또는 예방제를 질환의 부위에 전달하는 제제; SIR이 유도되는 표적 항원의 발현을 증가시키는 제제; 및 아데노신 A2a 수용체 중 하나 이상으로부터 선택된다.
본 발명은 피험자에서 질환 관련 항원의 발현과 연관된 질환을 치료하거나 예방하는 방법으로서, 합성 면역 수용체 (SIR) 분자를 포함하는 면역 효과기 세포의 유효량을 면역 세포의 효능을 증가시키는 제제와 조합하여 피험자에게 투여하는 것을 포함하는 방법을 제공하고, 여기서 (i) SIR 분자는 질환과 연관된 질환 관련 항원에 결합하는 하나 이상의 항원 결합 도메인에 조건부 링커를 통해 연결되는 하나 이상의 T 세포 수용체 불변 사슬을 포함하고, 질환 관련 항원은 CD5; CD19; CD123; CD22; CD30; CD171; CS-1 (CD2 하위집합 1, CRACC, SLAMF7, CD319 및 19A24라고도 지칭됨); C형 렉틴-유사 분자-1 (CLL-1 또는 CLECL1); CD33; 표피 성장인자 수용체 변이체 Ⅲ (EGFRvⅢ); 갱글리오시드 G2 (GD2); 갱글리오시드 GD3 (aNeu5Ac(2-8)aNeu5Ac(2-3)bDGalp(l-4)bDGlcp(l-l)Cer); TNF 수용체 패밀리 구성원 B 세포 성숙 (BCMA); Tn 항원 ((Tn Ag) 또는 (GalNAcα-Ser/Thr)); 전립선-특이적 막 항원 (PSMA); 수용체 타이로신 키나제-유사 고아 수용체 1 (ROR1); Fms 유사 타이로신 키나제 3 (FLT3); 종양-관련 당당백질 72 (TAG72); CD38; CD44v6; 급성 백혈병 또는 림프종 상에서 발현되지만 조혈 전구세포 상에서는 발현되지 않는 글리코실화된 CD43 에피토프; 비-조혈성 암 상에서 발현된 글리코실화된 CD43 에피토프; 암배아 항원 (CEA); 상피세포 부착 분자 (EPCAM); B7H3 (CD276); KIT (CD117); 인터루킨-13 수용체 소단위체 알파-2 (IL-13Ra2 또는 CD213A2); 메소틸린; 인터루킨 11 수용체 알파 (IL-llRa); 전립선 줄기 세포 항원 (PSCA); 프로테아제 세린 21 (테스티신 또는 PRSS21); 혈관 내피 성장인자 수용체 2 (VEGFR2); 루이스 (Y) 항원; CD24; 혈소판-유래 성장인자 수용체 베타 (PDGFR-베타); 단계-특이적 배아 항원-4 (SSEA-4); CD20; 폴레이트 수용체 알파; 수용체 타이로신-단백질 키나제 ERBB2 (Her2/neu); 세포 표면 연관된 뮤신 1 (MUC1); 상피 성장인자 수용체 (EGFR); 신경 세포 부착 분자 (NCAM); 프로스타제; 전립샘 산 포스파타제 (PAP); 변이된 신장인자 2 (ELF2M); 에프린 B2; 섬유모세포 활성화 단백질 알파 (FAP); 인슐린-유사 성장인자 1 수용체 (IGF-I 수용체); 탄산 무수화제 Ⅸ (CAⅨ); 프로테오좀 (프로좀, 마크로페인) 소단위체 베타형, 9 (LMP2); 당단백질 100 (gpl00); 절단점 클러스터 영역 (BCR)으로 구성된 종양원 유전자 융합 단백질 및 아벨슨 마우스 백혈병 바이러스 종양원 유전자 상동체 1 (Abl) (bcr-abl); 티로시나제; 에프린 A형 수용체 2 (EphA2); 퓨코실 GM1; 시아릴 루이스 부착 분자 (sLe); 갱글리오시드 GM3 (aNeu5Ac(2-3)bDClalp(l-4)bDGlcp(l-1)Cer); 글루타민 전이효소 5 (TGS5); 고분자량 흑색종 관련된 항원 (HMWMAA); o-아세틸-GD2 갱글리오시드 (OAcGD2); 종양 내피 마커 1 (TEM1/CD248); 관련된 종양 내피 마커 7 (TEM7R); 클라우딘 6 (CLDN6); 갑상샘 자극호르몬 수용체 (TSHR); G 단백질 연결된 수용체 클래스 C 그룹 5, 구성원 D (GPRC5D); 염색체 X 오픈 리딩 프레임 61 (CXORF61); CD97; CD179a; 역형성 림프종 키나제 (ALK); 폴리시알산; 태반-특이적 항원 1 (PLAC1); 글로보H 글리코세라미드의 육당질 부분 (글로보H); 유샘 분화 항원 (NY-BR-1); 유로플라킨 2 (UPK2); A형 간염 바이러스 세포 수용체 1 (HAVCR1); 아드레노셉터 베타 3 (ADRB3); 패넥신 3 (PANX3); G 단백질-연결된 수용체 20 (GPR20); 림프구 항원 6 복합체, 좌위 K 9 (LY6K); 후각 수용체 51E2 (OR51E2); TCR 감마 교대 리딩 프레임 단백질 (TARP); 윌름 종양 단백질 (WT1); 암/고환 항원 1 (NY-ES0-1); 암/고환 항원 2 (LAGE-1a); 흑색종-관련 항원 1 (MAGE-A1); 염색체 12p 상에 위치한 ETS 전위 변이체 유전자 6 (ETV6-AML); 정자 단백질 17 (SPA17); X 항원 패밀리, 구성원 lA (XAGEl); 안지오포이에틴-결합 세포 표면 수용체 2 (타이 2); 흑색종 암 고환 항원-1 (MAD-CT-1); 흑색종 암 고환 항원-2 (MAD-CT-2); Fos-관련된 항원 1; 종양 단백질 p53 (p53); p53 돌연변이체; 프로스테인; 서바이빈; 텔로머라제; 전립선 암종 종양 항원-1 (PCT A-1 또는 갈렉틴 8); T 세포에 의해 인식되는 흑색종 항원 1 (MelanA 또는 MARTI); 래트 육종 (Ras) 돌연변이체; 인간 텔로머라제 역전사효소 (hTERT); 육종 전위 절단점; 흑색종의 세포사멸 저해제 (ML-IAP); ERG (막통과 프로테아제, 세린 2 (TMPRSS2) ETS 융합 유전자); N-아세틸 글루코사미닐-전이효소 V (NA17); 쌍 형성된 박스 단백질 Pax-3 (PAX3); 안드로겐 수용체; 사이클린 Bl; v-myc 조류 백혈병 바이러스 종양원 유전자 신경모세포종 유래된 상동체 (MYCN); Ras 상동체 패밀리 구성원 C (RhoC); 티로시나제-관련 단백질 2 (TRP-2); 사이토크롬 P450 lB 1 (CYPlB 1); CCCTC-결합 인자 (아연 핑거 단백질)-유사 (BORIS 또는 각인 부위의 조절인자의 형제), T 세포에 의해 인식되는 편평세포 암종 항원 3 (SART3); 쌍 형성된 박스 단백질 Pax-5 (PAX5); 프로아크로신 결합 단백질 sp32 (OY-TESl); 림프구-특이적 단백질 타이로신 키나제 (LCK); 키나제 고정 단백질 4 (AKAP-4); 활액 육종 X 절단점 2 (SSX2); 진행된 당화 말단 산물의 수용체 (RAGE-1); 신장 유비퀴터스 1 (RUl); 신장 유비퀴터스 2 (RU2); 레구마인; 인간 파필로마 바이러스 E6 (HPV E6); 인간 파필로마 바이러스 E7 (HPV E7); 장내 카르복실 에스테라제; 변이된 열 충격 단백질 70-2 (hsp70-2); CD79a; CD79b; CD72; 백혈구-관련된 면역글로불린-유사 수용체 1 (LAIRl); IgA 수용체의 Fc 단편 (FCAR 또는 CD89); 백혈구 면역글로불린-유사 수용체 서브패밀리 A 구성원 2 (LILRA2); CD300 분자-유사 패밀리 구성원 f (CD300LF); C형 렉틴 도메인 패밀리 12 구성원 A (CLEC12A); 골수 간질 세포 항원 2 (BST2); EGF-유사 모듈-포함 뮤신-유사 호르몬 수용체-유사 항원 2 (EMR2); 림프구 항원 75 (LY75); 글리피칸-3 (GPC3); Fc 수용체-유사 5 (FCRL5); 면역글로불린 람다-유사 폴리펩티드 1 (IGLLl); MPL; 바이오틴; c-MYC 에피토프 태그; CD34; LAMP1; TROP2;, GFRα4; CDH17; CDH6; NYBR1; CDH19; CD200R; Slea (CA19.9; 시아릴 루이스 항원); 퓨코실-GM1; PTK7; gpNMB; CDH1-CD324; DLL3; CD276/B7H3; IL-11Ra; IL-13Ra2; CD179b-IGLl1; ALK TCRγ-δ; NKG2D; CD32 (FCGR2A); Tn 항원; CSPG4-HMW-MAA; Tim1-/HVCR1; CSF2RA (GM-CSFR-알파); TGFβR2; VEGFR2/KDR; 루이스 항원; TCR-β1 사슬; TCR-β2 사슬, TCR-γ 사슬, TCR-δ 사슬; FITC; 황체형성 호르몬 수용체 (LHR); 난포 자극 호르몬 수용체 (FSHR); 융모생식샘 자극호르몬 수용체 (CGHR); CCR4; GD3; SLAMF6; SLAMF4; HIV1 외투 당단백질; HTLV1-Tax; CMV pp65; EBV-EBNA3c; 인플루엔자 A 헤마글루티닌 (HA); GAD; PDL1; 구아니릴 사이클라제 C (GCC); KSHV-K8.1 단백질; KSHV-gH 단백질; 데스모글레인 3 (Dsg3)에 대한 자가항체; 데스모글레인 1 (Dsg1)에 대한 자가항체; HLA, HLA-A, HLA-A2, HLA-B, HLA-C, HLA-DP, HLA-DM, HLA-DOA, HLA-DOB, HLA-DQ, HLA-DR, HLA-G; IGE; CD99; RAS; G12V; 조직 인자 1 (TF1); AFP; GPRC5D; 클라우딘18.2 (CLD18A2 또는 CLDN18A.2)); P-당단백질; STEAP1; LIV1; 넥틴-4; CRIPTO; GPA33; BST1/CD157; 저전도도 염화물 통로; 및 TNT 항체에 의해 인식되는 항원으로 이루어진 군으로부터 선택되고, (ii) 면역 세포의 효능을 증가시키는 제제는 단백질 포스파타제 저해제; 키나제 저해제 (예로, PI3K/AKT 저해제, mTOR 저해제, LCK 저해제 또는 BTK 저해제); 사이토카인; 면역 억제성 분자의 저해제; TREG 세포의 수준 또는 활성을 감소시키는 제제; SIR-변형된 세포의 증식 및/또는 유지를 증가시키는 제제; 케모카인; SIR의 발현을 증가시키는 제제; SIR의 발현 또는 활성의 조절을 허용하는 제제; SIR-변형된 세포의 증식 및/또는 유지 동안 통제를 허용하는 제제; SIR-변형된 세포의 부작용을 통제하는 제제; Brd4 저해제; 치료제 (예로, sHVEM) 또는 예방제를 질환의 부위에 전달하는 제제; SIR이 유도되는 표적 항원의 발현을 증가시키는 제제; 및 아데노신 A2a 수용체 중 하나 이상으로부터 선택되고, 이로써 피험자를 치료하거나 피험자에서 질환을 예방한다.
본 발명은 피험자에서 질환 관련 항원의 발현과 연관된 질환을 치료하거나 예방하는 방법으로서, 합성 면역 수용체 (SIR) 분자를 포함하는 면역 효과기 세포의 유효량을 피험자에게 투여하는 것을 포함하고, 여기서 SIR 분자는 상기 질환과 연관된 질환 관련 항원에 결합하는 하나 이상의 항원 결합 도메인에 조건부 링커를 통해 연결되는 하나 이상의 T 세포 수용체 불변 사슬을 포함하고, 상기 질환 관련 항원은 CD5; CD19; CD123; CD22; CD30; CD171; CS-1 (CD2 하위집합 1, CRACC, SLAMF7, CD319 및 19A24라고도 지칭됨); C형 렉틴-유사 분자-1 (CLL-1 또는 CLECL1); CD33; 표피 성장인자 수용체 변이체 Ⅲ (EGFRvⅢ); 갱글리오시드 G2 (GD2); 갱글리오시드 GD3 (aNeu5Ac(2-8)aNeu5Ac(2-3)bDGalp(l-4)bDGlcp(l-l)Cer); TNF 수용체 패밀리 구성원 B 세포 성숙 (BCMA); Tn 항원 ((Tn Ag) 또는 (GalNAcα-Ser/Thr)); 전립선-특이적 막 항원 (PSMA); 수용체 타이로신 키나제-유사 고아 수용체 1 (ROR1); Fms 유사 타이로신 키나제 3 (FLT3); 종양-관련 당당백질 72 (TAG72); CD38; CD44v6; 급성 백혈병 또는 림프종 상에서 발현되지만 조혈 전구세포 상에서는 발현되지 않는 글리코실화된 CD43 에피토프; 비-조혈성 암 상에서 발현된 글리코실화된 CD43 에피토프; 암배아 항원 (CEA); 상피세포 부착 분자 (EPCAM); B7H3 (CD276); KIT (CD117); 인터루킨-13 수용체 소단위체 알파-2 (IL-13Ra2 또는 CD213A2); 메소틸린; 인터루킨 11 수용체 알파 (IL-llRa); 전립선 줄기 세포 항원 (PSCA); 프로테아제 세린 21 (테스티신 또는 PRSS21); 혈관 내피 성장인자 수용체 2 (VEGFR2); 루이스 (Y) 항원; CD24; 혈소판-유래 성장인자 수용체 베타 (PDGFR-베타); 단계-특이적 배아 항원-4 (SSEA-4); CD20; 폴레이트 수용체 알파; 수용체 타이로신-단백질 키나제 ERBB2 (Her2/neu); 세포 표면 연관된 뮤신 1 (MUC1); 상피 성장인자 수용체 (EGFR); 신경 세포 부착 분자 (NCAM); 프로스타제; 전립샘 산 포스파타제 (PAP); 변이된 신장인자 2 (ELF2M); 에프린 B2; 섬유모세포 활성화 단백질 알파 (FAP); 인슐린-유사 성장인자 1 수용체 (IGF-I 수용체); 탄산 무수화제 Ⅸ (CAⅨ); 프로테오좀 (프로좀, 마크로페인) 소단위체 베타형, 9 (LMP2); 당단백질 100 (gpl00); 절단점 클러스터 영역 (BCR)으로 구성된 종양원 유전자 융합 단백질 및 아벨슨 마우스 백혈병 바이러스 종양원 유전자 상동체 1 (Abl) (bcr-abl); 티로시나제; 에프린 A형 수용체 2 (EphA2); 퓨코실 GM1; 시아릴 루이스 부착 분자 (sLe); 갱글리오시드 GM3 (aNeu5Ac(2-3)bDClalp(l-4)bDGlcp(l-1)Cer); 글루타민 전이효소 5 (TGS5); 고분자량 흑색종 관련된 항원 (HMWMAA); o-아세틸-GD2 갱글리오시드 (OAcGD2); 종양 내피 마커 1 (TEM1/CD248); 관련된 종양 내피 마커 7 (TEM7R); 클라우딘 6 (CLDN6); 갑상샘 자극호르몬 수용체 (TSHR); G 단백질 연결된 수용체 클래스 C 그룹 5, 구성원 D (GPRC5D); 염색체 X 오픈 리딩 프레임 61 (CXORF61); CD97; CD179a; 역형성 림프종 키나제 (ALK); 폴리시알산; 태반-특이적 항원 1 (PLAC1); 글로보H 글리코세라미드의 육당질 부분 (글로보H); 유샘 분화 항원 (NY-BR-1); 유로플라킨 2 (UPK2); A형 간염 바이러스 세포 수용체 1 (HAVCR1); 아드레노셉터 베타 3 (ADRB3); 패넥신 3 (PANX3); G 단백질-연결된 수용체 20 (GPR20); 림프구 항원 6 복합체, 좌위 K 9 (LY6K); 후각 수용체 51E2 (OR51E2); TCR 감마 교대 리딩 프레임 단백질 (TARP); 윌름 종양 단백질 (WT1); 암/고환 항원 1 (NY-ES0-1); 암/고환 항원 2 (LAGE-1a); 흑색종-관련 항원 1 (MAGE-A1); 염색체 12p 상에 위치한 ETS 전위 변이체 유전자 6 (ETV6-AML); 정자 단백질 17 (SPA17); X 항원 패밀리, 구성원 lA (XAGEl); 안지오포이에틴-결합 세포 표면 수용체 2 (타이 2); 흑색종 암 고환 항원-1 (MAD-CT-1); 흑색종 암 고환 항원-2 (MAD-CT-2); Fos-관련된 항원 1; 종양 단백질 p53 (p53); p53 돌연변이체; 프로스테인; 서바이빈; 텔로머라제; 전립선 암종 종양 항원-1 (PCT A-1 또는 갈렉틴 8); T 세포에 의해 인식되는 흑색종 항원 1 (MelanA 또는 MARTI); 래트 육종 (Ras) 돌연변이체; 인간 텔로머라제 역전사효소 (hTERT); 육종 전위 절단점; 흑색종의 세포사멸 저해제 (ML-IAP); ERG (막통과 프로테아제, 세린 2 (TMPRSS2) ETS 융합 유전자); N-아세틸 글루코사미닐-전이효소 V (NA17); 쌍 형성된 박스 단백질 Pax-3 (PAX3); 안드로겐 수용체; 사이클린 Bl; v-myc 조류 백혈병 바이러스 종양원 유전자 신경모세포종 유래된 상동체 (MYCN); Ras 상동체 패밀리 구성원 C (RhoC); 티로시나제-관련 단백질 2 (TRP-2); 사이토크롬 P450 lB 1 (CYPlB 1); CCCTC-결합 인자 (아연 핑거 단백질)-유사 (BORIS 또는 각인 부위의 조절인자의 형제), T 세포에 의해 인식되는 편평세포 암종 항원 3 (SART3); 쌍 형성된 박스 단백질 Pax-5 (PAX5); 프로아크로신 결합 단백질 sp32 (OY-TESl); 림프구-특이적 단백질 타이로신 키나제 (LCK); 키나제 고정 단백질 4 (AKAP-4); 활액 육종 X 절단점 2 (SSX2); 진행된 당화 말단 산물의 수용체 (RAGE-1); 신장 유비퀴터스 1 (RUl); 신장 유비퀴터스 2 (RU2); 레구마인; 인간 파필로마 바이러스 E6 (HPV E6); 인간 파필로마 바이러스 E7 (HPV E7); 장내 카르복실 에스테라제; 변이된 열 충격 단백질 70-2 (hsp70-2); CD79a; CD79b; CD72; 백혈구-관련된 면역글로불린-유사 수용체 1 (LAIRl); IgA 수용체의 Fc 단편 (FCAR 또는 CD89); 백혈구 면역글로불린-유사 수용체 서브패밀리 A 구성원 2 (LILRA2); CD300 분자-유사 패밀리 구성원 f (CD300LF); C형 렉틴 도메인 패밀리 12 구성원 A (CLEC12A); 골수 간질 세포 항원 2 (BST2); EGF-유사 모듈-포함 뮤신-유사 호르몬 수용체-유사 항원 2 (EMR2); 림프구 항원 75 (LY75); 글리피칸-3 (GPC3); Fc 수용체-유사 5 (FCRL5); 면역글로불린 람다-유사 폴리펩티드 1 (IGLLl); MPL; 바이오틴; c-MYC 에피토프 태그; CD34; LAMP1; TROP2;, GFRα4; CDH17; CDH6; NYBR1; CDH19; CD200R; Slea (CA19.9; 시아릴 루이스 항원); 퓨코실-GM1; PTK7; gpNMB; CDH1-CD324; DLL3; CD276/B7H3; IL-11Ra; IL-13Ra2; CD179b-IGLl1; ALK TCRγ-δ; NKG2D; CD32 (FCGR2A); Tn 항원; CSPG4-HMW-MAA; Tim1-/HVCR1; CSF2RA (GM-CSFR-알파); TGFβR2; VEGFR2/KDR; 루이스 항원; TCR-β1 사슬; TCR-β2 사슬, TCR-γ 사슬, TCR-δ 사슬; FITC; 황체형성 호르몬 수용체 (LHR); 난포 자극 호르몬 수용체 (FSHR); 융모생식샘 자극호르몬 수용체 (CGHR); CCR4; GD3; SLAMF6; SLAMF4; HIV1 외투 당단백질; HTLV1-Tax; CMV pp65; EBV-EBNA3c; 인플루엔자 A 헤마글루티닌 (HA); GAD; PDL1; 구아니릴 사이클라제 C (GCC); KSHV-K8.1 단백질; KSHV-gH 단백질; 데스모글레인 3 (Dsg3)에 대한 자가항체; 데스모글레인 1 (Dsg1)에 대한 자가항체; HLA, HLA-A, HLA-A2, HLA-B, HLA-C, HLA-DP, HLA-DM, HLA-DOA, HLA-DOB, HLA-DQ, HLA-DR, HLA-G; IGE; CD99; RAS; G12V; 조직 인자 1 (TF1); AFP; GPRC5D; 클라우딘18.2 (CLD18A2 또는 CLDN18A.2)); P-당단백질; STEAP1; LIV1; 넥틴-4; CRIPTO; GPA33; BST1/CD157; 저전도도 염화물 통로; 및 TNT 항체에 의해 인식되는 항원:으로 이루어진 군으로부터 선택되고, (ii) SIR 분자의 항원 결합 도메인은 항원 결합 도메인이 유래한 항체보다 적어도 5배 낮은 결합 친화도를 갖는다.
임의의 전술한 방법 또는 용도의 또 다른 또는 추가의 구현예에서, 질환 관련 항원의 발현과 연관된 질환은 증식성 질환, 전암성 병태, 암 및 질환 관련 항원의 발현과 연관된 비-암 관련 적응증으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 임의의 전술한 방법 또는 용도의 또 다른 또는 추가의 구현예에서, 암은 만성 림프구 백혈병 (CLL), 급성 백혈병, 급성 림프성 백혈병 (ALL), B 세포 급성 림프성 백혈성 (B-ALL), T 세포 급성 림프성 백혈성 (T-ALL), 만성 골수성 백혈병 (CML), B 세포 전구림프구 백혈병, 혈장모세포성 가지세포 신생물, 버킷 림프종, 확산성 대형 B 세포 림프종, 일차 삼출 림프종, 난포성 림프종, 털세포 백혈병, 소세포 또는 대세포 난포성 림프종, 악성 림프증식성 병태, MALT 림프종, 외투 세포 림프종, 경계 영역 림프종, 다발성 골수종, 골수이형성증 및 골수이형성 증후군, 비-호지킨 림프종, 호지킨 림프종, 혈장모세포 림프종, 혈장모양 가지세포 신생물, 왈덴스트롬 거대글로불린혈증 또는 전-백혈병으로부터 선택된 혈액학적 암이다. 임의의 전술한 방법 또는 용도의 또 다른 또는 추가의 구현예에서, 암은 결장암, 직장암, 신장세포 암종, 간암, 폐의 비-소세포 암종, 소장의 암, 식도의 암, 흑색종, 골암, 췌장암, 피부암, 두경부의 암, 피부 또는 안구내 악성 흑색종, 자궁암, 난소암, 직장암, 항문 부위의 암, 위암, 고환암, 자궁암, 나팔관의 암종, 자궁내막의 암종, 자궁경부의 암종, 질의 암종, 외음의 암종, 호지킨병, 비-호지킨 림프종, 내분비계의 암, 갑상샘의 암, 부갑상샘의 암, 부신샘의 암, 연조직의 육종, 요도의 암, 음경의 암, 아동의 고형암, 방광의 암, 신장 또는 요관의 암, 신우의 암종, 중추신경계 (CNS)의 신생물, 일차 CNS 림프종, 종양 혈관생성, 척수 종양, 뇌줄기 교아종, 뇌하수체 샘암종, 카포시 육종, 메르켈 세포암, 표피성 암, 편평세포암, T 세포 림프종, 환경적으로 유도된 암, 상기 암의 조합 및 상기 암의 전이성 병변으로 이루어진 군으로 선택된다. 임의의 전술한 방법 또는 용도의 또 다른 또는 추가의 구현예에서, 질환은 이에 제한되는 것은 아니지만, HIV1, HIV2, HTLV1, 엡스타인 바 바이러스 (EBV), 사이토메갈로바이러스 (CMV), 아데노바이러스, 아데노-관련 바이러스, BK 바이러스, 인간 헤르페스 바이러스 6, 인간 헤르페스 바이러스 8, 인플루엔자 바이러스, 파라인플루엔자 바이러스, 조류 플루 바이러스, MERS 및 SARS 코로나 바이러스, 크리미아 콩고 출혈열 바이러스, 리노 바이러스, 엔테로바이러스, 뎅기 바이러스, 웨스트 나일 바이러스, 에볼라 바이러스, 마르버그 바이러스, 라사 열 바이러스, 지카 바이러스, RSV, 홍역 바이러스, 유행성 이하선염 바이러스, 리노 바이러스, 배리셀라 바이러스, 헤르페스 심플렉스 바이러스 1 및 2, 배리셀라 조스터 바이러스, HIV-1, HTLV1, 간염 바이러스, 엔테로바이러스, B형 간염 바이러스, C형 간염 바이러스, 니파 및 리프트 계곡 열 바이러스, 일본 뇌염 바이러스, 메르켈 세포 폴리오마 바이러스를 포함하는 바이러스에 의한 감염과 연관되거나, 마이코박테리움 튜버쿨로시스, 비전형적 마이코박테리아 종, 뉴모시스티스 지로벡시, 톡소플라스마, 리케챠, 노카르디아, 아스퍼질러스, 뮤코르 또는 칸디다로의 감염과 연관된다. 임의의 전술한 방법 또는 용도의 또 다른 또는 추가의 구현예에서, 질환은 이에 제한되는 것은 아니지만, 당뇨병, 다발성 골수종, 류마티스 관절염, 보통 천포창, 강직 척추염, 하시모토 갑상샘염, SLE, 사코이드증, 피부 경화증, 혼합된 연결조직 질환, 이식편대숙주병 또는 알츠하이머병을 포함하는 면역 또는 퇴화성 질환이다. 임의의 전술한 방법 또는 용도의 또 다른 또는 추가의 구현예에서, (i) 단백질 포스파타제 저해제는 SHP-1 저해제 및/또는 SHP-2 저해제이고/거나; (ii) 키나제 저해제는 CDK4 저해제, CDK4/6 저해제, mTOR 저해제, MNK 저해제 또는 이중 P13K/mTOR 저해제 중 하나 이상으로부터 선택되고/거나; (iii) 면역 억제성 분자를 억제하는 제제는 항체 또는 항체 단편, 억제성 핵산, 클러스터된 규칙적으로 상호이격된 짧은 팰린드롬 반복서열 (CRISPR), 전사-활성화인자 유사 효과기 핵산 분해효소 (TALEN) 또는 억제성 분자의 발현을 억제하는 아연 핑거 엔도뉴클레아제 (ZFN)를 포함하고/거나; (iv) T REG 세포의 수준 또는 활성을 감소시키는 제제는 사이클로포스파미드, 항-GITR 항체, CD25-고갈 또는 이들의 조합으로부터 선택되고/거나; (v) Brd4 저해제는 JQ1, MS417, OTXO15, LY 303511 및 미국 특허 US 20140256706 A1에 기술된 바와 같은 Brd4 저해제 또는 이들의 유도체로부터 선택된다. 임의의 전술한 방법 또는 용도의 또 다른 또는 추가의 구현예에서, 면역 억제성 분자는 PD1, PD-L1, CTLA-4, TIM-3, LAG-3, VISTA, BTLA, TIGIT, LAIR1, CD160, 2B4, TGFRβ, CEACAM-1, CEACAM-3 및 CEACAM-5로 이루어진 군으로부터 선택된다. 임의의 전술한 방법 또는 용도의 또 다른 또는 추가의 구현예에서, 억제성 분자를 억제하는 제제는 억제성 분자 및 이의 단편을 포함하는 제 1 폴리펩티드 및 상기 세포에 양성 신호를 제공하는 제 2 폴리펩티드를 포함하고, 여기서 제 1 및 제 2 폴리펩티드는 SIR-포함 면역 세포 상에서 발현되고, (i) 제 1 폴리펩티드는 PD1, PD-L1, CTLA-4, TIM-3, LAG-3, VISTA, BTLA, TIGIT, LAIR1, CD160, 2B4, TGFRβ, CEACAM-1, CEACAM-3 및 CEACAM-5 또는 이의 단편을 포함하고/거나; (ii) 제 2 폴리펩티드는 일차 신호전달 도메인 및/또는 보조자극 신호전달 도메인을 포함하는 세포내 신호전달 도메인을 포함한다. 임의의 전술한 방법 또는 용도의 또 다른 또는 추가의 구현예에서, 일차 신호전달 도메인은 CD3 제타의 기능적 도메인을 포함하고/거나; 보조자극 신호전달 도메인은 41BB, CD27 및 CD28로부터 선택된 단백질의 기능적 도메인을 포함한다. 임의의 전술한 방법 또는 용도의 또 다른 또는 추가의 구현예에서, 사이토카인은 IL-15 또는 IL-21 또는 둘 다로부터 선택된다. 임의의 전술한 방법 또는 용도의 또 다른 또는 추가의 구현예에서, SIR 분자를 포함하는 면역 효과기 세포 및 상기 면역 효과기 세포의 효능을 증가시키는 제제는 실질적으로 동시적으로 또는 연속적으로 투여된다. 임의의 전술한 방법 또는 용도의 또 다른 또는 추가의 구현예에서, SIR 분자를 포함하는 면역 세포는 GITR을 표적하고/거나 GITR 기능을 조정하는 분자와 조합하여 투여된다. 임의의 전술한 방법 또는 용도의 또 다른 또는 추가의 구현예에서, GITR을 표적하고/거나 GITR 기능을 조정하는 분자는 SIR 발현하는 세포 또는 세포의 집단 이전에 또는 성분채집술 이전에 투여된다. 임의의 전술한 방법 또는 용도의 또 다른 또는 추가의 구현예에서, 피험자는 인간이다.
본 발명은 또한 본 발명의 폴리펩티드 중 적어도 하나, 본 발명의 SIR 폴리펩티드 분자, 본 발명의 벡터 또는 본 발명의 세포 및 약제학적으로 허용가능한 부형제를 포함하는 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한 본 발명의 폴리펩티드 중 적어도 하나, 본 발명의 SIR 폴리펩티드 분자, 본 발명의 벡터 또는 본 발명의 세포 및/또는 본 발명의 조성물을 포함하는 키트를 제공한다.
본 발명은 또한 합성 면역 수용체를 인코딩하는 재조합 폴리뉴클레오티드로서, 서열번호 900 내지 2264, 서열번호 4531 내지 6013, 서열번호 7519 내지 8160, 서열번호 8803 내지 9230, 서열번호 9659 내지 9856, 서열번호 10474 내지 12041, 서열번호 15786 내지 16011, 서열번호 16240 내지 16465, 서열번호 16694 내지 16926, 서열번호 17162 내지 서열번호 17394, 서열번호 17864 내지 17979, 서열번호 18321 내지 18322, 서열번호 18242 내지 18259, 서열번호 18280 내지 18588, 서열번호 18899, 서열번호 18915 내지 18916 및 서열번호 19248 내지 19246로 이루어진 군으로부터 선택된 서열, 또는 합성 면역 수용체를 인코딩하는 서열번호 900 내지 2264, 서열번호 4531 내지 6013, 서열번호 7519 내지 8160, 서열번호 8803 내지 9230, 서열번호 9659 내지 9856, 서열번호 10474 내지 12041, 서열번호 15786 내지 16011, 서열번호 16240 내지 16465, 서열번호 16694 내지 16926, 서열번호 17162 내지 서열번호 17394, 서열번호 17864 내지 17979, 서열번호 18321 내지 18322, 서열번호 18242 내지 18259, 서열번호 18280 내지 18588, 서열번호 18899, 서열번호 18915 내지 18916 및 서열번호 19248 내지 19246 중 어느 하나에 나타낸 뉴클레오티드 서열과 적어도 75% 동일성을 갖는 서열을 포함하는, 재조합 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
본 발명은 또한 합성 면역 수용체 폴리펩티드를 인코딩하는 아미노산 서열로서, 서열번호 3135 내지 4498, 서열번호 6044 내지 7518, 서열번호 8161 내지 8802, 서열번호 9231 내지 9658, 서열번호 9873 내지 10070, 서열번호 12431 내지 13998, 서열번호 16013 내지 16238, 서열번호 16467 내지 16692, 서열번호 16928 내지 17160, 서열번호 17396 내지 17628, 서열번호 17981 내지 18096, 서열번호 18239 내지 18240, 서열번호 18261 내지 18278, 서열번호 18590 내지 18898, 서열번호 18900, 서열번호18919 내지 18920 및 서열번호 19248 내지 19246, 또는 합성 면역 수용체 폴리펩티드를 인코딩하는 서열번호 3135 내지 4498, 서열번호 6044 내지 7518, 서열번호 8161 내지 8802, 서열번호 9231 내지 9658, 서열번호 9873 내지 10070, 서열번호 12431 내지 13998, 서열번호 16013 내지 16238, 서열번호 16467 내지 16692, 서열번호 16928 내지 17160, 서열번호 17396 내지 17628, 서열번호 17981 내지 18096, 서열번호 18239 내지 18240, 서열번호 18261 내지 18278, 서열번호 18590 내지 18898, 서열번호 18900, 서열번호 18919 내지 18920 및 서열번호 19248 내지 19246 중 어느 하나에 나타낸 아미노산 서열과 적어도 75% 동일성을 갖는 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는, 아미노산 서열을 제공한다.
본 발명의 하나 이상의 구현예의 세부사항은 하기 첨부된 도면 및 설명에 설명된다. 본 발명의 다른 특징, 목적 및 장점은 도면 및 도면 설명으로부터 및 청구항으로부터 자명해질 것이다.
도 1은 항체, TCR, 이중 사슬 키메라 수용체 및 상이한 세대의 CAR의 모식적 설명을 나타낸다.
도 2는 본 발명의 예시적인 벡터 구조물을 나타낸다.
도 3은 본 발명의 SIR이 발현 시 갖을 수 있는 다양한 형식의 도시를 나타낸다. 이들 도시에서 TCR 쌍의 각각의 TCR은 vH 또는 vL 결합 도메인에 연결된다. 다른 구현예에서, 각각의 TCR은 vH 또는 vL이 아닌 vHH 도메인에 결합될 수 있다.
도 4는 본 발명의 SIR이 발현 시 갖을 수 있는 다양한 형식의 도시를 나타낸다. 이들 도시에서 TCR 쌍의 각각의 TCR은 vH 또는 vL 결합 도메인에 연결되고, vH 또는 vL가 다음으로 대향하는 vH 또는 vL에 연결된다. (A)에서 vL이 TCRb 사슬에 연결된 것으로 확인되지만, (A) 내지 (Q)의 모든 도시에서 배향은 (A) vL이 TCRa 사슬 등에 연결되도록 포장될 수 있음이 인식될 것이다.
도 5는 본 발명의 SIR이 발현 시 갖을 수 있는 다양한 형식의 도시를 나타낸다. 이들 구조물에서, SIR은 단일 도메인 항체 (vHH)에 기반하고, 이는 두 개의 TCR 불변 사슬 중 단 하나에 결합하고, 나머지 사슬이 빈 사슬로 남는다. 예시적인 이러한 구조물은CD8SP-V5-[hTCRb-KACIAH]-F-P2A-CD8SP-Her3-17B05So-vHH-Myc-[hTCRa-CSDVP]-F-F2A-PAC [서열번호 1715]이다. vHH 도메인이 대신에 다른 비-면역글로불린 결합 도메인에 기반하는 유사한 구조물이 제작될 수 있다. 예를 들면, 이러한 비-면역글로불린 결합 도메인은 애피바디, 다르핀, 자가항원 (예로 Dsg3), 리간드 (예로, MPL 또는 TRAIL) 또는 수용체 (예로, CD16)에 기반할 수 있다.
도 6은 본 발명의 SIR이 발현 시 갖을 수 있는 다양한 형식의 도시를 나타낸다. 이들 구조물에서, SIR은 구조적으로 상이한 두 개의 상이한 유형의 항원 결합 도메인을 포함한다. 일 예로서, 하나의 항원 결합 도메인은 단일 도메인 항체 (vHH)를 포함하는 한편, 나머지의 항원 결합 도메인은 scFV 단편을 vL-링커-vH 배향 또는 vH-링커-vL 배향으로 포함한다. 또 다른 예에서, 하나의 항원 결합 도메인은 단일 도메인 항체 (vHH)를 포함하는 한편, 나머지의 항원 결합 도메인은 수용체 (예로, CD16)를 포함한다. 또 다른 예에서, 하나의 항원 결합 도메인은 단일 도메인 항체 (vHH)를 포함하는 한편, 나머지의 항원 결합 도메인은 애피바디를 포함한다. 두 개의 상이한 유형의 항원 결합 도메인을 사용하는 것의 장점은 이들이 서로 거의 방해하지 않는 점이다. 제 1 항원 결합 도메인 (예로, vHH)은 하나의 항원에게로 유도될 수 있고, 제 2 항원 결합 도메인 (예로, scFV 단편)은 또 다른 항원으로 표적될 수 있다. 대안적으로, 이들 둘 다가 결합력 (avidity)을 증가시키도록 동일한 항원으로 유도될 수 있다.
도 7은 본 발명의 SIR이 발현 시 갖을 수 있는 다양한 형식의 도시를 나타낸다. 이들 구조물에서, SIR은 두 개의 scFV 단편을 기반으로 한다. 두 개의 scFv 단편은 두 개의 상이한 항원 (예로, CD8SP-CD19Bu12-scFv-V5-[hTCRb-KACIAH]-F-P2A-SP-CD20-2F2-scFv-Myc-[hTCRa-CSDVP]-F-F2A-PAC (040716-B04)[서열번호 1028])에게로 유도될 수 있다. 대안적으로, 이들 둘 다는 결합력을 증가시키도록 동일한 항원으로 유도될 수 있다 (예로, CD8SP-CD19Bu12-scFv-V5-[hTCRb-KACIAH]-F-P2A-SP-FMC63-scFv-Myc-[hTCRa-CSDVP]-F-F2A-PAC (020216-B07)[서열번호 1026]). scFV의 형식은 vH-링커-vL 또는 vL-링커-vH일 수 있다.
도 8은 본 발명의 SIR이 발현 시 갖을 수 있는 다양한 형식의 도시를 나타낸다. 일부 SIR 구조물에서, vL 영역에 프레임에 맞추어 융합된 신호 펩티드 (예로, 인간 CD8 신호 펩티드로부터 유래됨), Gly-Ser 링커 (GGGGS×3) 및 vH 영역으로 구성된 scFv 단편은 상보적 사슬 없이도 Cα, Cβ, pre-Cα, Cδ 또는 Cγ 중 어느 하나에 융합된다.
도 9a 및 9b는 293FT 세포에서 CAR의 발현을 측정하는 NLuc 검정법을 나타낸다. 형질전환되지 않은 293FT 세포 및 CD19 (FMC63-BBZ-PAC) 및 161-BBZ-PAC CAR로 형질전환된 세포가 CD19-GGSG-NLuc-AcV5 및 MPL-GGSG-NLuc-AcV5 상청액과 함께 배양되었고, 이후 PBS로 세척되고 PBS로 희석된 실레오엔트라진 (CTZ; 나노광)에 의해 Nluc 활성의 측정이 이어졌다. 발광은 BioTek 플레이트 판독기를 사용하여 정량되었다. 데이타는 세 벌 웰의 평균값 +/- 표준 편차 (SD)를 나타낸다.
도 10은 MPL-GGSG-NLuc AcV5 상청액에 대한 161(vL+vH)-Myc-BBz-PAC R07, 175(vL+vH)-Myc-28z-PAC Q04, VB22(vL+vH)-Myc-28z-PAC B06 CAR를 발현하는 T 세포의 강한 결합 및 161(vL+vH)-Myc-28z-PAC Z07, AB317(vL+vH)-Myc-28z-PAC T04 및 12E10(vL+vH)-Myc-28z-PAC B06를 발현하는 T 세포의 중등도 결합을 나타내고, 형질전환되지 않은 T 세포 또는 4C3(vL+vH)-Myc-28z-PAC 대조군 CAR을 발현하는 세포 상에서 유의한 결합은 전혀 관찰되지 않았다. 유사하게, 임의의 MPL CAR-T 세포 상에서 CD19-GGSG-NLuc-AcV5 상청액으로 특이적 결합이 전혀 관찰되지 않았고, 이로써 검정법의 특이성을 보여준다.
도 11은 야생형 뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩된 TCRα 및 TCRβ을 포함한 SIR이 인간 일차 T 세포에서 효과적으로 발현하지 못하는 보여주는 그래프를 나타낸다. 대조적으로, 사슬간 디설파이드 결합을 촉진하도록 추가적인 시스테인 잔기를 보유한 코돈-최적화된 인간 TCRa/b를 포함한 SIR은 효과적으로 발현된다. 인간 TCRα/β 불변 사슬의 마우스화는 (081415-D06)[서열번호 992] SIR에서 보이는 바와 같이, SIR 발현에서 추가의 증가를 유도한다. 또한, (082815-G07)[서열번호 1620] 및 (082815-E05)[서열번호 1622] 구조물에서 보이는 바와 같이, scFv 단편은 TCRb 불변 사슬이 임의의 항원 결합 모이어티를 보유하지 않더라도 TCRb 불변 사슬과 공동발현되면 TCRa 불변 영역에 융합된 것으로서 발현될 수 있다.
도 12는 원하는 또는 다양한 결합 친화도를 갖는 SIR 풀을 생성하는 방법을 나타낸다.
도 13a 및 13b는 대표적인 FACS 분석을 나타낸다. (A) 대조군 Jurkat-NFAT-GFP 세포 또는 CD19 (클론 번호 051716-I08), MPL (클론 번호 040716-A07) 및 BCMA (클론 번호 011116-A07)를 표적하는 SIR을 발현하는 세포가 RAJI (최상부), HEL (중간) 또는 U266 (바닥) 세포와 함께 각각 배양되었다. GFP 발현의 유도는 이들 각각의 표적 세포와 SIR 발현하는 Jurkat-NFAT-GFP 세포의 공동배양 시 명백하다. (B) CDH6 (클론 번호 051716-J05), CD276 (클론 번호 050516-Q06) 및 Her2/neu (클론 번호 0516-I03)를 표적하는 SIR을 발현하는 세포가 SKOV3 (최상부) 및 MC7 (중간 및 바닥) 세포와 함께 각각 배양되었다. GFP 발현의 유도는 이들 각각의 표적 세포와 SIR 발현하는 Jurkat-NFAT-GFP 세포의 공동배양 시 명백하다.
도 14는 본 발명의 SIR을 발현하는데 사용된 레트로바이러스 벡터의 예시적인 결과를 나타낸다.
도 15는 슬리핑 뷰티 트랜스포존 벡터를 사용한 결과, 구조물 pSBbi-puro-FMC63vL-V5-[TCRb-KACIAH]-F-P2A-FMC63vH-MYC-[TCRa-CSDVP]-F-F2A [010616-B01](서열번호 875)로 형질전환된 Jurkat-NFAT-GFP 세포가 상응하는 RAJI 표적 세포주와 함께 공동배양 시 GFP 유도를 나타내는 것을 나타낸다.
도 16은 APC-MYC-APC 및 바이오틴-단백질-L 플러스 APC-스트렙트아비딘으로의 염색에 의해 각각 결정된 바와 같이 T 세포 상에서 Bu12 CAR CD8SP-CD19Bu12-(vL-vH)-Myc-BBz-T2A-PAC (082815-P08)[서열번호 4503]와 비교하여 Bu12 SIR (CD8SP-CD19Bu12-vL-V5-[TCRb-S57C-opt1]-F-P2A-SP-CD19Bu12-vH-Myc-[TCRa-T48C-opt1]-F-F2A-PAC (070215-M03)[서열번호 1021]의 더 낮은 세포 표면 발현을 나타낸다.
도 17은 RAJI 세포로 주사되고, CD19에게 유도된 SIR D8SP-FMC63-vL-V5-[TCRb-S57C-opt1]-F-P2A-SP-FMC63-vH-Myc-[TCRa-T48C-opt1]-F-F2A-PAC (050515-L05)[서열번호 900] 및 CD8SP-CD19Bu12-vL-V5-[TCRb-S57C-opt1]-F-P2A-SP-CD19Bu12-vH-Myc-[TCRa-T48C-opt1]-F-F2A-PAC (070215-M03)[서열번호 1021]을 발현하는 T 세포를 수여받은 NSG 마우스의 생존을 MPL에게 유도된 대조군 SIR CD8SP-MPL-161-vL-V5-[hTCRb-S57C-opt1]-F-P2A-MPL-161-vH-Myc-[hTCRa-T48C-opt1]-F-F2A-PAC (040315-U02)[서열번호 1112]와 비교하여 나타낸다.
도 18은 본 발명의 구조물을 발현하는 Jurkat-NFAT-GFP 세포의 프로테인 L 비드와 함께 공동배양에 의한 GFP 유도를 나타낸다.
도 19a 내지 19d는 293-프로테인 L-Ⅱ 세포와의 공동배양이 (B) CD8SP-FMC63(vL-vH)-Myc-BBz-T2A-PAC (112014-A13)[서열번호 4501] CAR, (C) CD8SP-HuLuc64-vL-V5-[hTCRb-KACIAH]-F-P2A-SP-HuLuc64-vH-Myc-[hTCRa-CSDVP]-F-F2A-PAC (092916-E07)[서열번호1253] 및 (D) CD8SP-V5-[hTCRb-KACIAH]-F-P2A-CD8SP-CD19Bu12-vL-Gly-Ser-링커-CD19Bu12-vH-Myc-[hTCRa-CSDVP]-F-F2A-PAC (082815-E05)[서열번호 1622] SIR 구조물을 발현하는 Jurkat-NFAT-GFP 세포에서 GFP 발현의 강한 유도를 생성하였던 것을 나타낸다.
도 2는 본 발명의 예시적인 벡터 구조물을 나타낸다.
도 3은 본 발명의 SIR이 발현 시 갖을 수 있는 다양한 형식의 도시를 나타낸다. 이들 도시에서 TCR 쌍의 각각의 TCR은 vH 또는 vL 결합 도메인에 연결된다. 다른 구현예에서, 각각의 TCR은 vH 또는 vL이 아닌 vHH 도메인에 결합될 수 있다.
도 4는 본 발명의 SIR이 발현 시 갖을 수 있는 다양한 형식의 도시를 나타낸다. 이들 도시에서 TCR 쌍의 각각의 TCR은 vH 또는 vL 결합 도메인에 연결되고, vH 또는 vL가 다음으로 대향하는 vH 또는 vL에 연결된다. (A)에서 vL이 TCRb 사슬에 연결된 것으로 확인되지만, (A) 내지 (Q)의 모든 도시에서 배향은 (A) vL이 TCRa 사슬 등에 연결되도록 포장될 수 있음이 인식될 것이다.
도 5는 본 발명의 SIR이 발현 시 갖을 수 있는 다양한 형식의 도시를 나타낸다. 이들 구조물에서, SIR은 단일 도메인 항체 (vHH)에 기반하고, 이는 두 개의 TCR 불변 사슬 중 단 하나에 결합하고, 나머지 사슬이 빈 사슬로 남는다. 예시적인 이러한 구조물은CD8SP-V5-[hTCRb-KACIAH]-F-P2A-CD8SP-Her3-17B05So-vHH-Myc-[hTCRa-CSDVP]-F-F2A-PAC [서열번호 1715]이다. vHH 도메인이 대신에 다른 비-면역글로불린 결합 도메인에 기반하는 유사한 구조물이 제작될 수 있다. 예를 들면, 이러한 비-면역글로불린 결합 도메인은 애피바디, 다르핀, 자가항원 (예로 Dsg3), 리간드 (예로, MPL 또는 TRAIL) 또는 수용체 (예로, CD16)에 기반할 수 있다.
도 6은 본 발명의 SIR이 발현 시 갖을 수 있는 다양한 형식의 도시를 나타낸다. 이들 구조물에서, SIR은 구조적으로 상이한 두 개의 상이한 유형의 항원 결합 도메인을 포함한다. 일 예로서, 하나의 항원 결합 도메인은 단일 도메인 항체 (vHH)를 포함하는 한편, 나머지의 항원 결합 도메인은 scFV 단편을 vL-링커-vH 배향 또는 vH-링커-vL 배향으로 포함한다. 또 다른 예에서, 하나의 항원 결합 도메인은 단일 도메인 항체 (vHH)를 포함하는 한편, 나머지의 항원 결합 도메인은 수용체 (예로, CD16)를 포함한다. 또 다른 예에서, 하나의 항원 결합 도메인은 단일 도메인 항체 (vHH)를 포함하는 한편, 나머지의 항원 결합 도메인은 애피바디를 포함한다. 두 개의 상이한 유형의 항원 결합 도메인을 사용하는 것의 장점은 이들이 서로 거의 방해하지 않는 점이다. 제 1 항원 결합 도메인 (예로, vHH)은 하나의 항원에게로 유도될 수 있고, 제 2 항원 결합 도메인 (예로, scFV 단편)은 또 다른 항원으로 표적될 수 있다. 대안적으로, 이들 둘 다가 결합력 (avidity)을 증가시키도록 동일한 항원으로 유도될 수 있다.
도 7은 본 발명의 SIR이 발현 시 갖을 수 있는 다양한 형식의 도시를 나타낸다. 이들 구조물에서, SIR은 두 개의 scFV 단편을 기반으로 한다. 두 개의 scFv 단편은 두 개의 상이한 항원 (예로, CD8SP-CD19Bu12-scFv-V5-[hTCRb-KACIAH]-F-P2A-SP-CD20-2F2-scFv-Myc-[hTCRa-CSDVP]-F-F2A-PAC (040716-B04)[서열번호 1028])에게로 유도될 수 있다. 대안적으로, 이들 둘 다는 결합력을 증가시키도록 동일한 항원으로 유도될 수 있다 (예로, CD8SP-CD19Bu12-scFv-V5-[hTCRb-KACIAH]-F-P2A-SP-FMC63-scFv-Myc-[hTCRa-CSDVP]-F-F2A-PAC (020216-B07)[서열번호 1026]). scFV의 형식은 vH-링커-vL 또는 vL-링커-vH일 수 있다.
도 8은 본 발명의 SIR이 발현 시 갖을 수 있는 다양한 형식의 도시를 나타낸다. 일부 SIR 구조물에서, vL 영역에 프레임에 맞추어 융합된 신호 펩티드 (예로, 인간 CD8 신호 펩티드로부터 유래됨), Gly-Ser 링커 (GGGGS×3) 및 vH 영역으로 구성된 scFv 단편은 상보적 사슬 없이도 Cα, Cβ, pre-Cα, Cδ 또는 Cγ 중 어느 하나에 융합된다.
도 9a 및 9b는 293FT 세포에서 CAR의 발현을 측정하는 NLuc 검정법을 나타낸다. 형질전환되지 않은 293FT 세포 및 CD19 (FMC63-BBZ-PAC) 및 161-BBZ-PAC CAR로 형질전환된 세포가 CD19-GGSG-NLuc-AcV5 및 MPL-GGSG-NLuc-AcV5 상청액과 함께 배양되었고, 이후 PBS로 세척되고 PBS로 희석된 실레오엔트라진 (CTZ; 나노광)에 의해 Nluc 활성의 측정이 이어졌다. 발광은 BioTek 플레이트 판독기를 사용하여 정량되었다. 데이타는 세 벌 웰의 평균값 +/- 표준 편차 (SD)를 나타낸다.
도 10은 MPL-GGSG-NLuc AcV5 상청액에 대한 161(vL+vH)-Myc-BBz-PAC R07, 175(vL+vH)-Myc-28z-PAC Q04, VB22(vL+vH)-Myc-28z-PAC B06 CAR를 발현하는 T 세포의 강한 결합 및 161(vL+vH)-Myc-28z-PAC Z07, AB317(vL+vH)-Myc-28z-PAC T04 및 12E10(vL+vH)-Myc-28z-PAC B06를 발현하는 T 세포의 중등도 결합을 나타내고, 형질전환되지 않은 T 세포 또는 4C3(vL+vH)-Myc-28z-PAC 대조군 CAR을 발현하는 세포 상에서 유의한 결합은 전혀 관찰되지 않았다. 유사하게, 임의의 MPL CAR-T 세포 상에서 CD19-GGSG-NLuc-AcV5 상청액으로 특이적 결합이 전혀 관찰되지 않았고, 이로써 검정법의 특이성을 보여준다.
도 11은 야생형 뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩된 TCRα 및 TCRβ을 포함한 SIR이 인간 일차 T 세포에서 효과적으로 발현하지 못하는 보여주는 그래프를 나타낸다. 대조적으로, 사슬간 디설파이드 결합을 촉진하도록 추가적인 시스테인 잔기를 보유한 코돈-최적화된 인간 TCRa/b를 포함한 SIR은 효과적으로 발현된다. 인간 TCRα/β 불변 사슬의 마우스화는 (081415-D06)[서열번호 992] SIR에서 보이는 바와 같이, SIR 발현에서 추가의 증가를 유도한다. 또한, (082815-G07)[서열번호 1620] 및 (082815-E05)[서열번호 1622] 구조물에서 보이는 바와 같이, scFv 단편은 TCRb 불변 사슬이 임의의 항원 결합 모이어티를 보유하지 않더라도 TCRb 불변 사슬과 공동발현되면 TCRa 불변 영역에 융합된 것으로서 발현될 수 있다.
도 12는 원하는 또는 다양한 결합 친화도를 갖는 SIR 풀을 생성하는 방법을 나타낸다.
도 13a 및 13b는 대표적인 FACS 분석을 나타낸다. (A) 대조군 Jurkat-NFAT-GFP 세포 또는 CD19 (클론 번호 051716-I08), MPL (클론 번호 040716-A07) 및 BCMA (클론 번호 011116-A07)를 표적하는 SIR을 발현하는 세포가 RAJI (최상부), HEL (중간) 또는 U266 (바닥) 세포와 함께 각각 배양되었다. GFP 발현의 유도는 이들 각각의 표적 세포와 SIR 발현하는 Jurkat-NFAT-GFP 세포의 공동배양 시 명백하다. (B) CDH6 (클론 번호 051716-J05), CD276 (클론 번호 050516-Q06) 및 Her2/neu (클론 번호 0516-I03)를 표적하는 SIR을 발현하는 세포가 SKOV3 (최상부) 및 MC7 (중간 및 바닥) 세포와 함께 각각 배양되었다. GFP 발현의 유도는 이들 각각의 표적 세포와 SIR 발현하는 Jurkat-NFAT-GFP 세포의 공동배양 시 명백하다.
도 14는 본 발명의 SIR을 발현하는데 사용된 레트로바이러스 벡터의 예시적인 결과를 나타낸다.
도 15는 슬리핑 뷰티 트랜스포존 벡터를 사용한 결과, 구조물 pSBbi-puro-FMC63vL-V5-[TCRb-KACIAH]-F-P2A-FMC63vH-MYC-[TCRa-CSDVP]-F-F2A [010616-B01](서열번호 875)로 형질전환된 Jurkat-NFAT-GFP 세포가 상응하는 RAJI 표적 세포주와 함께 공동배양 시 GFP 유도를 나타내는 것을 나타낸다.
도 16은 APC-MYC-APC 및 바이오틴-단백질-L 플러스 APC-스트렙트아비딘으로의 염색에 의해 각각 결정된 바와 같이 T 세포 상에서 Bu12 CAR CD8SP-CD19Bu12-(vL-vH)-Myc-BBz-T2A-PAC (082815-P08)[서열번호 4503]와 비교하여 Bu12 SIR (CD8SP-CD19Bu12-vL-V5-[TCRb-S57C-opt1]-F-P2A-SP-CD19Bu12-vH-Myc-[TCRa-T48C-opt1]-F-F2A-PAC (070215-M03)[서열번호 1021]의 더 낮은 세포 표면 발현을 나타낸다.
도 17은 RAJI 세포로 주사되고, CD19에게 유도된 SIR D8SP-FMC63-vL-V5-[TCRb-S57C-opt1]-F-P2A-SP-FMC63-vH-Myc-[TCRa-T48C-opt1]-F-F2A-PAC (050515-L05)[서열번호 900] 및 CD8SP-CD19Bu12-vL-V5-[TCRb-S57C-opt1]-F-P2A-SP-CD19Bu12-vH-Myc-[TCRa-T48C-opt1]-F-F2A-PAC (070215-M03)[서열번호 1021]을 발현하는 T 세포를 수여받은 NSG 마우스의 생존을 MPL에게 유도된 대조군 SIR CD8SP-MPL-161-vL-V5-[hTCRb-S57C-opt1]-F-P2A-MPL-161-vH-Myc-[hTCRa-T48C-opt1]-F-F2A-PAC (040315-U02)[서열번호 1112]와 비교하여 나타낸다.
도 18은 본 발명의 구조물을 발현하는 Jurkat-NFAT-GFP 세포의 프로테인 L 비드와 함께 공동배양에 의한 GFP 유도를 나타낸다.
도 19a 내지 19d는 293-프로테인 L-Ⅱ 세포와의 공동배양이 (B) CD8SP-FMC63(vL-vH)-Myc-BBz-T2A-PAC (112014-A13)[서열번호 4501] CAR, (C) CD8SP-HuLuc64-vL-V5-[hTCRb-KACIAH]-F-P2A-SP-HuLuc64-vH-Myc-[hTCRa-CSDVP]-F-F2A-PAC (092916-E07)[서열번호1253] 및 (D) CD8SP-V5-[hTCRb-KACIAH]-F-P2A-CD8SP-CD19Bu12-vL-Gly-Ser-링커-CD19Bu12-vH-Myc-[hTCRa-CSDVP]-F-F2A-PAC (082815-E05)[서열번호 1622] SIR 구조물을 발현하는 Jurkat-NFAT-GFP 세포에서 GFP 발현의 강한 유도를 생성하였던 것을 나타낸다.
본원 및 첨부된 청구항에 사용된 바, 단수형 "일 (a)", "하나 (an)" 및 "이의 (the)"는 달리 문맥상 분명하게 진술하지 않으면, 복수의 대상을 포함한다. 따라서, 예를 들면 "세포"에 대한 언급은 다수의 이러한 세포를 포함하고, "폴리펩티드"에 대한 언급은 하나 이상의 폴리펩티드에 대한 언급 등을 포함한다.
또한 "또는"의 사용은 달리 진술되지 않으면 "및/또는"을 의미한다. 유사하게, "포함한다 (comprise)", "포함한다", "포함하는", "포함한다 (include)", "포함한다" 및 "포함하는"은 상호교환 가능하고, 제한하도록 의도되지 않는다.
또한, 다양한 구현예의 설명이 용어 "포함하는"을 사용하는 곳에서, 당업자라면 일부 특정한 경우에, 구현예가 용어 "필수적으로 구성되는" 또는 "구성되는"을 사용하여 대안적으로 기술될 수 있음을 이해할 것으로 이해되어야 한다.
달리 정의되지 않으면, 본원에 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속하는 기술분야에서 당업자에 의해 공통적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. Allen et al., Remington: The Science and Practice of Pharmacy 22 nd ed., Pharmaceutical Press (2012년 7월 15일); Hornyak et al., Introduction to Nanoscience and Nanotechnology, CRC Press (2008); Singleton and Sainsbury, Dictionary of Microbiology and Molecular Biology 3 rd ed., revised ed., J. Wiley & Sons (New York, NY 2006); Smith, March's Advanced Organic Chemistry Reactions, Mechanisms and Structure 7 th ed., J. Wiley & Sons (New York, NY 2013); Singleton, Dictionary of DNA and Genome Technology 3 rd ed., Wiley-Blackwell (2012년 11월 28일); 및 Green and Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual 4th ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press (Cold Spring Harbor, NY 2012)는 당업자에게 본 출원에 사용된 많은 용어의 일반 가이드를 제공한다. 항체를 제조하는 방법에 관한 참고문헌을 위해, Greenfield, Antibodies A Laboratory Manual 2 nd ed., Cold Spring Harbor Press (Cold Spring Harbor NY, 2013); Kohler and Milstein, Derivation of specific antibody-producing tissue culture and tumor lines by cell fusion, Eur. J. Immunol. 1976 Jul, 6(7): 511-9; Queen and Selick, humanized Immunoglobulins, 미국 특허 5,585,089 (1996 Dec); 및 Riechmann et al., Reshaping human antibodies for therapy, Nature 1988 Mar 24, 332(6162): 323-7 참조. 본원에 제공된 모든 제목 및 소제목은 단지 독서의 편의를 위한 것이고, 본 발명을 제한하는 것으로 고려되어서는 안된다. 본원에 기술된 방법 및 재료와 유사하거나 동등한 것이 본 발명의 실행 또는 테스트에 사용될 수 있지만, 적합한 방법 및 재료가 하기에 기술된다. 본원에 언급된 모든 출판물, 특허 출원, 특허 및 다른 참고문헌은 이들의 전문이 참고문헌으로 통합된다. 모순되는 경우에, 정의를 포함하는 본 명세서가 통제할 것이다. 또한, 재료, 방법 및 특정한 예는 단지 예시적이고, 제한하도록 의도되지 않는다.
본 발명의 합성 면역 수용체 (SIR)은, 예를 들면 MHC-의존적 또는 MHC-비의존적 방식으로 항원에 결합할 수 있는 항원 결합 도메인 (예로, 항체 또는 항체 단편)을 포함한다. 정상적으로, 내인성 단백질로부터 유래된 펩티드는 주요 조직적합성 복합체 (MHC) 클래스 I 분자의 포켓을 충전하고, CD8+ T 림프구 상의 T 세포 수용체 (TCR)에 의해 인식된다. MHC 클래스 I 복합체는 모든 핵을 갖는 세포에 의해 구성적으로 발현된다. 암에서, 바이러스-특이적 및/또는 종양-특이적 펩티드/MHC 복합체는 면역요법을 위한 독특한 클래스의 세포 표면 표적을 예시한다. 인간 백혈구 항원 (HLA)-A1 또는 HLA-A2의 맥락에서 바이러스 또는 종양 항원으로부터 유래된 펩티드를 표적하는 TCR-유사 항체는 기술되어 왔다 (예로, Sastry et al., J Viral. 2011 85(5): 1935-1942; Sergeeva et al., Blood, 2011, 117(16): 4262-4272; Verma et al., Jlmmunol, 2010, 184(4): 2156-2165; Willemsen et al., Gene Ther., 2001, 8(21): 1601-1608; Dao et al., Sci Transl Med., 2013, 5(176): 176ra33; Tassev et al., Cancer Gene Ther., 2012, 19(2): 84-100 참조). 예를 들면, TCR-유사 항체는 인간 scFv 파지 디스플레이 라이브러리와 같은 라이브러리를 스크리닝하는 것으로부터 식별될 수 있다.
본 발명은 일반적으로 T-세포 수용체 도메인에 작동가능하게 연결된 항원 결합 부위를 포함하는 합성 면역 수용체 (SIR)를 제공한다. 본 발명은 SIR을 인코딩하는 서열을 포함하는 하나 이상의 재조합 핵산 구조물을 제공하고, 여기서 SIR은 (본원에 하기 추가로 기술된 바와 같은) 항원 또는 표적 분자에 결합하고, 하나 이상의 T 세포 수용체 불변 사슬 (이의 돌연변이체 또는 변이체 포함)에 연결된 하나 이상의 항원 결합 도메인 (예로, 항체, 항체 단편, 비-면역글로불린 항원 결합 도메인, 자가항원, 리간드 또는 수용체)를 포함한다. SIR의 항원 결합 도메인(들)은 본원에 기술된 하나 이상의 질환 관련 항원 또는 동족체에 특이적으로 결합하고, 여기서 각각의 항원 결합 도메인의 코딩 서열은 각각의 T 세포 수용체 불변 사슬을 인코딩하는 핵산 서열과 작동가능하게 연결되어, 이는 항원 결합 도메인이 T 세포 불변 사슬과 함께 작동가능하게 발현되도록 연결된다. 일부 구현예에서, SIR은 단일 T 세포 수용체 불변 사슬에 연결된 항원 결합 도메인을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, SIR은 별도의 T 세포 수용체 불변 사슬에 각각 연결된 두 개의 항원 결합 도메인을 포함할 수 있다. 예를 들면, 항원 결합 도메인 1은 T 세포 수용체 알파 (TCRα)의 불변 사슬에 연결되어 "작용 단위 1"을 구성하고, 항원 결합 도메인 2는 T 세포 수용체 베타 (TCRβ)의 불변 사슬에 연결되어 "작용 단위 2"을 구성한다. 이러한 SIR의 두 개의 작용 단위는 기능적으로 활성을 갖도록 (예로, 이중합) 동일한 세포에서 공동발현된다. 일부 구현예에서, SIR은 하나의 T 세포 수용체 불변 사슬에 프레임에 맞추어 연결되지만 제 2 T 세포 수용체 불변 사슬과 함께 공동발현되는 항원 결합 도메인 (작용 단위 1)을 포함한다. 이러한 SIR에서 제 2 T 세포 수용체 불변 사슬의 목적은 작용 단위 1 (예로, T 세포 수용체 불변 사슬에 연결된 항원 결합 도메인 1)의 세포 표면 발현을 용이하게 하는 것이다. 이와 같이, 제 2 T 세포 수용체 불변 사슬은 자체로 발현되거나 에피토프 태크 (예로, MYC, V5, AcV5, G4Sx2, 스트렙태그Ⅱ 등)을 보유한 융합 단백질로서 발현되거나, 작용 단위 1의 조립 및 기능을 방해하지 않는 임의의 부적절한 단백질 단편 (예로, vL 또는 vH 단편)을 보유한 융합 단백질로서 발현될 수 있다. 예로서, SIR은 T 세포 수용체 알파 (TCRα)의 불변 사슬에 프레임에 맞추어 작동가능하게 연결된 항원 결합 도메인 1 및 T 세포 수용체 베타 (TCRβ)의 빈 (예로, 항원 결합 도메인이 결여된) 불변 사슬을 포함할 수 있다. 이러한 SIR의 두 개의 작용 단위는 기능적으로 활성을 갖도록 동일한 세포에서 공동발현된다. 일부 구현예에서, SIR의 두 개의 작용 단위는 둘 다의 작용 단위를 인코딩하는 단일 폴리뉴클레오티드의 형질감염에 의해 공동발현되는 한편, 다른 구현예에서 두 개의 작용 단위가 각각 하나의 작용 단위를 인코딩하는 두 개의 상이한 폴리뉴클레오티드의 형질감염에 의해 공동발현된다. 일부 구현예에서, SIR의 두 개의 작용 단위는 단일 게놈 좌위에 삽입되는 한편, 다른 구현예에서 두 개의 작용 단위가 두 개의 게놈 좌위에 삽입된다. 예를 들면, 일부 구현예에서, 둘 다의 작용 단위는 TCRα 불변 사슬 (TRAC) 좌위에 삽입되어 단일 폴리뉴클레오티드로서 발현될 수 있다. 다른 구현예에서, 작용 단위 1은 TCRα 불변 사슬 (TRAC) 좌위에 삽입될 수 있는 한편, 작용 단위 2는 TCR 불변 사슬 베타 1 (TRBC 1) 좌위에 삽입될 수 있다. 일부 구현예에서, SIR의 두 개의 작용 단위는 둘 다의 작용 단위를 인코딩하는 단일 폴리뉴클레오티드의 형질감염에 의해 공동발현되는 한편, 다른 구현예에서 두 개의 작용 단위가 각각 하나의 작용 단위를 인코딩하는 두 개의 상이한 폴리뉴클레오티드의 형질감염에 의해 공동발현된다. 일부 구현예에서, SIR은 하나의 T 세포 수용체 불변 사슬에 프레임에 맞추어 연결되지만 제 2 T 세포 수용체 불변 사슬과 함께 공동발현되는 항원 결합 도메인 (작용 단위 1)을 포함한다. 이러한 SIR에서 제 2 T 세포 수용체 불변 사슬의 목적은 작용 단위 1 (예로, T 세포 수용체 불변 사슬에 연결된 항원 결합 도메인 1)의 세포 표면 발현을 용이하게 하는 것이다. 이와 같이, 제 2 T 세포 수용체 불변 사슬은 자체로 발현되거나, 에피토프 태크 (예로, MYC, V5, AcV5, G4Sx2, 스트렙태그Ⅱ 등)을 보유한 융합 단백질로서 발현되거나, 작용 단위 1의 조립 및 기능을 방해하지 않는 임의의 부적절한 단백질 단편 (예로, vL 또는 vH 단편)을 보유한 융합 단백질로서 발현될 수 있다. 예로서, SIR은 T 세포 수용체 알파 (TCRα)의 불변 사슬에 프레임에 맞추어 작동가능하게 연결된 항원 결합 도메인 1 및 T 세포 수용체 베타 (TCRβ)의 빈 (예로, 항원 결합 도메인이 결여된) 불변 사슬을 포함할 수 있다. 이러한 SIR의 두 개의 작용 단위는 기능적으로 활성을 갖도록 동일한 세포에서 공동발현된다. 일부 구현예에서, SIR의 두 개의 작용 단위는 단일 벡터를 사용하여 공동발현되는 한편, 다른 구현예에서 두 개의 작용 단위가 상이한 벡터를 사용하여 동일한 세포에서 공동발현된다. 일부 구현예에서, SIR의 두 개의 작용 단위는 둘 다의 작용 단위를 인코딩하는 단일 폴리뉴클레오티드의 형질감염에 의해 공동발현되는 한편, 다른 구현예에서 두 개의 작용 단위가 각각 하나의 작용 단위를 인코딩하는 두 개의 상이한 폴리뉴클레오티드의 형질감염에 의해 공동발현된다. 본 발명의 SIR의 다양한 입체구조는 도 3 내지 도 8에 제공되어 있다.
본 발명은 암, 감염성, 자가면역 및 퇴화성 질환의 치료를 위한 입양 세포요법에 사용될 수 있는 키메라 T 세포 수용체 (합성 면역 수용체 (SIR))의 클래스를 제공한다. 키메라 항원 수용체 (CAR)와는 대조적으로, 본 발명의 SIR은 생리학적 T 세포 수용체 신호전달 경로의 능력 전부를 내포하고, 따라서 사이토카인 방출 증후군, 신경독성 및 생체내 지속성의 결여와 같은 CAR과 연관된 합병증을 거의 유발하지 않는다. CAR과는 대조적으로, 본 발명의 SIR은 항원 결합 도메인의 자가-응집의 경향성, 긴장성 신호전달의 기회 및 조기 T 세포 소모의 기회가 더 적다. 본 발명의 SIR은 TCRα (Cα), TCRβ (Cβ), TCRδ (Cδ), TCRγ (Cγ) 또는 preTCRα (Cα) (전술한 임의의 것의 변이체 및 돌연변이체 포함)의 불변 사슬에 융합된 하나 이상의 항원 결합 도메인을 포함한다. 항원 결합 도메인은 항체 또는 항체 단편, 항체의 vL 및/또는 vH 단편, 항체로부터 유래된 scFv 단편, 단일 도메인 항체, 애피바디, DARPIN, 임의의 항원 결합 리간드 또는 수용체, 자가항원 또는 임의의 다른 비-면역글로불린 항원 결합 단편을 포함할 수 있다. 항원 결합 도메인은 단일 항원 또는 다수의 항원 (이중특이적 또는 다중특이적 SIR)을 표적할 수 있다. SIR의 TCR 불변 도메인은 단독으로 발현될 수 있지만, 전형적으로 쌍으로 발현되어 (예로, Cα 및 Cβ, preCα 및 Cβ 또는 Cδ 및 Cγ 등) 최적의 세포 표면 발현을 용이하게 한다. TCR 불변 사슬 단편은 전형적으로 코돈-최적화되어 있어 최적의 세포 표면 발현을 허용한다. TCR 불변 사슬 단편은 추가적인 돌연변이 또는 치환을 보유할 수 있어 이들의 최적의 발현 및 상보적 사슬과의 쌍 형성을 용이하게 하고/거나, 내인성 TCR 사슬과의 쌍 형성을 감소시키고/거나 항원 결합 도메인 간의 상호작용을 안정화할 수 있다. SIR은 또한 융합 단백질로서 하나 이상의 추가적인 도메인 (예로, Myc, 스트렙태그, V5, 플래그, Ritx 태그 등)을 발현할 수 있다. 본 발명의 SIR은 이에 제한되는 것은 아니지만, 렌티바이러스성 벡터, 레트로바이러스성 벡터, 아데노-관련 바이러스성 벡터, 배큘로바이러스 벡터, 슬리핑 뷰티 트랜스포존, 피기백 트랜스포존의 사용, mRNA 형질감염에 의해 또는 상기 방법의 조합의 사용을 포함하는 임의의 기법을 사용하여 세포 내로 도입될 수 있다. SIR 전달을 위한 최적화된 벡터가 또한 개시되어 있다. 본 발명의 SIR은 내인성 프로모터 (예로, TCRα 또는 TCRβ 프로모터)의 조절 하에서 발현될 수 있다. 일부 구현예에서, 본 발명의 SIR은 외래 프로모터 (예로, CMV 프로모터)를 사용하여 발현된다. 본 발명의 SIR은 또한 SIR의 발현 또는 기능을 촉진하고 (예로, CD3z, CD3ε, CD3δ, CD3z-41BB 융합 단백질 등), T 세포의 증식, 유지, 확장 및 활성화를 촉진하는 (예로, 41BBL, CD40L, IL12f, K13, Tax, Tax2, MC159L, cFLIP, PD1 표적화 scFV, BRD4 표적화 shRNA 등), 독성을 감소시키는 (예로, vHH 또는 IL6R 표적화 scFV) 분자를 인코딩하는 cDNA, 선별 마커 (예로, tEGFR, tEGFRvⅢ, tBCMA, tCD19 등) 및/또는 자살 유전자 (예로, i캐스파제 9, HSV-티미딘 키나제)와 같은 추가적인 모듈을 공동발현한다. 본 발명의 SIR은 면역 효과기 세포 (예로, T 세포) 또는 면역 효과기 세포를 유도할 수 있는 유도된 다능성 줄기 세포 (iPSC)를 포함하는 줄기 세포에서 발현될 수 있다. 본 발명은 또한 SIR의 발현을 위한 면역 효과기 세포의 하위집합 및 SIR을 발현하는 면역 효과기 세포의 활성화 및 증식 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 SIR을 발현하는 면역 효과기 세포의 활성 및 유지를 증진하거나, 이들의 독성을 감소시키는데 사용될 수 있는 제제를 기술하고 있다. 본 발명은 다양한 응용에 적합한 SIR을 식별하는데 사용될 수 있는 시험관내 및 생체내 검정법의 세트를 기술하고 있다.
용어 "약"은 양 및 일시적 지속기간 등과 같은 측정가능한 값을 언급할 때, 특정된 값으로부터 ±20%, 일부 경우에 ±10%, 또는 일부 경우에 ±5%, 또는 일부 경우에 ±1%, 또는 일부 경우에 ±0.1%의 변화 범위를, 이러한 변화가 개시된 방법을 수행하거나 본원에서의 조성물을 기술하는데 적절한 바와 같이 포괄하도록 의미한다. 게다가, 임의의 값 또는 범위 (예로, 20 미만 또는 유사한 용어학)는 명시적으로 이러한 값 내지 해당 값까지의 임의의 정수를 포함한다. 따라서, 예를 들면, "1 내지 5개의 돌연변이"는 명시적으로 1, 2, 3, 4 및/또는 5개의 돌연변이를 포함한다.
용어 "부속 모듈"은 SIR과 공동발현될 수 있는 41BBL, CD40L, K13, MC159, cFLIP-L/MRITα, cFLIP-p22, HTLV1 Tax, HTLV2 Tax, HTLV2 Tax-RS 돌연변이체, FKBPx2-K13, FKBPx2-HTLV2-Tax, FKBPx2-HTLV2-Tax-RS, IL6R-304-vHH-Alb8-vHH, IL12f, PD1-4H1 scFV, PD1-5C4 scFV, PD1-4H1-Alb8-vHH, PD1-5C4-Alb8-vHH, CTLA4-이필리무맙-scFv, CTLA4-이필리무맙-Alb8-vHH, IL6-19A-scFV, IL6-19A-scFV-Alb8-vHH, sHVEM, sHVEM-Alb8-vHH, hTERT, Fx06, CD3z, CD3z-GGGS-41BB, CD3-BBz, CD3-CD28z, CD3-CD28-Lck 융합 단백질, Brd4 표적화 shRNA 및 이들의 조합 중 하나 이상을 말한다. "부속 모듈"은 단일 벡터를 사용하거나 두 개 이상의 상이한 벡터를 사용하여 SIR과 공동발현될 수 있다. 일 구현예에서, 부속 모듈은 서열번호 3087 내지 3117의 아미노산 서열 (서열번호 812 내지 842의 DNA 코딩 서열) 또는 이들과 80 내지 99% 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 다른 구현예에서, 부속 모듈을 인코딩하는 핵산 서열은 서열번호 812 내지 서열번호 842의 서열 또는 이들과 80 내지 99% 동일성을 갖는 서열을 포함한다.
"자가항체"는 자가항원에 특이적인 B 세포에 의해 생산된 항체를 말한다.
용어 "항체"는 본원에 사용된 바, 항원과 특이적으로 결합하는 면역글로불린 분자로부터 유래된 단백질 또는 폴리펩티드 서열을 말한다. 항체는 단일클론 또는 다중클론, 다중 또는 단일 사슬 또는 미가공 면역글로불린일 수 있고, 천연 출처로부터 또는 재조합 출처로부터 유래될 수 있다. 항체는 면역글로불린 분자의 사량체일 수 있다. 항체는 '인간화', '키메라' 또는 비-인간일 수 있다.
용어 "항체 단편"는 항원의 에피토프와 특이적으로 상호작용할 수 있는 능력을 (예로, 결합, 입체적 방해, 안정화/탈안정화, 공간적 분포에 의해) 보유하는 항체의 적어도 일부분을 말한다. 항체 단편의 예는 이에 제한되는 것은 아니지만, Fab, Fab', F(ab'h, Fv 단편, scFv 항체 단편, 디설파이드 연결된 Fvs (sdFv), VH 및 CHl 도메인으로 구성된 Fd 단편, 선형 항체, sdAb (vL 또는 vH 둘 중 하나)와 같은 단일 도메인 항체, 카멜리드 vHH 도메인, 힌지 영역에서 디설파이드 브리지에 의해 연결된 두 개 Fab 단편을 포함한 이가의 단편과 같은 항체 단편으로부터 형성된 다중특이적 항체 및 항체의 단리된 CDR 또는 다른 에피토프 결합 단편을 포함한다. 항원 결합 단편은 또한 단일 도메인 항체, 맥시바디, 나노바디, 인트라바디, 다이아바디, 트리아바디, 테트라바디, v-NAR 및 bis-scFv 내로 도입될 수 있다 (예로, Hollinger and Hudson, Nature Biotechnology 23: 1126-1136, 2005 참조). 항원 결합 단편은 또한 피브로넥틴 Ⅲ형 (Fn3)과 같은 폴리펩티드에 기초한 스캐폴드 내에 이식될 수 있다 (피브로넥틴 폴리펩티드 미니바디를 설명하고 있는, 미국 특허 6,703,199 참조).
용어 "항체 중쇄"는 항체의 자연 발생 입체구조에서 항체 분자에 존재하는 두 개 유형의 폴리펩티드 사슬 중 더 큰 사슬을 말하고, 이는 정상적으로 항체가 속하는 클래스를 결정한다.
용어 "항체 경쇄"는 항체의 자연 발생 입체구조에서 항체 분자에 존재하는 두 개 유형의 폴리펩티드 사슬 중 더 작은 사슬을 말한다. 카파 (κ) 및 람다 (λ) 경쇄는 두 개의 주요 항체 경쇄 아형을 말한다.
용어 "항암 효과"는 이에 제한되는 것은 아니지만, 종양 부피의 감소, 암 세포의 수의 감소, 전이의 수의 감소, 기대 수명의 증가, 암 세포 증식의 감소, 암 세포 생존의 감소 또는 암성 병태와 연관된 다양한 생리학적 증상의 개선을 포함하는 다양한 수단에 의해 나타날 수 있는 생물학적 효과를 말한다. "항암 효과"는 또한 우선 암 발생의 예방에서 SIR의 능력에 의해 나타날 수 있다.
"항암제"는 비정상 세포 분열 및 성장을 억제하거나, 신생물 세포의 이동을 억제하거나, 침습성을 억제하거나, 암 성장 및 전이를 예방하는 제제를 말한다. 용어는 화학치료제, 생물학적 제제 (예로, siRNA, 세포 독성 유전자를 전달하는 조작된 MLV, 아데노바이러스, 헤르페스 바이러스와 같은 바이러스성 벡터) 및 항체 등을 포함한다,
용어 "항원" 또는 "Ag"은 면역 반응을 유발하는 분자를 말한다. 이러한 면역 반응은 항체 생산 또는 특이적 면역학적으로 적격한 세포의 활성화 또는 둘 다를 수반할 수 있다. 당업자라면 실질적으로 모든 단백질 또는 펩티드를 포함하는 임의의 거대분자가 항원으로서 작용할 수 있음을 이해할 것이다. 또한, 항원은 재조합 또는 게놈 DNA로부터 유래될 수 있다. 당업자라면 면역 반응을 유도하는 단백질을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열 또는 부분적 뉴클레오티드 서열을 포함하는 임의의 DNA가 본원에서 해당 용어가 사용된 바와 같이, "항원"을 인코딩함을 이해할 것이다. 또한, 당업자라면 항원이 유전자의 전장의 뉴클레오티드 서열에 의해 단독으로 인코딩될 필요가 없음을 이해할 것이다. 본 발명이 이에 제한되는 것은 아니지만, 하나 이상의 유전자의 부분적 뉴클레오티드 서열의 사용을 포함하고, 이들 뉴클레오티드 서열이 다양한 조합으로 배열되어 원하는 면역 반응을 유도하는 폴리펩티드를 인코딩하는 것은 바로 자명하다. 게다가, 당업자라면 항원이 "유전자"에 의해 인코딩될 필요가 전혀 없음을 이해할 것이다. 항원이 합성될 수 있거나, 생물학적 시료로부터 유래될 수 있거나, 폴리펩티드가 아닌 거대분자일 수 있음이 바로 자명하다. 이러한 생물학적 시료는 이에 제한되는 것은 아니지만, 조직 시료, 종양 시료, 세포 또는 다른 생물학적 성분을 갖는 유체를 포함할 수 있다.
표적 항원의 비-제한적인 예는 CD5; CD19; CD123; CD22; CD30; CD171; CS-1 (CD2 하위집합 1, CRACC, SLAMF7, CD319 및 19A24라고도 지칭됨); C형 렉틴-유사 분자-1 (CLL-1 또는 CLECL1); CD33; 표피 성장인자 수용체 변이체 Ⅲ (EGFRvⅢ); 갱글리오시드 G2 (GD2); 갱글리오시드 GD3 (aNeu5Ac(2-8)aNeu5Ac(2-3)bDGalp(l-4)bDGlcp(l-l)Cer); TNF 수용체 패밀리 구성원 B 세포 성숙 (BCMA); Tn 항원 ((Tn Ag) 또는 (GalNAcα-Ser/Thr)); 전립선-특이적 막 항원 (PSMA); 수용체 타이로신 키나제-유사 고아 수용체 1 (ROR1); Fms 유사 타이로신 키나제 3 (FLT3); 종양-관련 당당백질 72 (TAG72); CD38; CD44v6; 급성 백혈병 또는 림프종 상에서 발현되지만 조혈 전구세포 상에서는 발현되지 않는 글리코실화된 CD43 에피토프; 비-조혈성 암 상에서 발현된 글리코실화된 CD43 에피토프; 암배아 항원 (CEA); 상피세포 부착 분자 (EPCAM); B7H3 (CD276); KIT (CD117); 인터루킨-13 수용체 소단위체 알파-2 (IL-13Ra2 또는 CD213A2); 메소틸린; 인터루킨 11 수용체 알파 (IL-llRa); 전립선 줄기 세포 항원 (PSCA); 프로테아제 세린 21 (테스티신 또는 PRSS21); 혈관 내피 성장인자 수용체 2 (VEGFR2); 루이스 (Y) 항원; CD24; 혈소판-유래 성장인자 수용체 베타 (PDGFR-베타); 단계-특이적 배아 항원-4 (SSEA-4); CD20; 폴레이트 수용체 알파; 수용체 타이로신-단백질 키나제 ERBB2 (Her2/neu); 세포 표면 연관된 뮤신 1 (MUC1); 상피 성장인자 수용체 (EGFR); 신경 세포 부착 분자 (NCAM); 프로스타제; 전립샘 산 포스파타제 (PAP); 변이된 신장인자 2 (ELF2M); 에프린 B2; 섬유모세포 활성화 단백질 알파 (FAP); 인슐린-유사 성장인자 1 수용체 (IGF-I 수용체); 탄산 무수화제 Ⅸ (CAⅨ); 프로테오좀 (프로좀, 마크로페인) 소단위체 베타형, 9 (LMP2); 당단백질 100 (gpl00); 절단점 클러스터 영역 (BCR)으로 구성된 종양원 유전자 융합 단백질 및 아벨슨 마우스 백혈병 바이러스 종양원 유전자 상동체 1 (Abl) (bcr-abl); 티로시나제; 에프린 A형 수용체 2 (EphA2); 퓨코실 GM1; 시아릴 루이스 부착 분자 (sLe); 갱글리오시드 GM3 (aNeu5Ac(2-3)bDClalp(l-4)bDGlcp(l-1)Cer); 글루타민 전이효소 5 (TGS5); 고분자량 흑색종 관련된 항원 (HMWMAA); o-아세틸-GD2 갱글리오시드 (OAcGD2); 종양 내피 마커 1 (TEM1/CD248); 관련된 종양 내피 마커 7 (TEM7R); 클라우딘 6 (CLDN6); 갑상샘 자극호르몬 수용체 (TSHR); G 단백질 연결된 수용체 클래스 C 그룹 5, 구성원 D (GPRC5D); 염색체 X 오픈 리딩 프레임 61 (CXORF61); CD97; CD179a; 역형성 림프종 키나제 (ALK); 폴리시알산; 태반-특이적 항원 1 (PLAC1); 글로보H 글리코세라미드의 육당질 부분 (글로보H); 유샘 분화 항원 (NY-BR-1); 유로플라킨 2 (UPK2); A형 간염 바이러스 세포 수용체 1 (HAVCR1); 아드레노셉터 베타 3 (ADRB3); 패넥신 3 (PANX3); G 단백질-연결된 수용체 20 (GPR20); 림프구 항원 6 복합체, 좌위 K 9 (LY6K); 후각 수용체 51E2 (OR51E2); TCR 감마 교대 리딩 프레임 단백질 (TARP); 윌름 종양 단백질 (WT1); 암/고환 항원 1 (NY-ES0-1); 암/고환 항원 2 (LAGE-1a); 흑색종-관련 항원 1 (MAGE-A1); 염색체 12p 상에 위치한 ETS 전위 변이체 유전자 6 (ETV6-AML); 정자 단백질 17 (SPA17); X 항원 패밀리, 구성원 lA (XAGEl); 안지오포이에틴-결합 세포 표면 수용체 2 (타이 2); 흑색종 암 고환 항원-1 (MAD-CT-1); 흑색종 암 고환 항원-2 (MAD-CT-2); Fos-관련된 항원 1; 종양 단백질 p53 (p53); p53 돌연변이체; 프로스테인; 서바이빈; 텔로머라제; 전립선 암종 종양 항원-1 (PCT A-1 또는 갈렉틴 8); T 세포에 의해 인식되는 흑색종 항원 1 (MelanA 또는 MARTI); 래트 육종 (Ras) 돌연변이체; 인간 텔로머라제 역전사효소 (hTERT); 육종 전위 절단점; 흑색종의 세포사멸 저해제 (ML-IAP); ERG (막통과 프로테아제, 세린 2 (TMPRSS2) ETS 융합 유전자); N-아세틸 글루코사미닐-전이효소 V (NA17); 쌍 형성된 박스 단백질 Pax-3 (PAX3); 안드로겐 수용체; 사이클린 Bl; v-myc 조류 백혈병 바이러스 종양원 유전자 신경모세포종 유래된 상동체 (MYCN); Ras 상동체 패밀리 구성원 C (RhoC); 티로시나제-관련 단백질 2 (TRP-2); 사이토크롬 P450 lB 1 (CYPlB 1); CCCTC-결합 인자 (아연 핑거 단백질)-유사 (BORIS 또는 각인 부위의 조절인자의 형제), T 세포에 의해 인식되는 편평세포 암종 항원 3 (SART3); 쌍 형성된 박스 단백질 Pax-5 (PAX5); 프로아크로신 결합 단백질 sp32 (OY-TESl); 림프구-특이적 단백질 타이로신 키나제 (LCK); 키나제 고정 단백질 4 (AKAP-4); 활액 육종 X 절단점 2 (SSX2); 진행된 당화 말단 산물의 수용체 (RAGE-1); 신장 유비퀴터스 1 (RUl); 신장 유비퀴터스 2 (RU2); 레구마인; 인간 파필로마 바이러스 E6 (HPV E6); 인간 파필로마 바이러스 E7 (HPV E7); 장내 카르복실 에스테라제; 변이된 열 충격 단백질 70-2 (hsp70-2); CD79a; CD79b; CD72; 백혈구-관련된 면역글로불린-유사 수용체 1 (LAIRl); IgA 수용체의 Fc 단편 (FCAR 또는 CD89); 백혈구 면역글로불린-유사 수용체 서브패밀리 A 구성원 2 (LILRA2); CD300 분자-유사 패밀리 구성원 f (CD300LF); C형 렉틴 도메인 패밀리 12 구성원 A (CLEC12A); 골수 간질 세포 항원 2 (BST2); EGF-유사 모듈-포함 뮤신-유사 호르몬 수용체-유사 항원 2 (EMR2); 림프구 항원 75 (LY75); 글리피칸-3 (GPC3); Fc 수용체-유사 5 (FCRL5); 면역글로불린 람다-유사 폴리펩티드 1 (IGLLl); MPL; 바이오틴; c-MYC 에피토프 태그; CD34; LAMP1; TROP2;, GFRα4; CDH17; CDH6; NYBR1; CDH19; CD200R; Slea (CA19.9; 시아릴 루이스 항원); 퓨코실-GM1; PTK7; gpNMB; CDH1-CD324; DLL3; CD276/B7H3; IL-11Ra; IL-13Ra2; CD179b-IGLl1; ALK TCRγ-δ; NKG2D; CD32 (FCGR2A); Tn 항원; CSPG4-HMW-MAA; Tim1-/HVCR1; CSF2RA (GM-CSFR-알파); TGFβR2; VEGFR2/KDR; 루이스 항원; TCR-β1 사슬; TCR-β2 사슬, TCR-γ 사슬, TCR-δ 사슬; FITC; 황체형성 호르몬 수용체 (LHR); 난포 자극 호르몬 수용체 (FSHR); 융모생식샘 자극호르몬 수용체 (CGHR); CCR4; GD3; SLAMF6; SLAMF4; HIV1 외투 당단백질; HTLV1-Tax; CMV pp65; EBV-EBNA3c; 인플루엔자 A 헤마글루티닌 (HA); GAD; PDL1; 구아니릴 사이클라제 C (GCC); KSHV-K8.1 단백질; KSHV-gH 단백질; 데스모글레인 3 (Dsg3)에 대한 자가항체; 데스모글레인 1 (Dsg1)에 대한 자가항체; HLA, HLA-A, HLA-A2, HLA-B, HLA-C, HLA-DP, HLA-DM, HLA-DOA, HLA-DOB, HLA-DQ, HLA-DR, HLA-G; IGE; CD99; RAS; G12V; 조직 인자 1 (TF1); AFP; GPRC5D; 클라우딘18.2 (CLD18A2 또는 CLDN18A.2)); P-당단백질; STEAP1; LIV1; 넥틴-4; CRIPTO; GPA33; BST1/CD157; 저전도도 염화물 통로; 및 TNT 항체에 의해 인식되는 항원을 포함한다.
용어 "항원 제시 세포" 또는 APC"는 주요 면역적합성 복합체 (MHC)와 복합화된 외래 항원을 세포의 표면에 제시하는, 부속 세포 (예로, B 세포 및 가지 세포 등)와 같은 면역계 세포를 말한다. T 세포는 이들의 T 세포 수용체 (TCR)를 사용하여 이들 복합체를 인식할 수 있다. APC는 항원을 가공하여 이들을 T 세포에 제시한다.
용어 "항-감염 효과"는 이에 제한되는 것은 아니지만, 예로 감염성 제제의 역가의 감소, 감염성 제제의 콜로니 계수의 감소, 감염성 제제와 연관된 다양한 생리학적 증상의 개선을 포함하는 다양한 수단에 의해 나타날 수 있는 생물학적 효과를 말한다. "항-감염 효과"는 또한 우선 감염의 발생의 예방에서 펩티드, 폴리뉴클레오티드, 세포 및 항체의 능력에 의해 나타날 수 있다.
용어 "항종양 효과" 또는 "항암 효과"는 이에 제한되는 것은 아니지만, 종양 부피의 감소, 종양 세포의 수의 감소, 종양 세포 증식의 감소 또는 종양 세포 생존의 감소를 포함하는 다양한 수단에 의해 나타날 수 있는 생물학적 효과를 말한다.
본원에 사용된 바 "친화도"는 결합 강도의 척도를 설명하도록 의미한다. 친화도는 일부 경우에, 결합제 및 이의 표적 사이 (예로, 항체 및 결합 도메인에 특이적인 에피토프를 포함한 항원 사이)의 입체화학적 피팅의 밀착성, 이들 사이의 접촉 면적의 크기 및 하전된 및 소수성 기의 분포에 의존한다. 친화도는 일반적으로 이의 표적에 결합하는 결합제의 "능력"을 말한다. 당해 기술분야에는 "친화도"를 측정하는데 사용되는 다수의 방식이 존재한다. 예를 들면, 항원에 대한 항체의 친화도를 계산하는 방법이 친화도를 계산하는데 결합 실험의 사용을 포함하여 당해 기술분야에 숙지되어 있다. 결합 친화도는 당해 기술분야에 숙지된 다양한 기법, 예를 들면 표면 플라스몬 공명, 생체층 간섭측정법, 이중 편광 간섭측정법, 정적 광 산란법, 동적 광 산란법, 등열 적정 열량측정법, ELISA, 분석 초원심분리법 및 유세포 계측법을 사용하여 결정될 수 있다. 표면 플라스몬 공명은 예를 들면 BIAcore 시스템 (Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Sweden and Piscataway, N.J.)을 사용한 바이오센서 매트릭스 내의 단백질 농도의 변경의 검출에 의해 실시간 생체특이적 상호작용의 분석을 허용하는 광학 현상이다.
"항원 결합 도메인' 또는 "항원 결합 모듈" 또는 "항원 결합 분절"은 이의 일차, 이차 또는 삼차 서열 및 번역후 변형 및/또는 전하로 인해 높은 정도의 특이성으로 항원에 결합하는 폴리펩티드 또는 펩티드를 말한다. 항원 결합 도메인은 상이한 출처, 예를 들면 항체, 비-면역글로불린 결합 단백질, 리간드 또는 수용체로부터 유래될 수 있다. 본 발명은 하나 이상의 표적 항원에 결합하는 항원 결합 도메인을 포함하는 SIR을 제공한다. 본 발명은 또한 항체로부터 유래되는 항원 결합 도메인을 포함하는 SIR을 제공한다.
"결합력 (avidity)"은 결합제 및 이의 표적 사이의 상호작용의 세기 (예로, 항체 및 이의 항원 표적, 수용체 및 이의 동족체 등 사이의 상호작용의 세기)를 말한다. 결합력은 약하거나 셀 수 있다. 항원에 대한 항체의 친화도를 계산하는 방법은 친화도를 계산하는데 결합 실험의 사용을 포함하여 당해 기술분야에 숙지되어 있다. 기능적 검정법 (예로, 유세포 계측 검정법)에서 항체 활성은 또한 항체 침화도를 반영한다. 항체 및 친화도는 표현형으로 특성화되고, 기능적 검정법 (예로, 유세포 계측 검정법)을 사용하여 비교될 수 있다.
용어 "결합 상수 (Ka)"는 수용체 및 리간드의 결합의 평형 상수로서 정의된다.
용어 "자가항원"은 자가항체의 생산과 같은 자가면역 반응의 생산을 자극하는 내인성 항원을 말한다. 자가항원은 또한 자가면역 질환의 발생을 유도할 수 있는 세포 매개된 또는 항체-매개된 면역 반응의 표적이 되는 정상 조직으로부터의 자가-항원 또는 항원을 포함한다. 자가항원의 예는 이에 제한되는 것은 아니지만, 데스모글레인 1, 데스모글레인 3 및 이의 단편을 포함한다.
본원에 사용된 바 "유익한 결과"는 이에 제한되는 것은 아니지만, 질환 병태의 중증도의 감축 또는 완화, 질환 병태의 악화로부터 예방, 질환 병태의 치유, 질환 병태를 발생시킬 환자의 기회 감소 및 환자의 수명 또는 기대 수명의 연장을 포함할 수 있다.
본원에 사용된 바, 용어 "결합 도메인" 또는 "항체 분자"는 단백질, 예로 면역글로불린 사슬 또는 적어도 하나의 도메인, 예로 비특이적 도메인보다 높은 친화도로 표적에 결합할 수 있는 면역글로불린 가변 도메인 서열을 포함하는 이의 단편을 말한다. 용어는 항체 및 항체 단편을 포괄한다. 또 다른 구현예에서, 항체 분자는 다중특이적 항체 분자이고, 예는 이는 다수의 면역글로불린 가변 도메인 서열을 포함하고, 다수의 서열 중 제 1 면역글로불린 가변 도메인 서열은 제 1 에피토프에 대한 결합 특이성을 갖고, 다수의 서열 중 제 2 면역글로불린 가변 도메인 서열은 제 2 에피토프에 대한 결합 특이성을 갖는다. 또 다른 구현예에서, 다중특이적 항체 분자는 이중특이적 항체 분자이다. 이중특이적 항체는 두 개의 항원에 대한 특이성을 갖는다. 이중특이적 항체 분자는 제 1 에피토프에 대한 결합 특이성을 갖는 제 1 면역글로불린 가변 도메인 서열 및 제 2 에피토프에 대한 결합 특이성을 갖는 제 2 면역글로불린 가변 도메인 서열을 특징으로 한다.
"동일한 에피토프에 결합한다"는 표적 항원에 결합하는 항체, scFv 또는 다른 항원 결합 도메인의 능력 및 예시된 항체, scFv 또는 다른 항원 결합 도메인와 동일한 에피토프를 갖는 것을 의미한다. 예로서, 예시된 항체, scFv 또는 다른 결합제 및 다른 항체의 에피토프는 표준 에피토프 맵핑 기법을 사용하여 결정될 수 있다. 당해 기술분야에 잘 숙지되어 있는 표준 에피토프 맵핑 기법은 Methods in Molecular Biology, Vol. 66 (Glenn E.Morris, Ed., 1996) Humana Press, Totowa, New Jersey에서의 에피토프 맵핑 프로토콜을 포함한다. 예를 들면, 선형의 에피토프는, 예로 고체 지지체 상에 많은 펩티드, 단백질 분자의 부분에 해당하는 펩티드를 동시에 합성하고, 펩티드가 여전히 지지체에 부착되면서 펩티드를 항체와 반응시키는 것에 의해 결정될 수 있다. 이러한 기법은 당해 기술분야에 숙지되고, 예로 미국 특허 4,708,871; Geysen et al, (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 8: 3998-4002; Geysen et al, (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 78-182; Geysen et al, (1986) Mol. lmmunol. 23: 709-715에 기술되어 있다. SIR의 항원 결합 도메인에 의해 결합된 에피토프는 또한 에피토프 비닝 검정법에 의해 결정될 수 있다. 에피토프 비닝은 표적 항원에 대한 단일클론 항체를 특성화한 다음 라이브리러를 선별하는데 사용되는 경쟁적 면역검정법이다. 유사한 표적에 대한 항체는 항체가 항원의 에피토프에 대한 서로의 결합을 차단하는지 여부를 조사하도록 쌍을 이룬 방식으로 라이브러리의 다른 항체 모두가 테스트된다. 각각의 항체가 라이브러리의 나머지 모든 항체에 대해 작성된 프로파일을 얻은 이후에, 경쟁적 차단 프로파일이 라이브러리에서 나머지와 비교하여 각각의 항체를 위해 작성된다. 밀접하게 관련된 비닝 프로파일은 항체가 동일한 또는 밀접하게 관련된 에피토프를 갖고, 다함께 "비닝"되는 점을 나타낸다. 유사하게, 입체구조적 에피토프는 예로 수소/중수소 교환, X-선 결정학 및 이차원 핵자기 공명에 의해서와 같은 아미노산의 공간적 입체구조를 결정함으로써 바로 식별된다. 예로, 상기 에피토프 맵핑 프로토콜 참조. 단백질의 항원성 영역은 또한 예로 옥스포드 몰레큘라 그룹으로부터 입수가능한 오메가 버전 1.0 소프트웨어 프로그램을 사용하여 계산된 플롯과 같은 표준 항원성 및 수치요법 (hydropathy) 플롯을 사용하여 식별될 수 있다. 이러한 컴퓨터 프로그램은 항원성 프로파일을 결정하기 위해 Hopp/Woods method, Hopp et al, (1981) Proc. Natl. Acad. Sci USA 78: 3824-3828; 및 수치요법 플롯을 위해 Kyte-Doolittle 기법, Kyte et al, (1982) J. Mol. Bioi. 157: 1 05-132를 채용한다. 표적 (예로, CD19)에 대해 선택된 단일클론 항체가 독특한 에피토프에 결합하는지 여부를 결정하기 위하여, 각각의 항체는 시판되는 (Pierce, Rockford, Ⅲ.)을 사용하여 바이오틴화될 수 있다. 미표지된 단일클론 항체 및 바이오틴화된 단일클론 항체를 사용한 경쟁 연구는 CD19-세포외 도메인 코팅된-ELISA 플레이트를 사용하여 수행될 수 있다. 바이오틴화된 mAb 결합은 스트렙-아비딘-알칼라인 포스파타제 프로브로 검출될 수 있다.
본원에 사용된 바, 용어 "CDR" 또는 "상보성 결정 영역"은 중쇄 및 경쇄 폴리펩티드 둘 다의 가변 영역 내에 발견되는 비-연속적인 항원 조합 부위를 의미하도록 의도된다. 이들 특정한 영역은 Kabat et al., J. Bioi. Chern. 252: 6609-6616 (1977); Kabat et al., U.S. Dept. of Health and Human Services, "Sequences of proteins of immunological interest" (1991); Chothia et al., J. Mol. Bioi. 196: 901-917 (1987); 및 MacCallum et al., J. Mol. Bioi. 25 262: 732-745 (1996)에 의해 기술되어 왔고, 여기서 정의는 서로 비교될 때 아미노산 잔기의 중첩 또는 하위집합을 포함한다. 그럼에도 불구하고, 항체 또는 이식된 항체 또는 이들의 변이체의 CDR을 언급하는 정의의 적용은 본원에 정의되고 사용된 바 용어의 범위에 속하도록 의도된다. 본원에 사용된 바, 항체의 상이한 CDR은 또한 상이한 정의의 조합에 의해 정의될 수 있다. 예를 들면, vHCDR1는 카밧에 기초하여 정의될 수 있고, VHCDR2는 초티아에 기초하여 정의될 수 있다. 상기 인용된 참고문헌 각각에 의해 정의된 바와 같은 CDR을 포괄하는 아미노산 잔기는 다음과 같다:
상이한 항원을 표적하는 본 발명의 SIR의 항원 결합 도메인을 구성하는 상이한 vL 및 vH 분절의 CDR의 서열번호는 표 5에 제공된다.
일부 구현예에서, 표적 항원에 특이적으로 결합하는 항원-결합 모듈 (예로, Fab-유사 또는 Fv-유사 항원-결합 모듈)에 대한 언급은 항원-결합 모듈이 (a) 다른 분자에 대한 결합 친화도의 적어도 약 10배 (예로, 약 10, 20, 30, 40, 50, 75, 100, 200, 300, 400, 500, 750 또는 1000배 이상); 또는 (b) 다른 분자에 대한 결합을 위한 Kd의 약 1/10 미만 (예로, 1/10, 1/20, 1/30, 1/40, 1/50, 1175, 1/100, 1/200, 1/300, 1/400, 1/500, 1/750 또는 1/1000 미만) Kd가 되는 친화도로 표적 항원에 결합하는 것을 의미한다. 결합 친화도는 ELISA, 형광 활성화된 세포 선별 (FACS) 분석법 또는 방사성면역침전 검정법 (RIA)과 같은 당해 기술분야에 숙지된 방법에 의해 결정될 수 있다. Kd는 예를 들면 비아코아 기기를 사용하는 표면 플라스몬 공명 (SPR) 검정법 또는 사피딘 기기를 사용하는 역학적 배제 검정법 (KinExA)과 같은 당해 기술분야에 숙지된 방법에 의해 결정될 수 있다.
"암" 및 "암성"은 전형적으로 미조절된 세포 성장을 특징으로 하는 포유동물에서 생리학적 병태를 말하거나 설명한다. 암의 예는 이에 제한되는 것은 아니지만, B-세포 림프종 (호지킨 림프종 및/또는 비-호지킨 림프종), T 세포 림프종, 골수종, 골수이형성 증후군, 피부암, 뇌암, 유방암, 결장암, 신장암, 직장암, 식도암, 항문암, 미지의 원발성 부위의 암, 내분비암, 고환암, 폐암, 감세포암, 위암, 췌장암, 자궁경부암, 난소암, 간암, 방광암, 요관의 암, 생식 기관의 암, 갑상샘암, 신장암, 암종, 흑색종, 두경부암, 뇌암 (예로, 다형성 교모세포종), 이에 제한되는 것은 아니지만 안드로겐-의존성 전립샘암 및 안드로겐-비의존성 전립샘암을 포함한 전립샘암 및 백혈병을 포함한다. 기타 암 및 세포 증식성 장애는 당해 기술분야에서 바로 인식될 것이다. 용어 "종양" 및 "암"은 본원에서 상호교환적으로 사용되고, 예로 둘 다의 용어가 고형 및 액상, 예로 확산성 또는 순환성 종양을 포괄한다. 본원에 사용된 바, 용어 "암" 또는 "종양"은 전악성, 뿐만 아니라 악성 암 및 종양을 포함한다.
"화학치료제"는 암의 화학요법에 유용한 것으로 알려진 화합물이다. 화학치료제의 비제한적인 예는 티오테파 및 사이토잔® 사이클로포스파미드와 같은 알킬화제; 부설판, 임프로설판 및 피포설판과 같은 알킬 설포네이트; 벤조도파, 카보쿠온, 메튜레도파 및 유레도파와 같은 아지리딘; 에틸렌이민 및 알트레타민, 트레에틸렌멜라민, 트레에틸렌포스파미드, 트레에틸렌티오포스파미드 및 트리메틸롤로멜라민을 포함하는 메틸아멜라민; 아세토제닌 (특히 불라타신 및 불라타신온); 캄프토테신 (합성 유사체 토포테칸 포함); 브리오스타틴; 칼리스타틴; CC-1065 (이의 아도젤레신, 카르젤레신 및 비젤레신 합성 유사체 포함); 크립토파이신 (상세하게 크립토파이신 1 및 크립토파이신 8); 돌라스타틴; 듀오카르마이신 (합성 유사체 KW-2189 및 CB1-TM1 포함); 엘류테로빈; 판크라티스타틴; 사르코딕티인; 스폰지스타틴; 클로르암부실, 클로르나파진, 콜로포스파미드, 에스트라무스틴, 이포스파미드, 메클로르에타민, 메클로르에타민 옥사이드 염화물, 멜팔란, 노벰비신, 펜스테린, 프레드니무스틴, 로무스틴, 니무스틴 및 라니무스틴과 같은 질소 머스타드; 에네디인 항생제 (예로, 칼리케아미신, 특히 칼리케아미신 감마Ⅱ 및 칼리케아미신 오메가Ⅱ (예로, Agnew, Chem. Intl. Ed. Engl., 33: 183-186 (1994)); 다이네미신 A를 포함하는 다이네미신; 클로드로네이트와 같은 비스포스포네이트; 에스페라미신; 네오카지노스타틴 발색단 및 관련된 발색단백질 에네디인 항생제 발색단, 아클라시노마신, 액티노마이신, 오트라마이신, 아자세린, 블레오마이신, 칵티노마이신, 카라비신, 카미노마이신, 카지노필린, 크로모마이신, 닥티노마이신, 다우노루비신, 데토루비신, 6-디아조-5-옥소-L-노르류신, 아드리아마이신® 독소루비신 (올로리노-독소루비신, 시아노몰포리노-독소루비신, 2-피롤리노-독소루비신 및 데옥시독소루비신 포함), 에피루비신, 에소루비신, 이다루비신, 마르셀로마이신, 미토마이신 C와 같은 미토마이신, 마이코페놀산, 노갈라마이신, 올리보마이신, 페프로마이신, 포트피로마이신, 퓨로마이신, 켈라마이신, 로도루비신, 스트렙토마이신, 스트렙토조신, 튜버시딘, 우베니멕스, 지노스타틴, 조루비신; 메토트렉세이트 및 5-플루오로우라실 (5-FU)과 같은 항-대사물; 데노프테린, 메토트렉세이트, 프테로프테린, 트리메트렉세이트와 같은 염산 유사체; 플루다라빈, 6-머캅토퓨린, 티아미프린, 티오구아닌와 같은 퓨린 유사체; 안시타빈, 아자시티딘, 6-아자우리딘, 카르모퍼, 사이타라빈, 디데옥시우리딘, 독시플루리딘, 에노시타빈, 플록스우리딘과 같은 피리미딘 유사체; 칼루스테론, 드로모스타놀온 프로피오네이트, 에피티오스탄올, 메피티오스탄, 테스토락톤과 같은 안드로겐; 아미노글루테티미드, 미토탄, 트릴로스탄과 같은 항-아드레날; 프로린산과 같은 엽산 보충제; 아세글라톤; 알도포스파미드 글리코시드; 아미노레불린산; 에닐우라실; 암사크린; 베스트라부실; 비스안트렌; 에다트라세이트; 데포파민; 데메콜신; 디아지쿠온; 엘포르미틴; 엘립티늄 아세테이트; 에포틸온; 에토글루시드; 갈륨 니트레이트; 하이드록시우레아; 렌티난; 로니다이닌; 메이탄신 및 안사미토신과 같은 메이탄시노이드; 미토구아존; 미토잔트론; 모피단몰; 니트라에린; 펜토스타틴; 페나메트; 피라루비신; 로소잔트론; 포도필린산; 2-에틸하이드라지드; 프로카바진; PSK® 다당류 복합체 (JHS Natural Products, Eugene, Oreg.); 라족산; 라이조신; 시조퓨란; 스피로제르마늄; 테누아존산; 트리아지쿠온; 2,2',2"-트리클로로트리에틸아민; 트리코테센 (특히 T-2 독소, 베라쿠린 A, 로리딘 A 및 안구이딘); 유레탄; 빈데신; 다카바진; 만노무스틴; 미토브로니톨; 미토락톨; 피포브로만; 가사이토신; 아라비노시드 ("Ara-C"); 사이클로포스파미드; 티오테파; 택소이드, 예로 택솔® 파크리탁셀 (Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, N.J.), 아브락산® 파크리탁셀의 무-크레모포 알부민-조작된 나노입자 제형물 (American Pharmaceutical Partners, Schaumberg, Ill.), 및 택소테르® 도세탁셀 (Rhone-Poulenc Rorer, Antony, France); 클로르안부실; 젬자르® 젬시타빈; 6-티오구아닌; 머캅토퓨린; 메토트렉세이트; 시스플라틴, 옥살리플라틴 및 카보플라틴과 같은 백금 유사체; 빈블라스틴; 백금; 에토포시드 (VP-16); 이포스파미드; 미토잔트론; 빈크리스틴; 나벨빈; 비노렐빈; 노반트론; 테니포시드; 에다트렉세이트; 다우노마이신; 아미노프테린; 젤로다; 이반드로네이트; 이리노테칸 (캄프토사르, CPT-11) (5-FU 및 류코보린과 함께 이리노테칸의 치료 요법 포함); 토포이소머라제 저해제 RFS 2000; 디플루오로메틸오르니틴 (DMFO); 레티노산과 같은 레티노이드; 카페시타빈; 콤브레타스타틴; 류코보린 (LV); 옥살리플라틴 치료 요법을 포함한 옥살리플라틴 (FOLFOX); 세포 증식을 감소시키는 라파티닙 (Tykerb); PKC-알파, Raf, H-Ras, EGFR (예로, 에를로티닙 (타르세바®)) 및 VEGF-A의 저해제; 및 임의의 상기 치료제의 약제학적으로 허용가능한 염, 산 또는 유도체 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다.
"키메라 항원 수용체" (CAR)는 입양 세포 전달이라고 불리는 기법을 사용하여 암 요법으로서 용도가 고려되는 인공적인 T 세포 수용체이다. 복합체의 필수적인 항원-결합, 신호전달 및 자극 기능은 일반적으로 키메라 항원 수용체 (CAR)라고 지칭되는 단일 폴리펩티드 사슬로의 유전적 재조합 방법에 의해 감소되어 왔다. 예로, Eshhar, 미국 특허 7,741,465; Eshhar, 미국 특허출원 2012/0093842 참조. CAR는 T 세포 활성화 및 증식을 CAR가 결합하는 특이적 항원에 반응하여 특이적으로 자극하도록 제작된다. 용어 "키메라 항원 수용체" 또는 대안적으로 "CAR"는 폴리펩티드의 집합, 전형적으로 가장 단순한 구현예에서 두 개의 폴리펩티드를 말하고, 이는 면역 효과기 세포에서 발현될 때 표적 세포, 전형적으로 암 세포에 대한 특이성을 세포내 신호 생성과 함께 갖는 세포를 제공한다. 일부 구현예에서, CAR는 자극 분자 및/또는 보조자극 분자로부터 유래된 기능적 신호전달 도메인을 포함하여 적어도 하나의 세포외 항원 결합 도메인, 막통과 도메인, 및 세포질 신호전달 도메인 ("세포내 신호전달 도메인"이라고도 지칭됨)을 포함한다. 일 관점에서, 자극 분자는 T 세포 수용체 복합체와 연관된 제타 사슬이다. 일 관점에서, 세포질 신호전달 도메인은 하기에 정의된 바와 같은 적어도 하나의 보조자극 분자로부터 유래된 하나 이상의 기능적 신호전달 도메인을 포함한다. 일 관점에서, 보조자극 분자는 본원에 기술된 보조자극 분자, 예로, 4-lBB (예로, CD137), CD27 및/또는 CD28로부터 선택된다. 일 관점에서, CAR는 CAR 융합 단백질의 아미노-말단 (N-ter)에서 조건부 리더 서열을 추가로 포함하고, 여기서 리더 서열은 CAR의 세포 프로세싱 및 세포막으로 국소화 동안 항원 결합 도메인 (예로, scFv)으로부터 선택적으로 절단된다. 전형적으로, 키메라 항원 수용체를 포함하도록 조작되었던 T 세포를 말하는 "CAR-T 세포"가 사용된다. 따라서, 이러한 CAR을 보유한 림프구는 일반적으로 CAR-T 림프구라고 지칭된다.
"코돈 최적화" 또는 "종 코돈 편향성의 조절"은 특정한 숙주 세포의 선호하는 코돈 사용법을 말한다. 당업자라면 이해할 바와 같이, 특정한 숙주에서 발현을 증진하도록 코딩 서열을 변형하는 것이 유리할 수 있다. 유전 코드는 64개 가능한 코돈으로 반복 (redundant)되지만, 대부분의 유기체는 전형적으로 이들 코돈의 하위집합을 사용한다. 종에서 가장 자주 사용되는 코돈을 최적의 코돈으로 부르고, 자주 사용되지 않는 코돈을 희귀한 또는 낮은 사용법 코돈으로 분류한다.
특정한 원핵 또는 진핵 숙주에 의해 선호된 코돈을 포함하는 최적화된 코딩 서열 (또한 Murray et al. (1989) Nucl. Acids Res. 17: 477-508 참조)은, 예를 들면 최적화되지 않은 서열로부터 생산된 전사체와 비교하여 번역 속도를 증가시키거나, 더 긴 반감기와 같은 바람직한 성질을 갖는 재조합 RNA 전사체를 생산하도록 제조될 수 있다. 번역 종결 코돈도 역시 숙주 선호도를 반영하도록 변형될 수 있다. 당업자라면 유전 코드의 중복 (degenerate) 특성으로 인해, 이들의 뉴클레오티드 서열이 상이한 다양한 DNA 화합물이 본 발명의 주어진 폴리펩티드를 인코딩하는데 사용된다.
본원에 사용된 바, "공동발현한다"는 두 개 이상의 유전자의 발현을 말한다. 유전자는 예를 들면, 단일 단백질 또는 단일 폴리펩티드 사슬로서 키메라 단백질을 인코딩하는 핵산일 수 있다. 본원에 기술된 SIR은 단일 폴리뉴클레오티드 사슬에 의해 인코딩되고, 단일 폴리펩티드 사슬로서 합성될 수 있고, 이는 후속적으로 각각이 구별된 작용 단위가 되는 상이한 폴리펩티드로 절단된다. 일부 구현예에서, SIR이 두 개 이상의 폴리펩티드 작용 단위로 구성되는 곳에서, 상이한 작용 단위는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드 사슬을 사용하여 공동발현된다. 또 다른 구현예에서, 상이한 폴리뉴클레오티드 사슬은 절단가능한 링커 (예로, T2A, F2A, P2A, E2A 등)을 인코딩하는 핵산 서열에 의해 연결된다. 또 다른 구현예에서, Ser-Gly-Ser-Gly (SGSG) 모티브 (서열번호 3065)가 또한 절단의 효율을 증진하도록 절단가능한 링커 서열의 상류에 첨가된다. 절단가능한 링커의 잠재적인 단점은 N-말단 단백질의 말단에 남은 작은 2A 태그가 단백질 기능에 영향을 주거나, 단백질의 항원성에 기여할 수 있는 가능성이다. 이러한 점을 극복하기 위하여, 일부 구현예에서, 퓨린 절단 부위 (RAKR) (서열번호 3066)가 번역 이후에 잔류 2A 펩티드의 절단을 용이하게 하도록 SGSG 모티브의 상류에 첨가된다. SIR의 상이한 단위를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드는 IRES (리보좀 내부 진입 부위) 서열에 의해 연결될 수 있다. 대안적으로, SIR의 상이한 작용 단위는 링커에 의해 연결되지 않은 두 개의 상이한 폴리뉴클레오티드에 의해 인코딩되지만, 대신에 예를 들면 두 개의 상이한 벡터에 의해 인코딩된다. 절단가능한 링커 및 퓨린 절단 부위의 핵산 서열은 서열번호 780 내지 서열번호 790에 제공된다.
"보존적 치환" 또는 "보존적 서열 변형"은 인코딩된 단백질의 결합 특징 또는 기능에 유의하게 영향을 주거나 이를 변경하지 않는 아미노산 변형을 말한다. 예를 들면 "보존적 서열 변형"은 TCR 불변 사슬, 항체, 항체 단편 또는 비-면역글로불린 결합 도메인의 결합 특징 또는 기능에 유의하게 영향을 주거나 이를 변경하지 않는 아미노산 변형을 말한다. 이러한 보존적 변형은 아미노산 치환, 첨가 및 결실을 포함한다. 변형은 부위-유도된 돌연변이유발 및 PCR-매개된 돌연변이유발과 같은 당해 기술분야에 숙지된 표준 기법에 의해 TCR 불변 사슬, 항체 또는 항체 단편, 비-면역글로불린 결합 도메인 또는 본 발명의 다른 단백질 또는 폴리펩티드 내로 도입될 수 있다. 보존적 아미노산 치환은 아미노산 잔기가 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기로 대체되는 것이다. 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기의 패밀리는 당해 기술분야에 정의되었다. 이들 패밀리는 염기성 측쇄 (예로, 라이신, 아르기닌, 히스티딘), 산성 측쇄 (예로, 아스파라긴산, 글루탐산), 미하전된 극성 측쇄 (예로, 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 타이로신, 시스테인, 트립토판), 비극성 측쇄 (예로, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌), 베타-분지된 측쇄 (예로, 트레오닌, 발린, 이소류신) 및 방향족 측쇄 (예로, 타이로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘)를 갖는 아미노산을 포함한다. 따라서, 본 발명의 SIR 내의 하나 이상의 아미노산 잔기는 동일한 측쇄 패밀리로부터의 다른 아미노산 잔기로 대체될 수 있고, 변경된 SIR은 본원에 기술된 결합 및/또는 기능적 검정법을 사용하여 테스트될 수 있다.
용어 "T 세포 수용체-알파의 불변 영역" 또는 "T 세포 수용체-알파의 불변 사슬" 또는 "TCRα" 또는 "Cα"는 서열번호 3010로서 제공된 단백질 또는 비-인간 종, 예로 마우스, 설치류, 원숭이 및 유인원 등으로부터의 동등한 잔기 (예로, 상동체)로서 정의된다. 본 발명은 또한 TCRα 폴리펩티드에 대한 특정 돌연변이를 제공한다. 예를 들면, 본 발명의 합성 면역 수용체 (SIR)의 발현 증가 및 미스페어링 감소를 보여주는 Cα의 돌연변이 부위는 서열번호 3010의 91, 92, 93 및 94번 위치에 위치한다. Cα에서 Thr 48번 Cys (T48C) 돌연변이 및 Cβ1 또는 Cβ2 사슬에서 Ser 57번 Cys (S57C) 돌연변이를 갖는 SIR (본원의 다른 곳에서 더 완벽하게 기술됨)은 두 개의 TCR 불변 사슬 (α 및 β) 사이의 추가적인 디설파이드 결합을 유도한다. 따라서, 다음으로 면역 세포에서 내인성 TCR 사슬과의 미스페어링 감소 및 기능성 증진을 유도한다. 유사하게, Cα의 Ser 61번 Arg (S61R) 돌연변이 및 Cβ1 또는 Cβ2 사슬에서 Arg 79번 Gly (R79G) 돌연변이를 갖는 SIR (본원의 다른 곳에서 더 완벽하게 기술됨)은 쌍 형성을 위한 "놉앤홀" 설계로 인해 내인성 TCR 사슬과의 미스페어링 감소 및 기능성 증진을 유도한다. 본 발명은 하기 표 1에 따른 하나 이상 또는 모든 돌연변이를 갖는 Cα 폴리펩티드를 제공한다.
인간 게놈은 두 개의 매우 상동적인 TCR 베타 불변 사슬, TCR 베타 1 (TCRβ1 또는 TCRb1 또는 cβ1) 및 TCR 베타 2 (TCRβ2 또는 TCRb2 또는 cβ2)을 인코딩한다. 본 발명의 SIR은 이들 두 개의 사슬 중 어느 하나를 포함할 수 있다. 유사하게, 다른 포유동물 종의 TCR 베타 1 또는 TCR 베타 2 사슬이 본 발명의 방법에서 SIR을 제조하는데 사용될 수 있다.
용어 "T 세포 수용체-베타 1의 불변 사슬" 또는 "T 세포 수용체-베타 1의 불변 영역" (TCR-베타1 또는 TCRβ1 또는 TCRb1 또는 hTCR-베타1 또는 Cβ1)은 서열번호 3024로서 제공된 단백질 또는 비-인간 종, 예로 마우스, 설치류, 원숭이 및 유인원 등으로부터의 동등한 잔기 (예로, 상동체)로서 정의된다.
용어 "T 세포 수용체-베타 2의 불변 사슬" 또는 "T 세포 수용체-베타 2의 불변 영역" (TCR-베타2 또는 TCRβ2 또는 TCRb2 또는 Cβ2)은 서열번호 3025로서 제공된 단백질 또는 비-인간 종, 예로 마우스, 설치류, 원숭이 및 유인원 등으로부터의 동등한 잔기 (예로, 상동체)로서 정의된다.
용어 "T 세포 수용체-베타의 불변 사슬" 또는 "T 세포 수용체-베타의 불변 영역" (TCR-베타 또는 TCRβ 또는 TCRb 또는 Cβ)은 서열번호 3024 또는 서열번호 3025로서 제공된 단백질 또는 비-인간 종, 예로 마우스, 설치류, 원숭이 및 유인원 등으로부터의 동등한 잔기 (예로, 상동체)로서 정의된다.
Cβ2 (서열번호 3025) 및 Cβ1 (서열번호 3024) 둘 다의 단백질 서열은 알려져 있다. Cβ2 및 β1의 서열 간의 차이는 당해 기술분야의 전형적이고 보통의 기술을 사용한 서열의 정렬에 의해 쉽게 확인될 수 있다. 본 발명은 또한 TCRβ에 대한 특정 돌연변이를 제공한다. 예를 들면, 합성 면역 수용체 (SIR)의 발현 증가 및 내인성 TCRα 사슬과의 미스페어링 감소를 보여주는 Cβ의 돌연변이 부위가 본원에 제공된다. Cβ1 및 Cβ2에서 이들 돌연변이는 서열번호 3025 및 3024의 18, 22, 57, 79 133, 136 및 139번 위치에 위치하고, 하기 표 2 및 표 3에 요약되어 있다. Cβ1 및 Cβ2에서 돌연변이는 이들 위치에서 일치한다. 두 개의 서열 간의 유일한 차이는 136번 위치에서 돌연변이이다. 이 위치에서, 글루탐산 (E)은 Cβ2에 존재하는 반면, 발린은 Cβ1에 존재한다.
용어 "preTCRa의 불변 사슬" (preTCR-알파 또는 preTCRα 또는 preTCRa 또는 preCα) 또는 "preTCRa의 불변 영역"은 서열번호 3046 또는 서열번호 3047로서 제공된 단백질 또는 비-인간 종, 예로 마우스, 설치류, 원숭이 및 유인원 등으로부터의 동등한 잔기 (예로, 상동체)로서 정의된다.
용어 "preTCRa-Del48의 불변 사슬" (preTCR-알파-Del48 또는 preTCR-Del48α 또는 preTCRa-Del48 또는 preC-Del48α) 또는 "preTCRa-Del48의 불변 영역"은 서열번호 3048로서 제공된 단백질 또는 비-인간 종, 예로 마우스, 설치류, 원숭이 및 유인원 등으로부터의 동등한 잔기 (예로, 상동체)로서 정의된다.
용어 "TCR-감마의 불변 사슬" 또는 "TCR-감마의 불변 영역" (TCR-감마 또는 TCRγ 또는 TCRg 또는 TCR-감마1 또는 TCRγ1 또는 TCRg1 또는 Cγ)은 서열번호 3049로서 제공된 단백질 또는 비-인간 종, 예로 마우스, 설치류, 원숭이 및 유인원 등으로부터의 동등한 잔기 (예로, 상동체)로서 정의된다.
용어 "TCR-델타의 불변 사슬" 또는 "TCR-델타의 불변 영역" (TCR-델타 또는 TCRδ 또는 TCRd 또는 Cδ)은 서열번호 3052로서 제공된 단백질 또는 비-인간 종, 예로 마우스, 설치류, 원숭이 및 유인원 등으로부터의 동등한 잔기 (예로, 상동체)로서 정의된다.
단백질이 서로 동일성 또는 상동성을 갖고 유사한 또는 동일한 기능을 보유할 수 있음이 인식될 것이다. 본 발명은 생물학적 활성을 보유하면서 본원에 기술된 임의의 서열과 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 98.5%, 99% 또는 99.9% 동일성을 갖는 TCR 불변 영역을 포함한다.
따라서, 본 발명은 (a) 서열번호 3010과 적어도 98% 동일하고, 61, 91, 92, 93 및/또는 94번 위치에서 하나 이상의 돌연변이를 갖을 수 있는 아미노산 서열; (b) 서열번호 3024와 적어도 98% 동일하고, 18, 22, 57, 79, 133, 136 및/또는 139번 위치에서 하나 이상의 돌연변이를 갖을 수 있는 아미노산 서열; (c) 서열번호 3025와 적어도 98% 동일하고, 18, 22, 57, 79, 133, 136 및/또는 139번 위치에서 하나 이상의 돌연변이를 갖을 수 있는 아미노산 서열; (d) 서열번호 3046 또는 3047와 적어도 98% 동일한 아미노산 서열; (e) 서열번호 3048과 적어도 98% 동일한 아미노산 서열; (f) 서열번호 3049와 적어도 98% 동일한 아미노산 서열; 및 (g) 서열번호 3051 또는 3052와 적어도 98% 동일한 아미노산 서열:로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 갖는 T 세포 수용체 불변 사슬을 제공한다. 임의의 (a) 내지 (g)의 T 세포 수용체 불변 사슬은 이것이 동일성 또는 상동성을 갖는 야생형 T 세포 수용체 불변 사슬의 적어도 하나의 생물학적 활성을 보유한다.
용어 "보조자극 분자"는 보조자극 리간드에 특이적으로 결합하고, 이로써 이에 제한되는 것은 아니지만 증식과 같은 T 세포에 의한 보조자극 반응을 매개하는 T 세포 상의 동족체 결합 파트너를 말한다. 보조자극 분자는 항원 수용체 또는 이들의 리간드가 아닌 효율적인 면역 반응에 기여하는 세포 표면 분자이다. 보조자극 분자는 이에 제한되는 것은 아니지만, MHC 클래스 I 분자, BTLA 및 톨 리간드 수용체, 뿐만 아니라 OX40, CD27, CD28, CD8, ICAM-1, LFA-1 (CD11a/CD18), ICOS (CD278) 및 4-1BB (CD137)를 포함한다. 이러한 보조자극 분자의 추가의 예는 CD8, ICAM-1, GITR, BAFFR, HVEM (LIGHTR), SLAMF7, NKp80 (KLRF1), NKp44, NKp30, NKp46, CD160, CD19, CD4, CD8 알파, CD8 베타, IL2R 베타, IL2R 감마, IL7R 알파, ITGA4, VLA1, CD49a, ITGA4, IA4, CD49D, ITGA6, VLA-6, CD49f, ITGAD, CDlld, ITGAE, CD103, ITGAL, CDlla, LFA-1, ITGAM, CDllb, ITGAX, CDllc, ITGB1, CD29, ITGB2, CD18, LFA-1, ITGB7, NKG2D, NKG2C, TNFR2, TRANCE/RANKL, DNAM1 (CD226), SLAMF4 (CD244, 2B4), CD84, CD96 (Tactile), CEACAM1, CRT AM, Ly9 (CD229), CD160 (BY55), PSGL1, CDlOO (SEMA4D), CD69, SLAMF6 (NTB-A, Ly108), SLAM (SLAMF1, CD150, IP0-3), BLAME (SLAMF8), SELPLG (CD162), LTBR, LAT, GADS, SLP-76, PAG/Cbp, CD19a 및 CD83과 특이적으로 결합하는 리간드를 포함한다. 보조자극 세포내 신호전달 도메인은 보조자극 분자의 세포내 부분일 수 있다. 보조자극 분자는 다음의 단백질 패밀리로 예시될 수 있다: TNF 수용체 단백질, 면역글로불린-유사 단백질, 사이토카인 수용체, 인테그린, 신호전달 림프구 활성화 분자 (SLAM 단백질) 및 활성화 NK 세포 수용체. 이러한 분자의 예는 CD27, CD28, 4-1BB (CD137), OX40, GITR, CD30, CD40, ICOS, BAFFR, HVEM, ICAM-1, 림프구-기능 관련된 항원-1 (LFA-1), CD2, CD8, CD7, CD287, LIGHT, NKG2C, NKG2D, SLAMF7, NKp80, NKp30, NKp44, NKp46, CD160, B7-H3 및 CD83에 특이적으로 결합하는 리간드 등을 포함한다. 세포내 신호전달 도메인은 이것이 유래된 분자의 전체 세포내 도메인 또는 전체 미가공 세포내 신호전달 도메인 또는 이들의 기능적 단편 또는 유도체를 포함할 수 있다.
용어 "cTCR"은 야생형 TCR 핵산 코딩 서열 및 항원 결합 도메인에 연결된 상응하는 야생형 TCR 단백질을 말한다. cTCR은 일부 구현예에서 및 기준 대조군에서 사용된다. 예를 들면, CD19 결합 도메인 및 CD19-SIR을 갖는 cTCR (돌연변이체 TCR 사슬 및 CD19 결합 도메인 포함)은 표적 항원에 상이한 발현 및/또는 상이한 결합 친화도를 갖을 것이다.
용어 "퇴행성 장애"는 조직 및 기관을 침범하는 퇴행성 세포 변화에 기초한 연속적인 과정의 결과인 질환을 말하고, 이는 정상적 신체 마모 및 운동과 식습관과 같은 생활스타일 선택으로 인해 시간 경과 시 점차로 약화될 것이다. 예시적인 퇴행성 질환은 알츠하이머병, 사르코-마리-투스병, 크루츠펠트-야콥병, 프리드리히 실조증, 당뇨병 (Ⅱ형) 및 죽상경화증을 포함한다.
"로부터 유래된"은 본원에서 해당 용어가 사용된 바, 제 1 및 제 2 분자 간의 관계를 나타낸다. 이것은 일반적으로 제 1 및 제 2 분자 간의 구조적 유사성을 말하고, 제 2 분자로부터 유래된 제 1 분자에 관한 과정 또는 출처 제한을 암시하거나 포함하지 않는다. 예를 들면, 항체 분자로부터 유래된 항원 결합 도메인의 경우에, 항원 결합 도메인은 요구된 기능을 갖기에 충분한 항체 구조, 즉 항원에 결합하는 능력을 보유한다. 이것은 항체를 생산하는 특정한 공정에 대한 제한을 암시하거나 포함하지 않고, 예로 이는 항원 결합 도메인을 제공하기 위하여 항체 서열로 시작하고 원치않는 서열을 결실시켜야 하거나, 항원 결합 도메인에 도달하기 위하여 돌연변이를 부여해야 하는 것을 의미하지 않는다.
용어 "표적 항원의 발현과 연관된 질환" 또는 "본원에 기술된 바와 같은 질환 연관된 항원"은 이에 제한되는 것은 아니지만, 예로 암과 같은 증식성 질환 또는 골수이형성, 골수이형성 증후군 또는 전백혈병과 같은 악성암 또는 전암성 병태; 또는 본원에 기술된 바와 같은 표적 항원을 발현하는 세포와 연관된 비암 관련 적응증을 포함하여, 본원에 기술된 바와 같은 표적 항원의 발현과 연관된 질환 또는 본원에 기술된 바와 같은 표적 항원을 발현하는 세포와 연관된 병태를 포함한다. 일 관점에서, 본원에 기술된 바와 같은 종양 항원의 발현과 연관된 암은 혈액학적 암이다. 일 관점에서, 본원에 기술된 바와 같은 종양 항원의 발현과 연관된 암은 고형암이다. 또한 본원에 기술된 종양 항원의 발현과 연관된 암은 이에 제한되는 것은 아니지만, 본원에 기술된 바와 같은 종양 항원의 발현과 연관된 비전형적 및/또는 비-고전적인 암, 악성암, 전암성 병태 또는 증식성 질환을 포함한다. 본원에 기술된 바와 같은 종양 항원의 발현과 연관된 비암 관련 적응증은 이에 제한되는 것은 아니지만, 예로 자가면역 질환, (예로, 루푸스), 염증성 장애 (알레르기 및 천식) 및 이식을 포함한다. 일부 구현예에서, 표적 항원-발현하는 세포는 발현되는 언제라도, 표적 항원을 인코딩하는 mRNA를 발현한다. 또 다른 구현예에서, 표적 항원-발현하는 세포는 표적 항원 단백질 (예로, 야생형 또는 돌연변이체)을 생산하고, 표적 항원 단백질은 정상 수준 또는 감소된 수준으로 존재할 수 있다. 또 다른 구현예에서, 표적 항원-발현하는 세포는 한 지점에서 검출가능한 수준의 표적 항원을 생산하였고, 이후에 검출가능한 표적 항원 단백질을 실질적으로 전혀 생산하지 못하였다.
본원에 사용된 바 "유전적으로 변형된 세포에 의해 표적된 질환"은 질환 또는 표적 조직 또는 세포 유형을 지향하는 유전적으로 변형된 세포에 의한 임의의 방식으로 임의의 질환에 관여된 임의의 세포의 표적화를, 유전적으로 변형된 세포가 병든 세포 또는 건강한 세포를 표적하여 치료적으로 유익한 결과를 달성하는지 여부와 상관없이 포괄한다.
용어 "해리 상수 (Kd)"는 수용체-리간드 상호작용의 해리의 평형 상수로서 정의된다.
본원에 사용된 바 "SIR의 다양한 집합" 또는 "합성 면역 수용체의 다양한 집합"은 T 세포 수용체 불변 사슬의 다양한 집합에 연결된 동일한 결합 도메인을 갖는 다수의 SIR을 말하고, 여기서 결합 도메인 및 상이한 T 세포 불변 사슬을 포함하는 각각의 구조물은 다양한 범위의 표적 항원에 대한 결합 및/또는 다양한 발현 수준을 제공한다. 예를 들면, 불변 도메인의 돌연변이 조성 (예로, 돌연변이체 TCRa + TCRb)에 의존하여 결합 도메인의 표적에 대한 결합 친화도가 변화한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 SIR (단일 사슬 또는 이종이량체)은 동일한 결합 도메인을 갖는 야생형 TCR (예로, cTCR)보다 큰 결합 친화도를 포함한다. 일 구현예에서, SIR은 cTCR보다 적어도 1.25배 내지 약 10,000배 (및 이들 사이의 임의의 수) 더 높은 발현 수준을 갖고, 여기서 SIR 및 cTCR은 TCR 도메인의 돌연변이만이 상이하다. 또 다른 구현예에서, SIR은 동일한 항원에 대한 결합 도메인을 갖는 cTCR보다 적어도 1.5배 내지 약 10,000배 더 높은 표적에 대한 결합 친화도를 갖는다. 또한 또 다른 구현예에서, SIR은 동일한 항원에 대해 cTCR보다 더 높은 결합 친화도를 갖지만, 동일한 결합 도메인을 갖는 키메라 항원 수용체 (CAR)보다는 낮다. 일부 구현예에서, SIR 발현하는 효과기 세포의 표적 항원에 대한 결합은 상응하는 TCR-발현하는 효과기 세포의 결합보다 적어도 1.25배 이상이지만 상응하는 cTCR보다는 100,000배 미만으로 더 많다. 일부 구현예에서, 항원 결합 도메인은 약 10-4 M 내지 10-8 M 사이 범위의 해리 상수 (KD, 이의 결합 친화도 반영)를 갖는다. 일부 구현예에서, 항원 결합 도메인은 상기에 인용된 하나 이상의 항원에 결합한다. 일부 구현예에서, 항원 결합 도메인은 표적 항원에 대해 약 10-4 M 내지 10-8 M, 예로 약 10-5 M 내지 10-7 M, 예로 약 10-5 M 내지 10-6 M의 KD를 갖는다. 일 구현예에서, 항원 결합 도메인의 결합 친화도는 기준 항체보다 적어도 5배, 10배, 20배, 30배, 50배, 100배 또는 1,000배 더 적다. 일 구현예에서, 인코딩된 항원 결합 도메인은 기준 항체보다 적어도 5배 더 적은 결합 친화도를 갖는다. 일부 구현예에서, 기준 항체는 항원 결합 도메인이 유래된 항체이다.
본원에 사용된 바, "에피토프"는 면역 반응을 유도할 수 있는 항원 부분 또는 항체 또는 항체 단편에 결합하는 항원의 부분인 것으로 정의된다. 에피토프는 단백질 서열 또는 하위서열일 수 있다.
용어 "발현 벡터"는 발현될 뉴클레오티드 서열에 작동적으로 연결된 발현 조절 서열을 포함하는 재조합 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 말한다. 발현 벡터는 발현을 위한 충분한 시스-작용 요소를 포함하고, 발현을 위한 다른 요소는 숙주 세포에 의해 또는 시험관내 발현 시스템에서 공급될 수 있다. 발현 벡터는 코스미드, 플라스미드 (예로, 미가공 또는 리포좀 내에 포함된) 및 재조합 폴리뉴클레오티드를 도입한 바이러스 (예로, 렌티바이러스, 레트로바이러스, 아데노바이러스 및 아데노-관련 바이러스)를 포함하여 당해 기술분야에 숙지된 모든 발현 벡터를 포함한다.
용어 SIR의 "폴리펩티드 작용 단위 (FPU)"는 TCR 불변 사슬에 기능적으로 연결된 아미노 말단 신호 서열을 포함한 폴리펩티드를 말한다. 일부 구현예에서, FPU는 신호 서열 및 TCR 불변 사슬 사이에 위치한 항원 결합 도메인을 포함한다. 다른 구현예에서, FPU는 신호 서열 및 TCR 불변 사슬 사이에 위치한 항원 결합 도메인을 결여한다. FPU는 링커와 같은 추가적인 서열을 포함한다. 예로서, FPU는 항원 결합 도메인 및 TCR 불변 사슬 사이에 MYC2-TAG (EQKLISEEDLGSG) 링커를 포함할 수 있다. FPU는 또한 절단가능한 링커 (예로, P2A, F2A), Ser-Gly (SGSG) 링커 및 퓨린 절단 부위 (RAKR)를 포함할 수 있다.
용어 "기능적 부분"은 SIR을 기준으로 사용될 때, SIR의 임의의 부분 또는 단편을 말하고, 이의 부분 또는 단편은 이것이 일부인 SIR (모체 SIR)의 생물학적 활성을 보유한다. 기능적 부분은 예를 들면 모체 SIR과 유사한 정도로, 동일한 정도로 또는 더 높은 정도로, 표적 세포를 인식하거나, 질환을 검출하거나, 치료하거나, 예방하는 능력을 보유하는 SIR의 일부를 포괄한다. 모체 SIR을 기준으로, 기능적 부분은 예를 들면 약 10%, 25%, 30%, 50%, 68%, 80%, 90% 또는 95% 이상의 모체 SIR을 포함할 수 있다.
"유전적으로 변형된 세포", "재유도된 세포", "유전적으로 조작된 세포" 또는 "변형된 세포"는 본원에 사용된 바 합성 면역 수용체 (SIR)를 발현하도록 변형되었던 세포를 말하고, 선택적으로 키메라 항원 수용체를 포함한다. 예를 들면, SIR을 발현하는 유전적으로 변형된 T 림프구는 유전적으로 변형된 세포이다.
용어 "면역 장애"는 면역계의 기능 이상을 특징으로 하는 질환을 말한다. 자가면역 질환은 정상 신체 일부에 대한 비정상 면역 반응으로부터 발생하는 병태이다. 적어도 80개 유형의 자가면역 질환이 존재한다.
"면역 효과기 세포"는 본원에서 해당 용어가 사용된 바, 면역 반응 예로 면역 효과기 반응의 촉진에 관여하는 세포를 말한다. 면역 효과기 세포의 예는 T 세포, 예로 알파/베타 T 세포 및 감마/델타 T 세포, B 세포, 자연 킬러 (NK) 세포, 자연 킬러 T (NKT) 세포, 비만 세포 및 골수-유래된 대식구를 포함한다.
"면역 효과기 기능 또는 면역 효과기 반응"은 본원에서 해당 용어가 사용된 바, 표적 세포의 면역 공격을 증진하거나 촉진하는, 예로 면역 효과기 세포의 기능 또는 반응을 말한다. 예로, 면역 효과기 기능 또는 반응은 표적 세포의 살상 또는 성장 또는 증식의 억제를 촉진하는 T 또는 NK 세포의 성질을 말한다. T 세포의 경우에, 일차 자극 및 보조자극은 면역 효과기 기능 또는 반응의 예이다.
"세포내 신호전달 도메인"은 본원에서 해당 용어가 사용된 바, 분자의 세포내 신호전달 부분을 말한다. 세포내 신호전달 도메인은 TCR 포함 세포의 면역 효과기 기능을 촉진하는 신호를 생성한다. 면역 효과기 기능의 예는 사이토카인의 분비를 포함하여 세포용해 활성 및 헬퍼 활성을 포함한다. TCRα/β/γ/δ 사슬은 이들 자신의 세포내 신호전달 도메인을 갖지 않지만, 신호전달 도메인을 소유한 TCR 신호전달 복합체 (예로, CD3z, CD3e, CD3d 및 CD3g)의 다른 사슬과 연결됨으로써 신호를 전달한다.
또 다른 구현예에서, 세포내 신호전달 도메인은 일차 세포내 신호전달 도메인을 포함할 수 있다. 예시적인 일차 세포내 신호전달 도메인은 일차 자극 또는 항원 의존성 자극을 책임지는 분자로부터 유래된 도메인을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 세포내 신호전달 도메인은 보조자극 세포내 도메인을 포함할 수 있다. 예시적인 보조자극 세포내 신호전달 도메인은 보조자극 신호 또는 항원 비의존성 자극을 책임지는 분자로부터 유래된 도메인을 포함한다. 예를 들면, 일차 세포내 신호전달 도메인은 CD3z의 세포질 서열을 포함할 수 있고, 보조자극 세포내 신호전달 도메인은 CD28 또는 41BB와 같은 보조-수용체 또는 보조자극 분자의 세포질 서열을 포함할 수 있다.
일차 세포내 신호전달 도메인은 면역수용체 타이로신-기반의 활성화 모티브 또는 ITAM으로서 알려져 있는 신호전달 모티브를 포함할 수 있다. ITAM을 포함하는 일차 세포질 신호전달 서열의 예는 이에 제한되는 것은 아니지만, CD3 제타, 공통 FeR 감마 (FCER1G), Fe 감마 RⅡa, FeR 베타 (Fe 엡실론 R1b), CD3 감마, CD3 델타, CD3 엡실론, CD79a, CD79b, DAPlO 및 DAP12를 포함한다.
본원에 사용된 바, 용어 "링커" (또한 "링커 도메인" 또는 "링커 영역")는 본원에 개시된 SIR의 두 개 이상의 도메인 또는 영역을 함께 연결한 올리고 또는 폴리펩티드를 말한다. 링커는 어디에서든 길이가 1 내지 500개의 아미노산일 수 있다. 일부 구현예에서, "링커"는 절단가능 또는 비-절단가능하다. 달리 특정되지 않으면, 본원에 사용된 용어 "링커"는 비-절단가능한 링커를 의미한다. 예시적인 SIR의 생성에 사용될 수 있는 비-절단가능한 링커는 표 6d에 제공된다. 상기 비-절단가능한 링커는 인접한 단백질 도메인의 서로에 대비한 이동의 자유를 허용하는 가요성 잔기로 구성될 수 있다. 이러한 잔기의 비-제한적인 예는 글리신 및 세린을 포함한다. 일부 구현예에서, 링커는 비-가요성 잔기를 포함한다. 비-가요성 잔기를 갖는 링커의 예시적인 구현예는 EAAAK (서열번호 18933), E-코일 (서열번호 18931), K-코일 (서열번호 18932) 또는 PG4SP (18929)이다. CD19를 표적하고 FMC63 항체로부터 유래된 항원 결합 도메인을 포함하는 SIR은, 링커를 포함하지 않는 SIR과 비교하여 항원 결합 도메인 및 TCR 불변 사슬 사이에 비-가요성 링커 (예로, EAAAK (서열번호 18933), E-코일 (서열번호 18931), K-코일 (서열번호 18932) 또는 PG4SP (18929))와 함께 제작될 때 표적 항원에 대한 약 1.5배 이상의 결합 친화도를 보여준다. 따라서, 일부 구현예에서, 비-가요성 링커 (예로, EAAAK (서열번호 18933), E-코일 (서열번호 18931), K-코일 (서열번호 18932) 또는 PG4SP (18929)는 SIR을 제작하기 위한 바람직한 링커를 예시한다. 다른 구현예에서, 이중 사슬 SIR의 항원 결합 도메인 및 TCR 불변 사슬을 연결하는 두 개의 링커는 유사한 길이를 공유한다. 다른 구현예에서, 이중 사슬 SIR의 항원 결합 도메인 및 TCR 불변 사슬을 연결하는 두 개의 링커는 길이가 많아야 20개 아미노산, 전형적으로 많아야 10개 아미노산, 바람직하게는 많아야 5개 아미노산, 더욱 바람직하게 많아야 2개 아미노산으로 상이하다. 일부 구현예에서, 이중 사슬 SIR의 항원 결합 도메인 및 TCR 불변 사슬을 연결하는 두 개의 링커는 동일한 또는 유사한 아미노산 조성을 갖는다. 동일한 조성을 갖는 예시적인 링커는 PG4SP (서열번호 18922) 및 PG4SP-v2 (서열번호 18923)이다. 일부 구현예에서, 이중 사슬 SIR의 항원 결합 도메인 및 TCR 불변 사슬을 연결하는 두 개의 링커 PG4SP (DNA 서열번호 18922; PRT 서열번호 18929) 및 PG4SP-v2 (DNA 서열번호 18923; PRT 서열번호 18929 또는 18930)이다. 일부 구현예에서, 이중 사슬 SIR의 항원 결합 도메인 및 TCR 불변 사슬을 연결하는 두 개의 링커는 EAAAK (서열번호 18926; PRT 서열번호18933 및 18934) 및 EAAAK-v2 (DNA 서열번호 18927)이다. 일부 구현예에서, 이중 사슬 SIR의 항원 결합 도메인 및 TCR 불변 사슬을 연결하는 두 개의 링커는 E-코일 (DNA 서열번호 18924) 및 K-코일 (DNA 서열번호 18925)이다. 일부 구현예에서, 링커는 에피토프 태그를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 에피토프 태그는 MYC 태그, V5 태그, AcV5 태그, 스트렙태그Ⅱ, 플래그 태그 또는 HA의 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 비-절단가능한 링커는 두 개의 인접한 도메인이 입체적으로 서로 방해하지 않도록 보장하기에 충분한 길이이다. 본 발명의 일 구현예에서, 3개의 아미노산 잔기 (Gly-Ser-Gly)가 SIR의 항원 결합 도메인 및 TCR 불변 사슬 사이에 위치하는 링커 (예로, Myc 태그 또는 V5 태그)의 카르복시-말단에 첨가된다. 특정 구현예에서, 링커는 제한효소 부위와 같은 추가적인 서열을 보유할 수 있다. 여러 예시적인 링커의 핵산 서열은 서열번호 701 내지 서열번호 725에 제공되고, 여러 예시적인 링커의 아미노산 서열은 서열번호 2981 내지 서열번호 3003에 제공된다.
용어
"가요성 폴리펩티드 링커"는 본원에 사용된 바, 폴리펩티드 사슬 (예로, 가변 중쇄 및 가변 경쇄 영역)을 함께 연결하는데 단독으로 또는 조합하여 사용되는 글리신 및/또는 세린 잔기와 같은 아미노산으로 구성되는 펩티드 링커를 말한다. 일 구현예에서, 가요성 폴리펩티드 링커는 Gly/Ser 링이고, 아미노산 서열 (Gly-Gly-Gly-Ser)n을 포함하고, 여기서 n은 1 이상의 양의 정수이다. 예를 들면, n=l, n=2, n=3. n=4, n=5, n=6, n=7, n=8, n=9 및 n=l0이다. 일 구현예에서, 가요성 폴리펩티드 링커는 이에 제한되는 것은 아니지만, (Gly4Ser)4 또는 (Gly4Ser)3 (서열번호 2500)을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 링커는 (Gly2Ser), (GlySer) 또는 (Gly3Ser) (서열번호 2501 및 2502)의 다수의 반복서열을 포함한다. 또한, 본원에 참고문헌으로 통합되는 국제특허출원 W02012/138475에 기술된 링커도 본 발명의 범위 내에 포함된다.
절단가능한 링커의 비제한적인 예는 2A 링커 (예를 들면, T2A), 피코나바이러스성 2A-유사 링커, 돼지 테스코바이러스의 CHYSEL 서열 (P2A), 토세아 어시그나 바이러스 (T2A), 2A-유사 링커 또는 이들의 기능적 등가물 및 이들의 조합을 포함한다. 일부 구현예에서, 링커 서열은 2A 글리신 및 2B 프롤린 사이에 절단을 유도하는 모티브 (예로, T2A 서열, 서열번호 3061, C-말단 Gly-Pro 참조)를 포함할 수 있다. 여러 예시적인 절단가능한 링커의 핵산 서열은 서열번호 780 내지 서열번호 785에 제공되고, 여러 예시적인 링커의 아미노산 서열은 서열번호 3060 내지 서열번호 3064에 제공된다. 본원에 사용될 수 있는 다른 절단가능한 링커는 당업자라면 바로 이해된다.
용어 "렌티바이러스"는 레트로비리대 과의 하나의 속을 말한다. 렌티바이러스는 분열하지 않는 세포를 감염할 수 있는 점에서 레트로바이러스 중에서 독특하고, 이들은 상당한 양의 유전 정보를 숙주 세포의 DNA 내로 전달할 수 있어, 유전자 전달 벡터의 가장 효율적인 방법 중 하나가 된다. HIV, SIV 및 FIV은 모두 렌티바이러스의 예이다.
용어 "렌티바이러스성 벡터"는 특히 Milone et al., Mol. Ther. 17(8): 1453-1464 (2009)에 제공된 바와 같은 자가-불활성화 렌티바이러스성 벡터를 포함하는, 렌티바이러스 게놈의 적어도 일부로부터 유래된 벡터를 말한다. 임상에서 사용될 수 있는 렌티바이러스성 벡터의 다른 예는 이에 제한되는 것은 아니지만, 예로 옥스포드 바이오메디카사로부터의 LENTIVECTOR® 유전자 전달 기술학, 렌티겐사로부터의 LENTIMAXTM 벡터 시스템 등을 포함한다. 렌티바이러스성 벡터의 비임상적 유형도 역시 입수가능하고, 당업자에게 잘 숙지되어 있을 것이다. 렌티바이러스성 벡터의 다른 예는 pLENTI-EF1α (서열번호 870) 및 pLENTI-EF1αDWPRE (서열번호 871)이다.
본원에 사용된 바, "포유동물"은 이에 제한되는 것은 아니지만, 인간 및 침팬지 및 다른 유인원 및 원숭이 종과 같은 비인간 영장류; 소, 양, 돼지, 염소 및 말과 같은 가축 동물; 개 및 고양이와 같은 애완 동물; 마우스, 래트 및 기니아피그와 같은 설치류 등을 포함한 실험 동물을 포함하여, 포유류 강의 임의의 구성원을 말한다. 이 용어는 특정한 연령 또는 성별을 구별하지 않는다. 따라서 어른 및 신생 개체, 뿐만 아니라 암컷 또는 수컷에 상관없이 태아가 이 용어의 범위 내에 포함되도록 의도된다.
본원에 사용된 바 "비-자연 발생하는 TCR 항원 결합 도메인"은 키메라이고 자연에 존재하는 TCR과 관련하여 비-자연 발생하는 TCR 불변 영역에 작동가능하게 연결된 결합 도메인을 말한다. 다시 말하면, 비-자연 발생하는 TCR 항원 결합 도메인은 재조합 분자생물학 기법을 사용하여 TCR에 작동가능하게 연결되도록 "조작"되고, 게다가 항원 결합 도메인은 자연에서 발견되는 TCR과는 구별된 분자로부터 획득되거나 유래된다. 자연에서의 TCR과는 구별된 항원 결합 도메인은 항체 vH 및 vL 단편, 인간화 항체 단편, 키메라 항체 단편 및 수용체 리간드 등을 포함한다.
용어 "작동가능하게 연결된"은 각각의 성분이 기능적일 수 있도록 제 1 성분 및 제 2 성분 사이의 기능적 연결 또는 결합을 말한다. 예를 들면, 작동가능하게 연결된은 후자의 발현을 유도하는 조절 서열 및 이종유래 핵산 서열 간의 결합을 포함한다. 예를 들면, 제 1 핵산 서열은 제 1 핵산 서열이 제 2 핵산 서열과 기능적 관계로 배치될 때 제 2 핵산 서열과 작동가능하게 연결된다. 작동가능하게 연결된 두 개의 폴리펩티드의 맥락에서, 제 1 폴리펩티드는 이것이 임의의 연결과 독립적인 방식으로 작용하고, 제 2 폴리펩티드는 둘 사이의 연결이 부재한 것 같이 작용한다.
"동일성 백분율"은 두 개 이상의 핵산 또는 폴리펩티드 서열의 맥락에서, 동일한 두 개 이상의 서열을 말한다. 두 개의 서열은, 다음의 서열 비교 알고리즘 중 하나를 사용하거나 수동 정렬 및 육안 조사에 의해 측정된 바 비교창 또는 지정된 영역에서 최대 상응성을 위해 비교되고 정렬될 때 두 개의 서열이 동일한 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드의 특정된 백분율 (예로, 특정된 영역에 걸쳐 또는 특정되지 않은 때 전체 서열에 걸쳐 60% 동일성, 선택적으로 70%, 71%. 72%. 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%,81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 동일성)을 갖으면 "실질적으로 동일"하다. 선택적으로, 동일성은 길이가 적어도 약 50개 뉴클레오티드 (또는 10개 아미노산)인 영역에 걸쳐, 더욱 바람직하게는 길이가 100 내지 500개 또는 1000개 이상의 뉴클레오티드 (또는 20개, 50개 또는 200개 이상의 아미노산)인 영역에 걸쳐 존재한다.
서열 비교를 위해, 일반적으로 하나의 서열은 기준 서열로서 작용하고, 여기에 테스트 서열이 비교된다. 서열 비교 알고리즘을 사용할 때, 테스트 및 기준 서열이 컴퓨터에 입력되고, 필요한 경우 하위서열 조합이 지정되며, 서열 알고리즘 프로그램 매개변수가 지정된다. 디폴트 프로그램 매개변수가 사용될 수 있거나, 대안의 매개변수가 지정될 수 있다. 다음으로 서열 비교 알고리즘이 컴퓨터 매개변수에 기초하여 기준 서열에 대비한 테스트 서열의 서열 동일성 백분율을 계산한다. 비교를 위한 서열의 정렬 방법은 당해 기술분야에서 잘 알려져 있다. 비교를 위한 최적의 서열 정렬은 예로 Smith and Waterman, (1970) Adv. Appl. Math. 2: 482c의 로칼 상동성 알고리즘에 의해, Needleman and Wunsch, (1970) J. Mol. Bioi. 48: 443의 상동성 정렬 알고리즘에 의해, Pearson and Lipman, (1988) Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85: 2444의 유사성 방법을 위한 탐색에 의해, 이들 알고리즘 (위스콘신 유전학 소프트웨어 패키지에서 GAP, BESTFIT, FASTA, 및 TFASTA, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI)의 컴퓨터화된 실행에 의해, 또는 수동 정렬 및 육안 조사에 의해 (예로, Brent et al., (2003) Current Protocols in Molecular Biology 참조) 시행될 수 있다.
서열 동일성 백분율 및 서열 유사성을 결정하는데 사용될 수 있는 두 개의 알고리즘 예는 BLAST 및 BLAST 2.0 알고리즘이고, 이는 Altschul et al., (1977) Nuc. Acids Res. 25: 3389-3402; 및 Altschul et al., (1990) J. Mol. Bioi. 215: 403-410에 각각 기술되어 있다. BLAST 분석을 수행하기 위한 소프트웨어는 국립 생체기술학 정보 센터 (National Center for Biotechnology Information)를 통하여 공개적으로 입수가능하다.
두 개의 아미노산 서열 간의 동일성 백분율은 또한 PAM120 무게 잔기 표, 갭 길이 페널티 12 및 갭 페널티 4를 사용하여 ALIGN 프로그램 (버전 2.0) 내로 통합되었던 E. Meyers and W. Miller, (1988) Comput. Appl. Biosci. 4: 11-17의 알고리즘을 사용하여 결정될 수 있다. 또한, 두 개의 아미노산 서열 간의 동일성 백분율은 Blossom 62 매트릭스 또는 PAM250 매트릭스 둘 중 하나 및 갭 무게 16, 14, 12, 10, 8, 6 또는 4 및 길이 무게 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6를 사용하는 GCG 소프트웨어 패키지 (www.gcg.com에서 입수가능함)의 GAP 프로그램 내로 통합되었던 Needleman and Wunsch (1970) J. Mol. Bioi. 48: 444-453의 알고리즘을 사용하여 결정될 수 있다.
용어 "폴리뉴클레오티드", "핵산" 또는 "재조합 핵산"은 데옥시리보산 (DNA) 및 적절한 곳에서 리보핵산 (RNA)dhk 같은 뉴클레오티드의 중합체를 말한다.
본원에서 상호교환적으로 사용되는 용어 "단백질" 또는 "폴리펩티드"는 펩티드 결합으로 불리는 화학적 결합에 의해 다함께 연결되는 아미노산으로 불리는 화학적 구성 블록의 하나 이상의 사슬을 포함한다.
용어 "레트로바이러스 벡터"는 레트로바이러스 게놈의 적어도 일부로부터 유래된 벡터를 말한다. 레트로바이러스 벡터의 예는 Addgene 또는 Clontech로부터 입수가능한 MSCVneo, MSCV-pac (또는 MSCV-puro), MSCV-hygro를 포함한다. Addgene 또는 Clontech 벡터의 다른 예는 MSCV-Bgl2-AvrⅡ-Bam-EcoRI-Xho-BstBI-Mlu-Sal-ClaI.I03 (서열번호 872)를 포함한다.
용어 "슬리핑 뷰티 트랜스포존" 또는 "슬리핑 뷰티 트랜스포존 벡터"는 슬리핑 뷰티 트랜스포존 게놈의 적어도 일부로부터 유래된 벡터를 말한다. 슬리핑 뷰티 트랜스포존 벡터의 예는 pSBbi-Pur (서열번호 874)이다. SIR을 인코딩하는 슬리핑 뷰티 트랜스포존 벡터의 다른 예는 서열번호 875 및 서열번호 876에 제공된다.
용어 "scFv"는 경쇄의 가변 영역을 포함하는 적어도 하나의 항체 및 중쇄의 가변 영역을 포함하는 적어도 하나의 항체를 포함하는 융합 단백질을 말하고, 여기서 경쇄 및 중쇄 가변 영역은 합성 링커, 예로 짧은 가요성 폴리펩티드 링커를 통해 연속적으로 연결되고, 단일 사슬 폴리펩티드로서 발현될 수 있으며, scFv는 이것이 유래된 미가공 항체의 특이성을 보유한다. 달리 특정되지 않으면, 본원에 사용된 바 scFv는 어느 순서로도 vL 및 vH 가변 영역을 포함할 수 있고, 예로 폴리펩티드의 N-말단 및 C-말단과 관련하여 scFv는 vL-링커-vH를 포함할 수 있거나, vH-링커-vL를 포함할 수 있다. 본 발명에서, scFv는 또한 vL-Gly-Ser-링커-vH로서 기술된다. 예를 들면, FMC63-vL-Gly-Ser-링커-FMC63-vH는 Gly 및 Ser 잔기로 구성된 링커를 통해 연결된 FMC63 단일클론 항체의 vL 및 vH 단편을 포함하는 scFv를 말한다. 예시적인 Gly-Ser 링커의 아미노산 서열은 서열번호 2500에 제공된다. 대안적으로, scFv는 (vL+vH)로서도 역시 기술된다. 예를 들면, FMC6-(vL+vH)는 vL 단편이 N-말단에 위치하는 링커를 통해 연결된 FMC63 단일클론 항체의 vL 및 vH 단편을 포함하는 scFv를 말한다.
용어 "신호전달 도메인"은 세포 내의 정보를 전달하여, 제 2 메신저를 생성하거나 이러한 메신저에 대한 반응에 의해 효과기로서 작용함으로써 정의된 신호전달 경로를 통해 세포 활성을 조절하는 단백질의 기능적 영역을 말한다.
용어 "합성 면역 수용체" 또는 대안적으로 "SIR"은 폴리펩티드의 집합, 전형적으로 일부 구현예에서 두 개의 폴리펩티드를 말하고, 이는 효과기 세포에서 발현될 때 표적 세포, 전형적으로 암 세포에 대한 특이성을 세포내 신호 생성과 함께 갖는 세포를 제공한다. 전형적인 구현예에서, SIR은 본원에 기술된 바와 같은 항원에 결합하고, 하나 이상의 T 세포 수용체 불변 사슬 또는 영역에 조건부 링커를 통해 연결된 하나 이상의 항원 결합 도메인 (예로, 항체 또는 항체 단편, 리간드 또는 수용체)을 포함한다. 일부 구현예에서, 폴리펩티드 집합은 서로 연속적이다. 일부 구현예에서, SIR은 두 개 이상의 폴리펩티드의 두 개 이상의 집합을 포함한다. SIR의 각각의 집합의 폴리펩티드는 서로 연속적이지만 (폴리펩티드 작용 단위 1), 다른 집합의 폴리펩티드는 서로 연속적이지 않다 (폴리펩티드 작용 단위 2). 일부 관점에서, SIR의 T 세포 수용체 불변 사슬 (또는 영역)은 인간 T 세포 수용체-알파 (TCR-알파 또는 TCRα 또는 TCRa 또는 hTCR-알파 또는 hTCRα 또는 hTCRa 또는 Cα), 인간 T 세포 수용체-베타1 (TCR-베타1 또는 TCRβ1 또는 TCRb1 또는 hTCR-베타1 또는 hTCRβ1 또는 hTCRb1 또는 Cβ1), 인간 T 세포 수용체-베타 2 (TCR-베타, TCRβ 또는 TCRb 또는 Cβ라고도 지칭되는 TCR-베타2 또는 TCRβ2 또는 TCRb2 또는 hTCR-베타2 또는 hTCRβ2 또는 hTCRb2 또는 Cβ2), 인간 pre-T 세포 수용체 알파 (preTCR-알파 또는 preTCRα 또는 preTCRa 또는 preCα), 인간 T 세포 수용체-감마 (TCR-감마 또는 TCRγ 또는 TCRg 또는 또는 hTCR-감마 또는 hTCRγ 또는 hTCRg 또는 hTCRγ1 또는 hTCR감마1, 또는 Cγ), 또는 인간 T 세포 수용체-델타 (TCR-델타 또는 TCRd 또는 TCRδ 또는 hTCR-델타 또는 hTCRd 또는 hTCRδ 또는 Cδ)의 불변 사슬으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, SIR의 TCR 불변 사슬은 이들의 야생형 뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩되는 한편, 다른 관점에서 SIR의 TCR 불변 사슬은 야생형이 아닌 뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩된다. 일부 구현예에서, SIR의 TCR 불변 사슬은 이들의 코돈-최적화된 서열에 의해 인코딩된다. 일부 구현예에서, SIR의 TCR 불변 사슬은 야생형 폴리펩티드 서열을 인코딩하는 한편, 다른 구현예에서 SIR의 TCR 불변 사슬은 하나 이상의 돌연변이를 보유한 폴리펩티드를 인코딩한다. 일부 구현예에서, SIR의 TCR 불변 사슬은 하나 이상의 돌연변이를 보유한 이들의 코돈-최적화된 서열에 의해 인코딩된다. 본원에 기술된 것과 같은 특이적 종양 마커 X"를 표적하는 항원 결합 도메인 (예로, scFv 또는 vHH)을 포함하는 SIR은 또한 X-SIR 또는 XSIR이라고도 지칭된다. 예를 들면, CD19 표적하는 항원 결합 도메인은 CD19-SIR 또는 CD19SIR라고 지칭된다. SIR의 TCR 불변 사슬/도메인은 SIR이 궁극적으로 사용될 동일한 종으로부터 유래된다. 예를 들면, 인간에서 사용되기 위해, SIR의 TCR 불변 사슬은 인간 TCR 불변 사슬로부터 유래되거나 이를 포함하는 것이 유익할 수 있다. 그러나, 일부 경우에, TCR 불변 사슬은 SIR이 궁극적으로 사용될 동일한 종으로부터 유래되지만 TCR 불변 사슬의 발현을 증진하는 아미노산 치환을 보유하도록 변형되는 것이 유익하다. 예를 들면, 인간에서 사용되기 위해, SIR의 TCR 불변 사슬은 인간 TCR 불변 사슬로부터 유래되거나 이를 포함하지만, 여기서 특정 아미노산이 마우스 TCR 불변 사슬로부터의 상응하는 아미노산으로 치환되는 것이 유익할 수 있다. 이러한 마우스화된 TCR 불변 사슬은 SIR의 발현 증가를 제공한다. 예시적인 마우스화된 TCR 불변 사슬의 아미노산 서열은 서열번호 3017, 서열번호 3033 내지 3039에 제공된다 (또한 표 1 내지 표 3 참조). SIR 또는 이의 기능적 부분은 아미노 또는 카르복시 말단에 또는 둘 다의 말단에서 추가적인 아미노산을 포함할 수 있고, 여기서 추가적인 아미노산은 SIR을 구성하는 TCR 또는 항원 결합 도메인의 아미노산 서열에서는 발견되지 않는다. 바람직하게, 추가적인 아미노산은 SIR 또는 이의 기능적 부분의 생물학적 기능을 방해하지 않고, 예로 표적 세포를 인식하거나, 암을 검출하거나, 암 등을 치료하거나 예방한다. 더욱 바람직하게, 추가적인 아미노산은 모체 SIR의 생물학적 활성과 비교하여, 생물학적 활성을 증진시킨다.
용어 "자극"은 자극 분자 (예로, TCR/CD3 복합체 또는 SIR)의 이의 동족체 리간드 (또는 SIR의 경우 표적 항원)와의 결합에 의해 유도되고, 이로써 이에 제한되는 것은 아니지만, TCR/CD3를 통한 신호 전달과 같은 신호 전달 과정을 매개하는 일차 반응을 말한다. 자극은 특정 분자의 변경된 발현을 매개할 수 있다.
용어 "자극 분자"는 면역 세포 신호전달 경로의 적어도 일부 관점의 경우 자극 방식으로 면역 세포의 활성화를 조절하는 세포질 신호전달 서열을 제공하는 면역 세포 (예로, T 세포, NK 세포, B 세포)에 발현된 분자를 말한다. 일 관점에서, 신호는 예를 들면 TCR/CD3 복합체의 펩티드로 로딩된 MHC 분자와의 결합에 의해 개시된 일차 신호이고, 이는 이에 제한되는 것은 아니지만 증식, 활성화 및 분화 등을 포함한 T 세포 반응의 매개를 유도한다. 자극 방식으로 작용하는 일차 세포질 신호전달 서열 ("일차 신호전달 도메인"이라고도 지칭됨)은 면역수용체 타이로신-기반의 활성화 모티브 또는 ITAM으로서 알려진 신호전달 모티브를 포함할 수 있다. 세포질 신호전달 서열을 포함한 ITAM의 예는 이에 제한되는 것은 아니지만 CD3 제타, 공통 FeR 감마 (FCERIG), Fe 감마 RⅡa, FeR 베타 (Fe 엡실론 Rib), CD3 감마, CD3 델타, CD3 엡실론, CD79a, CD79b, DAPIO 및 DAP12로부터 유래한 것을 포함한다.
용어 "피험자"는 면역 반응이 유도될 수 있는 살아있는 유기체 (예로, 임의의 애완 포유동물 또는 인간)을 포함하도록 의도된다.
용어 "T 세포" 및 "T 림프구"는 본원에서 상호교환적이고, 동의어로 사용된다. 예로는 이에 제한되는 것은 아니지만 미감작 T 세포 ("림프구 전구체"), 중앙 메모리 T 세포, 효과기 메모리 T 세포, 줄기 메모리 T 세포 (Tscm), iPSC-유래된 T 세포, 합성 T 세포 또는 이들의 조합을 포함한다.
용어 "치료적 효과"는 이에 제한되는 것은 아니지만, 예로 종양 부피의 감소, 암 세포의 수의 감소, 전이의 수의 감소, 기대 수명의 증가, 암 세포 증식의 감소, 암 세포 생존의 감소, 감염성 제제의 역가의 감소, 감염성 제제의 콜로니 계수의 감소, 질환 병태와 연관된 다양한 생리학적 증상의 개선을 포함하는 다양한 수단에 의해 나타날 수 있는 생물학적 효과를 말한다. "치료적 효과"는 또한 우선 감염의 발생의 예방에서 또는 질환의 재발의 예방에서 펩티드, 폴리뉴클레오티드, 세포 및 항체의 능력에 의해 나타날 수 있다.
용어 "전달 벡터"는 단리된 핵산을 세포의 내부에 전달하는데 사용될 수 있는 단리된 핵산을 포함하는 물질의 조성물을 말한다. 다수의 벡터가 이에 제한되는 것은 아니지만, 선형의 폴리뉴클레오티드, 이온성 또는 양극성 화합물과 연관된 폴리뉴클레오티드, 플라스미드 및 바이러스를 포함하여 당해 기술분야에서 알려져 있다. 용어는 또한 예를 들면 폴리라이신 화합물 및 리포좀 등과 같은 핵산의 세포 내로의 전달을 용이하게 하는 비-플라스미드 및 비-바이러스성 화합물을 추가로 포함하도록 고려되어야 한다. 바이러스성 전달 벡터의 예는 이에 제한되는 것은 아니지만, 아데노바이러스성 벡터, 아데노-관련 바이러스 벡터, 레트로바이러스성 벡터 및 렌티바이러스성 벡터 등을 포함한다.
본원에 사용된 바, "치료" 및 "치료하는"은 치료적 처치 및 예방적 (prophylactic) 또는 예방적 척도 둘 다를 말하고, 여기서 목적은 표적화된 병리학적 병태를 예방하거나 지연 (감축)하거나, 병리학적 병태를 예방하거나, 유익한 결과를 추구하거나 획득하거나, 치료가 궁극적으로 성공하지 못하더라도 병태를 발생시킬 개인의 기회를 낮추는 것이다. 치료가 필요한 개인은 병태를 이미 가진 개인뿐만 라니라 병태를 가질 가능성이 있는 개인 또는 병태가 예방될 개인을 포함한다.
본원에 사용된 바 "종양"은 악성 또는 양성 상관 없이 모든 신생물 세포 성장 및 증식 그리고 모든 전암성 및 암성 세포 및 조직을 말한다.
용어 "제타" 또는 대안적으로 "제타 사슬", "CD3-제타" 또는 "TCR-제타"는 진뱅크 기탁번호 BAG36664.1로서 제공된 단백질 또는 비-인간 종, 예로 마우스, 설치류, 원숭이 및 유인원 등으로부터의 동등한 잔기로서 정의되고, "제타 자극 도메인" 또는 대안적으로 "CD3-제타 자극 도메인" 또는 "TCR-제타 자극 도메인"은 T 세포 활성화에 필요한 초기 신호를 기능적으로 전달하기에 충분한, 제타 사슬의 세포질 도메인으로부터의 아미노산 잔기 또는 이들의 기능적 유도체로서 정의된다. 일 관점에서, 제타의 세포질 도메인은 이의 기능적 오르토로그인 진뱅크 기탁번호 BAG36664.1의 잔기 52 내지 164 또는 비-인간 종 예로 마우스, 설치류, 원숭이 및 유인원 등으로부터의 동등한 잔기를 포함하고, "제타 자극 도메인" 또는 대안적으로 "CD3-제타 자극 도메인" 또는 "TCR-제타 자극 도메인"은 T 세포 활성화에 필요한 초기 신호를 기능적으로 전달하기에 충분한, 제타 사슬의 세포질 도메인으로부터 아미노산 잔기 또는 이들의 기능적 유도체로서 정의된다. 일 관점에서, "제타 자극 도메인" 또는 "CD3-제타 자극 도메인"은 서열번호 18로서 제공된 서열이다. 일 관점에서, "제타 자극 도메인" 또는 "CD3-제타 자극 도메인"은 서열번호 20으로서 제공된 서열이다.
본원에 상기 및 다른 곳에 기술된 바와 같이, 본 발명의 SIR의 각각의 사슬은 일반 구조: 신호 펩티드-(결합 도메인)-(조건부 링커)-(T 세포 수용체 불변 영역)-(조건부 부속 분자)를 갖는다. SIR의 T 세포 수용체 불변 영역은 T 세포 수용체 불변 사슬 및 조건부 보조자극 도메인을 갖는 CD3 신호전달 사슬 사이의 융합을 포함할 수 있다. 예시적인 TCRβ 불변 사슬 및 CD3z 융합 단백질은 서열번호 12401 내지 12407에 제공되어 있다. 예시적인 TCRβ 불변 사슬 및 조건부 보조자극 도메인을 갖는 CD3z 융합 단백질은 서열번호 12408 내지 12409에 제공되어 있다. 예시적인 TCRα 불변 사슬 및 CD3z 융합 단백질은 서열번호 12422 내지 12426에 제공되어 있다. . 예시적인 TCRα 불변 사슬 및 조건부 보조자극 도메인을 갖는 CD3z 융합 단백질은 서열번호 12427 내지 12428에 제공되어 있다. 다음은 본 발명의 SIR의 각각의 "도메인" 또는 "분절"을 기술한다. 당업자라면 다양한 TCR이 상이한 결합 도메인 등과 셔플링되고 조합될 수 있음을 인식할 것이다.
본 발명은 본 발명의 SIR을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열, SIR 폴리펩티드, 발현 구조물, 본 발명의 SIR 또는 구조물을 포함하는 재조합으로 조작된 세포, 뿐만 아니라 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드 및 세포를 제조하고 사용하는 방법을 제공한다.
본 발명은 합성 면역 수용체 (SIR)을 인코딩하는 단리된 핵산 분자를 제공하고, 여기서 SIR은 본원에 기술된 바와 같은 항원에 결합하고, 하나 이상의 T 세포 수용체 불변 사슬에 연결되는 하나 이상의 항원 결합 도메인 (예로, 항체 또는 항체 단편, 자가항원, 리간드 또는 수용체)를 포함한다.
일부 구현예에서, SIR은 단일 T 세포 수용체 불변 사슬에 연결된 단일 항원 결합 도메인을 포함하거나 이로 구성될 수 있다. 일부 구현예에서, SIR은 링커를 통해 연결되고 다시 단일 T 세포 수용체 불변 사슬 (예로, 서열번호 1169, 서열번호 1182, 서열번호 10497 내지 10508, 10524 내지 10538)로 연결되는 하나 이상의 항원 결합 도메인 (예로, vL 및 vH 단편 또는 두 개의 vHH 단편)을 포함하거나 이로 구성될 수 있다. 또 다른 구현예에서, SIR은 별도의 T 세포 수용체 불변 사슬 (예로, 서열번호 1200)에 프레임에 맞추어 각각 연결된 두 개의 항원 결합 도메인을 포함하거나 이로 구성된다. 예를 들면, 항원 결합 도메인 1은 TCRα (Cα)의 불변 사슬에 결합되어 작용 단위 1을 구성하고, 항원 결합 도메인 2는 TCRβ (Cβ)의 불변 사슬에 결합되어 작용 단위 2를 구성한다. 이러한 SIR의 두 개의 작용 단위는 기능적으로 활성을 갖도록 동일한 세포에서 공동발현된다. 일부 구현예에서, SIR의 두 개의 작용 단위는 단일 벡터를 사용하여 공동발현되는 한편, 다른 구현예에서 두 개의 작용 단위는 상이한 벡터를 사용하여 동일한 세포에서 공동발현된다. 일부 구현예에서, SIR의 두 개의 작용 단위는 둘 다의 작용 단위를 인코딩하는 단일 mRNA의 형질감염에 의해 공동발현되는 한편, 다른 구현예에서 두 개의 작용 단위는 각각 하나의 작용 단위를 인코딩하는 두 개의 상이한 mRNA의 형질감염에 의해 공동발현된다.
또한 또 다른 구현예에서, SIR은 하나의 T 세포 수용체 불변 사슬에 연결되지만 제 2 T 세포 수용체 불변 사슬 (예로, 서열번호 1620)과 함께 공동발현되는 항원 결합 도메인 (작용 단위 1)을 포함하거나 이로 구성된다. 이러한 SIR에서 제 2 T 세포 수용체 불변 사슬의 목적은 작용 단위 1 (예로, T 세포 수용체 불변 사슬에 연결된 항원 결합 도메인 1)의 세포 표면 발현을 용이하게 하는 것이다. 이와 같이, 제 2 T 세포 수용체 불변 사슬은 자체로 발현되거나, 에피토프 태크 (예로, MYC, V5, AcV5, G4Sx2, 스트렙태그Ⅱ 등)을 보유한 융합 단백질로서 발현되거나, 작용 단위 1의 조립 및 기능을 방해하지 않는 임의의 부적절한 단백질 단편 (예로, vL 또는 vH 단편)을 보유한 융합 단백질로서 발현될 수 있다. 예로서, SIR은 항원 결합 도메인 1 및 T 세포 수용체 베타 (TCRβ)의 빈 (예로, 항원 결합 도메인이 결여된) Cβ (예로, 서열번호 1620)을 포함할 수 있다. 이러한 SIR의 두 개의 작용 단위는 기능적으로 활성을 갖도록 동일한 세포에서 공동발현된다. 일부 구현예에서, SIR의 두 개의 작용 단위는 단일 벡터를 사용하여 공동발현되는 한편, 다른 구현예에서 두 개의 작용 단위는 상이한 벡터를 사용하여 동일한 세포에서 공동발현된다. 일부 구현예에서, SIR의 두 개의 작용 단위는 둘 다의 작용 단위를 인코딩하는 단일 mRNA의 형질감염에 의해 공동발현되는 한편, 다른 구현예에서 두 개의 작용 단위는 각각 하나의 작용 단위를 인코딩하는 두 개의 상이한 mRNA의 형질감염에 의해 공동발현된다.
본원에 기술된 SIR은 단일 폴리뉴클레오티드 사슬에 의해 인코딩되고, 단일 폴리펩티드 사슬로 번역될 수 있고, 이는 후속적으로 상이한 단백질로 절단된다. SIR을 인코딩하는 핵산은 하나 이상의 리더 서열 (신호 펩티드라고도 알려짐)을 포함할 수 있다. 일 구현예에서, SIR의 작용 단위 (예로, T 세포 수용체 불변 사슬 플러스 퓨린-SGSG-절단가능한 링커에 연결된 항원 결합 도메인 또는 T 세포 수용체 불변 사슬 플러스 퓨린-SGSG-절단가능한 링커)는 SIR을 제 I형 막통과 단백질로서 세포 표면으로 안내하는 리더 서열이 선행할 수 있다. 일 구현예에서, SIR의 항원 결합 도메인은 세포외로 대면한다. 일부 구현예에서, 리더 서열은 임의의 서열번호 1 내지 9의 핵산 서열 및 서열번호 2300 내지 서열번호 2302의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 제한효소 부위를 포함한 짧은 핵산 서열 (3 내지 9개 핵산)은 SIR의 상이한 하위단위 사이에, 예로 SIR의 신호 서열 및 항원 결합 도메인 사이에 또는 항원 결합 및 TCR 사슬 사이에 위치한다.
합성 면역 수용체 (SIR)는 상이한 TCR 불변 사슬로 생성될 수 있다. TCR 불변 사슬은 이들의 야생형 서열, 비-야생형 서열 또는 코돈 최적화된 서열에 의해 인코딩될 수 있다. 또한, TCR 불변 사슬은 특이적 돌연변이를 보유하여 (예로, 표 2 또는 3에 제시된 하나 이상의 돌연변이를 갖는 TCRβ 불변 사슬 및 표 1의 하나 이상의 돌연변이를 갖는 TCRα 불변 사슬) 이들의 세포 표면 발현 및/또는 서로의 쌍 형성을 증진하고, 내인성 TCR 사슬과의 쌍 형성을 감소시킨다. SIR의 TCR 도메인에서 돌연변이는 표적 또는 세포에 대한 결합 친화도 및/또는 발현을 각각 변형시킨다. 예를 들면, 본 발명은 쌍 형성 또는 발현을 촉진하는 핵산 서열 코돈 최적화 및/또는 TCR 사슬의 돌연변이 및/또는 결합 도메인 및 TCR 도메인 사이의 링커 사용에 기초하여 설계되고 스크리닝될 수 있는 특정한 항원 표적에 대한 다양한 SIR 집단을 고려한다. 일부 구현예에서, 풀로부터 SIR을 발현하는 면역 효과기 세포는 항원 결합 친화도, 세포 표면 발현, 세포 신호전달, NFAT 리포터 활성, 세포독성, 사이토카인 분비, 증식, 생체내 지속성, 소모 마커의 발현 및 생체내 활성의 군으로부터 선택된 하나 이상으로 특징에서, 유사한 조건 하에서 검정될 때 동일한 결합 도메인 (예로, 테스트 SIR에 존재하는 동일한 scFv로부터 유래된 결합 도메인)을 포함한 풀로부터의 또 다른 SIR을 발현하는 비슷한 면역 효과기 세포와 비교하여 2배 이상, 5배 이상, 10배 이상 및 심지어 100배 이상의 차이를 보여준다. 본 발명은 X가 항원 결합 도메인 표적인 X-SIR 분자의 라이브러리를 고려하여, 라이브러리 또는 "풀"이 다양한 결합 친화도, 발현 수준 및 기능적 특징 (예로, 세포독성, 사이토카인 생산 및 장기간의 유지)을 갖는 SIR을 제공한다. 일부 구현예에서, 풀의 SIR는 항원 결합 친화도, 세포 표면 발현, 세포독성, 사이토카인 분비, T 세포 증식, T 세포 지속성, T 세포 소모 및 생체내 활성의 군으로부터 선택된 하나 이상으로 특징에서, 유사한 조건 하에서 검정될 때 동일한 결합 도메인 (예로, 테스트 SIR에 존재하는 동일한 scFv로부터 유래된 결합 도메인)을 포함한 풀의 또 다른 SIR과 비교하여 면역 효과기 세포에서 발현될 때 2배 이상, 바람직하게 5배 이상, 훨씬 더 바람직하게 10배 이상, 훨씬 더 바람직하게는 100배 이상의 차이를 보여준다. 풀에서의 상이한 SIR은 상이한 DNA 바코드로 태그되어 신세대 시퀀싱 또는 당해 기술분야에 숙지된 다른 기법에 의한 이들의 식별을 허용할 수 있다. 예시적인 바코드는 서열번호 864 내지 869로 제시된다. 바코드는 SIR을 인코딩하는 벡터 내의 편리한 위치에 삽입될 수 있어 SIR의 발현을 방해하지 않는다. 예시적인 구현예에서, 바코드는 SIR의 종결 코돈의 바로 하류에 삽입된다. 당업자는 이러한 풀을 검색하여 원하는 결합 친화도, 발현 수준 또는 기능적 특징을 갖는 X-SIR을 본원에 기술된 임의의 하나 이상의 검정법을 사용하여 식별할 수 있다. 상이한 SIR 또는 상이한 SIR 풀은 상이한 질환 및 질환 병태에 적합할 수 있고, 조합되어 다양한 다중클론 면역 반응을 생성할 수 있다. 따라서, 표적에 대한 더 높은 친화도를 갖는 SIR을 발현하는 T 세포는 단기간에 종양 세포를 살상하는데 더욱 효과적일 수 있지만 신속하게 소모되고/거나 생체내에서 단기간의 유지를 갖을 수 있다. 이러한 높은 친화도 SIR을 발현하는 T 세포는 단기간에 종양 세포를 살상하는데 효과적이지 않을 수 있지만 신속하게 소모되지 않고/거나 생체내에서 더 지속될 수 있는 낮은 친화도 SIR을 발현하는 T 세포와 조합될 수 있다. 본 발명의 SIR은 SIR의 상이한 풀을 포함하여 CAR-T 세포와 같은 다른 유전적으로 조작된 T 세포와도 역시 조합되어 다양한 면역 반응을 생성할 수 있다. 이에 따라, 본 발명은 X-SIR의 라이브러리를 제공한다.
상기 및 본원에 기술된 바와 같이, SIR은 하나 이상의 T 세포 수용체 (TCR) 불변 사슬 영역에 작동가능하게 연결된 하나 이상의 항원 결합 도메인을 포함한다. 본 발명의 SIR은 인간 베타 1 사슬 불변 영역 (Cβ1) 또는 인간 베타 2 사슬 불변 영역 (Cβ2)을 포함할 수 있다. 일 구현예에서, SIR의 인간 불변 베타 영역 (1 또는 2)는 18번 위치에서 염기성 아미노산을 포함한다. 이러한 염기성 아미노산은 아르기닌 (R) 및 라이신 (K)으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 용어 "위치 18번"은 서열번호 3025 (Cβ2의 경우) 또는 서열번호 3024 (Cβ1의 경우)의 서열에서 18번째 아미노산을 말한다. 위치 18번에서 이러한 돌연변이 이외에도, SIR의 Cβ1 또는 Cβ2는 SIR의 생물학적 기능이 그대로 유지되는 한 추가의 돌연변이를 포함할 수 있다. 생물학적 활성은 이것이 일치하지는 않더라도 (예로, 더 양호 또는 더 나쁨) 여전히 유사하게 수행하면 그대로인 것이다. 용어 "SIR의 기능"은 주어진 항원에 특이적으로 예로 특정한 특이도로 결합하고/거나, 활성화, 증식, 사이토카인 분비 및/또는 세포독성과 같은 T 세포 기능의 활성화를 유도하는 세포 신호전달을 활성화함으로써 이에 반응하는 SIR의 능력을 말하도록 의미한다.
일 구현예에서, SIR은 위치 18번에 염기성 아미노산을 갖는 것에 추가하여 Cβ1 또는 Cβ2 사슬에서 적어도 하나의 추가적인 돌연변이를 포함한다. 이러한 돌연변이는 위치 22번에서 알라닌 (A), 위치 133번에서 이소류신 (I), 위치 136번에서 알라닌 (A) 및 위치 139번에서 히스티딘 (H)으로 이루어진 군으로부터 선택되고, 여기서 언급된 위치는 서열번호 3025 (Cβ2의 경우) 또는 서열번호 3024 (Cβ1의 경우)의 서열에서의 위치이다. 또 다른 구현예에서, SIR은 Cβ1 또는 Cβ2 사슬의 위치 18번에서 염기성 아미노산 및 위치 22번에서 알라닌 (A), 위치 133번에서 이소류신 (I), 위치 136번에서 알라닌 (A) 및 위치 139번에서 히스티딘 (H)으로 이루어진 군으로부터의 두 개 이상의 추가적인 돌연변이를 포함하고, 여기서 언급된 위치는 서열번호 3025 (Cβ2의 경우) 또는 서열번호 3024 (Cβ1의 경우)의 서열에서의 위치이다.
본 발명은 α 및 β 사슬의 불변 영역에 추가적인 시스테인을 포함하는 SIR이 서로 선호적인 쌍 형성을 촉진하고, 도입된 SIR의 총 표면 발현을 증가시키고, 표적 항원에 대한 결합 친화도를 개선하고, 기능성을 개선할 수 있는 점을 보여준다. 예를 들면, Cα에서의 48 Cys (T48C) 돌연변이 및 Cβ 또는 Cβ2에서의 Ser-57-Cys (S57C) 돌연변이는 내인성 TCR 사슬과의 미스페어링을 감소시키고, 기능성을 증진하는 두 개 사슬 간의 추가적인 디설파이드 결합을 갖는다. 다른 디설파이드 결합 위치 (또는 이들의 조합)은 다음과 같다: Cα-T48C 및 Cβ1 또는 Cβ2-S57C, Cα-S15C 및 Cβ1 또는 Cβ2-E15C, Cα-T45C 및 Cβ1 또는 Cβ2-D59C, Cα-T45C 및 Cβ1 또는 Cβ2-S77C, Cα-Y10C 및 Cβ1 또는 Cβ2-S17C.
도입된 TCRα 및 TCRβ 사슬의 내인성 TCR 사슬과의 원치않은 쌍 형성의 문제점을 극복하는 또 다른 접근법은 "놉인투홀" 또는 "홀인투놉" 입체 구조의 사용 및 정전기적 환경을 포함한다. 본 발명은 Cα에서의 Ser 61 Arg (S61R) 돌연변이 및 Cβ1 또는 Cβ2 사슬에서의 Arg 79 Gly (R79G) 돌연변이를 갖는 SIR이 내인성 TCR 사슬과의 미스페어링 감소 및 증가된 기능성도 역시 유도하는 점을 입증한다. 증가된 표면 발현 및 기능성을 갖는 SIR을 샹성하도록 N-글리코실화 부위의 제거와 같은 도입된 TCR 사슬의 발현을 증진하는 다른 접근법이 또한 본 발명의 방법에 사용될 수 있다.
SIR의 도입된 TCRα 및 TCRβ 사슬의 내인성 TCR 사슬과의 원치않은 쌍 형성의 문제점을 극복하는 또 다른 접근법은 내인성 TCRα 및/또는 TCRβ 사슬의 발현을 녹아웃시키는 유전적 표적화의 사용을 포함한다. 내인성 TCRα 및/또는 TCRβ 사슬의 녹아웃은 CRISP/Cas9 및 Zn 핑커 핵산 분해효소의 사용과 같은 당해 기술분야에서 숙지된 다수의 기법을 사용하여 달성될 수 있다. 서열번호 897 및 898은 TCRα 및 TCRβ 좌위를 표적하는 gRNA의 서열을 제공한다. 이들 gRNA는 T 세포 또는 iPSC 또는 줄기 세포 내로 Cas9 mRNA와 함께 도입되어 내인성 TCRα 및 TCRβ 사슬의 발현을 녹아웃시킬 수 있다. 이러한 TCRα/β 녹아웃된 세포는 본 발명의 SIR을 도입하는데 사용될 수 있다. 대안의 구현예에서, 동일한 접근법은 표 7A에 열거된 본 발명의 cTCR을 포함하여 cTCR의 발현 및 사슬 쌍 형성을 증증하는데 사용될 수 있다. 내인성 TCR 사슬의 발현이 감소되거나 제거된 T 세포에서 발현될 때, cTCR은 SIR의 일부 기능적 성질을 획득한다. 본 발명의 대안의 구현예에서, SIR 또는 cTCR은 T 세포 또는 iPSC 또는 줄기 세포에 먼저 도입될 수 있고, 이후 TCRα 및 TCRβ 사슬의 녹아웃이 이어진다. 필수적으로 유사한 접근법은 SIR 또는 cTCR를 TCRγδ 세포에서 발현하는 것이 바람직한 경우에 내인성 TCRγ 및/또는 TCRδ 사슬의 발현을 감소시키거나 제거하는데 사용될 수 있다. 표 1 내지 표 3은 Cα, Cβ1 및 Cβ2 폴리펩티드 사슬에서 적합한 치환의 비제한적인 예를 제공한다. 예를 들면, 동등한 아미노산이 동일한 "돌연변이" 위치에서 사용될 수 있다 (예로, 보존적인 치환).
도입된 SIR 사슬의 발현 증가 및 내인성 TCR 사슬과의 미스페어링 감소를 유도하는 TCRα, TCRβ1, 및 TCRβ2의 불변 영역에서 추가적인 돌연변이가 본 발명의 SIR의 설계에 도입될 수 있다. 또한, 마우스 TCR이 인간 TCR과 비교하여 더 양호하게 발현되는 점은 문헌으로 알려져 있다. 본 발명은 마우스화된 인간 TCRα 및 β 사슬을 포함한 SIR (예로, 인간 TCRα 및 β 불변 영역의 특정 아미노산 잔기가 마우스 TCRα 및 β 사슬의 상응하는 아미노산으로 대체됨)이 인간 TCRα 및 β 불변 사슬의 야생형 아미노산 서열을 포함하는 SIR과 비교하여 더 양호하게 발현되는 것을 보여준다. 인간 TCRα 및 TCRβ 사슬의 추가적인 돌연변이는 마우스 TCRα 
및 TCRβ 사슬의 서열에 기초하여 유사하게 생성될 수 있다. 이러한 마우스화된 TCRα 및 TCRβ 사슬을 포함하는 SIR은 SIR의 발현 증가 및/또는 기능적 활성을 유도하는 변이체를 식별하도록 본원에 기술된 검정법 (예로, NLuc 결합 검정법, 사이토카인 분비, 세포 살상, Jurkat NFAT-GFP 검정법 등을 사용한 표적 항원에 대한 결합)으로 쉽게 테스트될 수 있다.
본 발명의 SIR을 인코딩하는 핵산은 하나 이상의 T 세포 수용체 불변 사슬 또는 영역을 인코딩한다. SIR을 제조하는데 사용될 수 있는 예시적인 T 세포 수용체 불변 사슬 또는 영역의 핵산 서열은 서열번호 730 내지 775, 10427 내지 10452 및 10464 내지 10471에 제공되어 있다. 상응하는 아미노산 서열은 서열번호 3010 내지 3055, 12384 내지 12409 및 12421 내지 12428에 제공되어 있다 (표 4). 일부 구현예에서, 인코딩된 SIR의 T 세포 수용체 불변 사슬을 인코딩하는 핵산 서열은 인간 T 세포 수용체-알파 (TCR-알파 또는 TCRα 또는 TCRa 또는 Cα; 서열번호 730 및 731), 인간 T 세포 수용체-베타1 (TCR-베타1 또는 TCRβ1 또는 TCRb1 또는 Cβ1; 서열번호 744), 인간 T 세포 수용체-베타 2 (TCR-베타, TCRβ 또는 TCRb 또는 Cβ라고도 지칭되는 TCR-베타2 또는 TCRβ2 또는 TCRb2 또는 Cβ2; 서열번호 745 및 746), 인간 pre-T 세포 수용체 알파 (preTCR-알파 또는 preTCRα 또는 preTCRa 또는 preCα), 인간 T 세포 수용체-감마 (TCR-감마 또는 TCRγ 또는 TCRg 또는 Cγ; 서열번호 769) 또는 인간 T 세포 수용체-델타 (TCR-델타 또는 TCRd 또는 TCRδ 또는 Cδ)의 불변 사슬의 야생형 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 인코딩된 SIR 분자의 T 세포 수용체 불변 사슬을 인코딩하는 핵산 서열은 인간 T 세포 수용체-알파 (TCR-알파 또는 TCRα 또는 TCRa 또는 Cα), 인간 T 세포 수용체-베타1 (TCR-베타1 또는 TCRβ1 또는 TCRb1 또는 Cβ1), 인간 T 세포 수용체-베타 2 (TCR-베타, TCRβ 또는 TCRb 또는 Cβ라고도 지칭되는 TCR-베타2 또는 TCRβ2 또는 TCRb2 또는 Cβ2), 인간 pre-T 세포 수용체 알파 (preTCR-알파 또는 preTCRα 또는 preTCRa 또는 preCα), 인간 T 세포 수용체-감마 (TCR-감마 또는 TCRγ 또는 TCRg 또는 Cγ) 또는 인간 T 세포 수용체-델타 (TCR-델타 또는 TCRd 또는 TCRδ 또는 Cδ)의 비-야생형 핵산 서열을 포함한다. 예를 들면, 비-야생형 서열은 코돈 최적화된 서열 및/또는 인코딩된 폴리펩티드에서 돌연변이를 유도하는 하나 이상의 돌연변이를 포함하는 서열일 수 있다.
일부 구현예에서, 인코딩된 SIR 분자의 T 세포 수용체 불변 사슬을 인코딩하는 핵산 서열은 인간 T 세포 수용체-알파 (TCR-알파 또는 TCRα 또는 TCRa 또는 Cα), 인간 T 세포 수용체-베타1 (TCR-베타1 또는 TCRβ1 또는 TCRb1 또는 Cβ1), 인간 T 세포 수용체-베타 2 (TCR-베타, TCRβ 또는 TCRb 또는 Cβ라고도 지칭되는 TCR-베타2 또는 TCRβ2 또는 TCRb2 또는 Cβ2), 인간 pre-T 세포 수용체 알파 (preTCR-알파 또는 preTCRα 또는 preTCRa 또는 preCα), 인간 T 세포 수용체-감마 (TCR-감마 또는 TCRγ 또는 TCRg 또는 Cγ) 또는 인간 T 세포 수용체-델타 (TCR-델타 또는 TCRd 또는 TCRδ 또는 Cδ)의 코돈 최적화된 서열을 포함한다. 예시적인 코돈 최적화된 인간 TCRβ1 불변 영역 핵산 서열은 서열번호 752에 제공되어 있다. 예시적인 코돈 최적화된 인간 TCRβ2 불변 영역 핵산 서열은 서열번호 749 및 750에 제공되어 있다.
일부 구현예에서, 인코딩된 SIR 분자의 T 세포 수용체 불변 사슬을 인코딩하는 핵산 서열은, SIR 사슬의 발현 및 쌍 형성을 증진시키고, 이들의 내인성 T 세포 수용체 사슬과의 쌍 형성을 감소시키는 특이적 돌연변이 (점 돌연변이 또는 결실 또는 둘)를 보유하는 인간 T 세포 수용체-알파 (TCR-알파 또는 TCRα 또는 TCRa 또는 Cα), 인간 T 세포 수용체-베타1 (TCR-베타1 또는 TCRβ1 또는 TCRb1 또는 Cβ1), 인간 T 세포 수용체-베타 2 (TCR-베타, TCRβ 또는 TCRb 또는 Cβ라고도 지칭되는 TCR-베타2 또는 TCRβ2 또는 TCRb2 또는 Cβ2), 인간 pre-T 세포 수용체 알파 (preTCR-알파 또는 preTCRα 또는 preTCRa 또는 preCα), 인간 T 세포 수용체-감마 (TCR-감마 또는 TCRγ 또는 TCRg 또는 Cγ) 또는 인간 T 세포 수용체-델타 (TCR-델타 또는 TCRd 또는 TCRδ 또는 Cδ)의 불변 사슬을 포함한다.
일부 구현예에서, 인코딩된 SIR 분자의 T 세포 수용체 불변 사슬을 인코딩하는 핵산 서열은, 코돈 최적화되고, SIR 사슬의 발현 및 쌍 형성을 증진시키고, 이들의 내인성 T 세포 수용체 사슬과의 쌍 형성을 감소시키는 특이적 돌연변이 (점 돌연변이 또는 결실 또는 둘)를 보유하는 인간 T 세포 수용체-알파 (TCR-알파 또는 TCRα 또는 TCRa 또는 Cα), 인간 T 세포 수용체-베타1 (TCR-베타1 또는 TCRβ1 또는 TCRb1 또는 Cβ1), 인간 T 세포 수용체-베타 2 (TCR-베타, TCRβ 또는 TCRb 또는 Cβ라고도 지칭되는 TCR-베타2 또는 TCRβ2 또는 TCRb2 또는 Cβ2), 인간 pre-T 세포 수용체 알파 (preTCR-알파 또는 preTCRα 또는 preTCRa 또는 preCα), 인간 T 세포 수용체-감마 (TCR-감마 또는 TCRγ 또는 TCRg 또는 Cγ) 또는 인간 T 세포 수용체-델타 (TCR-델타 또는 TCRd 또는 TCRδ 또는 Cδ)의 불변 사슬을 포함한다.
일부 구현예에서, 인코딩된 SIR 분자의 T 세포 수용체 불변 사슬을 인코딩하는 핵산 서열은, 개 T 세포 수용체-알파 (TCR-알파 또는 TCRα 또는 TCRa 또는 Cα), 개 T 세포 수용체-베타 (TCR-베타, TCRβ 또는 TCRb 또는 Cβ), 개 pre-T 세포 수용체 알파 (preTCR-알파 또는 preTCRα 또는 preTCRa 또는 preCα), 개 T 세포 수용체-감마 (TCR-감마 또는 TCRγ 또는 TCRg 또는 Cγ) 또는 개 T 세포 수용체-델타 (TCR-델타 또는 TCRd 또는 TCRδ 또는 Cδ)의 야생형, 비-야생형 또는 코돈 최적화된 불변 사슬을 포함한다.
일부 구현예에서, 인코딩된 SIR 분자의 T 세포 수용체 불변 사슬을 인코딩하는 핵산 서열은, 코돈 최적화되고, SIR 사슬의 발현 및 쌍 형성을 증진시키고, 이들의 내인성 T 세포 수용체 사슬과의 쌍 형성을 감소시키는 특이적 돌연변이 (점 돌연변이 또는 결실 또는 둘)를 보유하는 개 T 세포 수용체-알파 (TCR-알파 또는 TCRα 또는 TCRa 또는 Cα), 개 T 세포 수용체-베타 (TCR-베타, TCRβ 또는 TCRb 또는 Cβ), 개 pre-T 세포 수용체 알파 (preTCR-알파 또는 preTCRα 또는 preTCRa 또는 preCα), 개 T 세포 수용체-감마 (TCR-감마 또는 TCRγ 또는 TCRg 또는 Cγ) 또는 개 T 세포 수용체-델타 (TCR-델타 또는 TCRd 또는 TCRδ 또는 Cδ)의 불변 사슬을 포함한다.
일부 구현예에서, 인코딩된 SIR 분자의 T 세포 수용체 불변 사슬을 인코딩하는 핵산 서열은, SIR 사슬의 발현 및 쌍 형성을 증진시키고, 이들의 내인성 T 세포 수용체 사슬과의 쌍 형성을 감소시키는 특이적 돌연변이 (점 돌연변이 또는 결실 또는 둘)를 보유하거나 보유하지 않을 수 있는 개 T 세포 수용체-알파 (TCR-알파 또는 TCRα 또는 TCRa 또는 Cα), 개 T 세포 수용체-베타 (TCR-베타, TCRβ 또는 TCRb 또는 Cβ), 개 pre-T 세포 수용체 알파 (preTCR-알파 또는 preTCRα 또는 preTCRa 또는 preCα), 개 T 세포 수용체-감마 (TCR-감마 또는 TCRγ 또는 TCRg 또는 Cγ) 또는 개 T 세포 수용체-델타 (TCR-델타 또는 TCRd 또는 TCRδ 또는 Cδ)의 야생형, 비-야생형 또는 코돈 최적화된 불변 사슬을 포함한다.
특정 구현예에서, SIR 분자의 핵산 서열은 서열번호 730, 서열번호 731 또는 서열번호 733에 나타낸 바와 같은 인간 T 세포 수용체 알파 (TCR-알파 또는 TCRα 또는 TCRa 또는 Cα) 불변 사슬의 핵산 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, SIR 분자의 핵산 서열은 서열번호 3010 또는 서열번호 3011의 아미노산 서열 중 적어도 1개, 5 내지 9개이나 20개를 넘지 않는 변형을 갖는 인간 T 세포 수용체-알파의 불변 사슬의 아미노산 서열 또는 서열번호 3010 또는 서열번호 3011의 아미노산 서열과 80 내지 99% 동일성을 갖는 서열을 인코딩한다. 특정 구현예에서, SIR 분자의 핵산 서열은 서열번호 3010 또는 서열번호 3011의 서열을 포함하는 인간 TCRα의 불변 서열을 인코딩한다.
특정 구현예에서, SIR 분자의 핵산 서열은 서열번호 3010의 아미노산 서열을 인코딩하지만 위치 91번 세린 (S), 위치 92번 (D), 위치 93번 발린 (V), 위치 94번 프롤린 (P), 위치 48번 시스테인 (C) 및 위치 61번 아르기닌을 포함한 하나 이상의 돌연변이를 보유한 인간 T 세포 수용체 알파 불변 영역 (사슬)의 핵산 서열을 포함한다 (예로, 서열번호 732, 735, 736, 737, 738, 739 또는 740).
특정 구현예에서, SIR 분자의 핵산 서열은 서열번호 3010의 아미노산 서열을 인코딩하지만 하나 이상의 아미노산이 마우스 TCRα 불변 영역 (사슬)의 상응하는 아미노산으로 대체되는 핵산 서열을 포함한다 (예로, 서열번호 3022).
특정 구현예에서, SIR 분자의 핵산 서열은 서열번호 732에 나타낸 바와 같은 인간 T 세포 수용체 알파 (TCR-알파 또는 TCRα 또는 TCRa 또는 hTCRa 또는 hTCRα 또는 Cα) 불변 사슬의 핵산 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, SIR 분자의 핵산 서열은 인코딩된 폴리펩티드의 발현 및 SIR의 상보적인 TCRb 불변 사슬과의 사슬 쌍 형성을 증진하고 내인성 TCRβ 사슬과의 사슬 쌍 형성을 감소시키는 아미노산 치환 (CSDVP)을 보유하는 인간 TCRa의 불변 사슬을 인코딩한다. 특정 구현예에서, SIR 분자의 핵산 서열은 서열번호 3012의 아미노산 서열 중 적어도 1개, 5 내지 10개이나 20개를 넘지 않는 변형을 갖는 인간 T 세포 수용체-알파의 불변 사슬의 아미노산 서열을 인코딩하는 서열 또는 서열번호 3012의 아미노산 서열과 80 내지 99% 동일성을 갖는 서열을 인코딩하는 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, SIR 분자에 의해 인코딩된 인간 TCRa의 불변 사슬은 서열번호 3012의 아미노산 서열을 포함한다.
특정 구현예에서, SIR 분자의 핵산 서열은 서열번호 737에 나타낸 바와 같은 인간 T 세포 수용체 알파 (TCR-알파 또는 TCRα 또는 TCRa 또는 hTCRa 또는 hTCRα 또는 Cα) 불변 사슬의 핵산 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, SIR 분자의 핵산 서열은 인코딩된 폴리펩티드의 발현을 증진하는 아미노산 치환 (SDVP)을 보유하는 인간 TCRa의 불변 사슬을 인코딩한다. 특정 구현예에서, SIR의 뉴클레오티드 서열은 서열번호 3017의 아미노산 서열 중 적어도 1개, 5 내지 10개이나 20개를 넘지 않는 변형을 갖는 인간 T 세포 수용체-알파 (TCR-알파 또는 TCRα 또는 TCRa 또는 Cα)의 불변 사슬의 아미노산 서열을 인코딩하는 서열 또는 서열번호 3017의 아미노산 서열과 80 내지 99% 동일성을 갖는 서열을 인코딩하는 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, SIR 분자에 의해 인코딩된 인간 TCRa의 불변 사슬은 서열번호 3017의 아미노산 서열을 포함한다.
특정 구현예에서, SIR 분자의 핵산 서열은 서열번호 740에 나타낸 바와 같은 인간 T 세포 수용체 알파 (TCR-알파 또는 TCRα 또는 TCRa 또는 hTCRa 또는 hTCRα 또는 Cα) 불변 사슬의 핵산 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, SIR 분자의 핵산 서열은 인코딩된 폴리펩티드의 발현을 증진하는 아미노산 치환 (SD)을 보유하는 인간 TCRa의 불변 사슬을 인코딩한다. 특정 구현예에서, SIR의 뉴클레오티드 서열은 서열번호 3020의 아미노산 서열 중 적어도 1개, 5 내지 10개이나 20개를 넘지 않는 변형을 갖는 인간 T 세포 수용체-알파 (TCR-알파 또는 TCRα 또는 TCRa 또는 Cα)의 불변 사슬의 아미노산 서열을 인코딩하는 서열 또는 서열번호 3020의 아미노산 서열과 80 내지 99% 동일성을 갖는 서열을 인코딩하는 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, SIR 분자에 의해 인코딩된 인간 TCRa의 불변 사슬은 서열번호 3020의 아미노산 서열을 포함한다.
특정 구현예에서, SIR 분자의 핵산 서열은 서열번호 736에 나타낸 바와 같은 인간 T 세포 수용체 알파 (TCR-알파 또는 TCRα 또는 TCRa 또는 hTCRa 또는 hTCRα 또는 Cα) 불변 사슬의 핵산 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, SIR 분자의 핵산 서열은 S57C (Ser57Cys) 치환을 보유하는 도입된 돌연변이체 인간 TCRβ 불변 사슬과 공동발현될 때 추가적인 사슬간 디설파이드 결합의 형성을 촉진하는 Thr48Cys (T48C) 치환을 갖는 인간 TCRα의 불변 사슬을 인코딩한다. 특정 구현예에서, SIR의 뉴클레오티드 서열은 서열번호 3016의 아미노산 서열 중 적어도 1개, 5 내지 9개이나 20개를 넘지 않는 변형을 갖는 인간 T 세포 수용체-알파 (TCR-알파 또는 TCRα 또는 TCRa 또는 Cα)의 불변 사슬의 아미노산 서열을 인코딩하는 서열 또는 서열번호 3016의 아미노산 서열과 80 내지 99% 동일성을 갖는 서열을 인코딩하는 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, SIR 분자에 의해 인코딩된 인간 TCRa의 불변 사슬은 서열번호 3016의 아미노산 서열을 포함한다.
특정 구현예에서, SIR 분자의 핵산 서열은 서열번호 738에 나타낸 바와 같은 인간 T 세포 수용체 알파 (TCR-알파 또는 TCRα 또는 TCRa 또는 hTCRa 또는 hTCRα 또는 Cα) 불변 사슬의 핵산 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, SIR 분자의 핵산 서열은 R79G (Arg79Gly) 치환을 보유하는 도입된 돌연변이체 인간 TCRβ 불변 사슬과 공동발현될 때 사슬 쌍 형성을 촉진하고, 내인성 TCRβ 사슬과의 사슬 쌍 형성을 감소시키는 Ser61Arg (S61R) 치환을 갖는 인간 TCRα의 불변 사슬을 인코딩한다. 특정 구현예에서, SIR의 뉴클레오티드 서열은 서열번호 3018의 아미노산 서열 중 적어도 1개, 5 내지 9개이나 20개를 넘지 않는 변형을 갖는 인간 T 세포 수용체-알파 (TCR-알파 또는 TCRα 또는 TCRa 또는 Cα)의 불변 사슬의 아미노산 서열을 인코딩하는 서열 또는 서열번호 3018의 아미노산 서열과 80 내지 99% 동일성을 갖는 서열을 인코딩하는 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, SIR 분자에 의해 인코딩된 인간 TCRa의 불변 사슬은 서열번호 3018의 아미노산 서열을 포함한다.
특정 구현예에서, SIR 분자의 핵산 서열은 서열번호 739에 나타낸 바와 같은 인간 T 세포 수용체 알파 (TCR-알파 또는 TCRα 또는 TCRa 또는 hTCRa 또는 hTCRα 또는 Cα) 불변 사슬의 핵산 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, SIR 분자의 핵산 서열은 인코딩된 폴리펩티드의 발현 및 상보적인 TCRβ 불변 사슬과의 이의 쌍 형성을 증진하고, 내인성 TCRβ 사슬과의 사슬 쌍 형성을 감소시키는 아미노산 치환 (SDVPR)을 보유하는 인간 TCRa의 불변 사슬을 인코딩한다. 특정 구현예에서, SIR의 뉴클레오티드 서열은 서열번호 3019의 아미노산 서열 중 적어도 1개, 5 내지 9개이나 20개를 넘지 않는 변형을 갖는 인간 T 세포 수용체-알파 (TCR-알파 또는 TCRα 또는 TCRa 또는 Cα)의 불변 사슬의 아미노산 서열을 인코딩하는 서열 또는 서열번호 3019의 아미노산 서열과 80 내지 99% 동일성을 갖는 서열을 인코딩하는 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, SIR 분자에 의해 인코딩된 인간 TCRa의 불변 사슬은 서열번호 3019의 아미노산 서열을 포함한다.
특정 구현예에서, SIR 분자의 핵산 서열은 서열번호 744 또는 서열번호 745에 나타낸 바와 같은 인간 T 세포 수용체-베타 (TCR-베타, TCRβ 또는 TCRb 또는 hTCR-베타 또는 hTCRβ 또는 hTCRb 또는 Cβ) 불변 사슬의 핵산 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, SIR의 핵산 서열은 서열번호 3024 또는 서열번호 3025의 아미노산 서열 중 적어도 1개, 5 내지 9개이나 20개를 넘지 않는 변형을 갖는 인간 T 세포 수용체-베타의 불변 사슬의 아미노산 서열 또는 서열번호 3024 또는 서열번호 3025의 아미노산 서열과 80 내지 99% 동일성을 갖는 서열을 인코딩한다. 특정 구현예에서, SIR 분자에 의해 인코딩된 인간 TCRb의 불변 사슬은 서열번호 3024 또는 서열번호 3025의 아미노산 서열을 포함한다.
특정 구현예에서, SIR 분자의 핵산 서열은 서열번호 3024 또는 서열번호 3025의 아미노산 서열을 인코딩하지만 위치 18번에서 염기성 아미노산 (Arg 또는 Lys), 위치 22번에서 알라신 (A), 위치 133번에서 이소류신 (I), 위치 136번에서 알라닌 (A), 위치 139번에서 히스티딘 (H), 위치 57번에서 시스테인 (C) 및/또는 79번에서 글리신 (G)을 포함하는 하나 이상의 돌연변이를 보유하는 인간 T 세포 수용체 베타 (TCR-베타, TCRβ 또는 TCRb 또는 hTCR-베타 또는 hTCRβ 또는 hTCRb 또는 Cβ) 불변 사슬의 핵산 서열을 포함한다.
특정 구현예에서, SIR 분자의 핵산 서열은 인간 TCRβ1 (서열번호 3024) 또는 TCRβ2 (서열번호 3025)의 불변 사슬의 아미노산 서열을 인코딩하지만 하나 이상의 아미노산이 마우스의 TCRβ 불변 사슬 (서열번호 3047)의 상응하는 아미노산 서열에 의해 대체되는 인간 T 세포 수용체 베타 (TCR-베타, TCRβ 또는 TCRb 또는 hTCR-베타 또는 hTCRβ 또는 hTCRb 또는 Cβ) 불변 사슬의 핵산 서열을 포함한다.
특정 구현예에서, SIR 분자의 핵산 서열은 서열번호 748에 나타낸 바와 같은 인간 T 세포 수용체 베타 (TCR-베타, TCRβ 또는 TCRb 또는 hTCR-베타 또는 hTCRβ 또는 hTCRb 또는 Cβ) 불변 사슬의 핵산 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, SIR 분자의 핵산 서열은 인코딩된 폴리펩티드의 발현 및 SIR의 상보적인 TCRa 불변 사슬과의 사슬 쌍 형성을 증진하고, 내인성 TCRa 사슬과의 사슬 쌍 형성을 감소시키는 서열번호 3028에 나타낸 바와 같은 아미노산 치환 (KACIAH)을 보유하는 인간 TCRb의 불변 사슬을 인코딩한다. 특정 구현예에서, SIR의 핵산 서열은 서열번호 3028의 아미노산 서열 중 적어도 1개, 5 내지 10개이나 20개를 넘지 않는 변형을 갖는 인간 TCRb의 불변 사슬의 아미노산 서열 또는 서열번호 3028의 아미노산 서열과 80 내지 99% 동일성을 갖는 서열을 인코딩하는 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, SIR 분자에 의해 인코딩된 인간 TCRb의 불변 사슬은 서열번호 3028의 아미노산 서열을 포함한다.
특정 구현예에서, SIR 분자의 핵산 서열은 서열번호 747에 나타낸 바와 같은 인간 T 세포 수용체 베타 (TCR-베타, TCRβ 또는 TCRb 또는 hTCR-베타 또는 hTCRβ 또는 hTCRb 또는 Cβ) 불변 사슬의 핵산 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, SIR 분자의 핵산 서열은 T48C (Thr57Cys) 치환을 보유하는 돌연변이체 인간 TCRα 불변 사슬과 공동발현될 때 추가적인 사슬간 디설파이드 결합의 형성을 촉진하고, 내인성 TCRα 사슬과의 사슬 쌍 형성을 감소시키는 Ser57Cys (S57C) 치환을 보유하는 인간 TCRb의 불변 사슬을 인코딩한다. 특정 구현예에서, SIR의 핵산 서열은 서열번호 3027의 아미노산 서열 중 적어도 1개, 5 내지 10개이나 20개를 넘지 않는 변형을 갖는 인간 TCRb의 불변 사슬의 아미노산 서열 또는 서열번호 3027의 아미노산 서열과 80 내지 99% 동일성을 갖는 서열을 인코딩하는 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, SIR 분자에 의해 인코딩된 인간 TCRb2의 불변 사슬은 서열번호 3027의 아미노산 서열을 포함한다.
특정 구현예에서, SIR 분자의 핵산 서열은 서열번호 762에 나타낸 바와 같은 인간 T 세포 수용체 베타 (TCR-베타, TCRβ 또는 TCRb 또는 hTCR-베타 또는 hTCRβ 또는 hTCRb 또는 Cβ) 불변 사슬의 핵산 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, SIR 분자의 핵산 서열은 Ser61Arg (S61R) 치환을 보유하는 도입된 돌연변이체 인간 TCRα 불변 사슬과 사슬 쌍 형성을 촉진하고, 내인성 TCRα 사슬과의 사슬 쌍 형성을 감소시키는 Arg79Gly (R79G) 치환을 보유하는 인간 TCRb의 불변 사슬을 인코딩한다. 특정 구현예에서, SIR의 핵산 서열은 서열번호 3042의 아미노산 서열 중 적어도 1개, 5 내지 10개이나 20개를 넘지 않는 변형을 갖는 인간 T 세포 수용체 베타의 불변 사슬의 아미노산 서열 또는 서열번호 3042의 아미노산 서열과 80 내지 99% 동일성을 갖는 서열을 인코딩하는 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, SIR 분자에 의해 인코딩된 인간 TCRb의 불변 사슬은 서열번호 3042의 아미노산 서열을 포함한다.
특정 구현예에서, SIR 분자의 핵산 서열은 서열번호 753 내지 759에 나타낸 바와 같은 인간 T 세포 수용체 베타 (TCR-베타, TCRβ 또는 TCRb 또는 hTCR-베타 또는 hTCRβ 또는 hTCRb 또는 Cβ) 불변 사슬의 핵산 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, SIR 분자의 핵산 서열은 이의 발현을 증진하는 서열번호 3034, 3035, 3036, 3037, 3038 또는 3039에 나타낸 바와 같은 아미노산 치환을 보유하는 인간 TCRb의 불변 사슬을 인코딩한다. 특정 구현예에서, SIR의 핵산 서열은 서열번호 3034 내지 3038 또는 3039의 아미노산 서열 중 적어도 1개, 5 내지 10개이나 20개를 넘지 않는 변형을 갖는 인간 T 세포 수용체 베타의 불변 사슬의 아미노산 서열 또는 서열번호 3034, 3035, 3036, 3037, 3038 또는 3039의 아미노산 서열과 80 내지 99% 동일성을 갖는 서열을 인코딩하는 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, SIR 분자에 의해 인코딩된 인간 TCRb의 불변 사슬은 서열번호 3034, 3035, 3036, 3037, 3038 또는 3039의 아미노산 서열을 포함한다.
특정 구현예에서, SIR 분자의 핵산 서열은 서열번호 753에 나타낸 바와 같은 인간 T 세포 수용체 베타 (TCR-베타, TCRβ 또는 TCRb 또는 hTCR-베타 또는 hTCRβ 또는 hTCRb 또는 Cβ) 불변 사슬의 핵산 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, SIR 분자의 핵산 서열은 이의 발현을 증진하는 서열번호 3033에 나타낸 바와 같은 아미노산 치환 (KAIAH)을 보유하는 인간 TCRb의 불변 사슬을 인코딩한다. 특정 구현예에서, SIR의 핵산 서열은 서열번호 3033의 아미노산 서열 중 적어도 1개, 5 내지 10개이나 20개를 넘지 않는 변형을 갖는 인간 T 세포 수용체 베타의 불변 사슬의 아미노산 서열 또는 서열번호 3033의 아미노산 서열과 80 내지 99% 동일성을 갖는 서열을 인코딩하는 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, SIR 분자에 의해 인코딩된 인간 TCRb의 불변 사슬은 서열번호 3033의 아미노산 서열을 포함한다.
특정 구현예에서, SIR 분자의 핵산 서열은 서열번호 761에 나타낸 바와 같은 인간 T 세포 수용체 베타 (TCR-베타, TCRβ 또는 TCRb 또는 hTCR-베타 또는 hTCRβ 또는 hTCRb 또는 Cβ) 불변 사슬의 핵산 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, SIR 분자의 핵산 서열은 이의 발현을 증진하는 서열번호 3041에 나타낸 바와 같은 아미노산 치환 (KAG)을 보유하는 인간 TCRb의 불변 사슬을 인코딩한다. 특정 구현예에서, SIR의 핵산 서열은 서열번호 3041의 아미노산 서열 중 적어도 1개, 5 내지 10개이나 20개를 넘지 않는 변형을 갖는 인간 T 세포 수용체 베타의 불변 사슬의 아미노산 서열 또는 서열번호 3041의 아미노산 서열과 80 내지 99% 동일성을 갖는 서열을 인코딩하는 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, SIR 분자에 의해 인코딩된 인간 TCRb의 불변 사슬은 서열번호 3041의 아미노산 서열을 포함한다.
특정 구현예에서, SIR 분자의 핵산 서열은 서열번호 760에 나타낸 바와 같은 인간 T 세포 수용체 베타 (TCR-베타, TCRβ 또는 TCRb 또는 hTCR-베타 또는 hTCRβ 또는 hTCRb 또는 Cβ) 불변 사슬의 핵산 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, SIR 분자의 핵산 서열은 이의 발현을 증진하는 서열번호 3040에 나타낸 바와 같은 아미노산 치환 (KAIHAG)을 보유하는 인간 TCRb의 불변 사슬을 인코딩한다. 특정 구현예에서, SIR의 핵산 서열은 서열번호 3040의 아미노산 서열 중 적어도 1개, 5 내지 10개이나 20개를 넘지 않는 변형을 갖는 인간 T 세포 수용체 베타의 불변 사슬의 아미노산 서열 또는 서열번호 3040의 아미노산 서열과 80 내지 99% 동일성을 갖는 서열을 인코딩하는 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, SIR 분자에 의해 인코딩된 인간 TCRb의 불변 사슬은 서열번호 3040의 아미노산 서열을 포함한다.
특정 구현예에서, SIR 분자의 핵산 서열은 이의 발현 및 도입된 TCRa 불변 사슬과의 쌍 형성을 증진하는 아미노산 치환 (K18I133 또는 K18A136 또는 K18A136 또는 K18H139 또는 R18A22 또는 R18)을 보유한 인간 TCRb2의 불변 사슬을 인코딩하는 서열번호 755, 756, 757, 758 또는 759의 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, SIR의 뉴클레오티드 서열은 서열번호 3035, 3036, 3037, 3038 또는 3039의 아미노산 서열 중 적어도 1개, 5 내지 10개이나 20개를 넘지 않는 변형을 갖는 인간 T 세포 수용체 베타 2 (TCR-베타2, TCRβ2 또는 TCRb2 또는 Cβ2; TCR-베타, TCRβ 또는 TCRb 또는 Cβ라고도 지칭됨)의 불변 사슬의 아미노산 또는 서열번호 3035, 3036, 3037, 3038 또는 3039의 아미노산 서열과 80 내지 99% 동일성을 갖는 서열을 인코딩하는 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, SIR 분자에 의해 인코딩된 인간 TCRb2의 불변 사슬은 서열번호 3035, 3036, 3037, 3038 또는 3039의 아미노산 서열을 포함한다.
특정 구현예에서, SIR 분자의 핵산 서열은 C-말단 48개 아미노산이 결실되고 (pre-TCR-알파-Del48 또는 pre-TCRα-Del48 또는 pre-TCRa-Del48 또는 preCα-Del48), 서열번호 768에 나타낸 바와 같은 핵산 서열을 갖는 인간 preT 세포 수용체 알파의 불변 사슬의 아미노산 서열을 인코딩한다. 특정 구현예에서, SIR의 핵산 서열은 서열번호 3048의 아미노산 서열 중 적어도 1개, 5 내지 9개이나 20개를 넘지 않는 변형을 갖는 preCα-Del48의 불변 사슬의 아미노산 서열 또는 서열번호 3048의 아미노산 서열과 80 내지 99% 동일성을 갖는 서열을 인코딩한다. 특정 구현예에서, SIR 분자에 의해 인코딩된 인간 preCα-Del48의 불변 사슬은 서열번호 3048의 아미노산 서열을 포함한다.
특정 구현예에서, SIR 분자의 핵산 서열은 서열번호 766 또는 767에 나타낸 바와 같은 인간 preT 세포 수용체 알파 (pre-TCR-알파 또는 pre-TCRα 또는 pre-TCRa 또는 preCα)의 불변 사슬의 핵산 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, SIR의 핵산 서열은 서열번호 3046 또는 3047에 나타낸 바와 같고, 서열번호 3046 또는 3047의 아미노산 서열 중 적어도 1개, 5 내지 9개이나 20개를 넘지 않는 변형을 갖는 인간 preT 세포 수용체 알파의 불변 사슬의 아미노산 서열 또는 서열번호 3046 또는 3047의 아미노산 서열과 80 내지 99% 동일성을 갖는 서열을 인코딩한다. 특정 구현예에서, SIR 분자에 의해 인코딩된 인간 preCα의 불변 사슬은 서열번호 3046 또는 3047의 아미노산 서열을 포함한다.
특정 구현예에서, SIR 분자의 핵산 서열은 서열번호 769 또는 770에 나타낸 바와 같은 인간 T 세포 수용체 감마 (TCR-감마 또는 TCRγ 또는 TCRg 또는 hTCR-감마 또는 hTCRγ 또는 hTCRg 또는 Cγ)의 불변 사슬의 핵산 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, SIR의 핵산 서열은 서열번호 3049 또는 3050의 아미노산 서열 중 적어도 1개, 5 내지 9개이나 20개를 넘지 않는 변형을 갖는 인간 T 세포 수용체 감마의 불변 사슬의 아미노산 서열 또는 서열번호 3049 또는 3050의 아미노산 서열과 80 내지 99% 동일성을 갖는 서열을 인코딩한다. 특정 구현예에서, SIR 분자에 의해 인코딩된 인간 TCRg의 불변 사슬은 서열번호 3049 또는 3050의 아미노산 서열을 포함한다.
특정 구현예에서, SIR 분자의 핵산 서열은 서열번호 771 또는 772에 나타낸 바와 같은 인간 T 세포 수용체 델타 (TCR-델타 또는 TCRδ 또는 TCRd 또는 hTCR-델타 또는 hTCRδ 또는 hTCRd 또는 Cδ)의 불변 사슬의 핵산 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, SIR의 핵산 서열은 서열번호 3052에 나타낸 바와 같고, 서열번호 3052의 아미노산 서열 중 적어도 1개, 5 내지 9개이나 20개를 넘지 않는 변형을 갖는 인간 T 세포 수용체 델타의 불변 사슬의 아미노산 서열 또는 서열번호 3052의 아미노산 서열과 80 내지 99% 동일성을 갖는 서열을 인코딩한다. 특정 구현예에서, SIR 분자에 의해 인코딩된 인간 TCR 델타의 불변 사슬은 서열번호 3052의 아미노산 서열을 포함한다.
특정 구현예에서, SIR의 핵산 서열은 서열번호 743에 나타낸 바와 같은 개 T 세포 수용체 알파 (개 TCR-알파 또는 개 TCRα 또는 개 TCRa 또는 cTCR알파 또는 cTCRα 또는 cTCRa 또는 cCα)의 불변 사슬의 핵산 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, SIR의 핵산 서열은 서열번호 3023에 나타낸 바와 같고, 서열번호 3023의 아미노산 서열 중 적어도 1개, 5 내지 9개이나 20개를 넘지 않는 변형을 갖는 개 T 세포 수용체 알파의 불변 사슬의 아미노산 서열 또는 서열번호 3023의 아미노산 서열과 80 내지 99% 동일성을 갖는 서열을 인코딩한다. 특정 구현예에서, SIR 분자에 의해 인코딩된 개 TCR 알파의 불변 사슬은 서열번호 3023의 아미노산 서열을 포함한다.
특정 구현예에서, SIR 분자의 핵산 서열은 서열번호 764에 나타낸 바와 같은 개 T 세포 수용체 베타 (개 TCR-베타 또는 개 TCRβ 또는 개 TCRb 또는 개 Cβ 또는 cTCR베타 또는 cTCRβ 또는 cTCRb 또는 cCβ)의 불변 사슬의 핵산 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, SIR의 핵산 서열은 서열번호 3044에 나타낸 바와 같고, 서열번호 3044의 아미노산 서열 중 적어도 1개, 5 내지 9개이나 20개를 넘지 않는 변형을 갖는 개 T 세포 수용체 베타의 불변 사슬의 아미노산 서열 또는 서열번호 3044의 아미노산 서열과 80 내지 99% 동일성을 갖는 서열을 인코딩한다. 특정 구현예에서, SIR 분자에 의해 인코딩된 개 TCR 베타의 불변 사슬은 서열번호 3044의 아미노산 서열을 포함한다.
특정 구현예에서, SIR 분자의 핵산 서열은 서열번호 742에 나타낸 바와 같은 마우스 T 세포 수용체 알파 (마우스 TCR-알파 또는 마우스 TCRα 또는 마우스 TCRa 또는 mTCR알파 또는 mTCRα 또는 mTCRa 또는 mCα)의 불변 사슬의 핵산 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, SIR의 핵산 서열은 서열번호 3022에 나타낸 바와 같고, 서열번호 3022의 아미노산 서열 중 적어도 1개, 5 내지 9개이나 20개를 넘지 않는 변형을 갖는 마우스 T 세포 수용체 알파의 불변 사슬의 아미노산 서열 또는 서열번호 3022의 아미노산 서열과 80 내지 99% 동일성을 갖는 서열을 인코딩한다. 특정 구현예에서, SIR 분자에 의해 인코딩된 마우스 TCR 알파의 불변 사슬은 서열번호 3022의 아미노산 서열을 포함한다.
특정 구현예에서, SIR 분자의 핵산 서열은 서열번호 763에 나타낸 바와 같은 마우스 T 세포 수용체 베타 (마우스 TCR-베타 또는 마우스 TCRβ 또는 마우스 TCRb 또는 마우스 Cβ 또는 mTCR베타 또는 mTCRβ 또는 mTCRb 또는 mCβ)의 불변 사슬의 핵산 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, SIR의 핵산 서열은 서열번호 3043에 나타낸 바와 같고, 서열번호 3043의 아미노산 서열 중 적어도 1개, 5 내지 9개이나 20개를 넘지 않는 변형을 갖는 마우스 T 세포 수용체 베타의 불변 사슬의 아미노산 서열 또는 서열번호 3043의 아미노산 서열과 80 내지 99% 동일성을 갖는 서열을 인코딩한다. 특정 구현예에서, SIR 분자에 의해 인코딩된 마우스 TCR 베타의 불변 사슬은 서열번호 3043의 아미노산 서열을 포함한다.
특정 구현예에서, SIR 분자의 핵산 서열은 서열번호 741에 나타낸 바와 같은 인간 CD3 제타 (CD3ζ) 사슬의 세포외 도메인, 막통과 도메인 및 세포질 도메인과 융합한 인간 TCRa 불변 사슬 세포외 도메인의 핵산 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, SIR의 핵산 서열은 서열번호 3021에 나타낸 바와 같고, 서열번호 3021의 아미노산 서열 중 적어도 1개, 5 내지 9개이나 20개를 넘지 않는 변형을 갖는 아미노산 서열 또는 서열번호 3021의 아미노산 서열과 80 내지 99% 동일성을 갖는 서열을 인코딩한다. 특정 구현예에서, SIR 분자에 의해 인코딩된 인간 CD3 제타 (CD3ζ)의 세포외 도메인, 막통과 도메인 및 세포질 도메인과 융합한 인간 TCRa 불변 사슬 세포외 도메인의 불변 사슬은 서열번호 3021의 아미노산 서열을 포함한다.
특정 구현예에서, SIR 분자의 핵산 서열은 서열번호 765에 나타낸 바와 같은 인간 CD3 제타 (CD3ζ) 사슬의 세포외 도메인, 막통과 도메인 및 세포질 도메인과 융합한 인간 TCRb 불변 사슬 세포외 도메인의 불변 사슬의 핵산 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, SIR의 핵산 서열은 서열번호 3045에 나타낸 바와 같고, 서열번호 3045의 아미노산 서열 중 적어도 1개, 5 내지 9개이나 20개를 넘지 않는 변형을 갖는 아미노산 서열 또는 서열번호 3045의 아미노산 서열과 80 내지 99% 동일성을 갖는 서열을 인코딩한다. 특정 구현예에서, SIR 분자에 의해 인코딩된 인간 CD3 제타 (CD3ζ)의 세포외 도메인, 막통과 도메인 및 세포질 도메인과 융합한 인간 TCRb 불변 사슬 세포외 도메인의 불변 사슬은 서열번호 3045의 아미노산 서열을 포함한다.
특정 구현예에서, 본 발명의 SIR을 인코딩하는 핵산 서열은 인간, 마우스 또는 개 기원의 TCRa, TCRb, preTCRa, TCR 감마 또는 TCR 델타 사슬 중 어느 하나의 불변 사슬을 포함하거나 이로부터 유래된 단일 T 세포 수용체 불변 사슬을 인코딩한다. 단일 TCR 불변 사슬을 갖는 예시적인 SIR은 클론 번호 051216-F04로 예시되고, 이의 핵산 및 아미노산 서열은 서열번호 1023 및 3258에 각각 주어진다.
특정 구현예에서, 본 발명의 SIR을 인코딩하는 핵산 서열은 인간, 마우스 또는 개 기원의 TCRa, TCRb, preTCRa, TCR 감마 또는 TCR 델타 사슬를 포함하거나 이로부터 유래된 두 개의 T 세포 수용체 불변 사슬을 인코딩한다. 두 개의 TCR 불변 사슬을 갖는 예시적인 SIR은 클론 번호 102615-C08로 예시되고, 이의 핵산 및 아미노산 서열은 서열번호 1200 및 3435에 각각 주어진다.
특정 구현예에서, SIR의 두 개 T 세포 수용체 불변 사슬은 동일한 유형일 수 있다 (예로, TCRa/TCRa; TCRb/TCRb; preTCRa/preTCRa; TCR감마/TCR감마; 및 TCR-델타/TCR-델타). 동일한 유형의 두 개 TCR 불변 사슬을 갖는 예시적인 SIR은 클론 번호 021116-E08 (서열번호 905), 클론 번호 012216-P08 (서열번호 906), 클론 번호 012216-Q05 (서열번호 907), 클론 번호 012216-R04 (서열번호 908) 및 클론 번호 012216-S02 (서열번호 909)이다. 또 다른 구현예에서, SIR의 두 개 TCR 불변 사슬은 상이한 유형일 수 있다 (예로, TCRa/TCRb; preTCRa/TCRb; TCR감마/TCR-델타 등). 상이한 유형의 두 개 TCR 불변 사슬을 갖는 예시적인 SIR은 클론 번호 102615-C08로 예시되고, 이의 핵산 및 아미노산 서열은 서열번호 1200 및 3435에 각각 주어진다.
상기 언급된 바와 같이, 본 발명의 SIR은 항원 결합 도메인에 연결된 TCR 도메인을 포함한다. 이에 따라, 본 발명의 SIR은 항원 결합 도메인 (예로, 항체 또는 항체 단편, 리간드 또는 수용체) 및 하나 이상의 T 세포 수용체 불변 사슬 (본원에 및 상기 기술된 바와 같음)을 포함할 수 있고, 상기 항원 결합 도메인 또는 도메인은 표적 항원에 결합한다. 표적 항원의 비-제한적인 예는 CD19; CD123; CD22; CD30; CD171; CS-1 (CD2 하위집합 1, CRACC, SLAMF7, CD319 및 19A24라고도 지칭됨); C형 렉틴-유사 분자-1 (CLL-1 또는 CLECL1); CD33; 표피 성장인자 수용체 변이체 Ⅲ (EGFRvⅢ); 갱글리오시드 G2 (GD2); 갱글리오시드 GD3 (aNeu5Ac(2-8)aNeu5Ac(2-3)bDGalp(l-4)bDGlcp(l-l)Cer); TNF 수용체 패밀리 구성원 B 세포 성숙 (BCMA); Tn 항원 ((Tn Ag) 또는 (GalNAcα-Ser/Thr)); 전립선-특이적 막 항원 (PSMA); 수용체 타이로신 키나제-유사 고아 수용체 1 (ROR1); Fms 유사 타이로신 키나제 3 (FLT3); 종양-관련 당당백질 72 (TAG72); CD38; CD44v6; 급성 백혈병 또는 림프종 상에서 발현되지만 조혈 전구세포 상에서는 발현되지 않는 글리코실화된 CD43 에피토프; 비-조혈성 암 상에서 발현된 글리코실화된 CD43 에피토프; 암배아 항원 (CEA); 상피세포 부착 분자 (EPCAM); B7H3 (CD276); KIT (CD117); 인터루킨-13 수용체 소단위체 알파-2 (IL-13Ra2 또는 CD213A2); 메소틸린; 인터루킨 11 수용체 알파 (IL-llRa); 전립선 줄기 세포 항원 (PSCA); 프로테아제 세린 21 (테스티신 또는 PRSS21); 혈관 내피 성장인자 수용체 2 (VEGFR2); 루이스 (Y) 항원; CD24; 혈소판-유래 성장인자 수용체 베타 (PDGFR-베타); 단계-특이적 배아 항원-4 (SSEA-4); CD20; 폴레이트 수용체 알파; 수용체 타이로신-단백질 키나제 ERBB2 (Her2/neu); 세포 표면 연관된 뮤신 1 (MUC1); 상피 성장인자 수용체 (EGFR); 신경 세포 부착 분자 (NCAM); 프로스타제; 전립샘 산 포스파타제 (PAP); 변이된 신장인자 2 (ELF2M); 에프린 B2; 섬유모세포 활성화 단백질 알파 (FAP); 인슐린-유사 성장인자 1 수용체 (IGF-I 수용체); 탄산 무수화제 Ⅸ (CAⅨ); 프로테오좀 (프로좀, 마크로페인) 소단위체 베타형, 9 (LMP2); 당단백질 100 (gpl00); 절단점 클러스터 영역 (BCR)으로 구성된 종양원 유전자 융합 단백질 및 아벨슨 마우스 백혈병 바이러스 종양원 유전자 상동체 1 (Abl) (bcr-abl); 티로시나제; 에프린 A형 수용체 2 (EphA2); 퓨코실 GM1; 시아릴 루이스 부착 분자 (sLe); 갱글리오시드 GM3 (aNeu5Ac(2-3)bDClalp(l-4)bDGlcp(l-1)Cer); 글루타민 전이효소 5 (TGS5); 고분자량 흑색종 관련된 항원 (HMWMAA); o-아세틸-GD2 갱글리오시드 (OAcGD2); 종양 내피 마커 1 (TEM1/CD248); 관련된 종양 내피 마커 7 (TEM7R); 클라우딘 6 (CLDN6); 갑상샘 자극호르몬 수용체 (TSHR); G 단백질 연결된 수용체 클래스 C 그룹 5, 구성원 D (GPRC5D); 염색체 X 오픈 리딩 프레임 61 (CXORF61); CD97; CD179a; 역형성 림프종 키나제 (ALK); 폴리시알산; 태반-특이적 항원 1 (PLAC1); 글로보H 글리코세라미드의 육당질 부분 (글로보H); 유샘 분화 항원 (NY-BR-1); 유로플라킨 2 (UPK2); A형 간염 바이러스 세포 수용체 1 (HAVCR1); 아드레노셉터 베타 3 (ADRB3); 패넥신 3 (PANX3); G 단백질-연결된 수용체 20 (GPR20); 림프구 항원 6 복합체, 좌위 K 9 (LY6K); 후각 수용체 51E2 (OR51E2); TCR 감마 교대 리딩 프레임 단백질 (TARP); 윌름 종양 단백질 (WT1); 암/고환 항원 1 (NY-ES0-1); 암/고환 항원 2 (LAGE-1a); 흑색종-관련 항원 1 (MAGE-A1); 염색체 12p 상에 위치한 ETS 전위 변이체 유전자 6 (ETV6-AML); 정자 단백질 17 (SPA17); X 항원 패밀리, 구성원 lA (XAGEl); 안지오포이에틴-결합 세포 표면 수용체 2 (타이 2); 흑색종 암 고환 항원-1 (MAD-CT-1); 흑색종 암 고환 항원-2 (MAD-CT-2); Fos-관련된 항원 1; 종양 단백질 p53 (p53); p53 돌연변이체; 프로스테인; 서바이빈; 텔로머라제; 전립선 암종 종양 항원-1 (PCT A-1 또는 갈렉틴 8); T 세포에 의해 인식되는 흑색종 항원 1 (MelanA 또는 MARTI); 래트 육종 (Ras) 돌연변이체; 인간 텔로머라제 역전사효소 (hTERT); 육종 전위 절단점; 흑색종의 세포사멸 저해제 (ML-IAP); ERG (막통과 프로테아제, 세린 2 (TMPRSS2) ETS 융합 유전자); N-아세틸 글루코사미닐-전이효소 V (NA17); 쌍 형성된 박스 단백질 Pax-3 (PAX3); 안드로겐 수용체; 사이클린 Bl; v-myc 조류 백혈병 바이러스 종양원 유전자 신경모세포종 유래된 상동체 (MYCN); Ras 상동체 패밀리 구성원 C (RhoC); 티로시나제-관련 단백질 2 (TRP-2); 사이토크롬 P450 lB 1 (CYPlB 1); CCCTC-결합 인자 (아연 핑거 단백질)-유사 (BORIS 또는 각인 부위의 조절인자의 형제), T 세포에 의해 인식되는 편평세포 암종 항원 3 (SART3); 쌍 형성된 박스 단백질 Pax-5 (PAX5); 프로아크로신 결합 단백질 sp32 (OY-TESl); 림프구-특이적 단백질 타이로신 키나제 (LCK); 키나제 고정 단백질 4 (AKAP-4); 활액 육종 X 절단점 2 (SSX2); 진행된 당화 말단 산물의 수용체 (RAGE-1); 신장 유비퀴터스 1 (RUl); 신장 유비퀴터스 2 (RU2); 레구마인; 인간 파필로마 바이러스 E6 (HPV E6); 인간 파필로마 바이러스 E7 (HPV E7); 장내 카르복실 에스테라제; 변이된 열 충격 단백질 70-2 (hsp70-2); CD79a; CD79b; CD72; 백혈구-관련된 면역글로불린-유사 수용체 1 (LAIRl); IgA 수용체의 Fc 단편 (FCAR 또는 CD89); 백혈구 면역글로불린-유사 수용체 서브패밀리 A 구성원 2 (LILRA2); CD300 분자-유사 패밀리 구성원 f (CD300LF); C형 렉틴 도메인 패밀리 12 구성원 A (CLEC12A); 골수 간질 세포 항원 2 (BST2); EGF-유사 모듈-포함 뮤신-유사 호르몬 수용체-유사 항원 2 (EMR2); 림프구 항원 75 (LY75); 글리피칸-3 (GPC3); Fc 수용체-유사 5 (FCRL5); 면역글로불린 람다-유사 폴리펩티드 1 (IGLLl); MPL; 바이오틴; c-MYC 에피토프 태그; CD34; LAMP1; TROP2;, GFRα4; CDH17; CDH6; NYBR1; CDH19; CD200R; Slea (CA19.9; 시아릴 루이스 항원); 퓨코실-GM1; PTK7; gpNMB; CDH1-CD324; DLL3; CD276/B7H3; IL-11Ra; IL-13Ra2; CD179b-IGLl1; ALK TCRγ-δ; NKG2D; CD32 (FCGR2A); Tn 항원; CSPG4-HMW-MAA; Tim1-/HVCR1; CSF2RA (GM-CSFR-알파); TGFβR2; VEGFR2/KDR; 루이스 항원; TCR-β1 사슬; TCR-β2 사슬, TCR-γ 사슬, TCR-δ 사슬; FITC; 황체형성 호르몬 수용체 (LHR); 난포 자극호르몬 수용체 (FSHR); 융모생식샘 자극호르몬 수용체 (CGHR); CCR4; GD3; SLAMF6; SLAMF4; HIV1 외투 당단백질; HTLV1-Tax; CMV pp65; EBV-EBNA3c; 인플루엔자 A 헤마글루티닌 (HA); GAD; PDL1; 구아니릴 사이클라제 C (GCC); KSHV-K8.1 단백질; KSHV-gH 단백질; 데스모글레인 3 (Dsg3)에 대한 자가항체; 데스모글레인 1 (Dsg1)에 대한 자가항체; HLA, HLA-A, HLA-A2, HLA-B, HLA-C, HLA-DP, HLA-DM, HLA-DOA, HLA-DOB, HLA-DQ, HLA-DR, HLA-G; IGE; CD99; RAS; G12V; 조직 인자 1 (TF1); AFP; GPRC5D; 클라우딘18.2 (CLD18A2 또는 CLDN18A.2)); P-당단백질; STEAP1; LIV1; 넥틴-4; CRIPTO; GPA33; BST1/CD157; 저전도도 염화물 통로; 및 TNT 항체에 의해 인식되는 항원을 포함한다.
일부 구현예에서, SIR 폴리펩티드 분자의 항원 결합 도메인은 종양 항원에결합한다. SIR 폴리펩티드에 의해 표적될 수 있는 종양 항원의 비제한적인 예는 TSHR, CD 171, CS-1, CLL-1, GD3, Tn 항원, FLT3, CD38, CD44v6, B7H3, KIT, IL-13Ra2, IL-11Ra, PSCA, PRSS21, VEGFR2, 루이스 Y, CD24, PDGFR-베타, SSEA-4, MUC1, EGFR, NCAM, CAlX, LMP2, EphA2, 퓨코실 GM1, sLe, GM3, TGS5, HMWMAA, o-아세틸-GD2, 폴레이트 수용체 베타, TEM1/CD248, TEM7R, CLDN6, GPRC5D, CXORF61, CD97, CD179a, ALK, 폴리시알산, PLAC1, 글로보 H, NY-BR-1, UPK2, HAVCR1, ADRB3, PANX3, GPR20, LY6K, OR51E2, TARP, WT1, ETV6-AML, 정자 단백질 17, XAGE1, 타이 2, MAD-CT-1, MAD-CT-2, Fos-관련 항원 1, p53 돌연변이체, hTERT, 육종 전위 절단점, ML-IAP, ERG (TMPRSS2 ETS 융합 유전자), NA17, PAX3, 안드로겐 수용체, 사이클린 B1, MYCN, RhoC, CYP1B1, BORIS, SART3, PAX5, OY-TES1, LCK, AKAP-4, SSX2, CD79a, CD79b, CD72, LAIR1, FCAR, LILRA2, CD300LF, CLEC12A, BST2, EMR2, LY75, GPC3, FCRL5 및 IGLLl을 포함한다.
일부 구현예에서, SIR 폴리펩티드 분자의 항원 결합 도메인은 HLA-A2과 연관된 항원에 결합한다. HLA-A2와 연관하여 인식되는 항원의 비제한적인 예는 TARP, WT1, hTERT, gp100, 티로시나제, MART1, NY-ESO1, CMV pp65, EBV EBNA3c, HIV1 gag, HTLV1-Tax, PR1, CMV pp65, EBV-EBNA3c, Ras G12V 돌연변이체 및 GAD를 포함한다.
일부 구현예에서, SIR 폴리펩티드 분자의 항원 결합 도메인은 자가항체에 결합하는 자가항원 또는 이의 단편을 포함한다. 자가항원의 비제한적인 예는 Dsg1 및 Dsg3를 포함한다.
일부 구현예에서, SIR 폴리펩티드 분자의 항원 결합 도메인은 항체, 항체 단편, scFv, Fv, Fab, (Fab')2, 단일 도메인 항체 (SDAB), vH 또는 vL 도메인, 카멜리드 VHH 도메인, 또는 다르핀, 어피바디, 어필린, 어드넥틴, 어피틴, 오바디, 레페바디, 파이노머, 알파바디, 어비머, 아트리머, 센티린, 프로넥틴, 안티칼린, 쿠니츠 도메인, 아미딜로 반복서열 단백질과 같은 비-면역글로불린 스캐폴드, 수용체 또는 리간드의 야생형 또는 비-야생형 서열로부터 유래하거나 이들을 포함한다. 일부 구현예에서, 인코딩된 SIR 폴리펩티드는 하나 이상의 항원 결합 도메인을 포함한다. 일 구현예에서, 항원 결합 도메인은 TCR 도메인 (예로, TCR-알파, TCR-베타1, TCR-베타2, preTCR-알파, pre-TCR-알파-Del48, TCR-감마 또는 TCR-델타의 불변 사슬)의 NH2-말단에 직접적으로 또는 조건부 링커를 통해 작동가능하게 연결된다. 여러 예시적인 링커의 핵산 및 아미노산 서열은 서열번호 701 내지 725, 18922 내지 18927 및 2981 내지 3003, 18929 내지 18934에 제공되어 있다. 예시적인 이러한 SIR을 인코딩하는 구조물은 클론 번호 082815-G07에 제공되어 있다. 인코딩된 SIR 폴리펩티드의 아미노산 서열은 서열번호 3855에 해당한다.
일부 구현예에서, SIR 폴리펩티드 분자의 항원 결합 도메인은 T 세포 수용체 (예로, 본원에 기술된 바와 같은 TCR-알파, TCR-베타1, TCR-베타2, preTCR-알파, pre-TCR-알파-Del48, TCR-감마 또는 TCR-델타의 불변 사슬 또는 이들의 돌연변이체 또는 변이체)의 두 개 불변 사슬의 NH2-말단에 별도로 부착되어 단일 항원 결합 도메인을 함께 구성하는 항체의 vL 및 vH 도메인으로부터 유래하거나 이들을 포함한다. CD19 표적하는 예시적인 이러한 SIR은 클론 번호 102615-C08에 제공되어 있다. 이러한 SIR의 아미노산 서열은 서열번호 3435에 해당한다. 이러한 SIR에서, FMC63, CD19 단일클론 항체로부터 유래된 vL 단편은 링커를 통해 돌연변이체 (KACIAH) 인간 TCRb 사슬의 불변 사슬에 부착되는 한편, FMC63 단일클론 항체로부터 유래된 vH 단편은 링커를 통해 돌연변이체 (CSDVP) 인간 TCRα 사슬의 불변 영역에 부착된다.
일부 구현예에서, SIR 폴리펩티드는 단일 사슬 가변 단편 (scFv)로서 발현된 항체로부터 유래하거나 이를 포함하고, T 세포 수용체 (예로, TCR-알파, TCR-베타1, TCR-베타2, preTCR-알파, pre-TCR-알파-Del48, TCR-감마 또는 TCR-델타의 불변 사슬의 불변 사슬, 이들의 변이체 또는 돌연변이체)의 두 개 불변 사슬의 NH2-말단에 별도로 연결되는 두 개 이상의 항원 결합 도메인을 갖는다. 일부 구현예에서, 인코딩된 SIR 분자의 두 개 (이상)의 항원 결합 도메인은 T 세포 수용체로부터 유래된 두 개의 불변 사슬 (예로, TCR-알파, TCR-베타1, TCR-베타2, preTCR-알파, pre-TCR-알파-Del48, TCR-감마 또는 TCR-델타의 불변 사슬의 불변 사슬)에 프레임에 맞추어 융합된 두 개의 사슬 가변 단편 (scFv)을 포함하는 뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩된다. 인코딩된 두 개의 scFv 단편은 동일한 항원 (예로 단일특이적 SIR) 또는 상이한 항원 (예로, 이중특이적 또는 다중특이적 SIR)을 표적할 수 있다. 단일특이적 SIR의 경우에, 두 개의 scFv는 동일한 아미노산 서열 또는 상이한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드로 인코딩될 수 있다. 또한, 두 개의 scFv가 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드로 인코딩되는 단일특이적 SIR의 경우에, 두 개의 동일한 scFV 폴리펩티드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열은 동일하거나 동일하지 않을 수 있다. 두 개의 scFv를 갖는 예시적인 단일특이적 SIR은 서열번호 1026로 예시된다. 이러한 SIR의 두 개의 항원 결합 도메인은 인간 CD19 항원을 표적하는 두 개의 상이한 단일클론 항체, CD19Bu12 및 FMC63로부터 유래된 scFv를 포함한다. 두 개의 scFv를 갖는 예시적인 다중특이적 SIR은 서열번호 1028로 예시된다. 이러한 SIR의 두 개의 항원 결합 도메인은 인간 CD19 및 CD20 항원을 각각 표적하는 두 개의 상이한 단일클론 항체, CD19Bu12 및 CD20-2F2로부터 유래된 scFv를 포함한다. 이러한 SIR의 예는 CD19 및 CD20을 표적하는 040716-B04 (CD8SP-CD19Bu12-scFv-V5-[hTCRb-KACIAH]-F-P2A-SP-CD20-2F2-scFv-Myc-[hTCRa-CSDVP]-F-F2A-PAC)로 예시되고, 상응하는 아미노산 서열은 서열번호 1028로 예시된다.
두 개의 결합 도메인을 갖는 예시적인 SIR은 서열번호 1028로 예시된 아미노산 서열을 갖는 CD19 및 CD20을 표적하는 040716-B04 (CD8SP-CD19Bu12-scFv-V5-[hTCRb-KACIAH]-F-P2A-SP-CD20-2F2-scFv-Myc-[hTCRa-CSDVP]-F-F2A-PAC)로 예시된다. 두 개의 scFv 폴리펩티드 단편은 동일한 항원 (예로 단일특이적 SIR) 또는 상이한 항원 (예로, 이중특이적 또는 다중특이적 SIR)을 표적할 수 있다. 단일특이적 SIR의 경우에, 두 개의 scFv는 동일한 아미노산 서열 또는 상이한 아미노산 서열을 갖을 수 있다. 두 개의 상이한 항원을 표적하는 예시적인 SIR은 서열번호 1028 및 1163로 예시된다. 특정 구현예에서, 두 개의 SIR 폴리펩티드의 항원 결합 도메인은 구조가 유사하다 (예로, 둘 다의 항원 결합 도메인이 scFv 또는 카멜리드 VHH 도메인 또는 어피바디 또는 vL 또는 vH임). 예를 들면, 제 1 SIR 폴리펩티드의 항원 결합 도메인은 Her2를 표적하는 카멜리드 VHH 도메인을 포함하고, 제 2 SIR 폴리펩티드의 항원 결합 도메인은 Her3을 표적하는 카멜리드 VHH 도메인을 포함한다. 둘 다의 항원 결합 도메인이 vL 사슬로 구성되는 SIR은 CD8SP-FMC63-11-vL-V5-[TCRb-KACIAH]-F-P2A-FMC63vL-Myc-[TCRa-CSDVP]-F-F2A-PAC이고, 서열번호 10474로 예시된다. 일 구현예에서, 두 개의 SIR 폴리펩티드의 항원 결합 도메인은 구조가 유사하지 않다 (예로, 제 1 항원 결합 도메인은 scFv이고, 제 2 항원 결합 도메인은 카멜리드 VHH임). 예시적인 이러한 SIR은 CD8SP-IL6R-304-vHH-V5-[hTCRb-KACIAH]-F-P2A-SP-FMC63-vL-Gly-Ser-Gly-링커-vH-MYC-[hTCRa-CSDVP]-F-F2A-PAC (서열번호 1166)이다. 특정 구현예에서, 제 1 SIR 폴리펩티드 (폴리펩티드 작용 단위 1)의 항원 결합 도메인은 CD123를 표적하는 카멜리드 VHH 도메인을 포함하고, 제 2 SIR 폴리펩티드 (폴리펩티드 작용 단위 2)의 항원 결합 도메인은 MPL을 표적하는 scFv를 포함한다.
일부 구현예에서, 인코딩된 SIR 폴리펩티드의 항원 결합 도메인은 상응하는 야생형 서열 또는 비-야생형 서열 항체, 단일 도메인 항체 (SDAB), vH 또는 vL 도메인, 카멜리드 VHH 도메인, 또는 다르핀, 어피바디, 어필린, 어드넥틴, 어피틴, 오바디, 레페바디, 파이노머, 알파바디, 어비머, 아트리머, 센티린, 프로넥틴, 안티칼린, 쿠니츠 도메인, 아미딜로 반복서열 단백질과 같은 비-면역글로불린 스캐폴드, 수용체 또는 리간드의 코돈 최적화된 뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩된다.
일부 구현예에서, SIR 폴리펩티드의 인코딩된 하나 이상의 항원 결합 도메인은 9개 이하의 아미노산이 임의의 다른 아미노산 잔기로 치환된 서열번호 2307 내지 2482 및 12042 내지 12159의 경쇄 가변 도메인 (vL 또는 VL) 아미노산 서열 또는 서열번호 2307 내지 2482 및 12042 내지 12159의 아미노산 서열과 80 내지 100% 동일성을 갖는 서열 또는 서열번호 2307 내지 2482 및 12042 내지 12159의 상보성 결정 영역 (CDR)과 98 내지 100% 동일성을 갖는 서열 중 임의의 하나 이상을 포함한다. 표 5는 본 발명에 사용된 예시적인 vL 도메인의 표적 항원, 명칭, 서열번호 (DNA), 서열번호 (PRT), CDR 1 내지 3의 서열번호 (PRT)를 도시한다.
일부 구현예에서, SIR 폴리펩티드의 인코딩된 하나 이상의 항원 결합 도메인은 9개 이하의 아미노산이 임의의 다른 아미노산 잔기로 치환된 서열번호 2506 내지 2680 및 12160 내지 12278의 중쇄 가변 도메인 (vH 또는 VH) 아미노산 서열 또는 서열번호 2506 내지 2680 및 12160 내지 12278의 아미노산 서열과 80 내지 100% 동일성을 갖는 서열 또는 서열번호 2506 내지 2680 및 12160 내지 12278의 상보성 결정 영역 (CDR)과 98 내지 100% 동일성을 갖는 서열 중 임의의 하나 이상을 포함한다. 표 5는 본 발명에 사용된 예시적인 vH 도메인의 표적항원, 명칭, 서열번호 (DNA), 서열번호 (PRT), CDR 1 내지 3의 서열번호 (PRT)를 도시한다. vH 단편의 명칭은 후자의 명칭에 기초하여 상응하는 vL 단편을 식별하는데 사용될 수 있다. 예를 들면, vH 단편 Alk-48-vH (서열번호 226)은 vL 단편 Alk-48-vL (서열번호 16)과 동일한 항체 및 scFv로부터 유래되고, 두 개의 성분은 ALK를 표적하는 scFv 또는 SIR을 제조하는데 함께 사용될 수 있다. 특정 경우에서, 표 5는 FMC63 (서열번호 30), FMC63-[2]-vL (서열번호 31) 및 FMC63-[3]-vL (서열번호 32)와 같은 번호가 이러지는 동일한 명칭을 갖는 두 개 이상의 vL 또는 vH 단편을 열거하고 있다. 이러한 경우에, 상기 FMC63 vL 사슬 중 어느 하나는 FMC63-vH 사슬 (서열번호 241 및 242) 중 어느 하나에 연결되어 FMC63-기반의 결합 도메인에 기초한 상응하는 SIR을 개발할 수 있다.
일부 구현예에서, SIR 폴리펩티드의 인코딩된 하나 이상의 항원 결합 도메인은 9개 이하의 아미노산이 임의의 다른 아미노산 잔기로 치환된 서열번호 2701 내지 2725 및 12279 내지 12294의 카멜리드 단일 도메인 항체 (vHH 또는 VHH) 아미노산 서열 또는 서열번호 2701 내지 2725 및 12279 내지 12294의 아미노산 서열과 80 내지 100% 동일성을 갖는 서열 또는 서열번호 2701 내지 2725 및 12279 내지 12294의 상보성 결정 영역 (CDR)과 98 내지 100% 동일성을 갖는 서열 중 임의의 하나 이상을 포함한다. 표 5는 본 발명에 사용된 예시적인 vHH 도메인의 표적 항원, 명칭 서열번호 (DNA) 및 서열번호 (PRT)를 도시한다.
일부 구현예에서, SIR 폴리펩티드의 인코딩된 하나 이상의 항원 결합 도메인은 9개 이하의 아미노산이 임의의 다른 아미노산 잔기로 치환된 서열번호 2728 내지 2732 및 12296 내지 12301의 비-면역글로불린 항원 결합 스캐폴드 아미노산 서열 또는 서열번호 2728 내지 2732 및 12296 내지 12301의 아미노산 서열과 80 내지 100% 동일성을 갖는 서열 또는 서열번호 2728 내지 2732 및 12296 내지 12301의 3개 상보성 결정 영역 (CDR)과 98 내지 100% 동일성을 갖는 서열 중 임의의 하나 이상을 포함한다. 표 6A는 본 발명에 사용된 예시적인 비-면역글로불린 항원 결합 스캐폴드의 표적 항원, 명칭 서열번호 (DNA) 및 서열번호 (PRT)를 도시한다.
일부 구현예에서, SIR 폴리펩티드의 인코딩된 하나 이상의 항원 결합 도메인은 19개 이하의 아미노산이 임의의 다른 아미노산 잔기로 치환된 서열번호 2736 내지 2747의 수용체 아미노산 서열 또는 서열번호 2736 내지 2747의 아미노산 서열과 80 내지 100% 동일성을 갖는 서열 중 임의의 하나 이상을 포함한다. 표 6A는 표적 항원, 서열번호 (DNA), 서열번호 (PRT) 및 명칭을 도시한다.
일부 구현예에서, SIR 폴리펩티드의 인코딩된 하나 이상의 항원 결합 도메인은 19개 이하의 아미노산이 임의의 다른 아미노산 잔기로 치환된 서열번호 2748의 자가항원 아미노산 서열 또는 서열번호 2748의 아미노산 서열과 80 내지 100% 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 표 6A는 표적 항원, 서열번호 (DNA), 서열번호 (PRT) 및 명칭을 도시한다.
일부 구현예에서, SIR 폴리펩티드의 인코딩된 하나 이상의 항원 결합 도메인은 19개 이하의 아미노산이 임의의 다른 아미노산 잔기로 치환된 서열번호 2758 내지 2768, 12359 내지 12361 및 18918의 리간드 아미노산 서열 또는 서열번호 2758 내지 2768, 12359 내지 12361 및 18918의 아미노산 서열과 80 내지 100% 동일성을 갖는 서열 중 임의의 하나 이상을 포함한다. 표 6A는 표적 항원, 서열번호 (DNA), 서열번호 (PRT) 및 명칭을 도시한다.
일부 구현예에서, SIR 폴리펩티드의 인코딩된 하나 이상의 항원 결합 도메인은 최대 18개이나 20개를 넘지 않는 아미노산이 임의의 다른 아미노산 잔기로 치환된 서열번호 2770 내지 2939, 12303 내지 12357 및 18162 내지 18224의 scFv 아미노산 서열 또는 서열번호 2770 내지 2939, 12303 내지 12357 및 18162 내지 18224의 아미노산 서열과 80 내지 100% 동일성을 갖는 서열 또는 서열번호 2770 내지 2939, 12303 내지 12357 및 18162 내지 18224의 6개 상보성 결정 영역 (CDR)과 98 내지 100% 동일성을 갖는 서열 중 임의의 하나 이상을 포함한다. 표 6B는 본 발명에 사용된 예시적인 scFv의 표적 항원, 서열번호 (DNA), 서열번호 (PRT), 명칭 및 아미노산 서열을 도시한다.
일부 구현예에서, SIR 폴리펩티드의 인코딩된 하나 이상의 항원 결합 도메인은 이러한 항원을 표적하는 항원 결합 부분, 예로 vL 및 vH 단편의 CDR 중 하나 이상을 포함한다. 상이한 항원을 표적하는 vL 및 vH 단편의 CDR 1 내지 3의 서열번호가 표 5에 열거되어 있다.
일부 구현예에서, SIR 폴리펩티드의 인코딩된 하나 이상의 항원 결합 도메인은 SIR 폴리펩티드를 포함하는 scFv의 항원 결합 부분, 예로 vL 및 vH 단편의 CDR 중 하나 이상을 포함한다. 상이한 항원을 표적하는 vL 및 vH 단편을 포함하는 scFv 단편의 CDR 1 내지 3의 서열번호가 표 5에 열거되어 있다. 상이한 항원을 표적하는 scFv 단편의 서열번호 (DNA) 및 서열번호 (PRT)는 표 6A에 열거되어 있고, 이들의 상응하는 CDR 1 내지 3의 서열은 당해 기술분야에 숙지된 방법에 의해 또는 표 5에 열거된 이들의 성분 vL 및 vH 단편의 CDR 1 내지 3의 서열번호로부터 결정될 수 있다.
일부 구현예에서, SIR 폴리펩티드의 인코딩된 하나 이상의 항원 결합 도메인은 이러한 항원을 표적하는 항원 결합 부분, 예로 vHH 단편의 CDR 중 하나 이상을 포함한다. 상이한 항원을 표적하는 vHH 단편의 서열번호는 표 5에 열거되어 있고, 이들의 상응하는 CDR 1 내지 3의 서열은 당해 기술분야에 숙지된 방법에 의해 결정될 수 있다.
일 구현예에서, SIR의 항원 결합 도메인은 이러한 표적 항원에 결합하는 것으로 알려진 수용체의 항원 결합 부분이다.
일부 구현예에서, SIR 폴리펩티드의 인코딩된 하나 이상의 항원 결합 도메인은 SIR 폴리펩티드를 포함하는 수용체의 항원 결합 부분 중 임의의 하나 이상을 포함한다.
일부 구현예에서, SIR 폴리펩티드의 인코딩된 하나 이상의 항원 결합 도메인은 SIR 폴리펩티드를 포함하는 리간드의 항원 결합 부분 중 임의의 하나 이상을 포함한다.
일부 구현예에서, SIR 폴리펩티드의 인코딩된 하나 이상의 항원 결합 도메인은 SIR 폴리펩티드를 포함하는 비-면역글로불린 스캐폴드의 항원 결합 부분 중 임의의 하나 이상을 포함한다.
또 다른 구현예에서, 본 발명은 표 7A 내지 7H에 기술된 상이한 표적 상에서 임의의 본 발명의 SIR과 동일한 에피토프에 결합하는 SIR을 제공한다 (예로, 임의의 본 발명의 SIR과 상이한 표적에 대한 결합을 교차-경쟁하는 능력을 갖는 SIR). 일부 구현예에서, 이들 SIR의 항원 결합 도메인은 SIR의 성분으로서 사용된 항체의 vL 단편, vH 단편 및/또는 scFv 단편으로부터 결정될 수 있다. 표 7A 내지 7H에 기술된 본 발명의 SIR에 의해 인식된 표적-에피토프를 결정하는 교차-경쟁 연구를 위한 기준 항체는 서열번호 2770 내지 2939, 12303 내지 12357 및 18162 내지 18224 (표 6B)에 나타낸 바와 같은 서열을 갖는 scFv이다. 예시적인 구현예에서, 서열번호 2770으로 예시되는 기준 scFv FMC63은 표 7A 내지 7H에 기술된 본 발명의 FMC63-기반의 SIR에 의해 인식된 표적-에피토프를 결정하는 교차-경쟁 연구에 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 표 7A 내지 7H에 기술된 본 발명의 SIR에 의해 인식된 표적-에피토프를 결정하는 교차-경쟁 연구를 위한 기준 vHH 단편은 서열번호 2701 내지 2725 및 12279 내지 12294 (표 5)에 나타낸 바와 같은 서열을 갖는 vHH 단편이다. 일부 구현예에서, 표 7A 내지 7H에 기술된 본 발명의 SIR에 의해 인식된 표적-에피토프를 결정하는 교차-경쟁 연구를 위한 기준 비-면역글로불린 항원 결합 스캐폴드는 서열번호 2728 내지 2732 및 12296 내지 12301 (표 6A)에 나타낸 바와 같은 서열을 갖는 비-면역글로불린 항원 결합 스캐폴드이다. 표 7A 내지 7H에 기술된 본 발명의 SIR에 의해 인식된 표적-에피토프를 결정하는 교차-경쟁 연구를 위한 기준 리간드는 서열번호 2758 내지 2968, 12359 내지 12361 및 18918 (표 6A)에 나타낸 바와 같은 서열을 갖는 리간드이다. 상이한 표적을 표적하는 SIR에 대한 교차-경쟁 연구를 위한 기준 SIR은 서열번호 3435 내지 3634, 13184 내지 13292 (표 7D) 및 서열번호 3855 내지 4051 및 13411 내지 13526 (표 7E)에 나타낸 바와 같은 서열을 갖는 SIR이다.
또 다른 구현예에서, MPL-표적하는 본 발명의 SIR (예로, 서열번호 3566 내지 3562, 13259, 및 13265 내지 13266)에 의해 인식된 표적-에피토프를 결정하는 교차-경쟁 연구를 위한 기준 scFv는 표 6B에 열거된 상응하는 scFv (예로, 서열번호 2871 내지 2878, 12318, 12326 내지12327)이다. 일 구현예에서, MPL-표적하는 본 발명의 SIR에 의해 인식된 표적-에피토프를 결정하는 교차-경쟁 연구를 위한 기준 scFv는 서열번호 2871 내지 2874로 예시된다.
또 다른 구현예에서, MPL-표적하는 본 발명의 SIR에 의해 인식된 표적-에피토프를 결정하는 교차-경쟁 연구를 위한 기준 리간드는 표 6A에 열거된 상응하는 리간드 (예로, 서열번호 2758 내지 2759)이다.
또 다른 구현예에서, MLP-표적하는 본 발명의 SIR에 의해 인식된 표적-에피토프를 결정하는 교차-경쟁 연구를 위한 기준 SIR은 표 7D 및 7E에 열거된 MPL-SIR (예로, 서열번호 3566 내지 3562, 13259 및 13265 내지 13266)이다.
일 구현예에서, MPL-표적하는 본 발명의 SIR은 펩티드 서열 -PWQDGPK- (서열번호 15784)에 상응하거나 이와 중첩하는 MPL-에피토프에 결합한다.
또 다른 구현예에서, CD19-표적하는 본 발명의 SIR (예로, 서열번호 33645 내지 3649, 13195 내지 13203, 13249 및 13267)에 의해 인식된 표적-에피토프를 결정하는 교차-경쟁 연구를 위한 기준 scFv는 표 6B에 열거된 상응하는 scFv (예로, 서열번호 2770 내지 2774, 12308, 12325 및 18162 내지 18170)이다. 일 구현예에서, CD19-표적하는 본 발명의 SIR에 의해 인식된 표적-에피토프를 결정하는 교차-경쟁 연구를 위한 기준 scFv는 서열번호 2771, 2772, 12308 및 1816로 예시된다.
또 다른 구현예에서, CD19-표적하는 본 발명의 SIR에 의해 인식된 표적-에피토프를 결정하는 교차-경쟁 연구를 위한 기준 SIR은 표 7A 내지 7H에 열거된 CD19-표적하는 SIR (예로, 서열번호 3645 내지 3649, 13195 내지 13203, 13249 및 13267)이다.
또 다른 구현예에서, CD20-표적하는 본 발명의 SIR (예로, 서열번호 3456 내지 3457, 13204 내지 13213)에 의해 인식된 표적-에피토프를 결정하는 교차-경쟁 연구를 위한 기준 scFv는 표 6B에 열거된 상응하는 scFv (예로, 서열번호 2787 내지 2788, 18177 내지 18187)이다. 일 구현예에서, CD20-표적하는 본 발명의 SIR에 의해 인식된 표적-에피토프를 결정하는 교차-경쟁 연구를 위한 기준 scFv는 서열번호 18182, 18185 및 2787로 예시된다.
또 다른 구현예에서, CD20-표적하는 본 발명의 SIR에 의해 인식된 표적-에피토프를 결정하는 교차-경쟁 연구를 위한 기준 SIR은 표 7A 내지 7H에 열거된 CD20-SIR (예로, 서열번호 3456 내지 3457, 13204 내지 13213)이다.
바람직한 구현예에서, CD20-표적하는 본 발명의 SIR은 -PAGIYAPI- (서열번호 18902), -FLKMESLNFIRAHTP- (서열번호 18903), -HFLKMESLNFIRAHTPY- (서열번호 18904), -YNAEPANPSEKNSPSTQY- (서열번호 18905), -YNAEPANPSEKNSPST- (서열번호 18906) 및 -YNCEPANPSEKNSP- (서열번호 18907) 중 하나 이상의 서열에 해당하는 에피토프에 결합한다.
또 다른 구현예에서, BCMA-표적하는 본 발명의 SIR (예로, 서열번호 3446 내지 3449, 3632 내지 3634, 13277 내지 13284)에 의해 인식된 표적-에피토프를 결정하는 교차-경쟁 연구를 위한 기준 scFv는 표 6B에 열거된 상응하는 scFv (예로, 서열번호 2780 내지 2783, 12337 내지 12344, 및 18174 내지 18176)이다. 일 구현예에서, BCMA-표적하는 본 발명의 SIR에 의해 인식된 표적-에피토프를 결정하는 교차-경쟁 연구를 위한 기준 scFv는 서열번호 2780, 2781, 18175 및 18176로 예시된다.
또 다른 구현예에서, BCMA-표적하는 본 발명의 SIR에 의해 인식된 표적-에피토프를 결정하는 교차-경쟁 연구를 위한 기준 SIR은 표 7A 내지 7H에 열거된 BCMA-SIR (예로, 서열번호 3446 내지 3449, 3632 내지 3634, 13277 내지 13284)이다.
바람직한 구현예에서, BCMA-표적하는 본 발명의 SIR은 서열번호 18908 내지 18912에 열거된 하나 이상의 서열에 해당하는 에피토프에 결합한다.
또 다른 구현예에서, CD22-표적하는 본 발명의 SIR (예로, 서열번호 3458 내지 3460, 13241 내지 13245, 13268)에 의해 인식된 표적-에피토프를 결정하는 교차-경쟁 연구를 위한 기준 scFv는 표 6B에 열거된 상응하는 scFv (예로, 서열번호 2789 내지 2791, 12320 내지 12324, 12330, 18188)이다. 일 구현예에서, CD22-표적하는 본 발명의 SIR에 의해 인식된 표적-에피토프를 결정하는 교차-경쟁 연구를 위한 기준 scFv는 서열번호 18188, 12330 및 12320로 예시된다.
또 다른 구현예에서, CD22-표적하는 본 발명의 SIR에 의해 인식된 표적-에피토프를 결정하는 교차-경쟁 연구를 위한 기준 SIR은 표 7A 내지 7H에 열거된 CD22-SIR (예로, 서열번호 3458 내지 3460, 13241 내지 13245, 13268)이다.
또 다른 구현예에서, CD123-표적하는 본 발명의 SIR (예로, 서열번호 2929, 3470, 13184 내지 13194)에 의해 인식된 표적-에피토프를 결정하는 교차-경쟁 연구를 위한 기준 scFv는 표 6B에 열거된 상응하는 scFv (예로, 서열번호 2801, 18196 내지 18206)이다. 일 구현예에서, CD123-표적하는 본 발명의 SIR에 의해 인식된 표적-에피토프를 결정하는 교차-경쟁 연구를 위한 기준 scFv는 서열번호 2929, 18196, 18197, 18200, 18202 및 18205로 예시된다.
또 다른 구현예에서, CD123-표적하는 본 발명의 SIR에 의해 인식된 표적-에피토프를 결정하는 교차-경쟁 연구를 위한 기준 SIR은 표 7A 내지 7H에 열거된 CD123-SIR (예로, 서열번호 3470, 13184 내지 13194)이다.
또 다른 구현예에서, CD33-표적하는 본 발명의 SIR (예로, 서열번호 3464, 3465, 13214 내지 13220)에 의해 인식된 표적-에피토프를 결정하는 교차-경쟁 연구를 위한 기준 scFv는 표 6B에 열거된 상응하는 scFv (예로, 서열번호 2795, 2796, 18189 내지 18194)이다. 일 구현예에서, CD33-표적하는 본 발명의 SIR에 의해 인식된 표적-에피토프를 결정하는 교차-경쟁 연구를 위한 기준 scFv는 서열번호 2795, 2796 및 18127로 예시된다.
또 다른 구현예에서, CD33-표적하는 본 발명의 SIR에 의해 인식된 표적-에피토프를 결정하는 교차-경쟁 연구를 위한 기준 SIR은 표 7A 내지 7H에 열거된 CD33-SIR (예로, 서열번호 3464, 3465, 13214 내지 13220)이다.
또 다른 구현예에서, CS1-표적하는 본 발명의 SIR (예로, 서열번호 3487 내지 3489, 13226 내지 1323)에 의해 인식된 표적-에피토프를 결정하는 교차-경쟁 연구를 위한 기준 scFv는 표 6B에 열거된 상응하는 scFv (예로, 서열번호 2817 내지 2819 및 18211 내지 18216)이다. 일 구현예에서, CS1-표적하는 본 발명의 SIR에 의해 인식된 표적-에피토프를 결정하는 교차-경쟁 연구를 위한 기준 scFv는 서열번호 2818, 18212, 18213, 18215 및 18216로 예시된다.
또 다른 구현예에서, CS1-표적하는 본 발명의 SIR에 의해 인식된 표적-에피토프를 결정하는 교차-경쟁 연구를 위한 기준 SIR은 표 7A 내지 7H에 열거된 CS1-SIR (예로, 서열번호 3487 내지 3489, 13226 내지 1323)이다.
또 다른 구현예에서, CLL1-표적하는 본 발명의 SIR (예로, 서열번호 3484, 3485, 13222 내지 13225)에 의해 인식된 표적-에피토프를 결정하는 교차-경쟁 연구를 위한 기준 scFv는 표 6B에 열거된 상응하는 scFv (예로, 서열번호 2814, 2815, 18207 내지 18210, 12345 내지 12346)이다.
또 다른 구현예에서, CLL1-표적하는 본 발명의 SIR에 의해 인식된 표적-에피토프를 결정하는 교차-경쟁 연구를 위한 기준 SIR은 표 7A 내지 7H에 열거된 CLL1-SIR (예로, 서열번호 3484, 3485, 13222 내지 13225)이다.
또 다른 구현예에서, 메소텔린-표적하는 본 발명의 SIR (예로, 서열번호 3554, 13287 및 13288)에 의해 인식된 표적-에피토프를 결정하는 교차-경쟁 연구를 위한 기준 scFv는 표 6B에 열거된 상응하는 scFv (예로, 서열번호 2870, 12352 및 12353)이다.
또 다른 구현예에서, 메소텔린-표적하는 본 발명의 SIR에 의해 인식된 표적-에피토프를 결정하는 교차-경쟁 연구를 위한 기준 SIR은 표 7A 내지 7H에 열거된 메소텔린-SIR (예로, 서열번호 3554, 13287 및 13288)이다.
또 다른 구현예에서, BST1/CD157-표적하는 본 발명의 SIR에 의해 인식된 표적-에피토프를 결정하는 교차-경쟁 연구를 위한 기준 scFv는 표 6B에 열거된 상응하는 scFv이다.
또 다른 구현예에서, BST1/CD157-표적하는 본 발명의 SIR에 의해 인식된 표적-에피토프를 결정하는 교차-경쟁 연구를 위한 기준 SIR은 표 7A 내지 7H에 열거된 BST1/CD157-SIR이다.
또 다른 구현예에서, DLL3-표적하는 본 발명의 SIR에 의해 인식된 표적-에피토프를 결정하는 교차-경쟁 연구를 위한 기준 scFv는 표 6B에 열거된 상응하는 scFv이다.
또 다른 구현예에서, DLL3-표적하는 본 발명의 SIR에 의해 인식된 표적-에피토프를 결정하는 교차-경쟁 연구를 위한 기준 SIR은 표 7A 내지 7H에 열거된 DLL3-SIR이다.
또 다른 구현예에서, PTK7-표적하는 본 발명의 SIR에 의해 인식된 표적-에피토프를 결정하는 교차-경쟁 연구를 위한 기준 scFv는 표 6B에 열거된 상응하는 scFv이다.
또 다른 구현예에서, PTK7-표적하는 본 발명의 SIR에 의해 인식된 표적-에피토프를 결정하는 교차-경쟁 연구를 위한 기준 SIR은 표 7A 내지 7H에 열거된 PTK7-SIR이다.
또 다른 구현예에서, IL13Ra2-표적하는 본 발명의 SIR에 의해 인식된 표적-에피토프를 결정하는 교차-경쟁 연구를 위한 기준 scFv는 표 6B에 열거된 상응하는 scFv이다.
또 다른 구현예에서, IL13Ra2-표적하는 본 발명의 SIR에 의해 인식된 표적-에피토프를 결정하는 교차-경쟁 연구를 위한 기준 SIR은 표 7A 내지 7H에 열거된 IL13Ra2-SIR이다.
또 다른 구현예에서, ROR1-표적하는 본 발명의 SIR에 의해 인식된 표적-에피토프를 결정하는 교차-경쟁 연구를 위한 기준 scFv는 표 6B에 열거된 상응하는 scFv이다.
또 다른 구현예에서, ROR1-표적하는 본 발명의 SIR에 의해 인식된 표적-에피토프를 결정하는 교차-경쟁 연구를 위한 기준 SIR은 표 7A 내지 7H에 열거된 ROR1-SIR이다.
또 다른 구현예에서, TCRgd-표적하는 본 발명의 SIR에 의해 인식된 표적-에피토프를 결정하는 교차-경쟁 연구를 위한 기준 scFv는 표 6B에 열거된 상응하는 scFv이다.
또 다른 구현예에서, TCRgd-표적하는 본 발명의 SIR에 의해 인식된 표적-에피토프를 결정하는 교차-경쟁 연구를 위한 기준 SIR은 표 7A 내지 7H에 열거된 TCRgd-SIR이다.
또 다른 구현예에서, TCRB1-표적하는 본 발명의 SIR에 의해 인식된 표적-에피토프를 결정하는 교차-경쟁 연구를 위한 기준 scFv는 표 6B에 열거된 상응하는 scFv이다.
또 다른 구현예에서, TCRB1-표적하는 본 발명의 SIR에 의해 인식된 표적-에피토프를 결정하는 교차-경쟁 연구를 위한 기준 SIR은 표 7A 내지 7H에 열거된 TCRB1-SIR이다.
또 다른 구현예에서, TCRB2-표적하는 본 발명의 SIR에 의해 인식된 표적-에피토프를 결정하는 교차-경쟁 연구를 위한 기준 scFv는 표 6B에 열거된 상응하는 scFv이다.
또 다른 구현예에서, TCRB2-표적하는 본 발명의 SIR에 의해 인식된 표적-에피토프를 결정하는 교차-경쟁 연구를 위한 기준 SIR은 표 7A 내지 7H에 열거된 TCRB2-SIR이다.
일부 구현예에서, gp100, MART, 티로시나제, hTERT, MUC1, CMV-pp65, HTLV1-Tax, HIV1-gag, NY-ESO, WT1, AFP, HPV-16-E7, PR1 및 Ras G12V를 표적하는 SIR은 MHC 클래스 I (예로, HLA-A201)과의 복합체로 표 7I에 도시된 표적 펩티드에 결합한다.
일 구현예에서, AFP/MHC I-표적하는 본 발명의 SIR에 의해 인식된 표적-에피토프를 결정하는 교차-경쟁 연구를 위한 기준 scFv는 서열번호 18171 및 18173로 예시된다.
일 구현예에서, WT1/MHC I-표적하는 본 발명의 SIR에 의해 인식된 표적-에피토프를 결정하는 교차-경쟁 연구를 위한 기준 scFv는 서열번호 2926 내지 2928로 예시된다.
일 구현예에서, ALK-표적하는 본 발명의 SIR에 의해 인식된 표적-에피토프를 결정하는 교차-경쟁 연구를 위한 기준 scFv는 서열번호 2777로 예시된다.
일 구현예에서, B7H4-표적하는 본 발명의 SIR에 의해 인식된 표적-에피토프를 결정하는 교차-경쟁 연구를 위한 기준 scFv는 서열번호 2934 및 2935로 예시된다.
일 구현예에서, CD30-표적하는 본 발명의 SIR에 의해 인식된 표적-에피토프를 결정하는 교차-경쟁 연구를 위한 기준 scFv는 서열번호 2792 및 2793로 예시된다.
일 구현예에서, CD138-표적하는 본 발명의 SIR에 의해 인식된 표적-에피토프를 결정하는 교차-경쟁 연구를 위한 기준 scFv는 서열번호 2802로 예시된다.
일 구현예에서, EGFRviii-표적하는 본 발명의 SIR에 의해 인식된 표적-에피토프를 결정하는 교차-경쟁 연구를 위한 기준 scFv는 서열번호 2826으로 예시된다.
일 구현예에서, FR1 (폴레이트 수용체 1)-표적하는 본 발명의 SIR에 의해 인식된 표적-에피토프를 결정하는 교차-경쟁 연구를 위한 기준 scFv는 서열번호 2833으로 예시된다.
또 다른 구현예에서, TROP2-, LAMP1-, CDH19-, CDH17-, CD70-, CD79b-, CDH6, TSHR-, ALK-, WT1/MHC 1, NY-ESO-1/MHC I, HIV1 외투 gp-, NYBR1, Lym1, Lym2, TSLRP-, 폴레이트 수용체 알파-, B7H4-, CD200R-, Igk-경쇄-, CD179a-, CD179b-, 크립토-, STEAP1-, hLiv1-, ILRAP-, 넥틴-4-, gpA33-, PSCA-, PSMA-, Muc1/MHC I, GFRa4-, EGFRviii-, EGFR-, Her2-, CSF2RA-, CLEC5A-, GPRC5D, Tn-Muc1-, FLT3-, PR1/MHC I-, AFP/MHC I- 및 HPV16-E7/MHC I-표적하는 본 발명의 SIR에 의해 인식된 표적-에피토프를 결정하는 교차-경쟁 연구를 위한 기준 scFv는 표 6B에 열거된 상응하는 scFv이다.
또 다른 구현예에서, TROP2-, LAMP1-, CDH19-, CDH17-, CD70-, CD79b-, CDH6, TSHR-, ALK-, WT1/MHC 1, NY-ESO-1/MHC I, HIV1 외투 당단백질-, NYBR1, Lym1, Lym2, TSLRP-, 폴레이트 수용체 알파-, B7H4-, CD200R-, Igk-경쇄-, CD179a-, CD179b-, 크립토-, STEAP1-, hLiv1-, ILRAP-, 넥틴-4-, gpA33-, PSCA-, PSMA-, Muc1/MHC I, GFRa4-, EGFRvⅢ-, EGFR-, Her2-, CSF2RA-, CLEC5A-, GPRC5D, Tn-Muc1-, FLT3-, PR1/MHC I-, AFP/MHC I- 및 HPV16-E7/MHC I-표적하는 본 발명의 SIR에 의해 인식된 표적-에피토프를 결정하는 교차-경쟁 연구를 위한 기준 SIR은 표 7A 내지 7H에 열거된 상응하는 SIR이다.
본 발명의 구현예에서, SIR 구조물은 scFv 도메인을 포함하고, 여기서 scFv는 서열번호 2300, 2301 또는 2302에 제공된 바와 같은 조건부 리더 서열이 선행하고, 서열번호 2981 내지 2986 중 어느 하나에 제공된 바와 같은 조건부 링커 서열 및 서열번호 3010 내지 3020, 서열번호 3022 내지 3044, 서열번호 3045 내지 3052에 제공된 바와 같은 T 세포 수용체 불변 사슬 (본원에 기술된 바와 같은 돌연변이체 및 변이체 포함)이 이어질 수 있고, 도메인은 연속적이고 동일한 리딩 프레임으로 단일 융합 단백질을 형성한다. 링커 서열가 SIR 구조물에 존재하거나 하지 않을 수 있다. 일 구현예에서, SIR은 두 개의 폴리펩티드 작용 단위를 포함하고, 이 경우에 두 개의 단위는 서열번호 3060 내지 3064에 제공된 바와 같은 절단가능한 링커에 의해 분리된다. 절단가능한 링커는 서열번호 3065와 같은 짧은 가요성 링커 (예로, SGSG) 및 서열번호 3066과 같은 퓨린 절단 부위 (예로, RAKR)가 선행할 수 있다. SIR의 폴리펩티드 작용 단위는 또한 IRES 서열에 의해 분리된 두 개의 상이한 폴리뉴클레오티드에 의해 인코딩될 수 있다. 대안적으로, SIR의 두 개의 폴리펩티드 작용 단위를 인코딩하는 두 개의 상이한 폴리뉴클레오티드는 두 개의 상이한 벡터에 의해 인코딩될 수 있다.
일 구현예에서, 예시적인 SIR 구조물은 리더 서열 (예로, 본원에 기술된 리더 서열), 세포외 항원 결합 도메인 (예로, 본원에 기술된 항원 결합 도메인), 조건부 링커 (예로, 본원에 기술된 링커 영역) 및 T 세포 수용체 불변 사슬 (예로, 본원에 기술된 T 세포 수용체 불변 사슬, 돌연변이체 및 변이체 포함)을 포함한다.
예를 들면, 본 발명의 SIR은 표 5 및 표 6A 및 6B에 확인된 임의의 항원 결합 서열과 같은 항원 결합 도메인에 연결된, 서열번호 2300, 2301 및 2302로부터 선택된 예시적인 리더 서열, 서열번호 3010 내지 3020, 3022 내지 3044, 3045 내지 3051 및 3052으로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함하는 T 세포 수용체 불변 사슬 도메인 (및 본원에 기술된 바와 같은 이들의 돌연변이체 및 변이체)에 연결된, 서열번호 2981 내지 2985 및 2986 (표 6D 역시 참조)로부터 선택된 조건부 링커를 포함할 수 있다. SIR은 T 세포 수용체 불변 사슬의 세포외 도메인 및 서열번호 3021 및 서열번호 3045에 제공된 바와 같은 CD3z의 세포외, 막통과 및 세포질 도메인 및 돌연변이체 및 변이체의 융합을 추가로 포함할 수 있다.
본원에 기술된 임의의 구현예에서, SIR 발현하는 효과기 세포는 상응하는 cTCR-발현하는 효과기 세포 (SIR의 항원 결합 도메인을 포함하는 cTCR, 예로 SIR의 항원 결합 도메인을 포함하는 scFv, vL 및/또는 vH 단편을 포함하는 cTCR을 이의 표면에 제시하는 효과기 세포와 같음)와 비교하여, 유사한 조건 하에 비교될 때 표적 항원에 대한 더 높은 결합을 보여준다. CD19을 표적하는 예시적인 SIR은 CD8SP-FMC63-vL-V5-[hTCRb-KACIAH]-F-P2A-SP-FMC63-vH-Myc-[hTCRa-CSDVP]-F-F2A-PAC (서열번호 1200)로 제시된다. CD19을 표적하는 상응하는 cTCR는 CD8SP-FMC63-vL-[hTCRb-WT]-F-P2A-SP-FMC63-vH-[hTCRa-WT]-F-F2A-PAC (서열번호 18280)로 제시된다. 본 발명의 여러 예시적인 cTCR의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열번호는 표 7A 및 7B에 제공되어 있다. 예를 들면, 일부 구현예에서, CD19을 표적하는 SIR 발현하는 효과기 세포는 유사한 조건 하에서 상응하는 cTCR-발현하는 효과기 세포와 비교하여 4℃에서 60분 동안 배양 이후에 CD19-ECD-GGSG-NLuc-AcV5 융합 단백질에 대한 더 높은 결합을 갖는다. 일부 구현예에서, SIR 발현하는 효과기 세포는 유사한 조건 하에서 상응하는 cTCR-발현하는 효과기 세포와 비교하여 표적 항원에 대한 더 높은 특이적 결합을 갖는다. SIR 발현하는 효과기 세포에 대한 표적 항원의 특이적 결합은 SIR 발현하는 효과기 세포로 획득된 값으로부터 대조군 효과기 세포로 획득된 결합 값을 차감함으로써 측정된다. 일부 구현예에서, 대조군 효과기 세포는 임의의 SIR을 발현하지 않는 모체 효과기 세포, 예로 형질도입되지 않은 T 세포이다. 대안의 구현예에서, 대조군 효과기 세포는 테스트 SIR이 의해 표적되는 항원이 아닌 항원을 표적하는 대조군 SIR을 발현하는 효과기 세포이다. CD19-SIR의 결합 활성을 비교할 예시적인 대조군 SIR은 CD8SP-MPL-161-vL-V5-[hTCRb-KACIAH]-F-P2A-SP-161-vH-Myc-[hTCRa-CSDVP]-F-F2A-PAC (서열번호 1322)이다. 일부 구현예에서, 표적 항원에 대한 SIR 발현하는 효과기 세포의 결합은 4℃에서 60분 배양 이후에 상응하는 cTCR-발현하는 효과기 세포의 결합보다 적어도 5, 10, 20, 30, 40, 50% 또는 100% 더 많다. 일부 구현예에서, 표적 항원에 대한 SIR 발현하는 효과기 세포의 결합은 상응하는 cTCR-발현하는 효과기 세포의 결합보다 적어도 1.25배 (예로, 1.5배, 2배, 5배 또는 10배) 더 많다. 일부 구현예에서, 표적 항원에 대한 SIR 발현하는 효과기 세포의 결합은 상응하는 cTCR-발현하는 효과기 세포의 결합보다 100,000배 (예로, 5000배, 10,000배 또는 50,000배) 미만으로 더 높다. 일부 구현예에서, 표적 항원에 대한 SIR 발현하는 효과기 세포의 결합은 상응하는 cTCR-발현하는 효과기 세포의 결합보다 약 1.25배 내지 약 100,000배 (예로, 약 5배 내지 약 50,000배, 약 10배 내지 약 10,000배 또는 약 100배 내지 약 1,000배 및 임의의 전술한 범위 사이의 임의의 값) 더 높다. 일부 구현예에서, 표적 항원에 대한 SIR 발현하는 효과기 세포의 결합은 4℃에서 60분 배양 이후에 유사한 조건 하에 상응하는 cTCR-발현하는 효과기 세포의 결합보다 적어도 1.25배 내지 약 100,000배 미만으로 더 높다. 일부 구현예에서, SIR 발현하는 효과기 세포는 SIR T 세포이다. 일부 구현예에서, SIR 발현하는 효과기 세포는 SIR 발현하는 Jurkat T 세포이다.
본원에 기술된 다른 구현예에서, SIR 발현하는 효과기 세포는 상응하는 CAR-발현하는 효과기 세포 (SIR의 항원 결합 도메인을 포함하는 CAR, 예로 SIR의 항원 결합 도메인을 포함하는 scFv를 포함하는 CAR를 이의 표면에 제시하는 효과기 세포와 같음)와 비교하여, 유사한 조건 하에 비교될 때 표적 항원에 대한 더 낮은 결합을 보여준다. CD19을 표적하는 예시적인 SIR은 CD8SP-FMC63-vL-V5-[hTCRb-KACIAH]-F-P2A-SP-FMC63-vH-Myc-[hTCRa-CSDVP]-F-F2A-PAC (서열번호 1200)로 제시된다. CD19을 표적하는 상응하는 CAR은 CD8SP-FMC63(vL-vH)-Myc-BBz-T2A-PAC (서열번호 4501)로 제시된다. 여러 예시적인 CAR의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열번호가 본원에 제공되어 있다. 예를 들면, 일부 구현예에서, CD19을 표적하는 SIR 발현하는 효과기 세포는 유사한 조건 하에서 상응하는 CAR-발현하는 효과기 세포와 비교하여 CD19-ECD-GGSG-NLuc-AcV5 융합 단백질에 대한 더 낮은 결합을 갖는다. 일부 구현예에서, 표적 항원에 대한 SIR 발현하는 효과기 세포의 결합은 4℃에서 60분 배양 이후에 유사한 조건 하에서 상응하는 CAR-발현하는 효과기 세포의 결합보다 적어도 5% (예로, 10, 20, 30, 40 또는 50% 또는 임의의 전술한 정수 사이의 임의의 값) 적다. 일부 구현예에서, 표적 항원에 대한 SIR 발현하는 효과기 세포의 결합은 상응하는 CAR-발현하는 효과기 세포의 결합보다 적어도 약 1.5배 (예로, 2배, 5배, 10배, 20 내지 100배, 100 내지 500배, 500 내지 1000배, 1000 내지10,000배, 10,000 내지 50,000배 또는 50,000 내지 100,000배 또는 이들 사이의 임의의 정수) 더 적다. 일부 구현예에서, 표적 항원에 대한 SIR 발현하는 효과기 세포의 결합은 4℃에서 60분 배양 이후에 유사한 조건 하에서 상응하는 CAR-발현하는 효과기 세포의 결합보다 약 1.25배 내지 약 100,000배 (또는 이들 사이의 임의의 값) 적다. 일부 구현예에서, SIR 발현하는 효과기 세포는 SIR T 세포이다. 일부 구현예에서, SIR 발현하는 효과기 세포는 SIR 발현하는 Jurkat T 세포이다.
본원에 기술된 다른 구현예에서, SIR 발현하는 효과기 세포는 상응하는 cTCR-발현하는 효과기 세포와 비교하여, 유사한 조건 하에 비교될 때 표적 항원에 대한 더 높은 결합을 보여주지만 상응하는 CAR-발현하는 효과기 세포와 비교하여, 표적 항원에 대한 더 낮은 결합을 보여준다. 예를 들면, 일부 구현예에서, CD19을 표적하는 SIR 발현하는 효과기 세포는 유사한 조건 하에서 상응하는 cTCR-발현하는 효과기 세포와 비교하여 CD19-ECD-GGSG-NLuc-AcV5에 대한 더 높은 결합을 갖지만, 상응하는 CAR-발현하는 효과기 세포와 비교하여 더 낮은 결합을 갖는다. 일부 구현예에서, 표적 항원에 대한 SIR 발현하는 효과기 세포의 결합은 4℃에서 60분 배양 이후에 유사한 조건 하에서 상응하는 cTCR-발현하는 효과기 세포의 결합보다 적어도 5% (예로, 10, 20, 30, 40, 50% 또는 100% 또는 이들 사이의 임의의 값) 많지만, 상응하는 CAR-발현하는 효과기 세포의 결합보다 적어도 5% (예로, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80 또는 90% 또는 이들 사이의 임의의 값) 적다. 일부 구현예에서, 표적 항원에 대한 SIR 발현하는 효과기 세포의 결합은 4℃에서 60분 배양 이후에 유사한 조건 하에서 상응하는 cTCR-발현하는 효과기 세포의 결합보다 적어도 1.25배 (예로, 1.5배, 2배, 5배 또는 10배 또는 이들 사이의 임의의 값) 많지만 상응하는 CAR-발현하는 효과기 세포의 결합보다 적어도 1.5배 (예로, 2배, 5배 또는 10배 또는 이들 사이의 임의의 값) 적다. 일부 구현예에서, SIR 발현하는 효과기 세포는 SIR T 세포이다. 일부 구현예에서, SIR 발현하는 효과기 세포는 SIR 발현하는 Jurkat T 세포이다.
본원에 기술된 다른 구현예에서, SIR은 효과기 세포에서 발현되고, 유사한 조건 하에서 비교될 때 상응하는 cTCR과 비교하여 더 높은 세포 표면 발현을 보여준다. CD19을 표적하는 예시적인 SIR은 CD8SP-FMC63-vL-V5-[hTCRb-KACIAH]-F-P2A-SP-FMC63-vH-Myc-[hTCRa-CSDVP]-F-F2A-PAC (서열번호 1200)로 제시된다. CD19을 표적하는 상응하는 cTCR는 CD8SP-FMC63-vL-[hTCRb-WT]-F-P2A-SP-FMC63-vH-[hTCRa-WT]-F-F2A-PAC (서열번호 18280)로 제시된다. 예를 들면, 일부 구현예에서, SIR의 세포 표면 발현은 APC-컨쥬게이션된 프로테인 L과 결합시킴으로써 측정된 바와 같이 유사한 조건 하에서 조사될 때 상응하는 cTCR의 발현보다 더 높다. 일부 구현예에서, SIR 발현하는 효과기 세포는 60분 배양 이후에 상응하는 cTCR-발현하는 효과기 세포와 비교하여 APC-컨쥬게이션된 프로테인 L에 대한 약 5% 이상 (약 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 또는 50% 이상과 같음, 이들 값 사이의 임의의 범위 포함)의 결합을 갖는다. 일부 구현예에서, SIR 발현하는 효과기 세포는 SIR T 세포이다. 효과기 세포의 표면 상에서의 SIR 및 상응하는 cTCR의 발현은 CD8SP-프로테인 L-GGSG-NLuc-4x플래그-x2STREP-8xHis 융합 단백질과의 결합 또는 SIR 및 cTCR의 세포외 도메인에 삽입된 에피토프 태그 (예로, MYC 태그)로의 염색을 포함하는 대안의 방법에 의해 측정될 수 있다.
본원에 기술된 다른 구현예에서, SIR은 효과기 세포에서 발현되고, 유사한 조건 하에서 비교될 때 상응하는 CAR과 비교하여 더 낮은 세포 표면 발현을 보여준다. CD19을 표적하는 예시적인 SIR은 CD8SP-FMC63-vL-V5-[hTCRb-KACIAH]-F-P2A-SP-FMC63-vH-Myc-[hTCRa-CSDVP]-F-F2A-PAC (서열번호 1200)로 제시된다. CD19을 표적하는 상응하는 CAR은 cTCR는 CD8SP-FMC63(vL-vH)-Myc-BBz-T2A-PAC (서열번호 4501)로 제시된다. 예를 들면, 일부 구현예에서, SIR의 세포 표면 발현은 APC-컨쥬게이션된 프로테인 L과 결합시킴으로써 측정된 바와 같이 유사한 조건 하에서 조사될 때 상응하는 CAR의 발현보다 더 낮다. 일부 구현예에서, SIR 발현하는 효과기 세포의 APC-프로테인 L에 대한 결합은 유사한 조건 하에서 상응하는 CAR-발현하는 효과기 세포의 결합보다 적어도 5% (예로, 10, 20, 30, 40 또는 50% 또는 이들 사이의 임의 값) 더 적다. 일부 구현예에서, SIR 발현하는 효과기 세포의 APC-프로테인 L에 대한 결합은 상응하는 CAR-발현하는 효과기 세포의 결합보다 적어도 5배 내지 약 1,000배 (또는 이들 사이의 임의 값) 더 적다. 일부 구현예에서, SIR 발현하는 효과기 세포의 APC-프로테인 L에 대한 결합은 상응하는 CAR-발현하는 효과기 세포의 결합보다 적어도 2배 내지 약 100배 (또는 이들 사이의 임의 값) 더 적다. 일부 구현예에서, SIR 발현하는 효과기 세포는 SIR T 세포이다. 일부 구현예에서, SIR 발현하는 효과기 세포는 SIR 발현하는 Jurkat T 세포이다. 효과기 세포의 표면 상에서의 SIR 및 상응하는 CAR의 발현은 CD8SP-프로테인 L-GGSG-NLuc-4x플래그-x2STREP-8xHis 융합 단백질과의 결합 또는 SIR 및 cTCR의 세포외 도메인서 비슷한 위치 (예로, N-말단 영역)에 삽입된 에피토프 태그 (예로, MYC 태그)로의 염색을 포함하는 대안의 방법에 의해 측정될 수 있다.
본원에 기술된 임의의 일부 이러한 구현예에서, SIR은 효과기 세포에서 발현되고, 유사한 조건 하에서 비교될 때 상응하는 cTCR과 비교하여 더 높은 세포 표면 발현을 보여주지만, 상응하는 CAR과 비교하여 더 낮은 발현을 보여준다. 예를 들면, 일부 구현예에서, SIR의 세포 표면 발현은 APC-컨쥬게이션된 프로테인 L과 결합시킴으로써 측정된 바와 같이 유사한 조건 하에서 조사될 때 상응하는 cTCR의 발현보다 더 높지만, 상응하는 CAR의 발현보다는 더 낮다. 일부 구현예에서, SIR 발현하는 효과기 세포는 60분 배양 이후에 상응하는 cTCR-발현하는 효과기 세포와 비교하여 APC-컨쥬게이션된 프로테인 L에 대한 약 5% 이상 (약 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40 또는 45% 이상과 같음, 이들 값 사이의 임의의 범위 포함)의 결합을 갖지만, 60분 배양 이후에 상응하는 CAR-발현하는 효과기 세포와 비교하여 APC-컨쥬게이션된 프로테인 L에 대한 약 50% 이하 (약 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15, 10, 5, 4, 3, 2 또는 1% 이하와 같음, 이들 값 사이의 임의의 범위 포함)의 결합을 갖는다. 일부 구현예에서, SIR 발현하는 효과기 세포는 SIR T 세포이다.
본원에 기술된 다른 구현예에서, SIR 발현하는 효과기 세포는 상응하는 cTCR-발현하는 효과기 세포 (SIR의 항원 결합 도메인을 포함하는 cTCR, 예로 SIR의 항원 결합 도메인을 포함하는 scFv, vL 및/또는 vH 단편을 포함하는 cTCR을 이의 표면에 제시하는 효과기 세포와 같음)와 비교하여, 유사한 조건 하에 비교될 때 표적 항원을 발현하는 세포에 대한 더 높은 세포독성을 보여준다. CD19을 표적하는 예시적인 SIR은 CD8SP-FMC63-vL-V5-[hTCRb-KACIAH]-F-P2A-SP-FMC63-vH-Myc-[hTCRa-CSDVP]-F-F2A-PAC (서열번호 1200)로 제시된다. CD19을 표적하는 상응하는 cTCR는 CD8SP-FMC63-vL-[hTCRb-WT]-F-P2A-SP-FMC63-vH-[hTCRa-WT]-F-F2A-PAC (서열번호 18280)로 제시된다. 본 발명의 여러 예시적인 SIR 및 cTCR의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열번호는 표 7A 및 7D에 제공되어 있다. 예를 들면, 일부 구현예에서, CD19을 표적하는 SIR 발현하는 효과기 세포는 유사한 조건 하에서 상응하는 cTCR-발현하는 효과기 세포와 비교하여 37℃에서 4시간 내지 96시간 공동배양 이후에 RAJI-GLuc 세포에 대한 더 높은 세포독성을 보여준다. 일부 구현예에서, SIR 발현하는 효과기 세포는 유사한 조건 하에서 상응하는 cTCR-발현하는 효과기 세포와 비교하여 표적 항원을 발현하는 세포에 대한 더 높은 특이적 세포독성을 갖는다. SIR 발현하는 효과기 세포의 특이적 세포독성은 SIR 발현하는 효과기 세포로 획득된 값으로부터 대조군 효과기 세포로 획득된 세포독성 값을 차감함으로써 측정된다. 일부 구현예에서, 대조군 효과기 세포는 임의의 SIR을 발현하지 않는 모체 효과기 세포, 예로 형질도입되지 않은 T 세포이다. 대안의 구현예에서, 대조군 효과기 세포는 테스트 SIR이 아닌 항원을 표적하는 대조군 SIR을 발현하는 효과기 세포이다. 예를 들면, CD19-SIR의 세포독 활성을 비교할 예시적인 대조군 SIR은 CD8SP-MPL-161-vL-V5-[hTCRb-KACIAH]-F-P2A-SP-161-vH-Myc-[hTCRa-CSDVP]-F-F2A-PAC (서열번호 1322)이다. 일부 구현예에서, 표적 항원-발현하는 세포 (예로, 표적 세포)에 대한 SIR 발현하는 효과기 세포의 세포독성은 37℃에서 4시간 내지 96시간 공동배양 이후에 상응하는 cTCR-발현하는 효과기 세포의 세포독성보다 적어도 5, 10, 20, 30, 40, 50% 또는 100% 이상이다. 일부 구현예에서, 표적 세포에 대한 SIR 발현하는 효과기 세포의 세포독성은 상응하는 cTCR-발현하는 효과기 세포의 세포독성보다 적어도 1.25배, 1.5배, 2배, 5배 또는 10배 이상이다. 일부 구현예에서, SIR 발현하는 효과기 세포는 SIR T 세포이다.
본원에 기술된 임의의 전술한 구현예의 또 다른 또는 추가의 구현예에서, SIR 발현하는 효과기 세포는 상응하는 cTCR-발현하는 효과기 세포 (SIR의 항원 결합 도메인을 포함하는 cTCR, 예로 SIR의 항원 결합 도메인을 포함하는 scFv, vL 및/또는 vH 단편을 포함하는 cTCR을 이의 표면에 제시하는 효과기 세포와 같음)와 비교하여, 유사한 조건 하에 비교될 때 표적 항원을 발현하는 세포에 대한 더 높은 생체내 활성을 보여준다. CD19을 표적하는 예시적인 SIR은 CD8SP-FMC63-vL-V5-[hTCRb-KACIAH]-F-P2A-SP-FMC63-vH-Myc-[hTCRa-CSDVP]-F-F2A-PAC (서열번호 1200)로 제시된다. CD19을 표적하는 상응하는 cTCR는 CD8SP-FMC63-vL-[hTCRb-WT]-F-P2A-SP-FMC63-vH-[hTCRa-WT]-F-F2A-PAC (서열번호 18280)로 제시된다. 본 발명의 여러 예시적인 SIR 및 cTCR의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열번호는 표 7A 및 7D에 제공되어 있다. 예를 들면, 일부 구현예에서, CD19을 표적하는 SIR 발현하는 효과기 세포는 유사한 조건 하에서 상응하는 cTCR-발현하는 효과기 세포와 비교하여 NSG 마우스 이종이식 모델에서 RAJI-GLuc 세포에 대한 더 높은 생체내 활성을 보여준다. 일부 구현예에서, SIR 발현하는 효과기 세포는 유사한 조건 하에서 상응하는 cTCR-발현하는 효과기 세포와 비교하여 표적 항원을 발현하는 세포에 대한 더 높은 생체내 활성을 갖는다. SIR 발현하는 효과기 세포의 생체내 활성은 SIR 발현하는 효과기 세포로 획득된 값으로부터 대조군 효과기 세포로 획득된 생체내 활성 (예로, 종양 감소 또는 FLuc 발현하는 종양으로부터 획득된 생체발광 값의 감소)을 차감함으로써 측정된다. 일부 구현예에서, 대조군 효과기 세포는 임의의 SIR을 발현하지 않는 모체 효과기 세포, 예로 형질도입되지 않은 T 세포이다. 대안의 구현예에서, 대조군 효과기 세포는 테스트 SIR에 의해 표적된 항원이 아닌 항원을 표적하는 대조군 SIR을 발현하는 효과기 세포이다. 예를 들면, CD19-SIR의 생체내 활성을 비교할 예시적인 대조군 SIR은 CD8SP-MPL-161-vL-V5-[hTCRb-KACIAH]-F-P2A-SP-161-vH-Myc-[hTCRa-CSDVP]-F-F2A-PAC (서열번호 1322)이다. 일부 구현예에서, NSG 마우스 이종이식 모델에서 표적 항원-발현하는 세포 (예로, 표적 세포)에 대한 SIR 발현하는 효과기 세포의 생체내 활성은 상응하는 cTCR-발현하는 효과기 세포의 생체내 활성보다 적어도 5, 10, 20, 30, 40, 50% 또는 100% 이상이다. 일부 구현예에서, 표적 세포에 대한 SIR 발현하는 효과기 세포의 생체내 활성은 상응하는 cTCR-발현하는 효과기 세포의 생체내 활성보다 적어도 1.25배, 1.5배, 2배, 5배 또는 10배 이상이다. 일부 구현예에서, SIR 발현하는 효과기 세포는 SIR T 세포이다. 일부 구현예에서, SIR 발현하는 효과기 세포의 생체내 활성은 생존의 향상 또는 캘리퍼를 사용하여 측정된 바와 같이 종양 부피의 감소와 같은 다른 방법에 의해 측정된다.
본원에 기술된 임의의 전술한 구현예의 또 다른 또는 추가의 구현예에서, SIR 발현하는 효과기 세포는 상응하는 cTCR-발현하는 효과기 세포 (SIR의 항원 결합 도메인을 포함하는 cTCR, 예로 SIR의 항원 결합 도메인을 포함하는 scFv, vL 및/또는 vH 단편을 포함하는 cTCR을 이의 표면에 제시하는 효과기 세포와 같음)와 비교하여, 유사한 조건 하에 비교될 때 이들의 표적 세포 (예로, 이들의 표적 항원을 발현하는 세포)와 공동배양될 때 더 높은 TNFα 생산을 보여준다. CD19을 표적하는 예시적인 SIR은 CD8SP-FMC63-vL-V5-[hTCRb-KACIAH]-F-P2A-SP-FMC63-vH-Myc-[hTCRa-CSDVP]-F-F2A-PAC (서열번호 1200)로 제시된다. CD19을 표적하는 상응하는 cTCR는 CD8SP-FMC63-vL-[hTCRb-WT]-F-P2A-SP-FMC63-vH-[hTCRa-WT]-F-F2A-PAC (서열번호 18280)로 제시된다. 본 발명의 여러 예시적인 SIR 및 cTCR의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열번호는 표 7A 및 7D에 제공되어 있다. 예를 들면, 일부 구현예에서, CD19을 표적하는 SIR 발현하는 효과기 세포는 유사한 조건 하에서 상응하는 cTCR-발현하는 효과기 세포와 비교하여 Nalm6 표적 세포와 37℃에서 4시간 내지 96시간 동안 공동배양될 때 ELISA에 의해 측정된 바와 같은 더 높은 TNFα 생산을 갖는다. 일부 구현예에서, SIR 발현하는 효과기 세포는 유사한 조건 하에서 상응하는 cTCR-발현하는 효과기 세포와 비교하여 더 높은 배수-유도된 TNFα 생산을 갖는다. SIR 발현하는 효과기 세포의 배수-유도된 TNFα 생산은 SIR 발현하는 효과기 세포가 단독으로 배양될 때 획득된 TNFα 값으로부터 SIR 발현하는 효과기 세포가 이들의 표적 세포와 공동배양될 때 획득된 TNFα 수준을 나눔으로써 측정된다. 일부 구현예에서, SIR 발현하는 효과기 세포는 유사한 조건 하에서 상응하는 cTCR-발현하는 효과기 세포와 비교하여 이들의 표적 세포와 공동배양될 때 더 높은 특이적 TNFα 생산을 갖는다. 이의 표적 세포에 노출될 때 SIR 발현하는 효과기 세포의 특이적 TNFα 생산은 유사한 조건 하에서 37℃에서 4시간 내지 96시간 동안 표적 세포와 공동배양될 때 SIR 발현하는 효과기 세포로 획득된 값으로부터 대조군 효과기 세포로 획득된 TNFα 값을 차감함으로써 측정된다. 일부 구현예에서, 대조군 효과기 세포는 임의의 SIR을 발현하지 않는 모체 효과기 세포, 예로 형질도입되지 않은 T 세포이다. 대안의 구현예에서, 대조군 효과기 세포는 테스트 SIR에 의해 표적된 항원이 아닌 항원을 표적하는 대조군 SIR을 발현하는 효과기 세포이다. CD19-SIR의 결합 활성을 비교할 예시적인 대조군 SIR은 CD8SP-MPL-161-vL-V5-[hTCRb-KACIAH]-F-P2A-SP-161-vH-Myc-[hTCRa-CSDVP]-F-F2A-PAC (서열번호 1322)이다. 일부 구현예에서, 37℃에서 24시간 배양 이후에 표적 항원에 대한 SIR 발현하는 효과기 세포의 특이적 TNFα 생산은 상응하는 cTCR-발현하는 효과기 세포의 특이적 TNFα 생산보다 적어도 5, 10, 20, 30, 40, 50% 또는 100% 더 많다. 일부 구현예에서, SIR 발현하는 효과기 세포의 특이적 TNFα 생산은 상응하는 cTCR-발현하는 효과기 세포의 특이적 TNFα 생산보다 적어도 1.25배, 1.5배, 2배, 5배 또는 10배 더 많다. 일부 구현예에서, SIR 발현하는 효과기 세포의 특이적 TNFα 생산은 상응하는 cTCR-발현하는 효과기 세포의 특이적 TNFα 생산보다 100,000배 미만으로 더 많다. 일부 구현예에서, SIR 발현하는 효과기 세포의 특이적 TNFα 생산은 유사한 조건 하에서 상응하는 cTCR-발현하는 효과기 세포의 특이적 TNFα 생산보다 적어도 1.25배, 1.5배, 2배, 5배 또는 10배 더 많지만, 유사한 조건 하에서 상응하는 cTCR-발현하는 효과기 세포의 특이적 TNFα 생산보다 100,000배 미만 (예로, 50,000배, 10,000배 또는 1,000배 미만)으로 더 많다. 일부 구현예에서, SIR 발현하는 효과기 세포는 SIR T 세포이다.
본원에 기술된 임의의 전술한 구현예의 또 다른 또는 추가의 구현예에서, SIR 발현하는 효과기 세포는 상응하는 cTCR-발현하는 효과기 세포 (SIR의 항원 결합 도메인을 포함하는 cTCR, 예로 SIR의 항원 결합 도메인을 포함하는 scFv, vL 및/또는 vH 단편을 포함하는 cTCR을 이의 표면에 제시하는 효과기 세포와 같음)와 비교하여, 유사한 조건 하에 비교될 때 이들의 표적 세포 (예로, 이들의 표적 항원을 발현하는 세포)와 공동배양될 때 더 높은 IL2 생산을 보여준다. CD19을 표적하는 예시적인 SIR은 CD8SP-FMC63-vL-V5-[hTCRb-KACIAH]-F-P2A-SP-FMC63-vH-Myc-[hTCRa-CSDVP]-F-F2A-PAC (서열번호 1200)로 제시된다. CD19을 표적하는 상응하는 cTCR는 CD8SP-FMC63-vL-[hTCRb-WT]-F-P2A-SP-FMC63-vH-[hTCRa-WT]-F-F2A-PAC (서열번호 18280)로 제시된다. 본 발명의 여러 예시적인 SIR 및 cTCR의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열번호는 표 7A 및 7D에 제공되어 있다. 예를 들면, 일부 구현예에서, CD19을 표적하는 SIR 발현하는 효과기 세포는 유사한 조건 하에서 상응하는 cTCR-발현하는 효과기 세포와 비교하여 Nalm6 표적 세포와 37℃에서 4시간 내지 96시간 동안 공동배양될 때 ELISA에 의해 측정된 바와 같은 더 높은 IL2 생산을 갖는다. 일부 구현예에서, SIR 발현하는 효과기 세포는 유사한 조건 하에서 상응하는 cTCR-발현하는 효과기 세포와 비교하여 더 높은 배수-유도된 IL2 생산을 갖는다. SIR 발현하는 효과기 세포의 배수-유도된 IL2 생산은 SIR 발현하는 효과기 세포가 단독으로 배양될 때 획득된 IL2 값으로부터 SIR 발현하는 효과기 세포가 이들의 표적 세포와 공동배양될 때 획득된 IL2 수준을 나눔으로써 측정된다. 일부 구현예에서, SIR 발현하는 효과기 세포는 유사한 조건 하에서 상응하는 cTCR-발현하는 효과기 세포와 비교하여 이들의 표적 세포와 공동배양될 때 더 높은 특이적 IL2 생산을 갖는다. 이의 표적 세포에 노출될 때 SIR 발현하는 효과기 세포의 특이적 IL2 생산은 유사한 조건 하에서 37℃에서 4시간 내지 96시간 동안 표적 세포와 공동배양될 때 SIR 발현하는 효과기 세포로 획득된 값으로부터 대조군 효과기 세포로 획득된 IL2 값을 차감함으로써 측정된다. 일부 구현예에서, 대조군 효과기 세포는 임의의 SIR을 발현하지 않는 모체 효과기 세포, 예로 형질도입되지 않은 T 세포이다. 대안의 구현예에서, 대조군 효과기 세포는 테스트 SIR에 의해 표적된 항원이 아닌 항원을 표적하는 대조군 SIR을 발현하는 효과기 세포이다. CD19-SIR의 결합 활성을 비교할 예시적인 대조군 SIR은 CD8SP-MPL-161-vL-V5-[hTCRb-KACIAH]-F-P2A-SP-161-vH-Myc-[hTCRa-CSDVP]-F-F2A-PAC (서열번호 1322)이다. 일부 구현예에서, 37℃에서 24시간 배양 이후에 표적 항원에 대한 SIR 발현하는 효과기 세포의 특이적 IL2 생산은 상응하는 cTCR-발현하는 효과기 세포의 특이적 IL2 생산보다 적어도 5, 10, 20, 30, 40, 50% 또는 100% 더 많다. 일부 구현예에서, SIR 발현하는 효과기 세포의 특이적 IL2 생산은 상응하는 cTCR-발현하는 효과기 세포의 특이적 IL2 생산보다 적어도 1.25배, 1.5배, 2배, 5배 또는 10배 더 많다. 일부 구현예에서, SIR 발현하는 효과기 세포의 특이적 IL2 생산은 상응하는 cTCR-발현하는 효과기 세포의 특이적 IL2 생산보다 100,000배 미만으로 더 많다. 일부 구현예에서, SIR 발현하는 효과기 세포의 특이적 IL2 생산은 유사한 조건 하에서 상응하는 cTCR-발현하는 효과기 세포의 특이적 IL2 생산보다 적어도 1.25배, 1.5배, 2배, 5배 또는 10배 더 많지만, 유사한 조건 하에서 상응하는 cTCR-발현하는 효과기 세포의 특이적 IL2 생산보다 100,000배 미만 (예로, 50,000배, 10,000배 또는 1,000배 미만)으로 더 많다. 일부 구현예에서, SIR 발현하는 효과기 세포는 SIR T 세포이다. 일부 구현예에서, SIR 발현하는 효과기 세포는 SIR 발현하는 Jurkat T 세포이다.
본원에 기술된 임의의 전술한 구현예의 또 다른 또는 추가의 구현예에서, SIR 발현하는 효과기 세포는 상응하는 CAR-발현하는 효과기 세포 (SIR의 항원 결합 도메인을 포함하는 CAR, 예로 SIR의 항원 결합 도메인을 포함하는 scFv, vL 및/또는 vH 단편을 포함하는 CAR을 이의 표면에 제시하는 효과기 세포와 같음)와 비교하여, 유사한 조건 하에 비교될 때 이들의 표적 세포 (예로, 이들의 표적 항원을 발현하는 세포)와 공동배양될 때 더 높은 TNFα 및/또는 IL2 생산을 보여준다. CD19을 표적하는 예시적인 SIR은 CD8SP-FMC63-vL-V5-[hTCRb-KACIAH]-F-P2A-SP-FMC63-vH-Myc-[hTCRa-CSDVP]-F-F2A-PAC (서열번호 1200)로 제시된다. 예를 들면, 일부 구현예에서, CD19을 표적하는 SIR 발현하는 효과기 세포는 유사한 조건 하에서 상응하는 cTCR-발현하는 효과기 세포와 비교하여 Nalm6 표적 세포와 37℃에서 4시간 내지 96시간 동안 공동배양될 때 ELISA에 의해 측정된 바와 같은 더 높은 TNFα 및/또는 IL2 생산을 갖지만, 상응하는 CAR-발현하는 효과기 세포와 비교하여 더 낮은 TNFα 및/또는 IL2 생산을 갖는다. 일부 구현예에서, SIR 발현하는 효과기 세포는 유사한 조건 하에서 상응하는 cTCR-발현하는 효과기 세포와 비교하여 더 높은 배수-유도된 TNFα 및/또는 IL2 생산을 갖지만, 상응하는 CAR-발현하는 효과기 세포와 비교하여 더 낮은 배수-유도된 TNFα 및/또는 IL2 생산을 갖는다. 일부 구현예에서, SIR 발현하는 효과기 세포는 유사한 조건 하에서 상응하는 cTCR-발현하는 효과기 세포와 비교하여 이들의 표적 세포와 공동배양될 때 더 높은 특이적 TNFα 및/또는 IL2 생산을 갖지만, 상응하는 CAR-발현하는 효과기 세포와 비교하여 더 낮은 특이적 TNFα 및/또는 IL2 생산을 갖는다. 일부 구현예에서, 37℃에서 24시간 배양 이후에 표적 항원에 대한 SIR 발현하는 효과기 세포의 특이적 TNFα 및/또는 IL2 생산은 상응하는 cTCR-발현하는 효과기 세포의 특이적 TNFα 및/또는 IL2 생산보다 적어도 5, 10, 20, 30, 40, 50% 또는 100% 더 많지만, 상응하는 CAR-발현하는 효과기 세포의 특이적 TNFα 및/또는 IL2 생산보다 적어도 5, 10, 20, 30, 40, 50% 또는 100% 더 적다. 일부 구현예에서, SIR 발현하는 효과기 세포의 특이적 TNFα 및/또는 IL2 생산은 유사한 조건 하에서 상응하는 cTCR-발현하는 효과기 세포의 특이적 TNFα 및/또는 IL2 생산보다 적어도 1.25배, 1.5배, 2배, 5배 또는 10배 더 많지만, 상응하는 CAR-발현하는 효과기 세포의 특이적 TNFα 및/또는 IL2 생산보다 적어도 1.25배, 1.5배, 2배, 5배 또는 10배 더 적다. 일부 구현예에서, SIR 발현하는 효과기 세포는 SIR T 세포이다. 일부 구현예에서, SIR 발현하는 효과기 세포는 SIR 발현하는 Jurkat T 세포이다.
본원에 기술된 임의의 구현예에서, 하나의 유형의 SIR을 발현하는 효과기 세포는 유사한 조건 하에서 비교될 때 상이한 유형의 SIR을 발현하는 효과기 세포 (제 1 SIR이나 상이한 TCR 사슬을 갖는 SIR의 항원 결합 도메인을 포함하는 SIR, 예로 제 1 SIR이나 상이한 TCR 사슬을 갖는 SIR의 항원 결합 도메인을 포함하는 scFv, vL 및/또는 vH 단편을 포함하는 SIR을 이의 표면에 제시하는 효과기 세포와 같음)와 비교하여 다양한 성질을 나타낸다. 표 7A 내지 7C는 상이한 유형의 예시적인 SIR의 서열번호를 제공한다. SIR은 설계상 모듈화되어, 추가적인 SIR 유형이 당업자라면 하나의 모듈을 또 다른 모듈로 대체함으로써 생성될 수 있다. 상이한 유형의 SIR이 면역 효과기 세포에서 발현될 때 다양성을 나타낼 수 있는 예시적인 성질은 이에 제한되는 것은 아니지만, 결합 친화도, 세포-표면 발현, 세포독성, 사이토카인 생산, 세포 증식 말단 분화, 소모 및 생체내 생물학적 활성을 포함한다. 예시적인 구현예에서, FMC63 기반의 CD19-표적하는 도메인을 포함하는 SIR1 (서열번호 1200)를 발현하는 효과기 세포는 유사한 조건 하에서 조사될 때, 둘 다의 SIR 유형이 TRAC (TCR 알파 불변 사슬) 게놈 좌위에 표적되어 사이한 SIR 구조물의 무작위 도입 부위로 인한 발현의 임의의 분산을 배제할 때 CD19 표적하는 SIR2 (서열번호 1410) 또는 SIR3 (서열번호 4531)를 발현하는 상응하는 효과기 세포와 비교하여, 4℃에서 60분 배양 이후에 CD19-ECD-GGSG-NLuc-AcV5 융합 단백질에 더 높은 결합을 갖는다. 일부 구현예에서, 하나의 유형의 SIR (예로, SIR1)을 발현하는 효과기 세포의 표적 항원 결합은 유사한 조건 하에서 조사될 때, 둘 다의 SIR 유형이 TRAC (TCR 알파 불변 사슬) 게놈 좌위에 표적될 때 동일한 결합 도메인을 포함하는 상이한 유형의 SIR (예로, SIR2)을 발현하는 효과기 세포의 표적 항원 결합보다, 4℃에서 60분 배양 이후에 적어도 5, 10, 20, 30, 40, 50% 또는 100% 이상이다. 일부 구현예에서, 동일한 결합 도메인을 포함하는 상이한 유형의 SIR (예로, SIR1, SIR2 및 SIR3 등)을 발현하는 효과기 세포의 표적 항원 결합은 유사한 조건 하에서 조사될 때, 둘 다의 SIR 유형이 TRAC (TCR 알파 불변 사슬) 게놈 좌위에 표적될 때, 4℃에서 60분 배양 이후에 5배, 10배, 20배, 50배 또는 100배 이상으로 변화한다. 게놈 삽입물을 특이적 게놈 좌위에 표적하는 기법은 당해 기술분야에서 숙지되어 있다. 일부 구현예에서, 동일한 결합 도메인을 포함하는 상이한 유형의 SIR (예로, SIR1, SIR2 및 SIR3 등)을 발현하는 효과기 세포의 표적 항원 결합은 유사한 조건 하에서 조사될 때, 둘 다의 SIR 유형이 TRAC (TCR 알파 불변 사슬) 게놈 좌위에 표적될 때, 4℃에서 60분 배양 이후에 5배, 10배, 20배, 50배 또는 100배 이상으로 변화한다. 일부 구현예에서, 동일한 결합 도메인을 포함하는 상이한 유형의 SIR (예로, SIR1, SIR2 및 SIR3 등)을 발현하는 효과기 세포의 표적 항원 결합에서의 표준 편차는 유사한 조건 하에서 조사될 때, 상이한 SIR 유형 및 cTCR이 TRAC 좌위에 표적될 때, 상응하는 cTCR을 발현하는 효과기 세포의 독립적으로 단리된 집단의 표적 항원 결합에서의 표준 편차와 비교하여 4℃에서 60분 배양 이후에 5배, 10배, 20배, 50배 또는 100배 이상이다. 본 발명의 다른 구현예에서, 동일한 결합 도메인을 포함하는 상이한 유형의 SIR (예로, SIR1, SIR2 및 SIR3 등)을 발현하는 효과기 세포의 세포독성에서의 표준 편차는 각각의 SIR 유형 및 cTCR이 TRAC 좌위에 삽입될 때, 상응하는 cTCR을 발현하는 효과기 세포의 독립적으로 단리된 집단의 세포독성에서의 표준 편차와 비교하여 4℃에서 60분 배양 이후에 5배, 10배, 20배, 50배 또는 100배 이상이다. 표준 편차는 분산의 제곱근이고, 당해 기술분야에서 숙지된 방법에 의해 측정될 수 있다. 일부 구현예에서, SIR 발현하는 효과기 세포는 SIR T 세포이다. 일부 구현예에서, SIR 발현하는 효과기 세포는 SIR 발현하는 Jurkat T 세포이다.
본원에 기술된 임의의 또는 일부 이러한 구현예에서, SIR은 인간 코돈 최적화된 폴리뉴클레오티드에 의해 인코딩된 야생형 및 변이체 TCRa (예로, 서열번호 732 내지 740) 및 TCRb (예로, 서열번호 747 내지 762) 불변 사슬을 포함하는 한편, 상응하는 cTCR은 이들의 야생형 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩된 야생형 TCRa (서열번호 730 내지 731) 및 TCRb 불변 사슬 (서열번호 744 내지 746)을 포함한다. 일부 구현예에서, SIR은 또한 하나 이상의 항원 결합 도메인을 TCRa 및 TCRb 불변 사슬에 연결하는 조건부 링커를 포함한다. 일부 구현예에서, SIR은 인간 코돈 최적화된 폴리뉴클레오티드에 의해 인코딩된 야생형 및 변이체 preTCRa (예로, 서열번호 767 및 768) 및 TCRb (예로, 서열번호 747 내지 762) 불변 사슬을 포함하는 한편, 상응하는 cTCR은 이들의 야생형 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩된 야생형 TCRa 및 TCRb 불변 사슬을 포함한다. 일부 구현예에서, SIR은 또한 하나 이상의 항원 결합 도메인을 preTCRa 및 TCRb 불변 사슬에 연결하는 조건부 링커를 포함한다. 일부 구현예에서, SIR은 인간 코돈 최적화된 폴리뉴클레오티드에 의해 인코딩된 야생형 및 변이체 preTCRa (예로, 서열번호 767 및 768) 및 TCRb (예로, 서열번호 747 내지 762) 불변 사슬을 포함하는 한편, 상응하는 cTCR은 이들의 야생형 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩된 야생형 TCRa 및 TCRb 불변 사슬을 포함한다. 일부 구현예에서, SIR은 또한 하나 이상의 항원 결합 도메인을 preTCRa 및 TCRb 불변 사슬에 연결하는 조건부 링커를 포함한다. 본원에 기술된 임의의 또는 일부 이러한 구현예에서, SIR은 인간 코돈 최적화된 폴리뉴클레오티드에 의해 인코딩된 야생형 및 변이체 TCRg (예로, 서열번호 770) 및 TCRd (예로, 서열번호 772) 불변 사슬을 포함하는 한편, 상응하는 cTCR은 이들의 야생형 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩된 야생형 TCRg (서열번호 769) 및 TCRd 불변 사슬 (서열번호 771)을 포함한다. 일부 구현예에서, SIR은 또한 하나 이상의 항원 결합 도메인을 TCRa 및 TCRb 불변 사슬에 연결하는 조건부 링커를 포함한다. 일부 구현예에서, SIR은 야생형 및 변이체 hTCRbECD-Bam-CD3zECDTMCP (서열번호 10444 내지 10452) 및 hTCRaECD-Kpn-CD3zECDTMCP-opt2 (서열번호 10464 내지 10471) 불변 사슬을 포함하는 한편, 상응하는 cTCR는 이들의 야생형 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩된 야생형 TCRa 및 TCRb 불변 사슬을 포함한다. 일부 구현예에서, SIR은 또한 하나 이상의 항원 결합 도메인을 hTCRbECD-Bam-CD3zECDTMCP (서열번호 10444 내지 10452) 및 hTCRaECD-Kpn-CD3zECDTMCP-opt2 (서열번호 10464 내지 10471) 불변 사슬에 연결하는 조건부 링커를 포함한다. CD19-ECD-GGSG-NLuc-AcV5 일부 구현예에서, 항원 결합 도메인은 약 10-4 M 내지 10-8 M 범위로부터의 해리 상수 (KD, 이의 결합 친화도 반영)를 갖는다. 일부 구현예에서, 항원 결합 도메인은 상기 인용된 하나 이상의 항원에 결합한다. 일부 구현예에서, 항원 결합 도메인은 표적 항원에 대해 약 10-4 M 내지 10-8 M, 예로 약 10-5 M 내지 10-7 M, 예로 약 10-5 M 내지 10-6 M범위의 KD를 갖는다. 일 구현예에서, 항원 결합 도메인의 결합 친화도는 기준 항체보다 적어도 5배, 10배, 20배, 30배, 50배, 100배 또는 1,000배 더 적다. 일 구현예에서, 인코딩된 항원 결합 도메인은 기준 항체보다 적어도 5배 더 적은 결합 친화도를 갖는다. 일부 구현예에서, 기준 항체는 항원 결합 도메인이 유래된 항체이다.
일부 구현예에서, 세포의 표면에 존재할 때, 상기 이중 사슬 SIR의 제 1 사슬의 항원 결합 도메인의 이의 동족체 항원에 대한 결합은 상기 SIR의 제 2 사슬의 존재 또는 CAR의 존재에 의해 실질적으로 감소되지 않는다. 일부 구현예에서, 상기 SIR (또는 CAR)의 제 2 사슬의 존재 시 상기 SIR의 제 1 사슬의 항원 결합 도메인의 이의 동족체 항원에 대한 결합은 상기 SIR (또는 CAR)의 제 2 사슬의 부재 시 상기 SIR의 제 1 사슬의 항원 결합 도메인의 이의 동족체 항원에 대한 결합의 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%이다. 예를 들면, 세포가 제 1 사슬이 TCRα에 연결된 CD19 표적하는 scFv를 포함하고, 제 2 사슬이 TCRβ2에 연결된 CD123를 표적하는 카멜리드 vHH 단편을 포함하는 이중 사슬 SIR을 발현하면, 다음으로 상기 SIR의 제 2 사슬의 존재 시 상기 SIR의 제 1 사슬의 항원 결합 도메인의 이의 동족체 항원 (예로, CD19)에 대한 결합은 이의 동족체 항원 (예로, CD123)에 상기 SIR의 제 2 사슬의 부재 시 상기 SIR의 제 1 사슬의 항원 결합 도메인의 이의 동족체 항원 (예로, CD19)에 대한 결합의 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%이다. 또 다른 예에서, 세포가 제 1 사슬이 TCRα에 연결된 CD19 표적하는 FMC63의 vL 단편을 포함하고, 제 2 사슬이 TCRβ2에 연결된 CD123를 표적하는 FMC63의 vH 단편을 포함하는 이중 사슬 SIR을 CD123을 표적하는 vHH 단편을 포함하는 CAR과 함께 발현하면, 다음으로 상기 CAR의 존재 시 상기 이중 사슬 CAR의 제 1 및 제 2 사슬의 항원 결합 도메인의 이의 동족체 항원 (예로, CD19)에 대한 결합은 이의 동족체 항원 (예로, CD123)에 상기 CAR의 부재 시 상기 SIR의 제 1 및 제 2 사슬의 항원 결합 도메인의 이의 동족체 항원 (예로, CD19)에 대한 결합의 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%이다.
일부 구현예에서, 세포의 표면 상에 존재할 때, 이중 사슬 SIR의 상기 제 1 사슬 및 상기 2 사슬의 항원 결합 도메인은 둘 다가 scFv 항원 결합 도메인인 경우보다 서로 더 적게 결합한다. 일부 구현예에서, 이중 사슬 SIR의 상기 제 1 사슬 및 상기 2 사슬의 항원 결합 도메인은 둘 다가 scFv 항원 결합 도메인인 경우보다 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 99%로 서로 더 적게 결합한다.
본원에 기술된 SIR 폴리펩티드 작용 단위는 단일 폴리뉴클레오티드 사슬에 의해 인코딩되고 단일 폴리펩티드 사슬로서 합성되며, 이는 후속적으로 상이한 폴리펩티드로 절단된다. 하나 이상의 리더 서열 (신호 펩티드로도 알려짐)을 포함하는 SIR 폴리펩티드가 처음에 합성될 수 있고, 이는 후속적으로 성숙한 폴리펩티드로부터 제거된다. 바람직한 구현예에서, SIR 폴리펩티드의 각각의 폴리펩티드 작용 단위 (예로, T 세포 수용체 불변 사슬 플러스 퓨린-SGSG-절단가능한 링커에 연결된 항원 결합 도메인 또는 T 세포 수용체 불변 사슬 플러스 퓨린-SGSG-절단가능한 링커)는 SIR의 폴리펩티드 작용 단위를 제 I형 막통과 단백질로서 세포 표면으로 안내하는 리더 서열이 선행할 수 있다. 바람직한 구현예에서, SIR의 항원 결합 도메인은 세포외로 대면한다. 일부 구현예에서, SIR 폴리펩티드의 리더 서열은 서열번호 2300 내지 서열번호 2302의 서열을 포함한다.
특정 구현예에서, SIR의 두 개 T 세포 수용체 불변 사슬은 동일한 유형일 수 있다 (예로, TCRa 및 TCRa; TCRb 및 TCRb; preTCRa 및 preTCRa; TCR감마 및 TCR감마; 및 TCR-델타 및 TCR-델타). 동일한 유형의 두 개 TCR 불변 사슬을 갖는 일부 예시적인 SIR은 클론 번호 021116-E08 (서열번호 905), 클론 번호 012216-P08 (서열번호 906), 클론 번호 012216-Q05 (서열번호 907), 클론 번호 012216-R04 (서열번호 908) 및 클론 번호 012216-S02 (서열번호 909)이다. 바람직한 구현예에서, SIR의 두 개 TCR 불변 사슬은 상이한 유형일 수 있다 (예로, TCRa 및 TCRb; preTCRa 및 TCRb; TCR감마 및 TCR-델타 등). 상이한 유형의 두 개 TCR 불변 사슬을 갖는 예시적인 SIR은 클론 번호 102615-C08로 예시되고, 이의 핵산 및 아미노산 서열은 서열번호 1200 및 서열번호 3435에 각각 주어진다.
특정 구현예에서, SIR 폴리펩티드는 인간, 마우스 또는 개 기원의 TCRa, TCRb, preTCRa, TCR 감마 또는 TCR 델타 사슬를 포함하거나 이로부터 유래된 단일 T 세포 수용체 불변 사슬을 포함한다. 단일 TCR 불변 사슬을 갖는 예시적인 SIR은 클론 번호 051216-F04로 예시되고, 이의 아미노산 서열은 서열번호 3435에 주어진다.
특정 구현예에서, 본 발명의 SIR은 인간, 마우스 또는 개 기원의 TCRa, TCRb, preTCRa, TCR 감마 또는 TCR 델타 사슬를 포함하거나 이로부터 유래된 두 개의 T 세포 수용체 불변 사슬을 인코딩한다. 두 개의 TCR 불변 사슬을 갖는 예시적인 SIR은 클론 번호 102615-C08로 예시되고, 이의 핵산 및 아미노산 서열은 서열번호 1200 및 서열번호 3435에 각각 주어진다.
특정 구현예에서, SIR 폴리펩티드의 두 개 T 세포 수용체 불변 사슬은 동일한 유형일 수 있다 (예로, TCRa 및 TCRa; TCRb 및 TCRb; preTCRa 및 preTCRa; TCR감마 및 TCR감마; 및 TCR-델타 및 TCR-델타). 동일한 유형의 두 개 TCR 불변 사슬을 갖는 예시적인 SIR은 이의 아미노산 서열이 서열번호 3140에 주어지는 클론 번호 021116-E08이다. 바람직한 구현예에서, SIR 폴리펩티드의 두 개 TCR 불변 사슬은 상이한 유형일 수 있다 (예로, TCRa 및 TCRb; preTCRa 및 TCRb; TCR감마 및 TCR-델타 등). 상이한 유형의 두 개 TCR 불변 사슬을 갖는 예시적인 SIR은 클론 번호 102615-C08로 예시되고, 이의 핵산 및 아미노산 서열은 서열번호 1200 및 서열번호 3435에 각각 주어진다.
일부 구현예에서, SIR 폴리펩티드의 두 개 T 세포 수용체 불변 사슬 모두는 야생형 TCRa 또는 야생형 TCRb 또는 야생형 TCRg 또는 야생형 TCRd 또는 야생형 preTCRa가 아니다.
다음의 표는 본 발명에 기술된 여러 예시적인 SIR의 표적 항원, 클론 번호, 서열번호 (DNA), 서열번호 (PRT) 및 명칭을 요약하고 있다. 이들 구조물은 일반적으로 표 5 및 표 6에 기술된 항원 결합 단편을 본원에 기술된 TCR 불변 사슬의 예시적인 변이체와 함께 (표 1 내지 표 3에 제공된 바와 같은 변이체 포함) 조합함으로써 제작되었다. SIR은 이들 골격, 예로 이들 내에 존재하는 TCR 불변 사슬의 유형을 기초로 하여 상이한 유형 (예로, SIR1 내지 SIR8)으로 나누어진다. 그러나, SIR이 설계상 모듈화되어 본 발명의 범위가 다음의 표에 기술된 SIR에 제한되지 않음이 이해되어야 하고, 상이한 모듈을 스위칭함으로써 상이한 SIR을 생성하는 것이 가능한다. 따라서, 항원 결합 도메인을 TCR 불변 사슬의 다른 변이체와 조합하는 것이 가능하지만, 이는 다음의 표 7에 기술된 SIR에 포함되지 않는다. 표 5 및 표 6에 열거된 항원 결합 도메인을 사용하여 SIR을 설계하는 것도 역시 가능한다. 또한 SIR에 상이한 치료제 및 부속 모듈을 첨가하거나, 대체하거나, 제거하는 것도 가능하다. 따라서, 다음의 표가 항생제 저항성 유전자 (예로, PAC)를 갖는 SIR을 포함하는 한편, 이러한 모듈이 제거될 수 있다. 본 발명의 SIR에 추가하여, 표 7은 또한 CD3z 일차 신호전달 도메인 및 41BB 보조자극 도메인을 포함하는 여러 키메라 항원 수용체 (CAR)를 기술하고 있다. 유사한 CAR가 (예로, CD28로부터의) 다른 일차 및 보조자극 도메인을 사용하여 생성될 수 있음이 이해되어야 한다. 이들 CAR은 본원에 기술된 SIR과 조합하여 발현될 수 있다.
표 7A 내지 7C에서, SIR 유형은 각각의 서열이 동일한 "골격"을 갖지만 상이한 항원 결합 도메인을 갖는 "예시적인 SIR"으로 열거된 구조물 골격을 말한다. 표 7A 내지 7C는 특정한 결합 도메인을 포함하고 특정한 SIR 유형, cTCR 또는 CAR에 속하는 구조물의 DNA 및 PRT 서열번호를 결정하는데 사용될 수 있다. 따라서, 서열번호 1200은 FMC63 결합 도메인을 갖는 반면, 서열번호 1201은 동일한 SIR 골격을 갖지만 huFMC63 항원 결합 도메인을 갖는다. SIR1 유형의 여러 예시적인 구조물의 표적 항원, DNA 및 PRT 서열번호 및 결합 도메인을 포함한 명칭은 표 7D에 열거되어 있다. SIR1 유형의 DNA 및 PRT 서열번호와 관련하여 골격 SIR2 내지 SIR9 및 cTCR 상에 상이한 결합 도메인의 DNA 및 PRT 서열번호의 순서는 표 7A 및 7B에 제시되어 있다. 따라서, 표 7A 및 7D를 사용하여, SIR1 내지 SIR6 유형 골격 및 cTCR 상에 임의의 항원 결합 도메인의 DNA 및 PRT 서열번호가 결정될 수 있다. 유사하게, 표 7B 및 7D를 사용하여, SIR7 내지 SIR9 골격 유형 상에 임의의 항원 결합 도메인의 DNA 및 PRT 서열번호가 결정될 수 있다. SIR10 유형의 여러 예시적인 구조물의 표적 항원, DNA 및 PRT 서열번호 및 결합 도메인을 포함한 명칭은 표 7E에 열거되어 있다. SIR10 유형의 DNA 및 PRT 서열번호와 관련하여 골격 SIR10 내지 SIR18 및 cTCR 상에 상이한 결합 도메인의 DNA 및 PRT 서열번호의 순서는 표 7C에 제시되어 있다. 따라서, 표 7E 및 7C를 사용하여, SIR10 내지 SIR18 유형 골격 및 cTCR 상에 임의의 항원 결합 도메인의 DNA 및 PRT 서열번호가 결정될 수 있다. 대안적으로, 본 발명의 특정한 항원 결합 도메인을 포함하는 SIR의 서열은 본 발명에 첨부된 서열 목록 파일의 상동성 검색에 의해 결정될 수 있다. 마지막으로, SIR은 설계상 모듈화되기 때문에, 특정한 모듈을 포함하는 SIR의 DNA 및 아미노산 서열은 단순하게 SIR1 및 SIR 10 유형에 존재하는 모듈(들)을 새로운 모듈로 교체함으로써 생성될 수 있다.
또 다른 관점에서 본 발명은 본원에 기술된 항원에 결합하고, 하나 이상의 T 세포 수용체 불변 사슬에 연결된 하나 이상의 항원 결합 도메인 (예로, 항체 또는 항체 단편, 리간드 또는 수용체)을 포함하는 단리된 SIR 폴리펩티드 분자를 제공한다.
일부 구현예에서, SIR은 단일 T 세포 수용체 불변 사슬 (클래스 1)의 NH2-말단에 연결된 단일 항원 결합 도메인을 포함하는 단일 폴리펩티드를 포함하거나 이로 구성될 수 있다. 예시적인 클래스 1 SIR을 인코딩하는 구조물이 클론 번호 051216-F04에 제공되어 있다. 인코딩된 SIR의 핵산 서열은 서열번호 1023에 제시되고, 인코딩된 SIR의 아미노산 서열은 서열번호 3258에 해당한다.
일부 구현예에서, SIR은 기능적 SIR (클래스 2)를 제조하도록 조립되는 두 개의 폴리펩티드를 포함하거나 이로 구성될 수 있다. 이러한 이중 사슬 클래스 2 SIR의 각각의 폴리펩티드는 T 세포 수용체 불변 사슬을 포함하고, 항원 결합 도메인을 포함하거나 (클래스 2A에서와 같음) 포함하지 않는다 (클래스 2B에서와 같음). 클래스 2A SIR에서, 각각의 항원 결합 도메인은 별도의 T 세포 수용체 불변 사슬의 N-말단에 연결된다. 예를 들면, 항원 결합 도메인 1 (예로, 항체의 vL 단편)은 T 세포 수용체 베타 (TCRβ)에 연결되어 폴리펩티드 작용 단위 1을 구성하고, 항원 결합 도메인 2 (예로, 항체의 vH 단편)는 T 세포 수용체 알파 (TCRα)에 연결되어 폴리펩티드 작용 단위 2를 구성한다. 이러한 SIR의 두 개의 폴리펩티드 작용 단위는 동일한 세포에서 공동발현되고, 서로 쌍을 형성하여 기능적으로 활성을 갖는다. 각각의 항원 결합 도메인은 다시 이중특이적 또는 다중특이적이 될 수 있고, 이로써 클래스 2 SIR가 2개 이상의 항원을 표적하도록 허용한다. CD19 표적하는 예시적인 클래스 2A SIR은 CD8SP-FMC63-vL-V5-[hTCRb-KACIAH]-F-P2A-SP-FMC63-vH-Myc-[hTCRa-CSDVP]-F-F2A-PAC (102615-C08)[서열번호 1200]에 제공되어 있다. 이러한 SIR의 핵산 서열은 서열번호 1200에 제시되고, 이의 아미노산 서열은 서열번호 3435에 해당한다. 이러한 SIR에서, FMC63, CD19 단일클론 항체로부터 유래된 vL 단편은 링커를 통해 인간 TCRb 사슬의 돌연변이체 (KACIAH)의 불변 사슬에 부착되는 한편, FMC63 단일클론 항체로부터 유래된 vH 단편은 링커를 통해 돌연변이체 (CSDVP) 인간 TCRα 사슬의 불변 영역에 부착된다.
일부 구현예에서, 이중 폴리펩티드 사슬 SIR은 단 하나의 T 세포 수용체 불변 사슬 (폴리펩티드 작용 단위 1)에 연결되지만, 제 2 T 세포 수용체 불변 사슬과 함께 공동발현되는 항원 결합 도메인을 포함하거나 이로 구성된다. 이러한 SIR은 클래스 2B로 지정된다. 이러한 클래스 2B SIR에서 제 2 T 세포 수용체 불변 사슬의 목적은 폴리펩티드 작용 단위 1 (예로, T 세포 수용체 불변 사슬에 연결된 항원 결합 도메인 1)의 세포 표면 발현을 용이하게 하는 것이다. 이와 같이, 클래스 2B SIR에서 제 2 T 세포 수용체 불변 사슬은 자체로 발현되거나, 에피토프 태크 (예로, MYC, V5, AcV5, G4Sx2, 스트렙태그Ⅱ 등)를 보유한 융합 단백질로서 발현되거나, 부적절한 단백질이 작용 단위 1의 조립 및 기능을 방해하지 않는 한 임의의 부적절한 단백질 단편 (예로, vL 또는 vH 단편)을 보유하는 융합 단백질로서 발현될 수 있다. 예로서, 클래스 2B SIR SIR은 T 세포 수용체 알파 (TCRα)의 불변 사슬에 연결되어 폴리펩티드 작용 단위 1을 구성하는 항원 결합 도메인 1 및 폴리펩티드 작용 단위 2를 구성하는 T 세포 수용체 베타 (TCRβ)의 빈 (예로, 항원 결합 도메인이 결여된) 불변 사슬을 포함하거나, 이로 구성될 수 있다. 이러한 SIR의 두 개의 폴리펩티드 작용 단위는 동일한 세포에서 공동발현된다. 예시적인 클래스 2B SIR을 인코딩하는 구조물은 CD8SP-V5-[hTCRb-KACIAH]-F-P2A-CD8SP-FMC63-vL-Gly-Ser-링커-FMC63-vH-Myc-[hTCRa-CSDVP]-F-F2A-PAC (082815-G07)[서열번호 1620]에 제공된다 인코딩된 SIR의 핵산 및 아미노산 서열은 각각 서열번호 1620 및 서열번호 3855에 해당한다.
일부 구현예에서, 클래스 2 SIR의 두 개 폴리펩티드 작용 단위는 상이한 벡터를 사용하여 세포에서 공동발현된다. 일부 구현예에서, 클래스 2 SIR의 두 개 폴리펩티드 작용 단위는 두 개의 별도의 조절 요소 (예로, 프로모터)를 채용하여 클래스 2 SIR의 두 개 폴리펩티드 작용 단위를 인코딩하는 두 개의 폴리뉴클레오티드를 인코딩하는 상이한 벡터를 사용하여 세포에서 공동발현된다. 일부 구현예에서, 클래스 2 SIR의 두 개 폴리펩티드 작용 단위는 단일한 프로모터를 채용하여 SIR의 두 개 폴리펩티드를 인코딩하는 뉴클레오티드 단편을 분리하는 IRES 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 발현하는 단일 벡터를 사용하여 세포에서 공동발현된다. 일부 구현예에서, 클래스 2 SIR의 두 개 폴리펩티드 작용 단위는 단일한 프로모터를 채용하여 절단가능한 링커 (예로, F2A, T2A, E2A, P2A, 퓨린-SGSG-F2A, 퓨린-SGSG-T2A, 퓨린-SGSG-E2A, 퓨린-SGSG-P2A 등)를 포함한 단일 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 발현하는 단일 벡터를 사용하여 세포에서 공동발현된다. 결과로 얻은 mRNA는 후속적으로 SIR의 두 개 폴리펩티드 작용 단위를 생성하는 단일 폴리펩티드를 인코딩한다. 일부 구현예에서, 클래스 2 SIR의 두 개 폴리펩티드 작용 단위는 둘 다의 폴리펩티드 작용 단위를 인코딩하는 단일 mRNA 서열의 형질감염을 사용하여 공동발현되는 한편, 다른 구현예에서, 두 개의 폴리펩티드 작용 단위는 각각이 하나의 폴리펩티드 작용 단위를 인코딩하는 두 개의 상이한 mRNA 서열의 형질감염에 의해 공동발현된다. 일부 구현예에서, SIR을 인코딩하는 벡터 또는 mRNA는 추가적인 유전자/단백질 (치료제 대조군, 억제성 분자, 부속 모듈 등)을 인코딩할 수 있고, 이는 SIR 인코딩 서열로부터 IRES 또는 절단가능한 링커 또는 이들의 조합에 의해 분리될 수 있다. 또 다른 구현예에서, 치료제 대조군 또는 부속 모듈 또는 둘 다는 SIR가 별도의 벡터 또는 mRNA를 사용하여 발현되는 세포에서 발현될 수 있다. 예시적인 치료제 대조군은 표 8 (서열번호 3070 내지 3076)에 제공되어 있다. 치료제 대조군 또는 부속 모듈은 SIR의 기능에 필수적이지 않고, 구현예의 SIR이 치료제 대조군 또는 부속 모듈이 없이도 사용될 수 있는 것으로 이해되어야 한다. 예를 들면, PAC (퓨로마이신 저항성 유전자)와 같은 항생제 저항성 카세트는 SIR의 기능성에 영향 없이도 본 발명의 SIR-인코딩 벡터로부터 제거될 수 있다.
또한 본원에 기술된 SIR의 기능적 변이체가 제공되고, 이는 모체 SIR과 실질적인 또는 유의한 서열 동일성 또는 유사성을 갖고, 이의 기능적 변이체는 이의 변이체가 되는 SIR의 생물학적 활성을 유지한다. 기능적 변이체는 예를 들면, 모체 SIR과 유사한 정도, 동일한 정도 또는 더 높은 정도로 표적 세포를 인식하는 능력을 보유하는 본원에 기술된 SIR (모체 SIR)의 이들 변이체이다. 모체 SIR과 관련하여, 기능적 변이체는 예를 들면 아미노산 서열에서 모체 SIR과 적어도 약 30%, 약 50%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98% 또는 약 99% 이상 동일할 수 있다.
기능적 변이체는 예를 들면, 적어도 하나의 보존적 아미노산 치환을 갖는 모체 SIR의 아미노산 서열을 포함한다. 대안적으로 또는 추가적으로, 기능적 변이체는 적어도 하나의 비-보존적 아미노산 치환을 갖는 모체 SIR의 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 이러한 경우에, 비-보존적 아미노산 치환은 기능적 변이체의 생물학적 활성을 방해하거나 억제하지 않는 것이 바람직하다. 비-보존적 아미노산 치환은 기능적 변이체의 생물학적 활성을 증진할 수 있어, 기능적 변이체의 생물학적 활성이 모체 SIR과 비교하여 증가된다.
SIR (기능적 부분 및 기능적 변이체 포함)이 이들의 생물학적 활성, 예로 항원에 특이적으로 결합하거나, 포유동물에서 병든 세포를 검출하거나, 포유동물에서 질환을 치료하거나 예방하는 능력을 유지하면, SIR (기능적 부분 및 기능적 변이체 포함)은 임의의 길이를 갖을 수 있고, 예를 들어 임의의 수의 아미노산을 포함할 수 있다. 예를 들면, SIR은 길이가 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900 또는 1000개 이상의 아미노산과 같은 약 300 내지 약 5000개의 아미노산 길이일 수 있다.
SIR (본 발명의 기능적 부분 및 기능적 변이체 포함)은 하나 이상의 자연-발생하는 아미노산 대신에 합성 아미노산을 포함할 수 있다. 이러한 합성 아미노산은 당해 기술분야에 숙지되어 있고, 예를 들면 아미노고리헥산 카르복실산, 노르류신, α-아미노 n-데칸산, 호모세린, S-아세틸아미노메틸 시스테인, 트랜스-3- 및 트랜스-4-하이드록시프롤린, 4-아미노페닐알라닌, 4-니트로페닐알라닌, 4-클로로페닐알라닌, 4-카복시페닐알라닌, β-페닐세린 β-하이드록시페닐알라닌, 페닐글리신, α-나프틸알라닌, 고리헥실알라닌, 고리헥실글리신, 인돌린-2카르복실산, 1,2,3,4-테트라하이드로이소퀴놀린-3-카르복실산, 아미노말론산, 아미노말론산 모노아미드, N'-벤질-N'-메틸-라이신, N',N'-디벤질-라이신, 6-하이드록시라이신, 오르니틴, α-아미노고리펜탄 카르복실산, α-아미노고리헥산 카르복실산, α-아미노고리헵탄 카르복실산, α-(2-아미노-2-노르보르난)-카르복실산, γ-d디아미노부티르산, α,β-디아미노프로피온산, 호모페닐알라닌 및 α-터르-부틸글리신을 포함한다.
SIR (본 발명의 기능적 부분 및 기능적 변이체 포함)은 글리코실화, 아미드화, 카르복실화, 인산화, 에스테르화, N-아실화, 예로 디설파이드 결합을 통해 고리화 또는 산 부가염으로 전환되고/거나 선택적으로 이중합, 다중합 또는 컨쥬게이션될 수 있다.
본 발명은 SIR을 인코딩하는 핵산 분자를 포함하는 재조합 핵산 구조물을 제공하고, 여기서 핵산 분자는 하나 이상의 하나 이상의 항원 결합 도메인을 인코딩하는 핵산 분자를 포함하고, 각각의 항원 결합 도메인을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열은 T 세포 수용체 불변 사슬을 인코딩하는 핵산 서열과 동일한 리딩 프레임에서 이와 연속적이다. SIR의 제작에 사용될 수 있는 예시적인 T 세포 수용체 불변 사슬은 이에 제한되는 것은 아니지만, TCRα. TCRβ1, TCRβ2, TCRγ, TCRδ, preTCRα 및 이들의 변이체 및 돌연변이체의 불변 사슬을 포함한다 (예로, 표 1 내지 3 참조). 일부 경우에, SIR은 TCRα. TCRβ1, TCRβ2, TCRγ, TCRδ 및 preTCRα 등의 불변 사슬의 조합을 포함할 수 있다. 본 발명은 TCRα 및 TCRβ1, TCRα 및 TCRβ2, preTCRα 및 TCRβ1, preTCRα 및 TCRβ2, 및 TCRγ 및 TCRδ로부터 선택되는 TCR 불변 사슬의 쌍을 포함하는 SIR을 제공한다. 본 발명은 SIR의 제작 시 TCR 불변 사슬을 대체할 수 있는 CD3z 사슬과의 TCR 불변 사슬의 융합을 제공한다. 또한, SIR에서 인간 preTCRα 불변 사슬은 야생형 인간 preTCRα 불변 사슬의 카복시 말단 48개의 아미노산이 결여된다. 카복시 말단 48개의 아미노산이 결여된 preTCRα의 아미노산 서열은 서열번호 3048에 제공되어 있다.
본 발명은 또한 본원에 기술된 SIR을 인코딩하는 핵산 서열 또는 서열들을 포함하는 벡터 또는 벡터들을 제공한다. 일 구현예에서, SIR은 단일 벡터에 의해 인코딩된다. 또 다른 구현예에서, SIR은 하나 이상의 벡터에 의해 인코딩된다. 또한 또 다른 구현예에서, SIR의 두 개 폴리펩티드 작용 단위는 각각 별도의 벡터에 의해 또는 별도의 핵산에 의해 인코딩된다. 일 구현예에서, SIR의 두 개 폴리펩티드 작용 단위는 단일 벡터 또는 단일 핵산에 의해 인코딩된다. 일 구현예에서, 벡터 또는 벡터들은 DNA 벡터(들), RNA 벡터(들), 플라스미드(들), 렌티바이러스 벡터(들), 아데노바이러스성 벡터(들), 레트로바이러스 벡터(들), 배큘로바이러스 벡터(들), 슬리핑 뷰티 트랜스포존 벡터(들) 및 피기백 트랜스포존(들)으로부터 선택된다. 일 구현예에서, 벡터는 렌티바이러스 벡터 또는 레트로바이러스 벡터이다. 또 다른 구현예에서, 벡터는 슬리핑 뷰티 트랜스포존 벡터이다. 여러 예시적인 벡터의 핵산 서열은 서열번호 870 내지 876에 제공되어 있다. 벡터 pLenti-EF1α (서열번호 870) 및 pLenti-EF1α-DWPRE (서열번호 871)는 pLenti-EF1α-DWPRE가 WPRE 영역이 결여된 점으로 달라지는 빈 렌티바이러스성 벡터이다. 본 발명의 SIR 코딩 서열은 이들 벡터에서 Nhe I 및 Sal I 부위 사이에 클론될 수 있다. 벡터 MSCV-Bgl2-AvrII-Bam-EcoR1-Xho-BstB1-Mlu-Sal-ClaI.I03 (서열번호 872)은 레트로바이러스성 벡터이고, 본 발명의 SIR 코딩 서열은 이들 벡터의 다중클로닝 부위 사이에 클론될 수 있다. 벡터 MSCV-FMC63vL-V5-[TCRb-KACIAH]-F-P2A-2-Spe-FMC63vH-MYC-[TCRα-CSDVP]-F-F2A-Pac.N01 (서열번호 873)도 역시 SIR 코딩 서열이 이미 존재하는 레트로바이러성 벡터이다. 본 발명의 SIR 코딩 서열은 기존의 SIR을 제거하고 새로운 SIR을 인코딩하는 핵산을 삽입함으로써 이 벡터에 클론될 수 있다. 벡터 pSBbi-Pur (서열번호 874)는 슬리핑 뷰피 트랜스포존 벡터이다. 벡터 pSBbi-pur-EF1-FMC63vL-V5-[TCRb-KACIAH]-F-P2A-FMC63vH-MYC-[TCRa-CSDVP]-F-F2A-Xba.B01 (서열번호 875) 및 pSBbi-pur-EF1-Nhe-FMC63vL-Xho-V5-[TCRb-S57C-opt]-F-P2A-Spe-FMC63vH-Mlu-MYC-[TCRa-T48C-opt]-F2A-MCS-I01 (서열번호 876)는 당해 기술분야에 숙지된 표준 재조합 DNA 기법을 사용하여 기존 SIR의 제거 이후 본 발명의 SIR을 서브클로닝하는데 사용될 수 있는 SIR 핵산을 포함하는 슬리핑 뷰피 트랜스포존 벡터이다.
본 발명은 또한 세포 내로 직접적으로 형질감염될 수 있는 RNA 구조물을 포함한다. 형질감염에 사용되는 mRNA를 생성하는 방법은 특별히 설계된 프라이머로 주형의 시험관내 전사 (IVT), 이어지는 폴리A 첨가를 수반하여 3' 및 5' 미번역 서열 ("UTR") (예로, 본원에 기술된 3' 및/또는 5' UTR), 5' 캡 (예로, 본원에 기술된 5' 캡) 및/또는 리보좀 내부 진입 부위 (IRES) (예로, 본원에 기술된 IRES), 발현된 핵산 및 폴리 A 미단을 포함하는, 전형적으로 50 내지 2000개 염기 (서열번호 860 및 861) 길이의 구조물을 생산한다. 일 구현예에서, 주형은 SIR의 서열을 포함한다. 일 구현예에서, RNA SIR 벡터는 전기천공법에 의해 세포, 예로 T 세포 또는 NK 세포로 형질도입된다. 또 다른 구현예에서, RNA SIR 벡터는 마이클로플루이드 기기를 사용하여 세포막에 일시적 교란을 유발시킴으로써 세포, 예로 T 세포 또는 NK 세포 내로 형질도입된다. SIR의 상이한 사슬 (또는 폴리펩티드 작용 단위)는 또한 하나 이상의 벡터, 상이한 벡터의 조합 또는 기법을 사용하여 세포에 도입될 수 있다. 예로서, 벡터 클론 번호 050216-T02 및 클론 번호 050216-S08은 FMC63-vL 사슬이 hTCRb-KACIAH 사슬에 V5 링커를 통해 연결되는 SIR의 폴리펩티드 작용 단위 1을 포함하는 서열번호 913 (CD8SP-FMC63-vL-V5-[hTCRb-KACIAH]-F-P2A-PAC)을 인코딩한다. 이들 벡터는 퓨로마이신 저항성 유전자 (PAC)도 역시 포함한다. 벡터 클론 번호 041916-A02 및 041916-B03는 FMC63-vH 사슬이 hTCRa-CSDVP 사슬에 MYC 링커를 통해 연결되는 SIR의 폴리펩티드 작용 단위 2를 포함하는 서열번호 997 (CD8SP-FMC63-vH-MYC-[TCRα-CSDVP]-F-F2A-BlastR)을 인코딩한다. 이들 벡터는 블라스티시딘 저항성 유전자 (BlastR)도 역시 발현한다. 세포는 서열번호 913 및 서열번호 997를 동시적으로 또는 연속적으로 인코딩하는 렌티바이러스로 감염될 수 있고, 다음으로 이중-감염된 세포를 농축하도록 퓨로마이신 및 블라스티시딘에 대한 저항성으로 선별된다. 둘 다의 바이러스로 감염된 세포는 폴리펩티드 작용 단위를 발현할 것이고, 다음으로 세포 표면 상에 기능적 SIR을 조립하여 발현할 것이다. 또 다른 구현예에서, SIR의 하나의 사슬 또는 폴리펩티드 작용 단위는 레트로바이러스성 벡터를 사용하여 도입되는 한편, 나머지 폴리펩티드 작용 단위는 렌티바이러스성 벡터를 사용하여 도입된다. 또 다른 관점에서, 하나의 폴리펩티드 작용 단위는 렌티바이러스성 벡터를 사용하여 도입되는 한편, 나머지 폴리펩티드 작용 단위는 슬리핑 뷰티 트랜스포존을 사용하여 도입된다. 또한 또 다른 관점에서, 하나의 폴리펩티드 작용 단위는 렌티바이러스성 벡터를 사용하여 도입되는 한편, 나머지 폴리펩티드 작용 단위는 RNA 형질감염을 사용하여 도입된다. 또한 또 다른 관점에서, 하나의 폴리펩티드 작용 단위는 당해 기술분야에 숙지된 유전자 표적화 기법을 사용하여 내인성 TCR 사슬 좌위에서의 유전적 재조합에 의해 도입되는 한편, 나머지 폴리펩티드 작용 단위는 렌티바이러스성 또는 레트로바이러스성 벡터를 사용하여 도입된다.
RNA는 임의의 다수의 상이한 방법, 예를 들면 이에 제한되는 것은 아니지만, 전기천공법 (Amaxa Nucleofector-Ⅱ (Amaxa Biosystems, Cologne, Germany)), (ECM 830 (BTX) (Harvard Instruments, Boston, Mass.) 또는 유전자 펄서 Ⅱ (BioRad, Denver, Colo.), 다중천공기 (Eppendort, Hamburg Germany), 리포펙틴을 사용한 양이온성 리포좀 매개된 형질감염, 중합체 피막화, 펩티드 매개된 형질감염 또는 "윤전자 총"과 같은 바이오리스틱 입자 전달 시스템 (예를 들면, Nishikawa, et al. Hum Gene Ther., 12(8): 861-70 (2001) 참조)을 포함하는 시판되는 방법을 사용하여 또는 마이크로플루이드 기기 (예를 들면, 국제특허출원 WO 2013/059343 A1 및 PCT/US2012/060646 참조)를 사용하여 세포막에 일시적 교란을 유발시킴으로써 표적 세포 내로 도입될 수 있다.
일부 구현예에서, 비-바이러스성 방법은 트랜스포존 (전위가능한 요소로도 불림)의 사용을 포함한다. 일부 구현예에서, 트랜스포존은 자신을 게놈의 일정 위치에 삽입할 수 있는 DNA 조각, 예를 들면 자가-복제하고 이의 사본을 게놈 내에 삽입할 수 있는 DNA 조각 또는 더 긴 핵산으로부터 스프라싱되어 게놈 내의 또 다른 위치에 삽입될 수 있는 DNA 조각이다. 예를 들면, 트랜스포존은 전위를 위해 유전자를 연접하는 역전된 반복서열로 만들어진 DNA 서열을 포함한다.
트랜스포존을 사용한 예시적인 핵산 전달 방법은 슬리핑 뷰티 트랜스포존 시스템 (SBTS) 및 피기백 (PB) 트랜스포존 시스템을 포함한다. 예로, 본원에 모두 참고문헌으로 통합되는 Aronovich et al. Hum. Mol. Genet. 20.R1(2011): R14-20; Singh et al. Cancer Res. 15(2008): 2961-2971; Huang et al. Mol. Ther. 16(2008): 580-589; Grabundzija et al. Mol. Ther. 18(2010): 1200-1209; Kebriaei et al. Blood. 122.21(2013): 166; Williams. Molecular Therapy 16.9(2008): 1515-16; Bell et al. Nat. Protoc. 2.12(2007): 3153-65; 및 Ding et al. 세포. 122.3(2005): 473-83 참조.
SBTS는 두 개의 성분을 포함한다: 1) 트랜스유전자를 포함하는 트랜스포존 및 2) 트랜스포자제 효소의 출처. 트랜스포자제는 트랜스포존을 운반체 플라스미드 (또는 다른 공여 DNA)로부터 숙주 염색체/게놈과 같은 표적 DNA로 전위시킬 수 있다. 예를 들면, 트랜스포자제는 운반체 를라스미드/공여 DNA에 결합하여, 트랜스포존 (트랜스유전자(들) 포함)을 플라스미로부터 절단하여, 숙주 세포의 게놈 내에 이를 삽입한다. 예로 상기 Aronovich et al. 참조.
예시적인 트랜스포존은 pT2-기반의 트랜스포존을 포함한다. 예로, 본원에 모두 참고문헌으로 통합되는 Grabundzija et al. Nucleic Acids Res. 41.3(2013): 1829-47; 및 Singh et al. Cancer Res. 68.8(2008): 2961-2971 참조. 예시적인 트랜스포존의 핵산 서열은 서열번호 874 및 서열번호 875에 제공되어 있다. 예시적인 트랜스포자제는 Tc 1/마리너-유형 트랜스포자제, 예로, SB 10 트랜스포자제 또는 SB 11 트랜스포자제 (예로, 사이토메갈로바이러스 프로모터로부터 발현될 수 있는 과다활성 트랜스포자제)를 포함한다. 예로, 본원에 모두 참고문헌으로 통합되는, Aronovich et al.; Kebriaei et al.; 및 Grabundzija et al. 참조.
SBTS의 사용은 효율적인 통합 및 트랜스유전자, 예로 본원에 기술된 SIR을 인코딩하는 핵산의 발현을 허용한다. 본원에서는 본원에 기술된 SIR을 안정적으로 발현하는 세포, 예로 T 세포 또는 NKT 세포 또는 줄기 세포 또는 iPSC 또는 합성 T 세포를, 예로 SBTS와 같은 트랜스포존 시스템을 사용하여 생성하는 방법을 제공한다.
본원에 기술된 방법에 따르면, 일부 구현예에서, SBTS 성분을 포함하는 하나 이상 핵산, 예로 플라스미드가 세포 (예로, T 또는 NKT 세포 또는 줄기 세포 또는 iPSC 또는 합성 T 세포)로 전달된다. 예를 들면, 핵산(들)은 핵산 (예로, 플라스미드 DNA) 전달의 표준 방법, 예로 본원에 기술된 방법, 예로 전기천공법, 형질감염 또는 리포펙션에 의해 전달된다. 일부 구현예에서, 핵산은 트랜스유전자, 예로 본원에 기술된 SIR을 인코딩하는 핵산을 포함하는 트랜스포존을 포함한다. 일부 구현예에서, 핵산은 트랜스유전자 (예로 본원에 기술된 SIR을 인코딩하는 핵산)를 포함하는 트랜스포존, 뿐만 아니라 트랜스포자제 효소를 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 다른 구현예에서, 두 개의 핵산을 갖는 시스템, 예로 제 1 플라스미드가 트랜스유전자를 포함한 트랜스포존을 포함하고, 제 2 플라스미드가 트랜스포자제 효소를 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 이중-플라스미드 시스템이 제공된다. 예를 들면, 제 1 및 제 2 핵산은 숙주 세포 내로 공동전달된다.
일부 구현예에서, 본원에 기술된 SIR을 발현하는 세포, 예로 T 또는 NKT 또는 줄기 세포 또는 iPSC 또는 합성 T 세포는 SBTS를 사용한 유전자 삽입 및 핵산 분해효소 (예로, 아연 핑커 핵산 분해효소 (ZFNs), 전사 활성화인자-유사 효과기 핵산 분해효소 (TALENs), CRISPR/Cas 시스템 또는 조작된 메가뉴클레아제 재조작된 호밍 엔도뉴클레아제)를 사용한 유전적 편집의 조합을 사용함으로써 생성된다.
일부 구현예에서, 비-바이러스성 전달 방법의 사용은 세포, 예로 T 또는 NKT 또는 줄기 세포 또는 iPSC 또는 합성 T 세포의 재프로그래밍 및 피험자 내로 세포의 직접적인 주입을 허용한다. 비-바이러스성 벡터의 장점은 이에 제한되는 것은 아니지만, 용이성, 환자의 집단을 충족하도록 요구된 충분한 양을 생산하는 비교적 낮은 비용, 보관 동안의 안정성 및 면역원성의 결여를 포함한다.
일부 구현예에서, SIR을 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 벡터는 하나 이상의 억제성 분자를 인코딩하는 핵산 서열을 추가로 포함한다. 본원에 고려된 억제성 분자의 비제한적인 예는, 예를 들면 inhKIR 세포질 도메인; 막통과 도메인, 예로 KIR 막통과 도메인; 및 저해제 세포질 도메인, 예로 ITIM 도메인, 예로 inhKIR ITIM 도메인을 포함한다. 일 구현예에서, 억제성 분자는 야생형 inhKIR 또는 야생형 inhKIR과 적어도 50, 60, 70, 80, 85, 90, 95 또는 99% 상동성을 공유하거나 이로부터 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15 또는 20개 이상의 잔기가 상이한 서열; SLAM 패밀리 세포질 도메인; 막통과 도메인, 예로 SLAM 패밀리 막통과 도메인; 및 저해제 세포질 도메인, 예로 SLAM 패밀리 도메인, 예로 SLAM 패밀리 ITIM 도메인이다. 또 다른 구현예에서, 억제성 분자는 야생형 SLAM 패밀리 구성원 또는 야생형 SLAM 패밀리 구성원과 적어도 50, 60, 70, 80, 85, 90, 95 또는 99% 상동성을 공유하거나 이로부터 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15 또는 20개 이상의 잔기가 상이한 서열이다.
일부 구현예에서, 본 발명의 벡터는 프로모터를 추가로 포함한다. 프로모터의 비제한적인 예는, 예를 들면 EF-1 프로모터, CMV IE 유전자 프로모터, EF-lα 프로모터, 유비퀴틴 C 프로모터, 코아-프로모터 또는 포스포글리세레이트 키나제 (PGK) 프로모터를 포함한다. 일부 구현예에서, 프로모터는 EF-1 프로모터이다. 추가의 구현예에서, EF-1 프로모터는 서열번호 877을 포함한다. 일부 구현예에서, 벡터는 RNA 핵산이다. 일부 구현예에서, 벡터는 폴리(A) 미단을 포함한다. 예를 들면, 본원에서는 약 150개의 아데노신 염기 (서열번호 860 내지 서열번호 864)를 포함하는 폴리(A) 미단이 고려된다. 일부 구현예에서, 벡터는 3'UTR을 포함한다.
또 다른 관점에서, 본 발명은 세포 (예로, 면역 효과기 세포 또는 이의 집단)을 제조하는 방법으로서, SIR, 예로 본원에 기술된 SIR을 인코딩하는 핵산을 포함하는 벡터 또는 SIR 분자, 예로 본원에 기술된 SIR을 인코딩하는 핵산을 세포, 예로 본원에 기술된 T 세포, NKT 세포 또는 줄기 세포 또는 PSC 또는 합성 T 세포 내로 도입 (예로, 형질감염)하는 단계를 포함하는, 방법을 제공한다.
세포는 면역 효과기 세포 (예로, 세포 또는 NKT 세포 또는 이들의 조합) 또는 면역 효과기 세포 또는 합성 T 세포를 생성할 수 있는 줄기/전구체 세포일 수 있다. 일부 구현예에서, 방법에서의 세포는 디아실글리세롤 키나제 (DGK) 및/또는 이카로스에서 결핍성이다. 일부 구현예에서, 방법에서의 세포는 내인성 T 세포 수용체 α, β1, β2, preTCRα, γ 또는 δ 또는 이들의 조합에서 불변 사슬의 결핍성이다. 일부 구현예에서, 방법에서의 세포는 HLA 항원에서 결핍성이다. 일부 구현예에서, 방법에서의 세포는 β2 마이크로글로불린에서 결핍성이다. 일부 구현예에서, 방법에서의 세포는 SIR의 표적 항원의 발현에서 결핍성이다. 예를 들면, SIR 발현하는 T 세포는 SIR이 CD5에게로 유도되는 경우에 내인성 CD5에서 결핍성이거나, SIR이 TCR-베타1 불변 사슬에게로 유도되는 경우에 TCR-베타1 불변 사슬에서 결핍성이거나, SIR이 TCR-베타2 불변 사슬에게로 유도되는 경우에 TCR-베타2 불변 사슬에서 결핍성이거나, SIR이 CS1에게로 유도되는 경우에 내인성 CS1에서 결핍성이다
일부 구현예에서, SIR을 인코딩하는 핵산을 도입하는 것은 SIR을 인코딩하는 핵산을 포함하는 벡터를 형질도입하거나, SIR을 인코딩하는 핵산을 형질감염하는 것을 포함하고, 여기서 핵산 분자는 시험관내 전사된 RNA이다. 일부 구현예에서, 핵산 분자는 SIR의 두 개 이상의 성분을 인코딩하거나, 하나 이상의 벡터로 세포를 형질도입하거나, SIR의 상이한 소단위체를 인코딩하는 두 개 이상의 핵산 분자로 형질감염함으로써 도입된다. 예를 들면, 세포는 SIR의 두 개의 폴리펩티드 작용 단위 중 하나를 각각 인코딩하는 두 개 별도의 벡터로 형질도입될 수 있다. 두 개 별도의 벡터에 의해 인코딩된 예시적인 SIR 구조물은 SIR 단편 CD8SP-FMC63-vL-V5-[hTCRb-KACIAH]-F-P2A-PAC을 인코딩하는 서열번호 913에 해당하는 SIR 서열을 포함하는 SIR 렌티바이러스성 구조물 050216-S08에 의해 제공되고, 여기서 CD19 단일클론 항체 FMC63로부터 유래된 vL 단편은 KACIAH 돌연변이를 갖는 hTCRb의 불변 사슬에 V5 링커를 통해 연결된다. 이러한 SIR FPU은 F-P2A 절단가능한 링커를 통해 PAC (퓨로마이신 저항성) 유전자에 연결된다. 050216-S08 구조물을 위한 벡터는 pLenti-EF1α (서열번호 870)이다. SIR 렌티바이러스성 구조물 041916-A02은 SIR 단편 CD8SP-FMC63-vH-MYC-[TCRα-CSDVP]-F-F2A-BlastR을 인코딩하는 서열번호 997에 해당하는 SIR 서열을 포함하고, 여기서 CD19 단일클론 항체 FMC63로부터 유래된 vH 단편은 CSDVP 돌연변이를 갖는 hTCRa의 불변 사슬에 MYC 링커를 통해 연결된다. 이러한 SIR FPU는 F-F2A 절단가능한 링커를 통해 블라스티시딘 저항성 유전자에 연결된다. 041916-A02 구조물을 위한 벡터는 pLenti-EF1α-DWPRE (서열번호 871)이다. 예시적인 선별 마커는 서열번호 795 내지 서열번호 801에 제시되어 있다. 유사하게, 세포는 SIR의 두 개의 폴리펩티드 작용 단위 중 하나를 각각 인코딩하는 두 개 별도의 시험관내 전사된 RNA로 형질도입될 수 있다. SIR의 두 개 폴리펩티드 작용 단위에 추가하여, 각각의 RNA는 둘 다의 RNA로 형질도입되어 SIR의 둘 다의 폴리펩티드 작용 단위를 발현하는 세포를 선별하는데 사용될 수 있는 상이한 선별 마커 또는 리포터 (예로, tEGFR 또는 CD34 또는 CNB30 또는 돌연변이체 DHFR)를 보유할 수 있다.
일부 구현예에서, 방법은 a) 면역 효과기 세포 (예로, T 세포 또는 NK 세포)의 집단을 제공하는 단계; 및 b) 집단으로부터 T 조절 세포를 제거하고, 이로써 T 조절-고갈된 세포의 집단을 제공하는 단계:를 추가로 포함하고, 여기서 단계 a) 및 b)는 SIR을 인코딩하는 핵산을 집단 내로 도입하기 이전에 수행된다. 방법의 구현예에서, T 조절 세포는 CD25+ T 세포를 포함하고, CD25 항체 또는 이의 단편을 사용하여 세포 집단으로부터 제거된다. CD25 항체 또는 이의 단편은 기질, 예로 비드에 부착될 수 있다. 다른 구현예에서, 단계 (b)로부터 제공된 T 조절 세포가 고갈된 면역 효과기 세포의 집단은 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1% 미만의 CD25+ 세포를 포함한다. 또한 다른 구현예에서, 방법은 CD25를 포함하지 않는 질환-관련 항원을 발현하는 집단으로부터 세포를 제거하여 SIR을 인코딩하는 핵산을 집단에 도입하기 이전에 T 조절-고갈되고 질환-관련 항원이 고갈된 세포의 집단을 제공하는 단계를 추가로 포함한다. 질환-관련 항원은 CD19, CD30, CD123, CD20, CD22, CD33, CD138, BCMA, Lym1, Lym2, CD79b, CD170, CD179b, CD14 또는 CD11b 또는 이들의 조합으로부터 선택될 수 있다.
다른 구현예에서, 방법은 체크포인트 저해제를 발현하는 집단으로부터 세포를 고갈시켜서 SIR을 인코딩하는 핵산을 집단에 도입하기 이전에 T 조절-고갈되고 억제성 분자 고갈된 세포의 집단을 제공하는 단계를 추가로 포함한다. 체크포인트 저해제는 CTLA-4, PD-1, LAG-3, TIM3, B7-H1, CD160, P1H, 2B4, CEACAM (예로, CEACAM-1, CEACAM-3 및/또는 CEACAM-5), TIGIT, BTLA 및 LAIRl로부터 선택될 수 있다.
본 발명은 또한 본원에 기술된 바와 같은 핵산 분자, SIR 폴리펩티드 또는 벡터를 포함하는 재조합 세포, 예로 면역 효과기 세포, (예로, 세포의 집단, 예로 면역 효과기 세포의 집단) 및/또는 줄기 세포 (예로, 조혈 줄기 세포, 말초 혈액 줄기 세포, 골수 유래된 줄기 세포, 면역 줄기 세포, 유도된 다능성 줄기 세포 또는 iPSC)를 제공한다.
일부 구현예에서, 세포는 면역 세포이다. 면역 세포의 비제한적인 예는 T-세포 및 NK-세포를 포함한다. 또한, T-세포의 비제한적인 예는 Treg, CD8+ T 세포, 및 CD4+ T 세포를 포함한다. 일 구현예에서, 세포는 인간 T 세포이다. 일부 구현예에서, 세포는 인간 세포이다. 일부 구현예에서, 세포는 개 세포이다.
일 구현예에서, 인간 T 세포는 P-당단백질 (P-gp 또는 Pgp; MDR1, ABCB1, CD243)을 발현하는 T 세포이다. 일 구현예에서, 인간 T 세포는 P-당단백질 매개된 유출의 기질인 염료로 염색되지 않는 T 세포이다. 일 구현예에서, 세포는 본원에 참고문헌으로 통합되는 국제특허출원 PCT/US2017/042248에 기술된 바와 같은 T 세포이다. 일부 구현예에서, p-gp 발현 또는 p-gp 활성이 결여된 세포는 집단으로부터 제거된다.
일부 구현예에서, 세포는 디아실글리세롤 키나제 (DGK) 및/또는 이카로스 결핍성인 T 세포이다.
일 구현예에서, 세포는 T 세포이고, T 세포는 하나 이상의 내인성 T 세포 수용체 사슬에서 결핍성이다. 본 발명에 따라 기능적 TCR의 발현이 안정적으로 결여된 T 세포는 Zn 핑커 핵산 분해효소 (ZFN), CRISP/Cas9 및 내인성 T 세포 수용체 사슬을 표적하는 shRNA의 사용과 같은 다양한 접근법을 사용하여 생산될 수 있다. shRNA와 관련된 비제한적인 예시적 방법은 본원에 참고문헌으로 통합되는 미국 특허 US 2012/0321667A1에 기술되어 있다. TCR의 α 및 β 사슬의 불변 영역을 표적하는 ZEN을 사용하여 내인성 TCR 발현을 제거하는 것과 관련된 또 다른 비제한적인 예시적 방법은 Torikai H et al (Blood, 119(24), June, 14 2012에 기술되어 있다. 일부 구현예에서, 본 발명의 SIR이 코돈 최적화되거나 내인성 TCR 불변 사슬과 뉴클레오티드 서열에서 상이한 TCR 불변 사슬을 포함하고, 따라서 CRISP/Cas9, ZFN 및/또는 내인성 TCR 불변 사슬을 표적하는 shRNA에 의한 표적화를 회피하는 점이 언급되어야 한다.
기능적 내인성 TCR가 결여된 R 세포는, 예로 임의의 기능적 내인성 TCR을 이의 표면 상에 발현하지 않도록 조작되거나, 기능적 내인성 TCR을 포함하는 하나 이상의 소단위체 (예로, 내인성 TCRα, TCRβ1, TCRβ2, TCRγ, TCRδ 또는 pre-TCRα의 불변 사슬)을 발현하지 않도록 조작되거나, 기능적 내인성 TCR을 이의 표면 상에 거의 발현하지 않도록 조작될 수 있다. 대안적으로, T 세포는 실질적으로 손상된 내인성 TCR를, 예로 TCR의 하나 이상의 소단위체의 변이된 또는 절단된 형태의 발현에 의해 발현할 수 있다. 용어 "실질적으로 손상된 TCR"은 이러한 TCR숙주에서 유해한 면역 반응을 유도하지 않음을 의미한다. 미변형된 TCR은 일반적으로 외소적으로 발현될 때 (예로, 레트로바이러스성 또는 렌티바이러스성 벡터를 사용함) 일차 인간 T 세포에서 약하게 발현되고, 이들이 세포 표면 발현을 위해 내인성 TCR 사슬과 비효율적으로 경쟁하는 것을 제시한다. 그러나, 인간 세포에서 효율적인 번역을 위한 TCR 사슬의 최적화가 도입된 TCR의 더 나은 발현을 유도함을 보여주었다. 더욱 중요한 점은 이러한 우성 TCR의 외소적 발현은 인간 T 세포에서 내인성 TCR 목록의 많은 부분의 표면 발현을 방해한다.
일 구현예에서, 세포는 줄기 세포이고, 줄기 세포는 하나 이상의 내인성 T 세포 수용체 사슬에서 결핍성이다. 또 다른 구현예에서, 세포는 SIR의 하나 이상의 표적 항원 (예로, MPL, CD33, CD123, CD19 등)이 SIR에 의해 더 이상 인식되지 않는 형태로 결실되거나 변이되었던 줄기 세포이다. 예로서, CD19 표적하는 SIR은 CRISP/Cas9 또는 Zn 핑거 핵산 분해효소를 사용하여 CD19 결핍성이 되었던 줄기 세포에서 발현되어, 이러한 줄기 세포에 의해 생산된 B 세포는 CD19-표적하는 SIR을 발현하는 T 세포에 의해 제거되지 않는다. 대안적으로, CD19 표적하는 SIR는 내인성 CD19가 CRISP/Cas9 또는 Zn 핑거 핵산 분해효소를 사용하여 SIR에 의해 표적되지 않는 형태로 변이되었던 줄기 세포에서 발현되어, 이러한 줄기 세포에 의해 생산된 B 세포는 CD19-표적하는 SIR을 발현하는 T 세포에 의해 제거되지 않는다. 또 다른 구현예에서, SIR은 SIR-표적 항원의 발현이 결여되거나 SIR에 의해 인식되지 않는 SIR 표적 항원의 변이된 형태를 발현하도록 유전적으로 조작된 자가유래 또는 동종유래 공여체로부터의 면역 효과기 세포 및 줄기 세포에서 발현된다. 예를 들면, CD19 표적하는 SIR은 CRISP/Cas9 또는 Zn 핑거 핵산 분해효소를 사용하여 CD19 결핍성이 되었던 자가유래 또는 동종유래 조혈 줄기 세포와 함께 환자에게 주입된 T 세포에서 발현되어, 이러한 줄기 세포에 의해 생산된 B 세포는 CD19-표적하는 SIR을 발현하는 T 세포에 의해 제거되지 않는다. 대안적으로, CD19 표적하는 SIR은 내인성 CD19가 CRISP/Cas9 또는 Zn 핑거 핵산 분해효소에 의해 표적되지 않는 형태로 변이되었던 자가유래 또는 동종유래 조혈 줄기 세포와 함께 환자에게 주입된 T 세포에서 발현되어, 이러한 줄기 세포에 의해 생산된 B 세포는 CD19-표적하는 SIR을 발현하는 T 세포에 의해 제거되지 않는다. 유사한 접근법이 shRNA, CRISP/Cas9 또는 Zn 핑거 핵산 분해효소를 사용하여 이들 항원이 질환 관련 또는 질환 유발 세포 상에 발현되는 특이적 특환의 치료를 위해 이들 항원을 표적하는 SIR-T 세포를 수여받은 피험자에서의 줄기 세포에서 다른 내인성 항원 (예로, MPL, CD33, CD123 등)을 변이하거나 제거하는데 사용될 수 있다.
T 세포 또는 자연 킬러 (NK) 또는 줄기 세포는 피험자로부터 획득될 수 있다. 용어 "피험자"는 면역 반응이 유도될 수 있는 살아있는 유기체 (예로, 포유동물)을 포함하도록 의도된다. 피험자의 예는, 인간, 원숭이, 침팬지, 개, 고양이, 마우스, 래트 및 이들의 트랜스유전자 종을 포함한다. T 세포는 말초 혈액 단핵구, 골수, 림프절 조직, 제대혈, 흉선 조직, 감염 부위로부터의 조직, 복수, 흉막 삼출, 비장 조직 및 종양을 포함한 다수의 출처로부터 획득될 수 있다. T 세포는 조직 상주하는 감마-델타 T 세포일 수 있고, 이는 SIR의 발현 이전에 시험관내에서 배양되고, 증식될 수 있다.
SIR- 및/또는 CAR- 및/또는 Ab-TCR- 및/또는 TRUC 및/또는 cTCR-발현하는 면역 효과기 세포는 프로테인 L로의 자극에 의해 증식할 수 있다. 일 관점에서, 프로테인 L은 비드 상에 또는 플레이트와 같은 또 다른 표면 상에 고정화된다. 일 관점에서, 프로테인 L은 CD3 항체와 동일한 비드 상에 고정화된다. 일 관점에서, 프로테인 L은 CD28 항체와 동일한 비드 상에 고정화된다. 일 관점에서, 프로테인 L은 CD3 항체 및 CD28 항체 둘 다가 고정된 비드 상에 고정화된다. 일 관점에서, 프로테인 L은 인위적 항원 제시 세포의 표면에서 발현된다. 일 관점에서, 프로테인 L은 하나 이상의 보조자극 분자와 결합하여 인위적 항원 제시 세포의 표면에서 발현된다. 일 관점에서, 보조자극 분자는 CD28, 41BB 또는 OX40 중 하나 이상을 포함한다. 일 관점에서, 프로테인 L을 이의 표면에 발현하는 세포는 포유동물 세포이다. 일 관점에서, 세포는 인간 세포이다. 일 관점에서, 세포는 293FT 세포이다. 다른 관점에서, 세포는 K562 세포이다. 일 관점에서, 프로테인 L은 세포에서 안정적으로 발현된다. 다른 관점에서, 프로테인 L은 세포에서 일시적으로 발현된다. 프로테인 L은 당해 기술분야에 숙지된 임의의 방법에 의해 세포에서 발현될 수 있다. 일 관점에서, SIR 또는 CAR 또는 Ab-TCR 또는 TRUC 또는 cTCR-발현하는 면역 효과기 세포는 프로테인 L 코팅된 비드 또는 APC와 함께 10분 내지 수일 또는 수주의 기간 (또는 이들 사이의 임의의 기간) 동안 공동배양에 의해 증식될 수 있다.
본 발명의 특정 관점에서, 면역 효과기 세포, 예로 T 세포는 퍼콜TM 분리법과 같은 당업자에게 숙지된 임의의 다수의 기법을 사용하여 피험자로부터 수집된 혈액 유닛으로부터 획득될 수 있다. 바람직한 관점에서, 개인의 순환하는 혈액으로부터의 세포는 성분채집술에 의해 획득된다. 성분채집술 산물은 보통 T 세포를 포함하는 림프구, 단핵구, 과립구, B 세포, 다른 유핵 백혈구, 적혈구 및 혈소판을 포함한다. 일 관점에서, 성분채집술에 의해 수집된 세포는 세척되어 혈장 분획을 제거하고, 선택적으로 후속적 프로세싱 단계를 위해 세포를 적절한 완충액 또는 배지에 배치할 수 있다. 일 구현예에서, 세포는 포스페이트 완충된 식염수 (PBS)로 세척된다. 대안의 구현예에서, 세척 용액은 칼슘이 부족하고, 마그네슘이 부족할 수 있거나, 이가 양이온 모두가 아니더라도 많은 것이 부족할 수 있다.
칼슘의 부재 시 초기 활성화 단계는 확대된 활성화를 유도할 수 있다. 당업자라면 세척 단계가 반-자동화된 "유동-통과" 원심분리기 (예를 들면, Cobe 2991 세포 프로세서, Baxter CytoMate 또는 Haemonetics Cell Saver 5)를 제조사의 추천사항에 따라 사용하는 것과 같은 당해 기술분야에 숙지된 방법에 의해 달성될 수 있음을 바로 이해할 것이다. 세척 이후에, 세포는, 예를 들면 Ca 없는, Mg 없는 PBS, PlasmaLyte A 또는 완충액이 없거나 없는 다른 식염수 용액과 같은 다양한 생체적격한 완충액에 재현탁될 수 있다. 대안적으로, 성분채집술 시료의 원치않는 성분이 제거되고, 세포가 배양 배지에 직접적으로 재현탁될 수 있다.
본 출원의 방법은 5% 이하, 예를 들면 2%의 인간 AB 혈청을 포함하는 배양 배지 조건을 사용하고, 기지의 배양 배지 및 조성물, 예를 들면 Smith et al., "Ex vivo expansion of human T cell for adoptive immunotherapy using the novel Xeno-free CTS Immune Cell Serum Replacement" Clinical & Translational Immunology (2015) 4, e31; doi: 10.1038/cti.2014.31에 기술된 것을 채용할 수 있다.
일 관점에서, T 세포는 절혈구를 용해하여 단핵구를 고갈시킴으로써, 예를 들면 반대유동 원심분리 용출법 또는 퍼콜TM 구배를 통한 원심분리법에 의해 말초 혈액 림프구로부터 단리된다.
또 다른 구현예에서, 본원에 기술된 SIR 발현하는 효과기 세포는 SIR 발현하는 세포의 활성을 증진하는 제제를 추가로 발현할 수 있다. 일부 구현예에서, 제제는 억제성 분자를 억제하는 것이다. 억제성 분자의 비제한적인 예는 PD-1, PD-L1, CTLA-4, TIM-3, CEACAM (예로, CEACAM-1, CEACAM-3 및/또는 CEACAM-5), LAG-3, VISTA, BTLA, TIGIT, LAIR1, CD160, 2B4 및 TGFR 베타를 포함한다. 이들 억제성 분자를 억제하는 제제의 비제한적인 예는 서열번호 3102 내지 3107 (서열번호 827 내지 832의 코딩 서열)에 제공되어 있다 (표 8 참조). 일 구현예에서, 억제성 분자를 억제하는 제제는 억제성 분자에 결합하는 제 1 폴리펩티드, 예로 scFv 또는 VHH 또는 수용체 또는 리간드 단편를 세포에 양성 신호를 제공하는 제 2 폴리펩티드, 예로 41BB, CD27, OX40, CD28, Dap10, CD2, CD5, ICAM-1, LFA-1, Lck, TNFR-1, TNFR-II, Fas, CD30, CD40 또는 이들의 조합과 같은 세포내 신호전달 도메인 및/또는 일차 신호전달 도메인 (예로, CD3 제타 신호전달 도메인)과 함께 포함한다. 이러한 폴리펩티드를 발현하는 예시적인 SIR은 서열번호 3217 내지 3219 및 서열번호 3221 및 3222에 제시되어 있다. 일 구현예에서, 억제성 분자를 억제하는 제제는 억제성 분자에 결합하는 제 1 폴리펩티드, 예로 scFv 또는 VHH 단편 또는 수용체 또는 리간드 단편를, 본원에 기술된 T 세포 수용체 불변 사슬 (예로, TCRa, TCRb1, TCRb2, pre-TCRa, pre-TCRa-Del48, TCR-감마 또는 TCR-델타의 불변 사슬)과 함께 포함한다. 억제성 분자에 결합하는 예시적인 SIR은 서열번호 3572, 3573, 3574 및 3575에 제시되어 있다.
또 다른 구현예에서, 본원에 기술된 SIR 발현하는 세포는 부속 모듈, 예로 SIR 발현하는 세포의 활성을 증진하는 제제를 추가로 발현할 수 있다. SIR 발현하는 세포의 활성을 증진할 수 있는 제제를 포함하는 부속 모듈의 여러 예는 서열번호 3087 내지 3116 (표 8)에 제공되어 있다. 예를 들면, 일 구현예에서, 제제는 SIR 사슬 (예로, CD3ζ, CD3δ, CD3ε, CD3γ 또는 이들의 조합)의 발현 및/또는 활성을 증가시키는 제제일 수 있다. 또 다른 구현예에서, 제제는 SIR 발현하는 세포로 보조자극 신호를 제공하는 제제 (예로, vFLIP K13, vFLIP MC159, cFLIP-L, cFLIP-p22, HTLV1 Tax, HTLV2 Tax, 41BB 또는 CD28)일 수 있다. 또 다른 구현예에서, 제제는 유도가능한 방식으로 SIR 발현하는 세포로 보조자극 신호를 제공하는 제제 (예로, FKBPx2-K13, FKBPx2-MC159, FKBPx2-cFLIP, FKBPx2-cFLIP-L, FKBPx2-cFLIP-p22, FKBPx2-HTLV1 Tax, FKBPx2-HTLV2 Tax, FKBPx2-41BB 또는 FKBPx2-CD28, Myr-MYD88-CD40-Fv'-Fv 등)일 수 있다. 또 다른 구현예에서, 제제는 SIR 발현하는 세포의 증식 또는 유지를 촉진하는 사이토카인 또는 케모카인 (예로, CD40L, IL2, IL-7, IL-15, IL12f 또는 IL-21)일 수 있다. 또 다른 구현예에서, 제제는 SIR 발현하는 세포의 활성을 촉진하고/거나 SIR 발현하는 세포로 상승작용하는 용해성 수용체 (예로, sHVEM 또는 sHVEM-Alb8-vHH)일 수 있다. 또 다른 구현예에서, 제제는 억제성 분자를 억제하는 제제일 수 있다. 억제성 분자, 예로 PD1은 일부 구현예에서, SIR 발현하는 세포가 면역 효과기 반응을 올리는 능력을 감소시킬 수 있다. 또 다른 구현예에서, 제제는 PD1 또는 CTLA4를 표적하는 scFv일 수 있다. 예시적인 PD1 또는 CTLA4 표적하는 scFv는 서열번호 3102 내지 3107에 제공되어 있다. 일 구현예에서, 제제는 예로 PD1, PD-L1, CTLA4, TIM3, CEACAM (예로, CEACAM-1, CEACAM-3 및/또는 CEACAM-5), LAG3, VISTA, BTLA, TIGIT, LAIR1, CD160, 2B4 또는 TGFR 베타 또는 이들의 임의의 단편 (예로, 이들의 임의의 세포외 도메인의 적어도 일부)와 같은 억제성 분자의 제 1 폴리펩티드 및 본원에 기술된 세포내 신호전달 도메인 (예로, 본원에 기술된 바와 같은 41BB, CD27 또는 CD28) 및/또는 일차 신호전달 도메인 (예로, 본원에 기술된 CD3 제타 신호전달 도메인)인 제 2 폴리펩티드를 포함한다. 일 구현예에서, 제제는 PD1 또는 이의 단편의 제 1 폴리펩티드 (예로, PD1의 세포외 도메인의 적어도 일부) 및 본원에 기술된 세포내 신호전달 도메인의 제 2 폴리펩티드 (예로, 본원에 기술된 CD28 신호전달 도메인 및/또는 본원에 기술된 CD3 제타 신호전달 도메인)을 포함한다.
일 구현예에서, 제제는 PD1 또는 이의 단편의 제 1 폴리펩티드 및 본원에 기술된 세포내 신호전달 도메인의 제 2 폴리펩티드 (예로, CD28, CD27, OX40 또는 4-IBB 신호전달 도메인 및/또는 CD3 제타 신호전달 도메인)을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 제제는 PD1 또는 이의 단편의 제 1 폴리펩티드 및 본원에 기술된 T 세포 수용체 불변 사슬 (예로, TCRa, TCRb1, TCRb2, pre-TCRa, pre-TCRa-Del48, TCR-감마 또는 TCR-델타의 불변 사슬)인 제 2 폴리펩티드를 포함한다.
일 구현예에서, 본원에 기술된 SIR 발현하는 효과기 세포는 동일한 또는 상이한 표적에 대한 상이한 항원 결합 도메인을 포함할 수 있는 제 2 SIR을 추가로 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 제 2 SIR은 제 1 SIR과 동일한 또는 상이한 세포 유형을 표적할 수 있다.
일 구현예에서, 본원에 기술된 SIR 발현하는 효과기 세포는 동일한 또는 상이한 항원 결합 도메인, 선택적으로 동일한 또는 상이한 표적을 갖는 CAR을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, CAR은 제 1 SIR과 동일한 또는 상이한 세포 유형을 표적할 수 있다. 여러 예시적인 CAR의 핵산 및 아미노산 서열은 서열번호 9659 내지 9854 및 서열번호 9873 내지 10068에 각각 제시되어 있다. 일 구현예에서, CAR는 질환 관련 항원과 동일한 질환 세포 유형 (예로, 암) 상에 발현된 표적에 대한 항원 결합 도메인을 포함한다. 일 구현예에서, SIR 발현하는 세포는 제 1 항원을 표적하는 SIR 및 제 2 상이한 항원을 표적하고, 일차 신호전달 도메인은 없지만 보조자극 신호전달 도메인을 갖는 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 CAR를 포함한다. 이론에 결부되지 않더라고, CAR 상의 보조자극 신호전달 도메인, 예로 4-1BB, CD28, CD27 또는 OX-40의 배치는 둘 다의 표적이 발현된 세포에 대한 SIR 활성을 조정할 수 있다. 일 구현예에서, SIR 발현하는 세포는 i) 본원에 기술된 표적 항원에 결합하는 하나 이상의 항원 결합 도메인 및 하나 또는 두 개의 TCR 불변 사슬을 포함하는 제 1 질환 관련 항원, 및 ii) 상이한 표적 항원 (예로, 제 1 표적 항원과 동일한 질환 관련 (예로, 암) 세포 유형 상에 발현된 항원)을 표적하고, 항원 결합 도메인, 막통과 도메인, 일차 신호전달 도메인 및 보조자극 도메인을 포함하는 CAR:를 포함한다. 이러한 입체구조를 갖는 예시적인 구조물의 핵산 및 아미노산 서열은 서열번호 983 및 서열번호 3218에 각각 제시되어 있다. 이러한 구조물에서 SIR의 항원 결합 도메인은 CD19 표적하는 FMC63 단일클론 항체의 vL 및 vH 단편을 포함하는 한편, CAR의 항원 결합 도메인은 PD1의 세포외 도메인을 포함한다. 이러한 구조물에서, CAR의 일차 신호전달 도메인은 CD3z 세포질 도메인을 포함하는 한편, 보조자극 도메인은 4-1BB 세포질 도메인을 포함한다. 또 다른 구현예에서, SIR 발현하는 세포는 i) 본원에 기술된 표적 항원에 결합하는 항원 결합 도메인 및 하나 또는 두 개의 TCR 불변 사슬을 포함하는 SIR, 및 ii) 제 1 표적 항원이 아닌 항원 (예로, 제 1 표적 항원과 동일한 암 세포 유형 상에 발현된 항원)을 표적하고, 항원에 대한 항원 결합 도메인, 막통과 도메인 및 보조자극 신호전달 도메인을 포함하는 CAR:를 포함한다. 이러한 입체구조를 갖는 예시적인 구조물의 핵산 및 아미노산 서열은 서열번호 982 및 서열번호 3217에 각각 제시되어 있다. 이러한 구조물은 CAR가 CD3z 도메인이 결여된 점을 제외하고는 서열번호 983에 나타낸 구조물과 유사하다. 또한 또 다른 구현예에서, SIR 발현하는 세포는 i) 본원에 기술된 표적 항원에 결합하는 하나 이상의 항원 결합 도메인 및 하나 또는 두 개의 TCR 불변 사슬을 포함하는 제 1 질환 관련 항원, 및 ii) 상이한 표적 항원 (예로, 제 1 표적 항원과 동일한 질환 관련 (예로, 암) 세포 유형 상에 발현된 항원)을 표적하고, 항원 결합 도메인, 막통과 도메인 및 일차 신호전달 도메인을 포함하지만 보조자극 도메인은 없는 CAR:를 포함한다.
일 구현예에서, CAR는 항원 결합 도메인, 막통과 도메인 및 세포내 신호전달 도메인 (이에 제한되는 것은 아니지만, 41BB, CD27, OX40, CD28, Dap10, CD2, CD5, ICAM-1, LFA-1, Lck, TNFR-1, TNFR-II, Fas, CD30, CD40 또는 이들의 조합으로부터의 하나 이상의 세포내 신호전달 도메인과 같음) 및/또는 일차 신호전달 도메인 (이에 제한되는 것은 아니지만, CD3 제타 신호전달 도메인과 같음)을 포함한다. 예시적인 CAR 공동발현하는 SIR은 서열번호 3217 내지 3219 및 서열번호 3221 및 3222에 제시되어 있다.
일 구현예에서, SIR 발현하는 효과기 세포는 본원에 기술된 SIR 및 억제성CAR를 포함한다. 일 구현예에서, 억제성 CAR는 정상 세포 상에서 발견된 항원에 결합하나 암 세포에 결합하지 않는 항원 결합 도메인을 포함한다. 일 구현예에서, 억제성 CAR는 억제성 분자의 항원 결합 도메인, 막통과 도메인 및 세포내 도메인을 포함한다. 예를 들면, 억제성 CAR의 세포내 도메인은 PDl, PD-Ll, CTLA-4, TIM-3, CEACAM (예로, CEACAM-1, CEACAM-3 및/또는 CEACAM-5), LAG-3, VISTA, BTLA, TIGIT, LAIRl, CD160, 2B4 또는 TGFR 베타 중 어느 하나의 세포내 도메인일 수 있다. 억제성 CAR를 공동발현하는 예시적인 SIR 폴리펩티드는 서열번호 3220에 제시되어 있다. 이러한 폴리펩티드에서의 억제성 CAR는 막통과 도메인에 융합된 CXCR4 및 LAIR1의 세포질 도메인을 표적하는 vHH를 발현한다.
특정 구현예에서, SIR 분자의 항원 결합 도메인은 scFv를 포함하고, CAR 분자의 항원 결합 도메인은 scFv를 포함하지 않는다. 예를 들면, SIR 분자의 항원 결합 도메인은 scFv를 포함하고, CAR 분자의 항원 결합 도메인은 카멜리드 VHH 도메인을 포함한다.
일 구현예에서, 본 발명은 본원에 기술된 바와 같은 종양 항원에 결합하는 항원 결합 도메인을 포함하는 SIR 및 PD1 세포외 도메인 또는 이의 단편을 포함하는 CAR을 발현하는 면역 효과기 세포 (예로, T 세포, NK 세포)를 제공한다. 일부 구현예에서, 세포는 inhKIR 세포질 도메인; 막통과 도메인, 예로 KIR 막통과 도메인; 및 저해제 세포질 도메인, 예로 ITIM 도메인, 예로 inhKIR ITIM 도메인을 포함하는 억제성 분자를 추가로 포함한다. 일 구현예에서, 억제성 분자는 자연 발생하는 inhKIR 또는 자연 발생하는 inhKIR과 적어도 50, 60, 70, 80, 85, 90, 95 또는 99% 상동성을 공유하거나 이로부터 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15 또는 20개 이상의 잔기가 상이한 서열; SLAM 패밀리 세포질 도메인; 막통과 도메인, 예로 SLAM 패밀리 막통과 도메인; 및 저해제 세포질 도메인, 예로 SLAM 패밀리 도메인, 예로 SLAM 패밀리 ITIM 도메인이다. 또 다른 구현예에서, 억제성 분자는 자연 발생하는 SLAM 패밀리 구성원 또는 자연 발생하는 SLAM 패밀리 구성원과 적어도 50, 60, 70, 80, 85, 90, 95 또는 99% 상동성을 공유하거나 이로부터 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15 또는 20개 이상의 잔기가 상이한 서열이다.
본 발명은 또한 SIR 분자, SIR 분자를 발현하는 세포 또는 SIR 분자를 인코딩하는 핵산을 포함하는 세포를 피험자에게 투여하는 것을 포함한다. 일 구현예에서, 피험자는 본원에 기술된 장애를 갖고, 예로 피험자는 본원에 기술된 표적 항원을 발현하는, 암, 감염성 질환, 알레르기 질환, 퇴행성 질환 또는 자가면역 질환을 갖는다. 또한 일 구현예에서, 피험자는 본원에 기술된 장애의 증가된 위험성을 갖고, 예로 본원에 기술된 표적 항원을 발현하는, 암, 감염성 질환, 알레르기 질환, 퇴행성 질환 또는 자가면역 질환의 증가된 위험성을 갖는다. 일 구현예에서, 피험자는 인간이다. 또 다른 구현예에서, 피험자는 동물이다. 또한 또 다른 구현예에서, 피험자는 개와 같은 반려 동물이다.
본 발명은 본원에 기술된 질환 관련 항원의 발현과 관련된 질환을 치료하거나 예방하는 방법을 제공한다.
일 구현예에서, 본 발명은 표적화된 X-SIR을 발현하도록 조작된 면역 효과기 세포를 생성할 수 있는 면역 효과기 세포 (예로, T 세포) 또는 줄기 세포를 이를 필요로 하는 피험자에게 제공함으로써 질환을 치료하거나 예방하는 방법을 제공하고, 여기서 X는 본원에 기술된 바와 같은 질환 관련 항원을 예시하고, 질환 유발 또는 질환 관련 세포는 상기 X 항원을 발현한다. 표 9는 상이한 항원 및 이들 항원을 표적하는 SIR을 발현하는 면역 효과기 세포를 사용하여 예방되거나, 억제되거나, 치료될 수 있는 예시적인 질환의 목록을 제공하고 있다.
또 다른 구현예에서, 본 발명은 본원에 기술된 XSIR (또는 X-SIR)을 발현하도록 조작된 면역 효과기 세포 (예로, T 세포)를 이를 필요로 하는 피험자에게 제공함으로써 질환을 치료하거나 예방하는 방법을 제공하고, 여기서 암 세포는 항원 표적 "X"를 발현한다. 일 구현예에서, X는 정상 세포 및 암 세포 둘 다 상에서 발현되지만 정상 세포 상에서 더 낮은 수준으로 발현된다. 일 구현예에서, 방법은 XSIR가 X를 발현하는 암 세포에 결합하거나 이를 살상하지만, 본원에 기술된 검정법에 의해 결정된 바와 같이 X를 발현하는 정상 세포의 30%, 25%, 20%, 15%, 10% 또는 5% 미만을 살상하도록 허용하는 친화도로 X에 결합하는 SIR을 선별하는 단계를 추가로 포함한다. 예를 들면, 본원에 기술된 GLuc 방출 세포독성 검정법은 예로 암 세포를 표적하는 XSIR를 식별하는데 사용될 수 있다. 일 구현예에서, 선별된 SIR은 표적 항원에 대해 약 10-4 M 내지 10-8 M, 더욱 공통적으로 약 10-5 M 내지 10-7 M, 전형적으로 약 10-6 M 또는 10-7 M의 결합 친화도 KD를 갖는 항원 결합 도메인을 갖는다. 일 구현예에서, 선별된 항원 결합 도메인은 기준 항체 예로 본원에 기술되고, SIR의 결합 친화도가 유래된 항체보다 적어도, 2배, 5배, 10배, 20배, 30배, 50배, 100배 또는 1,000배 더 큰 결합 친화도를 갖는다.
또 다른 구현예에서, 본 발명은 표적화된 TCRB1-SIR을 발현하도록 조작된 면역 효과기 세포를 생성할 수 있는 면역 효과기 세포 (예로, T 세포) 또는 줄기 세포를 이를 필요로 하는 피험자에게 제공함으로써 질환을 치료하거나 예방하는 방법을 제공하고, 여기서 질환 유발 또는 질환 관련 세포는 TCRB1 (T 세포 수용체 베타1 사슬)을 발현한다. 일 구현예에서, 치료되거나 예방는 질환은 암 또는 면역 질환이다. 일 구현예에서, 치료되거나 예방되는 암은 T 세포 백혈병 또는 T 세포 림프종이다. 일 구현예에서, 치료되거나 예방되는 면역 장애는 다발성 경화증, 류마티스 관절염, 강직 척추염, 염증성 장 질환, 당뇨병, 이식편대숙주병 또는 자가면역 감상샘염이다.
또 다른 구현예에서, 본 발명은 표적화된 TCRB2-SIR을 발현하도록 조작된 면역 효과기 세포를 생성할 수 있는 면역 효과기 세포 (예로, T 세포) 또는 줄기 세포를 이를 필요로 하는 피험자에게 제공함으로써 질환을 치료하거나 예방하는 방법을 제공하고, 여기서 질환 유발 또는 질환 관련 세포는 TCRB2 (T 세포 수용체 베타2 SIR)을 발현한다. 일 구현예에서, 치료되거나 예방되는 질환은 암 또는 면역 장애이다. 일 구현예에서, 치료되거나 예방되는 암은 T 세포 백혈병 또는 T 세포 림프종이다. 일 구현예에서, 치료되거나 예방되는 면역 장애는 다발성 경화증, 류마티스 관절염, 강직 척추염, 염증성 장 질환, 당뇨병, 이식편대숙주병 또는 자가면역 감상샘염이다.
또 다른 구현예에서, 본 발명은 표적화된 T 세포 수용체 감마-델타-SIR을 발현하도록 조작된 면역 효과기 세포를 생성할 수 있는 면역 효과기 세포 (예로, T 세포) 또는 줄기 세포를 이를 필요로 하는 피험자에게 제공함으로써 질환을 치료하거나 예방하는 방법을 제공하고, 여기서 질환 유발 또는 질환 관련 세포는 T 세포 수용체 감마-델타를 발현한다. 일 구현예에서, 치료되거나 예방되는 질환은 암 또는 면역 장애이다. 일 구현예에서, 치료되거나 예방되는 암은 T 세포 백혈병 또는 T 세포 림프종이다. 일 구현예에서, 치료되거나 예방되는 면역 장애는 다발성 경화증, 류마티스 관절염, 강직 척추염, 염증성 장 질환, 당뇨병, 이식편대숙주병 또는 자가면역 감상샘염이다.
또 다른 구현예에서, 본 발명은 표적화된 CD4-DC-SIGN을 인코딩하는 SIR을 발현하도록 조작된 면역 효과기 세포를 생성할 수 있는 면역 효과기 세포 (예로, T 세포) 또는 줄기 세포를 이를 필요로 하는 피험자에게 제공함으로써 질환을 치료하거나 예방하는 방법을 제공한다. 일 구현예에서, 치료되거나 예방되는 질환은 HIV1/AIDS이다.
또 다른 구현예에서, 본 발명은 표적화된 자가항원 또는 이의 단편을 인코딩하는 SIR을 발현하도록 조작된 면역 효과기 세포를 생성할 수 있는 면역 효과기 세포 (예로, T 세포) 또는 줄기 세포를 이를 필요로 하는 피험자에게 제공함으로써 자가면역 질환을 치료하거나 예방하는 방법을 제공한다. 일 구현예에서, 자가면역 질환은 당뇨병, 류마티스 관절염, 다발성 경화증, 보통 천포창, 부신생물 천포창, 사구체신염, 강직 척추염, 궤양성 장염 또는 크론병이다. 일 관점에서, 질환은 보통 천포창이고, SIR의 항원 결합 도메인은 데스모글레인 3 (Dsg3)의 세포외 도메인을 포함한다.
또 다른 구현예에서, 본 발명은 CD16 또는 이의 결실 또는 점 돌연변이체 단편을 인코딩하는 보편적인 SIR을 SIR의 CD16 도메인에 결합하는 항체 또는 항체 단편 및 질환 관련 세포 상에 발현된 항원과 함께 발현하도록 조작된 면역 효과기 세포를 생성할 수 있는 면역 효과기 세포 (예로, T 세포) 또는 줄기 세포를 이를 필요로 하는 피험자에게 제공함으로써 암, 감염, 자가면역 또는 알레르기 질환을 치료하거나 예방하는 방법을 제공한다. 일 관점에서, 질환 관련 세포는 암 세포, 감염된 세포, 혈장 세포, B 세포 또는 T 세포이다.
또 다른 구현예에서, 본 발명은 면역글로불린 결합 수용체 또는 이의 결실 또는 점 돌연변이체 단편을 인코딩하는 보편적인 SIR을 발현하도록 조작된 면역 효과기 세포를 생성할 수 있는 면역 효과기 세포 (예로, T 세포) 또는 줄기 세포를 이를 필요로 하는 피험자에게 제공함으로써 암, 감염, 자가면역 또는 알레르기 질환을 치료하거나 예방하는 방법을 제공한다. SIR 발현하는 면역 효과기 세포는 SIR 수용체의 면역글로불린 결합 도메인에 결합하는 하나 이상의 항체 또는 항체 단편 및 질환 관련 세포 상에 발현된 하나 이상의 항원과 함께 환자에게 투여된다. 일 관점에서, 질환 관련 세포는 암 세포, 감염된 세포, 혈장 세포, B 세포 또는 T 세포이다.
또 다른 구현예에서, 본 발명은 T 세포 수용체 불변 사슬 (예로, TCRα 불변 사슬)에 연결된 면역글로불린 결합 수용체 또는 이의 결실 또는 점 돌연변이체 단편을 인코딩하는 보편적인 SIR 및 T 세포 수용체 불변 사슬 (예로, TCRβ 불변 사슬)에 연결된 항원 결합 도메인 (예로, scFv, vHH, vL, vH 또는 비-면역글로불린 항원 결합 도메인)을 발현하도록 조작된 면역 효과기 세포를 생성할 수 있는 면역 효과기 세포 (예로, T 세포) 또는 줄기 세포를 이를 필요로 하는 피험자에게 제공함으로써 암, 감염, 자가면역 또는 알레르기 질환을 치료하거나 예방하는 방법을 제공한다. SIR 발현하는 면역 효과기 세포는 제 1 SIR 수용체의 면역글로불린 결합 도메인에 결합하는 하나 이상의 항체 또는 항체 단편 및 질환 관련 세포 상에 발현된 하나 이상의 항원과 함께 환자에게 투여된다. 일 관점에서, 질환 관련 세포는 암 세포, 감염된 세포, 혈장 세포, B 세포 또는 T 세포이다.
또 다른 구현예에서, 면역글로불린 결합 수용체 또는 이의 결실 또는 점 돌연변이체 단편을 인코딩하는 보편적인 SIR을 상기 수용체에 결합된 하나 이상의 항체 또는 항체 단편 및 질환 관련 세포 상에서 발현된 하나 이상의 항원과 함께 발현하도록 조작된 면역 효과기 세포를 생성할 수 있는 면역 효과기 세포 (예로, T 세포) 또는 줄기 세포를 이를 필요로 하는 피험자에게 제공함으로써 암, 감염, 자가면역 또는 알레르기 질환을 치료하거나 예방하는 방법을 제공한다.
또 다른 구현예에서, 본 발명은 T 세포 수용체 불변 사슬에 연결된 CD16 또는 이의 결실 또는 점 돌연변이체 (예로, V158 돌연변이체) 단편을 인코딩하는 보편적인 SIR 및 T 세포 수용체 불변 사슬에 연결된 항원 결합 도메인 (예로, scFv, vHH, vL, vH 또는 비-면역글로불린 항원 결합 도메인)을 인코딩하는 SIR 둘 다를 발현하도록 조작된 면역 효과기 세포를 생성할 수 있는 면역 효과기 세포 (예로, T 세포) 또는 줄기 세포를 이를 필요로 하는 피험자에게 제공함으로써 암, 감염, 자가면역 또는 알레르기 질환을 치료하거나 예방하는 방법을 제공한다. SIR 발현하는 면역 효과기 세포는 SIR의 CD16 도메인에 결합하는 하나 이상의 항체 또는 항체 단편 및 질환 관련 세포 상에 발현된 하나 이상의 항원과 함께 환자에게 투여된다. 일 관점에서, 질환 관련 세포는 암 세포, 감염된 세포, 혈장 세포, B 세포 또는 T 세포이다.
또 다른 구현예에서, 본 발명은 CD16 또는 이의 결실 또는 점 돌연변이체 (예로, V158 돌연변이체) 단편을 인코딩하는 보편적인 SIR을, SIR의 CD16 도메인에 결합된 하나 이상의 항체 또는 항체 단편 및 질환 관련 세포 상에서 발현된 하나 이상의 항원과 함께 발현하도록 조작된 면역 효과기 세포를 생성할 수 있는 면역 효과기 세포 (예로, T 세포) 또는 줄기 세포를 이를 필요로 하는 피험자에게 제공함으로써 암, 감염, 자가면역 또는 알레르기 질환을 치료하거나 예방하는 방법을 제공한다. 일 관점에서, 질환 관련 세포는 암 세포, 감염된 세포, 혈장 세포, B 세포 또는 T 세포이다.
또 다른 구현예에서, 본 발명은 NKG2D 수용체 또는 이의 결실 또는 점 돌연변이체를 인코딩하는 SIR을 발현하도록 조작된 면역 효과기 세포 (예로, T 세포)를 이를 필요로 하는 피험자에게 제공함으로써 암, 감염, 자가면역 또는 알레르기 질환을 치료하거나 예방하는 방법을 제공한다. 일 관점에서, 질환 관련 세포는 암 세포, 감염된 세포, 혈장 세포, B 세포 또는 T 세포이다.
또 다른 구현예에서, 본 발명은 CD19SIR을 발현하도록 조작된 면역 효과기 세포를 생성할 수 있는 면역 효과기 세포 (예로, T 세포) 또는 줄기 세포를 이를 필요로 하는 피험자에게 제공함으로써 질환을 치료하거나 예방하는 방법을 제공한다. 일 관점에서, 질환은 면역 또는 알레르기 질환이다.
또 다른 구현예에서, 본 발명은 CD20SIR을 발현하도록 조작된 면역 효과기 세포 (예로, T 세포)를 이를 필요로 하는 피험자에게 제공함으로써 질환을 치료하거나 예방하는 방법을 제공한다. 일 관점에서, 질환은 면역 또는 알레르기 질환이다.
또 다른 구현예에서, 본 발명은 CD22SIR을 발현하도록 조작된 면역 효과기 세포 (예로, T 세포)를 이를 필요로 하는 피험자에게 제공함으로써 질환을 치료하거나 예방하는 방법을 제공한다. 일 관점에서, 질환은 면역 또는 알레르기 질환이다.
또 다른 구현예에서, 본 발명은 FITC-SIR을, 질환 관련 세포 상에서 발현된 항원에 결합하는 FITC-표지된 항체 또는 항체 단편 또는 수용체 또는 리간드 또는 비-면역글로불린 스캐폴드와 함께 발현하도록 조작된 면역 효과기 세포를 생성할 수 있는 면역 효과기 세포 (예로, T 세포) 또는 줄기 세포를 이를 필요로 하는 피험자에게 제공함으로써 암, 감염, 자가면역 또는 알레르기 질환을 치료하거나 예방하는 방법을 제공한다. 일 관점에서, 질환 관련 세포는 암 세포, 감염된 세포, 혈장 세포, B 세포 또는 T 세포이다.
또 다른 구현예에서, 본 발명은 아비딘-SIR을, 질환 관련 세포 상에서 발현된 항원에 결합하는 바이오틴-표지된 항체 또는 항체 단편 또는 수용체 또는 리간드 또는 비-면역글로불린 스캐폴드와 함께 발현하도록 조작된 면역 효과기 세포를 생성할 수 있는 면역 효과기 세포 (예로, T 세포) 또는 줄기 세포를 이를 필요로 하는 피험자에게 제공함으로써 암, 감염, 자가면역 또는 알레르기 질환을 치료하거나 예방하는 방법을 제공한다. 일 관점에서, 질환 관련 세포는 암 세포, 감염된 세포, 혈장 세포, B 세포 또는 T 세포이다.
또 다른 구현예에서, 본 발명은 아비딘-SIR을, 질환 관련 세포 상에서 발현된 항원에 결합하는 바이오틴-표지된 항체 또는 항체 단편 또는 수용체 또는 리간드 또는 비-면역글로불린 스캐폴드와 함께 발현하도록 조작된 면역 효과기 세포를 생성할 수 있는 면역 효과기 세포 (예로, T 세포) 또는 줄기 세포를 이를 필요로 하는 피험자에게 제공함으로써 암, 감염, 자가면역 또는 알레르기 질환을 치료하거나 예방하는 방법을 제공한다. 일 관점에서, 질환 관련 세포는 암 세포, 감염된 세포 또는 혈장 세포이다.
또 다른 구현예에서, 본 발명은 스트렙태그-SIR을, 질환 관련 세포 상에서 발현된 항원에 결합하는 스트렙태그-포함 항체 또는 항체 단편 또는 수용체 또는 리간드 또는 비-면역글로불린 스캐폴드와 함께 발현하도록 조작된 면역 효과기 세포를 생성할 수 있는 면역 효과기 세포 (예로, T 세포) 또는 줄기 세포를 이를 필요로 하는 피험자에게 제공함으로써 암, 감염, 자가면역 또는 알레르기 질환을 치료하거나 예방하는 방법을 제공한다. 일 관점에서, 질환 관련 세포는 암 세포, 감염된 세포 또는 혈장 세포이다.
또 다른 구현예에서, 본 발명은 항원 결합 도메인이 IgE에 결합하는 항체 또는 항체 단편을 포함하는 IgE-SIR을 발현하도록 조작된 면역 효과기 세포 (예로, T 세포)를 이를 필요로 하는 피험자에게 제공함으로써 질환을 치료하거나 예방하는 방법을 제공한다. 일 관점에서, 질환은 면역 또는 알레르기 질환이다.
또 다른 구현예에서, 본 발명은 암성 종양의 성장을 억제하도록 PD1SIR (예로, 이의 항원 결합 도메인으로서 PD1의 세포외 도메인을 포함하는 SIR)을 생체내에서 사용하는 피험자의 치료 방법에 관한 것이다. 예시적인 PD1-SIR의 핵산 서열은 서열번호 1337에 제공되어 있다. PD1SIR는 암성 종양의 성장을 억제하는데 단독으로 사용될 수 있다. 대안적으로, PD1SIR은 다른 SIR, CAR, 면역원성 제제, 표준 암 치료 또는 다른 항체와 조합하여 사용될 수 있다. 일 구현예에서, 피험자는 PD1SIR 및 본원에 기술된 XSIR로 치료된다. 또 다른 구현예에서, PD1SIR는 또 다른 SIR 또는 CAR, 예로 본원에 기술된 SIR 및 CAR 및 키나제 저해제, 예로 본원에 기술된 키나제 저해제와 조합하여 사용된다.
또 다른 구현예에서, 본 발명은 암성 종양의 성장을 억제하도록 XSIR 및 PD1-CAR 또는 CTL4-CAR을 생체내에서 사용하는 피험자의 치료 방법에 관한 것이다. 일 구현예에서, 피험자는 PD1-CAR 또는 CTL4-CAR 및 본원에 기술된 XSIR로 치료된다. PD1-CAR 및 XSIR (예로, CD19-SIR)을 인코딩하는 예시적인 구조물의 핵산 서열은 서열번호 982 내지 984에 제공되어 있다. CTLA4-CAR 및 XSIR (예로, CD19-SIR)을 인코딩하는 예시적인 구조물의 핵산 서열은 서열번호 986 및 987에 제공되어 있다. PD1SIR는 암성 종양의 성장을 억제하는데 단독으로 사용될 수 있다. 또 다른 구현예에서, PD1-CAR는 또 다른 SIR 또는 CAR, 예로 본원에 기술된 SIR 또는 CAR 및 키나제 저해제, 예로 본원에 기술된 키나제 저해제와 조합하여 사용된다. 일 구현예에서, XSIR는 PD1-CAR 또는 CTL4-CAR와 조합하여 사용된다.
또 다른 관점에서, 피험자를 치료하는 방법, 예로 과다증식 장애 또는 병태 (예로, 암), 예로 피험자에서 고형 종양, 연조직 종양, 혈액암 또는 전이성 병변을 감소 또는 완화하는 방법이 제공된다. 본원에서 사용된 바, 용어 "암"은 모든 유형의 암성 성장 또는 종양원 유전자 공정, 전이된 조직 또는 악성 형질전환된 세포, 조직 또는 기관을 침윤성의 조직병리학적 유형 또는 단계와 상관없이 포함하도록 의미한다. 예시적인 고형 종양은 유방, 간, 폐, 뇌, 림프, 위장관 (예로, 결장), 비뇨생식관 (예로, 신장, 요로상피 세포), 전립성 및 인두와 같은 다양한 기관계의 악성암, 예로 샘암종, 육종 및 암종을 포함한다. 샘암종은 대부분의 결장암, 신장암, 신장 세포 암종, 간암, 폐의 비-소세포 암종, 소장의 암 및 식도의 암과 같은 암을 포함한다. 일 구현예에서, 암은 흑색종, 예로 진행기 흑생종이다. 전술한 암의 전이성 병변은 또한 본 발명의 방법 및 조성물을 사용하여 치료되거나 예방될 수 있다. 치료되거나 예방될 수 있는 다른 암의 예는 췌장암, 골암, 피부암, 피부 또는 안구내 악성 흑색종, 자궁암, 난소암, 직장암, 두경부의 암, 항문 주변의 암, 위암, 고환암, 자궁암, 나팔관의 암종, 자궁내막의 암종, 자국경부의 암종, 질의 암종, 외음의 암종, 호지킨병, 비-호지킨 림프종, 식도의 암, 소장의 암, 내분비계의 암, 갑상샘의 암, 부갑상샘의 암, 부신샘의 암, 연조직의 육종, 요도의 암, 음경의 암, 급성 골수성 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 급성 림프모구성 백혈병, 만성 림프구성 백혈병을 포함한 만성 또는 급성 백혈병, 아동의 고형 종양, 림프구성 림프종, 방광의 암, 신장 또는 요관의 암, 신우의 암종, 중추신경계 (CNS)의 신생물, 일차 CNS 림프종, 종양 혈관생성, 척수 종양, 뇌줄기 교아종, 뇌하수체 샘암종, 카포시 육종, 표피성 암, 편평세포암, T 세포 림프종, 석면에 의해 유도된 암을 포함한 환경적으로 유도된 암 및 상기 암의 조합을 포함한다. 전이성 암, 예로 PD-L1을 발현하는 전이성 암 (Iwai et al. (2005) Int. Immunol. 17: 133-144)의 치료는 본원에 기술된 분자를 사용하여 효과적일 수 있다
암의 성장이 억제될 수 있는 예시적인 암은 전형적으로 면역요법에 반응하는 암을 포함한다. 치료를 위한 암의 비제한적인 예는 신장암 (예로, 투명 세포 암종), 흑색종 (예로, 전이성 악성 흑색종), 유방암, 전립선암 (예로, 호르몬 난치성 전립선 샘암종), 결장암 및 폐암 (예로, 비-소세포 폐암)을 포함한다. 추가적으로, 재발성 또는 난치성 악성암은 본원에 기술된 분자를 사용하여 치료될 수 있다.
일 구현예에서, 본 발명은 면역 효과기 세포를 생성할 수 있는 포유동물 면역 효과기 세포 (예로, T 세포) 또는 줄기 세포에서의 발현을 위한 프로모터에 작동가능하게 연결된 SIR을 포함하는 벡터에 관한 것이다. 일 관점에서, 본 발명은 본원에 기술된 바와 같은 암 관련 항원을 발현하는 암을 치료하거나 예방하는데 사용되는 본 발명의 SIR을 발현하는 재조합 면역 효과기 세포를 제공한다. 일 관점에서, 본 발명의 SIR 발현하는 세포는 종양 세포를 이의 표면에 발현된 적어도 하나의 암 관련 항원과 접촉시킬 수 있어, SIR 발현하는 세포는 암을 표적하고, 암의 성장을 억제한다. 일 관점에서, 본 발명은 본원에 기술된 바와 같은 질환 관련 항원을 발현하는 질환을 치료하거나 예방하는데 사용되는 본 발명의 SIR을 발현하는 재조합 면역 효과기 세포를 제공한다. 일 관점에서, 본 발명의 SIR 발현하는 세포는 질환 유발 또는 질환 관련 세포를 이의 표면에 발현된 적어도 하나의 암 관련 항원과 접촉시킬 수 있어, SIR 발현하는 세포는 질환 유발 또는 질환 관련 세포을 표적하고, 암의 성장을 억제한다.
일 구현예에서, 본 발명은 질환 (예로, 암, 자가면역 질환, 감염성 질환, 알레르기 질환 또는 퇴행성 질환)의 성장을 억제하는 방법으로서, SIRT가 항원에 반응하여 활성화되고, 질환 유발 또는 질환 관련 세포를 표적하도록 질환 유발 또는 질환 관련 세포를 본 발명의 SIR 발현하는 세포와 접촉시키는 단계를 포함하고, 여기서 질환 유발 또는 질환 관련 세포의 성장이 억제되는, 방법에 관한 것이다. 일 관점에서, 본 발명은 질환을 예방하는 방법으로서, 질환의 위험성이 있는 환자에게 SIRT가 항원에 반응하여 활성화되고, 질환 유발 또는 질환 관련 세포를 표적하도록 SIR 발현하는 세포 또는 본 발명의 SIR 발현하는 세포를 생성할 수 있는 세포를 투여하는 단계를 포함하고, 여기서 질환 유발 또는 질환 관련 세포의 성장이 예방되는, 방법에 관한 것이다. 일 관점에서, 질환은 암, 감염성 질환, 자가면역 질환, 알레르기 질환 또는 퇴행성 질환이다.
또 다른 구현예에서, 본 발명은 피험자에서 암을 치료하는 방법에 관한 것이다. 방법은 피험자에서 암을 치료하도록 본 발명의 SIR 발현하는 세포를 피험자에게 투여하여 단계를 포함한다. 일 관점에서, 본원에 기술된 바와 같은 암 관련 항원의 발현과 연관된 암은 혈액 또는 혈액학적 암이다. 일 관점에서, 혈액학적 암은 백혈병 또는 림프종이다. 일 관점에서, 본원에 기술된 바와 같은 암 관련 항원의 발현과 연관된 암은 이에 제한되는 것은 아니지만, 예로 이에 제한되는 것은 아니지만 B 세포 급성 림프성 백혈성 ("BALL"), 전구 B 세포 급성 림프구 백혈병, T 세포 급성 림프성 백혈병 ("TALL"), 급성 림프성 백혈병 (ALL)을 포함하는 하나 이상의 급성 백혈병; 이에 제한되는 것은 아니지만, 만성 골수성 백혈병 (CML), 만성 림프성 백혈병 (CLL)을 포함하는 하나 이상의 만성 백혈병을 포함하는 암 및 악성암을 포함한다. 본원에 기술된 바와 같은 암 관련 항원의 발현과 연관된 추가적인 암 또는 혈액학적 병태는 이에 제한되는 것은 아니지만, 예로 B 세포 전구림프구 백혈병, 혈장모세포성 가지세포 신생물, 버킷 림프종, 확산성 대형 B 세포 림프종, 난포성 림프종, 털세포 백혈병, 소세포 또는 대세포 난포성 림프종, 악성 림프증식성 병태, MALT 림프종, 외투 세포 림프종, 경계 영역 림프종, 다발성 골수종, 골수이형성증 및 골수이형성 증후군, 비-호지킨 림프종, 혈장모세포 림프종, 혈장모양 가지세포 신생물, 왈덴스트롬 거대글로불린혈증 및 골수성 혈액 세포의 비효율적 생산 (또는 이형성증)을 공유하는 혈액학적 병태의 다양한 집합인 "전-백혈병" 등을 포함한다. 또한 본원에 기술된 바와 같은 암 관련 항원의 발현과 연관된 질환은 이에 제한되는 것은 아니지만, 예로 비전형 및/또는 비-고전적 암, 악성암, 전암성 병태 또는 본원에 기술된 바와 같은 암 관련 항원의 발현과 연관된 증식성 질환을 포함한다.
또한 또 다른 구현예에서, 본 발명은 피험자에서 질환을 치료하는 방법에 관한 것이다. 방법은 피험자에서 질환을 치료하도록 본 발명의 SIR 발현하는 세포를 피험자에게 투여하여 단계를 포함한다. 일 관점에서, 본원에 기술된 바와 같은 질환 관련 항원의 발현과 연관된 질환은 감염성 질환이다. 일 관점에서, 감염성 질환은 HIV1, HIV2, HTLV1, 엡스타인 바 바이러스 (EBV), 사이토메갈로바이러스 (CMV), 아데노바이러스, 아데노-관련 바이러스, BK 바이러스, 인간 헤르페스 바이러스 6, 인간 헤르페스 바이러스 8, 인플루엔자 A 바이러스, 인플루엔자 B 바이러스, 파라인플루엔자 바이러스, 조류 플루 바이러스, MERS 및 SARS 코로나 바이러스, 크리미아 콩고 출혈열 바이러스, 리노 바이러스, 엔테로바이러스, 뎅기 바이러스, 웨스트 나일 바이러스, 에볼라 바이러스, 마르버그 바이러스, 라사 열 바이러스, 지카 바이러스, RSV, 홍역 바이러스, 유행성 이하선염 바이러스, 리노 바이러스, 배리셀라 바이러스, 헤르페스 심플렉스 바이러스 1 및 2, 배리셀라 조스터 바이러스, HIV-1, HTLV1, 간염 바이러스, 엔테로바이러스, B형 간염 바이러스, C형 간염 바이러스, 니파 및 리프트 계곡 열 바이러스, 일본 뇌염 바이러스, 마이코박테리움 튜버쿨로시스, 비전형적 마이코박테리아 종, 뉴모시스티스 지로벡시, 톡소플라스마, 리케챠, 노카르디아, 아스퍼질러스, 뮤코르 또는 칸디다에 의한 감염과 연관된다.
또한 또 다른 구현예에서, 본 발명은 피험자에서 질환을 치료하는 방법에 관한 것이다. 방법은 피험자에서 질환을 치료하도록 본 발명의 SIR 발현하는 세포를 피험자에게 투여하여 단계를 포함한다. 일 관점에서, 본원에 기술된 바와 같은 질환 관련 항원의 발현과 연관된 질환은 면역 또는 알레르기 또는 퇴행성 질환이다. 일 관점에서, 면역 또는 퇴행성 질환은 당뇨병, 다발성 골수종, 류마티스 관절염, 보통 천포창, 강직 척추염, 하시모토 갑상샘염, SLE, 사코이드증, 피부경화증, 혼합된 연결조직 질환, 이식편대숙주병, 땅콩 알레르기, 만성 자발성 두드러기, 식품 알레르기, 건초열, 계절성 알레르기, 화분 알레르기, HLH (적혈구포식 림프조직구증), 아밀로이드증 또는 알츠하이머병이다.
일부 구현예에서, 본 발명의 SIR 발현하는 세포로 치료되거나 예방될 수 있는 암은 다발성 골수종이다. 다발성 골수종은 골수에서 혈장 세포 클론의 축적을 특징으로 하는 암이다. 다발성 골수종을 위한 최신의 요법은 이에 제한되는 것은 아니지만, 탈리도미드의 유사체인 레날리도미드로의 치료를 포함한다. 레날리도미드는 항-종양 활성, 혈관생성 억제 및 면역조정을 포함하는 활성을 갖는다. 일반적으로 골수종 세포는 본원에 기술된 바와 같은 암 관련 항원 CD19 발현의 경우에 유세포 계측법에 의해 음성인 것으로 생각된다. 따라서, 일부 구현예에서, 예로 본원에 기술된 바와 같은 CD19SIR은 골수종 세포를 표적하는데 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 본 발명의 SIR 요법은 하나 이상의 추가적인 요법, 예로 레날리도미드 치료와 조합하여 사용될 수 있다. 본원에서 기술된 다른 SIR, 예로 BCMA-SIR, CD138-SIR, CSI-SIR, GPRC5D-SIR 등도 역시 다발성 골수종의 치료 또는 예방에 사용될 수 있다.
본 발명은 면역 효과기 세포 (예로, T 세포를 생성하는 T 세포 또는 줄기 세포)가 합성 항원 수용체 (SIR)를 발현하도록 유전적으로 변형되고, SIR 발현하는 T 세포 또는 줄기 세포가 이를 필요로 하는 수여자에게 주입되는 세포요법의 유형을 포함한다. 주입된 세포는 수여자에서 질환 관련 세포 (예로, 종양 세포 또는 바이러스로 감염된 세포)를 살상할 수 있다. 항체 요법과는 달리, SIR-변형된 면역 효과기 세포 (예로, T 세포, 줄기 세포)는 생체내에서 복제할 수 있어 지속적인 종양 조절을 유도할 수 있는 장기간의 유지를 가져온다. 다양한 관점에서, 환자에게 투여되는 면역 효과기 세포 (예로, T 세포를 생성할 수 있는 T 세포 또는 줄기 세포) 또는 이들의 자손은 환자에서, T 세포 또는 줄기 세포의 환자에게 투여 이후 적어도 4개월, 5개월, 6개월, 7개월, 8개월, 9개월, 10개월, 11개월, 12개월, 13개월, 14개월, 15개월, 16개월, 17개월, 18개월, 19개월, 20개월, 21개월, 22개월, 23개월, 2년, 3년, 4년 또는 5년 동안 유지된다.
본 발명은 면역 효과기 세포 (예로, T 세포)가 합성 항원 수용체 (SIR)를 발현하도록, 예로 시험관내 전사된 RNA에 의해 변형되고, SIRT 세포가 이를 필요로 하는 수여자에게 주입되는 세포요법의 유형을 포함한다. 주입된 세포는 수여자에서 질환 관련 세포 (예로, 종양 세포 또는 바이러스로 감염된 세포)를 살상할 수 있다. 따라서, 다양한 관점에서, 환자에게 투여되는 면역 효과기 세포 (예로, T 세포)는 환자에게 T 세포의 투여 이후 1개월 미만, 예로 3주, 2주 1주 동안 존재한다.
본 발명은 또한 면역 효과기 세포 (예로, T 세포)를 생성할 수 있는 줄기 세포 (예로, 조혈 줄기 세포 또는 림프성 줄기 세포 또는 배아 줄기 세포 또는 유도된 다능성 줄기 세포)가 합성 항원 수용체 (SIR)를 발현하도록 변형되고, 이를 필요로 하는 수여자에게 투여되는 세포요법의 유형을 포함한다. 투여된 줄기 세포는 수여자 내로 이식 이후에 면역 효과기 세포 (예로, T 세포)를 생성하고, 이는 (예로, 면역 효과기 세포) 수여자에서 질환 관련 세포를 살상할 수 있다. 따라서, 다양한 관점에서, 환자에서 SIR 발현하는 줄기 세포의 투여 이후 생산된 면역 효과기 세포 (예로, T 세포)는 환자에서, T 세포 또는 줄기 세포의 환자에게 투여 이후 적어도 1주, 2주, 3주, 1개월, 2개월, 3개월, 4개월, 5개월, 6개월, 7개월, 8개월, 9개월, 10개월, 11개월, 12개월, 13개월, 14개월, 15개월, 16개월, 17개월, 18개월, 19개월, 20개월, 21개월, 22개월, 23개월, 2년, 3년, 4년, 5년, 10년 또는 20년 동안 유지된다. 본 발명은 또한 면역 효과기 세포 (예로, T 세포)를 생성할 수 있는 줄기 세포가 합성 항원 수용체 (SIR)를 발현하도록 변형되고, 이를 필요로 하는 수여자에게 주입되는 면역 효과기 세포를 생성하도록 시험관내에서 분화되는 세포요법의 유형을 포함한다. 주입된 면역 효과기 세포 (예로, T 세포)는 수여자 내로 주입 이후에 수여자에서 질환 관련 세포를 살상할 수 있다. 따라서, 다양한 관점에서, 환자에서 투여되는 면역 효과기 세포 (예로, T 세포)는 환자에서 적어도 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 1주, 2주, 3주, 1개월, 2개월, 3개월, 4개월, 5개월, 6개월, 7개월, 8개월, 9개월, 10개월, 11개월, 12개월, 13개월, 14개월, 15개월, 16개월, 17개월, 18개월, 19개월, 20개월, 21개월, 22개월, 23개월, 2년, 3년, 4년, 5년, 10년 또는 20년 동안 유지된다.
본 발명은 또한 면역 효과기 세포 (예로, T 세포)가 자가항원 (예로, Dsg3 또는 Dsg1)을 인코딩하는 SIR을 발현하도록 변형된 세포요법의 유형을 포함한다. 이러한 자가항원 발현하는 본 발명의 SIR은 자가항원에 대한 자가항체를 발현하는 B 세포 및 혈장 세포를 박멸하는데 사용될 수 있다. 이러한 자가항원-SIR은 보통 천포창과 같은 자가면역 장애의 치료 및 예방에 사용될 수 있다.
본 발명은 또한 조절 면역 효과기 세포 (예로, TREG, 또는 CD25+ T 세포)가 특이적 항원을 표적하는 SIR을 발현하도록 변형된 세포요법의 유형을 포함한다. 이러한 SIR-TREG는 특이적 항원에 대한 자가 면역 반응을 억압하도록 환자에게 투여된다. SIR-TREG는 자가면역 질환을 치료하고 면역 내성을 증진하는데 사용될 수 있다. 임의의 특정한 이론에 결부되지 않더라도, SIR-변형된 면역 효과기 세포 (예로, T 세포)에 의해 유도된 항-종양 면역 반응은 능동적 또는 수동적 면역 반응일 수 있거나, 대안적으로 직접 대 간접적인 면역 반응로 인할 수 있다. 일 관점에서, SIR 형질도입된 면역 효과기 세포 (예로, T 세포)는 특이적 전염증성 사이토카인 분비를 나타내고, 본원에 기술된 바와 같은 질환 관련 항원을 발현하는 인간의 병든 세포 (예로, 암 또는 감염된 세포)에 반응한 강력한 세포용해 활성이 본원에 기술된 바와 같은 질환 관련 항원을 저항하고, 스탠드바이 살상을 매개하고, 암을 포함한 확립된 인간 질환의 퇴행을 매개한다. 예를 들면, 본원에 기술된 바와 같은 암 관련 항원의 이종유래 분야 내의 항원-감소 종양 세포는 이전에 인접한 항원-양성 암 세포에 대해 반응하였던 본원에 기술된 바와 같은 암 관련 항원-재유도된 면역 효과기 세포 (예로, T 세포)에 의한 간접적인 파괴에 취약할 수 있다.
일 관점에서, 본 발명의 완전한-인간 SIR-변형된 면역 효과기 세포 (예로, T 세포)는 포유동물에서 생체외 면역화 및/또는 생체내 요법을 위한 백신 유형일 수 있다. 일 관점에서, 포유동물은 인간이다. 일 관점에서, 포유동물은 개이다.
생체외 면역화와 관련하여, 다음 중 적어도 하나는 포유돌물 내로 세포를 투여하기 이전에 시험관내에서 일어난다: i) 세포의 증식, ii) SIR을 인코딩하는 핵산의 세포 내로 도입 또는 iii) 세포의 동결보존.
생체외 절차는 당해 기술분야에서 잘 숙지되어 있고, 하기에 더욱 완전하게 논의된다. 간략하게, 세포는 포유동물 (예로, 인간)로부터 단리되고, 본원에 개시된 SIR을 발현하는 벡터로 유전적으로 변형된다 (예로, 시험관내에서 형질도입 또는 형질감염됨). SIR-변형된 세포는 치료적 유익을 제공하도록 포유동물 수여자에게 투여될 수 있다. 포유동물 수여자는 인간일 수 있고, SIR-변형된 세포는 수여자와 관련하여 자가유래일 수 있다. 대안적으로, 세포는 수여자와 관련하여 동종유래, 동계유래 또는 이종유래일 수 있다.
또 다른 구현예에서, SIR-변형된 세포는 생체외에서 질환 관련 세포 (예로, 암 세포)의 골수 또는 말초 혈액 조혈 줄기 세포를 퍼지하는데 사용된다. 예로서, CD19-SIR를 발현하는 T 세포는 급성 림프구 백혈병 또는 비-호지킨 림프종을 갖는 환자로부터 채취한 골수 또는 말초 혈액 줄기 세포 시료와 함께 공동배양되어 골수 또는 말초 혈액 줄기 세포 조제물에 존재하는 임의의 백혈병 또는 림프종 세포를 살상한다. 6시간 내지 수일의 범위를 갖을 수 있는 시험관내 (생체외) 배양의 적합한 지속기간 이후에, 퍼지된 골수 및 말초 혈액 시료는 환자에서 자가유래 이식에 사용된다.
조혈 줄기 및 전구 세포의 생체외 증식을 위한 절차는 본원에 참고문헌으로 통합되는 미국 특허 5,199,942에 기술되어 있고, 본 발명의 세포에 적용될 수 있다. 다른 적합한 방법도 당해 기술분야에 숙지되어 있고, 따라서 본 발명은 세포의 생체외 증식의 임의의 특정한 방법에 제한되지 않는다. 간략하게, 면역 효과기 세포 (예로, T 세포)의 생체외 배양 및 증식은 (1) 말초 혈액 수확물 또는 골수 이식물로부터 포유동물의 CD34+ 조혈 줄기 및 전구 세포를 수집하는 단계; 및 (2) 이러한 세포를 생체외에서 증식시키는 단계:를 포함한다. 미국 특허 5,199,942에 기술된 세포 성장인자에 추가하여, flt3-L, IL-l, IL-3 및 c-kit 리간드와 같은 다른 인자가 세포의 배양 및 증식에 사용될 수 있다.
생체외 면역화의 견지에서 세포-기반의 백신을 사용하는 것에 추가하여, 본 발명은 또한 환자에서 항원에 대해 유도된 면역 반응을 나타내도록 생체외 면역화를 위한 조성물 및 방법을 제공한다.
일반적으로, 본원에 기술된 바와 같이 활성화되고 증식된 세포는 면역저하된 개인에서 발생하는 질환의 치료 및 예방에 사용될 수 있다. 상세하게, 본 발명의 SIR-변형된 면역 효과기 세포 (예로, T 세포)는 본원에 기술된 바와 같은 질환 관련 항원 (예로, 암 항원 또는 바이러스성 항원)의 발현과 연관된 질환, 장애 및 병태의 치료에 사용된다. 특정 관점에서, 본 발명의 세포는 본원에 기술된 바와 같은 질환 관련 항원의 발현과 연관된 질환, 장애 및 병태를 발생시킬 위험성이 있는 환자의 치료에 사용된다. 따라서 본 발명은 본원에 기술된 바와 같은 질환 관련 항원의 발현과 연관된 질환, 장애 및 병태의 치료 또는 예방 방법으로서, 본 발명의 면역 효과기 세포를 생성할 수 있는 SIR-변형된 면역 효과기 세포 (예로, T 세포) 또는 줄기 세포의 치료적 유효량을 이를 필요로 하는 피험자에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법을 제공한다.
일 관점에서, 본 발명의 SIR 발현하는 세포는 암 또는 악성암과 같은 증식성 질환 또는 골수이형성증, 골수이형성 증후군 또는 전백혈병과 같은 전암성 병태를 치료하는데 사용될 수 있다. 또한 본원에 기술된 바와 같은 암 관련 항원과 연관된 질환은 이에 제한되는 것은 아니지만, 예로 비전형 및/또는 비-고전적 암, 악성암, 전암성 병태 또는 본원에 기술된 바와 같은 암 관련 항원을 발현하는 증식성 질환을 포함한다. 본원에 기술된 바와 같은 질환 관련 항원의 발현과 연관된 비암 관련 적응증은 이에 제한되는 것은 아니지만, 예로 자가면역 질환 (예로, 루푸스), 염증성 장애 (알레르기 및 천식), 감염성 질환 (예로, HIV1, CMV, EBV, 인플루엔자) 및 이식을 포함한다.
본 발명의 SIR-변형된 면역 효과기 세포 (예로, T 세포)는 단독으로 또는 희석제 및/또는 IL-2 또는 다른 사이토카인와 같은 다른 성분 또는 세포 집단과 조합하여 약제학적 조성물로서 투여될 수 있다.
혈액학적 암 또는 혈액 암 병태는 백혈병, 림프종 및 혈액, 골수 및 림프계를 침범하는 악성 림프증식성 병태과 같은 암의 유형이다.
백혈병은 급성 백혈병 및 만성 백혈병으로서 분류될 수 있다. 급성 백혈병은 급성 골수성 백혈병 백혈병 (AML) 및 급성 림프성 백혈병 (ALL)으로서 추가로 분류될 수 있다. 만성 백혈병은 만성 골수성 백혈병 (CML) 및 만성 림프구 백혈병 (CLL)을 포함한다. 다른 백혈병은 골수성 혈액 세포의 비효율적 생산 (또는 이형성증) 및 AML로의 형질전환의 위험성을 공유하는 혈액학적 병태의 다양한 집합인 골수이형성 증후군 (MDS, 이전에 "전백혈병"으로 알려짐)을 포함한다.
림프종은 림프구로부터 발생하는 혈액 세포 종양의 군이다. 예시적인 림프종은 비-호지킨 림프종 및 호지킨 림프종이다.
본 발명은 암을 치료하고 예방하기 위한 조성물 및 방법을 제공한다. 일 관점에서, 암은 혈액학적 암 또는 혈액 암이지만 이에 제한되지 않고, 혈액학적 암은 백혈병 또는 림프종이다. 일 관점에서, 본 발명의 SIR 발현하는 세포는 이에 제한되는 것은 아니지만, 예로 이에 제한되는 것은 아니지만 B 세포 급성 림프성 백혈성 ("BALL"), T 세포 급성 림프성 백혈병 ("TALL"), 급성 림프성 백혈병 (ALL)을 포함하는 급성 백혈병; 이에 제한되는 것은 아니지만, 만성 골수성 백혈병 (CML), 만성 림프구 백혈병 (CLL)을 포함하는 하나 이상의 만성 백혈병; 이에 제한되는 것은 아니지만, 예로 B 세포 전구림프구 백혈병, 혈장모세포성 가지세포 신생물, 버킷 림프종, 확산성 대형 B 세포 림프종, 난포성 림프종, 털세포 백혈병, 소세포 또는 대세포 난포성 림프종, 악성 림프증식성 병태, MALT 림프종, 외투 세포 림프종, 경계 영역 림프종, 다발성 골수종, 골수이형성증 및 골수이형성 증후군, 비-호지킨 림프종, 혈장모세포 림프종, 혈장모양 가지세포 신생물, 왈덴스트롬 거대글로불린혈증 및 골수성 혈액 세포의 비효율적 생산 (또는 이형성증)을 공유하는 혈액학적 병태의 다양한 집합인 "전백혈병" 등을 포함하는 추가적인 혈액학적 백혈병 또는 혈액학적 병태와 같은 암 및 악성암을 치료하는데 사용될 수 있다. 또한 본원에 기술된 바와 같은 암 관련 항원의 발현과 연관된 질환은 이에 제한되는 것은 아니지만, 예로 비전형 및/또는 비-고전적 암, 악성암, 전암성 병태 또는 본원에 기술된 바와 같은 암 관련 항원을 발현하는 증식성 질환을 포함한다.
본 발명은 또한 본원에 기술된 바와 같은 질환 관련 항원을 발현하는 세포의 증식을 억제하거나 세포 집단을 감소시키는 방법으로서, 본원에 기술된 바와 같은 질환 관련 항원을 발현하는 세포를 포함하는 세포 집단을 본원에 기술된 바와 같은 질환 관련 항원을 발현하는 세포에 결합하는 본 발명의 SIR 발현하는 T 세포와 접촉시키는 단계를 포함하는, 방법을 제공한다. 상세한 관점에서, 본 발명은 본원에 기술된 바와 같은 질환 관련 항원을 발현하는 병든 세포의 증식을 억제하거나 병든 세포의 집단을 감소시키는 방법으로서, 본원에 기술된 바와 같은 질환 관련 항원을 발현하는 암 세포 집단을 본원에 기술된 바와 같은 질환 관련 항원을 발현하는 세포에 결합하는 본 발명의 SIR 발현하는 T 세포와 접촉시키는 단계를 포함하는, 방법을 제공한다. 일 관점에서, 본 발명은 본원에 기술된 바와 같은 질환 관련 항원을 발현하는 병든 세포의 증식을 억제하거나 병든 세포의 집단을 감소시키는 방법으로서, 본원에 기술된 바와 같은 질환 관련 항원을 발현하는 병든 세포 집단을 본원에 기술된 바와 같은 질환 관련 항원을 발현하는 세포에 결합하는 본 발명의 SIR 발현하는 T 세포와 접촉시키는 단계를 포함하는, 방법을 제공한다. 특정 관점에서, 본 발명의 SIR 발현하는 T 세포는 골수성 백혈병 또는 본원에 기술된 바와 같은 질환 관련 항원을 발현하는 세포와 연관된 또 다른 질환을 갖는 피험자에서 또는 이의 동물 모델에서 음성 대조군과 비교하여 세포 및/또는 병든 세포의 정량, 수, 양 또는 백분율을 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 65%, 적어도 75%, 적어도 85%, 적어도 95% 또는 적어도 99%로 감소시킨다.
본 발명은 또한 본원에 기술된 바와 같은 질환 관련 항원을 발현하는 세포 (예로, 본원에 기술된 바와 같은 질환 관련 항원을 발현하는 혈액학적 암, 비고전적인 암, 감염성 질환, 면역 질환, 알레르기 질환 또는 퇴행성 질환)와 연관된 질환을 예방하고/거나, 치료하고/거나, 관리하는 방법으로서, 본원에 기술된 바와 같은 질환 관련 항원을 발현하는 세포에 결합하는 본 발명의 SIR 발현하는 T 세포를 이를 필요로 하는 피험자에게 투여하는 것을 포함하는, 방법을 제공한다. 일 관점에서, 피험자는 인간이다. 본원에 기술된 바와 같은 질환 관련 항원과 연관된 비제한적인 예는 자가면역 질환 (루푸스와 같음), 염증성 장애 (알레르기 및 천식와 같음), 감염 (HIV1, HTLV1, 인플루엔자, CMV, 아데노바이러스, EBV 및 HHV8와 같음) 및 암 (본원에 기술된 바와 같은 암 관련 항원을 발현하는 혈액학적 암 또는 비고전적 암과 같음)을 포함한다.
본 발명은 또한 본원에 기술된 바와 같은 질환 관련 항원을 발현하는 세포와 연관된 질환의 재발을 예방하는 방법으로서, 본원에 기술된 바와 같은 질환 관련 항원을 발현하는 세포에 결합하는 본 발명의 SIR T 세포를 이를 필요로 하는 피험자에게 투여하는 것을 포함하는, 방법을 제공한다. 일 관점에서, 피험자는 인간이다.
본 발명은 본원에 기술된 바와 같은 질환 관련 항원을 발현하는 세포와 연관된 질환의 재발을 예방하는 방법으로서, 본원에 기술된 바와 같은 질환 관련 항원을 발현하는 세포에 결합하는 본 발명의 SIR T 세포를 이를 필요로 하는 피험자에게 투여하는 것을 포함하는, 방법을 제공한다. 일 관점에서, 방법은 본원에 기술된 바와 같은 질환 관련 항원을 발현하는 세포에 결합하는 본 발명에 기술된 SIR 발현하는 T 세포의 유효량을 또 다른 요법의 유효량과 조합하여 이를 필요로 하는 피험자에게 투여하는 것을 포함한다.
본 발명은 또한 표적 세포의 발현과 연관된 질환 또는 이의 위험성을 증가를 갖는 피험자의 질환을 치료하거나 예방하는 방법으로서, SIR 분자를 포함하는 세포의 유효량을 피험자에게 투여하는 것을 포함하는 방법을 제공한다.
본 발명은 또한 표적 항원의 발현과 연관된 질환 또는 이의 위험성의 증가를 갖는 피험자를 치료하거나 피험자에서 질환을 예방하는 방법으로서, SIR 분자를 포함하는 세포, 예로 면역 효과기 세포 (예로, 면역 효과기 세포의 집단)의 유효량을 피험자에게 투여하는 것을 포함하고, SIR 분자는 하나 이상의 항원 결합 도메인 및 하나 이상 T 세포 수용체 불변 사슬을 포함하고, 상기 항원 결합 도메인은 질환과 연관된 표적 항원에 결합하는, 방법을 제공한다. 표적 항원의 비제한적인 예는 상기 본원에 개시되어 있다.
본 발명은 유효량의 세포, 예로 면역 효과기 세포 또는 이의 집단를 피험자에게 투여하는 방법을 제공하고, 각각의 세포는 선택적으로 면역 세포의 효능 및/또는 안전성을 증가시키는 제제와 조합하여 SIR 분자를 포함한다. 다양한 구현예에서, 면역 세포의 효능 및/또는 안전성을 증가시키는 제제는 (1) 단백질 포스파타제 저해제; (ii) 키나제 저해제 ; (iii) 사이토카인; (iv) 면역 억제성 분자의 저해제; (v) TREG 세포의 수준 또는 활성을 감소시키는 제제; (vi) SIR-변형된 세포의 증식 및/또는 유지를 증가시키는 제제; (vii) 케모카인; (viii) SIR의 발현을 증가시키는 제제; (ix) SIR의 발현 또는 활성의 조절을 허용하는 제제; (x) SIR-변형된 세포의 증식 및/또는 유지 동안 통제를 허용하는 제제; (xi) SIR-변형된 세포의 부작용을 통제하는 제제; (xii) Brd4 저해제; (xiii) 치료제 (예로, sHVEM) 또는 예방제를 질환의 부위에 전달하는 제제; (xiv) SIR이 유도되는 표적 항원의 발현을 증가시키는 제제; 및 (xv) 아데노신 A2a 수용체로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 치료되거나 예방될 질환은 혈액학적 암이다. 추가의 구현예에서, 혈액학적 암은 백혈병이다. 급성 백혈병의 비제한적인 예는 B 세포 급성 림프성 백혈성 ("BALL"), T 세포 급성 림프성 백혈병 ("TALL"), 급성 림프성 백혈병 (ALL)을 포함하고; 하나 이상의 만성 백혈병은 이에 제한되는 것은 아니지만, 만성 골수성 백혈병 (CML), 만성 림프구 백혈병 (CLL)을 포함하고; 추가적인 혈액학적 암 또는 혈액학적 병태는 이에 제한되는 것은 아니지만, B 세포 전구림프구 백혈병, 혈장모세포성 가지세포 신생물, 버킷 림프종, 확산성 대형 B 세포 림프종, 난포성 림프종, 털세포 백혈병, 소세포 또는 대세포 난포성 림프종, 악성 림프증식성 병태, MALT 림프종, 외투 세포 림프종, 경계 영역 림프종, 다발성 골수종, 골수이형성증 및 골수이형성 증후군, 비-호지킨 림프종, 호지킨 림프종, 혈장모세포 림프종, 혈장모양 가지세포 신생물, 왈덴스트롬 거대글로불린혈증 및 골수성 혈액 세포의 비효율적 생산 (또는 이형성증)을 공유하는 혈액학적 병태의 다양한 집합인 "전백혈병" 등을 포함하고, 본원에 기술된 종양 항원의 발현과 연관된 질환은 이에 제한되는 것은 아니지만, 비전형 및/또는 비-고전적 암, 악성암, 전암성 병태 또는 본원에 기술된 바와 같은 종양 항원을 발현하는 증식성 질환을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 본원에 기술된 종양 항원과 연관된 질환은 고형 종양이다.
일부 구현예에서, 질환과 연관된 종양 항원은 CD5, CD19, CD123, CD22, CD23, CD30, CD171, CS-1, CLL-1 (CLECL1), CD33, EGFRvⅢ, GD2, GD3, BCMA, Tn 항원, PSMA, ROR1, FLT3, TAG72, CD38, CD44v6, CEA, EPCAM, B7H3, KIT, IL-13Ra2, 메조텔렌, IL-11Ra, PSCA, PRSS21, VEGFR2, 루이스 Y, CD24, PDGFR-베타, SSEA-4, CD20, 폴레이트 수용체 알파, ERBB2 (Her2/neu), MUC1, EGFR, NCAM, 프로스타제, PAP, ELF2M, 에프린 B2, FAP, IGF-I 수용체, CAlX, LMP2, gpl00, bcr-abl, 티로시나제, EphA2, 퓨코실 GM1, sLe, GM3, TGS5, HMWMAA, o-아세틸-GD2, 폴레이트 수용체 베타, TEM1/CD248, TEM7R, CLDN6, TSHR, GPRC5D, CXORF61, CD97, CD179a, ALK, 폴리시알산, PLAC1, 글로보H, NY-BR-1, UPK2, HAVCR1, ADRB3, PANX3, GPR20, LY6K, OR51E2, TARP, WT1, NY-ES0-1, LAGE-1a, MAGE-A1, MAGE A1, ETV6- AML, 정자 단백질 17, XAGE1, 타이 2, MAD-CT-1, MAD-CT-2, Fos-관련 항원 1, p53, p53 돌연변이체, 프로스테인, 서바이빈 및 텔로머라제, PCTA-1/갈렉틴 8, MelanA/MART1, Ras 돌연변이체, hTERT, 육종 전위 절단점, ML-IAP, ERG (TMPRSS2 ETS 융합 유전자), NA17, PAX3, 안드로겐 수용체, Cyclin B1, MYCN, RhoC, TRP-2, CYP1B1, BORIS, SART3, PAX5, OY-TES1, LCK, AKAP-4, SSX2, RAGE-1, 인간 텔로머라제 역전사효소, RUl, RU2, 레구마인, HPV E6, E7, 장내 카복실 에스테라제, 돌연변이체 hsp70-2, CD79a, CD79b, CD72, LAIR1, FCAR, LILRA2, CD300LF, CLEC12A, BST2, EMR2, LY75, FCRL5, IGLLI, MPL, , FITC, 바이오틴, c-MYC 에피토프 태그, CD34, LAMP1, TROP2, GFR알파4, CDH17, CDH6, NYBR1, CDH19, CD200R, Slea (CA19.9; 시아릴 루이스 항원), PTK7, gpNMB, CDH1-CD324, DLL3, CD276/B7H3, IL11Ra, IL13Ra2, CD179b-IGLl1, ALK, TCR감마-델타, NKG2D, CD32 (FCGR2A), Tn 항원, CSPG4-HMW-MAA, Tim1-/HVCR1, CSF2RA (GM-CSFR-알파), TGF베타R2, VEGFR2/KDR, Lews Ag, TCR-베타1 사슬, TCR-베타2 사슬, TCR-감마 사슬, TCR-델타 사슬, FITC, 황체형성 호르몬 수용체 (LHR), CCR4, GD3, 글리피칸-3 (GPC3), SLAMF6, SLAMF4, HTLV1-Tax, EBV-EBNA3c, HLA, HLA-A, HLA-A2, HLA-B, HLA-C, HLA-DP, HLA-DM, HLA-DOA, HLA-DOB, HLA-DQ, HLA-DR, HLA-G, IGE, CD99, RAS G12V, 조직인자 1 (TF1), AFP, GPRC5D, 클라우딘 18.2 (CLD18A2 또는 CLDN18A.2)), P-당단백질, STEAP1, LIV1, 넥틴-4, CRIPTO, GPA33, BST1/CD157, 저전도도 염화물 통로, TNT 항체에 의해 인식된 항원, TSHR, CD 171, CS-1, CLL-1, GD3, Tn 항원, FLT3, CD38, CD44v6, 급성 백혈병 또는 림프종 상에서 발현되지만 조혈 전구세포 상에서는 발현되지 않는 글리코실화된 CD43 에피토프; 비-조혈성 암 상에서 발현된 글리코실화된 CD43 에피토프, B7H3, KIT, IL-13Ra2, IL-llRa, PSCA, PRSS21, VEGFR2, 루이스 Y, CD24, PDGFR-베타, SSEA-4, MUC1, EGFR, NCAM, CAlX, LMP2, EphA2, 퓨코실 GM1, sLe, GM3, TGS5, HMWMAA, o-아세틸-GD2, 폴레이트 수용체 베타, TEM1/CD248, TEM7R, CLDN6, GPRC5D, CXORF61, CD97, CD179a, ALK, 폴리시알산, PLAC1, 글로보 H, NY-BR-1, UPK2, HAVCR1, ADRB3, PANX3, GPR20, LY6K, OR51E2, TARP, WT1, ETV6-AML, 정자 단백질 17, XAGE1, 타이 2, MAD-CT-1, MAD-CT-2, Fos-관련 항원 1, p53 돌연변이체, hTERT, 육종 전위 절단점, ML-IAP, ERG (TMPRSS2 ETS 융합 유전자), NA17, PAX3, 안트로겐 수용체, 사이클린 B1, MYCN, RhoC, CYP1B1, BORIS, SART3, PAX5, OY-TES1, LCK, AKAP-4, SSX2, CD79a, CD79b, CD72, LAIR1, FCAR, LILRA2, CD300LF, CLEC12A, BST2, EMR2, LY75, GPC3, FCRL5, IGLLI, TSHR, CLDN6, GPRC5D, CXORF61, CD97, CD179a, ALK, 폴리시알산, PLAC1, 글로보 H, NY-BR-1, UPK2, HAVCR1, ADRB3, PANX3, GPR20, LY6K 및 OR51E2로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 치료될 질환은 이에 제한되는 것은 아니지만, HIV1, HIV2, HTLV1, 엡스타인 바 바이러스 (EBV), 사이토메갈로바이러스 (CMV), 아데노바이러스, 아데노-관련 바이러스, BK 바이러스, 인간 헤르페스 바이러스 6, 인간 헤르페스 바이러스 8, 인플루엔자 바이러스, 파라인플루엔자 바이러스, 조류 플루 바이러스, MERS 및 SARS 코로나 바이러스, 크리미아 콩고 출혈열 바이러스, 리노 바이러스, 엔테로바이러스, 뎅기 바이러스, 웨스트 나일 바이러스, 에볼라 바이러스, 마르버그 바이러스, 라사 열 바이러스, 지카 바이러스, RSV, 홍역 바이러스, 유행성 이하선염 바이러스, 리노 바이러스, 배리셀라 바이러스, 헤르페스 심플렉스 바이러스 1 및 2, 배리셀라 조스터 바이러스, HIV-1, HTLV1, 간염 바이러스, 엔테로바이러스, B형 간염 바이러스, C형 간염 바이러스, 니파 및 리프트 계곡 열 바이러스, 일본 뇌염 바이러스, 마이코박테리움 튜버쿨로시스, 비전형적 마이코박테리아 종, 뉴모시스티스 지로벡시, 톡소플라스마, 리케챠, 노카르디아, 아스퍼질러스, 뮤코르 또는 칸디다에 의한 감염을 포함하는 감염성 질환이다.
본 발명의 방법 및 조성물에 의해 치료되거나 예방될 질환은 면역 또는 퇴행성 질환, 예로 당뇨병, 다발성 골수종, 류마티스 관절염, 보통 천포창, 강직 척추염, 하시모토 갑상샘염, SLE, 사코이드증, 피부경화증, 혼합된 연결조직 질환, 이식편대숙주병 또는 알츠하이머병일 수 있다. 이러한 구현예에서, 질환과 연관된 표적 항원은 자가항체이다. SIR을 위한 적합한 표적이 되는 예시적인 자가항체는 Dsg3 또는 Dsg1에 대한 자가항체이다.
표적 항원의 발현과 연관된 질환의 추가의 비제한적인 예는 다음의 암 또는 관련된 병태 중 어느 하나를 포함한다: 결장암, 직장암, 신장세포 암종, 간암, 폐의 비-소세포 암종, 소장의 암, 식도의 암, 흑색종, 골암, 췌장암, 피부암, 두경부의 암, 피부 또는 안구내 악성 흑색종, 자궁암, 난소암, 직장암, 항문 부위의 암, 위암, 고환암, 자궁암, 나팔관의 암종, 자궁내막의 암종, 자궁경부의 암종, 질의 암종, 외음의 암종, 호지킨병, 비-호지킨 림프종, 내분비계의 암, 갑상샘의 암, 부갑상샘의 암, 부신샘의 암, 연조직의 육종, 요도의 암, 음경의 암, 아동의 고형암, 방광의 암, 신장 또는 요관의 암, 신우의 암종, 중추신경계 (CNS)의 신생물, 일차 CNS 림프종, 종양 혈관생성, 척수 종양, 뇌줄기 교아종, 뇌하수체 샘암종, 카포시 육종, 메르켈 세포암, 표피성 암, 편평세포암, T 세포 림프종, 환경적으로 유도된 암, 상기 암의 조합 및 상기 암의 전이성 병변.
본원에 기술된 방법 또는 용도의 특정 구현예에서, SIR 분자는 면역 효과기 세포의 효능을 증가시키는 제제, 예로 하나 이상의 단백질 포스파타제 저해제, 키나제 저해제, 사이토카인, 케모카인, scFV 단편, 이중특이적c 항체, 면역 억제성 분자의 저해제, 세포 신호전달 단백질, 바이러스 신호전달 단백질, TREG 세포의 수준 또는 활성을 감소시키는 제제와 조합하여 투여된다. 단백질 포스파타제 저해제의 비제한적인 예는 SHP-1 저해제 및/또는 SHP-2 저해제를 포함한다. 키나제 저해제의 비제한적인 예는 CDK4 저해제, CDK4/6 저해제 (예로, 팔보시크립), BTK 저해제 (예로, 이브루티닙 또는 RN-486), mTOR 저해제 (예로, 라파마이신 또는 에버로니무스 (RAD001)), MNK 저해제 또는 이중 P13K/mTOR 저해제를 포함한다. 일 구현예에서, BTK 저해제는 인터류킨-2-유도성 키나제 (ITK)의 키나제 활성을 감소시키거나 억제하지 않는다. A2a 수용체 길항제의 비제한적인 예는 비파데난트를 포함한다. 일부 구현예에서, 면역 억제성 분자를 억제하는 제제는 항체 또는 항체 단편, 억제성 핵산, 클러스터된 규칙적으로 상호이격된 짧은 팰린드롬 반복서열 (CRISPR), 전사-활성화인자 유사 효과기 핵산 분해효소 (TALEN) 또는 억제성 분자의 발현을 억제하는 아연 핑거 엔도뉴클레아제 (ZFN) 중 하나 이상일 수 있다. 본원에 기술된 방법 또는 용도의 다른 구현예에서, T REG 세포의 수준 또는 활성을 감소시키는 제제는 사이클로포스파미드, 항-GITR 항체, CD25-고갈 또는 이들의 조합으로부터 선택된다. 본원에 기술된 방법 또는 용도의 특정 구현예에서, 면역 억제성 분자는 PD1, PD-L1, CTLA-4, TIM-3, LAG-3, VISTA, BTLA, TIGIT, LAIR1, CD160, 2B4, TGFRβ, CEACAM-1, CEACAM-3 및 CEACAM-5로 이루어진 군으로부터 선택된다. 다른 구현예에서, 사이토카인은 IL2, IL-7, IL-15 또는 IL-21로부터 선택된다. 다른 구현예에서, SIR 분자 및 제 2 제제, 예로 본원에 개시된 임의의 조합 요법 (예로, 면역 효과기 세포의 효능을 증가시키는 제제)를 포함하는 면역 효과기 세포는 실질적으로 동시적으로 또는 연속적으로 투여된다.
다른 구현예에서, 억제성 분자를 억제하는 제제는 억제성 분자 및 이의 단편을 포함하는 제 1 폴리펩티드 및 세포에 양성 신호를 제공하는 제 2 폴리펩티드를 포함하고, 여기서 제 1 및 제 2 폴리펩티드는 SIR-포함 면역 세포 상에서 발현되고, (i) 제 1 폴리펩티드는 PD1, PD-L1, CTLA-4, TIM-3, LAG-3, VISTA, BTLA, TIGIT, LAIR1, CD160, 2B4, TGFRβ, CEACAM-1, CEACAM-3 및 CEACAM-5 또는 이의 단편을 포함하고/거나; (ii) 제 2 폴리펩티드는 일차 신호전달 도메인 및/또는 보조자극 신호전달 도메인을 포함하는 세포내 신호전달 도메인을 포함한다. 일 구현예에서, 일차 신호전달 도메인은 CD3 제타의 기능적 도메인을 포함하고/거나; 보조자극 신호전달 도메인은 41BB, CD27 및 CD28로부터 선택된 단백질의 기능적 도메인을 포함한다.
일 구현예에서, 림프구 주입, 예를 들면 동종유래 림프구 주입은 암, 감염 또는 면역 질환의 치료에 사용되고, 여기서 림프구 주입은 본 발명의 SIR 발현하는 세포 중 적어도 하나를 포함한다. 일 구현예에서, 자가유래 림프구 주입은 암, 감염 또는 면역 질환의 치료에 사용되고, 여기서 자가유래 림프구 주입은 본원에 기술된 SIR 발현하는 세포 중 적어도 하나를 포함한다.
일 구현예에서, 방법은 본원에 기술된 바와 같은 SIR 분자를 발현하는 세포를 SIR 발현하는 세포의 활성을 증진하는 제제와 조합하여 투여하는 것을 포함하고, 제제는 사이토카인, 예로 IL-2, IL-7, IL-15, IL-21 또는 이들의 조합이다. 사이토카인은 SIR 발현하는 세포와 조합하여, 예로 동시적으로 또는 이의 투여 직후에 전달될 수 있다. 대안적으로, 사이토카인은 SIR 발현하는 세포의 투여 이후 연장된 기간 경과 시, 예로 SIR 발현하는 세포에 대한 피험자의 반응의 평가 이후에 전달될 수 있다. 일 구현예에서, 사이토카인은 청구항 143 내지 161 중 어느 하나의 세포 또는 세포의 집단과 동시적으로 (예로, 동일한 날짜에 투여됨) 또는 이들의 투여 직후에 (예로, 투여 이후 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일 또는 7일에 투여됨) 피험자에게 투여된다. 다른 구현예에서, 사이토카인은 세포 또는 세포의 집단의 투여 이후 또는 세포에 대한 피험자의 반응의 평가 이후에 연장된 기간 경과 시 (예로, 적어도 2주, 3주, 4주, 6주, 8주 또는 10주 이상) 피험자에게 투여될 수 있다.
다른 구현예에서, SIR 분자를 발현하는 세포는 SIR 분자를 발현하는 세포의 투여와 연관된 하나 이상의 부작용을 개선하는 제제와 조합하여 투여된다. SIR 발현하는 세포와 연관된 부작용은 사이토카인 방출 증후군 (CRS), 적혈구포식 림프조직구증 (HLH) 또는 신경학적 합병증으로부터 선택될 수 있다. 이러한 제제의 예는 스테로이드 (예로, 프레드니손, 덱사메타손), IL6R 길항제 (예로, 토실리주맙), src 키나제 저해제 (예로, 다사티닙), 키나제 저해제 (예로, 이브루티닙), 칼시뉴린 저해제 (예로, 타크롤리무스 또는 사이클로스포린 A) 또는 화학요법 약물 (예로, 사이클로포스파미드, 메토트렉세이트 또는 빈크리스틴)을 포함한다.
전술한 임의의 방법 또는 용도의 구현예에서, SIR 분자를 발현하는 세포는 표적 항원의 발현과 연관된 질환을 치료하는 제제, 예로 본원에 개시된 임의의 제 2 또는 제 3 요법과 조합하여 투여된다. 추가적인 예시적 조합은 다음 중 하나 이상을 포함한다.
또 다른 구현예에서, 예로 본원에 기술된 바와 같은 SIR 분자를 발현하는 세포는 SIR이 유도되는 표적 항원의 발현을 증가시키는 또 다른 제제와 조합하여 투여될 수 있다. 예를 들면, 고전적인 호지킨 림프종은 B 세포에서 발현되는 유전자 실제적 결여를 특징으로 한다. 프로모터 과다메틸화 및 히스톤 탈아세틸화를 통해 B 세포 특이적 유전자의 후생적 퇴행 및 B 세포 헌신된 전사인자의 발현 감소는 이러한 질환에서 소실된 B 세포 표현형에 기여하는 것으로 보고되어 있다. 두 등은 고전적인 호지킨 림프종 세포에서 B 세포 표현형의 재발현을 촉진한 여러 화합물 (화합물 27, 40 및 49)를 확인하였다 (Du, J et al, Blood, October 12, 2016 온라인으로 사전발표됨). 항-백혈병 약물 비소 삼산화물 및 ATRA도 역시 단독으로 또는 확인된 화합물 27, 40 및 49과 조합하여 사용될 때 고전적인 호지킨 림프종에서 B 세포 표현형의 재발현을 촉진하는 것으로 보고되었다. 일 구현예에서, CD19, CD20, CD22 등과 같은 B 세포 마커를 표적하는 SIR 발현하는 세포는 화합물 27, 40, 49, 비소 삼산화물 및 ATRA 중 하나 이상과 조합하여 투여될 수 있다.
또 다른 구현예에서, 본 발명의 SIR 발현하는 면역 효과기 세포, 예로 T 세포, NK 세포 또는 조혈 줄기 세포는 특정 암의 종양 미세환경에서 면역억제 경로를 교란하는 제제와 함께 피험자에게 투여된다. 일 구현예에서, 암의 종양 미세환경에서 면역억제 경로를 교란하는 제제는 아데노신 A2a 수용체 길항제이다. 본 발명의 SIR 발현하는 면역 효과기 세포와 함께 투여될 수 있는 예시적인 아데노신 A2a 수용체 길항제는 비다데난트이다.
일 구현예에서, 본 발명의 SIR 발현하는 면역 효과기 세포, 예로 T 세포, NK 세포 또는 조혈 줄기 세포는 이전에 줄기 세포 이식, 예로 자가유래 줄기 세포 이식 또는 동종유래 줄기 세포 이식을 받았던 피험자에게 투여된다.
일 구현예에서, 본 발명의 SIR 발현하는 면역 효과기 세포, 예로 T 세포, NK 세포 또는 조혈 줄기 세포는 이전에 멜팔란, 플루다라빈 또는 사이클로포스파미드와 같은 화학요법의 투약을 받았던 피험자에게 투여된다.
일 구현예에서, 본 발명의 SIR 발현하는 면역 효과기 세포, 예로 T 세포, NK 세포 또는 조혈 줄기 세포는 이전에 화합물 27, 40 및 49 (Du, J et al, Blood, October 12, 2016 온라인으로 사전발표됨), 비소 삼산화물 또는 ATRA와 같은 SIR의 표적 항원의 발현을 증진하는 약물의 투약을 받았던 피험자에게 투여된다.
일 구현예에서, SIR 분자, 예로 본원에 기술된 SIR 분자를 발현하는 세포는 SIR 분자를 발현하는 세포의 효능을 증가시키는 제제, 예로 본원에 기술된 제제와 조합하여 투여된다.
일 구현예에서, SIR 분자, 예로 본원에 기술된 SIR 분자를 발현하는 세포는 낮은 면역 증진하는 용량의 mTOR 저해제와 조합하여 투여된다. 이론에 결부되지 않더라도, 낮은 면역 증진하는 용량 (예로, 용량이 면역계를 완벽하게 억압하지 않지만 면역 기능을 개선하기에 충분함)으로의 치료가 PD-1 양성 T 세포의 감소 또는 PD-1 음성 세포의 감소를 수반하는 것으로 여겨진다. PD-1 음성 세포는 아니지만, PD-1 양성 세포는 PD-1 리간드, 예로 PD-L1 또는 PD-L2을 발현하는 세포와의 결합에 의해 소모될 수 있다.
동물 모델도 또한 SIR 활성을 측정하는데 사용될 수 있다. 예를 들면, 본원에 기술된 인간 암 관련 항원-특이적 SIR+ T 세포를 면역결핍 마우스에서 일차 인간 전-B-ALL을 치료하는데 사용하는 이종이식 모델이 사용될 수 있다. 예로, Milone et al., Molecular Therapy 17(S): 1453-1464 (2009) 참조. 매우 간략하게, ALL의 확립 이후에, 마우스가 처리군과 관련하여 무작위화된다. 암 관련 항원-특이적 SIR (예로, CD19-SIR) 조작된 T 세포의 상이한 수가 B-ALL을 보유한 NOD-SCID-γ-/- 마우스 내에 1 : 1 비율로 공동주사된다. 마우스로부터의 비장 DNA에서 암 관련 항원-특이적 SIR 벡터의 사본수가 T 세포 주사 이후에 다양한 시간대에 평가된다. 동물은 주 간격으로 백혈병에 대해 평가된다. 말초 혈액 모세포 계수가 B-ALL-SIR+ T 세포 또는 모의-형질도입된 T 세포로 주사된 마우스에서 측정된다. 실험군의 생존 곡선이 로그-순위 테스트를 사용하여 비교된다. 또한, NOD-SCID-γ-/- 마우스에서 T 세포 주사 이후 4주째 절대 말초 혈액 CD4+ 및 CD8+ T 세포 계수도 분석될 수 있다. 마우스는 백혈병 세포로 주사되고, 3주 이후에 eGFP에 연결된 SIR을 인코딩하는 이중시스트론 렌티바이러스성 벡터에 의해 SIR을 발현하도록 조작된 T 세포가 주사된다. T 세포는 주사 이전에 모의-형질도입된 세포와 혼합함으로써 45 내지 50% 유입 GFP+ T 세포로 정규화되었고, 유세포 계측법에 의해 검증되었다. 동물은 주 간격으로 백혈병에 대해 평가된다. SIR+ T 세포 실험군의 생존 곡선이 로그-순위 테스트를 사용하여 비교된다.
용량 의존성 SIR 치료 반응이 평가될 수 있다. 예로, Milone et al., Molecular Therapy 17(S): 1453-1464 (2009) 참조. 예를 들면, 말초 혈액은 SIR T 세포, 동등한 수의 모의-형질도입된 T 세포 또는 T 세포 없음으로 21일째 주사된 마우스에서 백혈병을 확립한 이후 35 내지 70일째 획득되었다. 각각의 실험군으로부터의 마우스는 말초 혈액 B+ ALL 모세포 계수의 결정을 위해 무작위로 사육된 다음 35일 및 49일째 살상되었다. 남은 동물은 57일 및 70일째 평가되었다..
세포 증식 및 사이토카인 생산의 평가는 이전에 Milone et al., Molecular Therapy 17(S): 1453-1464 (2009)에서 기술되었다. 간략하게, SIR-매개된 증식의 평가는 세척된 T 세포를 본원에 기술된 질환 관련 항원 (K19) 또는 CD32 및 CD137 (KT32-BBL)을 발현하는 K562 세포와 최종 T 세포 : K52 세포의 2 : 1 비율로 혼합함으로써 마이크로타이터 플레이트에서 수행된다. K562 세포는 사용 전에 감마선으로 방사선 조사된다. 항-CD3 (클론 OKT3) 및 항-CD28 (클론 9.3) 단일클론 항체가 첨가되어 KT32-BBL 세포와 함께 배양되고, T 세포 증식을 자극하기 위한 양성 대조군으로서 작용하는데 이들 신호가 생체외에서 장기간 CD8+ T 세포 증식을 지원하기 때문이다. T 세포는 배양 시 제조사에 의해 기술된 바와 같이 카운트브라이트TM 형광 비드 (Invitrogen, Carlsbad, CA) 및 유세포 계측법을 사용하여 계수된다. SIR+ T 세포는 eGFP-2A 연결된 SIR-발현하는 렌티바이러스성 벡터로 조작된 T 세포를 사용하여 GFP 발현에 의해 확인된다. GFP를 발현하지 않는 SIR+ T 세포의 경우, SIR+ T 세포는 본원에 기술된 바와 같은 바이오틴화된 재조합 암 관련 항원 단백질 및 아비딘-PE 컨쥬게이트로 검출된다. T 세포 상의 CD4+ 및 CD8+ 발현도 역시 특이적 단일클론 항체 (BD Biosciences)로 동시에 검출된다. 사이토카인 측정은 제조사의 추천사항에 따라 인간 TH1/TH2 사이토카인 세포계측 비드 어레이 키트 (BD Biosciences, San Diego, CA)를 사용하여 재자극 이후 24시간째 수집된 상청액 상에서 수행된다. 형광은 FACS칼리버 유세포 계측기를 사용하여 측정되고, 데이타가 제조사의 추천사항에 따라 분석된다.
세포독성은 표준 51Cr-방출 검정법에 의해 측정될 수 있다. 예로, Milone et al., Molecular Therapy 17(8): 1453-1464 (2009) 참조. 간략하게, 표적 세포 (K562 세포주 및 일차 전-B-ALL 세포)가 빈번한 교반과 함께 51Cr (NaCr04, New England Nuclear, Boston, MA)로 37℃에서 2시간 동안 로딩되고, 완전 RPMI으로 두 번 세척되고, 마이크로타이터 플레이트 내에 도말된다. 효과기 T 세포는 완전 RPMI의 웰에서 다양한 효과기 세포 : 표적 세포 (E:T)의 비율로 표적 세포와 혼합된다. 배지 단독 (자발적인 방출, SR) 또는 트리톤-X 100 계면활성제의 1% 용액 (전체 방출, TR)을 포함하는 추가적인 웰도 역시 준비되었다. 4시간의 37℃에서 배양 이후에, 각각의 웰로부터의 상청액이 수확된다. 다음으로 방출된 51Cr이 감마 입자 계수기 (Packard Instrument Co., Waltham, MA)를 사용하여 측정된다. 각각의 조건은 적어도 세 벌씩 수행되고, 용해 백분율은 공식: 용해%= (ER- SR) I (TR-SR)을 사용하여 계산되고, 여기서 ER은 각각의 실험적 조건의 경우에 방출된 평균51Cr을 나타낸다. 이러한 또는 유사한 검정법은 또한 임의의 집단에서 SIR 세포의 존재를 검출하는데 사용될 수 있다. 이러한 검정법은 또한 임의의 집단에서 SIR 세포의 증식 및 유지를 측정하는데 사용될 수 있다.
영상화 기술학은 종양-보유 동물 모델에서 SIR의 특이적 트래피킹 및 증식을 평가하는데 사용될 수 있다. 이러한 검정법은 예를 들면, Barrett et al., Human Gene Therapy 22: 1575-1586 (2011)에 기술되어 왔다. 간략하게, NOD/SCID/γ -/- (NSG) 마우스가 Nalm-6 세포로 정맥내 주사된 이후 7시간 경과 시 SIR 인코딩 mRNA로 전기천공한 4시간째의 T 세포로 주사된다. T 세포는 개똥벌레 루시퍼라제를 발현하도록 렌티바이러스성 구조물로 안정적으로 형질감염되고, 마우스가 생체발광에 대해 영상화된다. 대안적으로, Nalm-6 이종이식 모델에서, SIR+ T 세포의 단일 주사의 치료적 효능 및 특이성이 다음과 같이 즉정될 수 있다: NSG 마우스가 개똥벌레 루시퍼라제를 안정적으로 발현하도록 형질도입된 Nalm-6으로 주사되고, 이후 7일 경과 시 본 발명의 SIR (예로, CD19-SIR; 서열번호 1200)로 전기천공된 T 세포의 단일 꼬리-정맥 주사가 이어진다. 동물은 주사 이후 다양한 시점에 영상화된다. 예를 들면, 대표적인 마우스에서 개똥벌레 루시퍼라제 양성 백혈병의 광자-밀도 열 맵핑이 5일 (처리 전 2일) 및 8일 (SIR+ PBL 이후 24시간)에 생성될 수 있다. 유사한 접근법이 다른 암 또는 다른 질환을 표적하는 SIR을 평가하는데 사용될 수 있다.
본원에서 실시예 섹션에 기술된 검정법을 포함하는 다른 검정법, 뿐만 아니라 당해 기술분야에 숙지된 검정법도 역시 본원에 기술된 SIR을 평가하는데 사용될 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 본원에 기술된 바와 같은 SIR 발현하는 세포, 예로 다수의 SIR 발현하는 세포를 하나 이상의 약제학적으로 또는 생리학으로 허용가능한 담체, 희석제 또는 부형제와 조합하여 포함할 수 있다. 이러한 조성물은 중성 완충된 식염수 및 포스페이트 완충된 식염수 등과 같은 완충액; 포도당, 만노스 슈크로스, 덱스트란 또는 만니톨과 같은 탄수화물; 단백질; 폴리펩티드 또는 글리신과 같은 아미노산; 항산화제; EDTA와 같은 킬레이팅제 또는 글리타치온; 아쥬반트 (예로, 알루미늄 수산화물); 및 보존제를 포함할 수 있다. 본 발명의 조성물은 일 관점에서 정맥내 투여를 위해 제형화된다. 조성물은 제 2 활성 제제 (예로, 항암제, 항바이러스제 또는 항생제)를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 치료 (또는 예방)될 질환에 적절한 방식으로 투여될 수 있다. 투여의 정량 및 빈도는 환자의 병태 및 환자의 질환의 유형 및 중증도와 같은 요인에 의해 결정될 수 있다. "면역학적 유효량", "항종양 유효량", 종양-억제하는 유효량" 또는 "치료량" 또는 "항-감염량"이 표시될 때, 본 발명의 조성물의 투여될 양은 연령, 체중, 종양 크기, 감염 또는 전이의 정도 및 사례일 수 있는 환자 (피험자)의 병태에서 개인의 차이를 고려하여 의사에 의해 결정될 수 있다. 일반적으로 본원에 기술된 면역 효과기 세포 (예로, T 세포, NK 세포)를 포함하는 약제학적 조성물은 이들 범위 내의 모든 정수값을 포함하는 104 내지 109 세포/kg 체중, 일부 경우에 105 내지 106 세포/kg 체중의 용량으로 투여될 수 있음이 진술될 수 있다. T 세포 조성물은 또한 이들 용량에서 다수의 시간대에서 투여될 수 있다. 세포는 면역요법에서 공통적으로 숙지된 주입 기법을 사용하여 투여될 수 있다 (예로, Rosenberg et al., New Eng. J. of Med. 319: 1676, 1988 참조).
특정 관점에서, 활성화된 면역 효과기 세포 (예로, T 세포, NK 세포)를 피험자에게 투여한 다음 후속적으로 혈액을 수집하고 (또는 성분채집술을 수행하고), 이로부터의 면역 효과기 세포 (예로, T 세포, NK 세포)를 본 발명에 따라 활성화하고, 이들 활성화되고 증식된 면역 효과기 세포 (예로, T 세포, NK 세포)를 환자에게 재주입하는 것이 바람직할 수 있다. 이러한 공정은 매 수주마다 다수의 시간대에 수행될 수 있다. 특정 관점에서, 면역 효과기 세포 (예로, T 세포, NK 세포)는 10cc 내지 400cc의 혈액 수집물로부터 활성화될 수 있다. 특정 관점에서, 면역 효과기 세포 (예로, T 세포, NK 세포)는 20cc, 30cc, 40cc, 50cc, 60cc, 70cc, 80cc, 90cc 또는 l00cc의 혈액 수집물로부터 활성화된다.
일부 구현예에서, 피험자는 백혈구 성분채집술을 거칠 수 있고, 여기서 백혈구는 관심 있는 세포 예로 T 세포를 선별하고/거나 단리하도록 생체외에서 수집되거나, 농축되거나, 고갈된다. 이들 T 세포 단리물은 당해 기술분야에서 숙지된 방법에 의해 증식되고/거나, 형질전환될 수 있어, 본 발명의 하나 이상의 SIR 구조물은 도입되어, 이로써 본 발명의 SIR T 세포를 제작할 수 있다. 이를 필요로 하는 피험자는 후속적으로 고용량 화학요법으로 표준 치료를 거칠 수 있고, 이후에 말초 혈액 줄기 세포 이식이 이어진다. 특정 관점에서, 이식에 이어서 또는 이와 동시에, 피험자는 본 발명의 증식된 SIR T 세포의 주입을 받는다. 추가적인 관점에서, 증식된 세포가 수술 이전 또는 이후에 투여된다.
본 발명을 실행하는 키트도 또한 제공된다. 예를 들면, 피험자에서 암을 치료하거나, 하나 이상의 SIR를 발현하는 SIR T 세포를 제조하기 위한 키트가 본원에 개시된다. 키트는 SIR을 인코딩하는 핵산 분자 또는 폴리펩티드 분자 또는 SIR을 인코딩하는 벡터를 핵산을 면역 효과기 세포 내로 도입할 방법과 함께 포함할 수 있다. 키트는 SIR을 인코딩하는 핵산을 포함하는 바이러스 및 바이러스 형질도입을 증진하는 폴리브렌과 같은 화학물질을 포함할 수 있다. 키트는 SIR을 발현하는 T 세포의 단리를 위한 성분을 포함할 수 있다. 대안적으로, 키트는 SIR을 발현하는 면역 효과기 세포 (예로, T 세포 또는 NK 세포) 또는 줄기 세포를 포함할 수 있다. 개시된 SIR의 하나 이상이 키트에 포함될 수 있다. 키트는 용기 및 용기 상의 또는 이와 결합된 라벨 또는 포장 삽입물을 포함할 수 있다.
적합한 용기는 예를 들면, 병, 바이알, 주사기 등을 포함한다. 용기는 유리 또는 플라스틱과 같은 다양한 물질로 형성될 수 있다. 용기는 전형적으로 하나 이상의 핵산 분자, 바이러스, 벡터, SIR를 발현하는 T 세포를 포함하는 조성물을 t용한다. 여러 구현예에서, 용기는 무균의 접근 포트를 갖을 수 있다 (예를 들면, 용기는 정맥내 용액 백 또는 피하 주사 바늘에 의해 관통가능한 스토퍼를 갖는 바이알일 수 있음). 라벨 또는 포장 삽입물은 조성물이 특정한 병태를 치료하는데 사용되는 점을 표기한다. 라벨 또는 포장 삽입물은 전형적으로 예를 들면 종양을 치료하거나 예방하거나 SIR T 세포를 제조하는 방법에서, 개시된 핵산 분자, SIR 또는 SIR 발현하는 T 세포의 사용을 위한 지침을 추가로 포함할 것이다. 포장 삽입물은 전형적으로 이러한 치료제 산물의 용도와 관련하여 적응증, 사용법, 용량, 투여, 반대 적응증 및/또는 경고에 관한 정보를 포함하는, 치료제 산물의 시판되는 포장에 통상적으로 포함되는 지침을 포함한다. 지침의 매체는 전자적 형태 (컴퓨터 디스켓 또는 컴팩트 디스크와 같음)로 기록될 수 있거나, 영상화 (비디오 파일과 같음)될 수 있다. 키트는 또한 키트가 설계된 특정한 적용을 용이하게 하도록 추가적인 성분을 포함할 수 있다. 따라서, 예를 들면, 키트는 T 세포 상의 SIR 발현을 측정하거나, SIR을 발현하는 T 세포의 수 또는 백분율을 결정하거나, SIRT 세포의 기능성을 결정하기 위한 수단을 추가적으로 포함할 수 있다. 키트는 추가적으로 특정한 방법의 실행에 일상적으로 사용되는 완충액 및 기타 시약을 포함할 수 있다. 이러한 키트 및 적절한 내용물은 당해 기술분야에서 잘 숙지되어 있다.
본 발명은 다음의 실험적인 실시예를 참고하여 추가로 기술된다. 이들 실시예는 단지 예시의 목적으로 제공되고, 달리 특정되지 않는 한 제한하는 것으로 의도되지 않는다. 따라서, 본 발명은 결코 다음의 실시예에 제한되는 것으로 고려되어서는 안되고, 오히려 본원에 제공된 설명의 결과로서 자명해진 임의의 및 모든 변형을 포괄하는 것으로 고려되어야 한다.
실시예
SIR의 활성은 본원 및 하기에 기술된 여러 시험관내 및 생체내 검정법에 의해 테스트될 수 있다. 적합한 SIR을 생성하고, 선별하고, 사용하기 위한 일반적인 설계는 하기에 제공된다.
SIR 생성을 위한 표적의 확인
SIR이 설계된 적합한 표적은 문헌 또는 유전자 발현 데이타베이스의 검색에 기초하여 선별된다. 일반적으로, SIR을 위한 적합한 표적은 정상적인 건강한 세포와 비교하여 질환 유발 또는 질환 관련 세포 상의 더 높은 발현을 보여준다.
SIR의 생성
일단 SIR의 후보 표적 항원이 확인되면, SIR의 항원 결합 도메인이 문헌에서 입수가능한 정보에 기초하여 설계된다. 일반적으로, SIR의 항원 결합 도메인은 전형적으로 항체, 항체 단편, scFV 또는 카멜리드 vHH 도메인에 기초한다. 항체의 중쇄 (vH) 및 경쇄 (vL)의 가변 사슬, 카멜리드 vHH 도메인 및 다양한 수용체 및 리간드의 서열이 시퀀싱에 의해 또는 공개적으로 입수가능한 데이타베이스에 의해 획득될 수 있고, 상이한 실시예에 나타낸 바와 같이 본원에 기술된 방법을 사용하여 SIR의 합성에 사용될 수 있다. SIR의 항원 결합 도메인을 포함하는 서열은 코돈 최적화되고, 공개적으로 입수사능한 소프트웨어 (예로, ThermoFisher 또는 IDT) 및 시판 공급자 (예로, IDT)를 사용하여 인위적으로 합성된다. 결과로 얻은 단편은 표준 분자생물학 기법을 사용하여 PCR 증폭되고, 상이한 SIR 골격을 포함하는 상이한 벡터에 클론된다. 일반적으로, SIR 구조물은 전형적으로 렌티바이러스성 벡터에 클론된다. SIR 구조물의 서열은 자동화된 시퀸싱을 사용하여 검증된다.
예시적인 SIR 구조물은 pLenti-EF1a-CD8SP-MYC3-WT1-Ab13-vL-V5-[hTCRb-KACIAH]-F-P2A-SP-WT1-Ab13-vH-Myc4-[hTCRa-CSDVP]-F-F2A-PAC-DWPRE [클론 번호 071516-J04](서열번호 1380)이다. 이러한 구조물은 많은 편리한 제한효소 부위를 갖고 있어, 항원 결합 도메인 단편 (예로, vL 및 vH 도메인)이 절단되고 다른 항원을 표적하는 항원 결합 도메인 단편으로 대체될 수 있다. 예를 들면, vL 도메인은 EcoR I 및 Xho I 제한효소 분위를 사용하여 벡터로부터 절단되고, EcoRI 및 XhoI 부위를 포함하고 또 다른 항원을 표적하는 vL 도메인을 인코딩하는 새로운 DNA 단편으로 대체될 수 있다. 벡터는 CD8 신호 펩티드 (CD8SP)의 상류에 Nhe I 부위를 보유하고, 이는 또한 Xho I 부위와 함께 5' 신호 펩티드를 보유하는 새로운 vL 단편에 클론하는데 사용될 수 있다. BstB I 및 Mlu I 부위는 vH 단편을 대체하는데 사용될 수 있다. Xho I 및 Spe I 부위는 V5-[hTCRb-KACIAH]-F-P2A를 인코딩하는 모듈을 대체하는데 사용될 수 있다. 유사하게, MluI 및 Xba 부위는 Myc4-[hTCRa-CSDVP]-F-F2A를 포함하는 모듈을 대체하는데 사용될 수 있다. PAC을 인코딩하는 부속 모듈은 Xba I (또는 Nde I) 및 SalI 제한효소 부위를 사용하여 대체될 수 있다. 따라서, 당업자라면 이러한 벡터 및 항원 결합 도메인 (예로, 항체의 vL 및 vH 도메인)의 서열을 임의의 다른 새로운 항원을 표적하는 SIR을 생성하는데 사용할 수 있다.
항원 결합 도메인이 TCRb 불변 사슬에 연결되는 한편 TCRa 불변 사슬은 빈 상태로 남은 SIR을 제조하는데 사용될 수 있는 또 다른 예시적인 구조물은 pLenti-EF1a-CD8SP-MYC-[hTCRa-T48C-opt1]-F-F2A-FMC63-vH-V5-[hTCRb-S57C-opt1]-F-P2A-Pac-DWPRE [042616-B03] (서열번호 896)이다. 항원 결합 도메인은 이 벡터의 BstB I 및 Mlu I 제한효소 부위 사이에 클론될 수 있다. 대안적으로, 자신의 신호 서열을 갖는 항원 결합 도메인은 이 벡터의 Spe I 및 Mlu I 제한효소 부위 사이에 클론될 수 있다.
항원 결합 도메인이 TCRb 불변 사슬에 연결되는 한편 TCRa 불변 사슬은 빈 상태로 남은 SIR을 제조하는데 사용될 수 있는 또 다른 예시적인 구조물은 pLenti-EF1a-CD8SP-V5-[hTCRb-KACIAH]-F-P2A-FMC63-vH-MYC-[hTCRa-CSDVP]-F-F2A-Pac-DWPRE [081415-F04] (서열번호 895)이다. 항원 결합 도메인은 이 벡터의 BstB I 및 Mlu I 제한효소 부위 사이에 클론될 수 있다. 대안적으로, 자신의 신호 서열을 갖는 항원 결합 도메인은 이 벡터의 Spe I 및 Mlu I 제한효소 부위 사이에 클론될 수 있다.
분비성 항원-NLuc 융합 단백질의 생성 (조건부 단계)
면역 효과기 세포 상에서 SIR의 발현 및 결합 활성을 테스트하기 위하여, SIR의 항원성 표적의 세포외 도메인이 Gly-Ser 링커를 통해 NLuc 또는 GLuc 또는 MLuc7 또는 TurboLuc16 또는 PaLuc와 같은 루시퍼라제에 융합된다. 예를 들면, CD19의 세포외 도메인이 Gly-Ser 링커를 통해 NLuc에 프레임에 맞추어 융합된다. 융합 단백질이 N-말단 신호 서열을 보유한다. 결과로 얻은 구조물이 293FT 세포에 일시적으로 형질감염되고, 분비성 융합 단백질을 포함하는 상청액이 48 내지 72시간 이후에 수집된다.
분비성 항원 결합 도메인 (ABD)-NLuc 융합 단백질의 생성 및 사용 (조건부 단계)
SIR의 활성을 테스트하는데 적합한 세포주를 확인하기 위하여, SIR의 항원결합 도메인이 또한 NLuc 또는 GLuc 또는 MLuc7 또는 TurboLuc16 또는 PaLuc와 같은 루시퍼라제에 융합된다. 예를 들면, SIR이 CD19 표적하는 FMC63 단일클론 항체에 기초하는 경우에, FMC63의 scFV 단편 (vL-Gly-Ser-링커-vH)은 Gly-Ser 링커를 통해 NLuc에 프레임에 맞추어 융합된다. 융합 단백질은 N-말단 신호 서열을 보유한다. 결과로 얻은 구조물이 293FT 세포에 일시적으로 형질감염되고, 분비성 융합 단백질을 포함하는 상청액이 48 내지 72시간 이후에 수집된다. 세포주의 패널이 ABD-NLuc 융합 단백질에 대한 융합으로 테스트되고, 높은 수준의 SIR 표적을 발현하는 세포주를 확인하고, 따라서 SIR의 활성을 테스트하는데 사용될 수 있다. SIR의 표적을 발현하는 세포주는 문헌 검색, 시판되는 항체로의 면역염색과 같은 대안의 방법을 사용하거나, 공개적으로 입수가능한 유전자 발현 데이타베이스의 검색에 의해 역시 확인될 수 있다.
SIR을 발현하는 면역 효과기 세포가 기능적 SIR을 확인하도록 다음의 검정법으로 테스트된다.
(A) NLuc 결합 검정법:
대조군 벡터 및 SIR 발현하는 Jurkat-NFAT-GFP 또는 T 세포가 표적 항원-Nluc 융합 단백질 (상기에 기술된 바와 같음)로 염색되고, 표적 항원에 결합하는 이들의 능력이 Nluc 활성을 측정함으로써 검정된다. 예를 들면, CD19 표적하는 FMC63 기반의 SIR를 발현하는 Jurkat-NFAT-GFP 세포는 대조군 벡터를 발현하는 Jurkat-NFAT-GFP 세포 또는 모체 Jurkat-NFAT-GFP 세포와 비교하여 CD19-NLuc 융합 단백질에 대한 결합 증가를 나타낸다.
(B) NFAT 프로모터 구동된 GFP 발현의 유도:
대조군 벡터 및 SIR 발현하는 Jurkat-NFAT-GFP 또는 T 세포가 표적 항원-발현하는 세포주 (상기에 기술됨)와 함께 4 내지 24시간 동안 공동배양되고, 표적 항원에 결합하는 이들의 능력이 유세포 계측법을 사용하여 GFP 발현의 유도를 측정함으로써 검정된다. 세포 상청액이 수집되고, 사이토카인의 유도 (예로, IL2)에 대해 검정된다.
(C) 사이토카인 생산의 검정:
대조군 벡터 및 SIR 발현하는 Jurkat-NFAT-GFP 또는 T 세포가 표적 세포주와 함께 4 내지 96시간 동안 공동배양되고, 상청액이 사이토카인 (예로, IL2, IFNγ, TNFα 등) 발현의 유도에 대해 ELISA를 사용하여 조사된다..
(D) 세포독 활성의
시험관내
및
생체내
검정:
감염되지 않은 T 세포 또는 대조군 벡터 또는 SIR 발현하는 세포가 루시퍼라제 (GLuc, NLuc, Turboluc 16 등과 같음)의 비-분비 형태를 발현하는 표적 세포주와 함께 4 내지 96시간 동안 공동배양되고, 세포 용해의 유도가 국제특허출원 PCT/US17/52344에 기술된 바와 같이 루시퍼라제 활성을 측정함으로써 조사된다. 세포독 활성의 측정을 위한 대안의 방법 (예로, 51Cr 방출 검정법 또는 LDH 방출 검정법)도 마찬가지로 사용될 수 있다. SIR 발현하는 T 세포의 활성은 또한 면역결핍 마우스의 이종이식 모델을 사용하여 생체내에서 검정될 수 있다.
상기 방법에 기초하여, 당업자라면 임의의 항원에 대한 적절한 기능성 SIR 또는 SIR 풀을 용이하게 설계하고, 제작하고, 테스트하고, 선별할 수 있다. SIR 또는 SIR 풀은 인간 임상 시험 및 다양한 질환 병태의 예방 및 치료를 위한 임상적 용도에 사용될 수 있다. 표 9는 본 발명의 SIR을 사용하여 치료될 수 있는 인간 질환 병태의 예시적인 목록을 제공한다.
상이한 SIR 또는 SIR의 하위집합이 이에 제한되는 것은 아니지만, 유병율, 질환 유발 및 질환 관련 세포 상에서 표적 항원의 발현 수준, 질환 부하 및 질환의 진행 속도를 포함하는 다양한 요인에 의존하여 상이한 질환 병태에 최적으로 재단하는 것이 가능하다. 상이한 SIR은 심지어 상이한 환자의 단일 질환 병태를 위해 이들의 효능, 독성 프로파일 및 환자의 병태에 의존하여 최적으로 재단될 수 있다. 본 발명은 다양한 입양 면역 반응을 생성하도록 중요한 기술적 및 논리적 장애물에 대한 해법을 제공한다.
정상적인 TCR 다양성은 유전자 재배열에 의해 생성된다. 흉선에서 엄격한 양성 및 음성 선별 과정은 낮은 친화도 범위 내에서 자가-펩티드/ MHC를 인식하는데 제한된 αβTCR을 발현하는 T 세포만이 말단에 군집할 수 있음을 보장한다. 따라서, 흉선의 환경은 자가-제한되지만 자가-반응하지 않는 αβ T 세포의 풀의 생성을 허용한다.
상이한 항원 결합 도메인으로부터 SIR의 다양한 풀을 생성하는 것은 다수의 항원 결합 도메인을 생성하고 테스트하는 기술적 및 경제적 장애물에 의해 제한된다. 더욱 중요한 점은, 각각의 항원 결합 도메인 (예로, 항체의 vL 및 vH 단편)이 다른 항원에 결합하고 표적외 독성을 야기하는 잠재력을 갖으면서, 다수의 항원 결합 도메인에만 기초한 SIR의 다양한 풀은 독성의 증가된 위험성을 갖는다. 따라서, 이러한 풀의 잠재적인 다양성이 표적외 독성을 감소시키도록 제한되어야 할 것이다. 본 발명은 단일 또는 소수의 항원 결합 도메인으로부터 이들을 TCR 사슬의 상이한 변이체에 부착하여 SIR의 다양한 풀을 생성함으로써 이러한 문제점을 극복하고 있다. SIR 풀의 다양성은 상이한 링커의 사용에 의해 추가로 증가된다. 풀을 발현하는 T 세포의 다양성은 본 발명에 기술된 상이한 부속 모듈 및 치료제 대조군의 사용에 의해 추가로 증가될 수 있다.
이러한 SIR의 다양한 풀은 상기 항원을 발현하는 질환 유발 또는 질환 관련 세포에 대한 다양한 면역 반응을 제공하는데 사용될 수 있다. 대안적으로, SIR의 다양한 풀은 선택적으로 당해 기술분야에 숙지된 기법을 사용하여 바코드화된 DNA이고, 후속적으로 최적의 생물학적 및 임상적 특징을 갖는 단일 SIR 또는 이의 하위집합을 선별하는데 사용될 수 있다. 이들 특징은 이에 제한되는 것은 아니지만, 시험관내 생물학적 검정법에서의 성능 (예로, 세포독성, 사이토카인 분비, 결합 친화도, 세포 표면 발현, 표적외 효과, T 세포 증식, 소모 마커의 발현 및 말단 분화), 생체내 검정법에서의 성능 (예로, 생존, 종양 감소, T 세포 지속성, T 세포 증식 등) 및 임상적 경험 (예로, 질환 진정, 재발 속도, 독성 등)을 포함할 수 있다. 본 발명의 SIR은 단독으로 또는 다른 SIR, CAR, cTCR 및 이들의 표적 항원을 발현하는 세포에 의해 유발되거나 이와 연관된 다양한 질환 병태의 예방 및 치료를 위한 면역 효과기 세포의 다양한 풀을 생성하는 것으로 당해 기술분야에서 숙지된 다른 천연 및 합성 면역 수용체와 조합하여 사용될 수 있다.
본 발명의 SIR은 다양성뿐만 아니라 결합 친화도, 세포 표면 발현, 사슬 쌍 형성, 신호전달 및 세포 전달를 위해 최적화되었던 키메라 T 세포 수용체의 변형된 형태이다. 임상적 적용에 적합한 이중 사슬 SIR을 생성하기 위하여, 여러 기술적 및 개념적 장애물이 겨냥된다. 이중 사슬 cTCR 형식의 주요한 한계는 두 개의 상이한 플라스미드 구조물을 전달하는데 기술적 어려움이다. T 세포를 두 개 별도의 벡터 또는 두 개의 프로모터를 갖는 단일 벡터에서 이중 사슬 SIR의 두 개 사슬로 형질도입하는 것이 가능하더라도, 이들 접근법 둘 다는 도입된 SIR 사슬의 균형화되지 못한 발현의 위험이 있고, 과다하게 발현된 사슬이 내인성 TCR 사슬과 미스페어링할 가능성을 증가시킨다. 두 개 벡터의 접근법의 추가적인 제한은 단일 벡터 접근법과 비교하여 표적 세포의 더욱 낮은 감염 효율이다. 단일 벡터에서 두 개 별도의 프로모터의 사용은 삽입물 크기, 즉 벡터의 크기를 대부분의 레트로바이러스성 벡터 및 렌티바이러스성 벡터의 최적의 패키지 한계를 초과하여 증가시키는 단점을 갖고, 이는 다시 바이러스 역가의 감소를 유도한다. 추가적으로, 내부 프로모터는 프로모터 간섭을 통해 레트로바이러스성 벡터에서 침묵화될 수 있다. 뇌심근염 바이러스의 리보좀 내부 진입 부위 (IRES) 서열이 이중시스트론 바이러스성 벡터를 제작하는데 널리 사용되어 왔지만, IRES-매개된 번역은 비교적 비효율적이다. 또한, IRES가 크기가 비교적 크고, 복수의 IRES 요소의 사용은 번역 인자의 경쟁 및/또는 상동적 재조합을 유도할 수 있다. 이를 고려하여, 피코나바이러스 또는 돼지 테스코바이러스로부터 유래된 '자가-절단' 2A 펩티드 서열이 두 개의 SIR 사슬 사이의 도입이 도입된 SIR 사슬 둘 다의 동등한 몰 발현을 달성하도록 선택된다. 리보좀 스킵 기작을 통하여, 이들 서열이 단일 mRNA 전사물로부터 두 개 별도의 펩티드의 번역을 유도하여, 각각의 펩티드의 근접한 화학량적 생산을 달성한다. 절단가능한 "2A" 펩티드의 예는 서열번호 3060 내지 3062 및 3064에 제공되어 있다. 일부 구현예에서, (SG)2 모티브가 절단의 효율을 증진하도록 2A 서열의 상류에 역시 첨가되었다. 또한, SIR에 연결된 임의의 잔류 2A 펩티드 서열를 피하기 위하여, 퓨린 절단 부위가 (SG)2 모티브의 상류에 첨가되어 번역 이후에 잔류 2A 펩티드의 절단을 용이하게 한다.
렌티바이러스성 및 레트로바이러스성 벡터는 임상적 적용에 적합한 이중 사슬 SIR 시스템을 개발하기 위하여 처음에 선택되었다. 후속적으로, 실험이 T 세포에서 SIR을 성공적으로 발현하도록 슬리핑뷰티 트랜스포존 및 mRNA 형질감염을 사용하였다.
pLENTI-Blast 벡터는 pLenti6v5gw_lacz 벡터 (Invitrogen; ThermoFisher Scientific)로부터 LacZ 유전자의 제거에 의해 유래되었다. pLenti-MP2는 판달리스 출파스 (Addgene plasmid # 36097; Enomoto et al. Exp. Neurol. 248: 170-82, 2013)로부터 기증받았고, 표준 분자생물학 기법을 사용하여 CMV 프로모터를 인간 EF1α 프로모터로 대체함으로써 pLENTI-EF1α 렌티바이러스성 벡터 (서열번호 870)를 생성하는데 사용하였다. psPAX2는 디디에 트로노 (Addgene plasmid # 12260)로부터 기증받았다. pLP/VSVG 외투 플라스미드 및 293FT 세포는 인비트로겐사 (ThermoFisher Scientific)로부터 입수하였다. 레트로바이러스성 전달 벡터 MSCVneo, MSCVhygro 및 MSCVpac 및 패키지 벡터 pKAT는 로버트 일라리아 교수의 연구실로부터 입수하였다. phRGTK 레닐라 루시퍼라제 플라스미드는 프로메가사로부터 입수하였다.
상이한 신호 펩티드, 항체 결합 도메인, 링커, TCR 불변 사슬, 절단가능한 링커 및 선별 마커 (예로, PAC, EGFP, CNB30 등)을 인코딩하는 유전자 단편은 시판 공급자 (IDT)를 사용하여 단일 또는 다수의 단편으로 인위적으로 합성되었고, PCR 반응에서 주형으로서 적절한 제한효소 부위를 포함한 프라이머와 함께 사용되었다. 증폭된 단편은 적절한 제한효소로 소화된 다음, 표준 분자생물학 기법을 사용하여 pLENTI-EF1α (서열번호 870), pLENTI-EF1α-DWPRE (서열번호 871) 또는 MSCV-Bgl2-AvrII-Bam-EcoR1-Xho-BstB1-Mlu-Sal-ClaI.I03 (서열번호 872) 벡터에 클론되었다. pLENTI-EF1α-DWPRE 벡터는 WPRE 영역의 결여로 pLENTI-EF1α와 달라진다. 대안적으로, 전체 SIR 카세트를 인코딩하는 유전자 단편 (예로, CD8-신호 펩티드-161-vL-TCRb-F-2A-IgH-신호 펩티드-161-vH-TCRa-F-2A-PAC)이 인위적으로 합성될 수 있다. 다음으로 결과로 얻은 단편은 적절한 제한효소 부위를 포함한 프라이머와 함께 PCR 반응에서 주형으로서 사용될 수 있다. 증폭된 단편은 적절한 제한효소로 소화된 다음, 표준 분자생물학 기법을 사용하여 적절한 벡터에 클론될 수 있다.
인간 TCR-베타 (TCRb) 및 인간 TCR-알파 (TCRa) 사슬의 불변 영역에 각각 프레임에 맞추어 융합된 FMC63 단일클론 항체로부터 유래된 vL 및 vH 단편을 포함하는 다수의 상이한 렌티바이러스성 구조물이 제작되었다. 대부분의 구조물은 또한 퓨린-SGSG-2A를 인코딩하는 링커를 통해 SIR 발현 카세트에 융합된 상이한 선별 마커 (예로, 퓨로마이신 N-아세틸-전이효소 (PAC), 증진된 녹색 형광성 단백질 (EGFP) 및 분비성 NLuc)를 보유한다.
예시적인 구조물은 pLenti-EF1a 벡터 (서열번호 870)에 클론된 CD8SP-FMC63-vL-V5-[hTCRb-WT]-F-P2A-SP-FMC63-vH-Myc-[hTCRa-WT]-F-F2A-PAC (080815-F02)[서열번호 922]이다. 이러한 벡터에서 SIR 발현 카세트는 인간 EF1α (연장인자 1 알파) 프로모터에 의해 구동된다. SIR 발현 카세트는 5'-말단부터 인간 CD8 신호 펩티드 (CD8SP), 코돈 최적화된 FMC63 vL 단편, C-말단에 Gly-Ser-Gly 아미노산을 포함한 V5 링커, 인간 TCR-β2 (TCRb) 사슬의 불변 영역 (C 영역), 퓨린 절단 부위 (RAKR), SGSG 링커, P2A 리보좀 스킵 서열, 인간 IgH 신호 펩티드, 코돈 최적화된 FMC63 vH 단편, 공통적으로 사용된 Myc 에피토프 태그로부터 유래하고 C-말단에 Gly-Ser-Gly 아미노산을 포함한 Myc 링커, 인간 TCR-α (TCRa) 사슬의 불변 영역 (C 영역), 퓨린 절단 부위 (RAKR), SGSG 링커, F2A 리보좀 스킵 서열 및 퓨로마이신 저항성 유전자 (PAC)의 변이체 형태를 인코딩하는 뉴클레오티드를 포함한다. 여기에는 vL 단편 및 V5 에피토프 태그 사이의 Xho I 제한효소 부위, 인간 IgH 신호 펩티드 이전에 Spe I 제한효소 부위, Myc 태그 이전에 Mlu I 부위 및 PAC 유전자 이전에 Xba I 및 Nde I 부위를 포함하는 짧은 링커가 존재한다. 전체 발현 카세트는 pLenti-EF1a 벡터 (서열번호 870)에서 Nhe I 및 Sal I 부위 사이에 클론되었다. 이러한 벡터는 표준 분자생물학 기법을 사용하여 각각 Nhe I 및 XhoI 및 Spe I 및 Mlu I 효소로의 소화에 의해 FMC63-vL 및 -vH 단편을 제거하고 이들을 다른 항원을 표적하는 항원 결합 도메인 (예로, vL, vH, vHH, scFv, 수용체 또는 리간드 등)을 인코딩하는 DNA 단편으로 대체함으로써 다른 항원을 표적하는 항원 결합 도메인을 클론하는데 사용될 수 있다.
상기 구조물의 여러 변이체가 마찬가지로 제작되었다:
1. pLenti-EF1-FMC63vL-V5-[mTCRb-WT]-F-P2A-FMC63-vH-Myc-[mTCRa-WT]-F-F2A-Pac-B06: 이 구조물는 상응하는 인산 사슬 대신에 마우스 TCR-β (TCRb) 및 마우스 TCRα 사슬의 불변 영역 (C 영역)을 갖는 점을 제외하고는 pLenti-EF1-FMC63vL-V5-[hTCRb-WT]-F-P2A-FMC63-vH-Myc-[hTCRa-WT]-F-F2A-Pac-F02 구조물을 닮아 있다.
2. pLenti-EF1-FMC63-vL-V5-[TCRb-S57C-opt1]-F-P2A-FMC63-vH-Myc-[TCR-ca-T48C-opt1]-F-F2A-PAC-L05 (050515-L05): 이 구조물는 다음의 관점에서 pLenti-EF1-FMC63vL-V5-[hTCRb-WT]-F-P2A-FMC63-vH-Myc-[hTCRa-WT]-F-F2A-Pac-F02와 달라진다.
a. TCRb 및 TCRa 사슬의 불변 영역을 코딩하는 뉴클레오티드 서열이 SIR 발현을 증가시키도록 코돈 최적화되었다.
b. 도입된 TCR 사슬의 내인성 TCR 사슬과의 미스페어링을 감소시키기 위하여, 추가적인 시스테인 잔기가 각각의 사슬에 첨가되어 추가적인 사슬간 디설파이드 결합의 형성을 촉진하였다. 따라서, TCRb 서열이 Ser 57의 시스테인 돌연변이를 보유하고, TCRa 서열이 트레오닌 48의 시스테인 돌연변이를 보유한다.
3. pLenti-EF1-FMC63-vL-V5-[TCRb-KACIAH]-F-P2A-FMC63-vH-Myc-[TCRa-CSDVP]-F-F2A-PAC-D06 (081415-D06): 이 구조물은 다음의 관점에서 pLenti-EF1-FMC63vL-V5-[hTCRb-WT]-F-P2A-FMC63-vH-Myc-[hTCRa-WT]-F-F2A-Pac-F02와 달라진다.
a. TCRb 및 TCRa 사슬의 불변 영역을 코딩하는 뉴클레오티드 서열이 SIR 발현을 증가시키도록 코돈 최적화되었다.
b. 도입된 TCR 사슬의 내인성 TCR 사슬과의 미스페어링을 감소시키기 위하여, 추가적인 시스테인 잔기가 각각의 사슬에 첨가되어 추가적인 사슬간 디설파이드 결합의 형성을 촉진하였다. 따라서, TCRb 서열이 Ser 57의 시스테인 돌연변이를 보유하고, TCRa 서열이 트레오닌 48의 시스테인 돌연변이를 보유한다.
c. 마우스 TCR이 이들의 인간 상대방보다 더 잘 발현하는 것으로 관찰되었고, 인간 TCR의 마우스화는 이들의 발현을 개선하는 것으로 관찰되었다. 이러한 구조물에서, 인간 TCRβ (TCRb) 불변 영역의 5개 아미노산이 상응하는 마우스 아미노산으로 대체되었다. 이들 마우스 아미노산은 K-18, A-22, I-133, A-136 및 H-139이었다. 또한, 4개의 아미노산, 세린 (S-91), 아스파라긴산 (D-92), 발린 (V-93) 및 프롤린 (P-94)을 포함하는 마우스 TCRα (TCRa) 불변 사슬의 영역이 인간 TCRα (TCRa) 불변 사슬 (서열번호 3010)로 치환되었다..
렌티바이러스성 벡터에 추가하여, SIR 발현 카세트는 레트로바이러스성 벡터내로 클론되었다. 이러한 목적으로, pMSCV-puro 레트로바이러스성 벡터는 Bgl Ⅱ 및 Cla I 효소로의 소화 및 AvrⅡ, BamHI, EcoRI, Xho I, BstBI, Mlu I 및 Sal I의 제한효소 부위를 포함하는 Bgl Ⅱ 및 Cla I 절단된 이중 가닥 올리고뉴클레오티드의 라이게이션에 의해 변형되었다. 결과로 얻은 MSCV-Bgl2-AvrII-Bam-EcoR1-Xho-BstBI-Mlu-Sal-ClaI.I03로 명명된 벡터의 서열은 서열번호 872이다. 상이한 SIR 구조물을 위한 발현 카세트는 pLenti-EF1 벡터로부터 NheI 및 SalI 효소를 사용하여 소화되고, AvrⅡ 및 SalI로 소화된 상기 벡터에 클론되었다. 예시적인 SIR 구조물 MSCV-FMC63vL-V5-[TCRb-KACIAH]-F-P2A-2-Spe-FMC63vH-MYC-[TCRa-CSDVP]-F-F2A-Pac.N01 [클론 번호 032216-N01]의 서열은 서열번호 873에 제시되어 있다. MSCV 기반의 레트로바이러스성 벡터에서 다른 SIR 구조물이 이들의 상응하는 pLenti-EF1 벡터로부터 NheI 내지 SalI 단편을 클로닝함으로써 쉽게 제작될 수 있다.
SIR 발현 카세트가 또한 슬리핑 뷰티 벡터 pSBbi-pur (서열번호 874; Addgene; 플라스미드 #60523) 및 pSBbi-GP (Addgene; 플라스미드 #60511) 내로 클로닝되었다. 이러한 목적으로, 상이한 SIR 구조물을 위한 발현 카세트가 pLenti-EF1 벡터로부터 AgeI 및 XbaI 효소를 사용하여 소화되었고, AgeI 및 XbaI 효소로 소화된 pSBbi-pur 및 pSBbi-GP 벡터에 클론되었다. CD19 표적하는 SIR을 인코딩하는 예시적인 벡터의 서열은 서열번호 875에 제공되어 있다. 연장된 멀티클로닝 부위를 갖는 또 다른 예시적인 슬리핑 뷰티 벡터의 서열은 서열번호 876에 제시되어 있다.
상이한 세포 표면 및 세포내 항원을 표적하는 상이한 구조물의 세포독성을 측정하기 위한 루시퍼라제 (예로, GLuc 또는 NLuc)를 발현하도록 조작된 세포주가 표 A에 제공되어 있다. 이러한 실험에 사용된 세포주, 세포주 상의 표적 항원 및 이들의 배양 배지는 다음의 표 A에 나타낸다. 세포는 5% CO2 습식 배양기에서 37℃로 배양되었다. 세포주는 ATCC, NIH AIDS 시약 프로그램으로부터 획득되거나, 연구실에서 입수가능하였다.
NFAT-의존성 GFP 리포터 유전자로 조작된 Jurkat 세포주 (클론 E6-1)는 UCSF에서 아서 와이즈 교수로부터 기능받았다. Jurkat 세포는 10% FBS, 페니실린 및 스트렙토마이신이 보충된 RPMI-1640 배지에서 유지되었다.
렌티바이러스 및 레트로바이러스의 생성
렌티바이러스는 이전에 기술된 바와 같이 (Matta, Hozayev, Tomar, Chugh & Chaudhary, 2003), 필수적으로 293FT 세포에서 칼슘 포스페이트 기반의 형질감염에 의해 생성되었다. 293FT 세포가 10% FCS 4 mM L-글루타민, 0.1 mM MEM 비-필수 아미노산 및 1 mM MEM 소듐 피루베이트를 갖는 DMEM (본원에서 DMEM-10라고 지칭됨)에서 성장되었다. 렌티바이러스의 생성을 위해, 293FT 세포가 형질감염 당일에 대략 80 충만도가 되도록 10 cm 조직 배양 플레이트에서의 항생제 없는 10 mL DMEM-10 배지에 도말되었다. 다음날, 세포가 상이한 유전자를 인코딩하는 10 μg의 렌티바이러스성 발현 벡터, 7.5 μg의 PSPAX2 플라스미드 및 2 μg의 PLP/VSVG 플라스미드를 사용하여 칼슘 포스페이트 형질감염 방법에 의해 형질감염되었다. 형질감염 후 대략 15 내지 16시간째, 9 mL의 배지가 제거되어 5 mL의 신선한 배지로 교체되었다. 대략적으로, 형질감염 후 40시간째, 5 mL의 상청액이 수집되었고 (제 1 수집물), 신선한 5 mL 배지로 교체되었다. 대략적으로 형질감염 후 72시간째, 모든 배지가 수집되었다 (제 2 수집물, 보통 약 6 mL). 수집된 상청액이 풀로 형성되었고, 1000 rpm에서 1분 동안 원심분리하여 임의의 세포 잔류물 및 미부착된 세포를 제거하였다. 세포가 없는 상청액은 0.45 μm 주사기 필터를 통하여 여과되었다. 일부 경우에, 상청액이 18,500 rpm에서 2시간 동안 4℃로 초원심분리법에 의해 추가로 원심분리되었다. 바이러스 펠렛은 XVIVO 배지에서 초기 부피의 1/10에 재현탁되었다. 바이러스는 신선하게 표적 세포를 감염시키는데 사용되거나, 일정량으로 -80℃에서 냉동 보관되었다.
T 세포 및 PBMC의 감염
연층 세포가 로스앤젤레스 아동 병원의 혈액 은행에서의 미-확인된 성인 공여자로부터 획득되었고, 말초 혈액 단핵구 세포 (PBMC)를 피콜-하이파크 구배 원심분리법에 의해 단리하는데 사용되었다. PBMC는 이와 같이 사용되거나, 제조사의 추천사항에 따라 CD3 자기 마이크로비드 (Miltenyi Biotech)를 사용하여 T 세포를 단리하는데 사용되었다. PBMC 또는 단리된 T 세포가 10 ng/mL CD3 항체, 10 ng/mL CD28 항체 및 100 IU 재조합 인간-IL2가 보충된 XVIVO 배지 (Lonza)에 재현탁되었다. 세포는 5% CO2 습식 배양기에서 37℃로 배양되었다. 세포는 렌티바이러스성 벡터로 감염 전에 1시간 동안 상기 배지에서 활성화되었다. 일반적으로, 일차 세포 (예로, T 세포)가 아침에 스핀-감염 (8 μg/ml of 폴리브렌® (Sigma, 카탈로그 번호 H9268)의 존재 시 XVIVO 배지에 재현탁되었던 300 μL의 농축된 바이러스로 1800 rpm으로 37℃에서 90분 동안)을 사용하여 감염되었다. 배지가 저녁에 교환되었고, 감염은 2일 더 총 3번의 감염을 위해 반복되었다. 3번째 감염 이후, 세포는 펠렛화되었고, 10 ng/mL CD3 항체, 10 ng/mL CD28 항체 및 100 IU 재조합 인간-IL2를포함하고 각각의 항생제 (지시된 경우)가 보충된 신선한 XVIVO 배지에 재현탁되었고, 달리 지시되지 않는 한 선별을 위한 세포 배양 플라스크에 배치되었다. 세포는 약물 선별이 사용되지 않는 경우 상기 배지에 10 내지 15일 동안 및 약물 선별이 사용되는 경우 20 내지 30일 동안 배양되었다. 세포가 EGFP를 발현하는 렌티바이러스로 감염된 경우, 이들은 EGFP-발현하는 세포를 농축하도록 약물 선별 없이 증식되거나 유동-선별되었다. 암 세포주의 감염을 위해, 대략 500,000개의 세포가 폴리브렌® (Sigma, 카탈로그 번호 H9268)를 갖는 3 mL의 총 부피에서 2 mL의 미농축된 바이러스 상청액으로 감염되었다. 다음 날 아침에, 세포가 펠렛화되었고, 각각의 항생제를 갖는 배지에 재현학하여 선별을 위해 세포 배양 플라스크에 배치되었다.
렌티바이러스 벡터 생산을 위해, 293FT 세포가 10 mL의 DMEM-10 배지를 넣은 10 cm 조직 배양 플레이트에서 10 μg의 레트로바이러스성 구조물, 4 μg의 pKAT 및 2 μg의 VSVG 플라스미드을 사용하여 형질감염된 점을 제외하고는 필수적으로 상기에 기술된 바와 유사한 절차가 레트로바이러스성 벡터의 생성에 사용되었다. 바이러스 수집 및 표적 세포의 감염이 렌티바이러스성 벡터를 위해 필수적으로 상기에 기술된 바와 같이 수행되었다.
슬리핑 뷰티 벡터로의 Jurkat 세포 전기천공
전기천공을 위해, 5 × 106개 Jurkat 세포가 90 g에서 10분 동안 원심분리되었고, 100 μL 완충액에 재현탁되어 20 μg의 슬리핑 뷰티 SIR 인코딩 플라스미드 및 5 μg의 SB100X 트랜스포자제 플라스미드와 혼합되었다. 전기천공 완충액 및 큐벳이 론자사로부터의 아마사 세포주 뉴클레오펙터 키트 V (VCA-1003)로 제공되었다. 재현탁된 세포가 큐벳으로 이전되었고, 프로그램 X-001을 사용하여 전기천공되었다. 전기천공 이후에, 세포가 큐벳에서 상온으로 10분 동안 배양되었고, 다음으로 20% FBS가 보충된 미리 가온된 RPMI 1 mL이 큐벳의 세포에 첨가되었다. 세포는 각각의 웰에 1 mL 미리 가온된 배지를 포함하는 6 웰 플레이트로 이전되었고, 37℃에서 밤샘 배양되었다. 다음날, 세포가 원심분리되었고, 배지는 10% FBS 및 250 ng/mL 퓨로마이신이 보충된 RPMI로 교체되어 슬리핑 뷰티 SIR 발현하는 Jurkat 세포를 선별하였다.
항체 및 약물
디지토닌을 시그마사 (카탈로그 번호 D141)로부터 구입하였고, 100 mg/mL의 스톡 용액이 DMSO에서 제조되었다. 1 mg/mL의 희석된 스톡은 PBS에서 제조되었다. 세포 용해에 사용된 디지토닌의 최종 농도는 달리 표시되지 않는 한 30 μg/mL이었다.
IL2 ELISA
인간 IL2이 SIR-발현하는 Jurkat-NFAT-GFP 효과기 세포 또는 특이적 표적 세포와 24 내지 96시간 동안 공동배양되었던 T 세포의 세포 배양 상청액에서 R&D 시스템사 (Minneapolis, MN)로부터의 IL2-ELISA 키트를 제조사의 추천에 따라 사용하여 측정되었다.
FACS 분석
마우스 항-인간 c-Myc APC-컨쥬게이션된 단일클론 항체 (카탈로그 번호 # IC3696A)가 R&D 시스템사 (Minneapolis, MN)로부터 얻었다. 바이오틴화된 프로테인 L은 GeneScript (Piscataway, NJ)로부터 구입하였고, 포스페이트 완충된 식염수 (PBS)에서 1 mg/mL로 재구성되었으며, 4℃에서 보관되었다. 스트렙트아비딘-APC (SA1005)는 써모피셔 사이언티픽사로부터 구입하였다.
Myc 염색을 사용한 CAR 및 SIR의 검출을 위해, 1 × 106개 세포가 수확되었고, 4% 소혈청 알부민 (BSA)를 포함한 얼음에 냉각된 1× PBS 세척 완충액 3 mL로 세 번 세척되었다. 세척 이후에, 세포가 10 μL의 APC-컨쥬게이션된 Myc 항체를 포함한 얼음에 냉각된 세척 완충액 0.1 mL에 재현탁되었고, 암소에서 1시간 동안 배양되었으며, 이후에 얼음에 냉각된 세척 완충액으로 두 번 세척되었다.
프로테인 L 염색을 사용한 CAR 및 SIR의 검출을 위해, 1 × 106개 세포가 수확되었고, 4% 소혈청 알부민 (BSA)를 포함한 얼음에 냉각된 1× PBS 세척 완충액 3 mL로 세 번 세척되었다. 세척 이후에, 세포가 1 μL의 프로테인 L을 포함한 얼음에 냉각된 세척 완충액 0.1 mL에 4℃에서 1시간 동안 재현탁되었다. 세포는 얼음에 냉각된 세척 완충액으로 세 번 세척된 다음 세척 완충액 0.1 mL에 넣은 10 μL의 APC-컨쥬게이션된 스트렙트아비딘과 함께 (암소에서) 30분 동안 배양되었으며, 이후에 얼음에 냉각된 세척 완충액으로 두 번 세척되었다. FACS가 BD 바이오사이언스사로부터의 FACSVerse 분석기를 사용하여 시행되었다.
세포 사망 검정법
세포 사망을 측정하기 위하여, GLuc 또는 NLuc의 외소적 세포질 발현에 기초한 새로운 검정법이 국제특허출원 PCT/US17/52344 "A Non-Radioactive Cytotoxicity Assay"에 기술된 바와 같이 사용되었다. 이 방법은 표적 세포에서 리포터의 발현이 건강한 세포에서 선호적으로 보유되지만 죽거나 죽어가는 세포로부터 방출되거나 죽거나 죽어가는 세포에서 이의 활성이 선호적으로 측정되는 방식으로 관여한다. 이러한 검정법을 위한 바람직한 리포터는 1) Gaussia princeps, Pleuromamma abdominalis, Metridia pacifica, Metridia curticauda, Metridia asymmetrica, Metridia okhotensis, Metridia longa, Lucicutia ovaliformis, Heterorhabdus tanneri 및 Pleuromamma scutullata와 같은 요각류로부터의 비-분성 형태의 루시퍼라제; 2) NanoLuc과 같은 심해 새우로부터의 조작된 루시퍼라제 리포터이다. 이러한 여러 리포터 벡터의 서열은 서열번호 881 내지 서열번호 887에 제공되어 있다. 상기 벡터는 레트로바이러스 및 렌티바이러스를 생성하는데 사용되었고, 이는 다시 적절한 항생제로의 선별 이후에 GLuc, NLuc, TurboLuc 또는 MLuc7을 안정적으로 발현하는 어려 표적 세포주의 다중틀론 집단을 생성하는데 사용되었다. 달리 지시되지 않는한, 상이한 루시퍼라제 (GLuc, Nluc, MLuc7 또는 TurboLuc16)를 안정적으로 발현하는 표적 세포가 표적 세포를 성장시키는데 사용된 배지를 넣은 384 웰 플레이트에 세 벌씩 도말되었다. 현탁액에서 성장으로 표적 세포는 일반적으로 웰 당 2 내지 3 × 104개의 농도로 도말되는 한편, 부착성 단일층으로 성장하는 표적 세포는 웰 당 1 내지 2 × 104개의 농도로 도말되었다. 달리 지시되지 않는 한, 표적 세포는 유전적으로 변형된 T 세포 (예로, SIR 또는 CAR 발현하는 세포)와 함께 1 : 1 내지 10 : 1 범위로 변화하는 효과기: 표적 (E:T) 비율로 1 내지 96시간 동안 공동배양되었다. 표적 세포가 부착성 세포 (예로, HeLa 세포)로서 성장하는 경우에, 이들은 T 세포가 첨가되기 이전에 웰 바닥에 밤샘 동안 부착되도록 허용된다. T 세포 매개된 표적 세포의 용해 유도가 미가공 실렌터라진 (Nanaolight)을 포함하는 0.5× CTZ 검정 완충액을 직접적으로 주사함으로써 BioTek 시너지 플레이트 리더에 의해 측정된 바와 같이 루시퍼라제 활성의 증가로 검정되었다.
CTZ 검정법
미가공 실렌터라진 (CTZ; Nanolight, 카탈로그 # 303)의 100× 스톡 용액이 시간에 따른 CTZ의 산화를 피하도록 30 μL의 6 N HCl이 보충된 1.1 mL의 100% 메탄올에 1 mg의 동결건조된 CT 파우더를 용해함으로써 제조되었다. CTZ 검정 완충액을 제조하기 위하여, CTZ의 100× 스톡 용액이 PBS에서 0.5× 농도로 희석되었다. 달리 지시되지 않는 한, 대략 50 내지 60 μL 부피의 배지에서 비-분비 형태의 루시퍼라제를 발현하는 세포를 포함하는 384 웰 흰색 플레이트 (Greiner, 384 웰 흰색 플레이트 카탈로그 번호 #781075)의 각각의 웰에 총 부피 15 μL의 CTZ 검정 완충액 (상기에 제조된 바와 같음)이 첨가되었고, 플레이트가 BioTek 시너지 H4 플레이트 리더를 사용하여 종결 모드로 루시퍼라제에 대해 판독되었다. 96 웰 플레이트의 경우에, 세포가 200 μL의 배지에 도말되었고, 대략 50 μL의 0.5× CTZ 검정 완충액이 첨가되었다. 달리 지시되지 않는 한, 0.5× CTZ 검정 완충액이 GLuc, TurboLuc16 및 MLuc7의 활성을 검정하는데 사용되었다. CTZ 검정 완충액 (0.125× 농도로 희석됨)이 일부 실험에서 NLuc 활성의 측정에도 역시 사용되었다 (하기 참조). 일반적으로, 달리 지시되지 않는 한, 첨가된 0.5× CTZ 검정 완충액의 부피는 검정법이 0.5× CTZ 검정 완충액이 1 : 1 부피로 세포를 포함한 배지에 첨가될 때 작동하더라도, 세포를 포함한 웰에서 대략 액체 부피의 1/4이었다. 배지만을 포함한 웰 (Med) 및 표적 세포가 임의의 SIR 구조물로 감염되지 않은 T 세포와 배양된 웰 (T-UI)에서 GLuc 활성이 표시된 곳에서 대조군으로서 사용되었다.
플레이트는 세포 용해 이전에 BioTek 시너지 H4 플레이트 리더를 사용하여 종결 모드로 루시퍼라제에 대해 판독되었다. 일부 실험에서, NLuc 활성이 CTZ 완충 완충액을 사용하여 측정되었지만, 여기서 완충액은 0.125×의 최종 농도로 희석되었다. CTZ 검정 완충액이 NLuc 활성의 측정에 사용될 때, 대략 50 내지 60 μL 부피의 배지에서 세포를 포함하는 384 웰 흰색 플레이트 (Greiner, 384 웰 흰색 플레이트 카탈로그 번호 #781075)의 각각의 웰에 총 부피 15 μL (달리 지시되지 않는 한)의 0.125× CTZ 검정 완충액이 첨가되었고, 플레이트가 BioTek 시너지 H4 플레이트 리더를 사용하여 종결 모드로 루시퍼라제에 대해 판독되었다. 96 웰 플레이트의 경우에, 세포가 200 μL의 배지에 도말되었고, 대략 50 μL의 0.125× CTZ 검정 완충액이 첨가되었다.
CD19 및 MPL (트롬보포이에틴 수용체) 항원의 발현을 검출하는 검정법의 개발
SIR 및 이들의 표적 항원의 발현을 검출하기 위하여, 루시퍼라제 기반의 리포터 검정법이 국제특허출원 PCT/US2017/025602 "A Highly Sensitive and Specific Luciferase Based Reporter Assay For Antigen Detection"에 기술된 바와 같이 사용되었다. CD19 및 MPL (트롬보포이에틴 수용체 또는 TPO-R로도 알려짐) 둘 다는 조혈 세포 상에서 발현되지만 상이한 계열의 세포에서 차별적인 발현을 보여준다. FMC63는 잘 특성화된 인간 CD19를 특이적으로 인식하는 마우스 단일클론 항체이다. 유사하게, 161은 인간 MPL을 인식하는 단일클론 항체이다. 본 발명자는 FMC63 vL 및 vH 단편의 기지의 서열에 기초하여 FMC63 단일 사슬 Fv (scFv) 단편을 생성하였다. FMC63 scFv 단편을 인코딩하는 cDNA는 5'부터 3'말단까지 인간 CD8 분자로부터 유래한 신호 펩티드, FMC63 vL 단편, (Gly4Ser)×3 링커 및 FMC63-vH 단편을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열로 구성되었다. 다음으로 FMC63 scFv 단편을 인코딩하는 cDNA는 Gly-Gly-Ser-Gly 링커를 통하여 AcV5-태그화 NLuc를 인코딩하는 cDNA와 이의 3' 말단에서 프레임에 맞추어 융합되어 FMC63-GGSG-NLuc를 생성하였고, 이는 다음으로 인간 EF1α 프로모터의 하류에 렌티바이러스성 벡터 pLenti-EF1 내로 클로닝되어 구조물 Plenti-EF1a-FMC63(vL-vH)-GGSG-NLuc-AcV5-U09 (서열번호 880)을 제작하였다. 삽입물 단편의 서열은 서열번호 4516에 제공되어 있다. 161-GGSG-NLuc를 인코딩하는 구조물은 유사하게 MPL에 대한 161 단일클론 항체의 vL 및 vH 단편을 사용하여 생성되었다. 삽입물 단편의 핵산 서열은 서열번호 4517에 제공되어 있다. pLenti-EF1-FMC63-GGSG-NLuc-AcV5 및 pLenti-EF1-161-GGSG-NLuc-AcV5 플라스미드는 칼슘 포스페이트 공동침전법에 의해 293FT 세포 내로 형질감염되었다. 형질감염 후 대략 20시간째, 세포 배양 배지가 XVIVO 배지로 교체되었다. 분비된 FMC63-GGSG-NLuc-AcV5 및 161-GGSG-NLuc-AcV5 단백질을 포함한 적응용 배지가 48 내지 72시간 이후에 수집되었다.
FMC63-GGSG-NLuc-AcV5 및 161-GGSG-NLuc-AcV5 단백질을 포함하는 상청액이 인간 c-MPL cDNA를 발현하는 렌티바이러스성 벡터 또는 빈 벡터로 이들 세포를 형질도입함으로써 c-MPL cDNA를 발현하도록 조작되었던 Jurkat, K562, RAJI, RS-4-11 (RS411) 및 HEL.92.1.7 (HEL) 세포의 표면 상에서 CD19 및 MPL의 발현을 검출하는데 사용되었다. 이들 세포가 이의 신호 펩티드가 결여된 인간화 GLuc cDNA도 역시 발현하였다. 벡터- 및 MPL-발현하는 Jurkat-GLuc, K562-GLuc, HEL.92.1.7-GLuc, RAJI-GLuc 및 RS411-GLuc 세포는 FMC63-GGSG-NLuc-AcV5 및 161-GGSG-NLuc-AcV5 상청액과 함께 4℃에서 1시간 동안 배양되었고, 이후 0.1% BSA가 보충된 차가운 PBS로 철저한 세척이 이어졌다. 세포는 차가운 PBS에서 재현탁되었고, 웰 당 30 μL의 세포 현탁액이 편평바닥 384 웰 플레이트 (Greiner, 384 웰 흰색 플레이트, 카탈로그 번호 #781075)에 세 벌씩 도말되었다. 미가공 실렌터라진 (CTZ)을 NLuc 기질로서 포함하는 NLuc 검정 완충액 (PBS에 희석된 미가공 실렌터라진 30 μL/웰)이 BioTek 시너지 H4 플레이트 리더를 사용하여 웰 모드로 자동 분배기에 의해 각각의 웰에 첨가되었고, NLuc 활성의 척도로서 광 방출이 측정되었다. 강한 결합이 HEL.92.1.7-GLuc-벡터 세포 상에서 161-GGSG-NLuc-AcV5로 관찰되었고, 내재적으로 유의한 MPL 발현을 제시한다. HEL.92.1.7-GLuc-MPL 세포에서 MPL의 외소적 발현은 161-GGSG-NLuc-AcV5 결합의 적당한 증가를 유도하였다. 대조적으로, 161-GGSG-NLuc-AcV5와의 매우 약한 결합이 벡터-발현하는 Jurkat, RAJI 및 RS411 세포 상에서 관찰되었고, 단지 MPL의 외소적 발현 시에만 적당하게 증가되었다. 161-GGSG-NLuc-AcV5의 결합은 K562-벡터 세포 상에서 관찰되었고, K562-MPL 세포 상에서 유의하게 증가되었다. 161-GGSG-NLuc-AcV5와는 대조적으로, FMC63-GGSG-NLuc-AcV5 상청액은 벡터- 및 MPL-발현하는 RAJI 세포 상에서 가장 강한 결합, RS411 세포 상에서 적당히 강한 결합 및 다른 세포 상에서 매우 약한 내지 무시할만한 결합을 보여주었다.
CD19 및 MPL (트롬보포이에틴 수용체) 표적하는 키메라 항원 수용체 (CAR) 및 키메라 TCR (SIR)의 이들의 수용체에 대한 결합 치환도의 정량적 측정을 위한 검정법의 개발
입양 세포 요법의 분야에서 빈번한 문제점은 키메라 항원 수용체 및 SIR을 발현하는 세포를 검출할 수 있는 민감하고 특이적인 검정법이 부족한 것이다. 프로테인-L로의 염색이 CAR 및 SIR을 포함하는 scFv의 세포 표면 발현을 검출하는데 사용될 수 있지만, 이것이 이들의 표적 항원과 CAR 및 SIR의 상호작용을 측정하지 못한다. CD19 및 MPL을 표적하는 CAR의 결합 친화도를 검출하기 위하여, 본원에 이의 전문이 참고문헌으로 통합되는 국제특허출원 PCT/US2017/025602에 기술된 바와 같은 매우 민감한 루시퍼라제 기반의 항원 검출 검정법이 사용되었다. 이들의 신호 펩티드를 포함하여 인간 CD19 및 인간 MPL의 세포외 도메인은 Gly-Gly-Ser-Gly 링커, NLuc (분비 신호가 없음) 및 AcV5 에피토프 태그를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열과 프레임에 맞추어 융합되었다. CD19 구조물의 경우에, 플래그 태그가 신호 펩티드 및 세포외 도메인의 시작점 사이에 삽입되었다. 전체 카세트가 인간 EF1α 프로모터의 하류에서 렌티바이러스성 벡터 pLenti-EF1 내로 클로닝되어 구조물 pLenti-EF1-CD19-GGSG-NLuc-AcV5 및 pLenti-EF1-MPL-GGSG-NLuc-AcV5를 각각 제작하였다. 구조물이 칼슘 포스페이트 공동침전법에 의해 293FT 세포 내로 형질감염되었다. 형질감염 후 대략 20시간째, 세포 배양 배지가 신선한 배지로 교체되었다. 분비된 플래그-CD19-GGSG-NLuc-AcV5 및 MPL-GGSG-NLuc-AcV5 단백질을 포함하는 적응용 배지가 48 내지 72시간 이후에 수집되었다.
293FT-세포가 CD19 (FMC63-BBZ-PAC; 서열번호 4501), MPL (161-BBZ-PAC-R07; 서열번호 4502 또는 161-28Z-PAC-Z07)을 표적하는 키메라 항원 수용체를 발현하는 렌티바이러스성 구조물로 칼슘 포스페이트 공동감염법을 사용하여 일시적으로 형질감염시키거나 (24 웰 프레이트에서 500 μL 부피), 감염시키지 않고 두었다. 다음날 아침 형질감염 후 18시간째, 세포가 상하 피페팅으로 1.5 mL 튜브에 수집되었다. 튜브가 1500 rpm에서 5분 동안 회전되었다. 다음으로 세포가 세척 완충액 (PBS에서 1% FBS)으로 한 번 세척되었고, 이후 100 μL의 지시된 분비 형태의 GGS NLuc 상청액과의 배양이 이어졌다. 세포는 4℃에서 1시간 동안 배양되었다.
배양 이후에, 세포가 세척 완충액 (1 mL 각각의 세척 시)으로 5번 세척되었다. 마지막으로, 펠렛이 200 μL 세척 완충액으로 재현탁되었다. 재현탁된 세포가 384 웰 플레이트에 세 벌 (각각 25 μL) 배치되었다. 루시퍼라제 활성은 각각의 웰에 미가공 실렌터라진을 포함한 NLuc 검정 완충액 (Promega)(각각의 웰에 25 μL)의 직접적 첨가 이후에 (한 번에 하나씩) BioTek 시너지 H4 플레이트 리더를 사용하여 측정되었다.
도 9a 및 9b에 나타낸 바와 같이, CD19 (FMC63-BBZ-PAC)-CAR를 발현하는 293FT 세포는 Nluc 검정법에 의해 측정된 바와 같이 플래그-CD19-GGSG-NLuc-AcV5에 대한 강한 결합을 보여주었던 반면, 매우 약한 결합이 감염되지 않은 T 세포 (UI) 또는 대조군 161-BBZ-PAC CAR를 발현하는 세포에서 관찰되었다. 유사하게, 161-CD28Z-PAC CAR를 발현하는 293FT 세포는 형질감염되지 않은 293FT 세포 또는 FMC63-BBZ-PAC CAR로 형질감염된 세포와 비교하여 MPL-GGSG-NLuc-AcV5 상청액과 강한 결합을 보여주었다. 결과는 GGSG-NLuc 검정법 (또는 NLuc 결합 검정법)이 세포 표면 발현된 키메라 수용체의 이들의 항원 표적에 대한 결합을 민감하고 정량적인 방식으로 측정하는 능력을 보여준다. CAR 및 SIR의 상이한 잠재적인 표적의 세포외 도메인을 포함하는 다수의 기타 NLuc 융합 단백질이 제작되었고, 이들의 상응하는 CAR를 발현하는 293T 또는 T 세포를 사용하여 입증되었다. 이들 구조물의 명칭, DNA 및 아미노산 서열번호는 표 7I에 제공되어 있다. 유사한 구조물이 CAR/SIR의 표적인 이들의 세포외 도메인을 짧은 가요성 링커를 통해 LNuc에 융합함으로써 SIR의 다른 항원 표적에 대해 생성될 수 있다. CD20은 두 개의 세포외 루프를 갖는 제 Ⅲ형 막 단백질이다. CD20-ECx2-ECD-GGSG-TurboLuc16-4xFlag-2xStreptag-8xHis-T2A-Pac (060816-I04) 융합 구조물이 성공적으로 생성되었고, CD20 CAR 발현하는 세포에 대해 입증되었다. 이러한 구조물의 아미노산 서열은 서열번호 12374에 예시되어 있다. 따라서, CAR 또는 SIR의 임의의 단백질 항원 표적을 사용하여 NLuc (또는 TurboLuc16)-융합 단백질을 생성하는 것이 가능하고, 이는 CAR/SIR 발현하는 세포의 발현 및 결합 친화도를 검출하는데 사용될 수 있다.
프로테인 L은 카파 경쇄에 결합하는 것으로 알려져 있다. CAR 및 SIR을 포함하는 카파 경쇄의 발현을 검출하기 위하여, CD8 신호 펩티드의 하류 영역을 코딩하는 N-말단 프로테인 L을 포함하는 두 개의 NLuc 융합 구조물이 제작되었다. 두 개의 구조물은 구조물 CD8SP-단백질-L-2-GGSG-NLuc-4x플래그-x2STREP-8xHis-T2A-PAC(101916-P03)[서열번호 12382]이 프로테인 L 코딩 영역에서 단일 아미노산이 결여된 점을 제외하고는 동일하고, 이는 구조물 CD8SP-단백질-L-GGSG-NLuc-4x플래그-x2STREP-8xHis-T2A-PAC(112316-Q02)[서열번호12381]에 존재한다. 융합 단백질을 포함하는 적응용 상청액이 293FT 세포에서 구조물의 형질감염에 의해 생성되었고, 카파 경쇄가 프로테인 L에 결합하는 CAR 구조물을 포함하는 CAR 구조물에 결합하는 것으로 관찰되었다. CD19-ECD-GGSG-NLuc-AcV5와 같은 항원-NLuc 융합 단백질은 CAR 또는 SIR의 항원 결합 도메인에 결합하고, 따라서 CAR- 또는 SIR-발현하는 면역 효과기 세포의 결합 친화도를 측정하는데 사용될 수 있다. 대조적으로, 프로테인 L-GGSG-NLuc 융합 단백질은 CAR 또는 SIR의 카파 경쇄 성분에 결합한다. 이와 같이, 이들 시약의 주요 용도는 CAR 또는 SIR의 발현을 검출하기 위한 것이고, 이들은 CAR 또는 SIR의 이들의 표적 항원에 대한 결합 친화도를 측정하는데 사용될 수 있다.
MPL CAR를 발현하는 T 세포는 MPL-GGSG-NLuc 융합 단백질에 결합할 수 있다.
상이한 MPL CAR 구조물 또는 대조군 CAR (4C3)을 발현하는 Jurkat T 세포가 MPL-GGSG-NLuc-AcV5 및 CD19-GGSG-NLuc-AcV5 상청액과 함께 배양되었고, 철저한 세척 이후에, 필수적으로 선행 실시예에 기술된 바와 같이 NLuc 활성에 대해 검정되었다. 결과는 도 10에 제시되어 있고, 상이한 MPL CAR 구조물을 발현하는 Jurkat T 세포는 MPL-GGSG-NLuc-AcV5 융합 단백질에 대한 상이한 결합 수준을 보여준다. 이러한 차이는 상이한 구조물의 발현 수준에서의 차이 또는 이들의 개별적 scFv 단편의 MPL 또는 둘 다에 대한 결합 친화도의 차이를 반영할 수 있다.
일차 인간 T 세포 상의 SIR 발현 및 NLuc 검정법에 의한 이들의 검출
CD3 자성 비드를 사용하여 단리된 인간 말초 혈액 T 세포가 CD19 표적하는 표시된 SIR 구조물을 발현하는 렌티바이러스로 감염되었다. MPL (161-SIR-U01)을 표적하는 SIR을 인코딩하는 렌티바이러스 벡터는 음성 대조군으로서 사용되었다. 감염 이후에, 세포가 10 ng/mL 용해성 항-CD3, 10 ng/mL 용해성 항-CD28 및 100 IU 재조합 인간-IL2을 포함하는 XVIVO 배지에서 증식되었고, 달리 지시되지 않는 한 퓨로마이신으로 선별되었다. 상이한 SIR 구조물을 발현하는 T 세포는 CD19-GGSG-NLuc-AcV5 상청액과 함께 배양되었고, 철저한 세척 이후에, 필수적으로 선행 실시예에 기술된 바와 같이 NLuc 활성에 대해 검정되었다. 데이타가 상이한 SIR 구조물을 발현하는 T 세포에 CD19-GGSG-NLuc-AcV5의 결합을 보여준다. 야생형 인간 TCRα 및 인간 TCRβ2 뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩된 TCRα 및 TCRβ 불변 영역을 포함하는, CD8SP-FMC63-vL-V5-[hTCRb-WT]-F-P2A-SP-FMC63-vH-Myc-[hTCRa-WT]-F-F2A-PAC (080815-F02)[서열번호 922]를 발현하는 T 세포는 음성 대조군 SIR 161-SIR-U01 (NLuc 평균값 = 1580)과 비교하여, CD19-GGSG-NLuc-AcV5 (NLuc 평균값 = 1190)에 대한 임의의 유의한 결합을 보여주지 않았다. 대조적으로, 코돈 최적화된 마우스 TCRα 및 인간 TCRβ2 뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩된 TCRα 및 TCRβ 불변 영역을 포함하는, CD8SP-FMC63-vL-V5-[mTCRb-opt]-F-P2A-SP-FMC63-vH-Myc-[mTCRa-opt]-F-F2A-PAC (080815-B06)[서열번호 953]을 발현하는 T 세포는 CD19-GGSG-NLuc-AcV5 (NLuc 평균값 = 5359)에 대한 유의한 결합을 보여준다. CD8SP-FMC63-vL-V5-[TCRb-S57C-opt1]-F-P2A-SP-FMC63-vH-Myc-[TCRa-T48C-opt1]-F-F2A-PAC (050515-L05)[서열번호 900]을 발현하는 T 세포는 CD19-GGSG-NLuc-AcV5 (NLuc 평균값 = 19178)에 대한 견고한 결합을 보여준다. 이러한 구조물은 코돈 최적화된 인간 TCRα 및 TCRβ2 뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩된 TCRα 및 TCRβ 불변 사슬을 포함하고, TCRβ 불변 사슬에서 S57C 돌연변이 및 TCRα 사슬에서 T48C 돌연변이를 보유한다. CD8SP-FMC63-vL-V5-[TCRb-S57C-opt1]-F-P2A-SP-FMC63-vH-Myc-[TCRa-T48C-opt1]-F-F2A-PAC (050515-L05)[서열번호 900] SIR 구조물은 또한 FMC63-vL 영역 및 TCRβ 사슬 사이에 V5 에피토프 태그 및 FMC63-vH 영역 및 TCRα 사슬 사이에 Myc 태그를 보유한다. CD8SP-CD19Bu12-vL-V5-[TCRb-S57C-opt1]-F-P2A-SP-CD19Bu12-vH-Myc-[TCRa-T48C-opt1]-F-F2A-PAC (070215-M03)[서열번호 1021] SIR를 발현하는 T 세포는 CD19-GGSG-NLuc-AcV5 (NLuc 평균값 = 39575)에 대한 더 강한 결합을 보여준다. 이러한 구조물은 인간 CD19에 대한 인간화 단일클론 항체인 hCD19-Bu12 항체로부터 유래된 vL 및 vH 단편를 갖는 점을 제외하고 FMC63-based 050515-L05 구조물과 닯아 있다. CD8SP-FMC63-vL-V5-[hTCRb-KACIAH]-F-P2A-SP-FMC63-vH-Myc-[hTCRa-CSDVP]-F-F2A-PAC (081415-D06)[서열번호 992]를 발현하는 T 세포는 CD19-GGSG-NLuc-AcV5 (NLuc 평균값 =107077)에 대한 가장 강한 결합을 보여준다. 이러한 구조물은 코돈 최적화된 인간 TCRα 및 TCRβ2 뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩된 TCRα (TCRa) 및 TCRβ (TCRb) 불변 사슬을 포함하고, TCRβ 불변 사슬에서의 S57C 돌연변이 및 TCRα 사슬에서의 T48C 돌연변이를 보유한다. FMC63-SIR-D06 구조물은 또한 FMC63-vL 영역 및 TCRβ 사슬 사이에 V5 에피토프 태그 및 FMC63-vH 영역 및 TCRα 사슬 사이에 Myc 태그를 보유한다. 따라서, 인간 TCR-b 불변 영역의 5개 아미노산이 상응하는 마우스 아미노산으로 대체되었다. 이들 마우스 아미노산은 K-18, A-22, I-133, A-136 및 H-139이었다. 또한 4개의 아미노산 세린 (S-90), 아스파라긴산 (D-91), 발린 (V-92) 및 프롤린 (P-93)을 포함하는 마우스 TCRa 불변 사슬의 영역이 인간 TCRa 불변 사슬로 대체되었다.
CD8SP-V5-[hTCRb-KACIAH]-F-P2A-CD8SP-FMC63-vL-Gly-Ser-링커-FMC63-vH-Myc-[hTCRa-CSDVP]-F-F2A-PAC (082815-G07)[서열번호 1620] 및 CD8SP-V5-[hTCRb-KACIAH]-F-P2A-CD8SP-CD19Bu12-vL-Gly-Ser-링커-CD19Bu12-vH-Myc-[hTCRa-CSDVP]-F-F2A-PAC (082815-E05)[서열번호 1622] SIR 구조물은 또한 CD19-GGSG-NLuc-AcV5 (NLuc 평균값 = 각각 29262 및 4671.5)에 대한 유의한 결합을 보여주었다. 082815-G07 구조물에서, FMC63-scFv 단편 [예로, FMC63(vL + vH)]이 TCRa-CSDVP 단편에 융합된 한편, TCRb-KACIAH 불변 영역 단편은 임의의 항원 결합 모이어티 없이 발현된다. 082815-E05 구조물은 CD19-Bu12 scFv 단편이 082815-G07 구조물에 존재하는 FMC63-scFv을 대체하는 점을 제외하고는 082815-G07 구조물과 유사하다.
종합적으로, 이들 결과는 야생형 뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩된 TCRα 및 TCRβ를 포함하는 SIR이 CD19에 대한 유의한 결합을 보여주지 못하였고, 이는 아마도 인간 일차 T 세포에서 이 구조물의 빈약한 발현으로 인할 것이다. 대조적으로, 사슬간 디설파이드 결합을 촉진하도록 추가적인 시스테인 잔기를 보유하는 코돈 최적화된 인간 TCRa/b 사슬을 포함하는 SIR은 효과적인 CD19 결합 및 기능적 발현을 보여준다. 인간 TCRα/β 불변 사슬의 마우스화가 (081415-D06)[서열번호 992] SIR에서 관찰된 바와 같이, CD19 결합의 추가의 증가를 유도한다. 또한, (082815-G07)[서열번호1620] 및 (082815-E05)[서열번호1622] 구조물에서 관찰된 바와 같이, scFv 단편은 TCRb 불변 영역과 공동 발현되면, TCRb가 임의의 항원 결합 모이어티를 보유하지 않더라고 YCRa 불변 영역에 융합된 것으로서 기능적으로 발현된다 (도 11 참조). 대안적으로, 이러한 구조물에서의 TCRb 사슬은 scFv 단편에 존재하는 vL 및 vH 사슬의 기능적 조립을 방해하지 않는 한 부적절한 vL 또는 vH 사슬을 발현할 수 있다.
Jurkat-NFAT-Luc 세포는 다양한 구조물 (서열번호 922, 953, 900, 992, 1110 및 1021)로 안정적으로 형질되어, 퓨로마이신으로 선별되었다. 세포는 CD19-GGSG-NLuc-AcV5 상청액과 함께 배양되었고, 철저한 세척 이후에 필수적으로 이전에 기술된 바와 같이 NLuc 활성에 대해 검정되었다. 모체 Jurkat 및 상이한 구조물을 발현하는 세포의 NLuc 값은 각각 996, 3606, 12128, 37216, 503043, 101958 및 128996이었다. 실험은 야생형 뉴클레오티드 서열을 갖는 TCRa/b 불변 사슬을 포함하는 CD8SP-FMC63-vL-V5-[hTCRb-WT]-F-P2A-SP-FMC63-vH-Myc-[hTCRa-WT]-F-F2A-PAC (080815-F02)[서열번호 922] 구조물을 발현하는 Jurkat의 CD19-GGSG-NLuc AcV5 상청액에 대한 유의한 결합을 전혀 보여주지 않은 한편, 코돈 최적화된 뉴클레오티드 서열을 갖는 TCRa/b 불변 사슬을 포함하고/거나 사슬 쌍 형성 및 발현을 증진하도록 특이적 아미노산 치환을 보유하는 다른 구조물과는 다양한 결합 수준을 보여준다. 특히, 서열번호 900 및 992을 갖는 구조물은 CD19-GGSG-NLuc 결합에서 각각 10배 및 15배 이상의 증가를 보여주었다.
Jurkat-NFAT-Luc 세포는 상이한 SIR 구조물로 안정적으로 형질되어, 퓨로마이신으로 선별되었다. 세포는 CD19-GGSG-NLuc-AcV5 상청액과 함께 배양되었고, 철저한 세척 이후에 필수적으로 이전에 기술된 바와 같이 NLuc 활성에 대해 검정되었다. 상이한 SIR 구조물은 CD19-GGSG-NLuc-AcV5 융합 단백질에 대한 다양한 결합 수준을 보여준다. 특히 TCR-감마 및 TCR-델타로부터 유래된 TCR 불변 사슬을 포함하는 구조물 CD8SP-FMC63-vL-V5-[hTCRg-opt]-F-P2A-SP-FMC63-vH-Myc-[hTCRd-opt]-F-F2A-PAC (091015-A06)[서열번호 949]이 또한 CD19-GGSG-NLuc-AcV5 융합 단백질에 대한 결합을 보여주었다. 모체 Jurkat 및 서열번호 1620, 1623, 1622, 926, 949, 1112를 갖는 구조물을 발현하는 세포의 NLuc 값은 각각 1515, 27594, 6357, 10254, 693, 2176 및 179이었다. 따라서 서열번호 926을 갖는 구조물이 용해성 CD19에 대한 가장 낮은 결합을 보여주었다.
Jurkat-NFAT-Luc 세포는 표시된 구조물로 안정적으로 형질되어, 퓨로마이신으로 선별되었다. 세포는 CD19-GGSG-NLuc-AcV5 상청액과 함께 배양되었고, 철저한 세척 이후에 필수적으로 이전에 기술된 바와 같이 NLuc 활성에 대해 검정되었다. 상이한 SIR 구조물은 CD19-GGSG-NLuc-AcV5 융합 단백질에 대한 다양한 결합 수준을 보여주었다.
CD19 SIR을 발현하는 T 세포가 CD19 발현하는 RAJI 림프종 세포에서 세포독성을 유도한다.
CD3 자성 비드를 사용하여 단리된 인간 말초 혈액 T 세포가 CD19 표적하는 표시된 SIR 구조물을 발현하는 렌티바이러스로 감염되었다. 세포가 퓨로마이신으로 선별되어 증식되었다. 안정적으로 hGLuc를 세포내 발현하는 RAJI 세포가 SIR을 발현하는 T 세포와 함께 10 : 1의 효과기 : 표적 (E:T) 비율로 4시간 동안 공동배양되었다. SIR-T 세포 매개된 표적 세포의 용해 유도가 미가공 실렌터라진 (Nanaolight)을 포함하는 0.5× CTZ 검정 완충액을 직접적으로 주사함으로써 BioTek 시너지 플레이트 리더에 의해 측정된 바와 같이 루시퍼라제 활성의 증가로 검정되었다. 데이타는 MPL 표적하는 대조군 SIR CD8SP-MPL-161-vL-V5-[hTCRb-S57C-opt1]-F-P2A-MPL-161-vH-Myc-[hTCRa-T48C-opt1]-F-F2A-PAC (040315-U02)[서열번호 1112]를 발현하는 T 세포와 비교하여, 표적 세포의 용해를 나타내는 GLuc 활성의 증가를 CD19-특이적 SIR CD8SP-FMC63-vL-V5-[TCRb-S57C-opt1]-F-P2A-SP-FMC63-vH-Myc-[TCRa-T48C-opt1]-F-F2A-PAC (050515-L05)[서열번호 900] 및 CD8SP-CD19Bu12-vL-V5-[TCRb-S57C-opt1]-F-P2A-SP-CD19Bu12-vH-Myc-[TCRa-T48C-opt1]-F-F2A-PAC (070215-M03)[서열번호 1021]를 발현하는 T 세포와의 공동배양 이후에 입증하였다. 디지토닌으로의 처리가 최대의 세포 사망을 보여주는데 사용되었다. 구조물 (040315-U02)[서열번호 1112], (050515-L05)[서열번호 900], (070215-M03)[서열번호 1021]을 발현하는 T 세포에 노출되고, 디지토닌 처리 이후에 RAJI 세포의 GLuc 평균값은 각각 119, 3042, 2547 및 3869이었다.
CD19 SIR을 발현하는 T 세포가 CD19 발현하는 RAJI 림프종에서 세포독성을 유도한다.
CD3 자성 비드를 사용하여 단리된 인간 말초 혈액 T 세포가 CD19 표적하는 표시된 SIR 구조물을 발현하는 렌티바이러스로 감염시키거나, 감염시키지 않고 두었다 (T-UI). 세포가 퓨로마이신으로 선별되어 증식되었다. 안정적으로 hGLuc를 세포내 발현하는 RAJI 세포가 SIR을 발현하는 T 세포와 함께 10 : 1의 효과기 : 표적 (E:T) 비율로 4시간 동안 공동배양되었다. SIR-T 세포 매개된 표적 세포의 용해 유도가 미가공 실렌터라진 (Nanaolight)을 포함하는 0.5× CTZ 검정 완충액을 직접적으로 주사함으로써 BioTek 시너지 플레이트 리더에 의해 측정된 바와 같이 루시퍼라제 활성의 증가로 검정되었다. 배지 단독 (Med)을 포함하는 웰에서 및 표적 세포가 임의의 SIR로 감염되지 않은 T 세포와 함께 배양되는 웰에서의 GLuc 활성은 이 실험 및 후속 실험의 표시되는 곳에서 대조군으로서 사용되었다. 데이타는 MPL 표적하는 대조군 SIR CD8SP-MPL-161-vL-V5-[hTCRb-S57C-opt1]-F-P2A-MPL-161-vH-Myc-[hTCRa-T48C-opt1]-F-F2A-PAC (040315-U02)[서열번호 1112]을 발현하는 T 세포 또는 감염되지 않은 T 세포 (T-UI)와 비교하여, 표적 세포의 용해를 나타내는 GLuc 활성의 증가를 CD19-특이적 SIR CD8SP-FMC63-vL-V5-[TCRb-S57C-opt1]-F-P2A-SP-FMC63-vH-Myc-[TCRa-T48C-opt1]-F-F2A-PAC (050515-L05)[서열번호 900], CD8SP-FMC63-vL-V5-[hTCRb-WT]-F-P2A-SP-FMC63-vH-Myc-[preTCRa-Del48]-F-F2A-PAC (091015-Y08) [서열번호 926] 및 CD8SP-FMC63-vL-V5-[hTCRb-KACIAH]-F-P2A-SP-FMC63-vH-Myc-[hTCRa-CSDVP]-F-F2A-PAC (081415-D06)[서열번호 992]를 발현하는 T 세포와의 공동배양 이후에 보여주었다. 디지토닌으로의 처리가 최대의 세포 사망을 보여주는데 사용되었다. (091015-Y08)[서열번호 926] 구조물로의 결과는 preTCRα-del48 불변 사슬 단편이 TCRβ의 불변 사슬과 공동배양될 때 기능적 이중 사슬 SIR의 제조 시 TCRα 불변 사슬 영역을 치환할 수 있는 점을 보여준다. Med가 배지 단독을 가르키는 한편 T-UI는 임의의 SIR 구조물로 감염되지 않은 T 세포를 가리키는 점을 주목한다.
항원 결합 도메인이 TCR 불변 사슬 중 하나에 연결되고, 상보적 TCR 사슬이 결여된 CD19 단일 사슬 SIR을 발현하는 T 세포는 CD19 발현하는 RAJI 림프종에서 유의한 세포독성을 유도하지 못한다.
인간 CD19 항원에게로 유도된 CD19Bu12 및 FMC63 단일클론 항체로부터 유래된 scFv 단편이 TCRb의 불변 사슬에 융합되고, 상보적 TCRa 사슬이 발현되지 않는 SIR 구조물이 생성되었다. 구조물 CD8SP-CD19Bu12-vL-Gly-Ser-링커-CD19Bu12-vH-V5-[hTCRb-WT]-F-P2A-PAC (051216-D08)[서열번호 1022]에서, CD19Bu12의 scFV 단편 (CD19Bu12-vL-Gly-Ser-링커-CD19Bu12-vH으로서 예시됨)이 V5 링커를 통해 야생형 뉴클레오티드 서열을 포함하는 TCRb 불변 사슬에 연결된다. 구조물 CD8SP-FMC63-vL-Gly-Ser-링커-FMC63-vH-V5-[hTCRb-S57C-opt]-F-P2A-PAC (051216-G01)[서열번호 912]에서, FMC63의 scFv 단편 (FMC63-vL-Gly-Ser-링커-FMC63-vH으로서 예시됨)이 이의 코돈 최적화된 뉴클레오티드 서열을 포함하고 V5 링커를 통해 S57C 돌연변이를 보유하는 TCRb 불변 사슬에 연결된다. 구조물 CD8SP-V5-[hTCRb-KACIAH]-F-P2A-CD8SP-FMC63-vL-Gly-Ser-링커-FMC63-vH-Myc-[hTCRa-CSDVP]-F-F2A-PAC (082815-G07)[서열번호 1620]에서 FMC63의 scFV 단편이 이의 코돈 최적화된 뉴클레오티드 서열을 포함하고 Myc 링커를 통해 CSDVP 돌연변이를 보유하는 TCRa 불변 사슬에 연결되고, 이는 이의 코돈 최적화된 뉴클레오티드 서열을 포함하고 V5 링커를 통해 KACIAH 돌연변이를 보유하는 TCRb 불변 사슬과 연결된다. 구조물 CD8SP-FMC63-vL-V5-[hTCRb-KACIAH]-F-P2A-SP-FMC63-vH-Myc-[hTCRa-CSDVP]-F-F2A-PAC (081415-D06)[서열번호 992] 및 CD8SP-FMC63-vL-V5-[hTCRb-KACIAH]-F-P2A-SP-FMC63-vH-Myc-[hTCRa-CSDVP]-F-F2A-K13-FLAG-F-T2A-PAC (051216-K04)[서열번호 918]는 FMC63으로부터 유래된 vL 및 vH 단편이 각각 hTCRb-KACIAH 및 hTCRa-CSDVP 사슬에 부착된 이중 사슬 구조물이다.
상이한 구조물이 T 세포에서 발현되었고, 이전와 같이 RAJI-GLuc 세포를 용해시키는 이들의 능력에 대해 테스트되었다. 데이타는 상보적 TCRa 불변 사슬이 결여된 (051216-D08)[서열번호 1022] 및 (051216-G01)[서열번호 912] SIR을 발현하는 T 세포가 T 세포 (T-UI) 또는 배지를 단독으로 포함하는 웰과 비교하여 RAJI 세포의 용해를 유도하지 못하였던 점을 보여준다. 구조물 (082815-G07)[서열번호 1620], (051216-K04)[서열번호 918] 및 (081415-D06)[서열번호 992]를 발현하는 T 세포에 노출된 RAJI-GLuc 세포는 T-UI 세포에 노출된 세포와 비교하여 GLuc 활성에서 2배 이상 및 4배 이상의 증가를 보여주었다.
항원 결합 도메인이 TCR 불변 사슬 중 하나에 연결되고, 상보적 TCR 사슬이 결여된 CD19 단일 사슬 SIR (SC SIR)을 발현하는 T 세포는 CD19 발현하는 RAJI 림프종에서 유의한 세포독성을 유도하지 못한다.
CD3 자성 비드를 사용하여 단리된 인간 말초 혈액 T 세포가 CD19 표적하는 표시된 SIR 구조물을 발현하는 렌티바이러스로 감염되었다. 세포가 퓨로마이신으로 선별되어 증식되었다. 안정적으로 hGLuc를 발현하는 RAJI 세포가 SIR을 발현하는 T 세포와 함께 10 : 1의 효과기 : 표적 (E:T) 비율로 4시간 동안 공동배양되었다. SIR-T 세포 매개된 표적 세포의 용해 유도가 미가공 실렌터라진 (Nanaolight)을 포함하는 0.5× CTZ 검정 완충액을 직접적으로 주사함으로써 BioTek 시너지 플레이트 리더에 의해 측정된 바와 같이 GLuc 활성의 증가로 검정되었다. 데이타는 항원 결합 도메인이 TCRb 불변 사슬에 연결되고, 상보적 TCRa 불변 사슬이 결여된, SIR 구조물 (051216-D08)[서열번호 1022], (051216-F03)[서열번호 1023] 및 (051216-G01)[서열번호 912] SIR를 발현하는 감염되지 않은 T 세포 (T-UI) 또는 배지를 단독으로 포함하는 웰과 비교하여 RAJI 세포의 용해를 유도하지 못하는 점을 보여준다.
CD19 SIR을 발현하는 T 세포가 CD19 발현하는 RAJI 림프종에서 세포독성을 유도한다.
CD3 자성 비드를 사용하여 단리된 인간 말초 혈액 T 세포가 CD19 표적하는 표시된 SIR 구조물을 발현하는 렌티바이러스로 감염되었다. 구조물 TCRβ2를 표적하는 구조물 (CD8SP-V5-[hTCRb-KACIAH]-F-P2A-CD8SP-TCRB2-CP01-E05-vL-Gly-Ser-링커-TCRB2-CP01-E05-vH-Myc-[hTCRa-CSDVP]-F-F2A-PAC (030816-C05)[서열번호 1781])이 음성 대조군으로서 사용되었다. 세포는 선별하지 않고 두거나 (구조물 022216-A04 및 031416-A18의 경우), 퓨로마이신으로 선별하여 (다른 구조물의 경우) 증식하였다. 세포는 RAJI-GLuc 세포를 용해하는 이들의 능력에 대해 테스트되었다. 결과는 감염되지 않은 T 세포 (T-UI) 또는 배지를 단독으로 포함하는 웰 (Med)과 비교하여 모든 구조물을 포함하는 T 세포에 의해 효과적인 표적 세포 용해를 보여준다. 특히, 효과적인 표적 세포 용해는 CD19Bu12 scFv 단편이 TCRb 불변 사슬에 부착되고, 빈 hTCRa 불변 사슬과 함께 공동발현되는 구조물 (031616-B05)[서열번호 1019], (031616-C05)[서열번호 1020], (021816-N02)[서열번호 1016]에 의해 관찰된다. 효과적인 표적 세포 용해는 또한 CD19MM scFv가 Myc 링커를 통해 hTCRa-CSDVP 불변 사슬에 부착되고, V5 링커를 보유한 빈 hTCRb-KACIAH 불변 사슬과 함께 공동 발현되는 구조물 CD8SP-V5-[hTCRb-KACIAH]-F-P2A-CD8SP-2-CD19MM-vL-Gly-Ser-링커-CD19MM-vH-Myc-[hTCRa-CSDVP]-F-F2A-PAC (031616-A05)[서열번호 1623]에 의해 관찰된다. 효과적인 표적 세포 용해는 또한 CD19Bu12 scFv가 hTCRb-KACIAH 사슬에 부착되고, FMC63-scFv가 hTCRa-CSDVP 사슬에 부착된 구조물 CD8SP-CD19Bu12-scFv-V5-[hTCRb-KACIAH]-F-P2A-SP-FMC63-scFv-Myc-[hTCRa-CSDVP]-F-F2A-PAC (020216-B07)[서열번호 1026]에 의해 관찰되었고, 이로써 두 개의 scFv 단편을 포함하는 기능적 SIR가 제작될 수 있음을 입증한다. 마지막으로, 효과적인 표적 세포 용해는 FMC63으로부터 유래된 vL 및 vH 단편이 hTCRb-KACIAH 및 hTCRa-CSDVP 불변 사슬에 각각 부착된 구조물 CD8SP-FMC63-vL-V5-[hTCRb-KACIAH]-F-P2A-SP-FMC63-vH-Myc-[hTCRa-CSDVP]-F-F2A-K13-FLAG-F-T2A-CNB30 (022216-A04)[서열번호 920] 및 CD8SP-FMC63-vL-V5-[hTCRb-KACIAH]-F-P2A-SP-FMC63vH-MYC-[hTCRa-CSDVP]-F-P2A-CD3z-41BB-T2A-CNB30 (031416-A18)[서열번호 998]에 의해 역시 관찰되었다. 그러나, 이들 구조물은 카포시 육종과 연관된 헤르페스바이러스가 인코딩하는 바이러스성 FLICE 억제성 단백질 (vFLIP) K13 및 융합 단백질 CD3z-41BB을 각각 공동발현한다. K13 단백질이 세포 단백질 NEMO에 결합함으로써 NF-κB 경로를 선택적으로 활성화하는 한편 CD3z-41BB 융합 단백질은 TCR 복합체의 CD3z 사슬에 연결된 보조자극 분자 41BB의 세포질 신호전달 도메인을 포함하는 것으로 알려져 있다. 보조자극 신호를 제공함으로써, K13 및 CD3z-41BB 단백질은 SIR 발현하는 세포의 활성 및 증식을 증진할 것이고, 더 나은 기능성 및 장기간 지속성을 유도한다. 022216-A04 및 031416-A18 구조물은 또한 칼시뉴린 B 사슬의 CNB30 돌연변이체를 발현하고, 이는 FK506 (타크롤리무스)와 같은 칼시뉴린 저해제에 대한 저항성을 부여한다.
CD19 표적하는 이중 사슬 (DC) 및 하나-반 사슬 (OAH) SIR을 발현하는 T 세포가 CD19 발현하는 RAJI 림프종에서 세포독성을 유도한다.
T 세포가 CD19 표적하는 상이한 SIR 구조물을 발현하는 렌티바이러스로 감염되었고 RAJI-GLuc 세포에 대한 세포독성에 대해 테스트되었다. 데이타는 이들의 야생형 뉴클레오티드 서열 (예로, 서열번호 746 및 서열번호 731)에 의해 인코딩된 TCRβ 및 TCRα 불변 사슬을 포함하는 CD8SP-FMC63-vL-V5-[hTCRb-WT]-F-P2A-SP-FMC63-vH-Myc-[hTCRa-WT]-F-F2A-PAC (080815-F02)[서열번호 922] SIR 구조물이, MPL을 표적하는 음성 대조군 구조물 CD8SP-MPL-161-vL-V5-[hTCRb-S57C-opt1]-F-P2A-MPL-161-vH-Myc-[hTCRa-T48C-opt1]-F-F2A-PAC (040315-U02)[서열번호 1112]과 비교하여 유의한 표적 세포 용해를 유발하지 못하는 점을 보여준다. 대조적으로, 다른 모든 SIR 구조물 (예로, (050515-L05)[서열번호 900], (070215-M03)[서열번호 1021], (081415-D06)[서열번호 992], (080815-B06)[서열번호 953], (082815-G07)[서열번호 1620] 및 (082815-E05)[서열번호 1622])은 GLuc 활성 증가를 보여주었고, 표적 세포의 용해를 나타낸다. (082815-G07)[서열번호 1620] 및 (082815-E05)[서열번호 1622] 구조물은 빈 hTCRb-KACIAH (서열번호 748) 불변 사슬을 FMC63 및 CD19Bu12 scFV 단편이 각각 융합된 hTCRa-CSDVP (서열번호 732) 불변 사슬 단편과 함께 발현한다. 따라서, 항원 결합 도메인이 TCRa 불변 사슬에 융합된 SIR은 이것이 빈 상보적 TCRb 불변 사슬과 공동발현되면 효과적인 표적 세포 용해를 유도할 수 있다. 이러한 SIR 구조물에서 빈 TCRb 불변 사슬은 아미도 항원 결합 도메인을 보유하는 TCRa 불변 사슬의 세포 표면 발현을 용이하게 할 것이다.
TCRa 및 TCRb 불변 사슬의 야생형 뉴클레오티드 서열을 갖는 CD19Bu12 SIR을 발현하는 T 세포는 CD19 발현하는 RAJI 림프종에서 세포독성을 유도하지 못한다.
RAJI-GLuc 세포가 CD19 표적하는 상이한 SIR을 10 : 1의 효과기 : 표적 (E:T) 비율로 발현하는 T 세포와 함께 4시간 동안 공동배양되었다. SIR-T 세포 매개된 표적 세포의 용해가 이전와 같이 검정되었다. 데이타는 이들의 야생형 뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩된 TCRb 및 TCRa 불변 사슬을 포함하는 CD19Bu12 기반의 CD8SP-CD19Bu12-vL-V5-[hTCRb-WT]-F-P2A-CD19Bu12-vH-Myc-[hTCRa-WT]-F-F2A-PAC (021916-Q03)[서열번호 1038] SIR 구조물을 발현하는 T 세포가 음성 대조군 구조물 111815-O05 또는 감염되지 않은 T 세포와 비교하여 유의한 표적 세포 용해를 유발하지 못하는 점을 보여주고, 이는 아마도 인간 일차 T 세포에서 021916-Q03 SIR 구조물의 빈약한 발현으로 인할 것이다. 따라서, CD8SP-FMC63-vL-V5-[hTCRb-WT]-F-P2A-SP-FMC63-vH-Myc-[hTCRa-WT]-F-F2A-PAC (080815-F02)[서열번호 922] 구조물과 유사하게, TCRa 및 TCRb 사슬의 야생형 뉴클레오티드 서열에 기초한 또 다른 SIR도 표적 세포주에 대한 유의한 독성을 유도하지 못하였다.
CD19 표적하는 하나-반 사슬 (OAH SIR)을 발현하는 T 세포가 CD19 발현하는 RAJI 림프종에서 세포독성을 유도한다.
인간 말초 혈액 T 세포가 CD19 표적하는 상이한 SIR을 인코딩하는 렌티바이러스로 감염되었고, RAJI-GLuc 세포를 1 : 1의 효과기 : 표적 (E:T) 비율로 96시간 동안 사용하여 세포독성에 대해 테스트되었다. 데이타는 이들의 야생형 뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩된 TCRb 및 TCRa 불변 사슬을 포함하는 CD8SP-FMC63-vL-V5-[hTCRb-WT]-F-P2A-SP-FMC63-vH-Myc-[hTCRa-WT]-F-F2A-PAC (080815-F02)[서열번호 922] SIR 구조물이 음성 대조군 구조물 040315-U02과 비교하여 유의한 표적 세포 용해를 유도하지 못하였던 점을 보여주고, 이는 아마도 인간 일차 T 세포에서 이러한 구조물 (예로, 080815-F02)의 빈약한 발현으로 인할 것이다. 대조적으로, 다른 모든 SIR 구조물 (예로, 050515-L05, 070215-M03, 081415-D06, 080815-B06, 082815-G07 및 082815-E05)은 GLuc 활성의 증가를 보여주었고, 표적 세포의 용해를 나타낸다. 082815-G07 및 082815-E05 구조물은 TCRb 불변 사슬 (KACIAH 버전)을 FMC63 및 CD19Bu12 scFV 단편이 각각 융합된 TCRa (CSDVP) 단편과 함께 발현한다. 따라서, TCRa 불변 사슬에 융합된 항원 결합 도메인에 기초한 SIR은 빈 TCRb 불변 사슬과 공동발현되면 효과적인 세포 용해를 유도할 수 있다. 이러한 SIR은 하나-반 (OAH SIR)이라고 지칭된다. 따라서, OAH SIR는 단일 사슬 SIR (SC SIR)보다 더 효과적이다. 이것은 아마도 TCRa 및 TCRb이 T 세포 상의 효율적인 발현을 위해 상보적 사슬이 필요하기 때문이다.
CD19 표적하는 이중 사슬 (DC SIR)을 발현하는 T 세포가 CD19 발현하는 RAJI 림프종에서 세포독성을 유도한다.
RAJI-GLuc 세포가 CD19 표적하는 상이한 SIR를 발현하는 T 세포와 함께 10 : 1의 효과기: 표적 (E:T) 비율로 4시간 동안 공동배양되었고, 이후에 GLuc 활성의 측정이 이어졌다. 데이타는 FMC63-vL 사슬이 hTCRa-T48C-opt1 불변 사슬에 연결되고, FMC63-vH가 hTCRb-C57C-opt1 불변 사슬에 연결된 CD8SP-FMC63-vL-Myc-[hTCRa-T48C-opt1]-F-F2A-FMC63-vH-V5-[hTCRb-C57C-opt1]-F-P2A-PAC (100515-E03)[서열번호 902] 구조물을 발현하는 T 세포가 감염되지 않은 T 세포 또는 CD4 또는 KSHV 단백질을 표적하는 음성 대조군 CAR를 발현하는 T 세포와 비교하여 표적 세포의 효과적인 용해를 유도할 수 있는 점을 보여주었다. 유사하게, FMC63-vL 사슬이 TCRb-S57C-opt1 또는 hTCRb-S57C-opt 불변 사슬에 연결되고, FMC63-vH가 TCRa-T48C-opt1 또는 hTCRa-T48C-opt 불변 사슬에 연결된 CD8SP-FMC63-vL-V5-[TCRb-S57C-opt1]-F-P2A-SP-FMC63-vH-Myc-[TCRa-T48C-opt1]-F-F2A-PAC (050515-L05)[서열번호 900] 및 CD8SP-FMC63-vL-V5-[hTCRb-S57C-opt]-F-P2A-SP-FMC63-vH-Myc-[hTCRa-T48C-opt]-F-F2A-PAC (100815-B04)[서열번호 951] 구조물을 발현하는 T 세포는 효과적인 표적 세포 용해를 유도하였다. 마지막으로, FMC63-vH 사슬이 hTCRb-C57C-opt 불변 사슬에 연결되고, FMC63-vL이 hTCRa-T48C-opt 불변 사슬에 연결된 IgHSP-FMC63-vH-[hTCRb-C57C-opt]-F-P2A-CD8SP-FMC63-vL-MYC-[hTCRa-T48C-opt]-F-F2A-Pac (101415-M05)[서열번호 901] 구조물을 발현하는 T 세포도 또한 표적 세포의 효과적인 용해를 유도할 수 있다. 따라서, 이중 사슬 SIR 구조물에서, 항체의 vL 단편은 TCRa 또는 TCRb 불변 사슬 둘 중 하나에 연결되고, vH 단편은 상보적 TCRb 또는 TCRa 불변 사슬 둘 중 하나에 연결될 수 있다. 또한 둘 다의 폴리펩티드 작용 단위 (FPU)가 동일한 벡터로부터 발현되는 이중 사슬 SIR에서, FPU를 포함하는 TCRb 또는 TCRa 사슬은 제 1 (또는 5') FPU일 수 있다.
CD20 SIR을 발현하는 T 세포가 CD20 발현하는 RAJI 림프종에서 세포독성을 유도한다.
RAJI-GLuc 세포가 CD19 및 CD20 표적하는 상이한 SIR를 발현하는 T 세포와 함께 10 : 1의 효과기: 표적 (E:T) 비율로 4시간 동안 공동배양되었고, 이후에 GLuc 활성의 측정이 이어졌다. 데이타는 CD8SP-CD20-2F2-vL-V5-[hTCRb-KACIAH]-F-P2A-SP-CD20-2F2-vH-Myc-[hTCRa-CSDVP]-F-F2A-PAC (100615-D05)[서열번호 1221] SIR을 발현하는 T 세포에 의해 감염되지 않은 T 세포 또는 배지 (Med)를 단독으로 포함하는 웰과 비교하여 표적 세포 용해의 효과적인 유도를 보여주었다. 중등도 세포 독성이 또한 CD19 표적하는 SIR 구조물 (CD8SP-FMC63-vL-V5-[TCRb-S57C-opt1]-F-P2A-SP-FMC63-vH-Myc-[TCRa-T48C-opt1]-F-F2A-PAC (050515-L05)[서열번호 900] 및 CD8SP-FMC63-vL-V5-[hTCRb-S57C-opt]-F-P2A-SP-FMC63-vH-Myc-[hTCRa-T48C-opt]-F-F2A-PAC (100815-B04)[서열번호 951])로 관찰되었다.
개 TCRa 및 개 TCRb 불변 사슬을 포함하는 CD20 SIR을 발현하는 T 세포가 CD20 발현하는 RAJI 세포에서 세포독성을 유도한다.
CD3 자성 비드를 사용하여 단리된 인간 말초 혈액 T 세포가 인간 CD20 (2F2)에 대한 단일클론 항체의 vL 및 vH 단편이 코돈 최적화된 개 TCRa 및 TCRb 불변 사슬에 연결된, CD20을 표적하는 SIR 구조물을 발현하는 렌티바이러스로 감염되었다. 세포는 10 : 1의 E : T 비율로 4시간 공동 배양 이후에 RAJI-GLuc 세포에 대한 세포독성이 테스트되었다. 데이타는 개 TCRb 및 TCRa 불변 사슬에 기초한 CD8SP-CD20-2F2-vL-[개-TCRb-opt]-F-P2A-CD20-2F2-vH-[개-TCRa-opt]-F-F2A-PAC (051716-E02)[서열번호 1113]을 발현하는 T 세포에 의해 감염되지 않은 T 세포와 비교하여 표적 세포 용해의 효과적인 유도를 보여준다.
Lym1 SIR을 발현하는 T 세포가 Lym1-발현하는 Kasumi-1 세포에서 세포독성을 유도한다.
인간 T 세포가 CD8SP-Lym1-vL-[hTCRb-opt2]-F-P2A-SP-Lym1-vH-[hTCRa-opt2-Del]-F-F2A-PAC (012716-B01) [서열번호 1185] SIR을 인코딩하는 렌티바이러스로 감염되었고, 퓨로마이신으로의 선별 이후에 10 : 1의 효과기 : 표적 (E:T) 비율로 4시간 동안 Kasumi-1-GLuc 세포 또는 대조군으로서 또는 감염되지 않은 T 세포 (T-UI)에 대한 세포독성이 테스트되었다. 세포독성은 GLuc 활성의 증가에 의해 검정되었다. 데이타는 (012716-B01) [서열번호 1185] SIR를 발현하는 T 세포에 의해 감염되지 않은 T 세포 또는 배지 단독을 포함하는 웰과 비교하여 GLuc 활성에서 거의 9배 증가를 가즌 표적 세포 용해의 효과적인 유도를 보여주었다.
Lym1 및 Lym2 SIR을 발현하는 T 세포가 Lym1 및 Lym2-발현하는 RAJI 세포에서 세포독성을 유도한다.
Lym1 및 Lym2을 표적하는 SIR을 발현하는 T 세포가 10 : 1의 E : T 비율로 4시간 공동배양 이후에 RAJI-GLuc 세포에 대해 테스트되었다. GLuc-세포독성 검정법으로부터의 데이타는 CD8SP-Lym1-vL-V5-[hTCRb-KACIAH]-F-P2A-SP-Lym1-vH-Myc-[hTCRa-CSDVP]-F-F2A-PAC (021216-H02)[서열번호 1314] 및 CD8SP-Lym2-vL-V5-[hTCRb-KACIAH]-F-P2A-SP-Lym2-vH-Myc-[hTCRa-CSDVP]-F-F2A-PAC (100615-B07)[서열번호 1315] SIR 구조물 둘 다에 의해, 대조군 SIR (서열번호 4639)을 발현하는 T 세포, 감염되지 않은 T 세포 또는 배지 단독과 비교하여 각각 거의 20배 및 10배 더 높은 GLuc 값을 갖는 표적 세포 용해의 효과적인 유도를 보여주었다. 082815-P08은 CD19Bu12 scFv을 포함하고, CD19 항원을 표적하는 통상적인 CAR 이다. 이들의 야생형 뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩된 TCRb 및 TCRa 불변 사슬을 포함하는 CD19Bu12 기반의 (021916-Q03)[서열번호 1038] SIR 구조물은 다시 유의한 표적 세포 용해를 유발하지 못하였다.
CS1 (SLAMF7 또는 CD319)에 대한 SIR을 발현하는 T 세포가 CS1-발현하는 L363 및 U266 세포에서 세포독성을 유도한다.
CD3 자성 비드를 사용하여 딘리된 인간 말초 혈액 T 세포가 CS1 (SLAMF7)을 표적하는 SIR 구조물을 발현하는 렌티바이러스로 감염되었다. 세포가 퓨로마이신으로 선별되었고, L363-GLuc 및 U266-GLuc 세포에 대한 세포독성이 10 : 1의 E : T 비율로 4시간 동안 테스트되었다. GLuc-세포독성 검정법은 CD8SP-CS1-huLuc90-vL-V5-[hTCRb-KACIAH]-F-P2A-SP-huLuc90-vH-Myc-[hTCRa-CSDVP]-F-F2A-PAC (012716-A02)[서열번호 1254] SIR을 발현하는 T 세포에 의해, 감염되지 않은 T 세포 또는 배지를 단독으로 포함하는 웰과 비교하여 GLuc 값에서 거의 15 배 및 10배 이상 명백한 바, L363-GLuc 및 U266-GLuc 용해의 효과적인 유도를 보여주었다.
BCMA (B 세포 성숙 항원 또는 TNFRSF17 또는 CD269) 및 CSI에 대한 SIR을 발현하는 T 세포가 BCMA-발현하는 L363 및 U266 세포에서 세포독성을 유도한다..
CD3 자성 비드를 사용하여 단리된 인간 말초 혈액 T 세포가 CS1 (SLAMF7) 및 BCMA를 표적하는 SIR 구조물을 발현하는 렌티바이러스로 감염되었다. 세포는 퓨로마이신으로 선별되어 L363-GLuc 및 U266-GLuc 세포에 대한 독성이 10 : 1의 E : T 비율로 4시간 동안 테스트되었다. GLuc 세포독성 검정법이 CD8SP-BCMA-huC12A3-L3H3-vL-V5-[hTCRb-KACIAH]-F-P2A-SP-BCMA-huC12A3-L3H3-vH-Myc-[hTCRa-CSDVP]-F-F2A-PAC (011116-A07)[서열번호 1212] 및 CD8SP-CS1-huLuc90-vL-V5-[hTCRb-KACIAH]-F-P2A-SP-huLuc90-vH-Myc-[hTCRa-CSDVP]-F-F2A-PAC (012716-A02)[서열번호 1254] SIR를 발현하는 T 세포에 의해, 감염되지 않은 T 세포, 대조군 SIR CD8SP-KSHV-4C3-vL-V5-[hTCRb-S57C-opt]-F-P2A-SP-4C3-vH-Myc-[hTCRa-T48C-opt]-F-F2A-PAC (111815-O05)[서열번호 4639]를 발현하는 T 세포 또는 배지를 단독으로 포함하는 웰과 비교하여 표적 세포 용해의 효과적인 유도를 보여주었다. 경미한 내지 중증도 표적 세포 용해가 또한 LAMP1을 표적하는 SIR CD8SP-V5-[hTCRb-KACIAH]-F-P2A-CD8SP-LAMP1-Mb4-vL-Gly-Ser-링커-LAMP1-Mb4-vH-Myc-[hTCRa-CSDVP]-F-F2A-PAC (050216-F05)[서열번호 1732]를 발현하는 T 세포 및 cMet 및 Her3를 표적하는 이중특이적 CAR 041316-F06에 의해 관찰되었다.
CD138, CS1, GPRC5D 및 WT1에 대한 SIR을 발현하는 T 세포가 U266 및 L363 세포에서 세포독성을 유도한다.
CD138, CS1, GPRC5D 및 WT1을 표적하는 SIR 구조물을 발현하는 T 세포가 퓨로마이신으로 선별되었고, GLuc를 안정적으로 발현하는 U266 및 L363 세포에 대해 2 : 1의 E : T 비율로 72시간 동안 테스트되었다. GLuc-세포독성 검정법이 CD8SP-CD138-vL-V5-[hTCRb-KACIAH]-F-P2A-SP-CD138-vH-Myc-[hTCRa-CSDVP]-F-F2A-PAC (100815-A05)[서열번호 1236] SIR를 발현하는 T 세포에 의해, 감염되지 않은 T 세포 또는 배지 (Med)를 단독으로 포함하는 웰과 비교하여 표적 세포 용해의 효과적인 유도를 보여주었다. 야생형 TCRa 및 TCRb 불변 사슬을 포함하는 SIR CD8SP-CD138-vL-V5-[hTCRb-WT]-F-P2A-SP-CD138-vH-Myc-[hTCRa-WT]-F-F2A-PAC (021916-R04)[서열번호 1139]를 발현하는 T 세포는 U266 세포에서 단지 최소한으로 효과적이고, L363 세포에서는 효과적이지 않았다. CD138 scFv가 hTCRa-CSDVP 불변 사슬에 부착된 단일 사슬 SIR CD8SP-CD138-vL-Gly-Ser-링커-CD138-vH-Myc-[hTCRa-CSDVP]-F-F2A-PAC (030316-G03)[서열번호 1169]은 U266 세포에서만 효과적이었다. LAMP1에 대한 항체의 vL 단편 및 GPRC5D에 대한 항체의 vH 단편을 보유하는 이중특이적 구조물 LAMP1-humab1-2-vL-V5-[TCRb-KACIAH]-F-P2A-GPRC5D-ET150-18-vH-MYC-[TCRa-CSDVP]-F-F2A-Pac-E05 (092916-E05-VN) (서열번호 1163)도 역시 둘 다의 세포 유형에서 효과적으로 세포독성을 유도하였다. 마지막으로, 경미한 내지 중등도 세포독성이 특히 U266 세포에서 CS1 및 WT1을 표적하는 구조물로 관찰되었다. CS1 (서열번호 1674 및 1253) 및 WT1 (서열번호 1804 및 1805)에 대한 구조물의 제한된 세포독성은 이 실험에서 더 낮은 E : T 비율의 사용으로 인할 수 있다.
CLL1에 대한 SIR을 발현하는 T 세포가 CLL1-발현하는 HL60 세포에서 세포독성을 유도한다.
CLL1을 표적하는 SIR CD8SP-CLL1-M26-vL-[hTCRb-opt2]-F-P2A-SP-CLL1-M26-vH-[hTCRa-opt2]-F-F2A-PAC (012616-A05)[서열번호 4790] 구조물을 발현하는 T 세포가 퓨로마이신으로 선별되었고, HL60-GLuc 세포에 대해 10 : 1의 E : T 비율로 4시간 동안 테스트되었다. GLuc 세포독성이 (012616-A05)[서열번호 4790] SIR를 발현하는 T 세포에 의해, 감염되지 않은 T 세포 또는 배지를 단독으로 포함하는 웰과 비교하여 표적 세포 용해의 효과적인 유도를 보여주었다.
CLEC5A 및 CLL1에 대한 SIR을 발현하는 T 세포가 CLEC5A 및 CLL1-발현하는 HL60 세포에서 세포독성을 유도한다.
실험이 CLEC5A 및 CLL1에 대한 SIR을 발현하는 T 세포로 반복되었다. 결과는 CD8SP-V5-[hTCRb-KACIAH]-F-P2A-CD8SP-CLEC5A-8H8F5-vL-Gly-Ser-링커-CLEC5A-8H8F5-vH-Myc-[hTCRa-CSDVP]-F-F2A-PAC (042816-E05)[서열번호 1666], CD8SP-CLL1-M26-vL-[hTCRb-opt2]-F-P2A-SP-CLL1-M26-vH-[hTCRa-opt2]-F-F2A-PAC (012616-A05)[서열번호 4790] 및 CD8SP-CLL1-M32-vL-V5-[hTCRb-KACIAH]-F-P2A-SP-CLL1-M32-vH-Myc-[hTCRa-CSDVP]-F-F2A-PAC (021216-I03) [서열번호 1250] SIR을 발현하는 T 세포에 의해 감염되지 않은 T 세포 또는 배지를 단독으로 포함하는 웰과 비교하여HL60-GLuc 세포 용해의 효과적인 유도를 보여주었다. GLuc 값은 세 가지 SIR을 각각 발현하는 T 세포로 처리된 세포에서 거의 9배, 4배 및 7배 더 높았다.
CSF2RA, LAMP1 및 CLL1을 표적하는 SIR을 발현하는 T 세포가 CSF2RA, LAMP1 및 CLL1-발현하는 THP1 세포에서 세포독성을 유도한다.
상이한 SIR을 발현하는 T 세포가 THP-GLuc 세포와 함께 10 : 1의 E : T 비율로 4시간 동안 배양되었고, GLuc-세포독성 검정법을 사용하여 테스트되었다. 결과는 각각 CSF2RA, LAMP1 및 CLL1을 표적하는 CD8SP-V5-[hTCRb-KACIAH]-F-P2A-CD8SP-CSF2RA-Ab1-vL-Gly-Ser-링커-CSF2RA-Ab1-vH-Myc-[hTCRa-CSDVP]-F-F2A-PAC (050216-B02)[서열번호 1676], CD8SP-V5-[hTCRb-KACIAH]-F-P2A-CD8SP-LAMP1-Mb4-vL-Gly-Ser-링커-LAMP1-Mb4-vH-Myc-[hTCRa-CSDVP]-F-F2A-PAC (050216-F05)[서열번호 1732] 및 CD8SP-CLL1-M32-vL-V5-[hTCRb-KACIAH]-F-P2A-SP-CLL1-M32-vH-Myc-[hTCRa-CSDVP]-F-F2A-PAC (021216-I03) [서열번호 1250] SIR을 발현하는 T 세포에 의해, 감염되지 않은 T 세포 또는 배지를 단독으로 포함하는 웰과 비교하여 표적 세포 용해의 효과적인 유도를 보여주었다.
CSF2RA를 표적하는 SIR을 발현하는 T 세포가 CSF2RA-발현하는 Molm13 세포에서 세포독성을 유도한다.
CSF2RA를 표적하는 SIR을 발현하는 T 세포가 Molm13-GLuc 세포와 함께 10 : 1의 E : T 비율로 4시간 동안 배양되었고, GLuc-세포독성 검정법을 사용하여 테스트되었다. 결과는 CSF2RA를 표적하는 SIR CD8SP-V5-[hTCRb-KACIAH]-F-P2A-CD8SP-CSF2RA-Ab1-vL-Gly-Ser-링커-CSF2RA-Ab1-vH-Myc-[hTCRa-CSDVP]-F-F2A-PAC (050216-B02)[서열번호 1676]을 발현하는 T 세포에 의해 감염되지 않은 T 세포 또는 KSHV 단백질 (111815-O05)을 표적하는 SIR을 발현하는 T 세포 또는 배지를 단독으로 포함하는 웰과 비교하여 표적 세포 용해의 효과적인 유도를 보여주었다.
TSHR (갑상샘 자극호르몬 수용체) 및 Tn 항원을 표적하는 SIR을 발현하는 T 세포가 TSHR 및 TnAg-발현하는 Jurkat 및 PEER 세포에서 세포독성을 유도한다.
TSHR 및 Tn 항원을 표적하는 상이한 SIR을 발현하는 T 세포가 Jurkat-GLuc 및 PEER1-GLuc 세포와 함께 10 : 1의 E : T 비율로 배양되었고, GLuc-세포독성 검정법을 사용하여 테스트되었다. 결과는 각각 TSHR 및 Tn 항원을 표적하는 SIR CD8SP-V5-[hTCRb-KACIAH]-F-P2A-CD8SP-TSHR-KB1-vL-Gly-Ser-링커-TSHR-KB1-vH-Myc-[hTCRa-CSDVP]-F-F2A-PAC (042916-E03)[서열번호 1795] 및 CD8SP-V5-[hTCRb-KACIAH]-F-P2A-CD8SP-TnAg-vL-Gly-Ser-링커-TnAg-vH-Myc-[hTCRa-CSDVP]-F-F2A-PAC (050216-A04)[서열번호 1788]에 의해, 감염되지 않은 T 세포, 대조군 SIR (111815-O05, 042816-H07, 031516-J07)을 발현하는 T 세포 또는 배지를 단독으로 포함하는 웰과 비교하여 표적 세포 용해의 효과적인 유도를 보여주었다.
Tn 항원을 표적하는 SIR을 발현하는 T 세포가 Tn 항원-발현하는 Jurkat 및 PEER 세포에서 세포독성을 유도한다.
Tn 항원을 표적하는 SIR을 발현하는 T 세포가 Jurkat-GLuc 및 PEER1-GLuc 세포와 함께 10 : 1의 E : T 비율로 4시간 동안 배양되었고, GLuc-세포독성 검정법을 사용하여 테스트되었다. 결과는 Tn 항원을 표적하는 SIR CD8SP-V5-[hTCRb-KACIAH]-F-P2A-CD8SP-TnAg-vL-Gly-Ser-링커-TnAg-vH-Myc4-[preTCRa-Del48]-F-F2A-PAC (080816-H06)[서열번호 2003]을 발현하는 T 세포에 의해, 감염되지 않은 T 세포 또는 배지를 단독으로 포함하는 웰과 비교하여 표적 세포 용해의 효과적인 유도를 보여주었다.
MPL (TPO 수용체)을 표적하는 SIR을 발현하는 T 세포가 MPL-발현하는 세포에서 세포독성을 유도한다.
MPL 항원을 표적하는 SIR을 발현하는 T 세포가 HEL-GLuc 세포와 함께 10 : 1의 E : T 비율로 4시간 동안 배양되었고, GLuc-세포독성 검정법을 사용하여 테스트되었다. 실험은 MPL을 표적하는 SIR CD8SP-MPL-175-vL-[hTCRb-opt2]-F-P2A-SP-175-vH-[hTCRa-opt2]-F-F2A-PAC (042116-G01)[서열번호 4862]을 발현하는 T 세포에 의해, 감염되지 않은 T 세포 또는 배지를 단독으로 포함하는 웰과 비교하여 표적 세포 용해의 효과적인 유도를 보여주었다.
FLT3를 표적하는 SIR을 발현하는 T 세포가 FLT3-발현하는 RS:411 (또는 RS411) 세포에서 세포독성을 유도한다.
FLT3 항원을 표적하는 SIR을 발현하는 T 세포가 RS:411-GLuc 세포와 함께 10 : 1의 E : T 비율로 4시간 동안 배양되었고, GLuc-세포독성 검정법을 사용하여 테스트되었다. 데이타는 FLT3을 표적하는 SIR CD8SP-FLT3-NC7-vL-V5-[hTCRb-KACIAH]-F-P2A-SP-FLT3-NC7-vH-Myc-[hTCRa-CSDVP]-F-F2A-PAC (050316-C01)[서열번호 1273]를 발현하는 T 세포에 의해, 감염되지 않은 T 세포, 음성 대조군 SIR (111815-O05)을 발현하는 T 세포 또는 배지를 단독으로 포함하는 웰과 비교하여 표적 세포 용해의 효과적인 유도를 보여주었다.
NKG2D 세포외 도메인을 발현하는 SIR 및 FLT3 및 CSF2RA을 표적하는 SIR을 발현하는 T 세포가 MV411 표적 세포에서 세포독성을 유도한다.
NKG2D의 세포외 도메인 (hTCR-CSDVP 불변 사슬에 GGGGS-GGGGD-Myc 링커를 통해 연결됨)을 발현하는 인간 말초 혈액 T 세포 및 FLT3 및 CSF2RA을 표적하는 세포가 MV411-GLuc 세포에 대해 10 : 1의 효과기: 표적 (E:T) 비율로 4시간 동안 테스트되었다. GLuc 세포독성 검정법은 CD8SP-V5-[hTCRb-KACIAH]-F-P2A-CD8SP-NKG2D-(GGGGS-GGGGD)-Myc-[hTCRa-CSDVP]-F-F2A-PAC (042916-A06)[서열번호 1755] 및 CD8SP-FLT3-NC7-vL-V5-[hTCRb-KACIAH]-F-P2A-SP-FLT3-NC7-vH-Myc-[hTCRa-CSDVP]-F-F2A-PAC (050316-C01)[서열번호 1273] 및 CD8SP-V5-[hTCRb-KACIAH]-F-P2A-CD8SP-CSF2RA-Ab1-vL-Gly-Ser-링커-CSF2RA-Ab1-vH-Myc-[hTCRa-CSDVP]-F-F2A-PAC (050216-B02)[서열번호 1676] SIR을 발현하는 T 세포에 의해, 감염되지 않은 T 세포, 대조군 SIR CD8SP-KSHV-4C3-vL-V5-[hTCRb-S57C-opt]-F-P2A-SP-4C3-vH-Myc-[hTCRa-T48C-opt]-F-F2A-PAC (111815-O05)[서열번호 4639] SIR을 발현하는 T 세포 또는 배지를 단독으로 포함하는 웰과 비교하여 표적 세포 용해의 효과적인 유도를 보여주었다. 상기 결과는 항원 결합 도메인이 수용체 (예로, NKG2D)를 포함하는 SIR이 기능적으로 활성을 갖는 점을 입증한다.
CD30 및 WT1 SIR을 발현하는 T 세포가 U266 및 L363 표적 세포에서 세포독성을 유도한다.
특이적 HLA 항원과 조합하여 인식될 수 있는 세포내 펩티드에 대한 SIR이 생성될 수 있다. CD3 자성 비드를 사용하여 단리된 인간 말초 혈액 T 세포가 CD30 또는 WT1을 표적하는 표시된 SIR 구조물을 발현하는 렌티바이러스로 감염되었다. WT1 SIR은 HLA-A2 분자와 조합하여 WT1으로부터 유래된 펩티드 (RMFPNAPYL)를 인식한다. 세포가 퓨로마이신으로 선별되고 증식되었다. hGLuc를 안정적으로 발현하는 U266 (WT1+/HLA-A2+) 및 L-363 (WT1+/HLA-A2+) 세포가 SIR을 발현하는 T 세포와 함께 10 : 1의 효과기: 표적 (E:T) 비율로 4시간 동안 공동배양되었다. GLuc 세포독성 검정법은 SIR CD8SP-WT1-Ab1-vL-V5-[hTCRb-S57C-opt]-F-P2A-SP-WT1-Ab1-vH-Myc-[hTCRa-T48C-opt]-F-F2A-PAC (012816-G01)[서열번호 4709]을 발현하는 T 세포가 최소한으로 효과적일 때, SIR CD8SP-WT1-Ab5-vL-V5-[hTCRb-S57C-opt]-F-P2A-SP-WT1-Ab5-vH-Myc-[hTCRa-T48C-opt]-F-F2A-PAC (111815-C04)[서열번호 4710]을 발현하는 T 세포를 감염되지 않은 T 세포 (T-UI)와 비교하여 표적 세포를 효과적으로 살상하였다. 추가적으로, CD30을 표적하는 SIR CD8SP-CD30-Ac10-vL-V5-[hTCRb-KACIAH]-F-P2A-SP-CD30-Ac10-vH-Myc-[hTCRa-CSDVP]-F-F2A-PAC (010716-K01)[서열번호 1227]도 CD30 발현하는 표적 세포를 효과적으로 살상하였다.
CD33 및 CD179b를 표적하는 SIR을 발현하는 T 세포가 CD33 및 CD179b ㅂ바발현하는 HL60 및 Molm13 세포에서 세포독성을 유도한다.
CD33 및 CD179b를 표적하는 SIR을 발현하는 T 세포가 HL60-Gluc 및 Molm13-Gluc 세포와 함께 10 : 1의 E : T 비율로 4시간 동안 배양되었고, GLuc-세포독성 검정법을 사용하여 테스트되었다. 데이타는 CD33 및 CD179b를 각각 표적하는 SIR CD8SP-CD33-AF5-vL-V5-[TCRβ-KACIA]-F-P2A-SP-CD33-AF5vH-MYC-[TCRα-CSDVP]-F-F2A-Pac (052416-K05) [서열번호 1229] 및 CD179b-vL-V5-{TCRβ-KACIAH}-F-P2A-SP-CD179b-vH-MYC-[TCRα-CSDVP]-F-F2A-Pac (063016-Y06) [서열번호 1237]을 발현하는 T 세포에 의해, 감염되지 않은 T 세포 또는 배지를 단독으로 포함하는 웰과 비교하여 표적 세포 용해의 효과적인 유도를 보여주었다.
CD33을 표적하는 SIR을 발현하는 T 세포가 CD33 발현하는 HL60 세포에서 세포독성을 유도한다.
CD33 표적하는 SIR을 발현하는 T 세포가 HL60-Gluc 세포와 함께 10 : 1의 E : T 비율로 4시간 동안 배양되었고, GLuc-세포독성 검정법을 사용하여 테스트되었다. 실험은 CD33을 표적하는 SIR CD8SP-V5-[hTCRb-KACIAH]-F-P2A-CD8SP-CD33-huMyc9-vL-Gly-Ser-링커-CD33-huMyc9-vH-Myc-[hTCRa-CSDVP]-F-F2A-PAC (090116-C02)[서열번호 1650], CD8SP-V5-[hTCRb-KACIAH]-F-P2A-CD8SP-CD33-AF5-vL-Gly-Ser-링커-CD33-AF5-vH-Myc4-[preTCRa-Del48]-F-F2A-PAC (083116-E02)[서열번호 1864] 및 CD8SP-V5-[hTCRb-KACIAH]-F-P2A-CD8SP-CD33-huMyc9-vL-Gly-Ser-링커-CD33-huMyc9-vH-Myc4-[preTCRa-Del48]-F-F2A-PAC (083116-C06)[서열번호 1865]을 발현하는 T 세포에 의해, 감염되지 않은 T 세포 또는 배지를 단독으로 포함하는 웰과 비교하여 표적 세포 용해의 효과적인 유도를 보여주었다.
CXCR4를 표적하는 SIR을 발현하는 T 세포가 CXCR4 발현하는 THP 세포에서 세포독성을 유도한다.
CD3 자성 비드를 사용하여 단리된 인간 말초 혈액 T 세포가 CXCR4를 표적하는 표시된 이중특이적 SIR 구조물 CD8SP-CXCR4-1-vHH-V5-[hTCRb-KACIAH]-F-P2A-SP-FMC63-vH-MYC-[hTCRa-CSDV]-F-F2A-PAC (101415-V01)[서열번호 1171]을 발현하는 렌티바이러스로 감염되었다. SIR 구조물은 또한 CD19에 대한 FMC63 항체의 vH 단편을 발현하였다. 세포는 HL60-GLuc 세포와 함께 5 : 1의 E : T 비율로 4시간 동안 배양되었고, 세포독성이 Gluc 검정법을 사용하여 측정되었다. 실험은 CXCR4 표적하는 SIR을 발현하는 T 세포에 의해, 감염되지 않은 T 세포 또는 배지를 단독으로 포함하는 웰과 비교하여 표적 세포 용해의 효과적인 유도를 보여주었다.
IL11Ra에 대한 SIR을 발현하는 T 세포가 IL11Ra-발현하는 BV173 세포에서 세포독성을 유도한다.
IL11Ra 표적하는 SIR을 발현하는 T 세포가 THP-1-Gluc 세포와 함께 10 : 1의 E : T 비율로 4시간 동안 배양되었고, GLuc-세포독성 검정법을 사용하여 테스트되었다. 결과는 CD8SP-IL11Ra-8E2-Ts107-vL-V5-[hTCRb-KACIAH]-F-P2A-SP-IL11Ra-8E2-Ts107-vH-Myc-[hTCRa-CSDVP]-F-F2A-PAC (050516-R06)[서열번호 1304] SIR를 발현하는 T 세포에 의해, T-UI 세포 또는 배지 단독과 비교하여 Bv173 표적 세포의 효과적인 유도를 보여주었다.
CD16 SIR를 발현하는 T 세포가 CD20 단일클론 항체 리투시맙과 조합하여 CD20 발현하는 RAJI 림프종에서 세포독성을 유도한다.
CD3 자성 비드를 사용하여 단리된 인간 말초 혈액 T 세포가 인간 IgG에 대한 높은 친화도를 갖는 CD16A 변이체 v158A를 발현하는 SIR 구조물 CD8SP-V5-[hTCRb-KACIAH]-F-P2A-CD8SP2-CD16A-v158-v2-Myc-[hTCRa-T48C-opt]-F-F2A-PAC (020416-A08)[서열번호 1186]을 발현하는 렌티바이러스로 감염되었다. KSHV 단백질에 대한 4C3 SIR가 음성 대조군으로서 사용되었다. 세포가 퓨로마이신으로 선별되어 증식되었다. 안정적으로 hGLuc를 발현하는 RAJI 세포가 SIR을 발현하는 T 세포와 함께 10 : 1의 효과기: 표적 (E:T) 비율로 4시간 동안 리투시맙 (1 μg/mL)의 부재 및 존재 시 공동배양되었다. SIR-T 세포 매개된 표적 세포의 용해 유도가 미가공 실렌터라진 (Nanaolight)을 포함하는 0.5× CTZ 검정 완충액을 직접적으로 주사함으로써 BioTek 시너지 플레이트 리더에 의해 측정된 바와 같이 GLuc 활성의 증가로 검정되었다. 결과는 CD16A-v158 SIR 구조물에 의해 다만 리투시맙의 존재 시에만 효과적인 표적 세포 용해를 보여준다. 따라서, CD16A v158 SIR는 임의의 단일클론 항체로 사용될 수 있고 이로써 상이한 항원 표적에 대해 개별적인 SIR을 제조할 필요가 없어지는 보편적인 SIR로서 작용할 수 있다.
CD123-161 이중특이적 SIR을 발현하는 T 세포가 MPL 발현하는 Bv173 및 HEL 세포에서 세포독성을 유도한다.
CD3 자성 비드를 사용하여 단리된 인간 말초 혈액 T 세포가 CD123 및 MPL (161) 둘 다를 표적하는 IgHSP-CD123-2-vHH-V5-[hTCRb-S57C-opt]-F-P2A-CD8SP-MPL-161-HL-Myc-[hTCRa-T48C-opt]-F-F2A-PAC (022516-M08)[서열번호 4591] SIR 구조물을 발현하는 렌티바이러스로 감염되었다. 세포가 퓨로마이신으로 선별되어 증식되었다. 안정적으로 hGLuc를 발현하는 Bv173 및 HEL 표적 세포가 SIR을 발현하는 T 세포와 10 : 1의 효과기 : 표적 (E:T) 비율로 4시간 동안 공동배양되었다. Gluc 세포독성 검정법은 이중특이적 SIR가 이의 항원 또는 항원들을 발현하는 표적 세포의 효과적인 용해를 유도할 수 있는 점을 보여주었다.
CD123에 대한 SIR을 발현하는 T 세포가 CD123 발현하는 L428 세포에서 세포독성을 유도한다.
CD123 표적하는 SIR을 발현하는 T 세포가 L428-Gluc 세포와 함께 10 : 1의 E : T 비율로 4시간 동안 배양되었고, GLuc-세포독성 검정법을 사용하여 테스트되었다. 결과는 CD8SP-CD123-CSL362-vL-V5-[hTCRb-KACIAH]-F-P2A-SP-CD123-CSL362-vH-Myc-[preTCRa-Del48]-F-F2A-PAC (041416-K04)[서열번호 1445] SIR를 발현하는 T 세포에 의해, T-UI 세포 또는 배지 단독과 비교하여 L428 표적 세포 용해의 효과적인 유도를 보여주었다.
CD123에 대한 SIR을 발현하는 T 세포가 CD123 발현하는 Bv173 세포에서 세포독성을 유도한다.
CD123 표적하는 SIR을 발현하는 T 세포가 Bv173-Gluc 세포와 함께 10 : 1의 E : T 비율로 4시간 동안 배양되었고, GLuc-세포독성 검정법을 사용하여 테스트되었다. 결과는 IgHSP-CD123-2-vHH-V5-[hTCRb-KACIAH]-F-P2A-SP-CD123-1-vHH-Myc-[preTCRa-Del48]-F-F2A-PAC (041416-V03)[서열번호1467] SIR을 발현하는 T 세포에 의해, T-UI 세포 또는 배지 단독 (Med)과 비교하여 Bv173 표적 세포 용해의 효과적인 유도를 보여준다. 이러한 SIR은 hTCRb-KACIAH 및 preTCRa-Del48 불변 사슬 단편에 각각 부착된 두 개의 상이한 카멜리드 vHH (CD123-2 및 CD123-1)을 포함한다. 이들 결과는 두 개의 상이한 항원 결합 도메인을 포함하는 SIR이 기능적으로 활성을 갖는 점을 입증한다.
CD79b 및 CD138 표적하는 SIR을 발현하는 T 세포가 CD79b 및 CD138 발현하는 RAJI 및 L363 세포에서 세포독성을 유도한다.
CD79b 및 CD138 표적하는 SIR 발현하는 T 세포가 RAJI-Gluc 및 L363-Gluc 세포와 함께 10 : 1의 E : T 비율로 4시간 동안 배양되었고, GLuc-세포독성 검정법을 사용하여 테스트되었다. 결과는 CD79b 및 CD138 표적하는 CD8SP-CD79b-2F2-vL-V5-[hTCRb-S57C-opt]-F-P2A-SP-CD79b-2F2-vH-Myc-[preTCRa-Del48]-F-F2A-PAC (041216-H05)[서열번호 1130] 및 CD8SP-CD138-vL-V5-[hTCRb-KACIAH]-F-P2A-SP-CD138-vH-Myc-[preTCRa-Del48]-F-F2A-PAC (041416-I03)[서열번호 1446] SIR 발현하는 T 세포에 의해, 감염되지 않은 T 세포 또는 배지를 단독으로 포함하는 웰과 비교하여 표적 세포 용해의 효과적인 유도를 보여준다.
TCRβ1 SIR 발현하는 T 세포가 TCRβ1-발현하는 Jurkat 세포에서 세포독성을 유도한다.
CD3 자성 비드를 사용하여 단리된 인간 말초 혈액 T 세포가 TCRB1 (TCRβ1) 불변 사슬을 표적하는 CD8SP-V5-[hTCRb-KACIAH]-F-P2A-CD8SP-TCRB1-CP01-E09-vL-Gly-Ser-링커-TCRB1-CP01-E09-vH-Myc-[hTCRa-CSDVP]-F-F2A-PAC (030816-D04)[서열번호 1778] 및 CD8SP-V5-[hTCRb-KACIAH]-F-P2A-CD8SP-TCRB1-Jovi1-vL-Gly-Ser-링커-TCRB1-Jovi1-vH-Myc-[hTCRa-CSDVP]-F-F2A-PAC (030816-B07)[서열번호 1779] SIR 구조물 및 CD30 표적하는 CD8SP-CD30-Ac10-vL-V5-[hTCRb-KACIAH]-F-P2A-SP-CD30-Ac10-vH-Myc-[hTCRa-CSDVP]-F-F2A-PAC (063016-K02)[서열번호 1227] SIR을 발현하는 렌티바이러스로 감염되었다. 세포가 퓨로마이신으로 선별되어 증식되었다. 안정적으로 hGLuc를 발현하는 Jurkat 세포가 SIR을 발현하는 T 세포와 함께 10 : 1의 효과기 : 표적 (E:T) 비율로 4시간 동안 공동배양되었다. SIR-T 세포 매개된 표적 세포의 용해 유도는 GLuc 활성의 증가로 검정되었다. 결과는 CD8SP-V5-[hTCRb-KACIAH]-F-P2A-CD8SP-TCRB1-Jovi1-vL-Gly-Ser-링커-TCRB1-Jovi1-vH-Myc-[hTCRa-CSDVP]-F-F2A-PAC (030816-B07)[서열번호 1779] 및 CD8SP-CD30-Ac10-vL-V5-[hTCRb-KACIAH]-F-P2A-SP-CD30-Ac10-vH-Myc-[hTCRa-CSDVP]-F-F2A-PAC (063016-K02)[서열번호 1227]가 효과적인 표적 세포 용해를 유도하였던 한편, CD8SP-V5-[hTCRb-KACIAH]-F-P2A-CD8SP-TCRB1-CP01-E09-vL-Gly-Ser-링커-TCRB1-CP01-E09-vH-Myc-[hTCRa-CSDVP]-F-F2A-PAC (030816-D04)[서열번호 1778]는 효과적이지 않았다.
TCRβ2 SIR 발현하는 T 세포가 TCRβ2 불변 사슬을 포함하는 SIR 발현하는 Jurkat 세포에서 세포독성을 유도한다.
초기 실험에서, TCRβ2 사슬에게로 유도되는 SIR을 발현하는 T 세포가 세포 세포독성 검정법에서 기능적으로 활성을 가졌다. 이것은 이들 SIR에서 TCRβ 불변 사슬이 TCRβ2 사슬로부터 유래되고, 따라서 이러한 SIR-발현하는 T 세포가 자살 또는 살해 (fratricide) (예로, 이웃하는 SIR 발현하는 T 세포를 살해함)를 하였던 사실로 인할 수 있음이 추론된다. 이러한 문제점을 극복하기 위하여, TCRβ2 표적하는 SIR이 TCRβ1 사슬에 기초하는 TCRβ1-opt4 불변 사슬 (핵산 서열번호 752 및 아미노산 서열번호 3032)을 사용하여 생성되었다. CD3 자성 비드를 사용하여 단리된 인간 말초 혈액 T 세포가 TCRb2 (TCRβ2) 불변 사슬을 표적하는 표시된 SIR (CD8SP-TCRB2-D05-vL-[hTCRb-opt4]-F-P2A-SP-TCRB2-D05-vH-MYC-[hTCRa-CSDVP]-F-F2A-Pac-K06 (072816-K06)[서열번호 1129] 및 CD8SP-TCRB2-CP01-E05-vL-[hTCRb-opt4]-F-P2A-SP-TCRB2-CP01-E05-vH-Myc-[hTCRa-CSDVP]-F-F2A-PAC (072816-L06)[서열번호 1128]) 구조물을 발현하는 렌티바이러스로 감염되었다. 세포가 퓨로마이신으로 선별되어 증식되었다. 표적 세포를 위해, 본 발명자는 안정적으로 PSMA를 표적하는 TCRB2 불변 사슬을 포함하는 SIR을 발현하는 Jurkat 세포를 사용하였다. Jurkat 세포는 또한 리포터로서 TurboLuc의 신호 펩티드-결여된 버전을 공동발현하였다. Jurkat 세포가 SIR 발현하는 T 세포와 함께 10 : 1의 효과기 : 표적 (E:T) 비율로 4시간 동안 공동배양되었다. SIR-T 세포 매개된 표적 세포의 용해 유도가 미가공 실렌터라진 (Nanaolight)을 포함하는 0.5× CTZ 검정 완충액을 직접적으로 주사함으로써 BioTek 시너지 플레이트 리더에 의해 측정된 바와 같이 TurboLuc 활성의 증가로 검정되었다. 결과는 CD8SP-TCRB2-D05-vL-[TCRb-opt4]-F-P2A-SP-TCRB2-D05-vH-MYC-[TCRα-CSDVP]-F-F2A-Pac-K06 (072816-K06) [서열번호 1129] 및 CD8SP-TCRB2-CP01-E05-vL-[hTCRb-opt4]-F-P2A-SP-TCRB2-CP01-E05-vH-Myc-[hTCRa-CSDVP]-F-F2A-PAC (072816-L06)[서열번호 1128] SIR 둘 다를 발현하는 T 세포가 TurboLuc 활성의 증가에 의해 나타낸 바와 같이, 감염되지 않은 T 세포 (T-UI) 또는 배지 단독과 비교할 때 표적 세포의 효과적인 용해를 유도하였던 점을 보여준다.
폴레이트 수용체 1 (FR1) SIR 발현하는 T 세포가 FR1-발현하는 SKOV3, PC3 및 LNCAP 세포에서 세포독성을 유도한다.
CD3 자성 비드를 사용하여 단리된 인간 말초 혈액 T 세포가 FR1 표적하는 표시된 SIR 구조물 (CD8SP-FR1-huMov19-vL-V5-[hTCRb-KACIAH]-F-P2A-SP-FR1-huMov19-vH-Myc-[hTCRa-CSDVP]-F-F2A-PAC (102915-P07)[서열번호 1276])을 발현하는 렌티바이러스로 감염되었다. 세포가 퓨로마이신으로 선별되어 증식되었다. 안정적으로 hGLuc를 발현하는 SKOV3, PC3 및 LNCAP 세포가 SIR 발현하는 T 세포와 함께 10 : 1의 효과기 : 표적 (E:T) 비율로 4시간 동안 공동배양되었다. SIR-T 세포 매개된 표적 세포의 용해 유도가 GLuc 활성의 증가에 의해 검정되었다. 결과는 CD8SP-FR1-huMov19-vL-V5-[hTCRb-KACIAH]-F-P2A-SP-FR1-huMov19-vH-Myc-[hTCRa-CSDVP]-F-F2A-PAC (102915-P07)[서열번호 1276] SIR을 발현하는 T 세포에 의해, 감염되지 않은 T 세포 (T-UI)와 비교하여 SKOV3 및 PC3 세포 사망의 효과적인 유도를 보여준다. Epcam1 및 L1CAM 표적하는 SIR 발현하는 T 세포는 또한 SKOV3 및 PC3 세포주에서 감염되지 않은 T 세포와 비교하여 세포 사망의 약한 유도를 보여주었다.
세포내 항원 TERT, MART1, MUC1, gp100, 티로시나제 및 NYESO에 대한 SIR 발현하는 T 세포가 표적 세포에서 세포독성을 유도한다.
CD3 자성 비드를 사용하여 단리된 인간 말초 혈액 T 세포가 표시된 SIR 구조물 (CD8SP-V5-[hTCRb-KACIAH]-F-P2A-CD8SP-TERT-3G3-T865-vL-Gly-Ser-링커-TERT-3G3-T865-vH-Myc-[hTCRa-CSDVP]-F-F2A-PAC (021216-L07)[서열번호 1784], CD8SP-TERT-3G3-T865-vL-[hTCRb-opt2]-F-P2A-SP-TERT-3G3-T865-vH-[hTCRa-opt2]-F-F2A-PAC (050316-A01)[서열번호 4902], CD8SP-V5-[hTCRb-KACIAH]-F-P2A-CD8SP-MART1-CAG10-vL-Gly-Ser-링커-MART1-CAG10-vH-Myc-[hTCRa-CSDVP]-F-F2A-PAC (021216-N03)[서열번호 1739], CD8SP-V5-[hTCRb-KACIAH]-F-P2A-CD8SP-Muc1-D6-M3B8-vL-Gly-Ser-링커-Muc1-D6-M3B8-vH-Myc-[hTCRa-CSDVP]-F-F2A-PAC (021616-B05)[서열번호 1751], CD8SP-MUC1-D6-M3A1-vL-[hTCRb-opt2]-F-P2A-SP-MUC1-D6-M3A1-vH-[hTCRa-opt2]-F-F2A-PAC (050316-B01)[서열번호 4870], CD8SP-NYESO-T1-vL-[hTCRb-opt2]-F-P2A-SP-NYESO-T2-vH-[hTCRa-opt2]-F-F2A-PAC (040416-D01)[서열번호 4877], CD8SP-gp100-vL-[hTCRb-opt2]-F-P2A-SP-gp100-vH-[hTCRa-opt2]-F-F2A-PAC (031516-B03)[서열번호 4828], 및 CD8SP-Tyros-B2-vL-[hTCRb-opt2]-F-P2A-SP-Tyros-B2-vH-[hTCRa-opt2]-F-F2A-PAC (032816-B03)[서열번호 4915]을 발현하는 렌티바이러스로 감염되었다. TERT, MART1, MUC1, gp100, 티로시나제 및 NYESO 표적하는 SIR은 이전에 기술된 바와 같이 HLA-A2와 조합하여 이들 세포내 단백질로부터 유래된 펩티드를 인식한다. 세포가 퓨로마이신으로 선별되어 증식되었다. 안정적으로 GLuc를 발현하는 표시된 표적 (HLA-A2) 세포가 SIR 발현하는 T 세포와 함께 10 : 1의 효과기 : 표적 (E:T) 비율로 4시간 동안 공동배양되었다. SIR-T 세포 매개된 표적 세포의 용해 유도가 GLuc 활성의 증가에 의해 검정되었다. 결과는 TERT, MART1, MUC1, gp100, 티로시나제 및 NYESO 표적하는 SIR이 이들 세포내 항원을 발현하는 HLA-2A 양성 표적 세포의 용해를 나타내는 점을 보여준다. 또한, GD3 표적하는 SIR CD8SP-V5-[hTCRb-KACIAH]-F-P2A-CD8SP-GD3-KM-641-vL-Gly-Ser-링커-GD3-KM-641-vH-Myc-[hTCRa-CSDVP]-F-F2A-PAC (042816-A04)[서열번호 1697]를 발현하는 T 세포도 GD3 발현하는 MEL624 표적 세포의 용해를 보여주었다.
EGFR에 대한 SIR 발현하는 T 세포가 EGFR-발현하는 HeLa 세포에서 세포독성을 유도한다.
인간 말초 혈액 T 세포가 EGFR 표적하는 SIR 발현하는 렌티바이러스로 감염되었다. 세포가 퓨로마이신으로 선별되어 증식되었다. 안정적으로 hGLuc를 발현하는 HeLa 세포가 SIR 발현하는 T 세포 또는 감염되지 않은 T 세포 (T-UI)와 함께 5 : 1의 효과기 : 표적 (E:T) 비율로 24시간 동안 공동배양되었다. SIR-T 세포 매개된 표적 세포의 용해 유도가 GLuc 활성의 증가에 의해 검정되었다. 결과는 CD8SP-V5-[hTCRb-KACIAH]-F-P2A-CD8SP-세투시맙-vL-Gly-Ser-링커-세투시맙-vH-Myc4-[preTCRa-Del48]-F-F2A-PAC (062916-G04)[서열번호 1880] SIR를 발현하는 T 세포에 의해, T-UO 세포 또는 배지 단독과 비교하여 HeLa 표적 세포 용해의 효과적인 유도를 보여주었다.
CD324에 대한 SIR 발현하는 T 세포가 CD324-발현하는 MDA-MB-231 세포에서 세포독성을 유도한다.
단리된 인간 말초 혈액 T 세포가 CD324 표적하는 표시된 SIR 구조물을 발현하는 렌티바이러스로 감염되었다. 세포가 퓨로마이신으로 선별되어 증식되었다. 안정적으로 hGLuc를 발현하는 MDA-MB-231 세포가 SIR 발현하는 T 세포 또는 감염되지 않은 T 세포 (T-UI)와 함께 5 : 1의 효과기 : 표적 (E:T) 비율로 24시간 동안 공동배양되었다. SIR-T 세포 매개된 표적 세포의 용해 유도가 GLuc 활성의 증가에 의해 검정되었다. 데이타는 CD8SP-CD324-SC10-6-vL-V5-[hTCRb-KACIAH]-F-P2A-SP-CD324-SC10-6-vH-Myc4-[hTCRa-CSDVP]-F-F2A-PAC (071516-L04)[서열번호 1239] SIR를 발현하는 T 세포에 의해, T-UO 세포 또는 배지 단독과 비교하여 CD324 표적 세포 용해의 효과적인 유도를 보여주었다.
CD276 및 IL13Ra2 표적하는 SIR 발현하는 T 세포가 이들 항원을 발현하는 U87-MG 표적 세포에서 세포독성을 유도한다.
T 세포가 CD276 및 IL13Ra2 표적하는 SIR 구조물을 발현하는 렌티바이러스로감염되었다. 세포가 퓨로마이신으로 선별되어 증식되었다. 안정적으로 hGLuc를 발현하는 U87-MG-GLuc 세포가 SIR 발현하는 T 세포 또는 감염되지 않은 T 세포 (T-UI)와 함께 10 : 1의 효과기 : 표적 (E:T) 비율로 4시간 동안 공동배양되었다. SIR-T 세포 매개된 표적 세포의 용해 유도가 GLuc 활성의 증가에 의해 검정되었다. 데이타는 CD8SP-V5-[hTCRb-KACIAH]-F-P2A-CD8SP-CD276-17-vL-Gly-Ser-링커-CD276-17-vH-Myc-[hTCRa-CSDVP]-F-F2A-PAC (042816-C03)[서열번호 1658] SIR 발현하는 T 세포에 의해, T-UO 세포 또는 배지 단독과 비교하여 표적 세포 용해의 효과적인 유도를 보여주었다.
GD2 표적하는 SIR 발현하는 T 세포가 이들 항원을 발현하는 SKMEL-31 및 SKMEL-37 표적 세포에서 세포독성을 유도한다.
T 세포가 GD2 표적하는 SIR 구조물을 발현하는 렌티바이러스로감염되었다. 세포가 퓨로마이신으로 선별되어 증식되었다. 안정적으로 hGLuc를 발현하는 SKMEL-31 및 SKMEL-37 세포가 SIR 발현하는 T 세포 또는 감염되지 않은 T 세포 (T-UI)와 함께 10 : 1의 효과기 : 표적 (E:T) 비율로 4시간 동안 공동배양되었다. SIR-T 세포 매개된 표적 세포의 용해 유도가 GLuc 활성의 증가에 의해 검정되었다. 데이타는 CD8SP-GD2-hu3F8-vL-V5-[hTCRb-KACIAH]-F-P2A-SP-GD2-hu3F8-vH-Myc-[preTCRa-Del48]-F-F2A-PAC (041816-E01)[서열번호1489] SIR 발현하는 T 세포에 의해, T-UO 세포 또는 배지 단독과 비교하여 표적 세포 용해의 효과적인 유도를 보여주었다.
L1CAM에 대한 SIR 발현하는 T 세포가 L1CAM-발현하는 SKOV3 세포에서 세포독성을 유도한다.
L1CAM 표적하는 SIR 발현하는 T 세포가 SKOV3-GLuc 세포와 함께 10 : 1의 E : T 비율로 24시간 동안 배양되었고, GLuc-세포독성 검정법을 사용하여 테스트되었다. 데이타는 CD8SP-MYC-[hTCRa-T48C-opt1]-F-F2A-CD8SP-L1CAM-9-3-Hu3-V5-[hTCRb-T57C-opt1]-F-P2A-PAC (080316-T02)[서열번호 1136] SIR 발현하는 T 세포에 의해, T-UO 세포 또는 배지 단독과 비교하여 SKOV3 표적 세포 용해의 효과적인 유도를 보여주었다.
CDH6에 대한 SIR 발현하는 T 세포가 CDH6-발현하는 SKOV3 세포에서 세포독성을 유도한다.
CDH6 표적하는 SIR 발현하는 T 세포가 SKOV3-GLuc 세포와 함께 10 : 1의 E : T 비율로 24시간 동안 배양되었고, GLuc-세포독성 검정법을 사용하여 테스트되었다. 데이타는 CD8SP-CDH6-NOV712-vL-V5-[hTCRb-KACIAH]-F-P2A-SP-CDH6-NOV712-vH-Myc-[hTCRa-CSDVP]-F-F2A-PAC (062816-U01)[서열번호 1242] 및 CD8SP-CDH6-NOV710-vL-V5-[hTCRb-KACIAH]-F-P2A-SP-CDH6-NOV710-vH-Myc-[hTCRa-CSDVP]-F-F2A-PAC (063016-T05)[서열번호 1241] SIR 발현하는 T 세포에 의해, T-UO 세포 또는 배지 단독과 비교하여 SKOV3 표적 세포 용해의 효과적인 유도를 보여주었다.
TROP2에 대한 SIR 발현하는 T 세포가 TROP2-발현하는 PC3 세포에서 세포독성을 유도한다.
TROP2 표적하는 SIR 발현하는 T 세포가 PC3-GLuc 세포와 함께 10 : 1의 E : T 비율로 24시간 동안 배양되었고, GLuc-세포독성 검정법을 사용하여 테스트되었다. 데이타는 CD8SP-TROP2-ARA47-HV3KV3-vL-V5-[hTCRb-KACIAH]-F-P2A-SP-TROP2-ARA47-HV3KV3-vH-Myc-[hTCRa-CSDVP]-F-F2A-PAC (062816-S01)[서열번호 1367] SIR 발현하는 T 세포에 의해, T-UO 세포 또는 배지 단독과 비교하여 PC3 표적 세포 용해의 효과적인 유도를 보여주었다.
GFRA4 (GDNF 패밀리 수용체 알파 4)에 대한 SIR 발현하는 T 세포가 GFRA4-발현하는 TT 세포에서 세포독성을 유도한다.
GFRA4 표적하는 SIR 발현하는 T 세포가 TT-GLuc 세포와 함께 10 : 1의 E : T 비율로 24시간 동안 배양되었고, GLuc-세포독성 검정법을 사용하여 테스트되었다. 데이타는 CD8SP-GFRa4-P4-10-vL-V5-[hTCRb-KACIAH]-F-P2A-SP-GFRa4-P4-10-vH-Myc-[hTCRa-CSDVP]-F-F2A-PAC (062816-W05)[서열번호 1282] SIR 발현하는 T 세포에 의해, T-UO 세포 또는 배지 단독과 비교하여 TT 표적 세포 용해의 효과적인 유도를 보여주었다.
MPL (트롬보포이에틴 수용체)에 대한 SIR 발현하는 T 세포가 MPL-발현하는 HEL-92.1.7 세포에서 세포독성을 유도한다.
MPL 표적하는 SIR 발현하는 T 세포가 HEL-92.1.7-GLuc 세포와 함께 10 : 1의 E : T 비율로 4시간 동안 배양되었고, GLuc-세포독성 검정법을 사용하여 테스트되었다. 결과는 CD8SP-MPL-161-vL-V5-[hTCRb-S57C-opt1]-F-P2A-MPL-161-vH-Myc-[hTCRa-T48C-opt1]-F-F2A-PAC (040315-U02)[서열번호 1112] SIR 발현하는 T 세포에 의해, T-UI 세포 또는 CD8SP-FMC63-vL-V5-[TCRb-S57C-opt1]-F-P2A-SP-FMC63-vH-Myc-[TCRa-T48C-opt1]-F-F2A-PAC (050515-L05)[서열번호 900] SIR 발현하는 T 세포 또는 배지 단독과 비교하여 HEL-92.1.7 표적 세포 용해의 효과적인 유도를 보여주었다.
MPL (트롬보포이에틴 수용체)에 대한 SIR 발현하는 T 세포가 MPL-발현하는 HEL-92.1.7 세포에서 세포독성을 유도한다.
MPL 표적하는 SIR 발현하는 T 세포가 HEL-92.1.7-GLuc 세포와 함께 10 : 1의 E : T 비율로 4시간 동안 배양되었고, GLuc-세포독성 검정법을 사용하여 테스트되었다. 데이타는 CD8SP-MPL-161-vL-V5-[hTCRb-S57C-opt1]-F-P2A-MPL-161-vH-Myc-[hTCRa-T48C-opt1]-F-F2A-PAC (040315-U02)[서열번호 1112] SIR 발현하는 T 세포에 의해, T-UI 세포 또는 CD8SP-FMC63(vL-vH)-Myc-BBz-T2A-PAC (112014-A13)[서열번호 4501] CAR 발현하는 T 세포 또는 배지 단독과 비교하여 HEL-92.1.7 표적 세포 용해의 효과적인 유도를 보여주었다. 표적 세포 용해의 유도는 또한 단일 사슬 SIR, CD8SP-MPL-161-vL-Ser-Gly-링커-MPL-161-vH-Myc-[hTCRa-T48C-opt1]-F-T2A-PAC (040915-X03)[서열번호 1192] 및 CD8SP-MPL-161-vL-Ser-Gly-링커-MPL-161-vH-V5-[hTCRb-S57C-opt1]-T2A-PAC (032415-E07)[서열번호 1193]을 발현하는 T 세포가 HEL-92.1.7 표적 세포와 공동배양될 Ep 관찰되었다. 마지막으로, 단일 사슬 SIR CD8SP-MPL-161-vL-Ser-Gly-링커-MPL-161-vH-Myc-[hTCRa-T48C-opt1]-F-T2A-PAC (040915-X03)[서열번호 1192]을 발현하는 T 세포는 Jurkat-MPL 세포의 용해도 유도하였다. 본 발명의 상이한 scFv가 돌연변이체 TCRα 사슬에 부착된 다른 예시적인 단일 사슬 SIR는 DNA 서열번호 7519 내지 7715 및 16694 내지 16809 그리고 단백질 서열번호 8161 내지 8357 및 16928 내지 17043로 예시되어 있다. 이들 단일 사슬 SIR은 상보적 내인성 TCRβ 사슬이 없이, 바람직하게는 내인성 TCRα 사슬의 발현이 감소되거나 제거되었던 세포에서 발현된다. 본 발명의 상이한 scFv가 돌연변이체 TCRβ 사슬에 부착된 단일 사슬 SIR는 DNA 서열번호 7733 내지 7929 및 16811 내지 16926 그리고 단백질 서열번호 8375 내지 8571 및 17045 내지 17160에 예시되어 있다. 이들 단일 사슬 SIR은 상보적 내인성 TCRα 사슬이 없이, 바람직하게는 내인성 TCRβ1 및 TCRβ2 사슬의 발현이 감소되거나 제거되었던 세포에서 발현된다.
TSLPR (흉선 간질 림포포이에틴 수용체)에 대한 SIR 발현하는 T 세포가 TSLPR-발현하는 Jurkat 세포에서 세포독성을 유도한다.
TSLPR 표적하는 SIR 발현하는 T 세포가 Jurkat-Gluc 세포와 함께 10 : 1의 E : T 비율로 24시간 동안 배양되었고, GLuc-세포독성 검정법을 사용하여 테스트되었다. CD8SP-V5-[hTCRb-KACIAH]-F-P2A-CD8SP-TSLPR-vL-Gly-Ser-링커-TSLPR-vH-Myc-[hTCRa-CSDVP]-F-F2A-PAC (091216-C03)[서열번호 1797] SIR 발현하는 T 세포에 의해, T-UI 세포 또는 배지 단독과 비교하여 Jurkat 표적 세포 용해의 효과적인 유도를 보여주었다.
SSEA4에 대한 SIR 발현하는 T 세포가 SSEA4-발현하는 P19 및 F9 배아 암종 세포에서 세포독성을 유도한다.
SSEA4 표적하는 SIR 발현하는 T 세포가 HEL-92.1.7-Gluc 세포와 함께 10 : 1의 E : T 비율로 24시간 동안 배양되었고, GLuc-세포독성 검정법을 사용하여 테스트되었다. 결과는 CD8SP-V5-[hTCRb-KACIAH]-F-P2A-CD8SP-SSEA4-vL-Gly-Ser-링커-SSEA4-vH-Myc-[hTCRa-CSDVP]-F-F2A-PAC (091516-I06)[서열번호 1776] 및 CD8SP-V5-[hTCRb-KACIAH]-F-P2A-CD8SP-SSEA4-vL-Gly-Ser-링커-SSEA4-vH-Myc4-[preTCRa-Del48]-F-F2A-PAC (091516-K06)[서열번호 1991] SIR 발현하는 T 세포에 의해, T-UI 세포와 비교하여 SSEA4 표적 세포 용해의 효과적인 유도를 보여주었다.
CDH17에 대한 SIR 발현하는 T 세포가 CDH17-발현하는 LoVo 세포에서 세포독성을 유도한다.
CDH7 표적하는 SIR 발현하는 T 세포가 LoVo-GLuc 세포와 함께 10 : 1의 E : T 비율로 24시간 동안 배양되었고, GLuc-세포독성 검정법을 사용하여 테스트되었다. 결과는 CD8SP-CDH17-PTA001A4-vL-V5-[hTCRb-KACIAH]-F-P2A-SP-CDH17-PTA001A4-vH-Myc-[hTCRa-CSDVP]-F-F2A-PAC (062816-X02)[서열번호 1243] SIR 발현하는 T 세포에 의해, T-UI 세포 또는 배지 단독과 비교하여 LoVo 표적 세포 용해의 효과적인 유도를 보여주었다.
메조텔린에 대한 SIR을 발현하는 T 세포가 메조텔린을 발현하는 SKOV3 난소암 세포에서 세포독성을 유도한다.
메조텔린을 표적하는 SIR 발현하는 T 세포가 SKOV3-Gluc 세포와 함께 10 : 1의 E : T 비율로 24시간 동안 배양되었고, GLuc-세포독성 검정법을 사용하여 테스트되었다. 결과는 CD8SP-V5-[hTCRb-KACIAH]-F-P2A-CD8SP-메조텔린-m912-vL-Gly-Ser-링커-m912-vH-Myc4-[preTCRa-Del48]-F-F2A-PAC (090616-E04)[서열번호 1956] SIR 발현하는 T 세포에 의해, T-UI 세포 또는 배지 단독과 비교하여 SKOV3 표적 세포 용해의 효과적인 유도를 보여주었다.
FSHR (난포 자극호르몬 수용체)에 대한 SIR 발현하는 T 세포가 FSHR 발현하는 MDAMB-231 인간 유방암 세포에서 세포독성을 유도한다.
T 세포가 FIHR 표적하는 SIR 발현하는 구조물로 감염되었다. SIR의 항원 결합 도메인은 Gly-Ser 링커를 통해 CGHa (융모생식샘 자극호르몬 알파 사슬) 사슬에 연결된 FSHb (난포 자극호르몬 베타 사슬) 사슬을 포함한다. 세포가 퓨로마이신으로 선별되어 증식되었다. 안정적으로 hGLuc를 발현하는 MDAMB-231 세포가 SIR 발현하는 T 세포 SIR 또는 형질감염되지 않은 T 세포 (T-UI)와 함께 10 : 1의 효과기 : Target (E:T) 비율로 24시간 동안 공동배양되었다. SIR-T 세포 매개된 표적 세포의 용해 유도가 GLuc 활성의 증가에 의해 검정되었다. 결과는 CD8SP-V5-[hTCRb-KACIAH]-F-P2A-CD8SP-FSHb-Gly-Ser-링커-CGHa-Myc4-[preTCRa-Del48]-F-F2A-PAC (091516-N06)[서열번호 1909] SIR 발현하는 T 세포에 의해, T-UI 세포 또는 배지 단독과 비교하여 MDAMB-231 표적 세포 용해의 효과적인 유도를 보여주었다. 결과는 또한 항원 결합 도메인이 이종이량체 사이토카인을 포함하는 SIR이 기능적으로 활성을 갖는 점을 입증한다.
LHR (황체형성 호르몬 수용체)에 대한 SIR 발현하는 T 세포가 LHR-발현하는 MCF7 인간 유방암 세포에서 세포독성을 유도한다.
T 세포가 LHR 표적하는 SIR 구조물을 발현하는 렌티바이러스로 감염되었다. 이러한 SIR의 항원 결합 도메인은 Gly-Ser 링커를 통해 CGHa (융모생식샘 자극호르몬 알파 사슬) 사슬에 연결된 LHb (황체형성 호르몬 베타 사슬) 사슬을 포함한다. 세포가 퓨로마이신으로 선별되어 증식되었다. 안정적으로 hGLuc를 발현하는 MCF7 세포가 SIR 발현하는 T 세포 또는 감염되지 않은 T 세포 (T-UI)와 함께 2 : 1의 효과기 : 표적 (E:T) 비율로 24시간 동안 공동배양되었다. 결과는 CD8SP-V5-[hTCRb-KACIAH]-F-P2A-SP-LHb-Gly-Ser-링커-CGHa-Myc-[hTCRa-CSDVP]-F-F2A-PAC (091616-R03)[서열번호 1735] SIR 발현하는 T 세포에 의해, T-UI 세포 또는 배지 단독과 비교하여 MDAMB-231 표적 세포 용해의 중등도 유도를 보여주었다. 결과는 또한 항원 결합 도메인이 이종이량체 사이토카인을 포함하는 SIR이 기능적으로 활성을 갖는 점을 입증한다.
DLL3 (델타-유사 3)에 대한 SIR 발현하는 T 세포가 DLL3 발현하는 SKMEL31 및 SKMEL37 흑색종 세포에서 세포독성을 유도한다.
DLL3 표적하는 SIR 발현하는 T 세포가 SKMEL31-Gluc 및 SKMEL37-GLuc 세포와 함께 10 : 1의 E : T 비율로 24시간 동안 배양되었고, GLuc-세포독성 검정법을 사용하여 테스트되었다. 데이타는 CD8SP-DLL3-hSC16-13-vL-V5-[hTCRb-KACIAH]-F-P2A-SP-DLL3-hSC16-13-vH-Myc4-[hTCRa-CSDVP]-F-F2A-PAC (071516-N04)[서열번호 1263] SIR 발현하는 T 세포에 의해, T-UI 세포 또는 배지 단독과 비교하여 SKMEL31 및 SKMEL37 표적 세포 용해의 효과적인 유도를 보여주었다.
EGFRvⅢ 돌연변이체에 대한 SIR 발현하는 T 세포가 EGFRvⅢ 발현하는 HeLa 세포에서 세포독성을 유도한다.
CD3 자성 비드를 사용하여 단리된 인간 말초 혈액 T 세포가 EGFRvⅢ 표적하는 SIR 구조물을 발현하는 렌티바이러스로 감염되었다. 세포가 퓨로마이신으로 선별되어 증식되었다. HeLa 세포는 레트로바이러스성 벡터 (MSCV-EGFRvⅢ) 및 GLuc를 발현하는 레트로바이러성 벡터로의 감염에 의해 EGFRvⅢ 및 hGLuc를 발현하도록 조작되었다. Hela-EGFRvⅢ-hGluc 세포가 SIR 발현하는 T 세포 또는 감염되지 않은 T 세포 (T-UI)와 함께 2 : 1의 효과기 : 표적 (E:T) 비율로 24시간 동안 공동배양되었다. SIR-T 세포 매개된 표적 세포의 용해 유도는 GLuc 활성의 증가에 의해 검정되었다. 실험은 CD8SP-V5-[hTCRb-KACIAH]-F-P2A-CD8SP-EGFRvⅢ-2173-vH-Gly-Ser-링커-EGFRvⅢ-2173-vH-Myc4-[preTCRa-Del48]-F-F2A-PAC (090616-D03)[서열번호 1902] SIR 발현하는 T 세포에 의해, T-UI 세포 또는 배지 단독과 비교하여 표적 세포 용해의 효과적인 유도를 보여주었다.
EGFR에 대한 SIR 발현하는 T 세포가 EGFR 발현하는 HeLa 세포에서 세포독성을 유도한다.
EGFR 표적하는 SIR 발현하는 T 세포가 Hela-Gluc 세포와 함께 2 : 1의 E : T 비율로 24시간 동안 배양되었고, GLuc-세포독성 검정법을 사용하여 테스트되었다. 데이타는 CD8SP-세투시맙-vL-V5-[hTCRb-KACIAH]-F-P2A-SP-세투시맙-vH-Myc4-[hTCRa-CSDVP]-F-F2A-PAC (071516-H04)[서열번호 1245] SIR 발현하는 T 세포에 의해, T-UI 세포 또는 배지 단독과 비교하여 EGFR 표적 세포 용해의 유도를 보여주었다.
HIV1 외투 당단백질에 대한 SIR 발현하는 T 세포가 HIV1 외투 당단백질 발현하는 HL2/3 세포에서 세포독성을 유도한다.
CD3 자성 비드를 사용하여 단리된 인간 말초 혈액 T 세포가 HIV1 외투 당단백질을 표적하는 표시된 SIR 구조물을 발현하는 렌티바이러스로 감염되었다. 세포가 퓨로마이신으로 선별되어 증식되었다. HIV1 외투 당단백질을 발현하고 안정적으로 hGLuc를 발현하도록 조작된 HL2/3 세포가 SIR 발현하는 T 세포 또는 감염되지 않은 T 세포 (T-UI)와 함께 2 : 1의 효과기 : 표적 (E:T) 비율로 24시간 동안 공동배양되었다. SIR-T 세포 매개된 표적 세포의 용해 유도가 GLuc 활성의 증가에 의해 검정되었다. 결과는 CD8SP-HIV1-3BNC117-vL-MYC2-[hTCRb-KACIAH]-F-P2A-SP-HIV1-3BNC117-vH-Myc4-[hTCRa-CSDVP]-F-F2A-PAC (091616-Y01-RP)[서열번호 1297] SIR 발현하는 T 세포에 의해, T-UI 세포 또는 배지 단독과 비교하여 HIV1 외투 표적 세포 용해의 유도를 보여주었다.
BST1/CD157 표적하는 SIR이 Molm13 백혈병 세포에 대한 세포독성을 발휘한다.
T 세포가 BST1 표적하는 서열번호 11333 내지 11335를 갖는 SIR을 발현하도록 조작되고, 10 : 1의 E : T 비율로 24시간 공동배양 이후에 Molm13-Gluc 세포에 대한 세포독성이 테스트되었다. 세포독성은 GLuc 검정법에 의해 측정되었다. BST1 표적화 SIR-T 세포는 GLuc 활성의 증가에 의해 측정된 바와 같이 유의한 세포 사망을 유도하는 것으로 확인된다.
IL1RAP 표적하는 SIR이 Molm13 백혈병 세포에 대한 세포독성을 발휘한다.
T 세포가 IL1RAP 표적하는 서열번호 18242, 18248 및 18254를 갖는 SIR을 발현하도록 조작되고, 10 : 1의 E : T 비율로 24시간 공동배양 이후에 Molm13-Gluc 세포에 대한 세포독성이 테스트되었다. 세포독성은 GLuc 검정법에 의해 측정되었다. IL1RAP 표적화 SIR-T 세포는 GLuc 활성의 증가에 의해 측정된 바와 같이 유의한 세포 사망을 유도하는 것으로 확인된다.
SIR-TREG 세포가 SIR-T 세포의 세포독성을 차단한다.
T-Reg 세포가 Miltenyi로부터의 T-Reg 분리 키트 (130-091-301)를 사용하여 제조사의 추천사항에 따라 단리되었다. T-Reg 세포가 라파마이신 100 ng/mL가 보충된 T 세포 배양 배지에서 배양되었다. 모든 T 세포 및 T-Reg 세포가 표시된 CAR 및 SIR 렌티바이러스로 감염되었다. 세포가 퓨로마이신 400 ng/mL으로 선별되었다. CD19 표적하는 CAR 및 SIR을 발현하는 T 및 T-Reg 세포가 RAJI-Gluc 세포와 함께 단독으로 또는 조합하여 10 : 1의 E : T 비율로 4시간 동안 공동배양되었고, 세포독성이 미가공 실렌터라진 (Nanaolight)을 포함하는 0.5× CTZ 검정 완충액을 직접적으로 주사함으로써 측정되었다. 결과는 CD19 표적하는 SIR 발현하는 T-Reg 세포가 SIR 발현하는 T 세포의 세포독성 활성을 부분적으로 차단할 수 있는 점을 보여준다.
합성 면역 수용체를 위한 Jurkat NFAT-GFP 검정법
Jurkat-NFAT-GFP 세포가 NFAT 결합 부위를 보유하는 IL-2 프로모터가 GFP 유전자의 상류에 클론되는 방식으로 조작된다. 이들 세포가 TCR 및 CAR를 통한 신호전달을 연구하는데 사용되어 왔다. 상이한 SIR은 렌티바이러스 매개된 유전자 전달에 의해 Jurkat NFAT-GFP 세포에서 안정적으로 발현되었고, 이후에 퓨로마이신으로의 선별이 이어졌다. SIR 발현하는 Jurkat-NFAT-GFP 세포가 대략 1 : 2의 E : T 비율로 대략 4시간 내지 18시간 동안 공동배양되었다. SIR 및 이들의 표적 항원 간의 상호작용이 NFAT 경로의 활성화를 유도할 때, GFP 발현이 유도된다. 따라서, SIR 발현하는 Jurkat-NFAT-GFP 세포는 SIR의 수용체를 발현하는 표적 세포주와 상호작용할 때 GFP 발현의 수준 증가를 보여준다.
상이한 SIR 구조물을 발현하는 Jurkat-NFAT-GFP 세포 및 상이한 표적 세포의 공동배양에 의한 GFP 발현의 유도는 필수적으로 이전에 기술된 바와 같이 연구되었다 (Wu, Roybal, Puchner, Onuffer, & Lim, 2015). GFP 발현은 FACS 분석법에 의해 모니터링되었다. 이러한 검정법의 소수 예시적인 예는 도 13a 내지 13d에 도시되어 있다. 패널 A에서, 대조군 Jurkat-NFAT-GFP 세포 또는 CD19 표적하는 SIR ㅂ발현하는 세포 (클론 번호 051716-I08), MPL (클론 번호 040716-A07) 및 BCMA (클론 번호 011116-A07)가 각각 RAJI (최상부), HEL (중간) 또는 U266 (바닥) 세포와 함께 배양되었다. GFP 발현의 유도가 SIR 발현하는 Jurkat-NFAT-GFP 세포의 이들 각각의 표적 세포와 공동배양 시 분명하다. 패널 B에서, CDH6 표적하는 SIR 발현하는 Jurkat 세포 (클론 번호 051716-J05), CD276 (클론 번호 050516-Q06) 및 Her2/neu (클론 번호 050516-I03)는 각각 SKOV3 (최상부) 및 MC7 (중간 및 바닥)과 공동배양되었다. GFP 발현의 유도가 SIR 발현하는 Jurkat-NFAT-GFP 세포의 이들 각각의 표적 세포와 공동배양 시 분명하다. Jurkat-NFAT-GFP 세포는 다른 항원을 표적하는 상이한 SIR을 발현하도록 조작되었고, 실험은 이들 각각의 표적 항원을 발현하는 표적 세포와의 공동 배양 시 반복되었다. Jurkat-NFAT-GFP (모체) 세포가 대조군으로서 사용되었다. 상이한 SIR로의 결과는 다음의 표 10A에 요약되어 있다. 상이한 SIR, 이들의 서열번호, 항원 결합 도메인의 성분 및 TCR 사슬의 명칭이 표 7A 내지 7H와 관련하여 결정될 수 있다. SIR은 SIR 발현하는 Jurkat-NFAT-GFP 세포가 표적 세포와 배양될 때 모체 Jurkat-NFAT-GFP 세포와 비교하여 더 큰 GFP 양성 세포%를 나타내는 경우 검정법에서 양성으로 고려된다. 따라서, 서열번번호 1207로 예시되는 SIR을 발현하는 Jurkat-NFAT-GFP 세포는 LAN5 세포와 공동배양될 때 모체 Jurkat-NFAT-GFP 세포와 비교하여 GFP 발현의 더 큰 유도를 나타내지만, Karpass 299, SUDHL-1 또는 H460 세포주와 공동배양될 때눈 더 큰 GFP 유도를 나타내지 않았다. 세포주의 명칭 뒤의 기호 +/-, +, 2+ 등은 SIR 발현하는 Jurkat-NFAT-GFP 세포의 해당 세포주와의 배양 이후에 GFP 양성 세포%로 측정된 바 Jurkat-NFAT-GFP 검정법 상의 상대적인 양성도를 나타낸다. 결과는 동일한 항체 (예로, FMC63)로부터 유래된 결합 도메인을 포함하는 상이한 SIR이 존재하고, 이러한 검정법을 사용하여 이들의 제작 시의 TCR 사슬 및 링커에 의존하여 동일한 세포주에 노출될 때 NFAT 신호전달을 활성화하는 이들의 능력의 굉장한 다양성을 나타내는 점을 입증한다. 또한, 동일한 표적 세포주에 대한 반응의 큰 다양성은 심지어 SIR이 동일한 TCR 사슬 및 링커를 공유할 때 동일한 항원을 표적하는 상이한 항원 결합 도메인을 포함하는 SIR (예로, 상이한 CD19 항체로부터 유래된 항원 결합 도메인을 갖는 SIR)을 발현하는 Jurkat 세포로도 관찰된다. 마지막으로, 상이한 항원 (예로, CD19 대 CD20)을 표적하는 SIR을 발현하는 Jurkat 세포가 동일한 표적 세포주에 노출될 때 반응의 다양성을 보여준다. 따라서, 다양한 면역 반응은 SIR을 상이한 TCR 사슬, 링커, 항원 결합 도메인 및 표적 특이성과 조합함으로써 단일 표적 세포에 대해 생성될 수 있다. 표 10A는 이들의 표적 세포주에 노출될 때 상이한 SIR로 관찰된 GLuc 기반의 T 세포 세포독성 검정법의 결과를 또한 요약하고 있다. 기호 +/-, + 및 2+ 등은 SIR 발현하는 T 세포와 표적 세포주의 4 내지 96시간 공동배양 이후에 GLuc 세포독성 검정법을 사용하여 관찰된, 대조군 T 세포, 예로 SIR이 없거나 부적절한 SIR (예로, 특정한 표적 세포주 상에 발현되지 않은 항원을 표적하는 SIR)을 발현하는 T 세포와 비교하여, 검정법이 유사한 조건 하에 수행될 때 세포독성의 정도를 가리킨다. 다시 Jurkat-NFAT-GFP 세포로 획득된 결과와 유사하게, 상이한 SIR을 발현하는 T 세포는 이들의 TCR 사슬, 링커, 항원 결합 도메인, 표적 특이성 및 표적 세포주에 의존하여 이들의 표적 항원을 발현하는 세포에 노출될 때 세포독성을 발휘하는 이들의 능력에서 큰 다양성을 보여준다. 사이토카인 생산 (예로, IL2, TNFα 및 IFNγ)을 유도하는 능력에서 유사한 다양성이 이들이 비슷한 조건 하에 표적 세포주에 노출될 때 이들의 TCR 사슬, 링커, 항원 결합 도메인, 표적 특이성 및 표적 세포주에 의존하여 상이한 SIR 발현하는 T 세포 중에서 관찰되었다. 그러나, 이들의 표적 세포에 노출될 때 SIR-T 세포에 의한 사이토카인 생산은 검정법이 유사한 조건 하에 수행될 때 비슷한 CAR-T 세포로 관찰된 생산보다 일반적으로 더 낮았다. 동일한 항원 결합 도메인을 포함하지만 상이한 TCR 사슬 및 링커를 포함하는 상이한 SIR을 발현하는 T 세포도 역시 유사한 조건 하에 검정될 때 증식 및 소모 마커의 발현에서 차이를 보여주었다.
표 10A는 또한 41BB 또는 CD28로부터 유래된 조건부 보조자극 도메인이 있거나 없는 CD3z 사슬의 세포외, 막통과 및 세포질 도메인과 TCRα 및 TCRβ 사슬의 세포외 도메인의 융합을 포함하는 SIR로의 결과를 요약하고 있다. FMC63 결합 도메인에 기초한 이러한 유형의 예시적인 SIR은 CD8SP-FMC63-vL-TCRb-KAC-ECD-Bam-CD3zECDTMCP-opt-F-P2A-SP-FMC63-vH-hTCRa-CSDVP-ECDn-CD3zECDTMCP-opt2-F-F2A-PAC (서열번호 10554)이다. 이러한 구조물에서, FMC63의 vL 단편은 TCRb-KAC-ECD-Bam-CD3zECDTMCP-opt 사슬 (서열번호 12402)에 부착되는 한편, FMC63의 vH 단편은 hTCRa-CSDVP-ECDn-CD3zECDTMCP-opt2 사슬 (서열번호 12422)에 부착된다. 이러한 SIR은 Jurkat-NFAT-GFP 검정법에서 강한 양성이었지만, 용해성 CD19-NLuc 융합 단백질에 대한 결합으로 측정된 바 낮은 항원 결합 활성을 보여주었다. 유사한 설계이지만 TCRa 및 TCRb 사슬의 상이한 변이체를 갖는 여러 다른 구조물은 서열번호 10552 내지 10557로 예시되고, Jurkat-NFAT-GFP 검정법 및 T 세포 세포독성 검정법에서 강하지만 다양한 수준의 활성을 보여주었다. SIR 구조물 CD8SP-FMC63-vL-hTCRaECDn-CD3zECDTMCP-opt2-F-F2A-SP-FMC63-vH-TCRbECD-Bam-CD3zECDTMCP-opt-F-P2A-PAC (서열번호 10564)에서, FMC63 vL 단편은 TCRaECDn-CD3zECDTMCP-opt2 사슬 (서열번호 12421)에 부착되는 한편, FMC63 vH 단편은 TCRbECD-Bam-CD3zECDTMCP-opt (서열번호 12401)에 부착된다. 이러한 구조물도 역시 Jurkat-NFAT-GFP 검정법에서 강한 양성을 보여주었다. 두 개 사슬 각각의 CD3z 세포질 도메인에 삽입된 41BB로부터의 보조자극 도메인을 포함하는 구조물 CD8SP-FMC63-vL-TCRbECD-Bam-CD3zECDTMCP-BBz-opt-F-P2A-SP-FMC63-vH-Myc4-hTCRaECDn-CD3zECDTMCP-BBz-opt2-F-F2A-PAC (서열번호 10565)도 역시 Jurkat-NFAT-GFP 검정법에서 활성을 갖는다. 구조물 (서열번호 10563)은 설계에서 서열번호 10565와 유사하지만 이의 사슬 중 하나만이 41BB 보조자극 도메인을 포함한다. 이러한 구조물도 역시 Jurkat-NFAT-GFP 검정법에서 활성을 갖는다. 마지막으로, 하나의 사슬 상에 CD28 보조자극 도메인을 포함하는 구조물 CD8SP-FMC63-vL-V5-TCRbECD-Bam-CD3zECDTMCP-opt-F-P2A-SP-FMC63-vH-Myc-hTCRaECDn-CD3zECDTM-28z-opt2-F-F2A-PAC (서열번호 10557)도 역시 Jurkat-NFAT-GFP 검정법에서 활성을 갖는다.
동일한 항원 결합 도메인을 포함하는 SIR의 다양한 풀을 생성하는 능력을 입증하기 위하여, FMC63 기반의 항원 결합 도메인이지만 상이한 TCR 사슬 및 링커를 포함하는 SIR을 안정적으로 발현하는 Jurkat-NFAT-GFP 세포는 1) CD19-GGSG-NLuc-AcV5 융합 단백질에 결합하고 (예로, 항원 결합에 대한 검정); 2) RAJI 세포와의 18시간 공동배양 시 GFP 발현을 유도하고 (예로, 세포 신호전달의 검정); 3) RAJI 세포와의 18시간 공동배양 시 IL2 생산을 유도하고 (예로, 사이토카인 생산의 검정); 4) APC-컨쥬게이션된 프로테인-L로의 염색되는 (예로, 세포 표면 발현의 척도) 이들의 능력이 비교되었다. 결과는 표 10B에 요약되어 있고, 상기 검정법으로 동일한 항원 결합 도메인을 갖는 SIR 중에서의 거대한 다양성을 입증한다. 이들의야생형 뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩된 TCRα 및 TCRβ 사슬을 포함하는 구조물 서열번호 992는 CD19-GGSG-NLuc 결합, GFP 유도 및 프로테인 L 염색의 가장 낮은 수준을 보여주었다. 안정적으로 CD8SP-FMC63(vL-vH)-Myc-BBzT2A-PAC (서열번호 4501) CAR를 발현하는 Jurkat-NFAT-GFP 세포는 IL2 생산 및 프로테인-L 염색의 검정법으로의 비교를 위해 포함되었다. 현저하게, CAR가 SIR 모두와 비교하여 탁월하게 높은 IL2 생산 (1159 pg/mL) 및 프로테인-L 염색 (61%)을 보여주었다.
동일한 항원을 표적하지만 상이한 항원 결합 도메인을 포함하는 SIR의 다양성
심지어 더 큰 다양성을 갖는 특정한 표적에 대한 SIR을 생성하기 위하여, CD19 표적하는 여러 SIR이 상이한 항체로부터 유래된 항원 결합 도메인을 사용하여 생성되었다. 이들 SIR은 또한 이들의 TCR 도메인, 링커 및 항원 결합 도메인의 형식이 상이하였다. 상응하는 CAR (예로, SIR에 존재하는 것과 동일한 항원 결합 도메인을 포함하는 CAR)도 역시 생성되었다. 상이한 SIR 및 CAR이 Jurkat-NFAT-GFP 세포 내로 안정적으로 형질도입되었고, 결과로 얻은 세포는 RAJI 세포와 밤생 공동배양 시 CD19-GGSG-NLuc-AcV5에 결합하고, NFAT 신호전달을 활성화하는 이들의 능력에 대해 비교되었다. 표 9C는 상이한 CD19 항원 결합 도메인을 포함하는 상이한 SIR 및 CAR 중에서 표적 세포에 노출 시 CD19에 결합하고 NFAT 신호전달을 활성화하는 이들의 능력에 대한 유의한 다양성을 입증한다. TCRα 및 TCRβ 사슬의 야생형 뉴클레오티드 서열을 포함하는 Bu12 항체 기반의 SIR CD8SP-CD19Bu12-vL-V5-[hTCRb-WT]-F-P2A-CD19Bu12-vH-Myc-[hTCRa-WT]-F-F2A-PAC (서열번호 1038)은 매우 적은 CD19 결합 및 가장 낮은 NFAT 신호전달을 보여주었다. 상이한 SIR 중에는 CD19에 결합하고 NFAT 신호전달을 활성화하는 이들의 능력에서 거대한 차이가 또한 존재하였고, 이둘 두 가지 매개변수가 상이한 항원 결합 도메인을 포함하는 SIR 중에서 비교될 때 직접적으로 상관되지는 않았다. 따라서, 서열번호 11240로 예시된 SIR이 서열번호 10815 및 11245로 예시된 SIR과 비교하여 거의 10배 높은 CD19-NLuc-AcV5 결합이지만 더 낮은 NFAT-신호전달을 보여주었다. 이들 결과는 다양한 입양 면역 반응을 생성하기 위한 다양한 성질을 갖는 SIR 풀을 발현하는 면역 효과기 세포를 생성하는 능력을 입증한다. SIR을 발현하는 면역 효과기 세포는 훨씬 더 많은 다양한 면역 반응을 생성하기 위한 CAR 및 다른 키메라 면역 수용체를 발현하는 면역 세포와 조합될 수 있다.
SIR이 CAR와 비교하여 항원 결합은 더 낮지만 비슷한 NFAT 신호전달을 나타낸다.
SIR CD8SP-FMC63-vL-V5-[hTCRb-KACIAH]-F-P2A-SP-FMC63-vH-Myc-[hTCRa-CSDVP]-F-F2A-PAC (010616-C01)[서열번호 1200] 및 CAR CD8SP-FMC63(vL-vH)-Myc-BBz-T2A-PAC (112014-A13)[서열번호 4501]을 발현하는 Jurkat-NFAT-GFP 세포가 모체 Jurkat-NFAT-GFP 세포와 함께 RAJI 세포에 밤샘 노출 이후에 NFAT 유도된 GFP 발현에 대해 테스트되었다. SIR (서열번호 1200) 및 CAR (서열번호 4501)을 발현하는 세포는 모체 세포와 비교하여 비슷하고 유의하게 더 높은 GFP 유도를 유도하는 것으로 나타나고, SIR 및 CAR 둘 다에 의한 NFAT 신호전달의 효과적인 유도를 입증한다. 세포가 후속적으로 CD19-GGSG-NLuc 결합 검정법을 사용하여 세 벌씩 항원 결합에 대해 테스트되었다. 모체 Jurkat 세포로의 평균 NLuc 결합 활성이 93인 한편, SIR (서열번호 1200) 및 CAR (서열번호 4501)을 발현하는 Jurkat 세포는 각각 16422 및 186567의 NLuc 평균값을 나타낸다. 따라서, 둘 다가 표적 항원에 노출될 때 상응하는 CAR (서열번호 4501)와 거의 등등한 NFAT 신호전달 활성을 갖는 서열번호 1200의 SIR을 발현하는 Jarkat 세포는 거의 10배 더 낮은 결합 친화도를 나타낸다.
Bu12 기반의 SIR이 비슷한 Bu12 CAR와 비교하여 유의하게 더 낮은 세포 표면 발현을 나타낸다.
T 세포의 표면 상의 CAR의 발현 증가는 자가-응집, 긴장성 신호전달 및 세포의 조기 소모를 유도하는 것으로 알려져 있다. 인간 말단 T 세포가 CD19 표적하는 Bu12 기반의 SIR (CD8SP-CD19Bu12-(vL-vH)-Myc-BBz-T2A-PAC (서열번호 4503) 및 비슷한 CAR (CD8SP-CD19Bu12-vL-V5-[TCRb-S57C-opt1]-F-P2A-SP-CD19Bu12-vH-Myc-[TCRa-T48C-opt1]-F-F2A-PAC (070215-M03)[서열번호 1021]를 인코딩하는 렌티바이러스로 감염되었다. 세포가 퓨로마이신으로 선별되어 증식되었다. SIR 및 CAR을 발현하는 세포는 RAJI-GLuc 세포에 대한 효과적인 세포독성을 나타내었다. T 세포는 또한 SIR 및 CAR의 세포 표면 발현을, Myc 태그에 대한 항체 및 바이오틴화된 프로테인 L로의 염색, 이어서 APC-컨쥬게이션된 스트렙트아비딘 프로테인 L을 사용하여 조사되었다. 도 16은 SIR (서열번호 1021)을 발현하는 T 세포가 둘 중 하나의 방법으로 측정될 때 상응하는 CAR (서열번호 4503)을 발현하는 T 세포와 비교하여 유의하게 더 낮은 세포 표면 발현을 나타내는 점을 보여준다.
SIR-T 세포가 상응하는 CAR-T 세포와 비교하여 더 낮은 TNFα 생산을 나타낸다.
T 세포가 CAR CD8SP-FMC63-vL-Gly-Ser-링커-FMC63-vH-Myc-CD8TM-BBz (서열번호 9659) 및 상응하는 SIR (CD8SP-FMC63-vL-[hTCRa-CSDVP]-F-F2A-SP-FMC63-vH-[hTCRb-KACIAH]-F-P2A-PAC (서열번호 10596)을 발현하도록 조작된다. 세포가 Nalm6 및 BV173 표적 세포주와 함께 37℃에서 24시간 동안 공동배양되고, TNFα 생산의 유도가 ELISA에 의해 측정된다. CAR 발현하는 T 세포는 SIR-T 세포와 비교하여 TNFα 생산의 더 큰 배수 증가를 유도하는 것을 보여준다. SIR-T 및 CAR-T 세포 둘 다는 표적 세포주에 대해 유의한 세포독성을 유도하는 것을 보여준다.
SIR을 발현하는데 두 개의 벡터의 사용.
선행하는 실험에서, SIR의 두 개 폴리펩티드 작용 단위 (FPU)가 단일 벡터를 사용하여 발현되었다. 다음으로, SIR의 두 개 FPU가 두 개의 상이한 벡터를 사용하여 발현될 수 있는지 여부가 테스트되었다. SIR 렌티바이러스성 구조물 050216-T02 및 050216-S08는 CD19 단일클론 항체 FMC63으로부터 유래된 vH 단편이 V5 링커를 통해 KACIAH 돌연변이를 갖는 hTCRb의 불변 사슬에 연결되는 SIR 단편 CD8SP-FMC63-vL-V5-[hTCRb-KACIAH]-F-P2A-PAC을 인코딩하는 서열번호 913에 상응하는 SIR 서열을 포함한다. 이러한 SIR FPU가 F-P2A 절단가능한 링커를 통해 PAC (퓨로마이신 저항성) 유전자에 연결된다. 050216-T02 구조물을 위한 벡터는 pLenti-EF1α-DWPRE (서열번호 871)인 한편, 050216-S08를 위한 벡터는 pLenti-EF1α (서열번호 870)이다. SIR 렌티바이러스성 구조물 041916-A02 및 041916-B03은 CD19 단일클론 항체 FMC63으로부터 유래된 vH 단편이 MYC 링커를 통해 CSDVP 돌연변이를 갖는 hTCRa의 불변 사슬에 연결되는 SIR 단편 CD8SP-FMC63-vH-MYC-[TCRα-CSDVP]-F-F2A-BlastR을 인코딩하는 서열번호 997에 상응하는 SIR 서열을 포함한다. 이러한 SIR FPU가 F-F2A 절단가능한 링커를 통해 블라스티시딘 저항성 유전자에 연결된다. 041916-A02 구조물을 위한 벡터는 pLenti-EF1α-DWPRE (서열번호 871)인 한편, 041916-B03을 위한 벡터는 pLenti-EF1α (서열번호 870)이다. Jurkat-NFAT-GFP 세포가 050216-S08로 감염되었고, 퓨로마이신으로 선밸되었다. Jurkat-NFAT-GFP 세포는 또한 041916-A02 및 041916-B03 구조물로 감염되었고, 블라스티시딘으로 선밸되었다. 마지막으로, Jurkat-NFAT-GFP 세포가 050216-S08으로 감염되었고, 퓨로마이신으로 선별 시 041916-A02 또는 041916-B03 구조물 둘 중 하나로 감염되었고, 블라스티시딘으로 선별되어 SIR의 둘 다의 FPU를 발현하는 세포를 선별하였다. 단일하게 또는 이중으로 감염된 세포는 NLuc-결합 검정법을 사용하여 CD19-GGS-Nluc에 대한 결합이 테스트되었다. 결과는 구조물 050216-S08[서열번호 913], 041916-A02[서열번호 997] 또는 041916-B03[서열번호 997] 구조물 단독으로 감염된 Jurkat-NFAT-GFP 세포가 CD19-GGS-NLuc와 임의의 유의한 결합을 나타내지 않는 점을 보여주었다. 대조적으로, 구조물 050216-S08 플러스 041916-A02[서열번호 997] 및 050216-S08[서열번호 913] 플러스 041916-B03[서열번호 997]로 감염된 Jurkat-NFAT-GFP 세포는 CD19-GGS-NLuc와의 강한 결합을 나타내었다. 구조물 050216-S08[서열번호 913] 플러스 041916-A02[서열번호 997] 및 050216-S08[서열번호 913] 플러스 041916-B03[서열번호 997]도 역시 RAJI 표적 세포와 공동배양될 때 GFP 발현의 강한 유도를 나타내는 한편 단일하게 구조물로 간염된 Jurkat-NFAT-GFP 세포는 이러하지 못하였다. 이들 결과는 SIR의 두 개 FPU가 두 개의 상이한 벡터를 사용하여 발현될 수 있고, 이중으로 감염된 세포에서 기능적 수용체를 만들도록 조립될 수 있는 점을 입증한다. TCRb 사슬 (hTCRb-S57C-opt)에 V5 링커를 통해 연결된 본 발명의 상이한 vL 단편을 발현하는 예시적인 SIR 구조물은 DNA 서열번호 8803 내지 8978 및 17162 내지 17277 그리고 단백질 서열번호 9231 내지 9406 및 17396 내지 17511에 예시되어 있다. TCRa 사슬 (hTCRa-T48C-opt)에 Myc 링커를 통해 연결된 본 발명의 상이한 vH 단편을 발현하는 예시적인 상응하는 SIR 구조물은 DNA 서열번호 9017 내지 9191 및 17279 내지 17394 그리고 단백질 서열번호 9445 내지 9619 및 17513 내지 17628에 예시되어 있다.
SIR의 발현을 위한 레트로바이러스성 벡터의 사용
다수의 SIR 삽입물이 Nhe I 및 Sal I 효소로의 소화에 의해 렌티바이러스성 벡터로부터 절단되었고, AvrⅡ 및 Sal I 소화된 레트로바이러스성 벡터 MSCV-Bgl2-AvrⅡ-Bam-EcoR1-Xho-BstB1-Mlu-Sal-ClaI.I03 (서열번호 872) 내로 서브클론되었다. 삽입물의 클론 번호, 서열번호 및 명칭은 다음의 표 11에 나타낸다.
상기 구조물은 상응하는 레트로바이러스를 생성하는데 사용되었고, 다음으로 이는 Jurkat-NFAT-GFP 세포를 감염시키는데 사용되었다. 감염된 세포가 퓨로마이신으로 선별되어 다양한 검정법으로 SIR 발현 및 활성을 테스트하는데 사용되었다. 상기 구조물로 감염된 Jurkat-NFAT-GFP 세포는 상응하는 표적 세포주와의 공동배양 시 GFP 유도를 나타내었다. 이들 결과는 레트로바이러스성 벡터가 본 발명의 SIR을 발현하는데 사용될 수 있는 점을 입증한다. 예시적인 구조물 (서열번호 1212)로의 결과는 도 14에 도시한다.
SIR의 발현을 위한 슬리핑 뷰티 트랜스포존 벡터
다수의 SIR 삽입물이 Age I 및 Xba I 효소로의 소화에 의해 렌티바이러스성벡터로부터 절단되었고, Age I 및 Xba I 소화된 슬리핑 뷰티 트랜스포존 벡터 pSBbi-Pur (서열번호 874) 내로 서브클론되었다. 결과로 얻은 구조물은 트랜스포자제 인코딩 벡터 pCMV/SB10 (Addgene Plasmid #24551)와 함께 Jurkat-NFAT-GFP 세포 내로 감염되었다. 세포가 상기와 같이 퓨로마이신으로 선별되어 증식되었다. 다음의 도 15에서 도시된 바와 같이, 구조물 pSBbi-puro-FMC63vL-V5-[TCRb-KACIAH]-F-P2A-FMC63vH-MYC-[TCRa-CSDVP]-F-F2A [010616-B01](서열번호 875)로 형질감염된 Jurkat-NFAT-GFP 세포는 상응하는 RAJI 표적 세포주와 공동배양 시 GFP 유도를 나타내었다. 이들 결과는 슬리핑 뷰티 트랜스포존이 본 발명의 SIR을 발현하는데 사용될 수 있는 점을 입증한다.
SIR의 발현을 위한
시험관내
전사된 (IVT) RNA의 사용
SIR을 인코딩하는 RNA를 생성하는 IVT는 필수적으로 기술된 바와 같이 수행된다 (Zhao Y, et al, MOLECULAR THERAPY Vol. 13, No. 1, 2006). mMESSAGE mMACHINE 고수율 캡핑된 RNA 전사 키트 (Invitrogen)가 IVT RNA를 생성하는데 사용되었다. IVT RNA가 RNeasy 미니키트 (Qiagen, Inc., Valencia, CA, USA)를 사용하여 정제되었고, 정제된 RNA는 RNase 없는 물에서 1 내지 0.5 μg/mL로 용출되었다. 자극되지 않은 PBMC의 전기천공을 위해, 세포 (0.1 mL)가 CD19 표적하는 SIR CD8SP-FMC63-vL-V5-[hTCRb-KACIAH]-F-P2A-SP-FMC63-vH-Myc-[hTCRa-CSDVP]-F-F2A-PAC (102615-C08)[서열번호 1200]을 인코딩하는 5 μg의 RNA로 전기천공되었다. 세포 및 큐벳은 전기천공 이전에 5분 동안 얼음 상에 놓아 사전 냉각된다. 후속적으로, 0.05 내지 0.2 mL의 세포가 2 μg/1 × 106개 T 세포의 IVT RNA (또는 표시된 바와 같이)와 혼합되고, 2 mm 큐벳 (Harvard Apparatus BTX, Holliston, MA, USA)에서 ECM830 전기 스퀘어 웨이브 천공기 (Harvard Apparatus BTX)를 사용하여 전기천공된다. 전기천공 직후에, 세포가 300 IU/mL IL-2를 갖는 신선한 CM으로 이전되고, 37℃에서 배양된다. SIR을 인코딩하는 IVT RNA로 전사된 세포가 48 내지 72시간 이후에 검정된다. SIR 형질감염된 세포는 CD19-GGS-NLuc 융합 단백질에 대한 결합 증가 및 RAJI-GLuc 표적 세포의 용해 증가를 나타낸다.
CD19 표적하는 SIR의
생체내
효능.
CD3 자성 비드를 사용하여 단리된 인간 말초 혈액 T 세포가 CD8SP-FMC63-vL-V5-[hTCRb-WT]-F-P2A-SP-FMC63-vH-Myc-[hTCRa-WT]-F-F2A-PAC (080815-F02)[서열번호 922], CD8SP-FMC63-vL-V5-[mTCRb-opt]-F-P2A-SP-FMC63-vH-Myc-[mTCRa-opt]-F-F2A-PAC (080815-B06)[서열번호 953], CD8SP-FMC63-vL-V5-[hTCRb-KACIAH]-F-P2A-SP-FMC63-vH-Myc-[hTCRa-CSDVP]-F-F2A-PAC (081415-D06)[서열번호 992] SIR 구조물 및 구아시아 루시퍼라제의 비-분비성 형태를 인코딩하는 Gluc-PAC-G07 대조군 구조물을 발현하는 렌티바이러스로 감염되었다. 대략적으로 세포의 절반이 퓨로마이신으로 선별되는 한편, 나머지 절반은 퓨로마이신 선별이 없이 증식되었다. NSG 마우스 (Jackson Lab)가 치사량 이하로 175 cGy의 용량에서 방사선 조사되었다. 대략적으로 방사선 조사후 24시간 (2일)째, 마우스에게 꼬리 정맥을 통해 2.5 × 104개의 RAJI 세포를 주사하였다. 3일째, 마우스 (각각의 실험군의 경우 n = 5)가 표시된 SIR 인코딩 렌티바이러스 또는 Gluc-PAC-G07 구조물로 감염되었던 5백만 개의 T 세포 (50% 퓨로마이신 선별됨 + 50% 미선별됨)로 처리되었다. 대조군 마우스 (n = 5)는 T 세포 없음 또는 감염되지 않은 T 세포를 수여받았다. 마우스에게 인간 IL2 (복강내로 400 IU)을 대조군에서 마우스 모두의 사망 시까지 주사 다음 날에 주었다. 표 12는 각각의 실험군에서 마우스의 생존을 나타낸다. TCRb 및 TCRa 불변 사슬 둘 다가 이들의 야생형 뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩되는 FMC63 기반의 SIR (080815-F02)은 생존을 부여하지 못하는 한편, 코돈 최적화된 마우스 TCRb 및 TCRa 불변 사슬 서열을 포함하는 SIR 구조물 (080815-B06)[서열번호 953]는 생존 장점을 부여하였다. 유사하게, 코돈 최적화된 마우스화 인간 TCRb 및 TCRa 불변 사슬 서열을 포함하는 SIR 구조물 (081415-D06)[서열번호 992]도 생존 장점을 부여하였다.
CD3 자성 비드를 사용하여 단리된 인간 말초 혈액 T 세포가 표시된 SIR 구조물 (040315-U02)[서열번호 1112], (050515-L05)[서열번호 900], (082815-G07)[서열번호 1620], (082815-E05)[서열번호 1622] 및 (091015-Y08)[서열번호 926]을 발현하는 렌티바이러스로 감염되었다. 대략적으로 세포의 절반이 퓨로마이신으로 선별되는 한편, 나머지 절반은 퓨로마이신 선별이 없이 증식되었다. NSG 마우스 (Jackson Lab)가 치사량 이하로 175 cGy의 용량에서 방사선 조사되었다. 대략적으로 방사선 조사후 24시간 (2일)째, 마우스에게 꼬리 정맥을 통해 2.5 × 104개의 RAJI 세포를 주사하였다. 3일째, 마우스 (각각의 실험군의 경우 n = 5)가 표시된 SIR 인코딩 렌티바이러스로 감염되었던 5백만 개의 T 세포 (50% 퓨로마이신 선별됨 + 50% 미선별됨)로 처리되었다. 대조군 마우스 (n = 5)는 T 세포 없음 또는 감염되지 않은 T 세포를 수여받았다. 마우스에게 인간 IL2 (복강내로 400 IU)를 대조군에서 마우스 모두의 사망 시까지 주사 다음 날에 주었다. 표 13은 각각의 실험군에서 마우스의 생존을 나타낸다. TCRb 및 TCRa 불변 사슬 둘 다가 코돈 최적화된 뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩되고, 사슬 쌍 형성을 촉진하도록 아미노산 치환을 보유하는 이중 사슬 FMC63 기반의 SIR (050515-L05)[서열번호 900]은 생존 장점을 부여하였다. 중요한 점은, 야생형 TCRb 불변 사슬에 융합된 FMC63-vL 및 preTCRa-Del48 사슬에 융합된 FMC63-vHFMF 포함하는 이중 사슬 SIR 구조물 (091015-Y08)[서열번호 926]이 훨씬 더 큰 생존 장점을 부여하였다 (생존 중간값 = 31일).
TCRb-KACIAH 불변 사슬이 이에 융합된 임의의 vL (또는 vH) 단편을 갖지 않고, FMC63-유래된 scFV 단편 (vL-링커-vH)이 CRa-CSDVP에 융합되어 발현되는 (082815-G07)[서열번호 1620] 구조물은 훨씬 더 큰 생존 장점을 부여하였다 (생존 중간값 = 34일). 마지막으로, TCRb-KACIAH 불변 사슬이 이에 융합된 임의의 vL (또는 vH) 단편을 갖지 않고, CD19-Bu12-유래된 scFV 단편 (vL-링커-vH)이 TCRa-CSDVP에 융합되어 발현되는 (082815-E05)[서열번호 1622] 구조물도 훨씬 더 큰 생존 장점을 부여하였다 (생존 중간값 = 36일).
CD3 자성 비드를 사용하여 단리된 인간 말초 혈액 T 세포가 CD8SP-FMC63-vL-V5-[TCRb-S57C-opt1]-F-P2A-SP-FMC63-vH-Myc-[TCRa-T48C-opt1]-F-F2A-PAC (050515-L05)[서열번호 900] SIR 구조물을 발현하는 렌티바이러스로 감염되었다. NSG 마우스 (Jackson Lab)가 치사량 이하로 175 cGy의 용량에서 방사선 조사되었다. 대략적으로 방사선 조사후 24시간 (2일)째, 마우스에게 꼬리 정맥을 통해 2.5 × 104개의 RAJI 세포를 주사하였다. 3일째, 마우스 (각각의 실험군의 경우 n = 5)가 표시된 CD8SP-FMC63-vL-V5-[TCRb-S57C-opt1]-F-P2A-SP-FMC63-vH-Myc-[TCRa-T48C-opt1]-F-F2A-PAC (050515-L05)[서열번호 900] SIR 인코딩 렌티바이러스로 감염되었던 5백만 개의 T 세포로 처리되었다. 대조군 마우스 (n = 5)는 5백만 개의 감염되지 않은 T 세포로 주사되었거나 T 세포가 주어지지 않았다. 표는 각각의 실험군에서 마우스의 생존 중간값을 나타낸다. RAJI 세포 단독 및 감염되지 않은 T 세포가 주어진 마우스의 생존 중간값은 22일이었다. 대조적으로, (050515-L05) [서열번호 900]-SIR T 세포가 주어진 마우스의 생존 중간값은 27일이었고, 이는 유의하게 증가되었다. 따라서, (050515-L05) [서열번호 900]-SIR을 발현하는 T 세포의 주입이 림프종의 이러한 RAJI 이종이식 모델에서 T 세포가 없거나 감염되지 않은 T 세포가 주어진 마우스와 비교하여 마우스 생존에서 유의한 개선을 유도하고 있다.
CD3 자성 비드를 사용하여 단리된 인간 말초 혈액 T 세포가 CD8SP-FMC63-vL-V5-[TCRb-S57C-opt1]-F-P2A-SP-FMC63-vH-Myc-[TCRa-T48C-opt1]-F-F2A-PAC (050515-L05)[서열번호 900] 및 CD8SP-CD19Bu12-vL-V5-[TCRb-S57C-opt1]-F-P2A-SP-CD19Bu12-vH-Myc-[TCRa-T48C-opt1]-F-F2A-PAC (070215-M03)[서열번호 1021] SIR 구조물을 발현하는 렌티바이러스로 감염되었다. 대조군 SIR CD8SP-MPL-161-vL-V5-[TCRb-S57C-opt1]-F-P2A-MPL-161-vH-Myc-[TCRa-T48C-opt1]-F-F2A-PAC (040315-U02)[서열번호 1112] SIR을 발현하는 T 세포가 대조군으로서 포함되었다. NSG 마우스가 치사량 이하로 175 cGy의 용량에서 방사선 조사되었다. 방사선 조사후 24시간 (2일)째, 마우스에게 꼬리 정맥을 통해 2.5 × 104개의 RAJI 세포를 주사하였다. 3일째, 마우스 (각각의 실험군의 경우 n = 5)가 표시된 SIR 인코딩 렌티바이러스로 감염되었던 5백만 개의 T 세포로 처리되었다. 마우스에게 인간 IL2 (복강내로 400 IU)를 대조군에서 마우스 모두의 사망 시까지 주사 다음날에 주었다. 표 17은 각각의 실험군에서 마우스의 생존을 나타낸다. RAJI 세포 및 대조군 SIR 발현하는 T 세포 (서열번호 1112)가 주어진 마우스의 생존 중간값은 12일이었다. 대조적으로, (050515-L05) [서열번호 900]-SIR-T 및 (070215-M03)[서열번호 1021] SIR-T 세포를 수여받았던 마우스의 생존 중간값은 28.0일 및 51일이었고, 이는 유의하게 증가되었다 (p = 0.0004).
CD3 자성 비드를 사용하여 단리된 인간 말초 혈액 T 세포가 폴레이트 수용체 1 (FR1), L1CAM 및 Epcam1을 표적하는 표시된 SIR 구조물을 발현하는 렌티바이러스로 감염되었다. 1일째, NSG 마우스가 치사량 이하로 175 cGy의 용량에서 방사선 조사되었다. 방사선 조사후 24시간 (2일)째, 마우스에게 복강내로 1 × 106개의 SVOK-3 세포를 주사하였다. 3일째, 마우스가 5백만 개의 표시된 CAR-T 세포로 정맥내 처리되었다. 4일째의 시작 시, 마우스에게 인간 IL-2를 복강내 400 IU/마우스의 용량으로 대조군에서 마우스 모두의 사망 시까지 CAR-T 세포의 주사 다음날마다 주었다.
CD3 자성 비드를 사용하여 단리된 인간 말초 혈액 T 세포가 CS1을 표적하는 표시된 SIR 구조물을 발현하는 렌티바이러스로 감염되었다. 1일째, NSG 마우스가 치사량 이하로 175 cGy의 용량에서 방사선 조사되었다. 방사선 조사후 24시간 (2일)째, 마우스에게 정맥내로 0.5 × 106개의 L363 세포를 주사하였다. 3일째, 마우스가 10백만 개의 표시된 CAR-T 세포로 정맥내 처리되었다. 4일째의 시작 시, 마우스에게 인간 IL-2를 복강내 400 IU/마우스의 용량으로 대조군에서 마우스 모두의 사망 시까지 CAR-T 세포의 주사 다음날마다 주었다.
CD3 자성 비드를 사용하여 단리된 인간 말초 혈액 T 세포가 Lym1 및 Lym2를 표적하는 표시된 SIR 구조물을 발현하는 렌티바이러스로 감염되었다. 1일째, NSG 마우스가 치사량 이하로 175 cGy의 용량에서 방사선 조사되었다. 방사선 조사후 24시간 (2일)째, 마우스에게 정맥내로 25 × 103개의 Raji 세포를 주사하였다. 3일째, 마우스가 10백만 개의 표시된 CAR-T 세포로 정맥내 처리되었다. 4일째의 시작 시, 마우스에게 인간 IL-2를 복강내 400 IU/마우스의 용량으로 대조군에서 마우스 모두의 사망 시까지 CAR-T 세포의 주사 다음날마다 주었다.
필수적으로, 선행하는 실시예에서 기술된 바와 유사한 실험적 계획이 본 발명에 기술된 다른 SIR 구조물의 생체내 효능을 NSG 마우tm 및 SIR의 표적을 발현하는 적절한 세포주를 사용하여 테스트하는데 사용될 것이다.
SIR 및 CAR 발현하는 세포의 자극을 위한 프로테인 L 마이크로비드 및 프로테인 L 발현하는 세포의 사용.
암 면역요법을 위한 다수의 인간 세포-기반의 인위적인 항원-제시 세포가 기술되어 왔다. CAR+ 및 SIR+ T 세포의 생체외 증식을 위한 하나의 접근법은 표적화된 종양 관련 항원 (TAA)을 발현하는 방사선 조사된 인위적인 항원 제시 세포 (aAPC)의 사용을 수반한다. 그러나, 이러한 접근법은 aAPC가 각각의 개별적 TAA를 발현하도록 조작되는 것이 요구된다. 이러한 문제점을 극복하기 위하여, 보편적인 항원 제시 세포가 개발되었다. 프로테인 L은 혐기성 세균 종 펩토스트렙토코커스 마그누스 (Peptostreptococcus magnus)의 일부 균주에 의해 발현되는 면역글로불린 (Ig) 경쇄-결합 단백질이다. 프로테인 L은 κ 경쇄 vL 도메인의 프레임워크 영역에 결합하고, 항원 결합 도메인을 방해하지 않는다. aAPC 상에 개별적 TAA를 발현하는 대안으로서, 프로테인 L이 특이성과 상관없이 CAR+ T 및 SIR+ T 세포를 활성화할 수 있는지 여부를 결정하도록 실험이 수행되었다. 초기 실험에서, 상이한 CAR 및 SIR 구조물을 발현하는 Jurkat-NFAT-GFP 세포의 공동배양이 테스트되어 프로테인 L 자성 비드가 GFP 발현의 유도를 유발하는지 여부를 결정하였다. 피어스사 프로테인 L 자성 비드 (카탈로그 번호 # 88849; 농도 10 mg/mL)가 써모피셔사로부터 구입되었고, PBS에서 1 : 10으로 희석되었다. 대략 웰 당 10 μL의 희석된 비드가 U-바닥 96 웰 플레이트에 첨가되었다. Jurkat-NFAT-GFP 모체 세포 또는 CD8SP-FMC63(vL-vH)-Myc-BBz-T2A-PAC (112014-A13)[서열번호 4501] CAR을 발현하는 Jurkat-NFAT-GFP 세포가 웰에 첨가되었고, 비드와 함께 18시간 동안 공동배양되었다. GFP 발현의 유도가 유세포 계측법에 의해 조사되었다. 하기 도 18은 CD8SP-FMC63(vL-vH)-Myc-BBz-T2A-PAC (112014-A13)[서열번호 4501] CAR을 발현하는 Jurkat-NFAT-GFP 세포의 프로테인 L 비드와의 공동배양에 의한 GFP 발현의 중등도 유도를 도시한다.
세포 표면 상에 프로테인 L을 발현하는 인간 aAPC의 생성
힌지 및 인간 CD8, 41BB 보조자극 도메인 및 CD3z 사슬의 막통과 영역과 융합하여 프로테인 L의 상이한 영역을 발현하는 렌티바이러스성 키메라 항원 수용체 (CAR) 구조물이 생성되었다. 프로테인 L의 뉴클레오티드 서열은 인간 세포에서의 발현을 위해 코돈 최적화되었다. 41BB 보조자극 도메인 및 CD3z 사슬이 본 발명의 목적을 위한 프로테인 L의 기능에 필수적이지 않음을 주목하는 것이 필요하다. 벡터는 또한 인간 CD8 또는 IgH로부터 유래된 N-말단 신호 펩티드를 보유하여 프로테인 L의 세포 표면 운반을 허용하였다. 벡터의 완벽한 핵산 및 아미노산 서열은 서열번호 888 및 서열번호 889에 제공되어 있다.
상이한 프로테인 L 구조물이 293FT 세포 내로 일시적으로 형질감염되었다. 세포 표면 발현된 프로테인 L이 상이한 scFV 단편에 결합하는 능력이 세포를 sscFv-GGSG-NLuc 융합 단백질 상청액과 함께 배양함으로써 조사되었다. 상이한 프로테인 L 영역을 발현하는 293FT 세포는 scFV-GGSG-NLuc 상청액에 대한 결합 증가를 나타내었고, 이로써 프로테인 L이 포유동물 세포에서 세포 표면 단백질로서 성공적으로 발현될 수 있는 점을 입증한다.
다음으로, 293 세포는 프로테인 L-Ⅱ 구조물 (072716-K01)을 인코딩하는 렌티바이러스 벡터로 감염되었고, 프로테인 L을 안정적으로 발현하는 세포의 다중클론 집단이 750 ng/mL 퓨로마이신으로의 선별 이후에 생성되었다. 이들 293-프로테인 L-Ⅱ 세포가 항원 제시 세포로서 사용되었고, 상이한 SIR 및 CAR 구조물을 발현하는 Jurkat-NFAT-GFP 세포를 활성화하는 이들의 능력이 테스트되었다. 이러한 목적으로, 293-프로테인 L-Ⅱ 세포가 24 웰 플레이트에 도말되었고, 상이한 SIR 및 CAR 구조물을 발현하는 Jurkat-NFAT-GFP 세포로 12 내지 24시간 오버레이하고 대략 18시간 동안 공동배양 이후에, GFP 발현의 유도가 유세포 계측법에 의해 조사되었다. 도 19a 내지 19d에 도시된 바와 같이, 293-프로테인 L-Ⅱ 세포의 공동배양은 CD8SP-FMC63(vL-vH)-Myc-BBz-T2A-PAC (112014-A13)[서열번호 4501] CAR 및 CD8SP-HuLuc64-vL-V5-[hTCRb-KACIAH]-F-P2A-SP-HuLuc64-vH-Myc-[hTCRa-CSDVP]-F-F2A-PAC (092916-E07)[서열번호 1253], CD8SP-V5-[hTCRb-KACIAH]-F-P2A-CD8SP-CD19Bu12-vL-Gly-Ser-링커-CD19Bu12-vH-Myc-[hTCRa-CSDVP]-F-F2A-PAC (082815-E05)[서열번호 1622] SIR 구조물을 발현하는 Jurkat-NFAT-GFP 세포에서 GFP 발현의 강한 유도를 유발하였다. 이들 결과는 프로테인 L을 이들의 표면 상에 발현하는 포유동물 세포가 SIR 및 CAR 발현하는 면역 효과기 세포의 자극을 위한 보편적인 항원 제시 세포로서 작용할 수 있는 점을 입증한다. 그러나, 프로테인 L 발현하는 aAPC의 사용은 상기 유형의 세포에 제한되지 않는다. 이들 세포는 프로테인 L에 결합할 수 있는 적합한 κ 사슬을 포함하는 항체로부터 유래된 항원 결합 도메인을 보유하는 임의의 면역 효과기 세포를 위한 보편적인 aAPC로서 작용할 수 있다.
Pgp 양성 림프구에서 SIR의 발현.
말초 혈액 단핵구 세포 (10백만 개의 세포)가 피콜-하이파크 분리법을 사용하여 획득되었다. 세포가 원심분리되고, 세포 펠렛이 200 μL의 인간 AB 혈청으로 4℃에서 1시간 동안 차단된다. 세포가 얼음에 냉각된 1% FCS를 포함한 PBS로 세척되고, 3가지의 단일클론 항체 UIC2 (200 μg/mL; Santa Cruz Biotechnology; SC-73354), MRK16, 및 P-당단백질 (Pgp)에게로 유도된 4E3으로 4℃에서 1시간 동안 염색된다. 각각의 항체는 검정법의 민감도를 증가시키도록 0.5 μg/백만 개의 세포 농도로 사용된다. 1% FCS를 포함한 철저한 세척 이후에, 세포가 5 μL (2.5 μg)의 FITC- 컨쥬게이션된 염소 F(ab)2 항-마우스 IgG (H+L) 인간 흡착된 항체 (Southern Biotechnology; 카탈로그 번저 # 1032-02)로 염색된다. 2번의 세척 이후에 세포가 PE-컨쥬게이션된 인간 CD3 항체로 4℃에서 1시간 동안 표지된다. 세포가 세척되어 유세포 계측법으로 분석된다. CD3 양성 T 림프구는 Pgp+ve 및 Pgp-ve ㅂ분획으로 선별된다. 각각의 분획에서 세포가 CD8SP-FMC63-vL-V5-[hTCRb-KACIAH]-F-P2A-SP-FMC63-vH-Myc-[hTCRa-CSDVP]-F-F2A-PAC (081415-D06)[서열번호 992] SIR 또는 음성 대조군 SIR CD8SP-KSHV-4C3-vL-V5-[hTCRb-S57C-opt]-F-P2A-SP-4C3-vH-Myc-[hTCRa-T48C-opt]-F-F2A-PAC (111815-O05)[서열번호 4639]를 인코딩하는 렌티바이러스 벡터로 감염된다. NSG 마우스 (Jackson Lab)가 치사량 이하로 175 cGy의 용량에서 방사선 조사된다. 대략적으로 방사선 조사후 24시간 (2일)째, 마우스에게 꼬리 정맥을 통해 2.5 × 104개의 RAJI 세포를 주사한다. 3일째, 마우스 (각각의 실험군의 경우 n = 6)가 표시된 SIR 인코딩 렌티바이러스로 감염되었던 5백만 개의 림프구로 처리된다. 대조군 마우스 (n = 6)는 T 세포가 없거나 겸염되지 않은 T 세포를 수여받았다. 마우스에게 인간 IL2를 주사 다음날에 주었다. CD8SP-FMC63-vL-V5-[hTCRb-KACIAH]-F-P2A-SP-FMC63-vH-Myc-[hTCRa-CSDVP]-F-F2A-PAC (081415-D06)[서열번호 992] SIR로 감염된 Pgp+ve T 세포가 주어진 마우스는 CD8SP-FMC63-vL-V5-[hTCRb-KACIAH]-F-P2A-SP-FMC63-vH-Myc-[hTCRa-CSDVP]-F-F2A-PAC (081415-D06)[서열번호 992] SIR로 감염된 Pgp-ve T 세포 또는 음성 대조군 SIR CD8SP-KSHV-4C3-vL-V5-[hTCRb-S57C-opt]-F-P2A-SP-4C3-vH-Myc-[hTCRa-T48C-opt]-F-F2A-PAC (111815-O05)[서열번호 4639]로 감염된 Pgp+ve 또는 Pgp-ve T 세포가 주어진 마우스와 비교하여 더 오래 생존한다. CD8SP-FMC63-vL-V5-[hTCRb-KACIAH]-F-P2A-SP-FMC63-vH-Myc-[hTCRa-CSDVP]-F-F2A-PAC (081415-D06)[서열번호992] SIR로 감염된 Pgp+ve T 세포가 주어진 마우스의 더 오랜 생존은 SIR-T 세포의 생체내 지속성과 상관된다. 상기 실험은 MACS (자기 활성화된 세포 선별법)을 포함하는 국제특허출원 PCT/US2017/042248 (본원에 이의 발명은 참고문헌으로 통합됨)에 기술된 바와 같은 다른 방법을 사용하여 그리고 TH9402에 대한 노출과 이어진 광 노출에 의해 Pgp-발현하는 T 림프구를 농축시킴으로써 반복된다. 또한, CD8SP-FMC63-vL-V5-[hTCRb-KACIAH]-F-P2A-SP-FMC63-vH-Myc-[hTCRa-CSDVP]-F-F2A-PAC (081415-D06)[서열번호 992] SIR로 감염된 Pgp+ve T 세포가 주어진 마우스도 더 오래 생존하고, 이는 SIR-T 세포의 생체내 지속성과 상관된다.
SIR-T 세포의 활성을 차단하는데 다사티닙의 사용.
SIR CD8SP-CD19Bu12-vL-V5-[TCRb-S57C-opt1]-F-P2A-SP-CD19Bu12-vH-Myc-[TCRa-T48C-opt1]-F-F2A-PAC (070215-M03)[서열번호 1021] 및 CD8SP-CD20-2F2-vL-V5-[hTCRb-KACIAH]-F-P2A-SP-CD20-2F2-vH-Myc-[hTCRa-CSDVP]-F-F2A-PAC (100615-D05)[서열번호 1221]을 발현하는 T 세포가 100 nM 다사티닙과 37℃에서 대략 30분 동안 사전 배양되거나, 처리하지 않고 둔다. 약물-처리된 및 처리되지 않은 T 세포가 흰색 384-세포 플레이트에 도말된다. 안정적으로 GLuc를 발현하는 RAJI 세포가 T 세포를 포함하는 웰에 5 : 1의 E : T 비율을 내도록 30K 세포/웰의 농도로 첨가된다. 다사티닙이 또한 100 nM의 농도를 유지하도록 웰에 첨가된다. 4 내지 24시간의 공동배양 이후에, SIR-T 세포 매개된 표적 세포의 용해 유도가 미가공 실렌터라진을 포함한 0.5× CTZ 검정 완충액을 직접적으로 첨가함으로써 GLuc 활성의 증가로 검정된다. 결과는 100 nM 다사티닙에 의해 SIR-유도된 세포 사망의 유의한 억제를 보여준다. 다사티닙으로의 처리는 표적 세포주와 함께 SIR-T 세포의 공동배양 이후에 IFNγ 및 TNFα 생산을 유의하게 억제하는 것으로 확인된다. 결과는 다사티닙이 SIR T 세포에 의한 세포독성 및 사이토카인 생산을 차단하는 능력을 입증한다. 다사티닙은 FDA 승인된 약물이고 혈액 뇌 장벽을 통과할 수 있기 때문에, 신경독성을 포함하여 SIR-T 세포에 의해 유도된 독성을 조절하고, 환자에게 이들의 투여 이후에 SIR-T 세포의 활성을 조절하는데 사용될 수 있다.
SIR-T 세포를 증식하는 PI3K 저해제의 사용
CD3 자성 비드를 사용하여 단리된 인간 말초 혈액 T 세포가 CD19 표적하는 표시된 SIR 구조물을 발현하는 렌티바이러스로 감염된다. 세포는 선별하지 않고 두거나 퓨로마이신으로 선별되고, CD3/CD28 비드 및 IL2를 사용하지만 이중 PI3K/mTOR 저해제 PF-04691502 (0.10 μM 내지 0.5 μM)의 존재 또는 부재 시 이전에 기술된 표준 프로토콜을 사용하여 증식된다. NSG 마우스 (Jackson Lab)가 치사량 이하로 175 cGy의 용량에서 방사선 조사된다. 방사선 조사후 24시간 (2일)째, 마우스에게 꼬리 정맥을 통해 2.5 × 104개의 RAJI 세포를 주사한다. 3일째, 마우스 (각각의 실험군의 경우 n = 5)가 표시된 SIR을 인코딩하는 렌티바이러스로 감염되었고, PF-04691502의 존재 또는 부재 시 증식되었던 5백만 개의 T 세포로 처리되었다. 대조군 마우스 (n = 5)에게 5백만 개의 감염되지 않은 T 세포가 주사된다. 마우스에게 인간 IL2 (복강내로 400 IU)를 대조군에서 마우스 모두의 사망 시까지 주사 다음날에 준다. PI3K/AKT 저해제의 존재 시 증식된 (050515-L05) [서열번호 900]-SIR-T를 수여받은 마우스의 생존 중간값은 PI3K/AKT 저해제의 부재 시 증식된 SIR-T를 수여받은 마우스보다 더 높다.
CD16을 발현하는 보편적인 SIR-T 세포의 항원 결합 도메인으로서의 용도
루시퍼라제를 발현하는 다우디 세포가 NSG 마우스 (Jackson Laboratory)에게 복강내로 (i.p.; 0.3 × 106개 세포/마우스) 주사된다. 일부 마우스가 리투시맙 (150 mg)을 복강내로 수여받는다. CD8SP-MYC-[hTCRa-T48C-opt1]-F-F2A-SP-CD16A-V158-ECD-v2-V5-[hTCRb-S57C-opt1]-F-P2A-PAC (서열번호 2069) SIR을 발현하는 인간 T 세포 (1 × 107개)가 다우디 접종 이후 4일째 주사된다. 대조군 마우스는 리투시맙 또는 T 세포 대신에 조직 배양 배지를 수여받는다. 리투시맙 주사가 추가의 T 림프구 주사 없이 4주 동안 매주 반복된다. 모든 마우스가 1,000 내지 2,000 IU의 IL-2의 복강내 주사를 4주 동안 매주 두 번 수여받는다. 리투시맙 플러스 SIR-T 세포를 수여받은 마우스는 종양 성장 감소를 나타낸다.
원하는 성질을 갖는 SIR을 선별하는데
시험관내
및 생체내 선별의 사용
표 7A 내지 7H에 열거된 CD19 표적하는 SIR 풀은 TRAC gRNA (서열번호 896) 및 당해 기술분야에서 숙지된 기법을 사용하여 T 세포에서의 TRAC 좌위에 표적된다. 표적화 벡터는 또한 SIR 삽입물의 종결 코돈의 하류에 위치하는 DNA 바코드를 ㅂ보g한다. T 세포는 말초 혈액으로부터 유래될 수 있다. 대안의 구현예에서, T 세포는 당해 기술분야에서 숙지된 기법을 사용하여 iPSC 또는 조혈 줄기 세포의 단일 클론으로부터 유래된다. SIR 풀을 발현하는 T 세포는 RAJI 세포와 함께 시험관내에서 1 내지 21일 동안 공동배양된다. SIR-T 세포 풀의 일정량이 표적 세포와의 배양 이전에 그리고 공동배양 이후 상이한 날짜에 수집된다. 시료가 표적 세포에 대한 노출 이후 상이한 SIR의 상대적 빈도를 결정하도록 신세대 시퀸싱에 착수된다. 생체정보학 분석은 표적 세포와의 공동배양 이후에 더 나은 증식 반응과 연관된 SIR을 결정하는데 사용된다. 필수적으로, 유사한 접근법이 생체내에서 T 세포 상의 더 높은 증식 잠재력을 부여하고/거나, 생체내에서 장기간 유지되고/거나, 종양 접종으로 죽는 동물과 비교하여 생존하는 동물에서의 초기 T 세포 집단의 이들 빈도로 정규화될 때 더 높은 빈도로 존재하는 SIR을 결정하는데 사용된다. 본 발명의 대안의 구현예에서, 필수적으로 유사한 접근법이 이에 제한되는 것은 아니지만, 더 나은 장기간 생존, 사이토카인 방출 증후군의 더 낮은 발병율, 더 낮은 신경독성 및/또는 더 높은 장기간 지속성을 포함하는 상이한 성질 및/또는 성과와 연관되는 SIR을 확인하도록 인간 임상 시료 상에서 사용된다. 이러한 SIR은 후속적으로 단일하게 또는 다양한 구현예에서, 상이한 질환 병태 및 상이한 환자의 치료를 위한 다양한 성질을 갖는, 동일한 또는 상이한 항원 결합 도메인을 표적하는 SIR을 포함하는 상이한 SIR 하위풀을 개발하는데 사용될 수 있다. 다른 가능성에서, SIR-T 세포는 이들의 표적 세포주에 노출되고, 다음으로 유세포 계측법에 의해 측정된 바 세포내 IFNγ의 정도에 기초한 상이한 집합으로 선별된다. 낮은 대 높은 IFNγ 집단에서 상이한 SIR의 빈도가 신세대 시퀸싱에 의해 결정되고, 대조군 SIR-T 세포 집단, 예로 표적 세포주에 노출된 적이 없거나 SIR의 표적을 발현하지 않는 세포주에 노출된 SIR-T 세포에서 이들 빈도로 정규화된다. 이러한 분석으로부터, IFNγ 생산의 상이한 수준과 연관된 SIR이 결정될 수 있다. 유사한 접근법이 이에 제한되는 것은 아니지만, 더 낮은 TNFα 생산, 소모 마커의 더 낮은 발현, 말단 분화 마커의 더 낮은 발현 및/또는 세포독성 마커의 더 높은 발현을 포함하는 임의의 원하는 성질 또는 속성 또는 이들의 조합을 갖는 SIR을 스크리닝하고 선택하는데 사용된다.
SIR-T 세포와 함께 IL7의 사용
연구는 SIR-T 세포의 주입 이후 개시 1일째, 마우스에게 내인성 재조합 인간 IL-7을 200 ng/마우스의 용량으로 복강내 주사에 의해 세 번 투여하는 한편 대조군 마우스에게는 정상 식염수를 수여한 점을 제외하고는 선행하는 실시예에서 기술된 바와 같이 시행된다.
SIR-T 세포와 함께 BRD4 표적하는 shRNA의 사용
연구는 H1 프로모터 구동된 BRD4에 대한 shRNA를 공동발현하는 서열번호 893 (pLenti-EF1α-CD8SP-FMC63-vL-V5-[hTCRb-KACIAH]-F-P2A-SP-FMC63-vH-Myc-[preTCRa-Del48]-F-F2A-PAC-shRNA-BRD4-DWPRE)로 예시되는 SIR 구조물을 발현하는 T 세포가 사용된 점을 제외하고는 선행하는 실시예에서 기술된 바와 같이 시행된다. 이러한 구조물은 BRD4에 대한 shRNA가 결여된 서열번호 1200로 예시되는 SIR을 발현하는 구조물과 대비된다. BRD4-shRNA (예로, 서열번호 893)를 공동발현하는 shDNA 구조물을 수여받은 마우스는 SIR-T 세포의 더 긴 지속성을 나타내고, 더 오래 생존한다.
실험은 마우스 절반 (n = 6)이 BRD4 저해제 JQ1(+) (50 mg/kg)의 복강내 주사를 매일 두 번 수여받는 한편 대조군 마우스는 운반체 대조군 (10% β-사이클로덱스트린, Sigma)를 수여받는 점을 제외하고는 서열번호 1200로 예시되는 SIR을 발현하는 T 세포를 수여받은 마우스로 반복된다. JQ1(+)를 수여받은 마우스가 대조군 마우스와 비교하여 SIR-T 세포의 더 긴 지속성을 나타내고, 더 오래 생존한다.
입양 세포요법을 위한 자가유래 SIR-T 세포의 사용
본 발명의 SIR-T 세포는 입양 세포요법에 사용될 수 있다. 예로서, 재발된 급성 림프구 백혈병 (ALL), 만성 림프구 백혈병 (CLL) 또는 고위험성 중간 등급 B 세포 림프종을 갖는 환자는 입양으로 전달된 CD19 표적하는 자가유래 SIR-T 세포로의 면역요법을 수여받을 수 있다. 각각의 환자로부터 수집된 백혈구 성분채집술 산물은 Miltenyi Biotec로부터의 CliniMACS 프로디지® 시스템을 사용하고 제조사의 추천사항에 따라 CD3 양성 T 림프구의 선별을 거친다. T 림프구는 Pgp 항체로의 염색 이후에 유동 선별, Pgp 항체로의 염색 이후에 MACS 또는 TH9402 플러스 광에 대한 노출 이후에 광역동적 선별을 사용하여 Pgp 양성 T 세포에 대해 선택적으로 농축된다. 세포는 임상 등급의 CD19-SIR 바이러스 (예로, CD8SP-CD19Bu12-vL-V5-[hTCRb-KACIAH]-F-P2A-CD19Bu12-vH-Myc-[hTCRa-CSDVP]-F-F2A-GMCSF-SP-tEGFR [서열번호 1087]로 형질도입되고, 다음으로 SIR-T 세포의 선별 및 증식이 폐쇄 시스템에서 일어난다. 결과로 얻은 산물은 품질 제어 테스트 (무균도 및 종양 특이적 세포독성 테스트 포함)를 거친 이후에, 동결보존된다. 한편으로, 백혈구 성분채집술에 이어서, 연구 참여자는 림프고갈 화학요법을 시작한다 (30 mg/m2/일 플루다라빈 플러스 500 mg/m2/일 사이클로포스파미드 ×3일). 이들 림프고갈 요법의 완료 이후 1일째, 이전에 저장된 SIR-T 세포 산물이 이송되고, 해동되고, 환자의 침상에서 주입된다. 연구 참가자는 정맥내로 주입된 SIR-형질도입된 림프구, 이어서 고용량 (720,000 IU/kg) IL-2 (Aldesleukin; Prometheus, San Diego, CA)을 내성까지 8시간마다 수여받았다. SIR-T 산물의 용량은 연구 프로토콜에 따라 1 × 104개 SIR+ve CD3 세포/kg 내지 5 × 109개 SIR+ve CD3 세포/kg의 범위를 갖는다. SIR-T 산물은 단일 주입 또는 분리된 주입으로 투여될 수 있다. 연구 참가자는 T 세포 주입 이전에 적어도 30분 미리, 15 mg/kg의 아세토아미노펜 P.O. (최대 650 mg) 및 디펜하이드라민 0.5 내지 1 mg/kg I.V. (최대 용량 50 mg)이 투약된다. 연구 참가자는 선택적으로 인간 IL-2의 주사를 매일 수여받는다. 다음으로 임상 및 연구실 상관된 추적 연구가 의사의 판단으로 수행될 수 있고, CD19-발현하는 ALL/림프종 세포 및/또는 입양으로 전달된 T 세포의 존재에 대한 정량적 RT-PCR; FDG-PET 및/또는 CT 스캔; 질환 특이적 병리학적 평가를 위한 골수 검사; 림프절 생검; 및/또는 FDA 생물학적 반응 변형제 위원회에 의해 제시된 유전자 전달 연구에 적용되는 지침에 따라 장기간 추적을 포함할 수 있다. 필수적으로, 유사한 접근법은 본 발명의 SIR을 발현하도록 조작되었던 자가유래 면역 세포 (예로, T 세포)를 사용하여 다른 질환을 치료하는데 사용될 수 있고, 여기서 SIR은 질환 유발 또는 질환 관련 세포 상에서 발현된 항원 또는 항원들을 표적한다.
입양 세포요법을 위한 다수의 항원을 표적하는 자가유래 SIR-T 세포의 사용
환자는 감염성 질환 (예로, HIV1, EBV, CMV, HTLV1 등), 퇴행성 질환 (예로, 알츠하이머병), 자가면역 질환 (예로, 보통 천포창), 알레르기 질환 (예로, 만성 특발성 두드러기) 및 다수의 암을 포함하여 많은 상이한 질환으로, 상이한 질환 유발 또는 질환 관련 항원을 표적하는 입양으로 전달된 자가유래 SIR-T 세포로의 면역요법에 대해 IRB 승인된 제 I상 임상 시험에 등록된다. 상이한 질환을 위한 SIR은 질환 유발 또는 질환 관련 세포에서 이들의 표적 항원의 기지의 발현에 기초하여 선택된다. 가능한 곳에서, 질환 유발 또는 질환 관련 세포 상에서 SIR 표적의 발현은 SIR의 항원 결합 도메인이 가요성 링커를 통해 NGluc 단백질의 비-분비성 형태에 융합된 ABD-GGS-NLuc 융합 단백질과의 결합에 의해 검증된다. 대안적으로, 시판되는 항체를 사용한 면역조직화학법 또는 유세포 계측법이 질환 유발 또는 질환 관련 세포 상에서 SIR 표적의 발현을 검증하는데 사용된다. 적절한 SIR 인코딩하는 렌티바이러스 벡터로 형질도입된 T 세포가 피험자로부터 백혈구 성분채집술을 사용하여 수집되고, 폐쇄 시스템에서 CD3/CD28 비드를 사용하여 생체외에서 증식된다. 결과로 얻은 산물이 품질 제어 테스트 (무균도 및 종양 특이적 세포독성 테스트 포함)를 거친 이후에, 동결보존된다. 한편으로, 연구 참여자는 림프고갈 화학요법을 시작한다 (30 mg/m2/일 플루다라빈 플러스 500 mg/m2/일 사이클로포스파미드 ×3일). 이들 림프고갈 요법의 완료 이후 1일째, 연구 참가자는 정맥내로 주입된 형질도입된 림프구, 이어서 고용량 (720,000 IU/kg) IL-2 (Aldesleukin; Prometheus, San Diego, CA)을 내성까지 8시간마다 수여받았다. 이전에 저장된 SIR-T 세포 산물이 이송되고 해동되고, 환자의 침상에서 주입된다. SIR-T 산물의 용량은 연구 프로토콜에 따라 1 × 104개 SIR+ve CD3 세포/kg 내지 5 × 109개 SIR+ve CD3 세포/kg의 범위를 갖는다. SIR-T 산물은 단일 주입 또는 분리된 주입으로 투여될 수 있다. 연구 참가자는 T 세포 주입 이전에 적어도 30분 미리, 15 mg/kg의 아세토아미노펜 P.O. (최대 650 mg) 및 디펜하이드라민 0.5 내지 1 mg/kg I.V. (최대 용량 50 mg)이 투약된다. 연구 참가자는 선택적으로 인간 IL-2의 주사를 매일 수여받는다. 다음으로 임상 및 연구실 상관된 추적 연구가 의사의 판단으로 수행될 수 있다.
SIR-T 세포와 조합하여 mTOR 저해제 RAD001의 사용
연구는 SIR-T 세포의 주입 이후 시작 1일째, 연구 참가자에게 mTOR 저해제, 예로 알로스테리 저해제, 예로 RAD001를 표적 최저 수준 0.1 내지 3 ng/mL를 제공하는 용량으로 투여하는 것을 제외하고는 선행하는 실시예에 기술된 바와 같이 시행되고, 여기서, 최저 수준은 다음 용량 직전에 혈장에서 약물의 농도 또는 두 개의 용량 사이의 최소 약물 농도를 말한다.
SIR-T 세포와 조합하여 이브루티닙의 사용
연구는 SIR-T 세포의 주입 이후 시작 1일째, 연구 참가자에게 경구 이브루티닙을 140 mg/d 내지 420 mg/d의 용량으로 투여하는 것을 제외하고는 선행하는 실시예에 기술된 바와 같이 시행된다. 이브루티닙을 수여받은 연구 참가자가 이브루티닙이 없이 SIR-T 세포를 수여받은 참가자와 비교하여 중증도 사이토카인 방출 증후군의 더 낮은 유병율을 갖는 점을 주목한다.
입양 세포요법을 위한 동종유래 SIR-T 세포의 사용
동종유래 골수 이식을 경험한 재발된 급성 림프구 백혈병 또는 고위험성 중간 등급 B 세포 림프종을 갖는 환자는 입양으로 전달된 동종유래 SIR-T 세포로의 면역요법을 수여받을 수 있다. 공여자 (동종유래 이식에 사용된 동일한 공여자)로부터 수집된 백혈구 성분채집술 산물은 Miltenyi Biotec로부터의 CliniMACS 프로디지® 시스템을 사용하고 제조사의 추천사항에 따라 CD3 양성 T 림프구의 선별을 거친다. T 림프구는 Pgp 항체로의 염색 이후에 유동 선별, Pgp 항체로의 염색 이후에 MACS 또는 TH9402 플러스 광에 대한 노출 이후에 광역동적 선별을 사용하여 Pgp 양성 T 세포에 대해 선택적으로 농축된다. 세포가 CD3 및 CD28 자성 비드-기반의 인위적인 항원 제시 세포를 사용하여 활성화되고, 임상 등급의 CD19-SIR 바이러스 (예로, CD8SP-CD19Bu12-vL-V5-[hTCRb-KACIAH]-F-P2A-CD19Bu12-vH-Myc-[hTCRa-CSDVP]-F-F2A-i캐스파제9 [서열번호1080])로 형질도입된다. 세포는 폐쇄 시스템에서 9 내지 12일 동안 증식된다. 결과로 얻은 산물은 품질 제어 테스트 (무균도 및 종양 특이적 세포독성 테스트 포함)를 거친 이후에, 동결보존된다. 한편으로, 연구 참여자는 림프고갈 화학요법을 시작한다 (30 mg/m2/일 플루다라빈 플러스 500 mg/m2/일 사이클로포스파미드 ×3일). 이들 림프고갈 요법의 완료 이후 1일째, 연구 참가자는 정맥내로 주입된 형질도입된 림프구, 이어서 고용량 (720,000 IU/kg) IL-2 (Aldesleukin; Prometheus, San Diego, CA)을 내성까지 8시간마다 수여받았다. SIR-T 세포 산물이 이송되고, 해동되고, 환자의 침상에서 주입된다. SIR-T 산물의 용량은 연구 프로토콜에 따라 1 × 104개 SIR+ve CD3 세포/kg 내지 5 × 109개 SIR+ve CD3 세포/kg의 범위를 갖을 수 있다. SIR-T 산물은 단일 주입 또는 분리된 주입으로 투여될 수 있다. 연구 참가자는 T 세포 주입 이전에 적어도 30분 미리, 15 mg/kg의 아세토아미노펜 P.O. (최대 650 mg) 및 디펜하이드라민 0.5 내지 1 mg/kg I.V. (최대 용량 50 mg)이 투약될 수 있다. 다음으로 임상 및 연구실 상관된 추적 연구가 의사의 판단으로 수행될 수 있고, CD19-발현하는 ALL/림프종 세포 및/또는 입양으로 전달된 T 세포의 존재에 대한 정량적 RT-PCR; FDG-PET 및/또는 CT 스캔; 질환 특이적 병리학적 평가를 위한 골수 검사; 림프절 생검; 및/또는 FDA 생물학적 반응 변형제 위원회에 의해 제시된 유전자 전달 연구에 적용되는 지침에 따라 장기간 추적을 포함할 수 있다. 면역억제제 약물의 사용도 역시 의사의 판단이 맡겨둔다. 필수적으로, 유사한 접근법은 본 발명의 SIR을 발현하는 동종유래 면역 세포 (예로, T 세포)를 사용하여 다른 질환을 치료하는데 사용될 수 있고, 여기서 SIR은 질환 유발 또는 질환 관련 세포 상에서 발현된 항원 또는 항원들을 표적한다.
SIR-T 세포 간동맥 주입
정맥내 주입에 추가하여, SIR-T 세포는 질환이 관여된 국소적 영역 또는 기관에서 SIR-T 세포의 높은 농도를 제공하도록 동맥내로 주입될 수 있다. 다음의 실시예에서, 이러한 접근법은 폴레이트 수용체 알파 (FR1)를 발현하는 위창자암으로부터의 간 전이를 갖는 환자의 경우에 사용된다. 필수적으로, 유사한 접근법이 ㄷ다 종양 항원을 표적하는 SIR-T 세포의 동맥내 주입에 사용될 수 있다.
혈관조영상 맵핑이 기저선에서 우측 공통 대퇴골 동맥 접근을 통해 수행된다. 간외 관류의 다른 잠재적인 출처에 추가하여, 위십이지장 및 우측 위 동맥이 마이크로코일로 색전된다. 동일한 동맥 접근 절차가 CD8SP-FR1-huMov19-vL-V5-[hTCRb-KACIAH]-F-P2A-SP-FR1-huMov19-vH-Myc-[hTCRa-CSDVP]-F-F2A-PAC (102915-P07)[서열번호 1276] SIR를 발현하는 T 세포의 투여를 위해 수행된다. T 세포가 환자로부터 0일째 수집되고, 이전의 실시예에 기술된 바와 같이 SIR 인코딩하는 렌티바이러스로 감염되고, 증식되었다. SIR-T 세포는 14일째 (108개 SIR-T 세포), 28일째 (109개 SIR-T 세포) 및 44일째 (1010개 SIR-T 세포) 용량 상승 방식으로 주어질 것이다. SIR- T 세포는 60 cc 주사기를 통해 < 2 cc/초의 속도로 손수 주사된다. 주입의 총량은 대략 100 cc이다. 계산된 일정한 속도로의 혈관조영술이 50 cc의 제 1 주입 이후 및 SIR-T 주입의 완료 시에 수행되어 유지된 동맥 유동을 검증한다. 주입은 가능할 때 적절한 간 동맥 내로 전달된다. 특정 환자는 우측 또는 좌측 간 동맥이 적절한 간 동맥으로부터 발생하지 않는, 비정상 간 동맥 해부학을 갖는다. 이러한 경우에 SIR-T 세포의 용량이 간엽 부피 산정에 기초하여 분리된다. 이러한 경우에, 분리된 용량은 우측 및 좌측 간 동맥 내로 분리되어 전달되어 둘 다의 간엽으로 비례적인 SIR-T 전달을 보장한다.
임상적 평가는 기저선에서, 주입 일에 및 주입 후 1, 2, 4 및 7일에 수행된다. 간 MRI 및 PET 검사로의 계획된 영상화 평가가 제 1 주입 이전 1개월 이내, 다음으로 마지막 SIR-T 주입 이후 1개월 이내의 일정을 갖는다. 연구 방사선과 의사 (BS)는 변형된 RECIST (mRECIST) 및 면역 관련 반응 판정기준 (Wolchok et al., 2009, Clin Cancer Res, 15: 7412-7420)에 따라 반응을 등듭화한다. 피부관통 생검이 치료 전에 및 최종 용량 이후 3주째 수행된다. 블라인드 병리학 의사가 생검 표본 상의 종양 괴사 및 섬유증을 점수로 매긴다. 안전성 평가가 프로토콜에 따라 수행된다. 부작용에 대한 국립 암 연구소 공통 용어학 판정기준 버전 3.0이 부작용의 중증도를 등급화하는데 사용된다.
SIR-T 세포의 복강내 투여
SIR-T 세포는 또한 필수적으로 코네루 등에 기술된 바와 같이 (Koneru M et al., Journal of Translational Medicine; 2015; 13: 102) 복강내로 투여될 수 있다. 다음의 실시예에서, 이러한 접근법은 폴레이트 수용체 알파 (FR1)를 발현하는 난소암의 복강내 관련성을 갖는 환자의 경우에 사용된다. 필수적으로, 유사한 접근법이 다른 종양 항원을 표적하는 SIR-T 세포의 복강내 주입에 사용될 수 있다.
스크리닝 정보 동의가 재발성 고등급 장액성 난소암을 갖는 환자에게 FR1의 발현에 대해 이들의 암을 테스트하도록 제공될 것이다. FR1 발현의 경우에서는, 면역조직화학법에 의해 검증되고, 다음으로 환자는 말초 혈액으로부터 획득된 백혈구 성분채집술 산물을 갖게 될 것이다. 과다한 혈소판 및 적혈구 오염이 백혈구 성분채집술 산물로부터 제거되고, 산물이 냉동된다. 연구의 치료 단계에서, 백혈구 성분채집술 산물은 해동되고 세척될 것이다. 후속적으로, CD3+ T 세포는 해동된 백혈구 성분채집술 산물로부터 CD3/CD28 비드를 사용한 자기 분리법에 의해 ㄷ단리될 것이다. 활성화된 T 세포는 CD8SP-FR1-huMov19-vL-V5-[hTCRb-KACIAH]-F-P2A-SP-FR1-huMov19-vH-Myc-[hTCRa-CSDVP]-F-F2A-PAC (102915-P07)[서열번호 1276] SIR를 갖고 레트로바이러스로 형질도입되며, CD3/CD28 비드 확장 프로토콜을 사용하여 추가로 증식될 것이다.
이것은 재발성 FR1+ 난소암, 나팔관암 또는 일차 복강암을 갖는 환자에서 유전적으로 변형된 자가유래 T 세포의 정맥내 (IV) 및 복강내 (IP) 주입 (사이클로포스파미드 화학요법이 있거나 없음)의 안전성을 테스트하는 제 I상 임상 시험이다. 이들 자가유래 T 세포는 CD8SP-FR1-huMov19-vL-V5-[hTCRb-KACIAH]-F-P2A-SP-FR1-huMov19-vH-Myc-[hTCRa-CSDVP]-F-F2A-PAC(102915-P07)[서열번호 276] SIR를 발현하도록 유전적으로 변형될 것이다. 처리된 (파리핀 포매됨) 또는 신선하게 생검된 종양의 면역조직화학 (IHC) 분석에 의해 검증된 FR1 항원을 발현하는 것으로 확인된 재발성 고등급 장액 난소 암종, 일차 복장 암종 또는 나팔관 암종을 갖는 환자는 잠재적으로 연구에 적합할 것이다. 중등도 내지 강한 면역반응성 점수 (3 내지 5)만이 양성으로 고려될 것이고, 점수 3은 51 내지 75% 강한 또는 51 내지 100% 약한, 4는 76 내지 99% 강한 그리고 5는 100% 강한 염색으로서 설명한다. 모든 환자는 재발을 위한 이전의 화학요법을 허용된 화학요법 라인의 이전의 최대 5번과 함께 받았을 것이다. 다른 활성 악성암, 기대 수명 < 3개월 또는 게획된 치료 시점에서 카르노프스키 성능 상태 (KPS) 점수 < 70%를 갖는 환자는 무시할만하다.
제 I상 용량-상승 투약이 임상 시험에 사용될 것이다. 2 내지 6명 환자의 집단이 변형된 T 세포의 상승하는 용량으로 주입되어 최대 내성화 용량 (MTD)을 확립할 것이다. 4가지 계획된 용량 수준이 존재한다: 3 × 105, 1 × 106, 3 × 106 및 1 × 107개의 CD8SP-FR1-huMov19-vL-V5-[hTCRb-KACIAH]-F-P2A-SP-FR1-huMov19-vH-Myc-[hTCRa-CSDVP]-F-F2A-PAC (102915-P07)[서열번호 1276] SIR-T 세포/kg. 집단 I 및 Ⅱ는 3 × 105개의 CD8SP-FR1-huMov19-vL-V5-[hTCRb-KACIAH]-F-P2A-SP-FR1-huMov19-vH-Myc-[hTCRa-CSDVP]-F-F2A-PAC (102915-P07)[서열번호 1276] SIR-T 세포/kg로 처리될 것이지만, 집단 Ⅱ의 환자는 또한 림프고갈하는 사이클로포스파미드를 수여받을 것이다. 집단 Ⅱ 내지 Ⅴ는 사이클로포스파미드의 사전 처리 이후에 변형된 T 세포의 상승 용량을 수여받을 것이다. 750 mg/m2로 투약된 림프고갈하는 사이클로포스파미드는 초기 T 세포 주입 이전 2 내지 4일째 투여될 것이다. 표준 3 + 3 용량 상승 계획이 이어질 것이다. 제 1 용량 수준이 MTD를 초과하면, 3 내지 6명 환자의 후속 집단은 림프고갈하는 사이클로포스파미드의 첨가 없이 1 × 105개 CD8SP-FR1-huMov19-vL-V5-[hTCRb-KACIAH]-F-P2A-SP-FR1-huMov19-vH-Myc-[hTCRa-CSDVP]-F-F2A-PAC (102915-P07)[서열번호1276] SIR-T 세포/kg의 -1 용량 수준으로 처리될 것이다 (집단 -I).
IP 카테터가 T 세포 주입 이전에 배치될 것이다. 카테터는 변형된 T 세포가투여를 위해 준비될 때 배치될 것이다. 환자는 SIR T 세포의 이들의 제 1 주입 이전에 병원에 입원이 허용될 것이고, SIR T 세포의 제 2 주입 이후 적어도 3일까지 입원할 것이다. 치료될 환자의 제 1 집단 및 각각의 후속 집단에서 치료된 제 1 환자는 중환자실 (ICU)에 입원이 허용될 것이고, 후속의 환자는 의료 암종학 입원 서비스에 허용될 수 있다 (치료한 의사의 임상적 판단에 따름).
환자는 림프고갈하는 사이클로포스파미드 (750 mg/m2 IV) 화학요법의 단일 용량을 SIR-변형된 T 세포로의 치료를 시작하기 이전 2 내지 4일째 수여받을 것이다. 형질도입된 T 세포는 주입 이전에 수, 순도, 생존도 및 무균도에 대해 품질 테스트될 것이다. 다음의 T 세포 방출 판정기준은 생존도 > 80%, CD3+ ≥ 5%를 포함하여 충족되어야 하고, 주입된 T 세포 집단은 증식된 T 세포 집단의 유세포 계측 분석에 기초하여 > 20%의 형질도입된 분획을 가져야 한다. 또한, 형질도입된 T 세포에서 평균 벡터 사본수는 주입 이전에 실시간 PCR에 의해 결정될 것이고, 세포 당 0.3 내지 5개 사본수 범위일 필요가 있으며, PCR은 형질도입된 T 세포에서 복제 적격한 렌티바이러스의 부재를 입증하는데 사용될 것이다. 모든 환자는 유전적으로 변형된 T 세포 용량의 50%를 정맥내로 수여받을 것이다. 환자는 독성에 대해 긴밀하게 모니터링될 것이다. 이후 1 내지 3일째, T 세포의 잔여 용량이 IP 주입으로서 투여될 것이다. 적어도 3명의 환자가 용량 수준 1로 처리될 것이고, 개월 당 2명 이상의 환자가 각각의 용량 수준 내에서 증가된다. 적어도 1주가 등록된 각각의 환자의 처리 사이에 경과할 것이다. 선행 집단에서 처리된 모든 환자는 처음 T 세포 주입일로부터 다음 집단으로 상승되기 이전 최소 4주 동안 관찰될 것이다. 사이클로포스파미드 요법 이후에 중성구감소증 (ANC ≤ 1,000/mm3)의 유의한 위험성의 견지에서, 사이클로포스파미드로 처리된 환자 모두는 연구자의 판단으로 후원 성장인자로 처리될 수 있다 (페그필그라스팀의 단일 피하 주사 또는 연속 3일의 피하 필그라스팀).
혈액 시료는 독성, 치료 효과 및 유전적으로 변형된 T 세포의 생존을 평가하도록 처리 이전 및 이후에 모든 환자로부터 획득될 것이다. 치료 후 혈액 시료는 T 세포 주입 이후 대략 1시간, 1일 및 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 및 12주, 다음으로 이후 1년까지 매월마다, 다음으로 T 세포 주입 후 15년까지 이후 매년마다 수집될 것이다. 기술적으로 가능하면, 환자의 복수도 역시 사이클로포스파미드 또는 T 세포요법 이전에 (어느 것도 먼저 올 수 있음), 뿐만 아니라 추적 연구 동안 시료화될 수 있다. 환자는 T 세포 주입 이후 대략 6주, 3개월, 6개월, 9개월 및 12개월에 그리고 이후 임상적으로 지시되면 CT 스캔을 받을 것이다.
종양내 주사를 위한 SIR-T 세포의 사용
SIR-T 세포는 또한 필수적으로 브라운 등에 기술된 바와 같이 종양내로 투여될 수 있다 (Brown CE, et al, Clin Cancer Res. 2015 September 15; 21(18): 4062-4072). 다음의 실시예에서, 이러한 접근법은 IL13Ra2를 발현하는 재발성 교모세포종 (GBM)을 갖는 환자의 경우에 사용된다. 필수적으로 유사한 접근법이 다른 종양 항원을 표적하는 SIR-T 세포의 종양내 주사에 사용될 수 있다.
파일럿 안정성 및 실행가능성 연구는 재발성 GBM에서 CD8SP-IL13Ra2-hu107-vL-V5-[hTCRb-KACIAH]-F-P2A-SP-IL13Ra2-hu107vH-Myc-[hTCRa-CSDVP]-F-F2A-PAC (051816-Y03)[서열번호 1306] SIR 발현하는 T 세포를 테스트하도록 실행될 것이다. 모든 찬가한 환자는 문서화된 사전 정보 동의를 내도록 요구될 것이다. 임상 프로토콜은 남캘리포니아 대학교 연구소 검토 위원회에 의해 승인되고, 연구적 신약 적용 하에 시행되고, ClinicalTrials.gov에 등록될 것이다. 적격한 환자는 재발성 또는 난치성 단일초점 천막상 등급 Ⅲ 또는 Ⅳ 교모세포종을 갖는 성인 (18 내지 70세)을 포함할 것이고, 이 종양은 뇌실/CSF 경로와의 소통을 보이지 않고, 절제에 순응한다. 이러한 임상 시험에 참가는 IL13Rα2 (또는 IL13Ra2) 종양 항원 상태와는 독립적일 것이다. 환자는 고등급 교모세포종 (WHO 등급 Ⅲ 또는 Ⅳ)의 처음 진단 이후에 등록될 것이고, 이 시점에 환자는 말초 혈액 단핵구 세포 (PBMC)의 수집을 위해 백혈구 성분채집술을 거칠 것이다. 이들 세포는 이전의 실시예에서 기술된 바와 같이 상응하는 렌티바이러스성 벡터로 감염 이후에 퓨로마이신 저항성 유전자 (PAC)를 포함하는 CD8SP-IL13Ra2-hu107-vL-V5-[hTCRb-KACIAH]-F-P2A-SP-IL13Ra2-hu107vH-Myc-[hTCRa-CSDVP]-F-F2A-PAC (051816-Y03)[서열번호 1306] SIR을 발현하도록 T 세포를 조작하는데 사용될 것이다. 대안적으로, SIR-T 세포는 레트로바이러스성 벡터로의 감염 이후에 또는 슬리핑 뷰티 트랜스포존을 사용하여 또는 IVT mRNA의 형질감염에 의해 생성될 수 있다. 후속적으로, 방출 테스트된 치료적 SIR-T 세포는 동결보존되고, 나중의 사용을 위해 저장될 것이다. 종양의 처음 재발 시점에, 연구 참가자는 릭햄 저장조/카테터의 배치와 함께 종양의 절제를 거칠 것이다. 동시에, 치료적 SIR-T 세포는 해동되고, CD3/CD28 비드 기반의 신속한 증식 프로토콜을 사용하여 시험관내에서 재증식될 것이다. 수술로부터 회복 및 후-기저선 MR 영상화 이후에, CD8SP-IL13Ra2-hu107-vL-V5-[hTCRb-KACIAH]-F-P2A-SP-IL13Ra2-hu107vH-Myc-[hTCRa-CSDVP]-F-F2A-PAC (051816-Y03)[서열번호 1306] SIR이 필수적으로 기술된 바와 같이 (Brown C. E., et al, Clin Cancer Res. 2015 September 15; 21(18): 4062-4072), 내부 카테터를 통해 절제 내강 내로 직접적으로 투여될 것이다. 세포는 21 게이지 버퍼플라이스 바늘을 사용하여 릭햄 저장조 내로 직접적으로 주사되어 2 mL 부피를 5 내지 10분 동안, 이어서 보존제 없는 정상적인 식염수로 2 mL 플러시를 5분 동안 전달할 것이다. 프로토콜 치료 계획은 매주마다 처리 주기를 포함하는 5주 기간에 걸쳐 두개내로 투여된 12개 CAT T 세포 표적 용량으로 환자내 용량 상승 일정을 특정할 것이다. 주기 1, 2, 4 및 5 동안, T 세포 주입은 주기의 주간 1, 3 및 5일째 수행될 것이고, 3주째는 휴식 주기가 될 것이다. 안전성을 위해, 주기 1에서 본 발명자는 각각 1, 3 및 5일째 투여된 주입 당 107 , 5 × 107 및 108개 세포의 SIR T 세포 용량을 갖는 환자내 용량 상승 전략을 사용할 것이고, 이는 4주에 걸친 108개 세포의 9번 추가적인 SIR T 세포 주입으로 이어질 것이다. 반응을 평가하는 영상화가 3주째 휴식 주기 동안 및 5주째 이후에 수행될 것이다. NCI 공통 독성 판정기준 버전 2.0 (https://ctep.ifo.nih.gov/l)에 제공된 지침을 독성의 모니터링 및 부작용 보고를 위해 따를 것이다.
이식 이전에 골수 또는 말초 혈액 줄기 세포 제조물의
생체외
퍼징을 위한 SIR-T 세포의 사용
SIR T 세포는 줄기 세포 이식 이전에 암 세포의 골수 또는 말초 혈액 줄기 세포 제조물을 퍼지하는데 사용될 수 있다. 다음의 실시예에서, CD8SP-HuLuc64-vL-V5-[hTCRb-KACIAH]-F-P2A-SP-HuLuc64-vH-Myc-[hTCRa-CSDVP]-F-F2A-PAC (092916-E07)[서열번호 1253]을 발현하는 SIR-T 세포가 자가유래 줄기 세포 (또는 골수) 이식 이전에 다발성 골수종을 갖는 환자로부터 획득된 골수 또는 말초 혈액 줄기 세포를 퍼지하는데 사용된다.
환자는 말초 혈액 단핵구 세포 (PBMC)를 수집하도록 백혈구 성분채집술을 거칠 것이다. T 세포가 CD3 비드를 사용하여 정제될 것이다. 이들 세포는 이전의 실시예에서 기술된 바와 같이 상응하는 렌티바이러스성 벡터로의 감염 이후에 퓨로마이신 저항성 유전자 (PAC)을 포함하는 CD8SP-HuLuc64-vL-V5-[hTCRb-KACIAH]-F-P2A-SP-HuLuc64-vH-Myc-[hTCRa-CSDVP]-F-F2A-PAC (092916-E07)[서열번호 1253] SIR를 발현하도록 T 세포를 조작하는데 사용될 수 있다. 이러한 SIR은 CS1, 골수종 세포 상에 발현된 항원을 표적한다. CD8SP-CS1-huLuc90-vL-V5-[hTCRb-KACIAH]-F-P2A-SP-huLuc90-vH-Myc-[hTCRa-CSDVP]-F-F2A-PAC (012716-A02)[서열번호 1254], CD8SP-CD138-vL-V5-[hTCRb-KACIAH]-F-P2A-SP-CD138-vH-Myc-[hTCRa-CSDVP]-F-F2A-PAC (100815-A05)[서열번호 1236] 또는 CD8SP-GPRC5D-ET150-5-vL-Myc2-[hTCRb-KACIAH]-F-P2A-SP-GPRC5D-ET150-5-vH-Myc4-[hTCRa-CSDVP]-F-F2A-PAC (100616-C03)[서열번호 1285]을 발현하는 SIR-T 세포는 대안으로서 또는 CS1을 표적하는 상기 SIR-T 세포와 조합하여 사용될 것이다. 대안적으로, SIR-T 세포는 레트로바이러스성 벡터로의 감염 이후에 또는 슬리핑 뷰티 트랜스포존을 사용하여 또는 IVT mRNA의 형질감염에 의해 생성될 수 있다. 후속적으로, 방출 테스트된 치료적 SIR-T 세포는 동결보존되고, 나중의 사용을 위해 저장되거나 신선하게 사용될 것이다. 골수 세포 및 말초 혈액 전구 세포 산물이 표준 절차 이후에 다발성 골수종을 갖는 환자로부터 수집될 것이다. 말초 혈액 줄기 세포의 고정화 이후에, 환자는 사이클로포스파미드 3 g/m2, 이어서 G-CSF 10 μg/kg를 사이클로포스파미드 이후 24시간째 시작하여 성분채집술이 완료될 때까지 매일 피하로 수여받을 것이다. 말초 혈액 줄기 세포는 일단 말초 혈액 CD34+ 세포 계수가 15개 세포/μL가 되면 수집될 것이다. 수집의 목표는 프로세싱 이후에 106개 CD34+ 세포/kg의 최소 두 배가 될 때까지 매일 3개 혈액 부피를 프로세싱하는 것이다. 골수 및 말초 혈액 줄기 세포 산물은 Miltenyi Biotec로부터의 CliniMACS 프로디지® 시스템을 사용하고 제조사의 추천사항에 따라 선택적으로 적혈구이 고갈되고/거나 CD34 발현하는 세포가 농축될 것이다. 산물은 신선하게 생체외 퍼징에 사용되거나 동결보존될 것이다. 퍼징을 위해, 골수 및 말초 혈액 줄기 세포 산물은 해동된 SIR-T 세포와 함께 5 : 1 내지 30 : 1 범위를 갖는 효과기 대 표적 비율로 100 IU 재조합 인간 IL2가 보충된 XVIVO (Lonza) 배지에서 4 내지 24시간 동안 공동배양될 것이다. 세포는 5% CO2 습식 배양기에서 37℃로 배양되었다. 공동배양 기간의 종료 시, 세포의 일정량을 무균도 및 품질 테스트 (CFU-GM의 측정 및 CD34 및 CD138 양성 세포의 유세포 계측법 포함)를 위해 취하였다. 잔여 시료는 이전에 골수절제 화학요법 (예로, 고용량 멜팔란, 총 용량 140 mg/m2의 분할된 용량 70 mg/m2 두 번)을 받았던 환자에게 정맥내로 투여될 것이다.
자가면역 질환의 억압을 위한 자가-SIR의 사용
보통 천포창을 갖는 환자가 Dsg3 세포외 도메인을 포함하는 SIR의 안전성 및 효능을 테스트하도록 임상 시험에 등록될 것이다. 환자는 치료에 저항성을 갖는 보통 천포창의 진단 이후에 등록될 것이고, 이 시점에 이들은 말초 혈액 단핵구 세포 (PBMC)의 수집을 위한 백혈구 성분채집술을 거칠 것이다. 이들 세포는 이전의 실시예에서 기술된 바와 같이 상응하는 렌티바이러스성 벡터로의 감염 이후에 SIR CD8SP-MYC-[hTCRa-T48C-opt1]-F-F2A-SP-Dsg3-ECD-V5-[hTCRb-S57C-opt1]-F-P2A-PAC (서열번호 1144)를 발현하도록 T 세포를 조작하는데 사용될 것이다. 대안적으로, SIR-T 세포는 레트로바이러스성 벡터로의 감염 이후에 또는 슬리핑 뷰티 트랜스포존을 사용하여 또는 IVT mRNA의 형질감염에 의해 생성될 수 있다. 후속적으로, 방출 테스트된 치료적 SIR-T 세포는 동결보존되고, 나중의 사용을 위해 저장될 것이다. 환자는 림프고갈하는 사이클로포스파미드 (750 mg/m2 IV) 화학요법의 단일 용량을 SIR-변형된 T 세포로의 치료를 시작하기 이전 2 내지 4일째 수여받을 것이다. 형질도입된 T 세포는 주입 이전에 수, 순도, 생존도 및 무균도에 대해 품질 테스트될 것이다. SIR-T 산물의 용량은 연구 프로토콜에 따라 1 × 104개 SIR+ve CD3 세포/kg 내지 5 × 109개 SIR+ve CD3 세포/kg의 범위를 갖을 수 있다. SIR-T 산물은 단일 주입 또는 분리된 주입으로 투여될 수 있다. 연구 참가자는 T 세포 주입 이전에 적어도 30분 미리, 15 mg/kg의 아세토아미노펜 P.O. (최대 650 mg) 및 디펜하이드라민 0.5 내지 1 mg/kg I.V. (최대 용량 50 mg)이 투약될 수 있다. 다음으로 임상 및 연구실 상관된 추적 연구가 의사의 판단으로 수행될 수 있다.
다수의 구현예가 본 발명을 예시하도록 상기에 설명되었다. 다음의 청구항은 출원인이 이들의 발명으로서 간주하는 것을 추가로 설명하고 있다.
Claims (198)
- 적어도 하나의 합성 면역 수용체 (SIR)를 인코딩하는 적어도 하나의 재조합 폴리뉴클레오티드로서,
상기 적어도 하나의 SIR은
(a) (i) 서열번호 3010과 적어도 98% 동일하고, 48, 61, 91, 92, 93, 및/또는 94번 위치에서 하나 이상의 돌연변이를 갖으며, 조건부 부속 모듈을 포함할 수 있는 아미노산 서열;
(ii) 서열번호 3024와 적어도 98% 동일하고, 18, 22, 57, 79, 133, 136 및/또는 139번 위치에서 하나 이상의 돌연변이를 갖으며, 조건부 부속 모듈을 포함할 수 있는 아미노산 서열;
(iii) 서열번호 3025와 적어도 98% 동일하고, 18, 22, 57, 79, 133, 136 및/또는 139번 위치에서 하나 이상의 돌연변이를 갖으며, 조건부 부속 모듈을 포함할 수 있는 아미노산 서열;
(iv) 서열번호 3046, 3047 또는 3048과 적어도 98% 동일하고, 조건부 부속 모듈을 포함할 수 있는 아미노산 서열;
(v) 서열번호 3049와 적어도 98% 동일하고, 조건부 부속 모듈을 포함할 수 있는 아미노산 서열;
(vi) 서열번호 3051 또는 3052와 적어도 98% 동일하고, 조건부 부속 모듈을 포함할 수 있는 아미노산 서열; 및
(vii) (i) 및 (ii), (i) 및 (iii), (iv) 및 (ii), (iv) 및 (iii), 그리고 (v) 및 (vi)로부터 선택된 두 개의 TCR 불변 사슬의 이량체 조합:
으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 T 세포 수용체 (TCR) 불변 사슬;
(b) 조건부 링커: 및
(c) (1) 항체;
(2) 항체 단편 (예로, Fv, Fab, (Fab')2);
(3) 항체 (vH 도메인) 또는 이의 단편의 중쇄 가변 영역;
(4) 항체 (vL 도메인) 또는 이의 단편의 경쇄 가변 영역;
(5) 단일 사슬 가변 단편 (scFv) 또는 이의 단편;
(6) 단일 도메인 항체 (SDAB) 또는 이의 단편;
(7) 카멜리드 VHH 도메인 또는 이의 단편;
(8) 항체의 단량체 가변 영역;
(9) 다르핀 (DARPIN), 어피바디, 어필린, 어드넥틴, 어피틴, 오바디, 레페바디, 파이노머, 알파바디, 어비머, 아트리머, 센티린, 프로넥틴, 안티칼린, 쿠니츠 도메인, 아미딜로 반복서열 단백질 또는 이들의 단편과 같은 비-면역글로불린 항원 결합 스캐폴드;
(10) 수용체 또는 이의 단편;
(11) 리간드 또는 이의 단편;
(12) 이중특이적 -항체, -항체 단편, -scFV, -vHH, -SDAB, -비-면역글로불린 항원 결합 스캐폴드, -수용체 또는 -리간드; 및
(13) 자가항원 또는 이의 단편:
으로 이루어진 군으로부터 선택된 (a)에 연결된 하나 이상의 비-천연 TCR 항원 결합 도메인(들):을 포함하고,
상기 (a)(i) 내지 (a)(iii)의 돌연변이 및 상기 (a)(vii)의 이량체는 항원 결합 도메인의 표적 도메인에 대한 다양한 결합 친화도를 제공하고, 이는 동일한 결합 도메인을 갖는 cTCR의 결합 친화도보다 적어도 5% 더 높고, 상기 합성 면역 수용체가 림프구에서 발현 시, 하나 이상의 연속적 사슬로 상기 항원 결합 도메인 및 상기 T 세포 수용체 불변 사슬 둘 다를 상기 림프구의 표면 상에 발현하여, 상기 발현된 항원 결합 도메인이 이의 항원에 결합할 때 림프구가 활성화하고/거나, 증식하고/거나, 사이토카인을 분비하고/거나, 표적 세포의 살상을 조정 (유도 또는 억압)하도록 촉발되고, MHC-제한 및 MHC-비-제한된 항체-유형 특이성을 갖는, 재조합 폴리뉴클레오티드. - 제 1항에 있어서,
상기 (a)(vii)의 TCR 불변 사슬을 포함하고, 상기 비-천연 TCR 결합 도메인은
- 발현될 때 하기 항체 또는 이의 단편의 하나의 중쇄 및 경쇄가 상기 T 세포 불변 영역의 상기 (a)(vii)의 두 개 사슬 중 하나에 부착되고, 하기 항체 또는 이의 단편의 나머지의 중쇄 및 경쇄는 상기 T 세포 불변 영역의 상기 두 개 사슬 중 나머지에 부착되도록, 사전 정의된 표적 항원에 특이적인 항체 또는 이의 단편의 중쇄 및 경쇄의 가변 영역;
- 발현될 때 하기 scFv 중 하나가 상기 T 세포 불변 영역의 상기 (a)(vii)의 두 개 사슬 중 하나에 부착되고, 하기 scFv 중 나머지는 상기 T 세포 불변 영역의 상기 두 개 사슬 중 나머지에 부착되도록, 하나 이상의 사전 정의된 표적 항원에 특이적인 두 개의 단일 사슬 가변 단편 (scFv);
- 발현될 때 하기 항체 단편 중 하나가 상기 T 세포 불변 영역의 상기 (a)(vii)의 두 개 사슬 중 하나에 부착되고, 하기 항체 단편 중 나머지는 상기 T 세포 불변 영역의 상기 두 개 사슬 중 나머지에 부착되도록, 하나 이상의 사전 정의된 표적 항원에 특이적인 두 개의 항체 단편;
- 발현될 때 하기 SDAB 단편 중 하나가 상기 T 세포 불변 영역의 상기 (a)(vii)의 두 개 사슬 중 하나에 부착되고, 하기 SDAB 단편 중 나머지는 상기 T 세포 불변 영역의 상기 두 개 사슬 중 나머지에 부착되도록, 하나 이상의 사전 정의된 표적 항원에 특이적인 두 개의 단일 도메인 항체 (SDAB);
- 발현될 때 하기 vHH 도메인 중 하나가 상기 T 세포 불변 영역의 상기 (a)(vii)의 두 개 사슬 중 하나에 부착되고, 하기 vHH 도메인 중 나머지는 상기 T 세포 불변 영역의 상기 두 개 사슬 중 나머지에 부착되도록, 하나 이상의 사전 정의된 표적 항원에 특이적인 두 개의 카멜리드 vHH 도메인;
- 발현될 때 하기 비-면역글로불린 항원 결합 스캐폴드 중 하나가 상기 T 세포 불변 영역의 상기 (a)(vii)의 두 개 사슬 중 하나에 부착되고, 하기 비-면역글로불린 항원 결합 스캐폴드 중 나머지는 상기 T 세포 불변 영역의 상기 두 개 사슬 중 나머지에 부착되도록, 하나 이상의 사전 정의된 표적 항원에 특이적인 두 개의 비-면역글로불린 항원 결합 스캐폴드;
- 발현될 때 하기 수용체 또는 이의 단편 중 하나가 상기 T 세포 불변 영역의 상기 (a)(vii)의 두 개 사슬 중 하나에 부착되고, 하기 수용체 또는 이의 단편의 나머지는 상기 T 세포 불변 영역의 상기 두 개 사슬 중 나머지에 부착되도록, 하나 이상의 사전 정의된 표적 항원에 특이적인 두 개의 수용체 또는 이의 단편;
- 발현될 때 하기 리간드 또는 이의 단편 중 하나가 상기 T 세포 불변 영역의 상기 (a)(vii)의 두 개 사슬 중 하나에 부착되고, 하기 리간드 또는 이의 단편의 나머지는 상기 T 세포 불변 영역의 상기 두 개 사슬 중 나머지에 부착되도록, 하나 이상의 사전 정의된 표적 항원에 특이적인 두 개의 리간드 또는 이의 단편;
- 발현될 때 하기 항원 결합 단편 중 하나가 상기 T 세포 불변 영역의 상기 (a)(vii)의 두 개 사슬 중 하나에 부착되고, 하기 항원 결합 단편의 나머지는 상기 T 세포 불변 영역의 상기 두 개 사슬 중 나머지에 부착되도록, 하나 이상의 사전 정의된 표적 항원에 특이적인 두 개의 구조적으로 구별된 항원 결합 단편;
- 발현될 때 하기 항원 결합 단편 중 하나가 상기 T 세포 불변 영역의 상기 (a)(vii)의 두 개 사슬 중 하나에 부착되고, 하기 항원 결합 단편의 나머지는 상기 T 세포 불변 영역의 상기 두 개 사슬 중 나머지에 부착되도록, 하나 또는 둘 다가 이중특이적 또는 다중특이적인 두 개의 결합 단편;
- 발현될 때 하기 자가항원 또는 이의 단편 중 하나가 상기 T 세포 불변 영역의 상기 (a)(vii)의 두 개 사슬 중 하나에 부착되고, 하기 자가항원 또는 이의 단편의 나머지는 상기 T 세포 불변 영역의 상기 두 개 사슬 중 나머지에 부착되도록, 두 개의 자가항원 또는 이의 단편;
- 발현될 때 하기 vL 또는 이의 단편 중 하나가 상기 T 세포 불변 영역의 상기 (a)(vii)의 두 개 사슬 중 하나에 부착되고, 하기 vL 또는 이의 단편의 나머지는 상기 T 세포 불변 영역의 상기 두 개 사슬 중 나머지에 부착되도록, 두 개의 vL 또는 이의 단편; 및
- 발현될 때 하기 vH 또는 이의 단편 중 하나가 상기 T 세포 불변 영역의 상기 (a)(vii)의 두 개 사슬 중 하나에 부착되고, 하기 vH 또는 이의 단편의 나머지는 상기 T 세포 불변 영역의 상기 두 개 사슬 중 나머지에 부착되도록, 두 개의 vH 또는 이의 단편:
으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 재조합 폴리뉴클레오티드. - 제 1항에 있어서,
상기 (a)(iv)의 TCR 불변 사슬을 포함하고, 상기 비-천연 TCR 결합 도메인은
- 사전 정의된 표적 항원에 특이적인 항체 또는 이의 단편의 중쇄 (vH)의 가변 영역;
- 사전 정의된 표적 항원에 특이적인 항체 또는 이의 단편의 경쇄 (vL)의 가변 영역;
- 사전 정의된 표적 항원에 특이적인 단일 사슬 가변 단편 (scFv) 또는 이의 단편;
- 사전 정의된 표적 항원에 특이적인 항체 단편 (예로, Fv, Fab, (Fab')2);
- 사전 정의된 표적 항원에 특이적인 단일 도메인 항체 (SDAB);
- 사전 정의된 표적 항원에 특이적인 카멜리드 vHH 도메인;
- 사전 정의된 표적 항원에 특이적인 비-면역글로불린 항원 결합 스캐폴드;
- 사전 정의된 표적 항원에 특이적인 수용체 또는 이의 단편;
- 사전 정의된 표적 항원에 특이적인 리간드 또는 이의 단편;
- 하나 이상의 사전 정의된 표적 항원에 특이적인 이중특이적 -항체, -항체 단편, -scFV, -vHH, -SDAB, -비-면역글로불린 항원 결합 스캐폴드, -수용체 또는 -리간드; 및
- 자가항원 또는 이의 단편:
으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 재조합 폴리뉴클레오티드. - 제 1항에 있어서,
상기 (i), (ii), (iii), (iv), (v) 또는 (vi)을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하고, 상기 비-천연 TCR 결합 도메인은
- 사전 정의된 표적 항원에 특이적인 항체 또는 이의 단편의 중쇄 (vH)의 가변 영역;
- 사전 정의된 표적 항원에 특이적인 항체 또는 이의 단편의 경쇄 (vL)의 가변 영역;
- 사전 정의된 표적 항원에 특이적인 단일 사슬 가변 단편 (scFv) 또는 이의 단편;
- 사전 정의된 표적 항원에 특이적인 항체 단편 (예로, Fv, Fab, (Fab')2);
- 사전 정의된 표적 항원에 특이적인 단일 도메인 항체 (SDAB);
- 사전 정의된 표적 항원에 특이적인 카멜리드 vHH 도메인;
- 사전 정의된 표적 항원에 특이적인 비-면역글로불린 항원 결합 스캐폴드;
- 사전 정의된 표적 항원에 특이적인 수용체 또는 이의 단편;
- 사전 정의된 표적 항원에 특이적인 리간드 또는 이의 단편;
- 하나 이상의 사전 정의된 표적 항원에 특이적인 이중특이적 -항체, -항체 단편, -scFV, -vHH, -SDAB, -비-면역글로불린 항원 결합 스캐폴드, -수용체 또는 -리간드; 및
- 자가항원 또는 이의 단편:
으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 재조합 폴리뉴클레오티드. - 제 1항에 있어서,
상기 TCR 불변 사슬을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드는 코돈-최적화된 서열인, 재조합 폴리뉴클레오티드. - 제 1항에 있어서,
상기 (a)의 TCR 불변 사슬을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드는 TCR 불변 사슬의 발현 및/또는 쌍 형성을 증진하고, 이들의 내인성 세포 수용체 사슬과의 쌍 형성을 감소시키는 돌연변이를 포함하는 TCR 불변 사슬(들)을 인코딩하는, 재조합 폴리뉴클레오티드. - 제 1항에 있어서,
상기 (a)의 TCR 불변 사슬을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 730 내지 743의 핵산 서열의 1 내지 40개 변형의 핵산 서열 또는 서열번호 730 내지 743의 핵산 서열과 적어도 70% 동일성을 갖는 서열을 포함하고, TCRβ1 또는 TCRβ2 사슬과 이중합할 수 있는, 재조합 폴리뉴클레오티드. - 제 1항에 있어서,
상기 (b) 또는 (c)의 TCR 불변 사슬을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 744 내지 765의 핵산 서열의 1 내지 40개 변형의 핵산 서열 또는 서열번호 744 내지 765의 핵산 서열과 적어도 70% 동일성을 갖는 서열을 포함하고, TCRα 사슬과 이중합할 수 있는, 재조합 폴리뉴클레오티드. - 제 1항에 있어서,
상기 (v)의 TCR 불변 사슬을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 769 또는 770의 핵산 서열의 1 내지 40개 변형의 핵산 서열 또는 서열번호 769 또는 770의 핵산 서열과 적어도 70% 동일성을 갖는 서열을 포함하고, TCRδ 사슬과 이중합할 수 있는, 재조합 폴리뉴클레오티드. - 제 1항에 있어서,
상기 (vi)의 TCR 불변 사슬을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 771 또는 772의 핵산 서열의 1 내지 40개 변형의 핵산 서열 또는 서열번호 771 또는 772의 핵산 서열과 적어도 70% 동일성을 갖는 서열을 포함하고, TCRγ 사슬과 이중합할 수 있는, 재조합 폴리뉴클레오티드. - 제 1항에 있어서,
상기 (a)의 TCR 불변 사슬을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 766 내지 768의 핵산 서열의 1 내지 40개 변형의 핵산 서열 또는 서열번호 766 내지 768의 핵산 서열과 적어도 70% 동일성을 갖는 서열을 포함하고, TCRβ1 또는 TCRβ2 사슬과 이중합할 수 있는, 재조합 폴리뉴클레오티드. - 제 1항에 있어서,
상기 하나 이상의 비-천연 항원 결합 도메인(들)은 CD19; CD123; CD22; CD30; CD171; CS-1 (CD2 하위집합 1, CRACC, SLAMF7, CD319 및 19A24라고도 지칭됨); C형 렉틴-유사 분자-1 (CLL-1 또는 CLECL1); CD33; 표피 성장인자 수용체 변이체 Ⅲ (EGFRvⅢ); 갱글리오시드 G2 (GD2); 갱글리오시드 GD3 (aNeu5Ac(2-8)aNeu5Ac(2-3)bDGalp(l-4)bDGlcp(l-l)Cer); TNF 수용체 패밀리 구성원 B 세포 성숙 (BCMA); Tn 항원 ((Tn Ag) 또는 (GalNAcα-Ser/Thr)); 전립선-특이적 막 항원 (PSMA); 수용체 타이로신 키나제-유사 고아 수용체 1 (ROR1); Fms 유사 타이로신 키나제 3 (FLT3); 종양-관련 당당백질 72 (TAG72); CD38; CD44v6; 급성 백혈병 또는 림프종 상에서 발현되지만 조혈 전구세포 상에서는 발현되지 않는 글리코실화된 CD43 에피토프; 비-조혈성 암 상에서 발현된 글리코실화된 CD43 에피토프; 암배아 항원 (CEA); 상피세포 부착 분자 (EPCAM); B7H3 (CD276); KIT (CD117); 인터루킨-13 수용체 소단위체 알파-2 (IL-13Ra2 또는 CD213A2); 메소틸린; 인터루킨 11 수용체 알파 (IL-llRa); 전립선 줄기 세포 항원 (PSCA); 프로테아제 세린 21 (테스티신 또는 PRSS21); 혈관 내피 성장인자 수용체 2 (VEGFR2); 루이스 (Y) 항원; CD24; 혈소판-유래 성장인자 수용체 베타 (PDGFR-베타); 단계-특이적 배아 항원-4 (SSEA-4); CD20; 폴레이트 수용체 알파; 수용체 타이로신-단백질 키나제 ERBB2 (Her2/neu); 세포 표면 연관된 뮤신 1 (MUC1); 상피 성장인자 수용체 (EGFR); 신경 세포 부착 분자 (NCAM); 프로스타제; 전립샘 산 포스파타제 (PAP); 변이된 신장인자 2 (ELF2M); 에프린 B2; 섬유모세포 활성화 단백질 알파 (FAP); 인슐린-유사 성장인자 1 수용체 (IGF-I 수용체); 탄산 무수화제 Ⅸ (CAⅨ); 프로테오좀 (프로좀, 마크로페인) 소단위체 베타형, 9 (LMP2); 당단백질 100 (gpl00); 절단점 클러스터 영역 (BCR)으로 구성된 종양원 유전자 융합 단백질 및 아벨슨 마우스 백혈병 바이러스 종양원 유전자 상동체 1 (Abl) (bcr-abl); 티로시나제; 에프린 A형 수용체 2 (EphA2); 퓨코실 GM1; 시아릴 루이스 부착 분자 (sLe); 갱글리오시드 GM3 (aNeu5Ac(2-3)bDClalp(l-4)bDGlcp(l-1)Cer); 글루타민 전이효소 5 (TGS5); 고분자량 흑색종 관련된 항원 (HMWMAA); o-아세틸-GD2 갱글리오시드 (OAcGD2); 종양 내피 마커 1 (TEM1/CD248); 관련된 종양 내피 마커 7 (TEM7R); 클라우딘 6 (CLDN6); 갑상샘 자극호르몬 수용체 (TSHR); G 단백질 연결된 수용체 클래스 C 그룹 5, 구성원 D (GPRC5D); 염색체 X 오픈 리딩 프레임 61 (CXORF61); CD97; CD179a; 역형성 림프종 키나제 (ALK); 폴리시알산; 태반-특이적 항원 1 (PLAC1); 글로보H 글리코세라미드의 육당질 부분 (글로보H); 유샘 분화 항원 (NY-BR-1); 유로플라킨 2 (UPK2); A형 간염 바이러스 세포 수용체 1 (HAVCR1); 아드레노셉터 베타 3 (ADRB3); 패넥신 3 (PANX3); G 단백질-연결된 수용체 20 (GPR20); 림프구 항원 6 복합체, 좌위 K 9 (LY6K); 후각 수용체 51E2 (OR51E2); TCR 감마 교대 리딩 프레임 단백질 (TARP); 윌름 종양 단백질 (WT1); 암/고환 항원 1 (NY-ES0-1); 암/고환 항원 2 (LAGE-1a); 흑색종-관련 항원 1 (MAGE-A1); 염색체 12p 상에 위치한 ETS 전위 변이체 유전자 6 (ETV6-AML); 정자 단백질 17 (SPA17); X 항원 패밀리, 구성원 lA (XAGEl); 안지오포이에틴-결합 세포 표면 수용체 2 (타이 2); 흑색종 암 고환 항원-1 (MAD-CT-1); 흑색종 암 고환 항원-2 (MAD-CT-2); Fos-관련된 항원 1; 종양 단백질 p53 (p53); p53 돌연변이체; 프로스테인; 서바이빈; 텔로머라제; 전립선 암종 종양 항원-1 (PCT A-1 또는 갈렉틴 8); T 세포에 의해 인식되는 흑색종 항원 1 (MelanA 또는 MARTI); 래트 육종 (Ras) 돌연변이체; 인간 텔로머라제 역전사효소 (hTERT); 육종 전위 절단점; 흑색종의 세포사멸 저해제 (ML-IAP); ERG (막통과 프로테아제, 세린 2 (TMPRSS2) ETS 융합 유전자); N-아세틸 글루코사미닐-전이효소 V (NA17); 쌍 형성된 박스 단백질 Pax-3 (PAX3); 안드로겐 수용체; 사이클린 Bl; v-myc 조류 백혈병 바이러스 종양원 유전자 신경모세포종 유래된 상동체 (MYCN); Ras 상동체 패밀리 구성원 C (RhoC); 티로시나제-관련 단백질 2 (TRP-2); 사이토크롬 P450 lB 1 (CYPlB 1); CCCTC-결합 인자 (아연 핑거 단백질)-유사 (BORIS 또는 각인 부위의 조절인자의 형제), T 세포에 의해 인식되는 편평세포 암종 항원 3 (SART3); 쌍 형성된 박스 단백질 Pax-5 (PAX5); 프로아크로신 결합 단백질 sp32 (OY-TESl); 림프구-특이적 단백질 타이로신 키나제 (LCK); 키나제 고정 단백질 4 (AKAP-4); 활액 육종 X 절단점 2 (SSX2); 진행된 당화 말단 산물의 수용체 (RAGE-1); 신장 유비퀴터스 1 (RUl); 신장 유비퀴터스 2 (RU2); 레구마인; 인간 파필로마 바이러스 E6 (HPV E6); 인간 파필로마 바이러스 E7 (HPV E7); 장내 카르복실 에스테라제; 변이된 열 충격 단백질 70-2 (hsp70-2); CD79a; CD79b; CD72; 백혈구-관련된 면역글로불린-유사 수용체 1 (LAIRl); IgA 수용체의 Fc 단편 (FCAR 또는 CD89); 백혈구 면역글로불린-유사 수용체 서브패밀리 A 구성원 2 (LILRA2); CD300 분자-유사 패밀리 구성원 f (CD300LF); C형 렉틴 도메인 패밀리 12 구성원 A (CLEC12A); 골수 간질 세포 항원 2 (BST2); EGF-유사 모듈-포함 뮤신-유사 호르몬 수용체-유사 항원 2 (EMR2); 림프구 항원 75 (LY75); 글리피칸-3 (GPC3); Fc 수용체-유사 5 (FCRL5); 면역글로불린 람다-유사 폴리펩티드 1 (IGLLl); MPL; 바이오틴; c-MYC 에피토프 태그; CD34; LAMP1; TROP2;, GFRα4; CDH17; CDH6; NYBR1; CDH19; CD200R; Slea (CA19.9; 시아릴 루이스 항원); 퓨코실-GM1; PTK7; gpNMB; CDH1-CD324; DLL3; CD276/B7H3; IL-11Ra; IL-13Ra2; CD179b-IGLl1; ALK TCRγ-δ; NKG2D; CD32 (FCGR2A); Tn ag; CSPG4-HMW-MAA; Tim1-/HVCR1; CSF2RA (GM-CSFR-알파); TGFβR2; VEGFR2/KDR; 루이스 항원; TCR-β1 사슬; TCR-β2 사슬, TCR-γ 사슬, TCR-δ 사슬; FITC; 황체형성 호르몬 수용체 (LHR); 난포 자극 호르몬 수용체 (FSHR); 융모생식샘 자극호르몬 수용체 (CGHR); CCR4; GD3; SLAMF6; SLAMF4; HIV1 외투 당단백질; HTLV1-Tax; CMV pp65; EBV-EBNA3c; 인플루엔자 A 헤마글루티닌 (HA); GAD; PDL1; 구아니릴 사이클라제 C (GCC); KSHV-K8.1 단백질; KSHV-gH 단백질; 데스모글레인 3 (Dsg3)에 대한 자가항체; 데스모글레인 1 (Dsg1)에 대한 자가항체; HLA, HLA-A, HLA-A2, HLA-B, HLA-C, HLA-DP, HLA-DM, HLA-DOA, HLA-DOB, HLA-DQ, HLA-DR, HLA-G; IGE; CD99; RAS; G12V; 조직 인자 1 (TF1); AFP; GPRC5D; 클라우딘18.2 (CLD18A2 또는 CLDN18A.2)); P-당단백질; STEAP1; LIV1; 넥틴-4; CRIPTO; GPA33; BST1/CD157; 저전도도 염화물 통로; 및 TNT 항체에 의해 인식되는 항원:
으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 질환 관련 항원에 결합하는, 재조합 폴리뉴클레오티드. - 제 12항에 있어서,
상기 하나 이상의 비-천연 TCR 항원 결합 도메인(들)은 항체, 항체 단편, scFv, Fv, Fab, (Fab')2, 단일 도메인 항체 (SDAB), vH 또는 vL 도메인, 카멜리드 VHH 도메인, 다르핀, 어피바디, 어필린, 어드넥틴, 어피틴, 오바디, 레페바디, 파이노머, 알파바디, 어비머, 아트리머, 센티린, 프로넥틴, 안티칼린, 쿠니츠 도메인, 아미딜로 반복서열 단백질과 같은 비-면역글로불린 항원 결합 스캐폴드, 수용체 또는 리간드를 포함하는, 재조합 폴리뉴클레오티드. - 제 12항에 있어서,
상기 하나 이상의 비-천연 TCR 항원 결합 도메인(들)은
(i) 서열번호 226 내지 400 또는 10203 내지 10321 중 어느 하나의 서열 또는 이와 적어도 98% 동일성을 갖고, 이의 항원에 결합하는 폴리펩티드를 인코딩하는 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드에 의해 인코딩되는, 중쇄 가변 영역 (vH);
(ii) 서열번호 16 내지 191 또는 10085 내지 10202 중 어느 하나의 서열 또는 이와 적어도 98% 동일성을 갖고, 이의 항원에 결합하는 폴리펩티드를 인코딩하는 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드에 의해 인코딩되는, 경쇄 가변 영역 (vL);
(iii) 서열번호 488 657, 10346 내지 10400 또는 18098 내지 18160 중 어느 하나의 서열 또는 이와 적어도 98% 동일성을 갖고, 이의 항원에 결합하는 폴리펩티드를 인코딩하는 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드에 의해 인코딩되는, 단일 사슬 가변 단편 (scFv);
(iv) 서열번호 421 내지 445 또는 10322 내지 10337 중 어느 하나의 서열 또는 이와 적어도 98% 동일성을 갖고, 이의 항원에 결합하는 폴리펩티드를 인코딩하는 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드에 의해 인코딩되는, 카멜리드 VHH 도메인;
(v) 서열번호 439 내지 443 중 어느 하나의 서열 또는 이와 적어도 98% 동일성을 갖고, 이의 항원에 결합하는 폴리펩티드를 인코딩하는 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드에 의해 인코딩되는, 비-면역글로불린 스캐폴드;
(vi) 서열번호 456 내지 468 중 어느 하나의 서열 또는 이와 적어도 98% 동일성을 갖고, 이의 동족체에 결합하는 폴리펩티드를 인코딩하는 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드에 의해 인코딩되는, 수용체; 및
(vii) 서열번호 476 내지 486 또는 10402 내지 10404 중 어느 하나의 서열 또는 이와 적어도 98% 동일성을 갖고, 이의 동족체에 결합하는 폴리펩티드를 인코딩하는 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드에 의해 인코딩되는, 리간드:
로 이루어진 군으로부터 선택되는, 재조합 폴리뉴클레오티드. - 제 1항에 있어서,
상기 하나 이상의 비-천연 TCR 항원 결합 도메인(들)은 임의의 서열번호 13999 내지 14879 또는 14880에 나타낸 바와 같은 선택된 표적 항원에 대한 하나 이상의 경쇄 상보성 결정 영역 및/또는 임의의 서열번호 14881 내지 15761 또는 15762에 나타낸 바와 같은 선택된 표적 항원에 대한 하나 이상의 중쇄 상보성 결정 영역을 포함하는, 재조합 폴리뉴클레오티드. - 제 1항에 있어서,
상기 하나 이상의 비-천연 TCR 항원 결합 도메인(들)은 최대 10개의 보존적 아미노산 치환을 갖는 임의의 서열번호 2307 내지 2482 또는 12042 내지 12159의 서열을 포함하는 가변 경쇄 (vL) 도메인 및/또는 최대 10개의 보존적 아미노산 치환을 갖는 임의의 서열번호 2506 내지 2580 또는 12160 내지 12278의 서열을 포함하는 가변 중쇄 (vH) 도메인을 포함하는, 재조합 폴리뉴클레오티드. - 제 1항에 있어서,
상기 하나 이상의 비-천연 TCR 항원 결합 도메인(들)은 최대 10개의 보존적 아미노산 치환을 갖는 임의의 서열번호 2701 내지 2725 또는 12279 내지 12294에 나타낸 바와 같은 선택된 항원에 대한 하나 이상의 카멜리드 vHH 상보성 결정 영역을 포함하는, 재조합 폴리뉴클레오티드. - 제 1항에 있어서,
상기 하나 이상의 비-천연 TCR 항원 결합 도메인(들)은 임의의 서열번호 2728 내지 2732 또는 12296 내지 12301에 나타낸 바와 같은 서열을 갖고, 최대 10개의 보존적 아미노산 치환을 갖는 비-면역글로불린 항원 결합 도메인을 포함하는, 재조합 폴리뉴클레오티드. - 제 1항에 있어서,
상기 하나 이상의 비-천연 TCR 항원 결합 도메인(들)은 서열번호 2307 내지 2482 또는 12042 내지 12159 중 어느 하나의 서열을 포함하는 하나 이상의 경쇄 상보성 결정 영역 (vL) 도메인 및/또는 서열번호 2506 내지 2680 또는 12160 내지 12278의 서열을 포함하는 하나 이상의 중쇄 상보성 결정 영역 (vH) 도메인을 포함하는, 재조합 폴리뉴클레오티드. - 제 1항에 있어서,
상기 하나 이상의 비-천연 TCR 항원 결합 도메인(들)은 각각이 최대 10개의 보존적 아미노산 치환을 갖는 서열번호 2770 내지 2939, 12303 내지 12357 또는 18162 내지 18224로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 갖는 scFv 단편을 포함하는, 재조합 폴리뉴클레오티드. - 제 1항에 있어서,
상기 하나 이상의 비-천연 TCR 항원 결합 도메인(들)은 각각이 최대 10개의 보존적 아미노산 치환을 갖는 임의의 서열번호 2736 내지 2748의 아미노산 서열을 포함하는 하나 이상의 수용체를 포함하는, 재조합 폴리뉴클레오티드. - 제 1항에 있어서,
상기 하나 이상의 비-천연 TCR 항원 결합 도메인(들)은 최대 10개의 보존적 아미노산 치환을 갖는 임의의 서열번호 2758 내지 2768 또는 12359 내지 12361의 서열을 포함하는 하나 이상의 수용체를 포함하는, 재조합 폴리뉴클레오티드. - 제 1항에 있어서,
상기 하나 이상의 비-천연 TCR 항원 결합 도메인(들)은 CD16A, NKG2D, CD4, PD1, 데스모글레인 3 (Dsg3) 또는 CD4-DC-SIGN의 세포외 도메인을 포함하는, 재조합 폴리뉴클레오티드. - 제 1항에 있어서,
상기 하나 이상의 비-천연 TCR 항원 결합 도메인(들)은 hTPO, mTPO, CGHα 사슬, CGHβ 사슬, FHβ 사슬, LHβ 사슬, TSHβ 사슬, APRIL 또는 이들의 조합 중 하나 이상의 세포외 도메인을 포함하는, 재조합 폴리뉴클레오티드. - 제 1항에 있어서,
상기 하나 이상의 비-천연 TCR 항원 결합 도메인(들)은
임의의 서열번호 2770 내지 2939, 12303 내지 12357 또는 18162 내지 18224의 서열을 포함하고, 최대 10개의 보존적 아미노산 치환을 갖는 임의의 단일 사슬 가변 단편 (scFv) 및
(a) 최대 10개의 보존적 아미노산 치환을 갖는 임의의 서열번호 2701 내지 2725 또는 12279 내지 12294에 나타낸 바와 같은 임의의 카멜리드 vHH; 또는
(b) 임의의 서열번호 2728 내지 2732 또는 12296 내지 12301에 나타낸 바와 같은 서열을 갖고, 최대 10개의 보존적 아미노산 치환을 갖는 임의의 비-면역글로불린 항원 결합 도메인; 또는
(c) 최대 10개의 보존적 아미노산 치환을 갖는 임의의 서열번호 2736 내지 2748의 아미노산 서열을 포함하는 수용체의 임의의 세포외 도메인; 또는
(d) 최대 10개의 보존적 아미노산 치환을 갖는 임의의 서열번호 2758 내지 2768 또는 12359 내지 12361의 서열을 포함하는 리간드의 임의의 세포외 도메인:
을 포함하는, 재조합 폴리뉴클레오티드. - 제 1항에 있어서,
상기 하나 이상의 비-천연 TCR 항원 결합 도메인(들)은
최대 10개의 보존적 아미노산 치환을 갖는 임의의 서열번호 2701 내지 2725 또는 12279 내지 12294에 나타낸 바와 같은 카멜리드 vHH 및
(a) 임의의 서열번호 2770 내지 2939, 12303 내지 12357 또는 18162 내지 18224의 서열을 포함하고, 최대 10개의 보존적 아미노산 치환을 갖는 임의의 단일 사슬 가변 단편 (scFv); 또는
(b) 임의의 서열번호 2728 내지 2732 또는 12296 내지 12301에 나타낸 바와 같은 서열을 갖고, 최대 10개의 보존적 아미노산 치환을 갖는 임의의 비-면역글로불린 항원 결합 도메인; 또는
(c) 최대 10개의 보존적 아미노산 치환을 갖는 임의의 서열번호 2736 내지 2748의 아미노산 서열을 포함하는 수용체의 임의의 세포외 도메인; 또는
(d) 최대 10개의 보존적 아미노산 치환을 갖는 임의의 서열번호 2758 내지 2768 또는 12359 내지 12361의 서열을 포함하는 리간드의 임의의 세포외 도메인:
을 포함하는, 재조합 폴리뉴클레오티드. - 제 1항에 있어서,
상기 하나 이상의 비-천연 TCR 항원 결합 도메인(들)은 선택적으로 링커 영역에 의해 TCR 불변 영역 사슬 각각에 연결되고, 상기 링커 영역 핵산은 서열번호 2981 내지 3003 및 이들의 임의의 조합 또는 이와 적어도 98% 동일성을 갖는 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 인코딩하거나, 상기 링커가 서열번호 701 내지 725 또는 이와 적어도 98% 동일성을 갖는 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 핵산 서열에 의해 인코딩되는, 재조합 폴리뉴클레오티드. - 제 1항에 있어서,
상기 하나 이상의 비-천연 TCR 항원 결합 도메인(들)은 이것이 획득된 항체보다 적어도 5배 낮은 이의 표적 항원에 대한 결합 친화도를 갖는, 재조합 폴리뉴클레오티드. - 제 1항에 있어서,
상기 SIR을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드는 각각의 사슬의 N-말단에 존재하는 리더 서열 또는 신호 펩티드를 추가로 포함하고, 서열번호 1 내지 9 및 10으로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함하는, 재조합 폴리뉴클레오티드. - 제 1항에 있어서,
상기 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드는 두 개의 SIR을 인코딩하는, 재조합 폴리뉴클레오티드. - 제 30항에 있어서,
상기 폴리뉴클레오티드는 절단가능한 링커를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열에 의해 연결된 두 개의 SIR을 인코딩하는, 재조합 폴리뉴클레오티드. - 제 31항에 있어서,
상기 절단가능한 링커는 자가-절단하는 절단가능한 링커인, 재조합 폴리뉴클레오티드. - 제 31항에 있어서,
상기 절단가능한 링커는 2A 링커, 2A-유사 링커 또는 이들의 기능적 등가물 중 임의의 하나 이상인, 재조합 폴리뉴클레오티드. - 제 31항에 있어서,
상기 절단가능한 링커는 T2A 링커, P2A, F2A, E2A 링커 또는 이들의 기능적 등가물 중 임의의 하나 이상인, 재조합 폴리뉴클레오티드. - 제 31항에 있어서,
상기 절단가능한 링커는 서열번호 780 내지 785 중 임의의 하나 이상의 서열을 포함하는, 재조합 폴리뉴클레오티드. - 제 31항에 있어서,
상기 절단가능한 링커를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드는 선택적으로 퓨린 (furine) 절단 부위 또는 퓨린 유사 절단 부위 또는 이들의 기능적 등가물을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열이 선행하는, 재조합 폴리뉴클레오티드. - 제 36항에 있어서,
상기 절단가능한 링커를 선행하는 상기 퓨린 절단 부위는 서열번호 788 내지 790 중 임의의 하나 이상의 서열을 포함하는, 재조합 폴리뉴클레오티드. - 제 31항 내지 제 37항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 절단가능한 링커를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열은 가요성 링커를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열이 선행하는, 재조합 폴리뉴클레오티드. - 제 38항에 있어서,
상기 절단가능한 링커를 선행하는 상기 가요성 링커는 Ser-Gly 링커, Ser-Gly-Ser-Gly 링커 또는 이들의 기능적 등가물 중 하나 이상을 인코딩하는, 재조합 폴리뉴클레오티드. - 제 38항에 있어서,
상기 절단가능한 링커를 선행하는 상기 가요성 링커는 서열번호 786 또는 787의 서열을 포함하는, 재조합 폴리뉴클레오티드. - 제 38항에 있어서,
상기 퓨린 절단 부위를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열은 상기 가요성 링커를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드가 선행하고, 이는 상기 절단가능한 링커를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드가 선행하여 퓨린 절단 부위 - 가요성 링커 - 절단가능한 링커의 순서가 되는, 재조합 폴리뉴클레오티드. - 제 31항에 있어서,
상기 절단가능한 링커를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열은 제 2 SIR을 인코딩하는 리더 서열 (신호 펩티드)를 인코딩하는 서열 이전에 존재하는, 재조합 폴리뉴클레오티드. - 제 1항에 있어서,
상기 SIR은 선택된 항원에 대한 다양한 결합 친화도를 갖도록 설계될 수 있는, 재조합 폴리뉴클레오티드. - 제 1항에 있어서,
상기 SIR은 부속 모듈을 포함하는, 재조합 폴리뉴클레오티드. - 제 44항에 있어서,
상기 부속 모듈은 CD3z 도메인을 포함하는, 재조합 폴리뉴클레오티드. - 제 45항에 있어서,
상기 TCR 불변 사슬은
(viii) 서열번호 12401, 12402, 12403, 12408 또는 12409와 적어도 98% 동일한 아미노산 서열;
(ix) 서열번호 12421, 12422, 12423, 12427 또는 12428과 적어도 98% 동일한 아미노산 서열; 및
(x) 상기 (viii) 및 (ix)의 두 개 TCR 불변 사슬의 이량체 조합:
으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 재조합 폴리뉴클레오티드. - 제 12항에 있어서,
상기 하나 이상의 비-천연 TCR 항원 결합 도메인(들)은 CD19에 결합하는, 재조합 폴리뉴클레오티드. - 제 47항에 있어서,
상기 하나 이상의 비-천연 TCR 항원 결합 도메인(들)은
- 서열번호 2318 내지 2324, 12060 내지 12068, 12108, 12127 또는 12156 중 어느 하나와 적어도 98% 동일한 서열을 포함하는 폴리펩티드 또는 상기 전술한 임의의 폴리펩티드에 포함된 임의의 상보성 결정 영역 (CDR);
- 서열번호 2517 내지 2523, 12178 내지 12186, 1227, 12246 또는 12275 중 어느 하나와 적어도 98% 동일한 서열을 포함하는 폴리펩티드 또는 상기 전술한 임의의 폴리펩티드에 포함된 임의의 상보성 결정 영역 (CDR);
- 서열번호 12288과 적어도 98% 동일한 서열을 포함하는 폴리펩티드; 및
- 서열번호 2770 내지 2774, 12325, 12308, 18162 내지 18170 또는 12354 중 어느 하나와 적어도 98% 동일한 서열을 포함하는 폴리펩티드:
로 이루어진 군으로부터 선택되는, 재조합 폴리뉴클레오티드. - 제 47항에 있어서,
상기 재조합 폴리뉴클레오티드는 서열번호 3135 내지 3235, 3250 내지 3346, 3396, 3401 내지 3403, 3406, 3429 내지 3432, 3435 내지 3439, 3540, 3855 내지 3859, 12431 내지 12489, 12491 내지 12493, 12495 내지 12530, 12534, 13195 내지 13203, 13250, 13267, 13289, 13429 내지 13437, 13483, 13501 및 13523으로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함하는 폴리펩티드를 인코딩하는, 재조합 폴리뉴클레오티드. - 제 12항에 있어서,
상기 하나 이상의 비-천연 TCR 항원 결합 도메인(들)은 CD20에 결합하는, 재조합 폴리뉴클레오티드. - 제 50항에 있어서,
상기 하나 이상의 비-천연 TCR 항원 결합 도메인(들)은
- 서열번호 2325 내지 2326, 12069 내지 12077 또는 12078 중 어느 하나와 적어도 98% 동일한 서열을 포함하는 폴리펩티드 또는 상기 전술한 임의의 폴리펩티드에 포함된 임의의 상보성 결정 영역 (CDR);
- 서열번호 2524 내지 2525, 12187 내지 12195 또는 12196 중 어느 하나와 적어도 98% 동일한 서열을 포함하는 폴리펩티드 또는 상기 전술한 임의의 폴리펩티드에 포함된 임의의 상보성 결정 영역 (CDR);
- 서열번호 12289와 적어도 98% 동일한 서열을 포함하는 폴리펩티드; 및
- 서열번호 2787 내지 2788, 18177 내지 18186 또는 18187 중 어느 하나와 적어도 98% 동일한 서열을 포함하는 폴리펩티드:
로 이루어진 군으로부터 선택되는, 재조합 폴리뉴클레오티드. - 제 50항에 있어서,
상기 재조합 폴리뉴클레오티드는 서열번호 3263, 3348, 3456 내지 3457, 3876 내지 3877, 12464 내지 12465, 12477 내지 12482, 12492, 12534, 13204 내지 13213, 13438 내지 13446 및 13447로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함하는 폴리펩티드를 인코딩하는, 재조합 폴리뉴클레오티드. - 제 12항에 있어서,
상기 하나 이상의 비-천연 TCR 항원 결합 도메인(들)은 CD22에 결합하는, 재조합 폴리뉴클레오티드. - 제 53항에 있어서,
상기 하나 이상의 비-천연 TCR 항원 결합 도메인(들)은
- 서열번호 2327 내지 2329, 12122 내지 12126 또는 12132 중 어느 하나와 적어도 98% 동일한 서열을 포함하는 폴리펩티드 또는 상기 전술한 임의의 폴리펩티드에 포함된 임의의 상보성 결정 영역 (CDR);
- 서열번호 2526 내지 2528, 12241 내지 12245 또는 12251 중 어느 하나와 적어도 98% 동일한 서열을 포함하는 폴리펩티드 또는 상기 전술한 임의의 폴리펩티드에 포함된 임의의 상보성 결정 영역 (CDR); 및
- 서열번호 2789 내지 2791, 12320 내지 12330 또는 18188 중 어느 하나와 적어도 98% 동일한 서열을 포함하는 폴리펩티드:
로 이루어진 군으로부터 선택되는, 재조합 폴리뉴클레오티드. - 제 53항에 있어서,
상기 재조합 폴리뉴클레오티드는 서열번호 3332, 3433, 3458 내지 3460, 3878 내지 3880, 12483, 12485, 12488 내지 12490, 13241 내지 13245, 13268, 13475 내지 13479 및 13502로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함하는 폴리펩티드를 인코딩하는, 재조합 폴리뉴클레오티드. - 제 12항에 있어서,
상기 하나 이상의 비-천연 TCR 항원 결합 도메인(들)은 BCMA에 결합하는, 재조합 폴리뉴클레오티드. - 제 56항에 있어서,
상기 하나 이상의 비-천연 TCR 항원 결합 도메인(들)은
- 서열번호 2310 내지 2313, 12046 내지 12048, 12118 내지 12119, 12139 내지 12145 또는 12146 중 어느 하나와 적어도 98% 동일한 서열을 포함하는 폴리펩티드 또는 상기 전술한 임의의 폴리펩티드에 포함된 임의의 상보성 결정 영역 (CDR);
- 서열번호 2509 내지 2512, 12164 내지 12166, 12237 내지 12238, 12258 내지 12264 또는 12265 중 어느 하나와 적어도 98% 동일한 서열을 포함하는 폴리펩티드 또는 상기 전술한 임의의 폴리펩티드에 포함된 임의의 상보성 결정 영역 (CDR);
- 서열번호 12279 내지 12281, 12283 내지 12285, 12287, 12291 내지 12292, 12293 또는 12294 중 어느 하나와 적어도 98% 동일한 서열을 포함하는 폴리펩티드; 및
- 서열번호 2780 내지 2783, 12237 내지 12344, 18174 내지 18175 또는 18176 중 어느 하나와 적어도 98% 동일한 서열을 포함하는 폴리펩티드:
로 이루어진 군으로부터 선택되는, 재조합 폴리뉴클레오티드. - 제 56항에 있어서,
상기 재조합 폴리뉴클레오티드는 서열번호 3445 내지 3449, 3866 내지 3869, 12463, 12533, 12535 내지 12536, 13181 내지 13183, 13261 내지 13262, 13277 내지 13284, 13415 내지 13417, 13495 내지 13496, 13511 내지 13517 및 13518로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함하는 폴리펩티드를 인코딩하는, 재조합 폴리뉴클레오티드. - 제 12항에 있어서,
상기 하나 이상의 비-천연 TCR 항원 결합 도메인(들)은 MPL에 결합하는, 재조합 폴리뉴클레오티드. - 제 59항에 있어서,
상기 하나 이상의 비-천연 TCR 항원 결합 도메인(들)은
- 서열번호 2414 내지 2421, 12120, 12128 또는 12129 중 어느 하나와 적어도 98% 동일한 서열을 포함하는 폴리펩티드 또는 상기 전술한 임의의 폴리펩티드에 포함된 임의의 상보성 결정 영역 (CDR);
- 서열번호 2611 내지 2618, 12239, 12247 또는 12248 중 어느 하나와 적어도 98% 동일한 서열을 포함하는 폴리펩티드 또는 상기 전술한 임의의 폴리펩티드에 포함된 임의의 상보성 결정 영역 (CDR); 및
- 서열번호 2871 내지 2878, 12326 내지 12327 및 12318 중 어느 하나와 적어도 98% 동일한 서열을 포함하는 폴리펩티드:
로 이루어진 군으로부터 선택되는, 재조합 폴리뉴클레오티드. - 제 59항에 있어서,
상기 재조합 폴리뉴클레오티드는 서열번호 33347, 3373, 3427 내지 3428, 3495, 3556 내지 3562, 3979 내지 3985, 4025, 12454, 12456, 12458, 12462, 12532, 13259, 13265 내지 13266, 13493, 13499 및 13500으로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함하는 폴리펩티드를 인코딩하는, 재조합 폴리뉴클레오티드. - 제 12항에 있어서,
상기 하나 이상의 비-천연 TCR 항원 결합 도메인(들)은 CS1에 결합하는, 재조합 폴리뉴클레오티드. - 제 62항에 있어서,
상기 하나 이상의 비-천연 TCR 항원 결합 도메인(들)은
- 서열번호 2355 내지 2358, 12090 내지 12094 또는 12095 중 어느 하나와 적어도 98% 동일한 서열을 포함하는 폴리펩티드 또는 상기 전술한 임의의 폴리펩티드에 포함된 임의의 상보성 결정 영역 (CDR);
- 서열번호 2553 내지 2555, 12209 내지 12213 또는 12214 중 어느 하나와 적어도 98% 동일한 서열을 포함하는 폴리펩티드 또는 상기 전술한 임의의 폴리펩티드에 포함된 임의의 상보성 결정 영역 (CDR); 및
- 서열번호 2817 내지 2819, 18211 내지 18215 또는 18216 중 어느 하나와 적어도 98% 동일한 서열을 포함하는 폴리펩티드:
로 이루어진 군으로부터 선택되는, 재조합 폴리뉴클레오티드. - 제 62항에 있어서,
상기 재조합 폴리뉴클레오티드는 서열번호 3376, 3487 내지 3489, 3907 내지 3909, 12455, 12457, 12459, 12461, 12476, 13226 내지 13231, 13460 내지 13464 및 13465로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함하는 폴리펩티드를 인코딩하는, 재조합 폴리뉴클레오티드. - 제 12항에 있어서,
상기 하나 이상의 비-천연 TCR 항원 결합 도메인(들)은 CD33에 결합하는, 재조합 폴리뉴클레오티드. - 제 65항에 있어서,
상기 하나 이상의 비-천연 TCR 항원 결합 도메인(들)은
- 서열번호 2336 내지 2337, 12079 내지 12084 또는 12085 중 어느 하나와 적어도 98% 동일한 서열을 포함하는 폴리펩티드 또는 상기 전술한 임의의 폴리펩티드에 포함된 임의의 상보성 결정 영역 (CDR);
- 서열번호 2535 내지 2536, 12197 내지 12202 또는 12203 중 어느 하나와 적어도 98% 동일한 서열을 포함하는 폴리펩티드 또는 상기 전술한 임의의 폴리펩티드에 포함된 임의의 상보성 결정 영역 (CDR); 및
- 서열번호 2795 내지 2796, 18189 내지 18193 또는 18194 중 어느 하나와 적어도 98% 동일한 서열을 포함하는 폴리펩티드:
로 이루어진 군으로부터 선택되는, 재조합 폴리뉴클레오티드. - 제 65항에 있어서,
상기 재조합 폴리뉴클레오티드는 서열번호 3464 내지 3465, 3884 내지 3885, 12460, 12473, 12479, 13214 내지 13220, 13448 내지 13453 및 13454로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함하는 폴리펩티드를 인코딩하는, 재조합 폴리뉴클레오티드. - 제 12항에 있어서,
상기 하나 이상의 비-천연 TCR 항원 결합 도메인(들)은 CD123에 결합하는, 재조합 폴리뉴클레오티드. - 제 68항에 있어서,
상기 하나 이상의 비-천연 TCR 항원 결합 도메인(들)은
- 서열번호 2315, 2472, 12049 내지 12058 또는 12059 중 어느 하나와 적어도 98% 동일한 서열을 포함하는 폴리펩티드 또는 상기 전술한 임의의 폴리펩티드에 포함된 임의의 상보성 결정 영역 (CDR);
- 서열번호 2514, 2670, 12167 내지 12176 또는 12177 중 어느 하나와 적어도 98% 동일한 서열을 포함하는 폴리펩티드 또는 상기 전술한 임의의 폴리펩티드에 포함된 임의의 상보성 결정 영역 (CDR);
- 서열번호 2716 또는 2717과 적어도 98% 동일한 서열을 포함하는 폴리펩티드; 및
- 서열번호 2801, 2929, 18196 내지 18205 또는 18206 중 어느 하나와 적어도 98% 동일한 서열을 포함하는 폴리펩티드:
로 이루어진 군으로부터 선택되는, 재조합 폴리뉴클레오티드. - 제 68항에 있어서,
상기 재조합 폴리뉴클레오티드는 서열번호 3266 내지 3267, 3366 내지 3368, 3375, 3378, 3405, 3409, 3434, 3470, 3492 내지 3497, 3617, 3890, 3912 내지 3913, 4041, 12480, 13184 내지 13194, 13418 내지 13427 및 13428로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함하는 폴리펩티드를 인코딩하는, 재조합 폴리뉴클레오티드. - 제 12항에 있어서,
상기 하나 이상의 비-천연 TCR 항원 결합 도메인(들)은 폴레이트 수용체 1에 결합하는, 재조합 폴리뉴클레오티드. - 제 71항에 있어서,
상기 하나 이상의 비-천연 TCR 항원 결합 도메인(들)은
- 서열번호 2373과 적어도 98% 동일한 서열을 포함하는 폴리펩티드 또는 이에 포함된 임의의 상보성 결정 영역 (CDR);
- 서열번호 2570과 적어도 98% 동일한 서열을 포함하는 폴리펩티드 또는 이에 포함된 임의의 상보성 결정 영역 (CDR); 및
- 서열번호 2833과 적어도 98% 동일한 서열을 포함하는 폴리펩티드:
로 이루어진 군으로부터 선택되는, 재조합 폴리뉴클레오티드. - 제 71항에 있어서,
상기 재조합 폴리뉴클레오티드는 서열번호 3511 및 3928로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함하는 폴리펩티드를 인코딩하는, 재조합 폴리뉴클레오티드. - 제 12항에 있어서,
상기 하나 이상의 비-천연 TCR 항원 결합 도메인(들)은 메소틸린에 결합하는, 재조합 폴리뉴클레오티드. - 제 74항에 있어서,
상기 하나 이상의 비-천연 TCR 항원 결합 도메인(들)은
- 서열번호 2413, 12154 또는 12155 중 어느 하나와 적어도 98% 동일한 서열을 포함하는 폴리펩티드 또는 상기 전술한 임의의 폴리펩티드에 포함된 임의의 상보성 결정 영역 (CDR);
- 서열번호 2609 내지 2610, 12273 또는 12274 중 어느 하나와 적어도 98% 동일한 서열을 포함하는 폴리펩티드 또는 상기 전술한 임의의 폴리펩티드에 포함된 임의의 상보성 결정 영역 (CDR);
- 서열번호 2713 내지 2714 또는 2725 중 어느 하나와 적어도 98% 동일한 서열을 포함하는 폴리펩티드; 및
- 서열번호 2870, 2899, 12352 또는 12353 중 어느 하나와 적어도 98% 동일한 서열을 포함하는 폴리펩티드:
로 이루어진 군으로부터 선택되는, 재조합 폴리뉴클레오티드. - 제 74항에 있어서,
상기 재조합 폴리뉴클레오티드는 서열번호 3414, 3419, 3554, 3585, 3976, 4008, 13287 내지 13288, 13521 및 13522로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함하는 폴리펩티드를 인코딩하는, 재조합 폴리뉴클레오티드. - 제 12항에 있어서,
상기 하나 이상의 비-천연 TCR 항원 결합 도메인(들)은 IL-13Rα2에 결합하는, 재조합 폴리뉴클레오티드. - 제 77항에 있어서,
상기 하나 이상의 비-천연 TCR 항원 결합 도메인(들)은
- 서열번호 2399 또는 2400 중 어느 하나와 적어도 98% 동일한 서열을 포함하는 폴리펩티드 또는 상기 전술한 임의의 폴리펩티드에 포함된 임의의 상보성 결정 영역 (CDR);
- 서열번호 2595 또는 2596 중 어느 하나와 적어도 98% 동일한 서열을 포함하는 폴리펩티드 또는 상기 전술한 임의의 폴리펩티드에 포함된 임의의 상보성 결정 영역 (CDR); 및
- 서열번호 2858 또는 2859 중 어느 하나와 적어도 98% 동일한 서열을 포함하는 폴리펩티드:
로 이루어진 군으로부터 선택되는, 재조합 폴리뉴클레오티드. - 제 77항에 있어서,
상기 재조합 폴리뉴클레오티드는 서열번호 3541 내지 3542, 3963 및 3964로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함하는 폴리펩티드를 인코딩하는, 재조합 폴리뉴클레오티드. - 제 12항에 있어서,
상기 하나 이상의 비-천연 TCR 항원 결합 도메인(들)은 CD138에 결합하는, 재조합 폴리뉴클레오티드. - 제 80항에 있어서,
상기 하나 이상의 비-천연 TCR 항원 결합 도메인(들)은
- 서열번호 2316과 적어도 98% 동일한 서열을 포함하는 폴리펩티드 또는 이에 포함된 임의의 상보성 결정 영역 (CDR);
- 서열번호 2515와 적어도 98% 동일한 서열을 포함하는 폴리펩티드 또는 이에 포함된 임의의 상보성 결정 영역 (CDR); 및
- 서열번호 2802와 적어도 98% 동일한 서열을 포함하는 폴리펩티드:
로 이루어진 군으로부터 선택되는, 재조합 폴리뉴클레오티드. - 제 80항에 있어서,
상기 재조합 폴리뉴클레오티드는 서열번호 3268, 3374, 3404, 3471 및 3891로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함하는 폴리펩티드를 인코딩하는, 재조합 폴리뉴클레오티드. - 제 12항에 있어서,
상기 하나 이상의 비-천연 TCR 항원 결합 도메인(들)은 TCRgd에 결합하는, 재조합 폴리뉴클레오티드. - 제 83항에 있어서,
상기 하나 이상의 비-천연 TCR 항원 결합 도메인(들)은
- 서열번호 2449와 적어도 98% 동일한 서열을 포함하는 폴리펩티드 또는 이에 포함된 임의의 상보성 결정 영역 (CDR);
- 서열번호 2646과 적어도 98% 동일한 서열을 포함하는 폴리펩티드 또는 이에 포함된 임의의 상보성 결정 영역 (CDR); 및
- 서열번호 2907과 적어도 98% 동일한 서열을 포함하는 폴리펩티드:
로 이루어진 군으로부터 선택되는, 재조합 폴리뉴클레오티드. - 제 83항에 있어서,
상기 재조합 폴리뉴클레오티드는 서열번호 3594 및 4017로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함하는 폴리펩티드를 인코딩하는, 재조합 폴리뉴클레오티드. - 제 12항에 있어서,
상기 하나 이상의 비-천연 TCR 항원 결합 도메인(들)은 TCRB1에 결합하는, 재조합 폴리뉴클레오티드. - 제 86항에 있어서,
상기 하나 이상의 비-천연 TCR 항원 결합 도메인(들)은
- 서열번호 2445 또는 2446 중 어느 하나와 적어도 98% 동일한 서열을 포함하는 폴리펩티드 또는 상기 전술한 임의의 폴리펩티드에 포함된 임의의 상보성 결정 영역 (CDR);
- 서열번호 2642 또는 2643 중 어느 하나와 적어도 98% 동일한 서열을 포함하는 폴리펩티드 또는 상기 전술한 임의의 폴리펩티드에 포함된 임의의 상보성 결정 영역 (CDR); 및
- 서열번호 2903 또는 2904 중 어느 하나와 적어도 98% 동일한 서열을 포함하는 폴리펩티드:
로 이루어진 군으로부터 선택되는, 재조합 폴리뉴클레오티드. - 제 86항에 있어서,
상기 재조합 폴리뉴클레오티드는 서열번호 3590 내지 3591, 4013 및 4014로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함하는 폴리펩티드를 인코딩하는, 재조합 폴리뉴클레오티드. - 제 12항에 있어서,
상기 하나 이상의 비-천연 TCR 항원 결합 도메인(들)은 TCRB2에 결합하는, 재조합 폴리뉴클레오티드. - 제 89항에 있어서,
상기 하나 이상의 비-천연 TCR 항원 결합 도메인(들)은
- 서열번호 2447 또는 2448 중 어느 하나와 적어도 98% 동일한 서열을 포함하는 폴리펩티드 또는 상기 전술한 임의의 폴리펩티드에 포함된 임의의 상보성 결정 영역 (CDR);
- 서열번호 2644 또는 2645 중 어느 하나와 적어도 98% 동일한 서열을 포함하는 폴리펩티드 또는 상기 전술한 임의의 폴리펩티드에 포함된 임의의 상보성 결정 영역 (CDR); 및
- 서열번호 2905 또는 2906 중 어느 하나와 적어도 98% 동일한 서열을 포함하는 폴리펩티드:
로 이루어진 군으로부터 선택되는, 재조합 폴리뉴클레오티드. - 제 89항에 있어서,
상기 재조합 폴리뉴클레오티드는 서열번호 3353 내지 3364, 3592 내지 3593, 4015 및 4016로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함하는 폴리펩티드를 인코딩하는, 재조합 폴리뉴클레오티드. - 제 1항의 재조합 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 발현 시스템으로서, 치료제 대조군과 함께 공동발현되고, 상기 치료제 대조군은 절단된 표피 성장인자 수용체 (tEGFR), 절단된 표피 성장인자 수용체 viii (tEGFRvⅢ), 절단된 CD30 (tCD30), 절단된 BCMA (tBCMA), 절단된 CD19 (tCD19), CD34, 티미딘 키나제, 사이토신 탈아미나제, 니트로환원효소, 잔틴-구아닌 포스포리보실 전이효소, 인간 캐스파제 8, 인간 캐스파제 9, 유도성 캐스파제 9 (i캐스파제 9), 퓨린 뉴클레오시드 포스포릴라제, 리나마라제/리나마린/포도당 옥시다제, 데옥시리보뉴클레오시드 키나제, 호스래디쉬 퍼옥시다제 (HRP)/인돌-3-아세트산 (IAA), 감마-글루타밀시스테인 합성효소, CD20/알파CD20, CD34/키메라 티미딘 키나제, dox-의존성 캐스파제-2, 티미딘 키나제 변이체 (HSV-TKSR39), AP1903/Fas 시스템, 키메라 사이토카인 수용체 (CCR), 선별 마커 및 이들의 조합로 이루어진 군으로부터 선택되는, 재조합 발현 시스템.
- 제 92항에 있어서,
상기 tEGFR 및 tEGFRvⅢ은 EGFR-특이적 siRNA, 소분자, 항-EGFR 항체 또는 이의 단편 또는 이들의 조합 중 임의의 하나 이상에 결합하는, 재조합 발현 시스템. - 제 92항에 있어서,
상기 tCD30은 CD30-특이적 siRNA, 소분자, 항-CD30 항체 또는 이의 단편 또는 이들의 조합 중 임의의 하나 이상에 결합하는, 재조합 발현 시스템. - 제 92항에 있어서,
상기 tCD19는 CD19-특이적 siRNA, 소분자, 항-CD19 항체 또는 이의 단편 또는 이들의 조합 중 임의의 하나 이상에 결합하는, 재조합 발현 시스템. - 제 92항에 있어서,
상기 tCD34는 CD34-특이적 siRNA, 소분자, 항-CD34 항체 또는 이의 단편 또는 이들의 조합 중 임의의 하나 이상에 결합하는, 재조합 발현 시스템. - 제 92항에 있어서,
상기 선별 마커는 디하이드로폴레이트 수용체 (DHFR), 변이체 DHFR, 메틸화된-DNA-단백질-시스테인 메틸전이효소, 이노신 모노포스페이트 탈수소화효소 Ⅱ (IMDHP2), 퓨로마이신 아세틸전이효소 (PAC), 블라스티시딘-저항성 유전자, 변이체 칼시뉴린 a/b (Can/b), CNa12, CNb30 또는 이들의 조합 중 임의의 하나 이상을 포함하는, 재조합 발현 시스템. - 제 92항에 있어서,
상기 CCR은 (i) IL-7 사이토카인-링커-IL 7Ra, (ii) IL-2Rβ의 IL-7Ra 세포질 도메인의 IL-7Ra-막통과 도메인의 IL-7 사이토카인-링커-세포외 도메인, (iii) IL-7 사이토카인-링커-IL-2Rβ 및 이들의 조합 중 임의의 하나 이상을 포함하는, 재조합 발현 시스템. - 제 1항의 재조합 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 발현 시스템으로서, 부속 모듈과 함께 공동발현되고, 상기 부속 모듈은 41BBL, CD40L, K13, MC159, cFLIP-L/MRITα, cFLIP-p22, HTLV1 Tax, HTLV2 Tax, HTLV2 Tax-RS 변이체, FKBPx2-K13, FKBPx2-HTLV2-Tax, FKBPx2-HTLV2-Tax-RS, IL6R-304-vHH-Alb8-vHH, IL12f, PD1-4H1 scFV, PD1-5C4 scFV, PD1-4H1-Alb8-vHH, PD1-5C4-Alb8-vHH, CTLA4-이필리무맙-scFv, CTLA4-이필리무맙-Alb8-vHH, IL6-19A-scFV, IL6-19A-scFV-Alb8-vHH, sHVEM, sHVEM-Alb8-vHH, hTERT, Fx06, CD3z, CD3z-GGGS-41BB, CD3-BBz, CD3-CD28z, CD3-CD28-Lck 융합 단백질, Brd4 표적화 shRNA, 키메라 항원 수용체 (CAR), hTERT, 헤파리나제, CAR, 억제성 CAR 및 이들의 조합로 이루어진 군으로부터 선택되는, 재조합 발현 시스템.
- 제 92항 또는 제 99항에 있어서,
상기 SIR을 인코딩하는 재조합 폴리뉴클레오티드 및 하나 이상의 치료제 대조군 및/또는 하나 이상의 부속 모듈은 절단가능한 링커를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열에 의해 연결되는, 재조합 발현 시스템. - 제 100항에 있어서,
상기 절단가능한 링커는 자가-절단하는 절단가능한 링커인, 재조합 발현 시스템. - 제 101항에 있어서,
상기 절단가능한 링커를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드는 퓨린 절단 부위 또는 퓨린 유사 절단 부위 또는 이들의 기능적 등가물을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열이 선행하는, 재조합 발현 시스템. - 제 100항에 있어서,
상기 절단가능한 링커를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열은 선택적으로 가요성 링커를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열이 선행하는, 재조합 발현 시스템. - 제 1항의 재조합 폴리뉴클레오티드를 포함하는 적어도 하나의 벡터로서, 상기 벡터는 DNA 벡터, RNA 벡터, 플라스미드, 렌티바이러스 벡터, 아데노바이러스성 벡터, 레트로바이러스 벡터, 배큘로바이러스 벡터, 슬리핑 뷰티 트랜스포존 벡터 및 피기백 트랜스포존 벡터로 이루어진 군으로부터 선택되는, 벡터.
- 제 104항에 있어서,
상기 벡터 골격은 서열번호 870 내지 875 및 876로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 갖는, 벡터. - 제 104항에 있어서,
EF-1 프로모터, CMV IE 유전자 프로모터, EF-1a 프로모터, 유비퀴틴 C 프로모터, MSCV LTR 프로모터 또는 포스포글리세레이트 키나제 (PGK) 프로모터로부터 선택된 프로모터를 포함하는, 벡터. - 제 106항에 있어서,
상기 EF-1 프로모터는 서열번호 877의 서열 또는 이와 80 내지 99% 동일성을 갖는 서열을 포함하는, 벡터. - 제 106항에 있어서,
상기 벡터는 시험관내에서 전사된 벡터이거나, 상기 벡터는 폴리(A) 미단 또는 3'UTR을 추가로 포함하는, 벡터. - 제 1항의 재조합 폴리뉴클레오티드 중 적어도 하나에 의해 인코딩된 적어도 하나의 폴리펩티드.
- 제 1항의 재조합 폴리뉴클레오티드 중 적어도 하나를 발현하는 재조합 세포.
- 단리된 합성 면역 수용체 (SIR) 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 이종이량체로서,
(a) (i) 서열번호 3010과 적어도 98% 동일하고, 48, 61, 91, 92, 93, 및/또는 94번 위치에서 하나 이상의 돌연변이를 갖으며, 조건부 부속 모듈을 포함할 수 있는 아미노산 서열;
(ii) 서열번호 3024와 적어도 98% 동일하고, 18, 22, 57, 79, 133, 136 및/또는 139번 위치에서 하나 이상의 돌연변이를 갖으며, 조건부 부속 모듈을 포함할 수 있는 아미노산 서열;
(iii) 서열번호 3025와 적어도 98% 동일하고, 18, 22, 57, 79, 133, 136 및/또는 139번 위치에서 하나 이상의 돌연변이를 갖으며, 조건부 부속 모듈을 포함할 수 있는 아미노산 서열;
(iv) 서열번호 3046, 3047 또는 3048과 적어도 98% 동일하고, 조건부 부속 모듈을 포함할 수 있는 아미노산 서열;
(v) 서열번호 3049와 적어도 98% 동일하고, 조건부 부속 모듈을 포함할 수 있는 아미노산 서열;
(vi) 서열번호 3051 또는 3052와 적어도 98% 동일하고, 조건부 부속 모듈을 포함할 수 있는 아미노산 서열; 및
(vii) (i) 및 (ii), (i) 및 (iii), (iv) 및 (ii), (iv) 및 (iii), 그리고 (v) 및 (vi)으로부터 선택된 두 개의 TCR 불변 사슬의 이량체 조합:
으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 T 세포 수용체 (TCR) 불변 사슬;
(b) 조건부 링커; 및
(c) (1) 항체;
(2) 항체 단편 (예로, Fv, Fab, (Fab')2);
(3) 항체 (vH 도메인) 또는 이의 단편의 중쇄 가변 영역;
(4) 항체 (vL 도메인) 또는 이의 단편의 경쇄 가변 영역;
(5) 단일 사슬 가변 단편 (scFv) 또는 이의 단편;
(6) 단일 도메인 항체 (SDAB) 또는 이의 단편;
(7) 카멜리드 VHH 도메인 또는 이의 단편;
(8) 항체의 단량체 가변 영역;
(9) 다르핀 (DARPIN), 어피바디, 어필린, 어드넥틴, 어피틴, 오바디, 레페바디, 파이노머, 알파바디, 어비머, 아트리머, 센티린, 프로넥틴, 안티칼린, 쿠니츠 도메인, 아미딜로 반복서열 단백질 또는 이들의 단편과 같은 비-면역글로불린 항원 결합 스캐폴드;
(10) 수용체 또는 이의 단편;
(11) 리간드 또는 이의 단편;
(12) 이중특이적 -항체, -항체 단편, -scFV, -vHH, -SDAB, -비-면역글로불린 항원 결합 스캐폴드, -수용체 또는 -리간드; 및
(13) 자가항원 또는 이의 단편:
으로 이루어진 군으로부터 선택된 (a)에 연결된 하나 이상의 비-천연 TCR 항원 결합 도메인(들):을 포함하고,
상기 (a)(i) 내지 (a)(iii)의 돌연변이는 항원 결합 도메인의 표적 도메인에 대한 다양한 결합 친화도를 제공하고, 합성 면역 수용체는 림프구에서 발현 시, 하나 이상의 연속적 사슬로 상기 항원 결합 도메인 및 상기 T 세포 수용체 불변 사슬 둘 다를 상기 림프구의 표면 상에 발현하여, 상기 발현된 항원 결합 도메인이 이의 항원에 결합할 때 림프구가 활성화하고/거나, 증식하고/거나, 사이토카인을 분비하고/거나, 표적 세포의 살상을 조정 (유도 또는 억압)하도록 촉발되고, MHC-제한 및 MHC-비-제한된 항체-유형 특이성을 갖는, 단리된 합성 면역 수용체 (SIR) 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 이종이량체. - 제 111항에 있어서,
상기 (a)(vii)의 TCR 불변 사슬을 포함하고, 상기 비-천연 TCR 결합 도메인은
- 발현될 때 하기 항체 또는 이의 단편의 하나의 중쇄 및 경쇄가 상기 T 세포 불변 영역의 상기 (a)(vii)의 두 개 사슬 중 하나에 부착되고, 하기 항체 또는 이의 단편의 나머지의 중쇄 및 경쇄는 상기 T 세포 불변 영역의 상기 두 개 사슬 중 나머지에 부착되도록, 사전 정의된 표적 항원에 특이적인 항체 또는 이의 단편의 중쇄 및 경쇄의 가변 영역;
- 발현될 때 하기 scFv 중 하나가 상기 T 세포 불변 영역의 상기 (a)(vii)의 두 개 사슬 중 하나에 부착되고, 하기 scFv 중 나머지는 상기 T 세포 불변 영역의 상기 두 개 사슬 중 나머지에 부착되도록, 하나 이상의 사전 정의된 표적 항원에 특이적인 두 개의 단일 사슬 가변 단편 (scFv);
- 발현될 때 하기 항체 단편 중 하나가 상기 T 세포 불변 영역의 상기 (a)(vii)의 두 개 사슬 중 하나에 부착되고, 하기 항체 단편 중 나머지는 상기 T 세포 불변 영역의 상기 두 개 사슬 중 나머지에 부착되도록, 하나 이상의 사전 정의된 표적 항원에 특이적인 두 개의 항체 단편;
- 발현될 때 하기 SDAB 단편 중 하나가 상기 T 세포 불변 영역의 상기 (a)(vii)의 두 개 사슬 중 하나에 부착되고, 하기 SDAB 단편 중 나머지는 상기 T 세포 불변 영역의 상기 두 개 사슬 중 나머지에 부착되도록, 하나 이상의 사전 정의된 표적 항원에 특이적인 두 개의 단일 도메인 항체 (SDAB);
- 발현될 때 하기 vHH 도메인 중 하나가 상기 T 세포 불변 영역의 상기 (a)(vii)의 두 개 사슬 중 하나에 부착되고, 하기 vHH 도메인 중 나머지는 상기 T 세포 불변 영역의 상기 두 개 사슬 중 나머지에 부착되도록, 하나 이상의 사전 정의된 표적 항원에 특이적인 두 개의 카멜리드 vHH 도메인;
- 발현될 때 하기 비-면역글로불린 항원 결합 스캐폴드 중 하나가 상기 T 세포 불변 영역의 상기 (a)(vii)의 두 개 사슬 중 하나에 부착되고, 하기 비-면역글로불린 항원 결합 스캐폴드 중 나머지는 상기 T 세포 불변 영역의 상기 두 개 사슬 중 나머지에 부착되도록, 하나 이상의 사전 정의된 표적 항원에 특이적인 두 개의 비-면역글로불린 항원 결합 스캐폴드;
- 발현될 때 하기 수용체 또는 이의 단편 중 하나가 상기 T 세포 불변 영역의 상기 (a)(vii)의 두 개 사슬 중 하나에 부착되고, 하기 수용체 또는 이의 단편의 나머지는 상기 T 세포 불변 영역의 상기 두 개 사슬 중 나머지에 부착되도록, 하나 이상의 사전 정의된 표적 항원에 특이적인 두 개의 수용체 또는 이의 단편;
- 발현될 때 하기 리간드 또는 이의 단편 중 하나가 상기 T 세포 불변 영역의 상기 (a)(vii)의 두 개 사슬 중 하나에 부착되고, 하기 리간드 또는 이의 단편의 나머지는 상기 T 세포 불변 영역의 상기 두 개 사슬 중 나머지에 부착되도록, 하나 이상의 사전 정의된 표적 항원에 특이적인 두 개의 리간드 또는 이의 단편;
- 발현될 때 하기 항원 결합 단편 중 하나가 상기 T 세포 불변 영역의 상기 (a)(vii)의 두 개 사슬 중 하나에 부착되고, 하기 항원 결합 단편의 나머지는 상기 T 세포 불변 영역의 상기 두 개 사슬 중 나머지에 부착되도록, 하나 이상의 사전 정의된 표적 항원에 특이적인 두 개의 구조적으로 구별된 항원 결합 단편;
- 발현될 때 하기 항원 결합 단편 중 하나가 상기 T 세포 불변 영역의 상기 (a)(vii)의 두 개 사슬 중 하나에 부착되고, 하기 항원 결합 단편의 나머지는 상기 T 세포 불변 영역의 상기 두 개 사슬 중 나머지에 부착되도록, 하나 또는 둘 다가 이중특이적 또는 다중특이적인 두 개의 결합 단편;
- 발현될 때 하기 자가항원 또는 이의 단편 중 하나가 상기 T 세포 불변 영역의 상기 (a)(vii)의 두 개 사슬 중 하나에 부착되고, 하기 자가항원 또는 이의 단편의 나머지는 상기 T 세포 불변 영역의 상기 두 개 사슬 중 나머지에 부착되도록, 두 개의 자가항원 또는 이의 단편;
- 발현될 때 하기 vL 또는 이의 단편 중 하나가 상기 T 세포 불변 영역의 상기 (a)(vii)의 두 개 사슬 중 하나에 부착되고, 하기 vL 또는 이의 단편의 나머지는 상기 T 세포 불변 영역의 상기 두 개 사슬 중 나머지에 부착되도록, 두 개의 vL 또는 이의 단편; 및
- 발현될 때 하기 vH 또는 이의 단편 중 하나가 상기 T 세포 불변 영역의 상기 (a)(vii)의 두 개 사슬 중 하나에 부착되고, 하기 vH 또는 이의 단편의 나머지는 상기 T 세포 불변 영역의 상기 두 개 사슬 중 나머지에 부착되도록, 두 개의 vH 또는 이의 단편:
으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 단리된 합성 면역 수용체 (SIR) 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 이종이량체. - 제 111항에 있어서,
상기 (a)(iv)의 TCR 불변 사슬을 포함하고, 상기 비-천연 TCR 결합 도메인은
- 사전 정의된 표적 항원에 특이적인 항체 또는 이의 단편의 중쇄 (vH)의 가변 영역;
- 사전 정의된 표적 항원에 특이적인 항체 또는 이의 단편의 경쇄 (vL)의 가변 영역;
- 사전 정의된 표적 항원에 특이적인 단일 사슬 가변 단편 (scFv) 또는 이의 단편;
- 사전 정의된 표적 항원에 특이적인 항체 단편 (예로, Fv, Fab, (Fab')2);
- 사전 정의된 표적 항원에 특이적인 단일 도메인 항체 (SDAB);
- 사전 정의된 표적 항원에 특이적인 카멜리드 vHH 도메인;
- 사전 정의된 표적 항원에 특이적인 비-면역글로불린 항원 결합 스캐폴드;
- 사전 정의된 표적 항원에 특이적인 수용체 또는 이의 단편;
- 사전 정의된 표적 항원에 특이적인 리간드 또는 이의 단편;
- 하나 이상의 사전 정의된 표적 항원에 특이적인 이중특이적 -항체, -항체 단편, -scFV, -vHH, -SDAB, -비-면역글로불린 항원 결합 스캐폴드, -수용체 또는 -리간드; 및
- 자가항원 또는 이의 단편:
으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 단리된 합성 면역 수용체 (SIR) 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 이종이량체. - 제 111항에 있어서,
상기 (i), (ii), (iii), (iv), (v) 또는 (vi)의 TCR 불변 도메인을 포함하고, 상기 비-천연 TCR 결합 도메인은
- 사전 정의된 표적 항원에 특이적인 항체 또는 이의 단편의 중쇄 (vH)의 가변 영역;
- 사전 정의된 표적 항원에 특이적인 항체 또는 이의 단편의 경쇄 (vL)의 가변 영역;
- 사전 정의된 표적 항원에 특이적인 단일 사슬 가변 단편 (scFv) 또는 이의 단편;
- 사전 정의된 표적 항원에 특이적인 항체 단편 (예로, Fv, Fab, (Fab')2);
- 사전 정의된 표적 항원에 특이적인 단일 도메인 항체 (SDAB);
- 사전 정의된 표적 항원에 특이적인 카멜리드 vHH 도메인;
- 사전 정의된 표적 항원에 특이적인 비-면역글로불린 항원 결합 스캐폴드;
- 사전 정의된 표적 항원에 특이적인 수용체 또는 이의 단편;
- 사전 정의된 표적 항원에 특이적인 리간드 또는 이의 단편;
- 하나 이상의 사전 정의된 표적 항원에 특이적인 이중특이적 -항체, -항체 단편, -scFV, -vHH, -SDAB, -비-면역글로불린 항원 결합 스캐폴드, -수용체 또는 -리간드; 및
- 자가항원 또는 이의 단편:
으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 단리된 합성 면역 수용체 (SIR) 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 이종이량체. - 제 111항에 있어서,
상기 TCR 불변 사슬(들)은 TCR 불변 사슬의 발현 및/또는 쌍 형성을 증진하고, 이들의 내인성 세포 수용체 사슬과의 쌍 형성을 감소시키는 돌연변이를 포함하는, 단리된 합성 면역 수용체 (SIR) 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 이종이량체. - 제 111항에 있어서,
상기 TCR의 불변 영역은 서열번호 3010 내지 3023로 이루어진 군으로부터 선택된 서열 또는 서열번호 3010 내지 3023로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 98% 동일한 서열에서 1 내지 40개의 아미노산 치환 또는 돌연변이를 갖는 아미노산 서열을 포함하는 TCR 수용체 α 사슬 (Cα)인, 단리된 합성 면역 수용체 (SIR) 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 이종이량체. - 제 111항에 있어서,
상기 TCR의 불변 영역은 서열번호 3024 내지 3044로 이루어진 군으로부터 선택된 서열 또는 서열번호 3024 내지 3044로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 98% 동일한 서열에서 1 내지 40개의 아미노산 치환 또는 돌연변이를 갖는 아미노산 서열을 포함하는 TCR 수용체 β 사슬 (Cβ)인, 단리된 합성 면역 수용체 (SIR) 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 이종이량체. - 제 111항에 있어서,
상기 TCR의 불변 영역은 서열번호 3049 또는 3050으로 이루어진 군으로부터 선택된 서열 또는 서열번호 3049 또는 3050으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 98% 동일한 서열에서 1 내지 40개의 아미노산 치환 또는 돌연변이를 갖는 아미노산 서열을 포함하는 TCR 수용체 γ 사슬 (Cγ)인, 단리된 합성 면역 수용체 (SIR) 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 이종이량체. - 제 111항에 있어서,
상기 TCR의 불변 영역은 서열번호 3051 또는 3052로 이루어진 군으로부터 선택된 서열 또는 서열번호 3051 또는 3052로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 98% 동일한 서열에서 1 내지 40개의 아미노산 치환 또는 돌연변이를 갖는 아미노산 서열을 포함하는 TCR 수용체 δ 사슬 (Cδ)인, 단리된 합성 면역 수용체 (SIR) 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 이종이량체. - 제 111항에 있어서,
상기 TCR의 불변 영역은 서열번호 3046 내지 3048로 이루어진 군으로부터 선택된 서열 또는 서열번호 3046 내지 3048로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 98% 동일한 서열에서 1 내지 40개의 아미노산 치환 또는 돌연변이를 갖는 아미노산 서열을 포함하는 전구 TCR 수용체 α 사슬 (preCα)인, 단리된 합성 면역 수용체 (SIR) 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 이종이량체. - 제 1항에 있어서,
상기 하나 이상의 비-천연 항원 결합 도메인(들)은 CD19; CD123; CD22; CD30; CD171; CS-1 (CD2 하위집합 1, CRACC, SLAMF7, CD319 및 19A24라고도 지칭됨); C형 렉틴-유사 분자-1 (CLL-1 또는 CLECL1); CD33; 표피 성장인자 수용체 변이체 Ⅲ (EGFRvⅢ); 갱글리오시드 G2 (GD2); 갱글리오시드 GD3 (aNeu5Ac(2-8)aNeu5Ac(2-3)bDGalp(l-4)bDGlcp(l-l)Cer); TNF 수용체 패밀리 구성원 B 세포 성숙 (BCMA); Tn 항원 ((Tn Ag) 또는 (GalNAcα-Ser/Thr)); 전립선-특이적 막 항원 (PSMA); 수용체 타이로신 키나제-유사 고아 수용체 1 (ROR1); Fms 유사 타이로신 키나제 3 (FLT3); 종양-관련 당당백질 72 (TAG72); CD38; CD44v6; 급성 백혈병 또는 림프종 상에서 발현되지만 조혈 전구세포 상에서는 발현되지 않는 글리코실화된 CD43 에피토프; 비-조혈성 암 상에서 발현된 글리코실화된 CD43 에피토프; 암배아 항원 (CEA); 상피세포 부착 분자 (EPCAM); B7H3 (CD276); KIT (CD117); 인터루킨-13 수용체 소단위체 알파-2 (IL-13Ra2 또는 CD213A2); 메소틸린; 인터루킨 11 수용체 알파 (IL-llRa); 전립선 줄기 세포 항원 (PSCA); 프로테아제 세린 21 (테스티신 또는 PRSS21); 혈관 내피 성장인자 수용체 2 (VEGFR2); 루이스 (Y) 항원; CD24; 혈소판-유래 성장인자 수용체 베타 (PDGFR-베타); 단계-특이적 배아 항원-4 (SSEA-4); CD20; 폴레이트 수용체 알파; 수용체 타이로신-단백질 키나제 ERBB2 (Her2/neu); 세포 표면 연관된 뮤신 1 (MUC1); 상피 성장인자 수용체 (EGFR); 신경 세포 부착 분자 (NCAM); 프로스타제; 전립샘 산 포스파타제 (PAP); 변이된 신장인자 2 (ELF2M); 에프린 B2; 섬유모세포 활성화 단백질 알파 (FAP); 인슐린-유사 성장인자 1 수용체 (IGF-I 수용체); 탄산 무수화제 Ⅸ (CAⅨ); 프로테오좀 (프로좀, 마크로페인) 소단위체 베타형, 9 (LMP2); 당단백질 100 (gpl00); 절단점 클러스터 영역 (BCR)으로 구성된 종양원 유전자 융합 단백질 및 아벨슨 마우스 백혈병 바이러스 종양원 유전자 상동체 1 (Abl) (bcr-abl); 티로시나제; 에프린 A형 수용체 2 (EphA2); 퓨코실 GM1; 시아릴 루이스 부착 분자 (sLe); 갱글리오시드 GM3 (aNeu5Ac(2-3)bDClalp(l-4)bDGlcp(l-1)Cer); 글루타민 전이효소 5 (TGS5); 고분자량 흑색종 관련된 항원 (HMWMAA); o-아세틸-GD2 갱글리오시드 (OAcGD2); 종양 내피 마커 1 (TEM1/CD248); 관련된 종양 내피 마커 7 (TEM7R); 클라우딘 6 (CLDN6); 갑상샘 자극호르몬 수용체 (TSHR); G 단백질 연결된 수용체 클래스 C 그룹 5, 구성원 D (GPRC5D); 염색체 X 오픈 리딩 프레임 61 (CXORF61); CD97; CD179a; 역형성 림프종 키나제 (ALK); 폴리시알산; 태반-특이적 항원 1 (PLAC1); 글로보H 글리코세라미드의 육당질 부분 (글로보H); 유샘 분화 항원 (NY-BR-1); 유로플라킨 2 (UPK2); A형 간염 바이러스 세포 수용체 1 (HAVCR1); 아드레노셉터 베타 3 (ADRB3); 패넥신 3 (PANX3); G 단백질-연결된 수용체 20 (GPR20); 림프구 항원 6 복합체, 좌위 K 9 (LY6K); 후각 수용체 51E2 (OR51E2); TCR 감마 교대 리딩 프레임 단백질 (TARP); 윌름 종양 단백질 (WT1); 암/고환 항원 1 (NY-ES0-1); 암/고환 항원 2 (LAGE-1a); 흑색종-관련 항원 1 (MAGE-A1); 염색체 12p 상에 위치한 ETS 전위 변이체 유전자 6 (ETV6-AML); 정자 단백질 17 (SPA17); X 항원 패밀리, 구성원 lA (XAGEl); 안지오포이에틴-결합 세포 표면 수용체 2 (타이 2); 흑색종 암 고환 항원-1 (MAD-CT-1); 흑색종 암 고환 항원-2 (MAD-CT-2); Fos-관련된 항원 1; 종양 단백질 p53 (p53); p53 돌연변이체; 프로스테인; 서바이빈; 텔로머라제; 전립선 암종 종양 항원-1 (PCT A-1 또는 갈렉틴 8); T 세포에 의해 인식되는 흑색종 항원 1 (MelanA 또는 MARTI); 래트 육종 (Ras) 돌연변이체; 인간 텔로머라제 역전사효소 (hTERT); 육종 전위 절단점; 흑색종의 세포사멸 저해제 (ML-IAP); ERG (막통과 프로테아제, 세린 2 (TMPRSS2) ETS 융합 유전자); N-아세틸 글루코사미닐-전이효소 V (NA17); 쌍 형성된 박스 단백질 Pax-3 (PAX3); 안드로겐 수용체; 사이클린 Bl; v-myc 조류 백혈병 바이러스 종양원 유전자 신경모세포종 유래된 상동체 (MYCN); Ras 상동체 패밀리 구성원 C (RhoC); 티로시나제-관련 단백질 2 (TRP-2); 사이토크롬 P450 lB 1 (CYPlB 1); CCCTC-결합 인자 (아연 핑거 단백질)-유사 (BORIS 또는 각인 부위의 조절인자의 형제), T 세포에 의해 인식되는 편평세포 암종 항원 3 (SART3); 쌍 형성된 박스 단백질 Pax-5 (PAX5); 프로아크로신 결합 단백질 sp32 (OY-TESl); 림프구-특이적 단백질 타이로신 키나제 (LCK); 키나제 고정 단백질 4 (AKAP-4); 활액 육종 X 절단점 2 (SSX2); 진행된 당화 말단 산물의 수용체 (RAGE-1); 신장 유비퀴터스 1 (RUl); 신장 유비퀴터스 2 (RU2); 레구마인; 인간 파필로마 바이러스 E6 (HPV E6); 인간 파필로마 바이러스 E7 (HPV E7); 장내 카르복실 에스테라제; 변이된 열 충격 단백질 70-2 (hsp70-2); CD79a; CD79b; CD72; 백혈구-관련된 면역글로불린-유사 수용체 1 (LAIRl); IgA 수용체의 Fc 단편 (FCAR 또는 CD89); 백혈구 면역글로불린-유사 수용체 서브패밀리 A 구성원 2 (LILRA2); CD300 분자-유사 패밀리 구성원 f (CD300LF); C형 렉틴 도메인 패밀리 12 구성원 A (CLEC12A); 골수 간질 세포 항원 2 (BST2); EGF-유사 모듈-포함 뮤신-유사 호르몬 수용체-유사 항원 2 (EMR2); 림프구 항원 75 (LY75); 글리피칸-3 (GPC3); Fc 수용체-유사 5 (FCRL5); 면역글로불린 람다-유사 폴리펩티드 1 (IGLLl); MPL; 바이오틴; c-MYC 에피토프 태그; CD34; LAMP1; TROP2;, GFRα4; CDH17; CDH6; NYBR1; CDH19; CD200R; Slea (CA19.9; 시아릴 루이스 항원); 퓨코실-GM1; PTK7; gpNMB; CDH1-CD324; DLL3; CD276/B7H3; IL-11Ra; IL-13Ra2; CD179b-IGLl1; ALK TCRγ-δ; NKG2D; CD32 (FCGR2A); Tn ag; CSPG4-HMW-MAA; Tim1-/HVCR1; CSF2RA (GM-CSFR-알파); TGFβR2; VEGFR2/KDR; 루이스 항원; TCR-β1 사슬; TCR-β2 사슬, TCR-γ 사슬, TCR-δ 사슬; FITC; 황체형성 호르몬 수용체 (LHR); 난포 자극 호르몬 수용체 (FSHR); 융모생식샘 자극호르몬 수용체 (CGHR); CCR4; GD3; SLAMF6; SLAMF4; HIV1 외투 당단백질; HTLV1-Tax; CMV pp65; EBV-EBNA3c; 인플루엔자 A 헤마글루티닌 (HA); GAD; PDL1; 구아니릴 사이클라제 C (GCC); KSHV-K8.1 단백질; KSHV-gH 단백질; 데스모글레인 3 (Dsg3)에 대한 자가항체; 데스모글레인 1 (Dsg1)에 대한 자가항체; HLA, HLA-A, HLA-A2, HLA-B, HLA-C, HLA-DP, HLA-DM, HLA-DOA, HLA-DOB, HLA-DQ, HLA-DR, HLA-G; IGE; CD99; RAS; G12V; 조직 인자 1 (TF1); AFP; GPRC5D; 클라우딘18.2 (CLD18A2 또는 CLDN18A.2)); P-당단백질; STEAP1; LIV1; 넥틴-4; CRIPTO; GPA33; BST1/CD157; 저전도도 염화물 통로; 및 TNT 항체에 의해 인식되는 항원:
으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 질환 관련 항원에 결합하는, 단리된 합성 면역 수용체 (SIR) 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 이종이량체. - 제 121항에 있어서,
상기 하나 이상의 비-천연 TCR 항원 결합 도메인(들)은 항체, 항체 단편, scFv, Fv, Fab, (Fab')2, 단일 도메인 항체 (SDAB), vH 또는 vL 도메인, 카멜리드 VHH 도메인, 다르핀, 어피바디, 어필린, 어드넥틴, 어피틴, 오바디, 레페바디, 파이노머, 알파바디, 어비머, 아트리머, 센티린, 프로넥틴, 안티칼린, 쿠니츠 도메인, 아미딜로 반복서열 단백질과 같은 비-면역글로불린 항원 결합 스캐폴드, 수용체 또는 리간드를 포함하는, 단리된 합성 면역 수용체 (SIR) 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 이종이량체. - 제 121항에 있어서,
상기 하나 이상의 비-천연 TCR 항원 결합 도메인(들)은
(i) 임의의 서열번호 2506 내지 2680 또는 12160 내지 12278에 나타낸 바와 같은 서열 또는 이와 적어도 98% 동일성을 갖고, 이의 항원에 결합하는 폴리펩티드를 인코딩하는 서열을 포함하는, 중쇄 가변 영역 (vH);
(ii) 임의의 서열번호 2307 내지 2482 또는 12042 내지 12159에 나타낸 바와 같은 서열 또는 이와 적어도 98% 동일성을 갖고, 이의 항원에 결합하는 폴리펩티드를 인코딩하는 서열을 포함하는, 경쇄 가변 영역 (vL);
(iii) 서열번호 2770 내지 2939, 12303 내지 12357 또는 18162 내지 18224 중 어느 하나에 나타낸 바와 같은 서열 또는 이와 적어도 98% 동일성을 갖고, 이의 항원에 결합하는 폴리펩티드를 인코딩하는 서열을 포함하는, 단일 사슬 가변 단편 (scFv);
(iv) 서열번호 2701 내지 2725 또는 12279 내지 12294 중 어느 하나에 나타낸 바와 같은 서열 또는 이와 적어도 98% 동일성을 갖고, 이의 항원에 결합하는 폴리펩티드를 인코딩하는 서열을 포함하는, 카멜리드 VHH 도메인;
(v) 서열번호 439 내지 443 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 또는 이와 적어도 98% 동일성을 갖고, 이의 항원에 결합하는 폴리펩티드를 인코딩하는 서열에 의해 인코딩되는, 비-면역글로불린 스캐폴드;
(vi) 서열번호 2736 내지 2748 중 어느 하나에 나타낸 바와 같은 서열 또는 이와 적어도 98% 동일성을 갖고, 이의 동족체에 결합하는 폴리펩티드를 인코딩하는 서열을 포함하는, 수용체; 및
(vii) 서열번호 2758 내지 2768 또는 12359 내지 12361 중 어느 하나에 나타낸 바와 같은 서열 또는 이와 적어도 98% 동일성을 갖고, 이의 동족체에 결합하는 폴리펩티드를 인코딩하는 서열을 포함하는, 리간드:
로 이루어진 군으로부터 선택되는, 단리된 합성 면역 수용체 (SIR) 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 이종이량체. - 제 111항에 있어서,
상기 하나 이상의 비-천연 TCR 항원 결합 도메인(들)은 임의의 서열번호 13999 내지 14879 또는 14880에 나타낸 바와 같은 선택된 표적 항원에 대한 하나 이상의 경쇄 상보성 결정 영역 및/또는 임의의 서열번호 14881 내지 15761 또는 15762에 나타낸 바와 같은 선택된 표적 항원에 대한 하나 이상의 중쇄 상보성 결정 영역을 포함하는, 단리된 합성 면역 수용체 (SIR) 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 이종이량체. - 제 111항에 있어서,
상기 하나 이상의 비-천연 TCR 항원 결합 도메인(들)은 최대 10개의 보존적 아미노산 치환을 갖는 임의의 서열번호 2307 내지 2482 또는 12042 내지 12159의 서열을 포함하는 가변 경쇄 (vL) 도메인 및/또는 최대 10개의 보존적 아미노산 치환을 갖는 임의의 서열번호 2506 내지 2680 또는 12160 내지 12278의 서열을 포함하는 가변 중쇄 (vH) 도메인을 포함하는, 단리된 합성 면역 수용체 (SIR) 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 이종이량체. - 제 111항에 있어서,
상기 하나 이상의 비-천연 TCR 항원 결합 도메인(들)은 최대 10개의 보존적 아미노산 치환을 갖는 임의의 서열번호 2701 내지 2725 또는 12279 내지 12294에 나타낸 바와 같은 선택된 항원에 대한 하나 이상의 카멜리드 vHH 상보성 결정 영역을 포함하는, 단리된 합성 면역 수용체 (SIR) 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 이종이량체. - 제 111항에 있어서,
상기 하나 이상의 비-천연 TCR 항원 결합 도메인(들)은 임의의 서열번호 2728 내지 2732 또는 12296 내지 12301에 나타낸 바와 같은 서열을 갖고, 최대 10개의 보존적 아미노산 치환을 갖는 비-면역글로불린 항원 결합 도메인을 포함하는, 단리된 합성 면역 수용체 (SIR) 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 이종이량체. - 제 111항에 있어서,
상기 하나 이상의 비-천연 TCR 항원 결합 도메인(들)은 서열번호 2307 내지 2482 또는 12042 내지 12159 중 어느 하나의 서열을 포함하는 하나 이상의 경쇄 상보성 결정 영역 (vL) 도메인 및/또는 서열번호 2506 내지 2680 또는 12160 내지 12278의 서열을 포함하는 하나 이상의 중쇄 상보성 결정 영역 (vH) 도메인을 포함하는, 단리된 합성 면역 수용체 (SIR) 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 이종이량체. - 제 111항에 있어서,
상기 하나 이상의 비-천연 TCR 항원 결합 도메인(들)은 각각이 최대 10개의 보존적 아미노산 치환을 갖는 서열번호 2770 내지 2939, 12303 내지 12357 또는 18162 내지 18224로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 갖는 scFv 단편을 포함하는, 단리된 합성 면역 수용체 (SIR) 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 이종이량체. - 제 111항에 있어서,
상기 하나 이상의 비-천연 TCR 항원 결합 도메인(들)은 각각이 최대 10개의 보존적 아미노산 치환을 갖는 임의의 서열번호 2736 내지 2748의 아미노산 서열을 포함하는 하나 이상의 수용체를 포함하는, 단리된 합성 면역 수용체 (SIR) 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 이종이량체. - 제 111항에 있어서,
상기 하나 이상의 비-천연 TCR 항원 결합 도메인(들)은 최대 10개의 보존적 아미노산 치환을 갖는 임의의 서열번호 2758 내지 2768 또는 12359 내지 12361의 서열을 포함하는 하나 이상의 수용체를 포함하는, 단리된 합성 면역 수용체 (SIR) 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 이종이량체. - 제 111항에 있어서,
상기 하나 이상의 비-천연 TCR 항원 결합 도메인(들)은 CD16A, NKG2D, CD4, PD1, 데스모글레인 3 (Dsg3) 또는 CD4-DC-SIGN의 세포외 도메인을 포함하는, 단리된 합성 면역 수용체 (SIR) 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 이종이량체. - 제 111항에 있어서,
상기 하나 이상의 비-천연 TCR 항원 결합 도메인(들)은 hTPO, mTPO, CGHα 사슬, CGHβ 사슬, FHβ 사슬, LHβ 사슬, TSHβ 사슬, APRIL 또는 이들의 조합 중 하나 이상의 세포외 도메인을 포함하는, 단리된 합성 면역 수용체 (SIR) 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 이종이량체. - 제 111항에 있어서,
상기 하나 이상의 비-천연 TCR 항원 결합 도메인(들)은
임의의 서열번호 2770 내지 2939, 12303 내지 12357 또는 18162 내지 18224의 서열을 포함하고, 최대 10개의 보존적 아미노산 치환을 갖는 임의의 단일 사슬 가변 단편 (scFv) 및
(a) 최대 10개의 보존적 아미노산 치환을 갖는 임의의 서열번호 2701 내지 2725 또는 12279 내지 12294에 나타낸 바와 같은 임의의 카멜리드 vHH; 또는
(b) 임의의 서열번호 2728 내지 2732 또는 12296 내지 12301에 나타낸 바와 같은 서열을 갖고, 최대 10개의 보존적 아미노산 치환을 갖는 임의의 비-면역글로불린 항원 결합 도메인; 또는
(c) 최대 10개의 보존적 아미노산 치환을 갖는 임의의 서열번호 2736 내지 2748의 아미노산 서열을 포함하는 수용체의 임의의 세포외 도메인; 또는
(d) 최대 10개의 보존적 아미노산 치환을 갖는 임의의 서열번호 2758 내지 2768 또는 12359 내지 12361의 서열을 포함하는 리간드의 임의의 세포외 도메인:
을 포함하는, 단리된 합성 면역 수용체 (SIR) 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 이종이량체. - 제 111항에 있어서,
상기 하나 이상의 비-천연 TCR 항원 결합 도메인(들)은
최대 10개의 보존적 아미노산 치환을 갖는 임의의 서열번호 2701 내지 2725 또는 12279 내지 12294에 나타낸 바와 같은 카멜리드 vHH 및
(a) 임의의 서열번호 2770 내지 2939, 12303 내지 12357 또는 18162 내지 18224의 서열을 포함하고, 최대 10개의 보존적 아미노산 치환을 갖는 임의의 단일 사슬 가변 단편 (scFv); 또는
(b) 임의의 서열번호 2728 내지 2732 또는 12296 내지 12301에 나타낸 바와 같은 서열을 갖고, 최대 10개의 보존적 아미노산 치환을 갖는 임의의 비-면역글로불린 항원 결합 도메인; 또는
(c) 최대 10개의 보존적 아미노산 치환을 갖는 임의의 서열번호 2736 내지 2748의 아미노산 서열을 포함하는 수용체의 임의의 세포외 도메인; 또는
(d) 최대 10개의 보존적 아미노산 치환을 갖는 임의의 서열번호 2758 내지 2768 또는 12359 내지 12361의 서열을 포함하는 리간드의 임의의 세포외 도메인:
을 포함하는, 단리된 합성 면역 수용체 (SIR) 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 이종이량체. - 제 111항에 있어서,
상기 하나 이상의 비-천연 TCR 항원 결합 도메인(들)은 선택적으로 링커 영역에 의해 TCR 불변 영역 사슬 각각에 연결되고, 상기 링커 영역 핵산은 서열번호 2981 내지 3003 및 이들의 임의의 조합 또는 이와 적어도 98% 동일성을 갖는 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 인코딩하거나, 상기 링커가 서열번호 701 내지 725 또는 이와 적어도 98% 동일성을 갖는 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 핵산 서열에 의해 인코딩되는, 단리된 합성 면역 수용체 (SIR) 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 이종이량체. - 제 111항에 있어서,
상기 하나 이상의 비-천연 TCR 항원 결합 도메인(들)은 이것이 획득된 항체보다 적어도 5배 낮은 이의 표적 항원에 대한 결합 친화도를 갖는, 단리된 합성 면역 수용체 (SIR) 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 이종이량체. - 제 111항에 있어서,
상기 SIR을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드는 각각의 사슬의 N-말단에 존재하는 리더 서열 또는 신호 펩티드를 추가로 포함하고, 서열번호 1 내지 9 및 10으로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함하는, 단리된 합성 면역 수용체 (SIR) 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 이종이량체. - 제 111항에 있어서,
상기 SIR은 SIR 이종이량체를 포함하는, 단리된 합성 면역 수용체 (SIR) 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 이종이량체. - 제 111항에 있어서,
상기 폴리펩티드는 절단가능한 링커에 의해 연결된 두 개의 SIR을 포함하는, 단리된 합성 면역 수용체 (SIR) 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 이종이량체. - 제 140항에 있어서,
상기 절단가능한 링커는 자가-절단하는 절단가능한 링커인, 단리된 합성 면역 수용체 (SIR) 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 이종이량체. - 제 140항에 있어서,
상기 절단가능한 링커는 2A 링커, 2A-유사 링커 또는 이들의 기능적 등가물 중 임의의 하나 이상인, 단리된 합성 면역 수용체 (SIR) 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 이종이량체. - 제 31항에 있어서,
상기 절단가능한 링커는 T2A 링커, P2A, F2A, E2A 링커 또는 이들의 기능적 등가물 중 임의의 하나 이상인, 단리된 합성 면역 수용체 (SIR) 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 이종이량체. - 제 140항에 있어서,
상기 절단가능한 링커는 서열번호 780 내지 785 중 임의의 하나 이상의 서열을 포함하는, 단리된 합성 면역 수용체 (SIR) 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 이종이량체. - 제 140항에 있어서,
상기 절단가능한 링커는 선택적으로 퓨린 절단 부위 또는 퓨린 유사 절단 부위 또는 이들의 기능적 등가물이 선행하는,단리된 합성 면역 수용체 (SIR) 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 이종이량체. - 제 145항에 있어서,
상기 절단가능한 링커를 선행하는 상기 퓨린 절단 부위는 서열번호 788 내지 790 중 임의의 하나 이상의 서열을 포함하는, 단리된 합성 면역 수용체 (SIR) 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 이종이량체. - 제 140항 내지 제 146항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 절단가능한 링커는 가요성 링커가 선행하는, 단리된 합성 면역 수용체 (SIR) 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 이종이량체. - 제 147항에 있어서,
상기 절단가능한 링커를 선행하는 상기 가요성 링커는 Ser-Gly 링커, Ser-Gly-Ser-Gly 링커 또는 이들의 기능적 등가물 중 하나 이상을 인코딩하는, 단리된 합성 면역 수용체 (SIR) 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 이종이량체. - 제 147항에 있어서,
상기 절단가능한 링커를 선행하는 상기 가요성 링커는 서열번호 786 또는 787의 서열을 포함하는, 단리된 합성 면역 수용체 (SIR) 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 이종이량체. - 제 147항에 있어서,
상기 퓨린 절단 부위는 상기 가요성 링커가 선행하고, 이는 상기 절단가능한 링커가 선행하여 퓨린 절단 부위 - 가요성 링커 - 절단가능한 링커의 순서가 되는, 단리된 합성 면역 수용체 (SIR) 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 이종이량체. - 제 111항에 있어서,
상기 SIR은 선택된 항원에 대한 바람직한 결합 친화도를 갖도록 설계되는, 단리된 합성 면역 수용체 (SIR) 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 이종이량체. - 제 111항의 폴리펩티드 또는 헤테로이량체 중 적어도 하나를 포함하는 면역 효과기 세포 또는 줄기 세포.
- 제 1항의 재조합 폴리뉴클레오티드 중 적어도 하나를 포함하는 면역 효과기 세포 또는 줄기 세포.
- 제 104항 벡터 중 적어도 하나를 포함하는 면역 효과기 세포 또는 줄기 세포.
- 제 152항 내지 제 154항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 세포는 다수의 SIR 폴리펩티드를 포함하는, 면역 세포 또는 줄기 세포. - 제 155항에 있어서,
상기 다수의 SIR 폴리펩티드 중 적어도 하나의 SIR 폴리펩티드는 적어도 하나의 다른 SIR 폴리펩티드가 아닌 상이한 항원을 표적하는, 면역 세포 또는 줄기 세포. - 제 155항에 있어서,
상기 다수의 SIR 폴리펩티드 중 적어도 하나의 SIR 폴리펩티드는 동일한 항원을 표적하는, 면역 세포 또는 줄기 세포. - 제 157항에 있어서,
상기 다수의 SIR 폴리펩티드 중 적어도 하나의 SIR 폴리펩티드는 적어도 하나의 다른 SIR 폴리펩티드가 아닌 항원에 대한 상이한 결합 친화도를 포함하는, 면역 세포 또는 줄기 세포. - 제 152항 내지 제 154항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 면역 세포는 적어도 하나의 키메라 항원 수용체 (CAR) 폴리펩티드를 추가로 포함하는, 면역 세포 또는 줄기 세포. - 제 159항에 있어서,
상기 SIR 폴리펩티드의 항원 결합 도메인은 상기 CAR 폴리펩티드의 항원 결합 도메인이 아닌 상이한 항원을 표적하는, 면역 세포 또는 줄기 세포. - 제 159항에 있어서,
상기 CAR 폴리펩티드는 보조자극 신호전달 도메인을 포함하는 세포내 신호전달 도메인을 포함하지만 일차 신호전달 도메인은 포함하지 않거나, 일차 신호전달 도메인을 포함하는 세포내 신호전달 도메인을 포함하지만 보조자극 신호전달 도메인은 포함하지 않는, 면역 세포 또는 줄기 세포. - 제 159항에 있어서,
상기 CAR 폴리펩티드는 4-lBB, CD28, CD27 또는 OX-40로 이루어진 군으로부터 선택된 단백질의 기능적 신호전달 도메인을 포함하는 보조자극 신호전달 도메인을 포함하거나, 상기 CAR 폴리펩티드는 CD3 제타의 기능적 신호전달 도메인을 포함하는 일차 신호전달 도메인을 포함하는, 면역 세포 또는 줄기 세포. - 제 159항에 있어서,
상기 CAR 폴리펩티드는 억제성 CAR 폴리펩티드이고, 상기 억제성 CAR 폴리펩티드는 항원 결합 도메인, 막통과 도메인 및 억제성 분자의 세포내 도메인을 포함하고, 상기 억제성 분자는 PDl, PD-Ll, CTLA4, TIM3, LAG3, VISTA, BTLA, TIGIT, LAIRl, CD160, 2B4, TGFRβ, CEACAM-1, CEACAM-3 및 CEACAM-5로 이루어진 군으로부터 선택되는, 면역 세포 또는 줄기 세포. - 제 159항에 있어서,
상기 CAR 폴리펩티드는 일차 신호전달 도메인 및/또는 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 세포내 신호전달 도메인을 추가로 포함하고, 상기 세포내 신호전달 도메인은 CD3 제타의 기능적 신호전달 도메인을 포함하는 일차 신호전달 도메인 및 4-lBB 또는 CD28 또는 둘 다의 기능적 도메인을 포함하는 보조자극 신호전달 도메인을 포함하는, 면역 세포 또는 줄기 세포. - 제 159항에 있어서,
상기 CAR 폴리펩티드는 서열번호 3077 내지 3083의 아미노산 서열을 포함하는, 면역 세포 또는 줄기 세포. - 제 152항 내지 제 154항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 면역 효과기 세포는 인간 T 세포, 인간 NKT 세포 또는 면역 효과기 세포를 유도할 수 있는 합성 T 세포 또는 줄기 세포이고, 선택적으로 상기 T 세포는 디아글리세롤 키나제 (DGK) 및/또는 이카로스 결핍 및/또는 Brd4 결핍인, 면역 세포 또는 줄기 세포. - 제 152항의 면역 효과기 세포의 집단으로서, 상기 세포 집단은 다수의 다양한 SIR 폴리펩티드를 포함하는, 면역 효과기 세포의 집단.
- 제 167항에 있어서,
상기 다수의 다양한 SIR 폴리펩티드는 상이한 서열을 포함하지만 동일한 표적 항원에 결합하는, 면역 효과기 세포의 집단. - 제 167항에 있어서,
상기 세포의 집단은 특정한 질환 유형에 존재하는 상이한 항원을 표적하는 SIR 폴리펩티드를 포함하는, 면역 효과기 세포의 집단. - SIR 발현하는 면역 효과기 세포를 제조하는 방법으로서, 제 104항 벡터 중 적어도 하나 또는 제 1항의 재조합 폴리뉴클레오티드 중 적어도 하나를 상기 SIR 폴리펩티드가 발현되는 조건 하에 면역 효과기 세포 또는 면역 효과기 세포를 유도할 수 있는 조혈 줄기 세포 또는 전구 세포 내로 도입하는 단계를 포함하는, 방법.
- 제 170항에 있어서,
a) 면역 효과기 세포의 집단을 제공하는 단계; 및
b) 상기 집단으로부터 T 조절 세포를 제거하고, 이로써 T 조절-고갈된 세포의 집단을 제공하는 단계:를 추가로 포함하고,
상기 단계 a) 및 b)는 상기 SIR을 인코딩하는 벡터 또는 재조합 폴리뉴클레오티드를 상기 집단 내로 도입하기 이전에 수행되는, 방법. - 제 171항에 있어서,
상기 T 조절 세포는 항-CD25 항체 또는 항-GITR 항체를 사용하여 상기 세포 집단으로부터 제거되는, 방법. - 제 170항에 있어서,
a) 면역 효과기 세포의 집단을 제공하는 단계; 및
b) 상기 세포 집단으로부터 P-당단백질 (P-gp 또는 Pgp; MDR1, ABCB1, CD243)-양성 세포를 농축시키고, 이로써 P-당단백질 (P-gp 또는 Pgp; MDR1, ABCB1, CD243)-농축된 세포의 집단을 제공하는 단계:를 추가로 포함하고,
상기 단계 a) 및 b)는 상기 SIR을 인코딩하는 벡터 또는 재조합 폴리뉴클레오티드를 도입하기 이전 또는 이후에 수행되는, 방법. - 제 173항에 있어서,
상기 P-당단백질 양성 세포는
i) P-당단백질 특이적 항체 중 하나 또는 이의 칵테일을 사용한 면역선별 방법;
ii) P-당단백질의 기질인 형광 염료, 테트라메틸로다민 메틸 에스테르 (TMRM), 아드리아마이신 및 액티노마이신-D 중 하나 이상으로 P-당단백질이 펌프로서 활성을 갖는 조건 하에 염색하여, 염료로 덜 염색되는 세포를 농축시키는 방법;
iii) TH9402, 2-(4,5-디브로모-6-아미노-3-이미노-3H-잔텐-9-일)-벤조산 메틸 에스테르 염화물, 2-(4,5-디브로모-6-아미노-3-이미노-3H-잔텐-9-일)-벤조산 에틸 에스테르 염화물, 2-(4,5-디브로모-6-아미노-3-이미노-3H-잔텐-9-일)-벤조산 메틸 옥틸 에스테르 염화물, 2-(4,5-디브로모-6-아미노-3-이미노-3H-잔텐-9-일)-벤조산 n-부틸 에스테르 염화물, 2-(6-에틸 아미노-3-에틸 이미노-3H-잔텐-9-일)-벤조산 메틸 n-부틸 에스테르 염화물 또는 이들의 유도체 또는 이들의 조합 중 임의의 하나 이상과 같은 P-당단백질의 기질인, 광독성 화합물에 저항성을 갖는 세포의 선별 방법; 및
iv) 빈크리스틴, 빈블라스틴, 택솔, 파크리탁셀, 미토잔트론, 에토포시드, 아드리아마이신, 다우노루비신 및 액티노마이신-D와 같은 P-당단백질의 기질은 세포독성 화합물에 저항성을 갖는 세포의 선별 방법:
로 이루어진 군으로부터 선택된 임의의 하나 이상의 방법을 사용하여 농축되는, 방법. - RNA-조작된 세포의 집단을 생성하는 방법으로서, 시험관내에서 전사된 RNA 또는 RNA들 또는 합성 RNA 또는 RNA들을 세포 또는 세포의 집단 내에 도입하는 단계를 포함하고, 상기 RNA 또는 RNA들은 제 1항의 재조합 폴리뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 방법.
- 피험자에서 항-질환 면역을 제공하는 방법으로서, 제 152항 내지 제 154항 중 어느 한 항의 면역 효과기 세포 또는 면역 효과기 세포를 유도할 수 있는 줄기 세포의 유효량을 상기 피험자에게 투여하는 것을 포함하고, 상기 세포는 자가유래 T 세포 또는 동종유래 T 세포, 또는 자가유래 NKT 세포 또는 동종유래 NKT 세포, 또는 면역 효과기 세포를 유도할 수 있는 자가유래 또는 동종유래 조혈 줄기 세포 또는 자가유래 또는 동종유래 iPSC인, 방법.
- 제 176항에 있어서,
상기 동종유래 T 세포 또는 동종유래 NKT 세포 또는 조혈 줄기 세포 또는 iPSC는 기능적 TCR 또는 기능적 HLA의 발현이 결여되거나 이의 낮은 발현을 갖는, 방법. - 면역 효과기 세포 또는 면역 효과기 세포를 생성할 수 있는 줄기 세포를 포함하는 조성물로서, 질환 관련 항원의 발현과 연관된 질환을 갖는 피험자의 치료 및 질환 관련 항원의 발현과 관련된 질환의 위험성이 증가된 피험자에서 질환의 예방에서 면역 효과기 세포의 효능을 증가시키는 제제와 조합하여 사용되는 하나 이상의 합성 면역 수용체 (SIR)을 포함하고,
(i) 상기 SIR 분자는 상기 질환과 관련된 질환 관련 항원에 결합하는 하나 이상의 항원 결합 도메인에 조건부 링커를 통해 연결되는 하나 이상의 T 세포 수용체 불변 사슬을 포함하고, 상기 질환 관련 항원은 CD5; CD19; CD123; CD22; CD30; CD171; CS-1 (CD2 하위집합 1, CRACC, SLAMF7, CD319 및 19A24라고도 지칭됨); C형 렉틴-유사 분자-1 (CLL-1 또는 CLECL1); CD33; 표피 성장인자 수용체 변이체 Ⅲ (EGFRvⅢ); 갱글리오시드 G2 (GD2); 갱글리오시드 GD3 (aNeu5Ac(2-8)aNeu5Ac(2-3)bDGalp(l-4)bDGlcp(l-l)Cer); TNF 수용체 패밀리 구성원 B 세포 성숙 (BCMA); Tn 항원 ((Tn Ag) 또는 (GalNAcα-Ser/Thr)); 전립선-특이적 막 항원 (PSMA); 수용체 타이로신 키나제-유사 고아 수용체 1 (ROR1); Fms 유사 타이로신 키나제 3 (FLT3); 종양-관련 당당백질 72 (TAG72); CD38; CD44v6; 급성 백혈병 또는 림프종 상에서 발현되지만 조혈 전구세포 상에서는 발현되지 않는 글리코실화된 CD43 에피토프; 비-조혈성 암 상에서 발현된 글리코실화된 CD43 에피토프; 암배아 항원 (CEA); 상피세포 부착 분자 (EPCAM); B7H3 (CD276); KIT (CD117); 인터루킨-13 수용체 소단위체 알파-2 (IL-13Ra2 또는 CD213A2); 메소틸린; 인터루킨 11 수용체 알파 (IL-llRa); 전립선 줄기 세포 항원 (PSCA); 프로테아제 세린 21 (테스티신 또는 PRSS21); 혈관 내피 성장인자 수용체 2 (VEGFR2); 루이스 (Y) 항원; CD24; 혈소판-유래 성장인자 수용체 베타 (PDGFR-베타); 단계-특이적 배아 항원-4 (SSEA-4); CD20; 폴레이트 수용체 알파; 수용체 타이로신-단백질 키나제 ERBB2 (Her2/neu); 세포 표면 연관된 뮤신 1 (MUC1); 상피 성장인자 수용체 (EGFR); 신경 세포 부착 분자 (NCAM); 프로스타제; 전립샘 산 포스파타제 (PAP); 변이된 신장인자 2 (ELF2M); 에프린 B2; 섬유모세포 활성화 단백질 알파 (FAP); 인슐린-유사 성장인자 1 수용체 (IGF-I 수용체); 탄산 무수화제 Ⅸ (CAⅨ); 프로테오좀 (프로좀, 마크로페인) 소단위체 베타형, 9 (LMP2); 당단백질 100 (gpl00); 절단점 클러스터 영역 (BCR)으로 구성된 종양원 유전자 융합 단백질 및 아벨슨 마우스 백혈병 바이러스 종양원 유전자 상동체 1 (Abl) (bcr-abl); 티로시나제; 에프린 A형 수용체 2 (EphA2); 퓨코실 GM1; 시아릴 루이스 부착 분자 (sLe); 갱글리오시드 GM3 (aNeu5Ac(2-3)bDClalp(l-4)bDGlcp(l-1)Cer); 글루타민 전이효소 5 (TGS5); 고분자량 흑색종 관련된 항원 (HMWMAA); o-아세틸-GD2 갱글리오시드 (OAcGD2); 종양 내피 마커 1 (TEM1/CD248); 관련된 종양 내피 마커 7 (TEM7R); 클라우딘 6 (CLDN6); 갑상샘 자극호르몬 수용체 (TSHR); G 단백질 연결된 수용체 클래스 C 그룹 5, 구성원 D (GPRC5D); 염색체 X 오픈 리딩 프레임 61 (CXORF61); CD97; CD179a; 역형성 림프종 키나제 (ALK); 폴리시알산; 태반-특이적 항원 1 (PLAC1); 글로보H 글리코세라미드의 육당질 부분 (글로보H); 유샘 분화 항원 (NY-BR-1); 유로플라킨 2 (UPK2); A형 간염 바이러스 세포 수용체 1 (HAVCR1); 아드레노셉터 베타 3 (ADRB3); 패넥신 3 (PANX3); G 단백질-연결된 수용체 20 (GPR20); 림프구 항원 6 복합체, 좌위 K 9 (LY6K); 후각 수용체 51E2 (OR51E2); TCR 감마 교대 리딩 프레임 단백질 (TARP); 윌름 종양 단백질 (WT1); 암/고환 항원 1 (NY-ES0-1); 암/고환 항원 2 (LAGE-1a); 흑색종-관련 항원 1 (MAGE-A1); 염색체 12p 상에 위치한 ETS 전위 변이체 유전자 6 (ETV6-AML); 정자 단백질 17 (SPA17); X 항원 패밀리, 구성원 lA (XAGEl); 안지오포이에틴-결합 세포 표면 수용체 2 (타이 2); 흑색종 암 고환 항원-1 (MAD-CT-1); 흑색종 암 고환 항원-2 (MAD-CT-2); Fos-관련된 항원 1; 종양 단백질 p53 (p53); p53 돌연변이체; 프로스테인; 서바이빈; 텔로머라제; 전립선 암종 종양 항원-1 (PCT A-1 또는 갈렉틴 8); T 세포에 의해 인식되는 흑색종 항원 1 (MelanA 또는 MARTI); 래트 육종 (Ras) 돌연변이체; 인간 텔로머라제 역전사효소 (hTERT); 육종 전위 절단점; 흑색종의 세포사멸 저해제 (ML-IAP); ERG (막통과 프로테아제, 세린 2 (TMPRSS2) ETS 융합 유전자); N-아세틸 글루코사미닐-전이효소 V (NA17); 쌍 형성된 박스 단백질 Pax-3 (PAX3); 안드로겐 수용체; 사이클린 Bl; v-myc 조류 백혈병 바이러스 종양원 유전자 신경모세포종 유래된 상동체 (MYCN); Ras 상동체 패밀리 구성원 C (RhoC); 티로시나제-관련 단백질 2 (TRP-2); 사이토크롬 P450 lB 1 (CYPlB 1); CCCTC-결합 인자 (아연 핑거 단백질)-유사 (BORIS 또는 각인 부위의 조절인자의 형제), T 세포에 의해 인식되는 편평세포 암종 항원 3 (SART3); 쌍 형성된 박스 단백질 Pax-5 (PAX5); 프로아크로신 결합 단백질 sp32 (OY-TESl); 림프구-특이적 단백질 타이로신 키나제 (LCK); 키나제 고정 단백질 4 (AKAP-4); 활액 육종 X 절단점 2 (SSX2); 진행된 당화 말단 산물의 수용체 (RAGE-1); 신장 유비퀴터스 1 (RUl); 신장 유비퀴터스 2 (RU2); 레구마인; 인간 파필로마 바이러스 E6 (HPV E6); 인간 파필로마 바이러스 E7 (HPV E7); 장내 카르복실 에스테라제; 변이된 열 충격 단백질 70-2 (hsp70-2); CD79a; CD79b; CD72; 백혈구-관련된 면역글로불린-유사 수용체 1 (LAIRl); IgA 수용체의 Fc 단편 (FCAR 또는 CD89); 백혈구 면역글로불린-유사 수용체 서브패밀리 A 구성원 2 (LILRA2); CD300 분자-유사 패밀리 구성원 f (CD300LF); C형 렉틴 도메인 패밀리 12 구성원 A (CLEC12A); 골수 간질 세포 항원 2 (BST2); EGF-유사 모듈-포함 뮤신-유사 호르몬 수용체-유사 항원 2 (EMR2); 림프구 항원 75 (LY75); 글리피칸-3 (GPC3); Fc 수용체-유사 5 (FCRL5); 면역글로불린 람다-유사 폴리펩티드 1 (IGLLl); MPL; 바이오틴; c-MYC 에피토프 태그; CD34; LAMP1; TROP2;, GFRα4; CDH17; CDH6; NYBR1; CDH19; CD200R; Slea (CA19.9; 시아릴 루이스 항원); 퓨코실-GM1; PTK7; gpNMB; CDH1-CD324; DLL3; CD276/B7H3; IL-11Ra; IL-13Ra2; CD179b-IGLl1; ALK TCRγ-δ; NKG2D; CD32 (FCGR2A); Tn ag; CSPG4-HMW-MAA; Tim1-/HVCR1; CSF2RA (GM-CSFR-알파); TGFβR2; VEGFR2/KDR; 루이스 항원; TCR-β1 사슬; TCR-β2 사슬, TCR-γ 사슬, TCR-δ 사슬; FITC; 황체형성 호르몬 수용체 (LHR); 난포 자극 호르몬 수용체 (FSHR); 융모생식샘 자극호르몬 수용체 (CGHR); CCR4; GD3; SLAMF6; SLAMF4; HIV1 외투 당단백질; HTLV1-Tax; CMV pp65; EBV-EBNA3c; 인플루엔자 A 헤마글루티닌 (HA); GAD; PDL1; 구아니릴 사이클라제 C (GCC); KSHV-K8.1 단백질; KSHV-gH 단백질; 데스모글레인 3 (Dsg3)에 대한 자가항체; 데스모글레인 1 (Dsg1)에 대한 자가항체; HLA, HLA-A, HLA-A2, HLA-B, HLA-C, HLA-DP, HLA-DM, HLA-DOA, HLA-DOB, HLA-DQ, HLA-DR, HLA-G; IGE; CD99; RAS; G12V; 조직 인자 1 (TF1); AFP; GPRC5D; 클라우딘18.2 (CLD18A2 또는 CLDN18A.2)); P-당단백질; STEAP1; LIV1; 넥틴-4; CRIPTO; GPA33; BST1/CD157; 저전도도 염화물 통로; 및 TNT 항체에 의해 인식되는 항원:
으로 이루어진 군으로부터 선택되고,
(ii) 상기 면역 세포의 효능을 증가시키는 제제는
- 단백질 포스파타제 저해제;
- 키나제 저해제 (예로, PI3K/AKT 저해제, mTOR 저해제, LCK 저해제 또는 BTK 저해제);
- 사이토카인;
- 면역 억제성 분자의 저해제;
- TREG 세포의 수준 또는 활성을 감소시키는 제제;
- SIR-변형된 세포의 증식 및/또는 유지를 증가시키는 제제;
- 케모카인;
- SIR의 발현을 증가시키는 제제;
- SIR의 발현 또는 활성의 조절을 허용하는 제제;
- SIR-변형된 세포의 증식 및/또는 유지 동안 통제를 허용하는 제제;
- SIR-변형된 세포의 부작용을 통제하는 제제;
- Brd4 저해제;
- 치료제 (예로, sHVEM) 또는 예방제를 질환의 부위에 전달하는 제제;
- SIR이 유도되는 표적 항원의 발현을 증가시키는 제제; 및
- 아데노신 A2a 수용체:
중 하나 이상으로부터 선택되는, 조성물. - 피험자에서 질환 관련 항원의 발현과 연관된 질환을 치료하거나 예방하는 방법으로서, 합성 면역 수용체 (SIR) 분자를 포함하는 면역 효과기 세포의 유효량을 상기 면역 세포의 효능을 증가시키는 제제와 조합하여 상기 피험자에게 투여하는 것을 포함하고,
(i) 상기 SIR 분자는 상기 질환과 연관된 질환 관련 항원에 결합하는 하나 이상의 항원 결합 도메인에 조건부 링커를 통해 연결되는 하나 이상의 T 세포 수용체 불변 사슬을 포함하고, 상기 질환 관련 항원은 CD5; CD19; CD123; CD22; CD30; CD171; CS-1 (CD2 하위집합 1, CRACC, SLAMF7, CD319 및 19A24라고도 지칭됨); C형 렉틴-유사 분자-1 (CLL-1 또는 CLECL1); CD33; 표피 성장인자 수용체 변이체 Ⅲ (EGFRvⅢ); 갱글리오시드 G2 (GD2); 갱글리오시드 GD3 (aNeu5Ac(2-8)aNeu5Ac(2-3)bDGalp(l-4)bDGlcp(l-l)Cer); TNF 수용체 패밀리 구성원 B 세포 성숙 (BCMA); Tn 항원 ((Tn Ag) 또는 (GalNAcα-Ser/Thr)); 전립선-특이적 막 항원 (PSMA); 수용체 타이로신 키나제-유사 고아 수용체 1 (ROR1); Fms 유사 타이로신 키나제 3 (FLT3); 종양-관련 당당백질 72 (TAG72); CD38; CD44v6; 급성 백혈병 또는 림프종 상에서 발현되지만 조혈 전구세포 상에서는 발현되지 않는 글리코실화된 CD43 에피토프; 비-조혈성 암 상에서 발현된 글리코실화된 CD43 에피토프; 암배아 항원 (CEA); 상피세포 부착 분자 (EPCAM); B7H3 (CD276); KIT (CD117); 인터루킨-13 수용체 소단위체 알파-2 (IL-13Ra2 또는 CD213A2); 메소틸린; 인터루킨 11 수용체 알파 (IL-llRa); 전립선 줄기 세포 항원 (PSCA); 프로테아제 세린 21 (테스티신 또는 PRSS21); 혈관 내피 성장인자 수용체 2 (VEGFR2); 루이스 (Y) 항원; CD24; 혈소판-유래 성장인자 수용체 베타 (PDGFR-베타); 단계-특이적 배아 항원-4 (SSEA-4); CD20; 폴레이트 수용체 알파; 수용체 타이로신-단백질 키나제 ERBB2 (Her2/neu); 세포 표면 연관된 뮤신 1 (MUC1); 상피 성장인자 수용체 (EGFR); 신경 세포 부착 분자 (NCAM); 프로스타제; 전립샘 산 포스파타제 (PAP); 변이된 신장인자 2 (ELF2M); 에프린 B2; 섬유모세포 활성화 단백질 알파 (FAP); 인슐린-유사 성장인자 1 수용체 (IGF-I 수용체); 탄산 무수화제 Ⅸ (CAⅨ); 프로테오좀 (프로좀, 마크로페인) 소단위체 베타형, 9 (LMP2); 당단백질 100 (gpl00); 절단점 클러스터 영역 (BCR)으로 구성된 종양원 유전자 융합 단백질 및 아벨슨 마우스 백혈병 바이러스 종양원 유전자 상동체 1 (Abl) (bcr-abl); 티로시나제; 에프린 A형 수용체 2 (EphA2); 퓨코실 GM1; 시아릴 루이스 부착 분자 (sLe); 갱글리오시드 GM3 (aNeu5Ac(2-3)bDClalp(l-4)bDGlcp(l-1)Cer); 글루타민 전이효소 5 (TGS5); 고분자량 흑색종 관련된 항원 (HMWMAA); o-아세틸-GD2 갱글리오시드 (OAcGD2); 종양 내피 마커 1 (TEM1/CD248); 관련된 종양 내피 마커 7 (TEM7R); 클라우딘 6 (CLDN6); 갑상샘 자극호르몬 수용체 (TSHR); G 단백질 연결된 수용체 클래스 C 그룹 5, 구성원 D (GPRC5D); 염색체 X 오픈 리딩 프레임 61 (CXORF61); CD97; CD179a; 역형성 림프종 키나제 (ALK); 폴리시알산; 태반-특이적 항원 1 (PLAC1); 글로보H 글리코세라미드의 육당질 부분 (글로보H); 유샘 분화 항원 (NY-BR-1); 유로플라킨 2 (UPK2); A형 간염 바이러스 세포 수용체 1 (HAVCR1); 아드레노셉터 베타 3 (ADRB3); 패넥신 3 (PANX3); G 단백질-연결된 수용체 20 (GPR20); 림프구 항원 6 복합체, 좌위 K 9 (LY6K); 후각 수용체 51E2 (OR51E2); TCR 감마 교대 리딩 프레임 단백질 (TARP); 윌름 종양 단백질 (WT1); 암/고환 항원 1 (NY-ES0-1); 암/고환 항원 2 (LAGE-1a); 흑색종-관련 항원 1 (MAGE-A1); 염색체 12p 상에 위치한 ETS 전위 변이체 유전자 6 (ETV6-AML); 정자 단백질 17 (SPA17); X 항원 패밀리, 구성원 lA (XAGEl); 안지오포이에틴-결합 세포 표면 수용체 2 (타이 2); 흑색종 암 고환 항원-1 (MAD-CT-1); 흑색종 암 고환 항원-2 (MAD-CT-2); Fos-관련된 항원 1; 종양 단백질 p53 (p53); p53 돌연변이체; 프로스테인; 서바이빈; 텔로머라제; 전립선 암종 종양 항원-1 (PCT A-1 또는 갈렉틴 8); T 세포에 의해 인식되는 흑색종 항원 1 (MelanA 또는 MARTI); 래트 육종 (Ras) 돌연변이체; 인간 텔로머라제 역전사효소 (hTERT); 육종 전위 절단점; 흑색종의 세포사멸 저해제 (ML-IAP); ERG (막통과 프로테아제, 세린 2 (TMPRSS2) ETS 융합 유전자); N-아세틸 글루코사미닐-전이효소 V (NA17); 쌍 형성된 박스 단백질 Pax-3 (PAX3); 안드로겐 수용체; 사이클린 Bl; v-myc 조류 백혈병 바이러스 종양원 유전자 신경모세포종 유래된 상동체 (MYCN); Ras 상동체 패밀리 구성원 C (RhoC); 티로시나제-관련 단백질 2 (TRP-2); 사이토크롬 P450 lB 1 (CYPlB 1); CCCTC-결합 인자 (아연 핑거 단백질)-유사 (BORIS 또는 각인 부위의 조절인자의 형제), T 세포에 의해 인식되는 편평세포 암종 항원 3 (SART3); 쌍 형성된 박스 단백질 Pax-5 (PAX5); 프로아크로신 결합 단백질 sp32 (OY-TESl); 림프구-특이적 단백질 타이로신 키나제 (LCK); 키나제 고정 단백질 4 (AKAP-4); 활액 육종 X 절단점 2 (SSX2); 진행된 당화 말단 산물의 수용체 (RAGE-1); 신장 유비퀴터스 1 (RUl); 신장 유비퀴터스 2 (RU2); 레구마인; 인간 파필로마 바이러스 E6 (HPV E6); 인간 파필로마 바이러스 E7 (HPV E7); 장내 카르복실 에스테라제; 변이된 열 충격 단백질 70-2 (hsp70-2); CD79a; CD79b; CD72; 백혈구-관련된 면역글로불린-유사 수용체 1 (LAIRl); IgA 수용체의 Fc 단편 (FCAR 또는 CD89); 백혈구 면역글로불린-유사 수용체 서브패밀리 A 구성원 2 (LILRA2); CD300 분자-유사 패밀리 구성원 f (CD300LF); C형 렉틴 도메인 패밀리 12 구성원 A (CLEC12A); 골수 간질 세포 항원 2 (BST2); EGF-유사 모듈-포함 뮤신-유사 호르몬 수용체-유사 항원 2 (EMR2); 림프구 항원 75 (LY75); 글리피칸-3 (GPC3); Fc 수용체-유사 5 (FCRL5); 면역글로불린 람다-유사 폴리펩티드 1 (IGLLl); MPL; 바이오틴; c-MYC 에피토프 태그; CD34; LAMP1; TROP2;, GFRα4; CDH17; CDH6; NYBR1; CDH19; CD200R; Slea (CA19.9; 시아릴 루이스 항원); 퓨코실-GM1; PTK7; gpNMB; CDH1-CD324; DLL3; CD276/B7H3; IL-11Ra; IL-13Ra2; CD179b-IGLl1; ALK TCRγ-δ; NKG2D; CD32 (FCGR2A); Tn ag; CSPG4-HMW-MAA; Tim1-/HVCR1; CSF2RA (GM-CSFR-알파); TGFβR2; VEGFR2/KDR; 루이스 항원; TCR-β1 사슬; TCR-β2 사슬, TCR-γ 사슬, TCR-δ 사슬; FITC; 황체형성 호르몬 수용체 (LHR); 난포 자극 호르몬 수용체 (FSHR); 융모생식샘 자극호르몬 수용체 (CGHR); CCR4; GD3; SLAMF6; SLAMF4; HIV1 외투 당단백질; HTLV1-Tax; CMV pp65; EBV-EBNA3c; 인플루엔자 A 헤마글루티닌 (HA); GAD; PDL1; 구아니릴 사이클라제 C (GCC); KSHV-K8.1 단백질; KSHV-gH 단백질; 데스모글레인 3 (Dsg3)에 대한 자가항체; 데스모글레인 1 (Dsg1)에 대한 자가항체; HLA, HLA-A, HLA-A2, HLA-B, HLA-C, HLA-DP, HLA-DM, HLA-DOA, HLA-DOB, HLA-DQ, HLA-DR, HLA-G; IGE; CD99; RAS; G12V; 조직 인자 1 (TF1); AFP; GPRC5D; 클라우딘18.2 (CLD18A2 또는 CLDN18A.2)); P-당단백질; STEAP1; LIV1; 넥틴-4; CRIPTO; GPA33; BST1/CD157; 저전도도 염화물 통로; 및 TNT 항체에 의해 인식되는 항원:
으로 이루어진 군으로부터 선택되고,
(ii) 상기 면역 세포의 효능을 증가시키는 제제는
- 단백질 포스파타제 저해제;
- 키나제 저해제 (예로, PI3K/AKT 저해제, mTOR 저해제, LCK 저해제 또는 BTK 저해제);
- 사이토카인;
- 면역 억제성 분자의 저해제;
- TREG 세포의 수준 또는 활성을 감소시키는 제제;
- SIR-변형된 세포의 증식 및/또는 유지를 증가시키는 제제;
- 케모카인;
- SIR의 발현을 증가시키는 제제;
- SIR의 발현 또는 활성의 조절을 허용하는 제제;
- SIR-변형된 세포의 증식 및/또는 유지 동안 통제를 허용하는 제제;
- SIR-변형된 세포의 부작용을 통제하는 제제;
- Brd4 저해제;
- 치료제 (예로, sHVEM) 또는 예방제를 질환의 부위에 전달하는 제제;
- SIR이 유도되는 표적 항원의 발현을 증가시키는 제제; 및
- 아데노신 A2a 수용체:
중 하나 이상으로부터 선택되고, 이로써 상기 피험자를 치료하거나 상기 피험자에서 질환을 예방하는, 방법. - 피험자에서 질환 관련 항원의 발현과 연관된 질환을 치료하거나 예방하는 방법으로서, 합성 면역 수용체 (SIR) 분자를 포함하는 면역 효과기 세포의 유효량을 상기 피험자에게 투여하는 것을 포함하고,
(i) 상기 SIR 분자는 상기 질환과 연관된 질환 관련 항원에 결합하는 하나 이상의 항원 결합 도메인에 조건부 링커를 통해 연결되는 하나 이상의 T 세포 수용체 불변 사슬을 포함하고, 상기 질환 관련 항원은 CD5; CD19; CD123; CD22; CD30; CD171; CS-1 (CD2 하위집합 1, CRACC, SLAMF7, CD319 및 19A24라고도 지칭됨); C형 렉틴-유사 분자-1 (CLL-1 또는 CLECL1); CD33; 표피 성장인자 수용체 변이체 Ⅲ (EGFRvⅢ); 갱글리오시드 G2 (GD2); 갱글리오시드 GD3 (aNeu5Ac(2-8)aNeu5Ac(2-3)bDGalp(l-4)bDGlcp(l-l)Cer); TNF 수용체 패밀리 구성원 B 세포 성숙 (BCMA); Tn 항원 ((Tn Ag) 또는 (GalNAcα-Ser/Thr)); 전립선-특이적 막 항원 (PSMA); 수용체 타이로신 키나제-유사 고아 수용체 1 (ROR1); Fms 유사 타이로신 키나제 3 (FLT3); 종양-관련 당당백질 72 (TAG72); CD38; CD44v6; 급성 백혈병 또는 림프종 상에서 발현되지만 조혈 전구세포 상에서는 발현되지 않는 글리코실화된 CD43 에피토프; 비-조혈성 암 상에서 발현된 글리코실화된 CD43 에피토프; 암배아 항원 (CEA); 상피세포 부착 분자 (EPCAM); B7H3 (CD276); KIT (CD117); 인터루킨-13 수용체 소단위체 알파-2 (IL-13Ra2 또는 CD213A2); 메소틸린; 인터루킨 11 수용체 알파 (IL-llRa); 전립선 줄기 세포 항원 (PSCA); 프로테아제 세린 21 (테스티신 또는 PRSS21); 혈관 내피 성장인자 수용체 2 (VEGFR2); 루이스 (Y) 항원; CD24; 혈소판-유래 성장인자 수용체 베타 (PDGFR-베타); 단계-특이적 배아 항원-4 (SSEA-4); CD20; 폴레이트 수용체 알파; 수용체 타이로신-단백질 키나제 ERBB2 (Her2/neu); 세포 표면 연관된 뮤신 1 (MUC1); 상피 성장인자 수용체 (EGFR); 신경 세포 부착 분자 (NCAM); 프로스타제; 전립샘 산 포스파타제 (PAP); 변이된 신장인자 2 (ELF2M); 에프린 B2; 섬유모세포 활성화 단백질 알파 (FAP); 인슐린-유사 성장인자 1 수용체 (IGF-I 수용체); 탄산 무수화제 Ⅸ (CAⅨ); 프로테오좀 (프로좀, 마크로페인) 소단위체 베타형, 9 (LMP2); 당단백질 100 (gpl00); 절단점 클러스터 영역 (BCR)으로 구성된 종양원 유전자 융합 단백질 및 아벨슨 마우스 백혈병 바이러스 종양원 유전자 상동체 1 (Abl) (bcr-abl); 티로시나제; 에프린 A형 수용체 2 (EphA2); 퓨코실 GM1; 시아릴 루이스 부착 분자 (sLe); 갱글리오시드 GM3 (aNeu5Ac(2-3)bDClalp(l-4)bDGlcp(l-1)Cer); 글루타민 전이효소 5 (TGS5); 고분자량 흑색종 관련된 항원 (HMWMAA); o-아세틸-GD2 갱글리오시드 (OAcGD2); 종양 내피 마커 1 (TEM1/CD248); 관련된 종양 내피 마커 7 (TEM7R); 클라우딘 6 (CLDN6); 갑상샘 자극호르몬 수용체 (TSHR); G 단백질 연결된 수용체 클래스 C 그룹 5, 구성원 D (GPRC5D); 염색체 X 오픈 리딩 프레임 61 (CXORF61); CD97; CD179a; 역형성 림프종 키나제 (ALK); 폴리시알산; 태반-특이적 항원 1 (PLAC1); 글로보H 글리코세라미드의 육당질 부분 (글로보H); 유샘 분화 항원 (NY-BR-1); 유로플라킨 2 (UPK2); A형 간염 바이러스 세포 수용체 1 (HAVCR1); 아드레노셉터 베타 3 (ADRB3); 패넥신 3 (PANX3); G 단백질-연결된 수용체 20 (GPR20); 림프구 항원 6 복합체, 좌위 K 9 (LY6K); 후각 수용체 51E2 (OR51E2); TCR 감마 교대 리딩 프레임 단백질 (TARP); 윌름 종양 단백질 (WT1); 암/고환 항원 1 (NY-ES0-1); 암/고환 항원 2 (LAGE-1a); 흑색종-관련 항원 1 (MAGE-A1); 염색체 12p 상에 위치한 ETS 전위 변이체 유전자 6 (ETV6-AML); 정자 단백질 17 (SPA17); X 항원 패밀리, 구성원 lA (XAGEl); 안지오포이에틴-결합 세포 표면 수용체 2 (타이 2); 흑색종 암 고환 항원-1 (MAD-CT-1); 흑색종 암 고환 항원-2 (MAD-CT-2); Fos-관련된 항원 1; 종양 단백질 p53 (p53); p53 돌연변이체; 프로스테인; 서바이빈; 텔로머라제; 전립선 암종 종양 항원-1 (PCT A-1 또는 갈렉틴 8); T 세포에 의해 인식되는 흑색종 항원 1 (MelanA 또는 MARTI); 래트 육종 (Ras) 돌연변이체; 인간 텔로머라제 역전사효소 (hTERT); 육종 전위 절단점; 흑색종의 세포사멸 저해제 (ML-IAP); ERG (막통과 프로테아제, 세린 2 (TMPRSS2) ETS 융합 유전자); N-아세틸 글루코사미닐-전이효소 V (NA17); 쌍 형성된 박스 단백질 Pax-3 (PAX3); 안드로겐 수용체; 사이클린 Bl; v-myc 조류 백혈병 바이러스 종양원 유전자 신경모세포종 유래된 상동체 (MYCN); Ras 상동체 패밀리 구성원 C (RhoC); 티로시나제-관련 단백질 2 (TRP-2); 사이토크롬 P450 lB 1 (CYPlB 1); CCCTC-결합 인자 (아연 핑거 단백질)-유사 (BORIS 또는 각인 부위의 조절인자의 형제), T 세포에 의해 인식되는 편평세포 암종 항원 3 (SART3); 쌍 형성된 박스 단백질 Pax-5 (PAX5); 프로아크로신 결합 단백질 sp32 (OY-TESl); 림프구-특이적 단백질 타이로신 키나제 (LCK); 키나제 고정 단백질 4 (AKAP-4); 활액 육종 X 절단점 2 (SSX2); 진행된 당화 말단 산물의 수용체 (RAGE-1); 신장 유비퀴터스 1 (RUl); 신장 유비퀴터스 2 (RU2); 레구마인; 인간 파필로마 바이러스 E6 (HPV E6); 인간 파필로마 바이러스 E7 (HPV E7); 장내 카르복실 에스테라제; 변이된 열 충격 단백질 70-2 (hsp70-2); CD79a; CD79b; CD72; 백혈구-관련된 면역글로불린-유사 수용체 1 (LAIRl); IgA 수용체의 Fc 단편 (FCAR 또는 CD89); 백혈구 면역글로불린-유사 수용체 서브패밀리 A 구성원 2 (LILRA2); CD300 분자-유사 패밀리 구성원 f (CD300LF); C형 렉틴 도메인 패밀리 12 구성원 A (CLEC12A); 골수 간질 세포 항원 2 (BST2); EGF-유사 모듈-포함 뮤신-유사 호르몬 수용체-유사 항원 2 (EMR2); 림프구 항원 75 (LY75); 글리피칸-3 (GPC3); Fc 수용체-유사 5 (FCRL5); 면역글로불린 람다-유사 폴리펩티드 1 (IGLLl); MPL; 바이오틴; c-MYC 에피토프 태그; CD34; LAMP1; TROP2;, GFRα4; CDH17; CDH6; NYBR1; CDH19; CD200R; Slea (CA19.9; 시아릴 루이스 항원); 퓨코실-GM1; PTK7; gpNMB; CDH1-CD324; DLL3; CD276/B7H3; IL-11Ra; IL-13Ra2; CD179b-IGLl1; ALK TCRγ-δ; NKG2D; CD32 (FCGR2A); Tn ag; CSPG4-HMW-MAA; Tim1-/HVCR1; CSF2RA (GM-CSFR-알파); TGFβR2; VEGFR2/KDR; 루이스 항원; TCR-β1 사슬; TCR-β2 사슬, TCR-γ 사슬, TCR-δ 사슬; FITC; 황체형성 호르몬 수용체 (LHR); 난포 자극 호르몬 수용체 (FSHR); 융모생식샘 자극호르몬 수용체 (CGHR); CCR4; GD3; SLAMF6; SLAMF4; HIV1 외투 당단백질; HTLV1-Tax; CMV pp65; EBV-EBNA3c; 인플루엔자 A 헤마글루티닌 (HA); GAD; PDL1; 구아니릴 사이클라제 C (GCC); KSHV-K8.1 단백질; KSHV-gH 단백질; 데스모글레인 3 (Dsg3)에 대한 자가항체; 데스모글레인 1 (Dsg1)에 대한 자가항체; HLA, HLA-A, HLA-A2, HLA-B, HLA-C, HLA-DP, HLA-DM, HLA-DOA, HLA-DOB, HLA-DQ, HLA-DR, HLA-G; IGE; CD99; RAS; G12V; 조직 인자 1 (TF1); AFP; GPRC5D; 클라우딘18.2 (CLD18A2 또는 CLDN18A.2)); P-당단백질; STEAP1; LIV1; 넥틴-4; CRIPTO; GPA33; BST1/CD157; 저전도도 염화물 통로; 및 TNT 항체에 의해 인식되는 항원:으로 이루어진 군으로부터 선택되고,
(ii) 상기 SIR 분자의 항원 결합 도메인은 상기 항원 결합 도메인이 유래한 항체보다 적어도 5배 낮은 결합 친화도를 갖는, 방법. - 제 178항 내지 제 180항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 질환 관련 항원의 발현과 연관된 질환은 증식성 질환, 전암성 병태, 암 및 상기 질환 관련 항원의 발현과 연관된 비-암 관련 적응증으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 용도 또는 방법. - 제 181항에 있어서,
상기 암은 만성 림프구 백혈병 (CLL), 급성 백혈병, 급성 림프성 백혈병 (ALL), B 세포 급성 림프성 백혈성 (B-ALL), T 세포 급성 림프성 백혈성 (T-ALL), 만성 골수성 백혈병 (CML), B 세포 전구림프구 백혈병, 혈장모세포성 가지세포 신생물, 버킷 림프종, 확산성 대형 B 세포 림프종, 일차 삼출 림프종, 난포성 림프종, 털세포 백혈병, 소세포 또는 대세포 난포성 림프종, 악성 림프증식성 병태, MALT 림프종, 외투 세포 림프종, 경계 영역 림프종, 다발성 골수종, 골수이형성증 및 골수이형성 증후군, 비-호지킨 림프종, 호지킨 림프종, 혈장모세포 림프종, 혈장모양 가지세포 신생물, 왈덴스트롬 거대글로불린혈증 또는 전-백혈병으로부터 선택된 혈액학적 암인, 용도 또는 방법. - 제 181항에 있어서,
상기 암은 결장암, 직장암, 신장세포 암종, 간암, 폐의 비-소세포 암종, 소장의 암, 식도의 암, 흑색종, 골암, 췌장암, 피부암, 두경부의 암, 피부 또는 안구내 악성 흑색종, 자궁암, 난소암, 직장암, 항문 부위의 암, 위암, 고환암, 자궁암, 나팔관의 암종, 자궁내막의 암종, 자궁경부의 암종, 질의 암종, 외음의 암종, 호지킨병, 비-호지킨 림프종, 내분비계의 암, 갑상샘의 암, 부갑상샘의 암, 부신샘의 암, 연조직의 육종, 요도의 암, 음경의 암, 아동의 고형암, 방광의 암, 신장 또는 요관의 암, 신우의 암종, 중추신경계 (CNS)의 신생물, 일차 CNS 림프종, 종양 혈관생성, 척수 종양, 뇌줄기 교아종, 뇌하수체 샘암종, 카포시 육종, 메르켈 세포암, 표피성 암, 편평세포암, T 세포 림프종, 환경적으로 유도된 암, 상기 암의 조합 및 상기 암의 전이성 병변으로 이루어진 군으로 선택되는, 용도 또는 방법. - 제 183항에 있어서,
상기 질환은 이에 제한되는 것은 아니지만, HIV1, HIV2, HTLV1, 엡스타인 바 바이러스 (EBV), 사이토메갈로바이러스 (CMV), 아데노바이러스, 아데노-관련 바이러스, BK 바이러스, 인간 헤르페스 바이러스 6, 인간 헤르페스 바이러스 8, 인플루엔자 바이러스, 파라인플루엔자 바이러스, 조류 플루 바이러스, MERS 및 SARS 코로나 바이러스, 크리미아 콩고 출혈열 바이러스, 리노 바이러스, 엔테로바이러스, 뎅기 바이러스, 웨스트 나일 바이러스, 에볼라 바이러스, 마르버그 바이러스, 라사 열 바이러스, 지카 바이러스, RSV, 홍역 바이러스, 유행성 이하선염 바이러스, 리노 바이러스, 배리셀라 바이러스, 헤르페스 심플렉스 바이러스 1 및 2, 배리셀라 조스터 바이러스, HIV-1, HTLV1, 간염 바이러스, 엔테로바이러스, B형 간염 바이러스, C형 간염 바이러스, 니파 및 리프트 계곡 열 바이러스, 일본 뇌염 바이러스, 메르켈 세포 폴리오마 바이러스를 포함하는 바이러스에 의한 감염과 연관되거나, 마이코박테리움 튜버쿨로시스, 비전형적 마이코박테리아 종, 뉴모시스티스 지로벡시, 톡소플라스마, 리케챠, 노카르디아, 아스퍼질러스, 뮤코르 또는 칸디다에 의한 감염과 연관되는, 용도 또는 방법. - 제 183항에 있어서,
상기 질환은 이에 제한되는 것은 아니지만, 당뇨병, 다발성 골수종, 류마티스 관절염, 보통 천포창, 강직 척추염, 하시모토 갑상샘염, SLE, 사코이드증, 피부 경화증, 혼합된 연결조직 질환, 이식편대숙주병 또는 알츠하이머병을 포함하는 면역 또는 퇴화성 질환인, 용도 또는 방법. - 제 178항 내지 제 180항 또는 제 182항 내지 제 184항 중 어느 한 항에 있어서,
(i) 단백질 포스파타제 저해제는 SHP-1 저해제 및/또는 SHP-2 저해제이고/거나;
(ii) 키나제 저해제는 CDK4 저해제, CDK4/6 저해제, mTOR 저해제, MNK 저해제 또는 이중 P13K/mTOR 저해제 중 하나 이상으로부터 선택되고/거나;
(iii) 면역 억제성 분자를 억제하는 제제는 항체 또는 항체 단편, 억제성 핵산, 클러스터된 규칙적으로 상호이격된 짧은 팰린드롬 반복서열 (CRISPR), 전사-활성화인자 유사 효과기 핵산 분해효소 (TALEN) 또는 억제성 분자의 발현을 억제하는 아연 핑거 엔도뉴클레아제 (ZFN)를 포함하고/거나;
(iv) T REG 세포의 수준 또는 활성을 감소시키는 제제는 사이클로포스파미드, 항-GITR 항체, CD25-고갈 또는 이들의 조합으로부터 선택되고/거나;
(v) Brd4 저해제는 JQ1, MS417, OTXO15, LY 303511 및 미국 특허 US 20140256706 A1에 기술된 바와 같은 Brd4 저해제 또는 이들의 유도체로부터 선택되는, 용도 또는 방법. - 제 178항 내지 제 180항 또는 제 182항 내지 제 184항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 면역 억제성 분자는 PD1, PD-L1, CTLA-4, TIM-3, LAG-3, VISTA, BTLA, TIGIT, LAIR1, CD160, 2B4, TGFRβ, CEACAM-1, CEACAM-3 및 CEACAM-5로 이루어진 군으로부터 선택되는, 용도 또는 방법. - 제 178항 내지 제 180항 또는 제 182항 내지 제 184항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 억제성 분자를 억제하는 제제는 억제성 분자 및 이의 단편을 포함하는 제 1 폴리펩티드 및 상기 세포에 양성 신호를 제공하는 제 2 폴리펩티드를 포함하고, 상기 제 1 및 제 2 폴리펩티드는 상기 SIR-포함 면역 세포 상에서 발현되고, (i) 상기 제 1 폴리펩티드는 PD1, PD-L1, CTLA-4, TIM-3, LAG-3, VISTA, BTLA, TIGIT, LAIR1, CD160, 2B4, TGFRβ, CEACAM-1, CEACAM-3 및 CEACAM-5을 포함하고/거나; (ii) 상기 제 2 폴리펩티드는 일차 신호전달 도메인 및/또는 보조자극 신호전달 도메인을 포함하는 세포내 신호전달 도메인을 포함하는, 용도 또는 방법. - 제 188항에 있어서,
상기 일차 신호전달 도메인은 CD3 제타의 기능적 도메인을 포함하고/거나; 상기 보조자극 신호전달 도메인은 41BB, CD27 및 CD28로부터 선택된 단백질의 기능적 도메인을 포함하는, 용도 또는 방법. - 제 178항 내지 제 180항 또는 제 182항 내지 제 184항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 사이토카인은 IL-15 또는 IL-21 또는 둘 다로부터 선택되는, 용도 또는 방법. - 제 178항 내지 제 180항 또는 제 182항 내지 제 184항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 SIR 분자를 포함하는 면역 효과기 세포 및 상기 면역 효과기 세포의 효능을 증가시키는 제제는 실질적으로 동시적으로 또는 연속적으로 투여되는, 용도 또는 방법. - 제 191항에 있어서,
상기 SIR 분자를 포함하는 면역 세포는 GITR을 표적하고/거나 GITR 기능을 조정하는 분자와 조합하여 투여되는, 용도 또는 방법. - 제 192항에 있어서,
상기 GITR을 표적하고/거나 GITR 기능을 조정하는 분자는 상기 SIR 발현하는 세포 또는 세포의 집단 이전에 또는 성분채집술 이전에 투여되는, 용도 또는 방법. - 제 178항 내지 제 180항 또는 제 182항 내지 제 184항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 피험자는 인간인, 용도 또는 방법. - 제 1항의 폴리펩티드 중 적어도 하나, 제 111항의 SIR 폴리펩티드 분자, 제 104항의 벡터 또는 제 152항 또는 제 153항의 세포 및 약제학적으로 허용가능한 부형제를 포함하는 조성물.
- 제 1항의 폴리펩티드 중 적어도 하나, 제 111항의 SIR 폴리펩티드 분자, 제 104항의 벡터 또는 제 152항 또는 제 153항의 세포 및/또는 제 144항의 조성물을 포함하는 키트.
- 합성 면역 수용체를 인코딩하는 재조합 폴리뉴클레오티드로서, 서열번호 900 내지 2264, 서열번호 4531 내지 6013, 서열번호 7519 내지 8160, 서열번호 8803 내지 9230, 서열번호 9659 내지 9856, 서열번호 10474 내지 12041, 서열번호 15786 내지 16011, 서열번호 16240 내지 16465, 서열번호 16694 내지 16926, 서열번호 17162 내지 서열번호 17394, 서열번호 17864 내지 17979, 서열번호 18321 내지 18322, 서열번호 18242 내지 18259, 서열번호 18280 내지 18588, 서열번호 18899, 서열번호 18915 내지 18916 및 서열번호 19248 내지 19246로 이루어진 군으로부터 선택된 서열, 또는 합성 면역 수용체를 인코딩하는 서열번호 900 내지 2264, 서열번호 4531 내지 6013, 서열번호 7519 내지 8160, 서열번호 8803 내지 9230, 서열번호 9659 내지 9856, 서열번호 10474 내지 12041, 서열번호 15786 내지 16011, 서열번호 16240 내지 16465, 서열번호 16694 내지 16926, 서열번호 17162 내지 서열번호 17394, 서열번호 17864 내지 17979, 서열번호 18321 내지 18322, 서열번호 18242 내지 18259, 서열번호 18280 내지 18588, 서열번호 18899, 서열번호 18915 내지 18916 및 서열번호 19248 내지 19246 중 어느 하나에 나타낸 뉴클레오티드 서열과 적어도 75% 동일성을 갖는 서열을 포함하는, 재조합 폴리뉴클레오티드.
- 합성 면역 수용체 폴리펩티드를 인코딩하는 아미노산 서열로서, 서열번호 3135 내지 4498, 서열번호 6044 내지 7518, 서열번호 8161 내지 8802, 서열번호 9231 내지 9658, 서열번호 9873 내지 10070, 서열번호 12431 내지 13998, 서열번호 16013 내지 16238, 서열번호 16467 내지 16692, 서열번호 16928 내지 17160, 서열번호 17396 내지 17628, 서열번호 17981 내지 18096, 서열번호 18239 내지 18240, 서열번호 18261 내지 18278, 서열번호 18590 내지 18898, 서열번호 18900, 서열번호18919 내지 18920 및 서열번호 19248 내지 19246, 또는 합성 면역 수용체 폴리펩티드를 인코딩하는 서열번호 3135 내지 4498, 서열번호 6044 내지 7518, 서열번호 8161 내지 8802, 서열번호 9231 내지 9658, 서열번호 9873 내지 10070, 서열번호 12431 내지 13998, 서열번호 16013 내지 16238, 서열번호 16467 내지 16692, 서열번호 16928 내지 17160, 서열번호 17396 내지 17628, 서열번호 17981 내지 18096, 서열번호 18239 내지 18240, 서열번호 18261 내지 18278, 서열번호 18590 내지 18898, 서열번호 18900, 서열번호 18919 내지 18920 및 서열번호 19248 내지 19246 중 어느 하나에 나타낸 아미노산 서열과 적어도 75% 동일성을 갖는 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는, 아미노산 서열.
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