TW202042824A

TW202042824A - Tn-MUC1嵌合抗原受體（CAR）T細胞療法

Info

Publication number: TW202042824A
Application number: TW109110245A
Authority: TW
Inventors: 艾弗里波西; 卡爾Ｈ俊恩
Original assignee: 賓夕法尼亞大學董事會
Priority date: 2019-03-27
Filing date: 2020-03-26
Publication date: 2020-12-01
Also published as: EP3947471A1; WO2020198413A1; EP3947471A4; CN113661180A; JP2022527297A; US11090336B2; US20200306304A1; US20210338733A1

Abstract

本發明提供各種TnMUC1特異性嵌合抗原受體（CAR），編碼其之核酸及其使用方法，並提供用於在所需受試者中治療MUC1相關性癌症之含TnMUC1特異性CAR的組成物及方法。

Description

Tn-MUC1嵌合抗原受體（CAR）T細胞療法

本申請案依據35 U.S.C. § 119（e）主張美國臨時申請案第62/824,532號（2019年3月27日申請）及美國臨時申請案第62/881,269號（2019年7月31日申請）之優先權，本文藉由引用將其整體併入。

本發明係關於Tn-MUC1嵌合抗原受體（CAR）T細胞療法。

嵌合抗原受體（chimeric antigen receptor，CAR）T細胞為效應免疫細胞，其係經遺傳修飾以識別特定腫瘤相關抗原並隨後殺滅腫瘤細胞。儘管CAR T療法的成功已導致批准用於血液系統的惡性腫瘤，但CAR T療法在例如乳癌之實質固態瘤（solid tumor）治療中的有效性仍不確定。在實質固態瘤中，CAR T療法存在許多障礙，最重要的是，大多數由腫瘤表現的已鑑定及研究最深入的細胞表面抗原亦由正常組織表現，從而導致CAR T細胞的非特異性靶向（靶向，非腫瘤活性）。其次，基本上固態瘤具有一般的免疫抑制性腫瘤微環境，一旦細胞到達腫瘤並識別出抗原，其可抑制CAR T細胞的活性。第三，抗腫瘤反應的持續性與授受性轉移（adoptively-transferred）細胞的持續性高度相關，而實質固態瘤中CAR T細胞的最佳持續性尚未與造血系統惡性腫瘤中所觀察到的持續性匹配。

在持續將CAR T細胞療法應用於基本固態瘤中，鑑定腫瘤腫瘤抗原至關重要，對於治療例如乳癌之實質固態瘤的新穎組成物及方法有所需求，而本發明滿足了此需求。

黏液蛋白1（Mucin 1，MUC1）為一腫細胞表面黏液蛋白，其通常會連續添加多醣以形成高醣基化蛋白質（圖1），O-醣基化過程始於在絲胺酸和蘇胺酸殘基上添加GalNAc。延伸開始於藉由Core 1合成酶（由C1GalT1及其伴護蛋白（chaperone）C1GalT1C1（Cosmc）組成）添加半乳糖或藉由Core 3合成酶（B3GNT6）添加GlcNAc。在此系列醣基化中的畸變（例如Cosmc的表觀遺傳緘默化）會產生低度醣基化產物Tn-MUC1，於其中藉由（ST6GALNAC-1）會加入唾液酸以形成STn-MUC1。

本揭示基於以下發現：針對Tn-MUC1的CAR T細胞在活體外顯示出對各種癌細胞株的有效細胞裂解活性，並在活體內顯著消除腫瘤。一方面，提供一種經修飾之免疫細胞或其前驅細胞，包含特異性地結合MUC1之特異性嵌合抗原受體（CAR），其中CAR包含：包含重鏈可變（VH）域及輕鏈可變（VL）域之MUC1-特異性抗原結合域，其中VH域包含SEQ ID NO：22、23及24所述之重鏈互補性決定區（complementarity determining region，CDR）序列，且其中VL域包含SEQ ID NO：19、20及21所述之輕鏈互補性決定區（CDR）序列；跨膜域；共刺激信號傳導域；及細胞內信號傳導域。

在某些例示性實施方式中，MUC1-特異性抗原結合域對於MUC1之醣基表位（glycoepitope）具有特異性。在某些例示性實施方式中，MUC1-特異性抗原結合域對於MUC1之截斷醣基表位（truncated glycoepitope）具有特異性。

在某些例示性實施方式中，VH域包含SEQ ID NO：5所述之胺基酸序列。在某些例示性實施方式中，VL域包含SEQ ID NO：6所述之胺基酸序列。在某些例示性實施方式中，VH域包含SEQ ID NO：5所述之胺基酸序列，且VL域包含SEQ ID NO：6所述之胺基酸序列。在某些例示性實施方式中，MUC1-特異性抗原結合域包含SEQ ID NO：4所述之胺基酸序列。

在某些例示性實施方式中，跨膜域包含選自第1型跨膜蛋白質、T細胞受體之α、β或ζ（zeta）鏈、CD28、CD2、CD3 ε（epsilon）、CD45、CD4、CD5、CD7、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134（OX-40）、CD137（4-1BB）、CD154（CD40L）、CD278（ICOS）、CD357（GITR）、類鐸（Toll-like）受體 1（TLR1）、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8及TLR9所組成群組之蛋白質跨膜區。在某些例示性實施方式中，跨膜域包含CD8跨膜區。在某些例示性實施方式中，跨膜域包含SEQ ID NO：7所述之胺基酸序列。

在某些例示性實施方式中，共刺激信號傳導域包含選自TNFR超家族成員、CD27、CD28、4-1BB（CD137）、OX40（CD134）、CD30、CD40、PD-1、ICOS、淋巴細胞功能相關抗原-1（LFA-1）、CD2、CD5、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、特異性結合CD83之配體、DAP10、DAP12、Lck、Fas及其等之任何衍生物或變體所組成群組之蛋白質之共刺激域。在某些例示性實施方式中，共刺激信號傳導域為CD2共刺激信號傳導域。在某些例示性實施方式中，共刺激信號傳導域包含SEQ ID NO：28所述之胺基酸序列。

在某些例示性實施方式中，細胞內信號傳導域包含選自CD3 ζ、FcyRIII、FcsRI、Fc受體之細胞質尾（cytoplasmic tail）、帶有細胞質受體之免疫受體酪胺酸系活化基序（immunoreceptor tyrosine-based activation motif，ITAM）、TCR ζ、FcR γ（gamma）、FcR β、CD3 γ、CD3 δ（delta）、CD3 ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b及CD66d所組成群組之蛋白質之信號傳導域。在某些例示性實施方式中，細胞內信號傳導域包含CD3 ζ之信號傳導域。在某些例示性實施方式中，細胞內信號傳導域包含SEQ ID NO：30所述之胺基酸序列。

在某些例示性實施方式中，CAR進一步包含前導子序列。在某些例示性實施方式中，前導子（leader）序列為CD8前導子序列。在某些例示性實施方式中，前導子序列包含SEQ ID NO：48所述之胺基酸序列。

在某些例示性實施方式中，CAR進一步包含鉸鏈域。在某些例示性實施方式中，鉸鏈域來自選自抗體之Fc片段、抗體之鉸鏈區、抗體之CH2區、抗體之CH3區、人工間隔子序列、含CD8胺基酸序列之鉸鏈及其等之任何組合所組成群組之蛋白質。在某些例示性實施方式中，鉸鏈域為CD8鉸鏈域。在某些例示性實施方式中，鉸鏈域包含SEQ ID NO:13所述之胺基酸序列。

在某些例示性實施方式中，經修飾之細胞為經修飾之天然殺手（NK）細胞、經修飾之天然殺手T（NKT）細胞或經修飾之T細胞。在某些例示性實施方式中，經修飾之免疫細胞為經修飾之T細胞。在某些例示性實施方式中，經修飾之免疫細胞是自體的。

另一方面，提供一種包含特異性結合MUC1之嵌合抗原受體（CAR）的經修飾之T細胞，其中CAR包含：MUC1-特異性抗原結合域，包含重鏈可變（VH）域及輕鏈可變（VL）域，其中VH域包含SEQ ID NO：22、23及24所述之重鏈互補性決定區（CDR）序列，且其中VL域包含SEQ ID NO：19、20及21所述之輕鏈互補性決定區（CDR）序列；鉸鏈域；跨膜域；CD2共刺激信號傳導域；及細胞內信號傳導域。

另一方面，提供一種特異性結合MUC1之嵌合抗原受體（CAR）的經修飾之T細胞，其中CAR包含：MUC1-特異性抗原結合域，包含重鏈可變（VH）域及輕鏈可變（VL）域，其中VH域包含SEQ ID NO：22、23及24所述之重鏈互補性決定區（CDR）序列，且其中VL域包含SEQ ID NO：19、20及21所述之輕鏈互補性決定區（CDR）序列；鉸鏈域；跨膜域；CD2共刺激信號傳導域，包含SEQ ID NO：28所述之胺基酸序列；及細胞內信號傳導域。

另一方面，提供一種含特異性結合MUC1之嵌合抗原受體（CAR）的經修飾之T細胞，其中CAR包含：MUC1-特異性抗原結合域，包含重鏈可變（VH）域及輕鏈可變（VL）域，其中VH域包含SEQ ID NO：22、23及24所述之重鏈互補性決定區（CDR）序列，且其中VL域包含SEQ ID NO：19、20及21所述之輕鏈互補性決定區（CDR）序列；CD8鉸鏈域；CD8跨膜域；CD2共刺激信號傳導域，包含SEQ ID NO：28所述之胺基酸序列；及CD3 ζ細胞內信號傳導域。

另一方面，提供一種含特異性結合MUC1之嵌合抗原受體（CAR）的經修飾之T細胞，其包含SEQ ID NO：2、39、41、43、45或47所述之胺基酸序列。

另一方面，提供一種編碼嵌合抗原受體之經分離之核酸序列，該嵌合抗原受體包含：含重鏈可變（VH）域及輕鏈可變（VL）域之MUC1-特異性抗原結合域，其中VH域包含SEQ ID NO：22、23及24所述之重鏈互補性決定區（CDR）序列，且其中VL域包含SEQ ID NO：19、20及21所述之輕鏈互補性決定區（CDR）序列；跨膜域；共刺激信號傳導域；及細胞內信號傳導域。

在某些例示性實施方式中，MUC1-特異性抗原結合域對於MUC1之醣基表位具有特異性。在某些例示性實施方式中，MUC1-特異性抗原結合域對於MUC1之截斷醣基表位具有特異性。

在某些例示性實施方式中，MUC1-特異性抗原結合域係經由含SEQ ID NO：3所述之核苷酸序列的核酸序列編碼。

在某些例示性實施方式中，跨膜域包含選自第1型跨膜蛋白質、T細胞受體之α、β或ζ鏈、CD28、CD2、CD3 ε、CD45、CD4、CD5、CD7、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134（OX-40）、CD137（4-1BB）、CD154（CD40L）、CD278（ICOS）、CD357（GITR）、類鐸受體1（TLR1）、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8及TLR9所組成群組之蛋白質跨膜區。在某些例示性實施方式中，跨膜域包含CD8跨膜區。在某些例示性實施方式中，跨膜域係經由含SEQ ID NO：8所述之核苷酸序列的核酸序列編碼。

在某些例示性實施方式中，共刺激信號傳導域包含選自TNFR超家族成員、CD27、CD28、4-1BB（CD137）、OX40（CD134）、CD30、CD40、PD-1、ICOS、淋巴細胞功能相關抗原-1（LFA-1）、CD2、CD5、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、特異性結合CD83之配體、DAP10、DAP12、Lck、Fas及其等之任何衍生物或變體所組成群組之蛋白質之共刺激域。在某些例示性實施方式中，共刺激信號傳導域為CD2共刺激信號傳導域。在某些例示性實施方式中，共刺激信號傳導域包含SEQ ID NO：28所述之胺基酸序列。在某些例示性實施方式中，共刺激信號傳導域係經由含SEQ ID NO：29所述之核苷酸序列的核酸序列編碼。

在某些例示性實施方式中，細胞內信號傳導域包含CD3 ζ信號傳導域。在某些例示性實施方式中，細胞內信號傳導域係經由含SEQ ID NO：31所述之核苷酸序列的核酸序列編碼。

在某些例示性實施方式中，CAR進一步包含CD8前導子序列。在某些例示性實施方式中，前導子序列包含SEQ ID NO：48所述之胺基酸序列。

在某些例示性實施方式中，CAR進一步包含CD8鉸鏈域。在某些例示性實施方式中，鉸鏈域係經由含SEQ ID NO：14所述之核苷酸序列的核酸序列編碼。

另一方面，提供一種編碼嵌合抗原受體之經分離之核酸序列，該嵌合抗原受體包含：含重鏈可變（VH）域及輕鏈可變（VL）域之MUC1-特異性抗原結合域，其中VH域包含SEQ ID NO：22、23及24所述之重鏈互補性決定區（CDR）序列，且其中VL域包含SEQ ID NO：19、20及21所述之輕鏈互補性決定區（CDR）序列；鉸鏈域；跨膜域；CD2共刺激信號傳導域；及細胞內信號傳導域。

另一方面，提供一種編碼嵌合抗原受體之經分離之核酸序列，該嵌合抗原受體包含：含重鏈可變（VH）域及輕鏈可變（VL）域之MUC1-特異性抗原結合域，其中VH域包含SEQ ID NO：22、23及24所述之重鏈互補性決定區（CDR）序列，且其中VL域包含SEQ ID NO：19、20及21所述之輕鏈互補性決定區（CDR）序列；鉸鏈域；跨膜域；CD2共刺激信號傳導域，包含含SEQ ID NO：29所述之核苷酸序列的核酸序列；及細胞內信號傳導域。

另一方面，提供一種編碼嵌合抗原受體之經分離之核酸序列，該嵌合抗原受體包含：含重鏈可變（VH）域及輕鏈可變（VL）域之MUC1-特異性抗原結合域，其中VH域包含SEQ ID NO：22、23及24所述之重鏈互補性決定區（CDR）序列，且其中VL域包含SEQ ID NO：19、20及21所述之輕鏈互補性決定區（CDR）序列；CD8鉸鏈域；CD8跨膜域；CD2共刺激信號傳導域，包含含SEQ ID NO：29所述之核苷酸序列的核酸序列；及CD3 ζ細胞內信號傳導域。

另一方面，提供一種編碼嵌合抗原受體之經分離之核酸序列，該嵌合抗原受體包含含SEQ ID NO：1、38、40、42、44或46所述之核苷酸序列的核酸序列。

另一方面，提供一種編碼ICOS共刺激信號傳導域之經分離之核酸序列，該ICOS共刺激信號傳導域包含SEQ ID NO：27所述之核苷酸序列。

另一方面，提供一種特異性結合MUC1之嵌合抗原受體（CAR），該MUC1係經由任一前述實施方式之核酸編碼。

另一方面，提供一種特異性結合MUC1之嵌合抗原受體（CAR），包含：含重鏈可變（VH）域及輕鏈可變（VL）域之MUC1-特異性抗原結合域，其中VH域包含SEQ ID NO：22、23及24所述之重鏈互補性決定區（CDR）序列，且其中VL域包含SEQ ID NO：19、20及21所述之輕鏈互補性決定區（CDR）序列；鉸鏈域；跨膜域；共刺激信號傳導域；及細胞內信號傳導域。

另一方面，提供一種特異性結合MUC1之嵌合抗原受體（CAR），包含：含重鏈可變（VH）域及輕鏈可變（VL）域之MUC1-特異性抗原結合域，其中VH域包含SEQ ID NO：22、23及24所述之重鏈互補性決定區（CDR）序列，且其中VL域包含SEQ ID NO：19、20及21所述之輕鏈互補性決定區（CDR）序列；鉸鏈域；跨膜域；包含SEQ ID NO：28所述之胺基酸序列的CD2共刺激信號傳導域；及細胞內信號傳導域。

另一方面，提供一種特異性結合MUC1之嵌合抗原受體（CAR），包含：含重鏈可變（VH）域及輕鏈可變（VL）域之MUC1-特異性抗原結合域，其中VH域包含SEQ ID NO：22、23及24所述之重鏈互補性決定區（CDR）序列，且其中VL域包含SEQ ID NO：19、20及21所述之輕鏈互補性決定區（CDR）序列；CD8鉸鏈域；CD8跨膜域；含SEQ ID NO：28所述之胺基酸序列的CD2共刺激信號傳導域；及CD3 ζ細胞內信號傳導域。

另一方面，提供一種特異性結合MUC1之嵌合抗原受體（CAR），該MUC1包含SEQ ID NO：47所述之胺基酸序列。

另一方面，提供一種表現構建體（expression construct），其包含任一前述實施方式的經分離之核酸。在某些例示性實施方式中，表現構建體進一步包含EF-1α啟動子。在某些例示性實施方式中，表現構建體進一步包含rev反應元件（rev response element，RRE）。在某些例示性實施方式中，表現構建體進一步包含土撥鼠肝炎病毒轉錄後調節元件（woodchuck hepatitis virus posttranscriptional regulatory element，WPRE）。在某些例示性實施方式中，表現構建體進一步包含cPPT序列。在某些例示性實施方式中，表現構建體進一步包含EF-1α啟動子、rev反應元件（RRE）、土撥鼠肝炎病毒轉錄後調節元件（WPRE）及cPPT序列。

在某些例示性實施方式中，表現構建體為病毒載體，選自反轉錄病毒載體、慢病毒載體、腺病毒載體及腺相關病毒載體所組成之群組。在某些例示性實施方式中，表現構建體為慢病毒載體。在某些例示性實施方式中，表現構建體為自我滅活慢病毒載體。

另一方面，提供一種用於產生任一前述實施方式之經修飾之免疫細胞或其前驅細胞的方法，包含將任一前述實施方式之經分離核酸或任一前述實施方式之表現構建體引入免疫細胞或其前驅細胞。

另一方面，提供一種在所需受試者中治療MUC1相關癌症的方法，包含投予該受試者治療有效的含任一前述實施方式之經修飾之免疫細胞的組成物。

在某些例示性實施方式中，MUC1相關癌症係選自多發性骨髓瘤、非小細胞肺癌、乳癌、胰腺癌與卵巢及輸卵管癌所組成之群組。

在某些例示性實施方式中，MUC1相關癌症為乳癌。在某些例示性實施方式中，乳癌之特徵為MUC1之異常醣基化。在某些例示性實施方式中，乳癌係選自激素受體陽性乳癌、激素受體陰性乳癌、雌激素受體陰性乳癌、助孕酮受體陰性乳癌及Her2受體陰性乳癌所組成之群組。在某些例示性實施方式中，乳癌為轉移性乳癌。在某些例示性實施方式中，乳癌為為三陰性乳癌。

另一方面，提供一種在所需受試者中治療MUC1相關癌症的方法，包含：投予該受試者治療有效之含經修飾之T細胞的組成物，該經修飾之T細胞包含：含重鏈可變（VH）域及輕鏈可變（VL）域之MUC1-特異性抗原結合域，其中VH域包含SEQ ID NO：22、23及24所述之重鏈互補性決定區（CDR）序列，且其中VL域包含SEQ ID NO：19、20及21所述之輕鏈互補性決定區（CDR）序列；可選擇地鉸鏈域；跨膜域；共刺激信號傳導域；及細胞內信號傳導域。

另一方面，提供一種在所需受試者中治療MUC1相關多發性骨髓瘤的方法，包含：投予該受試者治療有效之含經修飾之T細胞的組成物，該經修飾之T細胞包含：含重鏈可變（VH）域及輕鏈可變（VL）域之MUC1-特異性抗原結合域，其中VH域包含SEQ ID NO：22、23及24所述之重鏈互補性決定區（CDR）序列，且其中VL域包含SEQ ID NO：19、20及21所述之輕鏈互補性決定區（CDR）序列；可選擇地鉸鏈域；跨膜域；共刺激信號傳導域；及細胞內信號傳導域。

另一方面，提供一種在所需受試者中治療MUC1相關非小細胞肺癌的方法，包含：投予該受試者治療有效之含經修飾之T細胞的組成物，該經修飾之T細胞包含：含重鏈可變（VH）域及輕鏈可變（VL）域之MUC1-特異性抗原結合域，其中VH域包含SEQ ID NO：22、23及24所述之重鏈互補性決定區（CDR）序列，且其中VL域包含SEQ ID NO：19、20及21所述之輕鏈互補性決定區（CDR）序列；可選擇地鉸鏈域；跨膜域；共刺激信號傳導域；及細胞內信號傳導域。

另一方面，提供一種在所需受試者中治療MUC1相關三陰性乳癌的方法，包含：投予該受試者治療有效之含經修飾之T細胞的組成物，該經修飾之T細胞包含：含重鏈可變（VH）域及輕鏈可變（VL）域之MUC1-特異性抗原結合域，其中VH域包含SEQ ID NO：22、23及24所述之重鏈互補性決定區（CDR）序列，且其中VL域包含SEQ ID NO：19、20及21所述之輕鏈互補性決定區（CDR）序列；可選擇地鉸鏈域；跨膜域；共刺激信號傳導域；及細胞內信號傳導域。

另一方面，提供一種在所需受試者中治療MUC1相關胰腺癌的方法，包含：投予該受試者治療有效之含經修飾之T細胞的組成物，該經修飾之T細胞包含：含重鏈可變（VH）域及輕鏈可變（VL）域之MUC1-特異性抗原結合域，其中VH域包含SEQ ID NO：22、23及24所述之重鏈互補性決定區（CDR）序列，且其中VL域包含SEQ ID NO：19、20及21所述之輕鏈互補性決定區（CDR）序列；可選擇地鉸鏈域；跨膜域；共刺激信號傳導域；及細胞內信號傳導域。

另一方面，提供一種在所需受試者中治療MUC1相關卵巢及輸卵管癌的方法，包含：投予該受試者治療有效之含經修飾之T細胞的組成物，該經修飾之T細胞包含：含重鏈可變（VH）域及輕鏈可變（VL）域之MUC1-特異性抗原結合域，其中VH域包含SEQ ID NO：22、23及24所述之重鏈互補性決定區（CDR）序列，且其中VL域包含SEQ ID NO：19、20及21所述之輕鏈互補性決定區（CDR）序列；可選擇地鉸鏈域；跨膜域；共刺激信號傳導域；及細胞內信號傳導域。

在某些例示性實施方式中，任一前述實施方式之方法進一步包含施予受試者淋巴細胞清除性化療（lymphodepleting chemotherapy）。在某些例示性實施方式中，淋巴細胞清除性化療包含投予受試者治療有效量之環磷醯胺（cyclophosphamide）。在某些例示性實施方式中，淋巴細胞清除性化療包含投予受試者治療有效量之氟達拉濱（fludarabine）。在某些例示性實施方式中，淋巴細胞清除性化療包含投予受試者治療有效量之環磷醯胺及治療有效量之氟達拉濱。

在某些例示性實施方式中，任一前述實施方式之方法進一步包含施予受試者細胞激素釋放症候群（cytokine release syndrome，CRS）管理方案。在某些例示性實施方式中，CRS管理方案包含治療有效量之托珠單抗（tocilizumab）。在某些例示性實施方式中，CRS管理方案包含治療有效量之托珠單抗及/或皮質類固醇。

在某些例示性實施方式中，經修飾之免疫細胞或經修飾之T細胞是自體的。

在某些例示性實施方式中，投予經修飾之免疫細胞或經修飾之T細胞係藉由腫瘤內遞送進行。在某些例示性實施方式中，投予經修飾之免疫細胞或經修飾之T細胞係藉由靜脈內遞送進行。在某些例示性實施方式中，投予經修飾之免疫細胞或經修飾之T細胞係藉由腹膜內遞送進行。

任一前述實施方式的經修飾之免疫細胞或其前驅細胞用於任一前述實施方式之方法。任一前述實施方式的經分離之核酸序列用於任一前述實施方式之方法。任一前述實施方式的嵌合抗原受體用於任一前述實施方式之方法。任一前述實施方式的表現載體用於任一前述實施方式之方法。

定義

除非另有定義，否則所有本文使用的技術和科學術語的涵義通常與本發明所屬技術領域中具有通常知識者所能理解的相同。儘管相似或相等於本文所描述的任何方法和材料都可用於實施本發明的測試，但本文描述較佳的材料和方法。在描述及主張本發明時，將使用以下術語。

亦應理解，本文所使用的術語僅出於描述特定實施方式的目的，而並非旨在進行限制。

本文所使用之冠詞「一」及「一種」係指一個或多於一個（即至少一個）本文的語法對象。舉例而言，「一元件」係指一個元件或多於一個元件。

當涉及例如量、持續時間等可測量值時，如本文所使用之「約」意指包括距離特定值±20%或±10%的變化範圍，更佳為±5%，甚至更佳為±1%，還更佳為±0.1%，如此變化程度是適於進行本文所揭露的方法。

如本文所使用，「活化」係指T細胞狀態已經充分被刺激而誘發出可檢測的細胞增生。活化亦與經誘導之細胞激素產生及可檢測的效用功能有關。術語「經活化之T細胞」除另有所指外，係指正在進行細胞分裂的T細胞。

如本文所使用，術語「減輕」疾病意指降低疾病的一或多種徵狀的嚴重程度。

「同種異體的」係指源自相同物種之不同動物的任何材料。

如本文所使用，術語「抗體」係指與抗原特異性結合的免疫球蛋白分子。抗體可以是衍生自天然來源或來自重組來源的完整免疫球蛋白，且可以是完整免疫球蛋白的免疫反應性部分。抗體通常是免疫球蛋白分子的四聚體。本發明中的抗體可以多種形式存在，包括例如多株抗體、單株抗體、Fv、Fab及F（ab）₂ ，以及單鏈抗體（scFv）及人源化抗體（Harlow et al., 1999, In：Using抗體： A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY；Harlow et al., 1989, In：Antibodies： A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, New York；Houston et al., 1988,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883；Bird et al., 1988,Science 242:423-426）。

術語「抗體片段」係指完整抗體的一部分，並且是指完整抗體的抗原決定可變區。抗體片段的實例包括但不限於Fab、Fab'、F（ab'）2及Fv片段、線性抗體、scFv抗體及由抗體片段形成之多特異性抗體。

如本文所使用，「抗體重鏈」係指在所有抗體分子的天然發生構形中，兩類型多肽鏈中較大者。

如本文所使用，「抗體輕鏈」係指在所有抗體分子的天然發生構形中，兩類型多肽鏈中較小者，α和β輕鏈係指兩種主要的抗體輕鏈同型。

如本文所使用，術語「合成抗體」意指使用重組DNA技術產生的抗體，例如本文所述的由噬菌體所表現的抗體。該術語亦應被解釋為，藉由合成編碼抗體之DNA分子所產生的抗體，且該DNA分子表現抗體蛋白質或指定抗體的胺基酸序列，其中該DNA或胺基酸序列已使用本領域中可獲得且熟知的合成DNA或胺基酸序列技術來獲得。

如本文所使用，術語「抗原」或「Ag」被定義為會引起免疫反應的分子，此種免疫反應可涉及抗體產生或特定具有免疫能力之細胞的活化，或兩者皆有。本領域技術人員將可理解，任何大分子，包括幾乎所有的蛋白質或肽，都可以作為抗原。此外，抗原可以衍生自重組或基因體DNA。本領域技術人員將可理解，任何DNA，包含編碼會引發免疫反應之蛋白質的核苷酸序列或部分核苷酸序列，其係編碼如本文所使用之術語「抗原」。此外，本領域技術人員將可理解，抗原不需要由基因的全長核苷酸序列來獨自編碼。很明顯地，本發明包括但不限於使用多於一個基因的部分核苷酸序列，且這些核苷酸序列係以各種方式進行組合排列，以引起所需的免疫反應。再者，本領域技術人員將可理解抗原不需要由一「基因」所編碼。很明顯地，抗原可以合成方式產生或源自生物樣本。這樣的生物樣本可包括但不限於組織樣本、腫瘤樣本、細胞或生物流體。

如本文所使用，術語「自體的」意指源自同一個體的任何物質，其隨後被重新引入該個體中。

如本文所使用，術語「嵌合抗原受體」或「CAR」係指人工T細胞受體，其係經工程化以表現在免疫效應細胞上，並與特異性結合抗原。CAR可用於授受性細胞轉移療法。從患者體內取出T細胞並進行修飾，因此其表現對抗原的特定形式具有特異性的受體。在一些實施方式中，CAR對選定的標靶具有特異性，例如MUC1。CAR亦可包含胞內活化域、跨膜域及包含抗原結合區的胞外域。

術語「裂解」係指共價鍵的斷裂，例如在核酸分子的主鏈中的共價鍵或肽鍵的水解，裂解可藉由多種方法引發，包括但不限於磷酸二酯鍵的酵素或化學水解。單鏈裂解及雙鏈裂解都是可能的，雙鏈裂解可為兩個不同的單鏈切割事件的結果。DNA裂解可導致產生鈍端或交錯端。在某些實施方式中，融合多肽可用於靶向斷裂的雙鏈DNA。

如本文所使用，術語「保守序列修飾」係指不顯著影響或改變含有胺基酸序列之抗體的結合特性的胺基酸修飾，此類保守修飾包括胺基酸取代、添加及缺失。可藉由本領域已知的標準技術將修飾導入本發明之抗體中，例如定點誘變（site-directed mutagenesis）及PCR介導誘變（PCR-mediated mutagenesis）。保守的胺基酸取代是一種其中胺基酸殘基被具有相似側鏈的胺基酸殘基置換的取代，具有相似側鏈的胺基酸殘基家族已在本領域中定義。這些家族包括具有鹼性側鏈（例如，離胺酸、精胺酸、組胺酸）、具有酸性側鏈（例如，天冬胺酸、麩胺酸）、具有不帶電極性側鏈（例如，甘胺酸、天冬醯胺酸、麩醯胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、酪胺酸、半胱胺酸、色胺酸）、具有非極性側鏈（例如，丙胺酸、纈胺酸、白胺酸、異白胺酸、脯胺酸、苯丙胺酸、甲硫胺酸）、具有β-支鏈（例如，蘇胺酸、纈胺酸、異白胺酸）及具有芳族側鏈（例如，酪胺酸、苯丙胺酸、色胺酸、組胺酸）之胺基酸。因此，在抗體CDR區域中的一或多個胺基酸殘基可以來自相同側鏈家族之其他胺基酸殘基置換，且可使用本文所述的功能分析測試所改變的抗體結合抗原的能力。

如本文所使用的，術語「共刺激配體」包括在抗原呈現細胞（antigen presenting cell）（例如，aAPC、樹突細胞、B細胞等）上的分子，該分子係特異性結合到T細胞上的同源共刺激分子，因此除了例如藉由TCR/CD3複合物與裝載肽之MHC分子進行結合所提供的主要訊號之外，其提供調控T細胞反應的訊號，包括但不限於增殖、活化、分化等。共刺激配體可包括但不限於CD7、B7-1（CD80）、B7-2（CD86）、PD-L1、PD-L2、4-1BBL、OX40L，誘導型共刺激配體（ICOS-L）、細胞間黏著分子（ICAM）、CD30L、CD40、CD70、CD83、HLA-G、MICA、MICB、HVEM、淋巴毒素β受體、3/TR6、ILT3、ILT4、HVEM、結合鐸（Toll）配體受體的促效劑或抗體及與B7-H3特異性結合的配體。共刺激配體亦包含與T細胞上所存在之共刺激分子特異性結合的抗體，例如但不限於CD27、CD28、4-1BB、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、淋巴細胞功能相關抗原-1（LFA-1）、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3及與CD83特異性結合的配體。

術語「共刺激分子」係指T細胞上的同源結合配偶體（partner），其特異性地與共刺激配體結合，從而調控藉由T細胞之共刺激反應，例如但不限於增生。共刺激分子包括但不限於MHC第1型分子、BTLA及鐸配體受體。

如本文所使用，「共刺激訊號」係指與主要訊號（例如TCR/CD3連接）組合的訊號，導致T細胞增生及/或關鍵分子的上調或下調。

「疾病」是動物無法維持體內恆定的一種健康狀態，且其中若疾病沒有改善則該動物的健康會繼續惡化。相反地，動物的「病症（disorder）」係指動物能夠維持體內恆定但該動物的健康狀態比沒有失調時的情況還差的一種健康狀態，若不治療，失調並不必然會導致動物健康狀態進一步變差。

「供體抗原」係指藉由被植入接受者（recipient）之供體組織所表現之抗原。

「接受者抗原」係指對於供體抗原有免疫反應之標靶。

如本文所使用，術語「下調」係指減少或剔除一或多種基因的基因表現。

「有效量」或「治療有效量」於本文可互換使用，其係指如本文所述化合物、調配物、材料或組成物的劑量能有效實現特定的生物學結果、提供治療性或預防性效益，此類結果可包括但不限於，當投予至哺乳動物時，與不存在本發明組成物時所檢測到的免疫反應相比，該量可引起可檢測程度的免疫抑制反應或耐受性。免疫反應可容易地以許多本領域所認可的方法加以評估。本領域技術人員能夠理解，本文所投予之組成物的量的變化並可基於許多因素決定，例如所治療的疾病或症狀、所治療之哺乳動物的年齡、健康狀況、身體狀況、疾病的嚴重程度、所投予之特定化合物等。

「編碼」係指多核苷酸（例如基因、cDNA或mRNA）中核苷酸之特定序列的固有特性及由此產生的生物學特性，該核苷酸之特定序列在生物過程中作為合成其他具有確定核苷酸序列（即，rRNA、tRNA及mRNA）或確定胺基酸序列的聚合物和大分子的模板。因此，若在細胞或其他生物系統中對應於一基因的mRNA轉錄及轉譯產生一蛋白質，則該基因編碼該蛋白質。編碼股（其核苷酸序列與mRNA序列相同且通常顯示在序列表中）與非編碼股（係用作轉錄基因或cDNA的模板）二者均可被稱為編碼該基因或cDNA的蛋白質或其他產物。

如本文所使用，「內源」係指來自生物體、細胞、組織或系統內部或由其等產生的任何物質。

如本文所使用，術語「表位」定義為抗原上可引發免疫反應的小化學分子，包括誘發B及/或T細胞反應。抗原可具有一或多個表位，大多數抗原具有多個表位。亦即，該些抗原是多價的。一般而言，表位大小約為10個胺基酸及/或糖類。在某些例示性實施方式中，表位為約4至18個胺基酸、約5至16個胺基酸、約6至14個胺基酸、約7至12個胺基酸或約8至10個胺基酸。本領域技術人員能夠理解，通常整體三維結構是抗原特異性的主要條件，而不是是分子的特定線性序列，因而由此區分不同表位。基於本文所揭露，本發明中所使用的肽可為一種表位。

如本文所使用，術語「外源」係指從生物體、細胞、組織或系統外引入或從其等產生的任何物質。

如本文所使用，術語「擴增」是指數量增加，例如T細胞數量的增加。在一實施方式中，離體（ex vivo）擴增的T細胞數量相對於其於培養基中的初始數量有所增加。在另一實施方式中，相對於培養基中的其他細胞，離體擴增的T細胞其數量有所增加。如本文所使用，術語「離體」係指已經從活體（例如人類）中移出並在該活體外繁殖的細胞（例如，在培養皿、試管或生物反應器中）。

如本文所使用，術語「表現」定義為藉由其之啟動子所驅動之特定核苷酸序列的轉錄及/或轉譯。

「表現載體」係指包括重組多核苷酸的載體，該重組多核苷酸包含與待表現之核苷酸序列可操作地連接的表現控制序列。表現載體包含用於表現之足量順式作用元件（cis-acting element）；用於表現的其他元件可由宿主細胞提供或在活體外表現系統中提供。表現載體包括本領域所知的所有類型，例如黏接質體（cosmid）、質體（例如裸露的質體或包含在脂質體中的質體）及併入重組多核苷酸的病毒（例如，仙台病毒（Sendai viruses）、慢病毒、反轉錄病毒、腺病毒及腺相關病毒）。

如本文所使用，「同源」係指兩種聚合物分子之間的次單元序列的一致性，例如兩種核酸分子之間，諸如兩種DNA分子或兩種RNA分子之間，或兩種多肽分子之間。當兩種分子的次單元位置均被同一單體次單元佔據時，例如若兩種DNA分子中之每一者中的位置被腺嘌呤佔據，則其在該位置處同源或一致。兩個序列之間的同源性為匹配位置或同源位置之數目的正函數；例如若兩個序列中之位置有一半（例如長度為十個次單元之聚合物中之五個位置）同源，則該兩個序列為50%同源；若90%之位置（例如10個中之9個）匹配或同源，則該兩個序列為90%同源。

非人類（例如鼠類）抗體的「人源化」形式是嵌合免疫球蛋白、免疫球蛋白鏈或其片段（例如Fv、Fab、Fab'、F（ab'）2或抗體的其他抗原結合次序列），其含有源自非人類免疫球蛋白的最小序列。在大多數情況下，人源化抗體為人類免疫球蛋白（接受者抗體），其中來自接受者之互補決定區（CDR）的殘基被具有所需的特異性、親和力及能力的來自例如小鼠、大鼠或兔子之非人類物種（供體抗體）之CDR的殘基置換。在一些情況下，人類免疫球蛋白的Fv框架區（framework region，FR）殘基被對應的非人類殘基置換。此外，人源化抗體可包含既不在接受者抗體中也不在導入的CDR或框架序列中的殘基。進行這些修飾以進一步改進和優化抗體性能。一般而言，人源化抗體將包含實質上至少一個的全部的，通常是兩個的可變域，其中全部或實直上全部的CDR區對應於非人類免疫球蛋白，且全部或實直上全部的FR區皆為人免疫球蛋白序列的FR區。人源化抗體較佳亦可包含免疫球蛋白恆定區（Fc）的至少一部分，通常是人類免疫球蛋白的恆定區。有關進一步的細節，請參見Jones et al.,Nature , 321：522-525, 1986；Reichmann et al.,Nature , 332：323-329, 1988；Presta,Curr. Op. Struct. Biol ., 2：593-596, 1992。

「完全人源化」係指例如抗體或其結合片段的免疫球蛋白其整個分子是人源的或由與人類抗體形式相同的胺基酸序列組成的。

如本文所使用，「同一性」係指兩個聚合分子之間的次單元序列同一性，特別是在兩個胺基酸分子之間，例如兩個多肽分子之間。當兩個胺基酸序列在相同位置具有相同的殘基時，例如，若兩個多肽分子中每一者的一位置都被精胺酸所佔據，則它們在該位置是具有同一性的。兩個胺基酸序列在比對中相同位置具有相同殘基的同一性或程度通常以百分比表示。兩個胺基算序列之間的同一性是匹配或相同位置數量的正函數，例如，若兩個序列中有一半位置（例如，長度為10個胺基酸的聚合物中有5個位置）是相同的，則這兩個序列的同一性為50%；若90%的位置（例如10個中有9個）是匹配的或相同，則兩個序列的同一性為90%。

如本文所使用，術語「免疫球蛋白」或「Ig」定義為一類蛋白質，其具有抗體的功能。藉由B細胞表現的抗體有時亦稱為BCR（B細胞受體）或抗原受體。包括於此類蛋白質的五個成員為IgA、IgG、IgM、IgD及IgE。IgA是存在於體內分泌物中的一級抗體，例如唾液、淚液、母乳、胃腸分泌物和呼吸道及泌尿生殖道的黏液分泌物。IgG是最常見的循環抗體。IgM是在大多數受試者之初級免疫反應中產生的主要免疫球蛋白，其為凝集、補體固定和其他抗體反應中最有效的免疫球蛋白，且在防禦細菌及病毒方面是很重要的。IgD是沒有已知的抗體功能的免疫球蛋白，但可作為抗原受體。IgE是當在暴露於過敏原時，藉由從肥大細胞和嗜鹼性球引起介質釋放調控即發性過敏反應的免疫球蛋白。

如本文所使用，術語「免疫反應」定義為對於抗原的細胞反應，這種反應發生在淋巴細胞將抗原性分子鑑定為外來物並誘發抗體形成及/或活化淋巴球以除去抗原時。

術語「免疫刺激性」在本文中用於指增加總體免疫反應。

術語「免疫抑制性」在本文中用於指降低總體免疫反應。

如本文所使用的，術語「教材」包括出版物、記錄、圖表或任何其他表現的媒體，其可用於傳達本發明組成物及方法的效用。舉例而言，本發明套組的教材可例如固定在含有本發明核酸、肽及/或組成物的容器上，或與含有本發明核酸、肽及/或組成物的容器一起運輸。或者，在目的為使教材與化合物由接受者配合使用下，教材可與容器分開運輸。

「分離的」意指從自然狀態改變或移除。舉例而言，自然存在於活體動物中的核酸或肽即不是「分離的」，但與其自然狀態下所共存之物質部分或完全分離開來的相同核酸或肽為「分離的」。分離的核酸或蛋白質可以實質上純化的形式存在，或可存在於例如宿主細胞之非自然環境中。

如本文所使用，術語「減弱（knockdown）」係指降低一或多種基因的基因表現。

如本文所使用，術語「剔除（knockout）」係指消除一或多種基因的基因表現。

如本文所使用，「慢病毒（lentivirus）」係指反轉錄病毒科的一個屬。慢病毒屬在反轉錄病毒中獨特之處在於能夠感染非分裂細胞，它們可將大量遺傳信息傳遞到宿主細胞的DNA中，因此是基因傳遞載體中最有效的方法之一。HIV、SIV和FIV都是慢病毒。源自慢病毒的載體提供在活體內達成顯著基因轉移水平的方法。

如本文所使用，術語「有限毒性」係指本發明的肽、多核苷酸、細胞及/或抗體，在活體外或活體內，對於健康細胞、非腫瘤細胞、非患病細胞、非標靶細胞或此類細胞的族群，缺乏實質上負面的生物效應、抗腫瘤作用或實質上負面的生理症狀。

如本文所使用，術語「經修飾的」係指本發明之分子或細胞狀態或結構的改變。分子可以多種方式修飾，包括以化學、結構和功能方式。細胞可藉由引入核酸來修飾。

如本文所使用，術語「調節」，意指相較於在沒有治療或化合物的情況中於受試者中的反應程度，及/或相較於在其他方面相同但未經治療的情況中於受試者中的反應程度，在受試者中調控可檢測之增加或減少的反應程度。該術語包含擾亂及/或影響天然信號或反應，從而調控受試者（例如，人類）的有益治療反應。

在本發明內容中，使用下列常見核酸鹼基的縮寫，「A」係指腺苷酸（adenosine）、「C」是指胞嘧啶（cytosine）、「G」是指鳥核苷（guanosine）、「T」是指胸腺嘧啶核苷（thymidine）、「U」是指尿核苷（uridine）。

除非另有說明，否則「編碼一胺基酸序列的核苷酸序列」包括為彼此退化形式及編碼相同胺基酸序列的所有的核甘酸序列。編碼蛋白質或RNA的核苷酸序列亦可包括插入子，在某種程度上編碼蛋白質的核苷酸序列在一些形式中可含有插入子。

免疫性的組成物之「非腸胃道」投予包括例如皮下（s.c.）、靜脈內（i.v.）、肌肉內（i.m.）、或胸骨內注射投予或輸注技術。

如本文所使用，術語「多核苷酸」定義為核苷酸鏈。此外，核酸為核苷酸之聚合物。因此，本文使用的核酸及多核苷酸是可互換的。本領域技術人員能夠理解核酸是多核苷酸，其可被水解成單體「核苷酸」，單體核苷酸可被水解成核苷。如本文所使用，多核苷酸包括但不限於藉由本領域可用的任何方法所獲得之所有核酸序列，這些方法包括但不限於重組方法及合成方法，即使用普通選殖技術及PCR^TM 等，並藉由合成芳法從重組庫或細胞基因體選殖核酸序列。

如本文所使用，術語「肽」、「多肽」及「蛋白質」可交替使用，且係指藉由肽鍵共價連接的胺基酸殘基所組成的化合物。蛋白質或肽必須含有至少兩個胺基酸，且不限制蛋白質或肽之序列可包含的胺基酸最大數量。多肽包括含經肽鍵彼此連接的二或更多個胺基酸的任何肽或蛋白質。如本文所使用，該術語係指短鏈及長鏈二者，短鏈在本領域中例如通常亦稱為肽、寡肽及寡聚物，長鏈在本領域通常稱為蛋白質，其中有很多種類。「多肽」包括，例如，生物活性片段、實質上同源的多肽、寡肽、同源二聚體（homodimer）、異源二聚體（heterodimer）、多肽變體、經修飾之多肽、衍生物、類似物、融合蛋白等等，多肽包括天然肽、重組肽、合成肽或其之組合。

如本文所使用，術語「自體抗原」定義為由宿主細胞或組織所表現的抗原。自體抗原可為腫瘤抗原，但在某些實施方式中，在正常細胞和腫瘤細胞中都有表現。本領域技術人員能夠容易理解，自體抗原可在細胞中過度表現。

如本文關於抗體所使用的術語「特異性結合」係指辨識特定抗原但實質上不辨識或結合樣本中的其他分子的抗體。例如，特異性結合來自一個物種抗原的抗體亦可結合來自一或多個物種的該抗原。但是，此類跨物種反應性本身並不會改變抗體的特異性分類。在另一個實施方式中，特異性結合至一抗原的抗體亦可結合至該抗原的不同等位基因形式（allelic form）。然而，這種交叉反應性本身並不會改變抗體的特異性分類。在一些情況下，術語「特異性結合」或「特異性地結合」可用於指稱抗體、蛋白質或肽與第二化學種類間的相互作用，表示該相互作用係取決於該化學種類上存有特定結構（例如，抗原決定位或表位），舉例而言，抗體通常辨識並結合特定蛋白質結構而不是蛋白質，如果抗體對表位「A」具有特異性，則在含經標記的「A」和抗體的反應中，含表位A（或游離、未標記的A）之分子的存在將降低與抗體結合的經標記的A的量。

術語「刺激」意指藉由結合刺激分子（例如，TCR/CD3複合物）與其同源配體所誘導的初級反應，進而調控訊息傳遞事件，例如但不限於藉由TCR/CD3複合物的訊息傳遞。刺激可調控某些分子的改變表現，例如TGF-β的下調，及/或細胞骨架結構的重組等。

如本文所使用，「刺激分子」意指T細胞上特異性結合抗原呈現細胞上之同源刺激配體的分子。

如本文所使用，「刺激配體」意指當存在於抗原呈現細胞（例如，aAPC、樹突細胞、B細胞等）上時可特異性結合T細胞上的同源結合配偶體（參照本文中「刺激分子」的描述）的配體，從而調控藉由T細胞的初級反應，包括但不限於活化、免疫反應的引發、增殖等。刺激配體為本領域所熟知的，並且，尤其包含載有肽的MHC第1型分子、抗CD3抗體、超級激動劑抗CD28抗體及超級激動劑抗CD2抗體。

術語「受試者」欲指包括可被引發免疫反應的活體（例如哺乳動物）。如本文所使用，「受試者」或「病患」可為人類或非人類哺乳動物。非人類哺乳動物包括例如家畜和寵物，例如綿羊、牛、豬、犬、貓及鼠類哺乳動物。在例示性實施方式中，受試者為人類。

如本文所使用，「實質上純化的」細胞為一種基本上不含其他細胞類型的細胞。實質上純化的細胞亦指已從通常與其自然存在狀態相關的其他細胞類型分離離出來的細胞。在一些實例中，實質上純化的細胞族群係指細胞的同源族群。在其他實例中，此術語僅指已從通常與自然狀態相關的細胞分離出來的細胞。在一些實施方式中，細胞在活體外培養。在其他實施方式中，細胞不在活體外培養。

「標靶位置」或「標靶序列」係指基因體核酸序列，其定義出在足以發生結合的情況下會與結合分子特異性地結合的核酸的一部分。

如本文所使用，術語「T細胞受體」或「TCR」係指一種膜蛋白複合體，其參與T細胞對抗原呈現之反應的活化作用。TCR負責辨識結合主要組織相容性複合物分子的抗原。TCR由α（alpha）和β（beta）鏈的異源二聚體組成，但是在一些細胞中TCR由γ和δ（gamma/delta）鏈組成。TCR可以α/β和γ/δ形式存在，其等結構上相似，但解剖位置及功能並不相同。每條鏈由兩個細胞外域組成，即可變域和恆定域。在一些實施方式中，TCR可在任何含TCR之細胞上被修飾，包括例如在輔助T細胞、細胞毒性T細胞、記憶T細胞、調節T細胞、自然殺手T細胞及γδ T細胞。

如本文所使用，術語「治療的（therapeutic）」意指治療處理及/或預防。治療效果係藉由抑制、緩解或根除疾病狀態來獲得。

如本文所使用，術語「轉染的」或「轉化的」或「轉導的」係指將外源核酸轉移或導入宿主細胞的過程。轉染的」或「轉化的」或「轉導的」細胞為一種已經以外源核酸轉染、轉化或轉導的細胞，細胞包括初代受試者細胞及其後代。

如本文所使用，術語「治療」意指降低受試者所經歷之疾病或失調的至少一種體徵或徵狀的頻率或嚴重性。

「載體」為包含分離的核酸並可用於遞送分離的核酸至細胞內部的一種物質組成物。本領域已知許多種載體，包括但不限於線性多核苷酸、與離子或兩親性化合物相關的多核苷酸、質體及病毒。因此，術語「載體」包括自主複製的質體或病毒。該術語亦應解釋為包括促進核酸轉移至細胞中的非質體和非病毒化合物，舉例而言，如聚離胺酸化合物、脂質體等。病毒載體的實例包括但不限於仙台病毒（Sendai virus）載體、腺病毒（adenovirus）載體、腺相關病毒（adeno-associated virus）載體、反轉錄病毒（retrovirus）載體、慢病毒（lentivirus）載體等。

「異種」係指源自不同種別動物的任何物質。

範圍：在整個本文中，本發明的各個方面可以範圍的形式呈現。應理解，範圍形式的描述僅為了方便及簡潔，不應該被解釋為對本發明範圍的不可變限制。因此，範圍的描述應被解釋為已特定揭露所有可能的子範圍以及該範圍內的單一數值。例如，從1至6的範圍的描述應該被解釋已特定揭露子範圍，例如1至3、1至4、1至5、2至4、2至6、3至6等，以及在該範圍內的個別數字，例如1、2、2.7、3、4、5、5.3及6。無論範圍的廣度如何皆適用。

說明

本發明提供MUC1特異性嵌合抗原受體（CARs；例如，Tn-MUC1 CAR）及包含其之經修飾之細胞。亦提供使用MUC1特異性CAR的組成物及其治療癌症的方法。特別是，本發明之Tn-MUC1 CAR可適用於治療液態瘤（例如，多發性骨髓瘤等）及實質固態瘤（例如，乳癌、非小細胞肺癌、卵巢及輸卵管癌、胰腺癌等）二者。

本文證實，Tn-MUC1在各種針對抗體的授受性免疫治療的癌症中是一種引人注目的腫瘤抗原。針對Tn-MUC1的CAR T細胞證實在活體外對癌細胞株有效的細胞裂解活性，及在活體內的顯著腫瘤根除。在腫瘤特異性醣基化作用範圍之外靶向MUC1的策略可證實靶向的、非腫瘤的毒性，但Tn-MUC1-靶向的CAR T細胞克服潛在的毒性，並對例如乳癌之實質固態瘤擴展了治療範圍。

嵌合抗原受體（CAR）

本發明提供用於經修飾之免疫細胞或其前驅細胞（例如，經修飾之T細胞）之組成物及方法，其包含對於MUC1具有親和性之嵌合抗原受體（CAR）或MUC1之醣化形式（例如，Tn-MUC1）。本發明之標的CAR包含抗原結合域（例如，Tn-MUC1結合域）、跨膜域、共刺激信號傳導域及細胞內信號傳導域。本發明之標的CAR可選擇地包含鉸鏈域。因此，本發明之標的CAR包含抗原結合域（例如，Tn-MUC1結合域）、鉸鏈域、跨膜域、共刺激信號傳導域及細胞內信號傳導域。在一些實施方式中，標的CAR之各個域經連接子分隔。

抗原結合域可操作地連接至CAR的另一域，例如跨膜域、共刺激信號傳導域或細胞內信號傳導域（其等各於本文他處描述），以在細胞中表現。在一實施方式中，編碼抗原結合域的第一核酸序列係可操作地連接編碼跨膜域的第二核酸，且進ㄧ步可操作地連接編碼共刺激信號傳導域之第三核酸序列。

本文所述抗原結合域可結合任何跨膜域、任何共刺激信號傳導域、任何細胞內信號傳導域或本文所述可包含在本發明CAR中的任何其他域。

一方面，本發明包括特異性結合MUC1之嵌合抗原受體（CAR），包含：MUC1-特異性抗原結合域、可選擇地鉸鏈域、跨膜域、共刺激信號傳導域及細胞內信號傳導域。

一方面，本發明包括特異性結合MUC1之嵌合抗原受體（CAR），包含：TnMUC1-特異性抗原結合域、可選擇地鉸鏈域、跨膜域、共刺激信號傳導域及細胞內信號傳導域。

在一例示性實施方式中，本發明包括特異性結合MUC1之嵌合抗原受體（CAR），包含：含重鏈可變（VH）域及輕鏈可變（VL）域之MUC1-特異性抗原結合域，其中VH域包含SEQ ID NO：22、23及24所述之重鏈互補性決定區（CDR）序列，且其中VL域包含SEQ ID NO：19、20及21所述之輕鏈互補性決定區（CDR）序列；CD8鉸鏈域；CD8跨膜域；CD2共刺激信號傳導域；及CD3 ζ細胞內信號傳導域。

在一例示性實施方式中，本發明包括特異性結合MUC1之嵌合抗原受體（CAR），包含：含重鏈可變（VH）域及輕鏈可變（VL）域之MUC1-特異性抗原結合域，其中VH域包含SEQ ID NO：22、23及24所述之重鏈互補性決定區（CDR）序列，且其中VL域包含SEQ ID NO：19、20及21所述之輕鏈互補性決定區（CDR）序列、CD8鉸鏈域；CD8跨膜域；4-1BB共刺激信號傳導域；及CD3 ζ細胞內信號傳導域。

在一例示性實施方式中，本發明包括特異性結合MUC1之嵌合抗原受體（CAR），包含：含重鏈可變（VH）域及輕鏈可變（VL）域之MUC1-特異性抗原結合域，其中VH域包含SEQ ID NO：22、23及24所述之重鏈互補性決定區（CDR）序列，且其中VL域包含the SEQ ID NO：19、20及21所述之輕鏈互補性決定區（CDR）序列；CD8鉸鏈域；CD8跨膜域；ICOS共刺激信號傳導域；及CD3 ζ細胞內信號傳導域。

在一些實施方式中，本發明之經基因修飾之免疫細胞（例如，T細胞）或其前驅細胞包含對MUC1具有親和性之嵌合抗原受體（CAR）。在一些實施方式中，本發明之經基因修飾之免疫細胞（例如，T細胞）或其前驅細胞包含對Tn-MUC1具有親和性之嵌合抗原受體（CAR）。

在某些實施方式中，經基因修飾之細胞為T細胞。在某些實施方式中，經基因修飾之細胞為天然殺手（NK）細胞。在某些實施方式中，經基因修飾之細胞為NKT細胞。

因此，在一例示性實施方式中，本文所提供的是含特異性結合MUC1之嵌合抗原受體（CAR）的經基因修飾之T細胞，包含：MUC1-特異性抗原結合域、可選擇的鉸鏈域、跨膜域、共刺激信號傳導域及細胞內信號傳導域。

因此，在一例示性實施方式中，本文所提供的是含特異性結合MUC1之嵌合抗原受體（CAR）的經基因修飾之T細胞，包含：TnMUC1-特異性抗原結合域、可選擇的鉸鏈域、跨膜域、共刺激信號傳導域及細胞內信號傳導域。

因此，在一例示性實施方式中，本文所提供的是含特異性結合MUC1之嵌合抗原受體（CAR）的經基因修飾之T細胞，包含：含重鏈可變（VH）域及輕鏈可變（VL）域之MUC1-特異性抗原結合域，其中VH域包含SEQ ID NO：22、23及24所述之重鏈互補性決定區（CDR）序列，且其中VL域包含SEQ ID NO：19、20及21所述之輕鏈互補性決定區（CDR）序列；CD8鉸鏈域；CD8跨膜域；CD2共刺激信號傳導域；及CD3 ζ細胞內信號傳導域。

因此，在一例示性實施方式中，本文所提供的是含特異性結合MUC1之嵌合抗原受體（CAR）的經基因修飾之T細胞，包含：含重鏈可變（VH）域及輕鏈可變（VL）域之MUC1-特異性抗原結合域，其中VH域包含SEQ ID NO：22、23及24所述之重鏈互補性決定區（CDR）序列，且其中VL域包含SEQ ID NO：19、20及21所述之輕鏈互補性決定區（CDR）序列；CD8鉸鏈域；CD8跨膜域；4-1BB共刺激信號傳導域；及CD3 ζ細胞內信號傳導域。

因此，在一例示性實施方式中，本文所提供的是含特異性結合MUC1之嵌合抗原受體（CAR）的經基因修飾之T細胞，包含：含重鏈可變（VH）域及輕鏈可變（VL）域之MUC1-特異性抗原結合域，其中VH域包含SEQ ID NO：22、23及24所述之重鏈互補性決定區（CDR）序列，且其中VL域包含SEQ ID NO：19、20及21所述之輕鏈互補性決定區（CDR）序列；CD8鉸鏈域；CD8跨膜域；ICOS共刺激信號傳導域；及CD3 ζ細胞內信號傳導域。

在本發明某些實施方式中，CAR係經由含核苷酸序列SEQ ID NO：1、38、40、42、44或46之核酸序列所編碼。在本發明某些實施方式中，CAR包含胺基酸序列SEQ ID NOs：2、39、41、43、45或47。

表1列出個別的域及CAR的序列。表1

SEQ ID NO:	序述	序列
1	Tn-MUC1 CAR核酸序列（5E5BBz）	ATGGCCTTACCAGTGACCGCCTTGCTCCTGCCGCTGGCCTTGCTGCTCCACGCCGCCAGGCCGGGATCCCAGGTGCAGCTGCAGCAGTCTGATGCCGAGCTCGTGAAGCCTGGCAGCAGCGTGAAGATCAGCTGCAAGGCCAGCGGCTACACCTTCACCGACCACGCCATCCACTGGGTCAAGCAGAAGCCTGAGCAGGGCCTGGAGTGGATCGGCCACTTCAGCCCCGGCAACACCGACATCAAGTACAACGACAAGTTCAAGGGCAAGGCCACCCTGACCGTGGACAGAAGCAGCAGCACCGCCTACATGCAGCTGAACAGCCTGACCAGCGAGGACAGCGCCGTGTACTTCTGCAAGACCAGCACCTTCTTTTTCGACTACTGGGGCCAGGGCACAACCCTGACAGTGTCTAGCGGAGGCGGAGGATCTGGCGGCGGAGGAAGTGGCGGAGGGGGATCTGAACTCGTGATGACCCAGAGCCCCAGCTCTCTGACAGTGACAGCCGGCGAGAAAGTGACCATGATCTGCAAGTCCTCCCAGAGCCTGCTGAACTCCGGCGACCAGAAGAACTACCTGACCTGGTATCAGCAGAAACCCGGCCAGCCCCCCAAGCTGCTGATCTTTTGGGCCAGCACCCGGGAAAGCGGCGTGCCCGATAGATTCACAGGCAGCGGCTCCGGCACCGACTTTACCCTGACCATCAGCTCCGTGCAGGCCGAGGACCTGGCCGTGTATTACTGCCAGAACGACTACAGCTACCCCCTGACCTTCGGAGCCGGCACCAAGCTGGAACTGAAGTCCGGAaccacgacgccagcgccgcgaccaccaacaccggcgcccaccatcgcgtcgcagcccctgtccctgcgcccagaggcgtgccggccagcggcggggggcgcagtgcacacgagggggctggacttcgcctgtgatatctacatctgggcgcccttggccgggacttgtggggtccttctcctgtcactggttatcaccctttactgcaaacggggcagaaagaaactcctgtatatattcaaacaaccatttatgagaccagtacaaactactcaagaggaagatggctgtagctgccgatttccagaagaagaagaaggaggatgtgaactgagagtgaagttcagcaggagcgcagacgcccccgcgtacaagcagggccagaaccagctctataacgagctcaatctaggacgaagagaggagtacgatgttttggacaagagacgtggccgggaccctgagatggggggaaagccgagaaggaagaaccctcaggaaggcctgtacaatgaactgcagaaagataagatggcggaggcctacagtgagattgggatgaaaggcgagcgccggaggggcaaggggcacgatggcctttaccagggtctcagtacagccaccaaggacacctacgacgcccttcacatgcaggccctgccccctcgc
2	Tn-MUC1 CAR胺基酸序列（5E5BBz）	MALPVTALLLPLALLLHAARPGSQVQLQQSDAELVKPGSSVKISCKASGYTFTDHAIHWVKQKPEQGLEWIGHFSPGNTDIKYNDKFKGKATLTVDRSSSTAYMQLNSLTSEDSAVYFCKTSTFFFDYWGQGTTLTVSSGGGGSGGGGSGGGGSELVMTQSPSSLTVTAGEKVTMICKSSQSLLNSGDQKNYLTWYQQKPGQPPKLLIFWASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQAEDLAVYYCQNDYSYPLTFGAGTKLELKSGTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
3	5E5 scFv核酸序列	CAGGTGCAGCTGCAGCAGTCTGATGCCGAGCTCGTGAAGCCTGGCAGCAGCGTGAAGATCAGCTGCAAGGCCAGCGGCTACACCTTCACCGACCACGCCATCCACTGGGTCAAGCAGAAGCCTGAGCAGGGCCTGGAGTGGATCGGCCACTTCAGCCCCGGCAACACCGACATCAAGTACAACGACAAGTTCAAGGGCAAGGCCACCCTGACCGTGGACAGAAGCAGCAGCACCGCCTACATGCAGCTGAACAGCCTGACCAGCGAGGACAGCGCCGTGTACTTCTGCAAGACCAGCACCTTCTTTTTCGACTACTGGGGCCAGGGCACAACCCTGACAGTGTCTAGCGGAGGCGGAGGATCTGGCGGCGGAGGAAGTGGCGGAGGGGGATCTGAACTCGTGATGACCCAGAGCCCCAGCTCTCTGACAGTGACAGCCGGCGAGAAAGTGACCATGATCTGCAAGTCCTCCCAGAGCCTGCTGAACTCCGGCGACCAGAAGAACTACCTGACCTGGTATCAGCAGAAACCCGGCCAGCCCCCCAAGCTGCTGATCTTTTGGGCCAGCACCCGGGAAAGCGGCGTGCCCGATAGATTCACAGGCAGCGGCTCCGGCACCGACTTTACCCTGACCATCAGCTCCGTGCAGGCCGAGGACCTGGCCGTGTATTACTGCCAGAACGACTACAGCTACCCCCTGACCTTCGGAGCCGGCACCAAGCTGGAACTGAAG
4	5E5 scFv胺基酸序列	QVQLQQSDAELVKPGSSVKISCKASGYTFTDHAIHWVKQKPEQGLEWIGHFSPGNTDIKYNDKFKGKATLTVDRSSSTAYMQLNSLTSEDSAVYFCKTSTFFFDYWGQGTTLTVSSGGGGSGGGGSGGGGSELVMTQSPSSLTVTAGEKVTMICKSSQSLLNSGDQKNYLTWYQQKPGQPPKLLIFWASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQAEDLAVYYCQNDYSYPLTFGAGTKLELK
5	5E5 scFv重鏈（VH）可變區胺基酸序列	QVQLQQSDAELVKPGSSVKISCKASGYTFTDHAIHWVKQKPEQGLEWIGHFSPGNTDIKYNDKFKGKATLTVDRSSSTAYMQLNSLTSEDSAVYFCKTSTFFFDYWGQGTTLTVSS
6	5E5 scFv輕鏈（VL）可變區胺基酸序列	ELVMTQSPSSLTVTAGEKVTMICKSSQSLLNSGDQKNYLTWYQQKPGQPPKLLIFWASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQAEDLAVYYCQNDYSYPLTFGAGTKLELK
7	CD8α跨膜域胺基酸序列	IYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYC
8	CD8α跨膜域核酸序列	atctacatctgggcgcccttggccgggacttgtggggtccttctcctgtcactggttatcaccctttactgc
9	4-1BB胺基酸序列	KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL
10	4-1BB核酸序列	aaacggggcagaaagaaactcctgtatatattcaaacaaccatttatgagaccagtacaaactactcaagaggaagatggctgtagctgccgatttccagaagaagaagaaggaggatgtgaactg
11	CD3 ζ域胺基酸序列	RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
12	CD3 ζ域核酸序列	agagtgaagttcagcaggagcgcagacgcccccgcgtaccagcagggccagaaccagctctataacgagctcaatctaggacgaagagaggagtacgatgttttggacaagagacgtggccgggaccctgagatggggggaaagccgagaaggaagaaccctcaggaaggcctgtacaatgaactgcagaaagataagatggcggaggcctacagtgagattgggatgaaaggcgagcgccggaggggcaaggggcacgatggcctttaccagggtctcagtacagccaccaaggacacctacgacgcccttcacatgcaggccctgccccctcgc
13	CD8鉸鏈胺基酸序列	TTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACD
14	CD8鉸鏈核酸序列	accacgacgccagcgccgcgaccaccaacaccggcgcccaccatcgcgtcgcagcccctgtccctgcgcccagaggcgtgccggccagcggcggggggcgcagtgcacacgagggggctggacttcgcctgtgat
15	CD28跨膜域胺基酸序列	FWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWV
16	CD28跨膜域核酸序列	ttttgggtgctggtggtggttggtggagtcctggcttgctatagcttgctagtaacagtggcctttattattttctgggtg
17	CD28細胞內域胺基酸序列	RSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS
18	CD28細胞內域核酸序列	aggagtaagaggagcaggctcctgcacagtgactacatgaacatgactccccgccgccccgggcccacccgcaagcattaccagccctatgccccaccacgcgacttcgcagcctatcgctcc
19	LC CDR1	QSLLNSGDQKNYLT
20	LC CDR2	LLIFWASTRES
21	LC CDR3	QNDYSYPL
22	HC CDR1	YTFTDHAIH
23	HC CDR2	WIGHFSPGNTDIKY
24	HC CDR3	KTSTFFFDY
25	ICOS共刺激域胺基酸序列	TKKKYSSSVHDPNGEYMFMRAVNTAKKSRLTDVTL
26	ICOS共刺激域核酸序列	ACAAAAAAGAAGTATTCATCCAGTGTGCACGACCCTAACGGTGAATACATGTTCATGAGAGCAGTGAACACAGCCAAAAAATCTAGACTCACAGATGTGACCCTA
27	ICOS共刺激域核酸序列	ACAAAAAAGAAGTATTCATCCAGTGTGCACGACCCTAACGGTGAATACATGTTCATGAGAGCAGTGAACACAGCCAAAAAATCCAGACTCACAGATGTGACCCTA
28	CD2共刺激域胺基酸序列	TKRKKQRSRRNDEELETRAHRVATEERGRKPHQIPASTPQNPATSQHPPPPPGHRSQAPSHRPPPPGHRVQHQPQKRPPAPSGTQVHQQKGPPLPRPRVQPKPPHGAAENSLSPSSN
29	CD2共刺激域核酸序列	ACCAAAAGGAAAAAACAGAGGAGTCGGAGAAATGATGAGGAGCTGGAGACAAGAGCCCACAGAGTAGCTACTGAAGAAAGGGGCCGGAAGCCCCACCAAATTCCAGCTTCAACCCCTCAGAATCCAGCAACTTCCCAACATCCTCCTCCACCACCTGGTCATCGTTCCCAGGCACCTAGTCATCGTCCCCCGCCTCCTGGACACCGTGTTCAGCACCAGCCTCAGAAGAGGCCTCCTGCTCCGTCGGGCACACAAGTTCACCAGCAGAAAGGCCCGCCCCTCCCCAGACCTCGAGTTCAGCCAAAACCTCCCCATGGGGCAGCAGAAAACTCATTGTCCCCTTCCTCTAAT
30	CD3 ζ域胺基酸序列（Q14K）	RVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
31	CD3 ζ域核酸序列（Q14K）	AGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACAAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGC
32	CD28細胞內域變體（YMFM）胺基酸序列	RSKRSRLLHSDYMFMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS
33	CD28細胞內域變體（YMFM）核酸序列	AGGAGTAAGAGGAGCAGGCTCCTGCACAGTGACTACATGTTCATGACTCCCCGCCGCCCCGGGCCCACCCGCAAGCATTACCAGCCCTATGCCCCACCACGCGACTTCGCAGCCTATCGCTCC
34	CD27細胞內域胺基酸序列	QRRKYRSNKGESPVEPAEPCRYSCPREEEGSTIPIQEDYRKPEPACSP
35	CD27細胞內域核酸序列	CAACGAAGGAAATATAGATCAAACAAAGGAGAAAGTCCTGTGGAGCCTGCAGAGCCTTGTCGTTACAGCTGCCCCAGGGAGGAGGAGGGCAGCACCATCCCCATCCAGGAGGATTACCGAAAACCGGAGCCTGCCTGCTCCCCC
36	OX40細胞內域胺基酸序列	ALYLLRRDQRLPPDAHKPPGGGSFRTPIQEEQADAHSTLAKI
37	OX40細胞內域核酸序列	GCCCTGTACCTGCTCCGCAGGGACCAGAGGCTGCCCCCCGATGCCCACAAGCCCCCTGGGGGAGGCAGTTTCAGGACCCCCATCCAAGAGGAGCAGGCCGACGCCCACTCCACCCTGGCCAAGATC
38	Tn-MUC1 CAR核酸序列（5E528z）	ATGGCCTTACCAGTGACCGCCTTGCTCCTGCCGCTGGCCTTGCTGCTCCACGCCGCCAGGCCGGGATCCCAGGTGCAGCTGCAGCAGTCTGATGCCGAGCTCGTGAAGCCTGGCAGCAGCGTGAAGATCAGCTGCAAGGCCAGCGGCTACACCTTCACCGACCACGCCATCCACTGGGTCAAGCAGAAGCCTGAGCAGGGCCTGGAGTGGATCGGCCACTTCAGCCCCGGCAACACCGACATCAAGTACAACGACAAGTTCAAGGGCAAGGCCACCCTGACCGTGGACAGAAGCAGCAGCACCGCCTACATGCAGCTGAACAGCCTGACCAGCGAGGACAGCGCCGTGTACTTCTGCAAGACCAGCACCTTCTTTTTCGACTACTGGGGCCAGGGCACAACCCTGACAGTGTCTAGCGGAGGCGGAGGATCTGGCGGCGGAGGAAGTGGCGGAGGGGGATCTGAACTCGTGATGACCCAGAGCCCCAGCTCTCTGACAGTGACAGCCGG CGAGAAAGTGACCATGATCTGCAAGTCCTCCCAGAGCCTGCTGAACTCCGGCGACCAGAAGAACTACCTGACCTGGTATCAGCAGAAACCCGGCCAGCCCCCCAAGCTGCTGATCTTTTGGGCCAGCACCCGGGAAAGCGGCGTGCCCGATAGATTCACAGGCAGCGGCTCCGGCACCGACTTTACCCTGACCATCAGCTCCGTGCAGGCCGAGGACCTGGCCGTGTATTACTGCCAGAACGACTACAGCTACCCCCTGACCTTCGGAGCCGGCACCAAGCTGGAACTGAAGTCCGGAACCACGACGCCAGCGCCGCGACCACCAACACCGGCGCCCACCATCGCGTCGCAGCCCCTGTCCCTGCGCCCAGAGGCGTGCCGGCCAGCGGCGGGGGGCGCAGTGCACACGAGGGGGCTGGACTTCGCCTGTGATTTTTGGGTGCTGGTGGTGGTTGGTGGAGTCCTGGCTTGCTATAGCTTGCTAGTAACAGTGGCCTTTATTATTTTCTGGGTG AGGAGTAAGAGGAGCAGGCTCCTGCACAGTGACTACATGAACATGACTCCCCGCCGCCCCGGGCCCACCCGCAAGCATTACCAGCCCTATGCCCCACCACGCGACTTCGCAGCCTATCGCTCCAGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACAAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAG GAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGC
39	Tn-MUC1 CAR胺基酸序列（5E528z）	MALPVTALLLPLALLLHAARPGSQVQLQQSDAELVKPGSSVKISCKASGYTFTDHAIHWVKQKPEQGLEWIGHFSPGNTDIKYNDKFKGKATLTVDRSSSTAYMQLNSLTSEDSAVYFCKTSTFFFDYWGQGTTLTVSSGGGGSGGGGSGGGGSELVMTQSPSSLTVTAGEKVTMICKSSQSLLNSGDQKNYLTWYQQKPGQPPKLLIFWASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQAEDLAVYYCQNDYSYPLTFGAGTKLELKSGTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
40	Tn-MUC1 CAR核酸序列（5E528z YMFM）	ATGGCCTTACCAGTGACCGCCTTGCTCCTGCCGCTGGCCTTGCTGCTCCACGCCGCCAGGCCGGGATCCCAGGTGCAGCTGCAGCAGTCTGATGCCGAGCTCGTGAAGCCTGGCAGCAGCGTGAAGATCAGCTGCAAGGCCAGCGGCTACACCTTCACCGACCACGCCATCCACTGGGTCAAGCAGAAGCCTGAGCAGGGCCTGGAGTGGATCGGCCACTTCAGCCCCGGCAACACCGACATCAAGTACAACGACAAGTTCAAGGGCAAGGCCACCCTGACCGTGGACAGAAGCAGCAGCACCGCCTACATGCAGCTGAACAGCCTGACCAGCGAGGACAGCGCCGTGTACTTCTGCAAGACCAGCACCTTCTTTTTCGACTACTGGGGCCAGGGCACAACCCTGACAGTGTCTAGCGGAGGCGGAGGATCTGGCGGCGGAGGAAGTGGCGGAGGGGGATCTGAACTCGTGATGACCCAGAGCCCCAGCTCTCTGACAGTGACAGCCGG CGAGAAAGTGACCATGATCTGCAAGTCCTCCCAGAGCCTGCTGAACTCCGGCGACCAGAAGAACTACCTGACCTGGTATCAGCAGAAACCCGGCCAGCCCCCCAAGCTGCTGATCTTTTGGGCCAGCACCCGGGAAAGCGGCGTGCCCGATAGATTCACAGGCAGCGGCTCCGGCACCGACTTTACCCTGACCATCAGCTCCGTGCAGGCCGAGGACCTGGCCGTGTATTACTGCCAGAACGACTACAGCTACCCCCTGACCTTCGGAGCCGGCACCAAGCTGGAACTGAAGTCCGGAACCACGACGCCAGCGCCGCGACC ACCAACACCGGCGCCCACCATCGCGTCGCAGCCCCTGTCCCTGCGCCCAGAGGCGTGCCGGCCAGCGGCGGGGGGCGCAGTGCACACGAGGGGGCTGGACTTCGCCTGTGATTTTTGGGTGCTGGTGGTGGTTGGTG GAGTCCTGGCTTGCTATAGCTTGCTAGTAACAGTGGCCTTTATTATTTTCTGGGTGAGGAGTAAGAGGAGCAGGCTCCTGCACAGTGACTACATGTTCATGACTCCCCGCCGCCCCGGGCCCACCCGCAAGCATTACCAGCCCTATGCCCCACCACGCGACTTCGCAGCCTATCGCTCCAGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACAAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAG AAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGC
41	Tn-MUC1 CAR胺基酸序列（5E528z YMFM）	MALPVTALLLPLALLLHAARPGSQVQLQQSDAELVKPGSSVKISCKASGYTFTDHAIHWVKQKPEQGLEWIGHFSPGNTDIKYNDKFKGKATLTVDRSSSTAYMQLNSLTSEDSAVYFCKTSTFFFDYWGQGTTLTVSSGGGGSGGGGSGGGGSELVMTQSPSSLTVTAGEKVTMICKSSQSLLNSGDQKNYLTWYQQKPGQPPKLLIFWASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQAEDLAVYYCQNDYSYPLTFGAGTKLELKSGTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMFMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
42	Tn-MUC1 CAR核酸序列（5E527z）	ATGGCCTTACCAGTGACCGCCTTGCTCCTGCCGCTGGCCTTGCTGCTCCACGCCGCCAGGCCGGGATCCCAGGTGCAGCTGCAGCAGTCTGATGCCGAGCTCGTGAAGCCTGGCAGCAGCGTGAAGATCAGCTGCAAGGCCAGCGGCTACACCTTCACCGACCACGCCATCCACTGGGTCAAGCAGAAGCCTGAGCAGGGCCTGGAGTGGATCGGCCACTTCAGCCCCGGCAACACCGACATCAAGTACAACGACAAGTTCAAGGGCAAGGCCACCCTGACCGTGGACAGAAGCAGCAGCACCGCCTACATGCAGCTGAACAGCCTGACCAGCGAGGACAGCGCCGTGTACTTCTGCAAGACCAGCACCTTCTTTTTCGACTACTGGGGCCAGGGCACAACCCTGACAGTGTCTAGCGGAGGCGGAGGATCTGGCGGCGGAGGAAGTGGCGGAGGGGGATCTGAACTCGTGATGACCCAGAGCCCCAGCTCTCTGACAGTGACAGCCGG CGAGAAAGTGACCATGATCTGCAAGTCCTCCCAGAGCCTGCTGAACTCCGGCGACCAGAAGAACTACCTGACCTGGTATCAGCAGAAACCCGGCCAGCCCCCCAAGCTGCTGATCTTTTGGGCCAGCACCCGGGAAAGCGGCGTGCCCGATAGATTCACAGGCAGCGGCTCCGGCACCGACTTTACCCTGACCATCAGCTCCGTGCAGGCCGAGGACCTGGCCGTGTATTACTGCCAGAACGACTACAGCTACCCCCTGACCTTCGGAGCCGGCACCAAGCTGGAACTGAAGTCCGGAACCACGACGCCAGCGCCGCGACCACCAACACCGGCGCCCACCATCGCGTCGCAGCCCCTGTCCCTGCGCCCAGAGGCGTGCCGGCCAGCGGCGGGGGGCGCAGTGCACACGAGGGGGCTGGACTTCGCCTGTGATATCTACATCTGGGCGCCCTTGGCCGGGACTTGTGGGGTCCTTCTCCTGTCACTGGTTATCACCCTTTACTGCCAACGAAGGAAATATAGATCAAACAAAGGAGAAAGTCCTGTGGAGCCTGCAGAGCCTTGTCGTTACAGCTGCCCCAGGGAGGAGGAGGGCAGCACCATCCCCATCCAGGAGGATTACCGAAAACCGGAGCCTGCCTGCTCCCCCAGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACAAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGC
43	Tn-MUC1 CAR胺基酸序列（5E527z）	MALPVTALLLPLALLLHAARPGSQVQLQQSDAELVKPGSSVKISCKASGYTFTDHAIHWVKQKPEQGLEWIGHFSPGNTDIKYNDKFKGKATLTVDRSSSTAYMQLNSLTSEDSAVYFCKTSTFFFDYWGQGTTLTVSSGGGGSGGGGSGGGGSELVMTQSPSSLTVTAGEKVTMICKSSQSLLNSGDQKNYLTWYQQKPGQPPKLLIFWASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQAEDLAVYYCQNDYSYPLTFGAGTKLELKSGTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCQRRKYRSNKGESPVEPAEPCRYSCPREEEGSTIPIQEDYRKPEPACSPRVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
44	Tn-MUC1 CAR核酸序列（5E5Ox40z）	ATGGCCTTACCAGTGACCGCCTTGCTCCTGCCGCTGGCCTTGCTGCTCCACGCCGCCAGGCCGGGATCCCAGGTGCAGCTGCAGCAGTCTGATGCCGAGCTCGTGAAGCCTGGCAGCAGCGTGAAGATCAGCTGCAAGGCCAGCGGCTACACCTTCACCGACCACGCCATCCACTGGGTCAAGCAGAAGCCTGAGCAGGGCCTGGAGTGGATCGGCCACTTCAGCCCCGGCAACACCGACATCAAGTACAACGACAAGTTCAAGGGCAAGGCCACCCTGACCGTGGACAGAAGCAGCAGCACCGCCTACATGCAGCTGAACAGCCTGACCAGCGAGGACAGCGCCGTGTACTTCTGCAAGACCAGCACCTTCTTTTTCGACTACTGGGGCCAGGGCACAACCCTGACAGTGTCTAGCGGAGGCGGAGGATCTGGCGGCGGAGGAAGTGGCGGAGGGGGATCTGAACTCGTGATGACCCAGAGCCCCAGCTCTCTGACAGTGACAGCCGG CGAGAAAGTGACCATGATCTGCAAGTCCTCCCAGAGCCTGCTGAACTCCGGCGACCAGAAGAACTACCTGACCTGGTATCAGCAGAAACCCGGCCAGCCCCCCAAGCTGCTGATCTTTTGGGCCAGCACCCGGGAAAGCGGCGTGCCCGATAGATTCACAGGCAGCGGCTCCGGCACCGACTTTACCCTGACCATCAGCTCCGTGCAGGCCGAGGACCTGGCCGTGTATTACTGCCAGAACGACTACAGCTACCCCCTGACCTTCGGAGCCGGCACCAAGCTGGAACTGAAGTCCGGAACCACGACGCCAGCGCCGCGACCACCAACACCGGCGCCCACCATCGCGTCGCAGCCCCTGTCCCTGCGCCCAGAGGCGTGCCGGCCAGCGGCGGGGGGCGCAGTGCACACGAGGGGGCTGGACTTCGCCTGTGATATCTACATCTGGGCGCCCTTGGCCGGGACTTGTGGGGTCCTTCTCCTGTCACTGGTTATCACCCTTTACTGCGCCCTGTACCTGCTCCGCAGGGACCAGAGGCTGCCCCCCGATGCCCACAAGCCCCCTGGGGGAGGCAGTTTCAGGACCCCCATCCAAGAGGAGCAGGCCGACGCCCACTCCACCCTGGCCAAGATCAGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACAAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGC
45	Tn-MUC1 CAR胺基酸序列（5E5Ox40z）	MALPVTALLLPLALLLHAARPGSQVQLQQSDAELVKPGSSVKISCKASGYTFTDHAIHWVKQKPEQGLEWIGHFSPGNTDIKYNDKFKGKATLTVDRSSSTAYMQLNSLTSEDSAVYFCKTSTFFFDYWGQGTTLTVSSGGGGSGGGGSGGGGSELVMTQSPSSLTVTAGEKVTMICKSSQSLLNSGDQKNYLTWYQQKPGQPPKLLIFWASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQAEDLAVYYCQNDYSYPLTFGAGTKLELKSGTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCALYLLRRDQRLPPDAHKPPGGGSFRTPIQEEQADAHSTLAKIRVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
46	Tn-MUC1 CAR核酸序列（5E5CD2z）	ATGGCCTTACCAGTGACCGCCTTGCTCCTGCCGCTGGCCTTGCTGCTCCACGCCGCCAGGCCGGGATCCCAGGTGCAGCTGCAGCAGTCTGATGCCGAGCTCGTGAAGCCTGGCAGCAGCGTGAAGATCAGCTGCAAGGCCAGCGGCTACACCTTCACCGACCACGCCATCCACTGGGTCAAGCAGAAGCCTGAGCAGGGCCTGGAGTGGATCGGCCACTTCAGCCCCGGCAACACCGACATCAAGTACAACGACAAGTTCAAGGGCAAGGCCACCCTGACCGTGGACAGAAGCAGCAGCACCGCCTACATGCAGCTGAACAGCCTGACCAGCGAGGACAGCGCCGTGTACTTCTGCAAGACCAGCACCTTCTTTTTCGACTACTGGGGCCAGGGCACAACCCTGACAGTGTCTAGCGGAGGCGGAGGATCTGGCGGCGGAGGAAGTGGCGGAGGGGGATCTGAACTCGTGATGACCCAGAGCCCCAGCTCTCTGACAGTGACAGCCGGCGAGAAAGTGACCATGATCTGCAAGTCCTCCCAGAGCCTGCTGAACTCCGGCGACCAGAAGAACTACCTGACCTGGTATCAGCAGAAACCCGGCCAGCCCCCCAAGCTGCTGATCTTTTGGGCCAGCACCCGGGAAAGCGGCGTGCCCGATAGATTCACAGGCAGCGGCTCCGGCACCGACTTTACCCTGACCATCAGCTCCGTGCAGGCCGAGGACCTGGCCGTGTATTACTGCCAGAACGACTACAGCTACCCCCTGACCTTCGGAGCCGGCACCAAGCTGGAACTGAAGTCCGGAACCACGACGCCAGCGCCGCGACCACCAACACCGGCGCCCACCATCGCGTCGCAGCCCCTGTCCCTGCGCCCAGAGGCGTGCCGGCCAGCGGCGGGGGGCGCAGTGCACACGAGGGGGCTGGACTTCGCCTGTGATATCTACATCTGGGCGCCCTTGGCCGGGACTTGTGGGGTCCTTCTCCTGTCACTGGTTATCACCCTTTACTGCACCAAAAGGAAAAAACAGAGGAGTCGGAGAAATGATGAGGAGCTGGAGACAAGAGCCCACAGAGTAGCTACTGAAGAAAGGGGCCGGAAGCCCCACCAAATTCCAGCTTCAACCCCTCAGAATCCAGCAACTTCCCAACATCCTCCTCCACCACCTGGTCATCGTTCCCAGGCACCTAGTCATCGTCCCCCGCCTCCTGGACACCGTGTTCAGCACCAGCCTCAGAAGAGGCCTCCTGCTCCGTCGGGCACACAAGTTCACCAGCAGAAAGGCCCGCCCCTCCCCAGACCTCGAGTTCAGCCAAAACCTCCCCATGGGGCAGCAGAAAACTCATTGTCCCCTTCCTCTAATATCGATAGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACAAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGC
47	Tn-MUC1 CAR胺基酸序列（5E5CD2z）	MALPVTALLLPLALLLHAARPGSQVQLQQSDAELVKPGSSVKISCKASGYTFTDHAIHWVKQKPEQGLEWIGHFSPGNTDIKYNDKFKGKATLTVDRSSSTAYMQLNSLTSEDSAVYFCKTSTFFFDYWGQGTTLTVSSGGGGSGGGGSGGGGSELVMTQSPSSLTVTAGEKVTMICKSSQSLLNSGDQKNYLTWYQQKPGQPPKLLIFWASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQAEDLAVYYCQNDYSYPLTFGAGTKLELKSGTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCTKRKKQRSRRNDEELETRAHRVATEERGRKPHQIPASTPQNPATSQHPPPPPGHRSQAPSHRPPPPGHRVQHQPQKRPPAPSGTQVHQQKGPPLPRPRVQPKPPHGAAENSLSPSSNIDRVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
48	CD8α前導胺基酸序列	MALPVTALLLPLALLLHAARP
49	Tn-MUC1 CAR胺基酸序列（5E5ICOSz）	MALPVTALLLPLALLLHAARPGSQVQLQQSDAELVKPGSSVKISCKASGYTFTDHAIHWVKQKPEQGLEWIGHFSPGNTDIKYNDKFKGKATLTVDRSSSTAYMQLNSLTSEDSAVYFCKTSTFFFDYWGQGTTLTVSSGGGGSGGGGSGGGGSELVMTQSPSSLTVTAGEKVTMICKSSQSLLNSGDQKNYLTWYQQKPGQPPKLLIFWASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQAEDLAVYYCQNDYSYPLTFGAGTKLELKSGTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDFWLPIGCAAFVVVCILGCILICWLTKKKYSSSVHDPNGEYMFMRAVNTAKKSRLTDVTLRVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
50	Tn-MUC1 CAR核酸序列（5E5ICOSz-1）	ATGGCCTTACCAGTGACCGCCTTGCTCCTGCCGCTGGCCTTGCTGCTCCACGCCGCCAGGCCGGGATCCCAGGTGCAGCTGCAGCAGTCTGATGCCGAGCTCGTGAAGCCTGGCAGCAGCGTGAAGATCAGCTGCAAGGCCAGCGGCTACACCTTCACCGACCACGCCATCCACTGGGTCAAGCAGAAGCCTGAGCAGGGCCTGGAGTGGATCGGCCACTTCAGCCCCGGCAACACCGACATCAAGTACAACGACAAGTTCAAGGGCAAGGCCACCCTGACCGTGGACAGAAGCAGCAGCACCGCCTACATGCAGCTGAACAGCCTGACCAGCGAGGACAGCGCCGTGTACTTCTGCAAGACCAGCACCTTCTTTTTCGACTACTGGGGCCAGGGCACAACCCTGACAGTGTCTAGCGGAGGCGGAGGATCTGGCGGCGGAGGAAGTGGCGGAGGGGGATCTGAACTCGTGATGACCCAGAGCCCCAGCTCTCTGACAGTGACAGCCGG CGAGAAAGTGACCATGATCTGCAAGTCCTCCCAGAGCCTGCTGAACTCCGGCGACCAGAAGAACTACCTGACCTGGTATCAGCAGAAACCCGGCCAGCCCCCCAAGCTGCTGATCTTTTGGGCCAGCACCCGGGAAAGCGGCGTGCCCGATAGATTCACAGGCAGCGGCTCCGGCACCGACTTTACCCTGACCATCAGCTCCGTGCAGGCCGAGGACCTGGCCGTGTATTACTGCCAGAACGACTACAGCTACCCCCTGACCTTCGGAGCCGGCACCAAGCTGGAACTGAAGTCCGGAACCACGACGCCAGCGCCGCGACCACCAACACCGGCGCCCACCATCGCGTCGCAGCCCCTGTCCCTGCGCCCAGAGGCGTGCCGGCCAGCGGCGGGGGGCGCAGTGCACACGAGGGGGCTGGACTTCGCCTGTGATTTCTGGTTACCCATAGGATGTGCAGCCTTTGTTGTAGTCTGCATTTTGGGATGCATACTTATTTGTTGGCTTACAAAAAAGAAGTATTCATCCAGTGTGCACGACCCTAACGGTGAATACATGTTCATGAGAGCAGTGAACACAGCCAAAAAATCCAGACTCACAGATGTGACCCTAAGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACAAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGC
51	Tn-MUC1 CAR核酸序列（5E5ICOSz-2）	ATGGCCTTACCAGTGACCGCCTTGCTCCTGCCGCTGGCCTTGCTGCTCCACGCCGCCAGGCCGGGATCCCAGGTGCAGCTGCAGCAGTCTGATGCCGAGCTCGTGAAGCCTGGCAGCAGCGTGAAGATCAGCTGCAAGGCCAGCGGCTACACCTTCACCGACCACGCCATCCACTGGGTCAAGCAGAAGCCTGAGCAGGGCCTGGAGTGGATCGGCCACTTCAGCCCCGGCAACACCGACATCAAGTACAACGACAAGTTCAAGGGCAAGGCCACCCTGACCGTGGACAGAAGCAGCAGCACCGCCTACATGCAGCTGAACAGCCTGACCAGCGAGGACAGCGCCGTGTACTTCTGCAAGACCAGCACCTTCTTTTTCGACTACTGGGGCCAGGGCACAACCCTGACAGTGTCTAGCGGAGGCGGAGGATCTGGCGGCGGAGGAAGTGGCGGAGGGGGATCTGAACTCGTGATGACCCAGAGCCCCAGCTCTCTGACAGTGACAGCCGGCGAGAAAGTGACCATGATCTGCAAGTCCTCCCAGAGCCTGCTGAACTCCGGCGACCAGAAGAACTACCTGACCTGGTATtCAGCAGAAACCCGGCCAGCCCCCCAAGCTGCTGATCTTTTGGGCCAGCACCCGGGAAAGCGGCGTGCCCGATAGATTCACAGGCAGCGGCTCCGGCACCGACTTTACCCTGACCATCAGCTCCGTGCAGGCCGAGGACCTGGCCGTGTATTACTGCCAGAACGACTACAGCTACCCCCTGACCTTCGGAGCCGGCACCAAGCTGGAACTGAAGTCCGGAACCACGACGCCAGCGCCGCGACCACCAACACCGGCGCCCACCATCGCGTCGCAGCCCCTGTCCCTGCGCCCAGAGGCGTGCCGGCCAGCGGCGGGGGGCGCAGTGCACACGAGGGGGCTGGACTTCGCCTGTGATTTCTGGTTACCCATAGGATGTGCAGCCTTTGTTGTAGTCTGCATTTTGGGATGCATACTTATTTGTTGGCTTACAAAAAAGAAGTATTCATCCAGTGTGCACGACCCTAACGGTGAATACATGTTCATGAGAGCAGTGAACACAGCCAAAAAATCTAGACTCACAGATGTGACCCTAAGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACAAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGC

因此，標的CAR可為對Tn-MUC1具有親和性之CAR，包含含SEQ ID NO：4、5、6及/或19-24所述之胺基酸序列的Tn-MUC1結合域。標的Tn-MUC1 CAR可進一步包含含SEQ ID NO：48所述之胺基酸序列的前導子序列。標的Tn-MUC1 CAR可進一步包含含SEQ ID NO：13所述之胺基酸序列的鉸鏈域。標的Tn-MUC1 CAR可進一步包含含SEQ ID NO：7及/或15所述之胺基酸序列的跨膜域。標的Tn-MUC1 CAR可進一步包含含SEQ ID NO：9、17、25、28、32、34及/或36所述之胺基酸序列的共刺激信號傳導域。標的Tn-MUC1 CAR可進一步包含含SEQ ID NO：11及/或30所述之胺基酸序列的細胞內信號傳導域。標的Tn-MUC1 CAR可包含SEQ ID NO：2、39、41、43、45及/或47所述之胺基酸序列。

因此，標的CAR可為對Tn-MUC1具有親和性之CAR，包含含SEQ ID NO：4、5、6及/或19-24所述之胺基酸序列的Tn-MUC1結合域。標的Tn-MUC1 CAR可進一步包含含SEQ ID NO：48所述之胺基酸序列的前導子序列。標的Tn-MUC1 CAR可進一步包含含SEQ ID NO：13所述之胺基酸序列的鉸鏈域。標的Tn-MUC1 CAR可進一步包含含SEQ ID NO：7或15所述之胺基酸序列的跨膜域。標的Tn-MUC1 CAR可進一步包含含SEQ ID NO：9、17、25、28、32、34或36所述之胺基酸序列的共刺激信號傳導域。標的Tn-MUC1 CAR 可進一步包含含SEQ ID NO：11或30所述之胺基酸序列的細胞內信號傳導域。標的Tn-MUC1 CAR可包含SEQ ID NO：2、39、41、43、45或47所述之胺基酸序列。

抗原結合域

CAR的抗原結合域是CAR的細胞外區域，用於結合特定標靶抗原，包括蛋白質、碳水化合物及醣脂類。在一些實施方式中，CAR包含對標靶細胞（例如，癌細胞）上的標靶抗原（例如，腫瘤相關抗原）的親和性。標靶抗原可包括與標靶細胞有關的任何類型蛋白質或其之表位。例如，CAR可包含對標靶細胞上的標靶抗原的親和性，其代表標靶細胞的特定疾病狀態。

在某些實施方式中，本發明之CAR包含結合至MUC1的抗原結合域。在某些實施方式中，抗原結合域結合醣化形式或MUC1之醣基表位。在某些實施方式中，抗原結合域對MUC1之截斷醣基表位具有特異性。在某些實施方式中，抗原結合域對Tn-MUC1具有特異性。在某些實施方式中，本發明之抗原結合域包含抗體或其片段，其結合MUC1分子或MUC1之醣基表位（Tn-MUC1）。在某些例示性實施方式中，抗原結合域為結合Tn-MUC1之scFv抗體。抗原結合域的選擇取決於標靶細胞表面上所存在的抗原的類型及數量。例如，可選擇抗原結合域以識別抗原，該抗原作為與標靶細胞之特定狀態相關的標靶細胞上之細胞表面標記。

如本文所述，對標靶細胞上特定標靶抗原具有親和性的本文CAR可包含標靶特異性結合域。在一些實施方式中，標靶特異性結合域是鼠類標靶特異性結合域，例如，標靶特異性結合域是鼠類來源的。在一些實施方式中，標靶特異性結合域是人類標靶特異性結合域，例如，標靶特異性結合域是人類來源的。在一例示性實施方式中，對標靶細胞上之Tn-MUC1具有親和性的本文CAR可包含Tn-MUC1結合域。在一些實施方式中，Tn-MUC1結合域為鼠類Tn-MUC1結合域，例如，Tn-MUC1結合域為鼠類來源的。在一些實施方式中，Tn-MUC1結合域為人源化Tn-MUC1結合域。在一些實施方式中，Tn-MUC1結合域為人類Tn-MUC1結合域，例如，Tn-MUC1結合域為人類來源的。

在一些實施方式中，Tn-MUC1結合域衍生自PCT公開號WO2008/040362所揭示之5E5抗體，該揭示內容藉由引用將其整體併入本文。因此，本文CAR包含Tn-MUC1結合域衍生自PCT公開號WO2008/040362所揭示之5E5抗體。在一些實施方式中，Tn-MUC1結合域為人源化Tn-MUC1結合域。在一些實施方式中，人源化Tn-MUC1結合域衍生自PCT公開號WO2015/159076所揭示之任一人源化5E5重鏈及輕鏈序列，該揭示內容藉由引用將其整體併入本文。因此，本文CAR包含人源化Tn-MUC1結合域衍生自PCT公開號WO2015/159076所揭示之任一人源化5E5重鏈及輕鏈序列。本文CAR可包含如本文所述之人源化Tn-MUC1結合域、任何跨膜域、可選擇地任何鉸鏈域、任何共刺激域及任何細胞內信號傳導域。

在一些實施方式中，本文CAR可對於一或多種標靶細胞上的一或多種標靶抗原具有親和性。在一些實施方式中，CAR可對於單一標靶細胞上的一或多種標靶抗原具有親和性。在此類實施方式中，CAR為雙特異性CAR或多特異性CAR。在一些實施方式中，CAR包含一或多種標靶特異性結合域，其賦予對一或多種標靶抗原的親和性。在一些實施方式中，CAR包含一或多種標靶特異性結合域，其賦予對相同標靶抗原的親和性。例如，包含對相同標靶抗原具有親和性的一或多種標靶特異性結合域的CAR可結合標靶抗原的不同表位。當CAR中存在多個標靶特異性結合域時，該等結合域可串聯排列並可透過連接子肽分開。例如，在包含二個標靶特異性結合域的CAR中，該等結合域係透多肽連接子、Fc鉸鏈區或膜鉸鏈區在單個多肽鏈上相互共價連接。

抗原結合域可包括結合抗原的任何域，且可包括，但不限於單株抗體、多株抗體、合成抗體，人類抗體、人源化抗體、非人類抗體及其等之任何片段。因此，在一實施方式中，抗原結合域部分包含哺乳動物抗體或其片段。在另一實施方式中，CAR之抗原結合域選自抗-Tn-MUC1抗體或其片段所組成之群組。在一些實施方式中，抗原結合域選自抗體、抗原結合片段（Fab）及單鏈可變片段（scFv）所組成之群組。在一些實施方式中，本發明之Tn-MUC1結合域選自Tn-MUC1-特異性抗體、Tn-MUC1-特異性Fab及Tn-MUC1-特異性scFv所組成之群組。在一實施方式中，Tn-MUC1結合域為Tn-MUC1-特異性抗體。在一實施方式中，Tn-MUC1結合域為Tn-MUC1-特異性Fab。在一實施方式中，Tn-MUC1結合域為Tn-MUC1-特異性scFv。

如本文所使用，術語「單鏈可變片段」或「scFv」為免疫球蛋白（例如，小鼠或人類）的重鏈可變區（VH）及輕鏈可變區（VL）的融合蛋白，其共價連接以形成VH::VL異源二聚體。重鏈（VH）和輕鏈（VL）直接連接或透過肽編碼的連接子或間隔子連接，其連接VH的N端與VL的C端，或連接VH的C端與VL的N端。術語「連接子」與「間隔子」在本文可互換使用。在一些實施方式中，抗原結合域（例如，Tn-MUC1結合域）包含scFv，具有從N端到C端的構型為VH-連接子-VL。在一些實施方式中，抗原結合域（例如，Tn-MUC1結合域）包含scFv，具有從N端到C端的構型為VL-連接子-VH。本領域技術人員能夠選擇適用於本發明的構型。

連接子通常富含甘胺酸以獲得可撓性，以及富含絲胺酸或蘇胺酸以獲得溶解性。連接子可連接細胞外抗原結合域的重鏈可變區及輕鏈可變區。連接子的非限制性實例已揭示於Shen et al.,Anal. Chem . 80（6）:1910-1917（2008）and WO 2014/087010，其內容藉由引用而將其整體併入本文。各種連接子序列是技術領域中已知的，包括但不限於，甘胺酸絲胺酸（GS）連接子，例如（GS）_n 、（GSGGS）_n （SEQ ID NO：52）、（GGGS）_n （SEQ ID NO：53）及（GGGGS）_n _（ SEQ ID NO：54），其中n表示至少為1的整數。例示性連接子序列可包含胺基酸序列，包括但不限於GGSG（SEQ ID NO：55）、GGSGG（SEQ ID NO：56）、GSGSG（SEQ ID NO：57）、GSGGG（SEQ ID NO：58）、GGGSG（SEQ ID NO：59）、GSSSG（SEQ ID NO：60）、GGGGS（SEQ ID NO：61）、GGGGSGGGGSGGGGS（SEQ ID NO：62）等。本領域技術人員能夠選擇適用於本發明之連接子序列。在一實施方式中，本發明之抗原結合域（例如，Tn-MUC1結合域）包含重鏈可變區（VH）及輕鏈可變區（VL），其中VH及VL被具有胺基酸序列GGGGSGGGGSGGGGS（SEQ ID NO：62）的連接子序列分開，其可由核酸序列ggtggcggtggctcgggcggtggtgggtcgggt ggcggcggatct（SEQ ID NO：63）編碼。

儘管移除恆定區並導入連接子，但scFv蛋白仍保有原始免疫球蛋白之特異性。單鏈Fv多肽抗體可由包含VH和VL編碼序列的核酸表現，如Huston, et al.（Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 85:5879-5883, 1988）中所述。亦請參見美國專利號5,091,513、5,132,405及4,956,778；及美國專利公開號20050196754及20050196754。具有抑制活性的拮抗性scFv已被敘述（參見例如，Zhao et al.,Hybridoma （ Larchmt）2008 27（6）:455-51；Peter et al.,J Cachexia Sarcopenia Muscle 2012 August 12；Shieh et al.,J Imunol 2009 183（4）:2277-85；Giomarelli et al., Thromb Haemost 2007 97（6）:955-63；Fife eta.,J Clin Invst 2006 116（8）:2252-61；Brocks et al.,Immunotechnolo gy 1997 3（3）:173-84；Moosmayer et al.,Ther Immunol 1995 2（10:31-40）。具有刺激活性的促效性scFv已被敘述（參見例如，Peter et al.,J Bioi Chem 2003 25278（38）:36740-7；Xie et al.,Nat Biotech 1997 15（8）:768-71；Ledbetter et al.,Crit Rev Immunol 1997 17（5-6）:427-55；Ho et al.,BioChim Biophys Acta 2003 1638（3）:257-66）。

如本文所使用，「Fab」係指抗體結構片段，其結合抗原但為單價且不具有Fc部分，例如，由木瓜蛋白酶消化的抗體產生二個Fab片段及一個Fc片段（例如，重（H）鏈恆定區；不與抗原結合的Fc區）。

如本文所使用，「F（ab'）2」係指藉由胃蛋白酶消化完整IgG抗體所產生的抗體片段，其中此片段具有二個抗原結合（ab'）（二價）區，其中各（ab'）區包含二個分離的胺基酸鏈，各一部分的H鏈和輕鏈（L）藉由S-S鍵連接以結合抗原，且剩餘的H鏈部分連接在一起。「F（ab'）2」片段可分成兩個獨立的Fab'片段。

在一些實例中，抗原結合域可源自最終將使用該CAR的相同物種。例如，在人類中使用，CAR的抗原結合域可包含本文他處所述之人類抗體或其片段。

在一例示性實施方式中，本發明Tn-MUC1 CAR包含Tn-MUC1結合域，例如，Tn-MUC1-特異性scFv。在一實施方式中，Tn-MUC1結合域包含SEQ ID NO：4所述之胺基酸序列。在一實施方式中，Tn-MUC1結合域藉由含SEQ ID NO：3所述之核苷酸序列的核酸序列編碼。

在一實施方式中，Tn-MUC1結合域包含含SEQ ID NO：6所述之胺基酸序列的輕鏈可變區。Tn-MUC1結合域之輕鏈可變區包含三個輕鏈互補決定區（CDR）。如本文所使用，「互補決定區」或「CDR」係指與特定抗原結合的抗原結合分子之可變鏈之區域。因此，Tn-MUC1結合域可包含輕鏈可變區，其包含含SEQ ID NO：19所述之胺基酸序列的CDR1；含SEQ ID NO：20所述之胺基酸序列的CDR2；及含SEQ ID NO：21所述之胺基酸序列的CDR3。

在一實施方式中，Tn-MUC1結合域包含含SEQ ID NO：5所述之胺基酸序列的重鏈可變區。Tn-MUC1結合域可包含重鏈可變區，其包含含SEQ ID NO：22所述之胺基酸序列的CDR1；含SEQ ID NO：23所述之胺基酸序列的CDR2；及含SEQ ID NO：24所述之胺基酸序列的CDR3。

本領域技術人員已知Tn-MUC1結合域之容許變異，同時保持特異性結合Tn-MUC1。例如，在一些實施方式中，Tn-MUC1結合域包含胺基酸序列，其對於任何SEQ ID NO：4-6及19-24所述之胺基酸序列具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%的序列同一性。

在一些實施方式中，Tn-MUC1結合域藉由含核苷酸序列之核酸序列編碼，該核苷酸序列對於SEQ ID NO：3所述之核苷酸序列具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%的序列同一性。

抗原結合域可操作地連接至CAR的另一域，例如跨膜域或共刺激信號傳導域，二者序述於本文他處。在一實施方式中，編碼抗原結合域之核酸可操作地連接至編碼跨膜域之核酸及編碼共刺激信號傳導域之核酸。

本文所述之抗原結合域，例如結合Tn-MUC1之抗體或其片段，其可與可包括於CAR中的任何本文所述之跨膜域、任何本文所述之細胞內域或細胞質域或任何本文所述之其他域組合。

跨膜域

關於跨膜域，本發明之CAR（例如，Tn-MUC1 CAR）可設計為包含一跨膜域，該跨膜域係將CAR之抗原結合域連接至細胞內域。標的CAR之跨膜域是能夠跨越細胞（例如，免疫細胞或其前體）之質膜的區域。跨膜域是用於插入細胞膜中，例如，真核細胞膜中。在一些實施方式中，跨膜域介於CAR的抗原結合域和細胞內域之間。

在一實施方式中，跨膜域與CAR中一或多種域自然聯結。在一些情況下，可選擇跨膜域或藉由胺基酸取代修飾跨膜域以避免此域與相同或不同表面膜蛋白的跨膜域結合，最小化與受體複合物其他成員的相互作用。

跨膜域可源自天然來源或合成來源。在天然來源時，該域可源自任何膜結合蛋白或跨膜蛋白，例如第1型跨膜蛋白。在合成來源時，跨膜域可為促進CAR插入細胞膜的任何人工序列，例如人工疏水性序列。在本發明中特別使用之跨膜區的實例包括，但不限於源自（即至少包含下列之跨膜區）T細胞受體之α、β或ζ鏈、CD28、CD3 ε、CD45、CD4、CD5、CD7、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134（OX-40）、CD137（4-1BB）、CD154（CD40L）、類鐸受體1（TLR1）、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8及TLR9。在一些實施方式中，跨膜域可為合成的，在此種情況下，它將主要包含疏水性殘基，例如白胺酸和纈胺酸。在某些例示性實施方式中，在合成跨膜域的各末端會發現苯丙胺酸、色胺酸及纈胺酸的三聯體。

本文所述的跨膜域可與可包括於標的CAR中的本文所述的任何抗原結合域、本文所述的任何共刺激信號傳導域、本文所述的任何細胞內信號傳導域或本文所述的任何其他域組合。

在一些實施方式中，跨膜域進一步包含鉸鏈區。本發明之標的CAR亦可包括鉸鏈區，CAR之鉸鏈區為親水性區域，其位於抗原結合域與跨膜域之間。在一些實施方式中，此域促進CAR進行適當的蛋白質折疊。鉸鏈區為CAR的可選擇的組件，鉸鏈區可包括選自抗體之Fc片段、抗體之鉸鏈區、抗體之CH2區、抗體之CH3區、人工鉸鏈序列或其等之組合的域。鉸鏈區之實例包括，但不限於CD8a鉸鏈、可小至三個甘胺酸（Gly）的多肽製人工鉸鏈及IgG之CH1及CH3域（例如人類IgG4）。

在一些實施方式中，本文之標的CAR包括連接抗原結合域及跨膜域的鉸鏈區，而其依次連接至細胞內域。鉸鏈區較佳能夠支持抗原結合域辨識並結合標靶細胞上的標靶抗原（參見例如，Hudecek et al.,Cancer Immunol.Res. （2015）3（2）：125-135）。在一些實施方式中，鉸鏈區是可撓性域，因此允許抗原結合域具有最佳辨識的結構，來辨識如腫瘤細胞之細胞上標靶抗原的特定結構及密度。鉸鏈區的可撓性使鉸鏈區域適應於許多不同的構形。

在一些實施方式中，鉸鏈區為免疫球蛋白重鏈鉸鏈區。在一些實施方式中，鉸鏈區為源自受體之鉸鏈區多肽（例如，CD8-來源鉸鏈區）。

鉸鏈區可具有長度約4個胺基酸至約50個胺基酸，例如，約4個胺基酸至約10個胺基酸、約10個胺基酸至約15個胺基酸、約15個胺基酸至約20個胺基酸、約20個胺基酸至約25個胺基酸、約25個胺基酸至約30個胺基酸、約30個胺基酸至約40個胺基酸或約40個胺基酸至約50個胺基酸。

適當的鉸鏈區可很容易地選擇並可為任何適當長度之數量，例如1個胺基酸（例如，Gly）至20個胺基酸、2個胺基酸至15個胺基酸、3個胺基酸至12個胺基酸，包括4個胺基酸至10個胺基酸、5個胺基酸至9個胺基酸、6個胺基酸至8個胺基酸或7個胺基酸至8個胺基酸，且可為1、2、3、4、5、6或7個胺基酸。

例如，鉸鏈區包括甘胺酸聚合物（（G）_n ）、甘胺酸-絲胺酸聚合物（包括例如（GS）_n 、（GSGGS）_n （SEQ ID NO：52）及（GGGS）_n （SEQ ID NO：53），其中n為至少是1的整數）、甘胺酸-丙胺酸聚合物、丙胺酸-絲胺酸聚合物，及本領域已知的其它可撓性連接子。可使用甘胺酸及甘胺酸-絲胺酸聚合物；Gly和Ser二者都是相對非結構化的，因此可作為組分之間的中性繫鏈（neutral tether）。可使用甘胺酸聚合物；甚至與丙胺酸相比，甘胺酸提供顯著更多的phi-psi空間，且其比具有較長側鏈的殘基受到更少的限制（參見例如，Scheraga,Rev. Computational. Chem. （ 1992）2：73-142）。例示性鉸鏈區可包含胺基酸序列，包括但不限於GGSG（SEQ ID NO：55）、GGSGG（SEQ ID NO：56）、GSGSG（SEQ ID NO：57）、GSGGG（SEQ ID NO：58）、GGGSG（SEQ ID NO：59）、GSSSG（SEQ ID NO：60）等。

在一些實施方式中，鉸鏈區為免疫球蛋白重鏈鉸鏈區。免疫球蛋白鉸鏈區胺基酸序列為技術領域中已知的，參見例如，Tan et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA （ 1990）87（1）:162-166；及Huck et al.,Nucleic Acids Res. （ 1986）14（4）：1779-1789。作為非限制性實例，免疫球蛋白鉸鏈區可包括下列胺基酸序列的其中之一：DKTHT（SEQ ID NO：64）；CPPC（SEQ ID NO：65）；CPEPKSCDTPPPCPR（SEQ ID NO：66）（參見例如，Glaser et al.,J. Biol. Chem. （ 2005）280:41494-41503）；ELKTPLGDTTHT（SEQ ID NO：67）；KSCDKTHTCP（SEQ ID NO：68）；KCCVDCP（SEQ ID NO：69）；KYGPPCP（SEQ ID NO：70）；EPKSCDKTHTCPPCP（SEQ ID NO：71）（人類IgG1鉸鏈）；ERKCCVECPPCP（SEQ ID NO：72）（人類IgG2鉸鏈）；ELKTPLGDTTHTCPRCP（SEQ ID NO：73）（人類IgG3鉸鏈）；SPNMVPHAHHAQ（SEQ ID NO：74）（人類IgG4鉸鏈）；等。

鉸鏈區可包含人類IgG1、IgG2、IgG3或IgG4鉸鏈區之胺基酸序列。在一實施方式中，鉸鏈區與野生型（自然發生）鉸鏈區相比可包括一或多個胺基酸取代及/或插入及/或刪除，例如，人類IgG1鉸鏈的His229可以Tyr取代，因此鉸鏈區包含序列EPKSCDKTYTCPPCP（SEQ ID NO：75）；參見例如，Yan et al.,J. Biol. Chem. （ 2012）287：5891-5897。在一實施方式中，鉸鏈區可包含源自人類CD8之胺基酸序列或其之變體。

在一實施方式中，跨膜域包含CD8α跨膜域。在一些實施方式中，標的CAR包含含SEQ ID NO：7所述之胺基酸序列的CD8α跨膜域，該胺基酸序列可藉由含SEQ ID NO：8所述之核苷酸序列的核酸序列所編碼。

在另一實施方式中，標的CAR包含CD8α 鉸鏈域及CD8α跨膜域。在一實施方式中，CD8α鉸鏈域包含SEQ ID NO：13所述之胺基酸序列，該胺基酸序列可藉由含SEQ ID NO：14所述之核苷酸序列的核酸序列所編碼。

在一實施方式中，跨膜域包含CD28跨膜域。在一些實施方式中，標的CAR包含含SEQ ID NO：15所述之胺基酸序列的CD28跨膜域，該胺基酸序列可藉由含SEQ ID NO：16所述之核苷酸序列的核酸序列所編碼。

本領域技術人員已知跨膜及/或鉸鏈域之容許變異，同時保持其預期功能。例如，在一些實施方式中，跨膜域或鉸鏈域包含胺基酸序列，其對於任何SEQ ID NO：7、13及15所述之胺基酸序列具有至少至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%的序列同一性。例如，在一些實施方式中，跨膜域或鉸鏈域藉由含核苷酸序列之核酸序列所編碼，該核苷酸序列對於任何SEQ ID NO：8、14及16所述之核苷酸序列具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%的序列同一性。

跨膜域可與任何鉸鏈域組合及/或可包含本文所述之一或多個跨膜域。

本文所述之跨膜域，例如T細胞受體之α、β或ζ鏈的跨膜區、CD28、CD2、CD3 ε、CD45、CD4、CD5、CD7、CD8、CD9、CD 16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134（OX-40）、CD137（4-1BB）、CD154（CD40L）、CD278（ICOS）、CD357（GITR）、類鐸受體1（TLR1）、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8及TLR9，可與可被包括於CAR之本文所述之任何抗原結合域、本文所述之任何共刺激信號傳導域或細胞內域或細胞質域或本文所述之任何其他域組合。

在一實施方式中，跨膜域可為合成的，在此種情況下，它將主要包含疏水性殘基，例如白胺酸和纈胺酸。在例示性實施方式中，在合成跨膜域的各末端會發現苯丙胺酸、色胺酸及纈胺酸的三聯體。

在一些實施方式中，標的CAR在CAR之細胞外域與跨膜域之間，或CAR之細胞內域與跨膜域之間，可進一步包含間隔子域。如本文所使用，術語「間隔子域」通常意指具有將跨膜域連接至多肽鏈中的細胞外域或細胞內域之功能的任何寡肽或多肽。間隔子域可包含最多300個胺基酸，例如10至100個胺基酸、或25至50個胺基酸。在一些實施方式中，間隔子域可為短寡肽或多肽連接子，例如長度為2至10個胺基酸。例如，甘胺酸-絲胺酸雙聯體在標的CAR的跨膜域與細胞內信號傳導域之間提供特別適當的連接子。

因此，本文之標的CAR可包含本文所述之任何跨膜域、鉸鏈域或間隔子域。

細胞內域

本發明之標的CAR亦可包括細胞內域。CAR之細胞內域負責活化表現CAR的細胞（例如免疫細胞）的至少一種效用功能。細胞內域轉導效用功能信號並引導該細胞（例如免疫細胞）執行其特化功能，例如，損傷及/或摧毀標靶細胞。

CAR的細胞內域或其他細胞質域負責活化表現CAR的細胞。用於本發明的細胞內域之實例包括，但不限於表面受體的細胞質部分、共刺激分子及協同作用以在T細胞中啟動訊息傳導的任何分子，以及這些元件的任何衍生物或變體及具有相同功能的任何合成序列。

在某些實施方式中，細胞內域包含共刺激信號傳導域。在某些實施方式中，細胞內域包含細胞內信號傳導域。在某些實施方式中，細胞內域包含共刺激信號傳導域及細胞內信號傳導域。在某些實施方式中，細胞內域包含4-1BB及CD3 ζ。在某些實施方式中，共刺激信號傳導域包含4-1BB。在某些實施方式中，細胞內信號傳導域包含CD3 ζ。

在一實施方式中，CAR之細胞內域包含共刺激信號傳導域，其包括一或多種共刺激分子的任何部分，例如至少一種信號傳導域，來自CD2、CD3、CD8、CD27、CD28、OX40、ICOS、4-1BB、PD-1及其等之任何衍生物或變體，具有相同功能的任何合成序列及其等之任何組合。

細胞內信號傳導域之實例包括，但不限於T細胞受體複合物之ζ鏈或任何其之同源物，例如，η鏈、FcsRIγ及β鏈、MB 1 （Iga）鏈、B29（Ig）鏈等、人類CD3 ζ鏈、CD3多肽（Δ、δ及ε）、syk家族酪胺酸激酶（Syk、ZAP 70等）、src家族酪胺酸激酶（Lck、Fyn、Lyn等）及其他涉及T細胞轉導之分子，例如CD2、CD5及CD28。在一實施方式中，細胞內信號傳導域可為人類CD3 ζ鏈、FcyRIII、FcsRI、Fc受體之胞質尾、攜帶細胞質受體之免疫受體酪胺酸系活化基序（ITAM）及其等之組合。

細胞內域之其他實例包括來自一或多種分子或受體之片段或域，該分子或受體包括，但不限於TCR、CD3 ζ、CD3 γ、CD3 δ、CD3 ε、CD86、一般FcR γ、FcR β（Fc Ε Rib）、CD79a、CD79b、Fc γ R11a、DAP10、DAP12、T細胞受體（TCR）、CD8、CD27、CD28、4-1BB（CD137）、OX9、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、KIR家族蛋白質、淋巴細胞功能相關抗原-1（LFA-1）、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、特異性結合CD83之配體、CD5、ICAM-1、GITR、BAFFR、HVEM（LIGHTR）、SLAMF7、NKp80（KLRF1）、CD127、CD160、CD19、CD4、CD8α、CD8β、IL2R β、IL2R γ、IL7R α、ITGA4、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CD1Id、ITGAE、CD103、ITGAL、CD11a、LFA-1、ITGAM、CD lib、ITGAX、CD11c、ITGBl、CD29、ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、TNFR2、TRANCE/RANKL、DNAM1（CD226）、SLAMF4（CD244、2B4）、CD84、CD96（Tactile）、CEACAM1、CRTAM、Ly9（CD229）、CD160（BY55）、PSGL1、CD100（SEMA4D）、CD69、SLAMF6（NTB-A、Lyl08）、SLAM（SLAMF1、CD150、IPO-3）、BLAME（SLAMF8）、SELPLG（CD 162）、LTBR、LAT、GADS、SLP-76、PAG/Cbp、NKp44、NKp30、NKp46、NKG2D、類鐸受體1（TLR1）、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9、本文所述其他共刺激分子、任何衍生物、變體或其片段、具有相同功能的共刺激分子之任何合成序列、及其等之任何組合。

細胞內域另外的實例包括，但不限於數種類型的不同其他免疫信號傳導受體的細胞內信號傳導域，其包括，但不限於第一代、第二代和第三代T細胞信號傳導蛋白，包括CD3、B7家族共刺激，及腫瘤壞死因子受體（Tumor Necrosis Factor Receptor ，TNFR）超家族受體（參見例如，Park and Brentjens, J. Clin. Oncol.（2015）33（6）：651-653）。另外，細胞內信號傳導域可包括經NK及NKT細胞使用之信號傳導域（參見例如，Hermanson and Kaufman, Front. Immunol.（2015）6：195），例如NKp30（B7-H6）（參見例如，Zhang et al.,J. Immunol .（2012）189（5）：2290-2299）及DAP 12（參見例如，Topfer et al.,J. Immunol .（2015）194（7）：3201-3212）、NKG2D、NKp44、NKp46、DAP10及CD3z之信號傳導域。

適用於本發明標的CAR之細胞內信號傳導域包括任何所欲之信號傳導域，該訊息傳遞域反應CAR之活化（即，被抗原及二聚劑活化）而提供獨特且可檢測之信號（例如，細胞一或多種細胞激素的產量增加、標靶基因的轉錄變化、蛋白質活性的改變；細胞行為的變化：例如細胞死亡、細胞增殖、細胞分化、細胞存活、細胞信號傳導反應的調節等）。在一些實施方式中，細胞內信號傳導域包括至少一個（例如，一個，二個，三個，四個，五個，六個等）如下所述的ITAM基序。在一些實施方式中，細胞內信號傳導域包括DAP10/CD28型信號傳導鏈。在一些實施方式中，細胞內信號傳導域並非共價附接至膜結合的CAR，而是散布在細胞質中。

適用於本發明標的CAR的細胞內信號傳導域包括含免疫受體酪胺酸系活化基序（ITAM）之細胞內信號傳導多肽。在一些實施方式中，ITAM基序在細胞內信號傳導域中被重複二次，其中ITAM基序的第一及第二次重複相互間隔6至8個胺基酸。在一實施方式中，標的CAR之細胞內信號傳導域包含3個ITAM基序。在一些實施方式中，細胞內信號傳導域包括人類免疫球蛋白受體之信號傳導域，其包含免疫受體酪胺酸系活化基序（ITAMs），例如，但不限於Fc γ RI、Fc γ RIIA、Fc γ RIIC、Fc γ RIIIA、FcRL5（參見例如，Gillis et al., Front.（2014）Immunol. 5:254）。

適當的細胞內信號傳導域可為含源自多肽的ITAM基序部分，該多肽含有ITAM基序。例如，適當的細胞內信號傳導域可為來自任何含ITAM基序之蛋白質的含ITAM基序之域。因此，適當的細胞內信號傳導域並不需包含源自它的整個蛋白質的完整序列。含ITAM基序的適當多肽之實例包括，但不限於：DAP12、FCER1G（Fcε受體I γ鏈）、CD3D（CD3 δ）、CD3E（CD3 ε）、CD3G（CD3 γ）、CD3Z（CD3 ζ）及CD79A（抗原受體複合體相關蛋白α鏈）。

在一實施方式中，細胞內信號傳導域源自DAP12（亦稱為TYROBP；TYRO蛋白質酪胺酸激酶結合蛋白；KARAP；PLOSL；DNAX-活化蛋白12；KAR相關蛋白；TYRO蛋白酪胺酸激酶結合蛋白；殺手細胞活化受體相關蛋白；殺手細胞活化受體相關蛋白質；等等）。在一實施方式中，細胞內信號傳導域源自FCER1G（亦稱為FCRG；Fc ε受體I γ鏈；Fc受體 γ鏈；fc-ε RI-γ；fcR γ；fceR1 γ；高親和性免疫球蛋白ε受體次單元γ；免疫球蛋白E受體，高親和性，γ鏈；等等）。在一實施方式中，細胞內信號傳導域源自T-細胞表面醣蛋白CD3 δ鏈（亦稱為CD3D；CD3-Δ；T3D；CD3抗原，δ次單元；CD3 δ；CD3d抗原，δ多肽（TiT3複合物）；OKT3，δ鏈；T-細胞受體T3 δ鏈；T-細胞表面醣蛋白CD3 δ鏈；等等）。在一實施方式中，細胞內信號傳導域源自T-細胞表面醣蛋白CD3 ε鏈（亦稱為CD3e，T-細胞表面抗原T3/Leu-4 ε鏈，T-細胞表面醣蛋白CD3 ε鏈，AI504783，CD3，CD3ε，T3e等）。在一實施方式中，細胞內信號傳導域源自T-細胞表面醣蛋白CD3 γ鏈（亦稱為CD3G，T-細胞受體T3 γ鏈，CD3-Γ，T3G，γ多肽（TiT3複合物）等）。在一實施方式中，細胞內信號傳導域源自T-細胞表面醣蛋白CD3 ζ鏈（亦稱為CD3Z，T-細胞受體T3 ζ鏈，CD247，CD3-Ζ，CD3H，CD3Q，T3Z，TCRZ等）。在一實施方式中，細胞內信號傳導域源自CD79A（亦稱為B-細胞抗原受體複合物相關蛋白質α鏈；CD79a抗原（免疫球蛋白相關α）；MB-1膜醣蛋白；Ig-α；與膜結合的免疫球蛋白相關蛋白質；表面IgM相關蛋白質；等等）。在一實施方式中，適用於本文之標的CAR的細胞內信號傳導域包括DAP10/CD28型信號傳導鏈。在一實施方式中，適用於本文之標的CAR的細胞內信號傳導域包括ZAP70多肽。在一些實施方式中，細胞內信號傳導域包括TCR ζ、FcR γ、FcR β、CD3 γ、CD3 δ、CD3 ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b或CD66d之細胞質信號傳導域。在一實施方式中，CAR中的細胞內信號傳導域包括人類CD3 ζ之細胞質信號傳導域。

雖然通常可使用整個細胞內信號傳導，但在許多情況下不必使用整個鏈。在使用細胞內信號傳導域之截短部分的情況下，可使用此類截短部分來代替完整的鏈，只要其長度足夠轉導效用功能信號。細胞內信號傳導域包括足以轉導效用功能信號的細胞內信號傳導域的任何截短部分。

本文所述之細胞內信號傳導域可組合本文所述之任何共刺激信號傳導域本文所述之任何抗原結合域、本文所述之任何跨膜域或本文所述之任何可包括於CAR之其他域。

此外，適用於標的CAR的變體細胞內信號傳導域為技術領域中已知的。YMFM基序被發現於ICOS且為一種SH2結合基序，其補充了PI3K之p85及p50α次單元，導致增強的AKT信號傳導。參見例如，Simpson et al.（2010）Curr. Opin. Immunol. , 22:326-332。在一實施方式中，可生成CD28細胞內域變體以包含YMFM基序。

在一實施方式中，標的CAR之細胞內域包含含SEQ ID NO：9所述之胺基酸序列的4-1BB共刺激域，該胺基酸序列可藉由含SEQ ID NO：10所述之核苷酸序列的核酸序列編碼。在一實施方式中，標的CAR之細胞內域包含含SEQ ID NO：17所述之胺基酸序列的CD28共刺激域，該胺基酸序列可藉由含SEQ ID NO：18所述之核苷酸序列的核酸序列編碼。在一實施方式中，標的CAR之細胞內域包含含SEQ ID NO：25所述之胺基酸序列的ICOS共刺激域，該胺基酸序列可藉由含SEQ ID NO：26或27所述之核苷酸序列的核酸序列編碼。在一實施方式中，標的CAR之細胞內域包含含SEQ ID NO：28所述之胺基酸序列的CD2共刺激域，該胺基酸序列可藉由含SEQ ID NO：29所述之核苷酸序列的核酸序列編碼。在一實施方式中，標的CAR之細胞內域包含含SEQ ID NO：32所述之胺基酸序列的CD28 YMFM變體共刺激域，該胺基酸序列可藉由含SEQ ID NO：33所述之核苷酸序列的核酸序列編碼。在一實施方式中，標的CAR之細胞內域包含含SEQ ID NO：34所述之胺基酸序列的CD27共刺激域，該胺基酸序列可藉由含SEQ ID NO：35所述之核苷酸序列的核酸序列編碼。在一實施方式中，標的CAR之細胞內域包含含SEQ ID NO：36所述之胺基酸序列的OX40共刺激域，該胺基酸序列可藉由含SEQ ID NO：37所述之核苷酸序列的核酸序列編碼。

在一實施方式中，標的CAR之細胞內域包含含SEQ ID NO：11或30所述之胺基酸序列的CD3 ζ細胞內信號傳導域，該胺基酸序列可藉由含SEQ ID NO：12或31所述之核苷酸序列的核酸序列編碼。

本領域技術人員已知細胞內域之容許變異，同時保持其特定功能。例如，在一些實施方式中，細胞內域包含胺基酸序列，其對於任何SEQ ID NO：9、11、17、25、28、32、34或36所述之胺基酸序列具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%的序列同一性。例如，在一些實施方式中，細胞內域經核酸序列所編碼，該核酸序列包含對於任何SEQ ID NO：10、12、18、26、27、29、31、33、35或37所述之核苷酸序列具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%序列同一性的核苷酸序列。

在一實施方式中，標的CAR之細胞內域包含ICOS共刺激域及CD3 ζ細胞內信號傳導域。在一實施方式中，標的CAR之細胞內域包含CD28共刺激域及CD3 ζ細胞內信號傳導域。在一實施方式中，標的CAR之細胞內域包含CD28 YMFM變體共刺激域及CD3 ζ細胞內信號傳導域。在一實施方式中，標的CAR之細胞內域包含CD27共刺激域及CD3 ζ細胞內信號傳導域。在一實施方式中，標的CAR之細胞內域包含OX40共刺激域及CD3 ζ細胞內信號傳導域。在一例示性實施方式中，標的CAR之細胞內域包含4-1BB共刺激域及CD3 ζ細胞內信號傳導域。在一例示性實施方式中，標的CAR之細胞內域包含CD2共刺激域及CD3 ζ細胞內信號傳導域。

CAR序列

本發明之標的CAR可為對MUC1（例如，MUC1）具有親和性之CAR。在一實施方式中，本發明之Tn-MUC1 CAR包含4-1BB共刺激域及含SEQ ID NO：2所述之胺基酸序列的CD3 ζ細胞內信號傳導域，該胺基酸序列可藉由含SEQ ID NO：1所述之核苷酸序列的核酸序列編碼。在一實施方式中，本發明之Tn-MUC1 CAR包含CD28共刺激域及含SEQ ID NO：39所述之胺基酸序列的CD3 ζ細胞內信號傳導域，該胺基酸序列可藉由含SEQ ID NO：38所述之核苷酸序列的核酸序列編碼。在一實施方式中，本發明之Tn-MUC1 CAR包含CD28 YMFM變體共刺激域及含SEQ ID NO：41所述之胺基酸序列的CD3 ζ細胞內信號傳導域，該胺基酸序列可藉由含SEQ ID NO：40所述之核苷酸序列的核酸序列編碼。在一實施方式中，本發明之Tn-MUC1 CAR包含CD27共刺激域及含SEQ ID NO：43所述之胺基酸序列的CD3 ζ細胞內信號傳導域，該胺基酸序列可藉由含SEQ ID NO：42所述之核苷酸序列的核酸序列編碼。在一實施方式中，本發明之Tn-MUC1 CAR包含OX40共刺激域及含SEQ ID NO：45所述之胺基酸序列的CD3 ζ細胞內信號傳導域，該胺基酸序列可藉由含SEQ ID NO：44所述之核苷酸序列的核酸序列編碼。在一實施方式中，本發明之Tn-MUC1 CAR包含CD2共刺激域及含SEQ ID NO：47所述之胺基酸序列的CD3 ζ細胞內信號傳導域，該胺基酸序列可藉由含SEQ ID NO：46所述之核苷酸序列的核酸序列編碼。

本領域技術人員已知CAR之容許變異，同時保持其特定功能。例如，在一些實施方式中，CAR包含對於任何SEQ ID NO：2、39、41、43、45或47所述之胺基酸序列具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%序列同一性的胺基酸序列。例如，在一些實施方式中，CAR藉由含核苷酸序列之核酸序列所編碼，該核苷酸序列對於任何SEQ ID NO：1、38、40、42、44或46所述之核苷酸序列具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%的序列同一性。

在一些實施方式中，本發明之標的CAR包含MUC1結合域及跨膜域。在一實施方式中，CAR包含MUC1結合域及跨膜域，其中跨膜域包含CD8鉸鏈區。在一實施方式中，CAR包含MUC1結合域及跨膜域，其中跨膜域包含CD8α跨膜域。在一實施方式中，CAR包含MUC1結合域及跨膜域，其中跨膜域包含CD8鉸鏈區及CD8α跨膜域。

在一些實施方式中，本發明之標的CAR包含MUC1結合域、跨膜域及細胞內域。在一實施方式中，CAR包含Tn-MUC1結合域、跨膜域及細胞內域。在一實施方式中，CAR包含Tn-MUC1結合域、跨膜域及含4-1BB共刺激域及CD3 ζ域之細胞內域。在一實施方式中，CAR包含Tn-MUC1結合域、跨膜域及含CD28共刺激域及CD3 ζ域之細胞內域。在一實施方式中，CAR包含Tn-MUC1結合域、跨膜域及含CD28 YMFM 變體共刺激域及CD3 ζ域之細胞內域。在一實施方式中，CAR包含Tn-MUC1結合域、跨膜域及含CD27域及CD3 ζ域之細胞內域。在一實施方式中，CAR包含Tn-MUC1結合域、跨膜域及含OX40域及CD3 ζ域之細胞內域。在一實施方式中，CAR包含Tn-MUC1結合域、跨膜域及含CD2域及CD3 ζ域之細胞內域。

因此，本發明提供一種經修飾之免疫細胞或其前驅細胞，例如，經修飾之T細胞、經修飾之NK細胞、經修飾之NKT細胞、其包含對本文所述MUC1具有親和性的嵌合抗原受體（CAR）。

人類抗體

CAR之抗原結合域以包含人類抗體或其片段為較佳。全人類抗體對人類受試者的治療處理來說是特別理想的，人類抗體可藉由本領域已知的各種方法製備，包括使用源自人類免疫球蛋白序列抗體庫的噬菌體顯現法，包括對這些技術的改進方法。亦參見美國專利號4,444,887及4,716,111；及PCT公開號WO 98/46645、WO 98/50433、WO 98/24893、WO 98/16654、WO 96/34096、WO 96/33735及WO 91/10741，其等各藉由引用全部內容而併入本文。

人類抗體亦可使用不能表現功能性內源免疫球蛋白但可以表現人類免疫球蛋白基因的轉基因小鼠來產生。例如，人類重鏈和輕鏈免疫球蛋白基因複合物可以隨機導入，或藉由同源重組導入小鼠胚胎幹細胞中。或者，除了人類重鏈和輕鏈基因之外，可將人類可變區、恆定區及多樣性區導入小鼠胚胎幹細胞中。小鼠重鏈和輕鏈免疫球蛋白基因可以同源重組分別或同時導入人類免疫球蛋白基因座而成為無功能。例如，已述及嵌合及種系（germ-line）突變小鼠中抗體重鏈連接區（heavy chain joining region，JH）基因的同型合子的刪除，會導致內源抗體產生的完全抑制。將經修飾的胚胎幹細胞擴增，並將其顯微注射到囊胚中以產生嵌合小鼠，然後繁殖嵌合小鼠以產生表現人類抗體的同型合子子代。以選定的抗原，例如本發明多肽的全部或部分，以正常方式使轉基因小鼠免疫。可使用常規融合瘤技術從被免疫的轉基因小鼠中獲得針對所選目標的抗體。轉基因小鼠所攜帶的人類免疫球蛋白轉基因會在B細胞分化期間重排，隨後進行類型轉換（class switching）和體細胞突變。因此，使用這種技術，可以產生治療上有用的IgG、IgA、IgM及IgE抗體，包括但不限於IgG1（γ1）和IgG3。關於用於產生人類抗體的此技術概述，參見Lonberg and Huszar（Int. Rev. Immunol., 13:65-93（1995））。關於用於產生人類抗體和人類單株抗體的此技術詳細討論及用於產生此類抗體的協定，參見例如PCT公開號WO 98/24893、WO 96/34096及WO 96/33735；及美國專利號5,413,923、5,625,126、5,633,425、5,569,825、5,661,016、5,545,806、5,814,318、及5,939,598，其等各自藉由引用而整體併入本文。此外，諸如Abgenix,Inc.（Freemont，CA）及Genpharm（San Jose，CA）等公司從事使用與上述類似的技術可提供針對所選抗原的人類抗體。對於在種系突變小鼠中轉移人類種系免疫球蛋白基因陣列將導致其在抗原攻擊後產生人類抗體的特定討論，參見例如，Jakobovits et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA , 90:2551（1993）；Jakobovits et al., Nature, 362:255-258（1993）；Bruggermann et al.,Year in Immunol ., 7:33（1993）；及Duchosal et al.,Nature , 355:258（1992）。

人類抗體亦可源自噬菌體顯現庫（Hoogenboom et al.,J.Mol.Biol.,227：381（1991）、Marks etal.,J.Mol.Biol.,222：581-597（1991）、Vaughan et al.,Nature Biotech.,14：309（1996））。噬菌體顯現技術（McCafferty et al.,Nature,348：552-553（1990））可用於從未免疫供體的免疫球蛋白可變（V）域基因庫中活體外產生人類抗體及抗體片段。根據此技術，以符合讀取框的方式，將抗體可變V域的基因轉殖（cloned in-frame）到絲狀噬菌體（例如M13或fd）的主要或次要外殼蛋白基因中，並在噬菌體顆粒的表面顯現出功能性抗體片段。因為絲狀顆粒所含有噬菌體基因體單股DNA複本，基於抗體功能特性所的選擇亦造成選擇編碼呈現這些特性之抗體的基因，因此，噬菌體模擬出B細胞的某些特性。噬菌體顯現可以多種形式進行，對於這些技術的回顧，參見例如Johnson, Kevin S, and Chiswell, David J., Current Opinion in Structural Biology 3:564-571（1993）。V-基因片段的多種來源可用於噬菌體顯現，Clackson et al.,Nature , 352:624-628（1991）從源自未免疫小鼠脾臟的V-基因的小隨機組合庫中分離出抗㗁唑酮抗體的多樣化陣列。依據Marks et al.,J. Mol. Biol ., 222:581-597（1991）,或Griffith et al.,EMBO J ., 12:725-734（1993）所述技術，可建構來自未免疫的人類供體的V基因庫，並可實質上分離針對不同系列抗原（包括自體抗原）的抗體。亦參見美國專利號5,565,332及5,573,905，其等各藉由引用而整體併入本文。

人類抗體亦可藉由活體外活化的B細胞產生（參見美國專利號5,567,610及5,229,275，其等各藉由引用而整體併入本文）。人類抗體亦可使用融合瘤技術在體外產生，例如，但不限於Roder等人所描述的技術（Methods Enzymol .,121：140-167（1986））。

經修飾之免疫細胞

本發明提供一種包含標的CAR的經修飾之免疫細胞或其前驅細胞（例如，經修飾之T細胞、經修飾之NK細胞、經修飾之NKT細胞），因此，此類經修飾之細胞具有經CAR指導在其中表現的特異性。例如，含TnMUC1 CAR的本發明經修飾之細胞擁有對標靶細胞上之MUC1的特異性。

可預想包含CAR之任何經修飾之細胞，而該CAR包含本文所述之任何抗原結合域、任何鉸鏈、任何跨膜域、任何細胞內共刺激域及任何細胞內信號傳導域，並鑑於本公開內容，本領域技術人員可易於理解和製造。

在一些實施方式中，經修飾之細胞為免疫細胞或其前驅細胞。在一例示性實施方式中，經修飾之細胞為T細胞。在一例示性實施方式中，經修飾之細胞為自體細胞。在一例示性實施方式中，經修飾之細胞為自體免疫細胞或其前驅細胞。在一例示性實施方式中，經修飾之細胞為自體T細胞。

核酸及表現載體

本發明提供一種編碼對MUC1（例如，Tn-MUC1）具有親和性之CAR的核酸。如本文所述，標的CAR包含抗原結合域（例如，MUC1結合域）、跨膜域及細胞內域，因此，本發明提供一種編碼抗原結合域（例如，MUC1結合域）、跨膜域及標的CAR之細胞內域的核酸。

在一例示性實施方式中，編碼本發明MUC1 CAR之核酸系藉由含SEQ ID NOs：1、38、40、42、44或46所述之核苷酸序列的核酸序列編碼。

在一些實施方式中，本揭示之核酸可操作地連接至轉錄控制元件，例如，啟動子及增強子等。適當的啟動子及增強子元件為本領域技術人員所知。

用於在細菌細胞中表現，適當的啟動子包括，但不限於lacI、lacZ、T3、T7、gpt、λ（lambda）P及trc。用於在真核細胞中表現，適當的啟動子包括，但不限於輕鏈及/或重鏈免疫球蛋白基因啟動子及增強子元件；細胞巨大病毒立即早期啟動子；單純皰疹病毒胸苷激酶啟動子；早期及晚期SV40啟動子；存在於反轉錄病毒的長末端重複序列中的啟動子；小鼠金屬硫蛋白-I啟動子；及各種技術已知的組織特定啟動子。適當的可逆啟動子，包括可逆誘導啟動子為技術領域中已知的。此類可逆啟動子可從許多生物中分離或衍生，例如，從真核生物和原核生物。技術領域中已熟知將源自第一生物的可逆啟動子的修飾用於第二生物，例如，第一原核生物及第二真核生物、第一個真核生物及第二個真核生物等等。此類可逆啟動子及基於此類可逆啟動子之系統，而且包含額外控制蛋白質，包括，但不限於醇調節啟動子（例如，醇去氫酶I（alcA）基因啟動子、對醇轉活化子（transactivator）蛋白質（A1cR）有反應之啟動子等）、四環素調節的啟動子（例如，包括TetActivators、TetON、TetOFF等之啟動子系統）、激素調節啟動子（例如，大鼠醣皮質素受體啟動子系統、人類雌激素受體啟動子系統、類視色素（retinoid）啟動子系統、甲狀腺啟動子系統、蛻皮激素（ecdysone）啟動子系統、美服培酮（mifepristone）啟動子系統等）、金屬調節啟動子（例如，金屬硫蛋白啟動子系統等）、致病性相關調節啟動子（例如，水楊酸調節啟動子、乙烯調節啟動子、苯并噻二唑調節啟動子等）、溫度調節啟動子（例如，熱休克誘導啟動子（例如，HSP-70、HSP-90、大豆熱休克啟動子等）、光調節啟動子、合成誘導啟動子等。

在一些實施方式中，啟動子為CD8細胞-特異性啟動子、CD4細胞-特異性啟動子、嗜中性球-特異性啟動子或NK-特異性啟動子，例如，可使用CD4基因啟動子；參見例如，Salmon et al.Proc. Natl. Acad. Sci .USA （1993）90:7739；及Marodon et al.（2003）Blood 101:3416。如另一實例，可使用CD8基因啟動子。NK細胞-特異性表現可藉由使用NcrI（p46）啟動子而達成；參見例如，Eckelhart et al.Blood （2011）117:1565。

用於在酵母菌細胞中表現，適當的啟動子是組成的啟動子，例如ADH1啟動子、PGK1啟動子、ENO啟動子、PYK1啟動子等；或可調節啟動子，例如GAL1啟動子、GAL10啟動子、ADH2啟動子、PHOS啟動子、CUP1啟動子、GALT啟動子、MET25啟動子、MET3啟動子、CYC1啟動子、HIS3啟動子、ADH1啟動子、PGK啟動子、GAPDH啟動子、ADC1啟動子、TRP1啟動子、URA3啟動子、LEU2啟動子、ENO啟動子、TP1啟動子及AOX1（例如，用於畢赤酵母菌屬（Pichia））。適當載體和啟動子的選擇完全在本領域中具有通常知識者的水平內。用於原核生物宿主細胞的適當的啟動子包括，但不限於噬菌體T7 RNA聚合酶啟動子；trp啟動子；lac操縱子啟動子；雜合啟動子，例如，lac/tac雜合啟動子、tac/trc雜合啟動子、trp/lac啟動子、T7/lac啟動子；trc啟動子；tac啟動子等；araBAD啟動子；活體內調節啟動子，例如ssaG啟動子或相關啟動子（參見例如，美國專利公開號20040131637）、pagC啟動子（Pulkkinen and Miller, J. Bacteriol.（1991）173（1）：86-93；Alpuche-Aranda et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. US A（1992）89（21）：10079-83）、nirB啟動子（Harborne et al.Mol. Micro .（1992）6:2805-2813）等（參見例如，Dunstan et al.,Infect. Immun .（1999）67:5133-5141；McKelvie et al.,Vaccine （2004）22:3243-3255；及 Chatfield et al.,Biotechnol. （1992）10:888-892）；σ（sigma）70啟動子，例如，一致性σ70啟動子（參見例如，GenBank 登記號AX798980、AX798961及AX798183）；固定相啟動子，例如，dps啟動子、spv啟動子等；源自致病島（pathogenicity island）SPI-2之啟動子（參見例如，WO96/17951）；actA啟動子（參見例如，Shetron-Rama et al.,Infect. Immun. （2002）70:1087-1096）；rpsM啟動子（參見例如，Valdivia and FalkowMol. Microbiol .（1996）. 22:367）；tet啟動子（參見例如，Hillen, W. and Wissmann, A.（1989）In Saenger, W. and Heinemann, U.（eds）, Topics in Molecular and Structural Biology, Protein--Nucleic Acid Interaction. Macmillan, London, UK, Vol. 10, pp. 143-162）；an SP6啟動子（參見例如，Melton et al.,Nucl. Acids Res .（1984）12:7035）；等等。用於例如大腸桿菌（Escherichia coli ）之原核生物的適當的強效啟動子包括，但不限於Trc、Tac、T5、T7及P λ。用於細菌宿主細胞的操縱子之非限制性實例包括乳糖啟動子操縱子（LacI抑制因子蛋白質與乳糖接觸時會改變構形，從而防止Lad抑制因子蛋白質與操縱子結合）、色胺酸啟動子操縱子（當與色胺酸複合時，TrpR抑制因子蛋白具有與操縱子結合的構形；在沒有色胺酸的情況下，TrpR抑制因子蛋白具有不與操縱子結合的構形）及tac啟動子操縱子（參見例如，deBoer et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. （1983）80:21-25）。

適當啟動子的其他實例包括立即早期巨細胞病毒（CMV）啟動子序列，此啟動子序列是強效組成型啟動子序列，其能夠驅動任何與其可操作連接的多核苷酸序列的高水平表現。然而，也可以使用其他組成啟動子序列，包括，但不限於猿猴病毒40（SV40）早期啟動子、小鼠乳癌病毒（MMTV）、人類免疫缺陷病毒（HIV）長末端重複序列（LTR）啟動子、MoMuLV啟動子、家禽白血病病毒啟動子，艾伯斯坦-巴爾病毒立即早期啟動子（Epstein-Barr virus immediate early promoter）、勞斯肉瘤病毒（Rous sarcoma virus）啟動子、EF-1α啟動子及人類基因啟動子，例如，但不限於肌動蛋白啟動子、肌凝蛋白啟動子、血紅蛋白啟動子及肌胺酸激酶啟動子。此外，本發明不應僅限於使用組成啟動子，亦涵蓋誘導啟動子作為本發明之一部分。使用誘導啟動子可提供一種分子開關，在有需要時，可用來啟動與其可操作連接的多核苷酸序列的表現，或在不想要發生表現時，用來關閉與其可操作連接的多核苷酸序列的表現。誘導啟動子的實例包括，但不限於金屬硫蛋白啟動子、醣皮質素啟動子、黃體素啟動子及四環素啟動子。

在一些實施方式中，含有適當啟動子的基因座或構建體或轉基因透過誘導系統的誘導來進行不可逆轉換。適用於誘導不可逆轉換的系統為技術領域中所熟知，例如，不可逆轉換的誘導可以利用Cre-lox調控的重組（參見例如，Fuhrmann-Benzakein, et al.,Proc. Natl. Acad.Sci.USA（2000）28：e99，其揭示內容藉由引用併入本文）。技術領域中已知的重組酶、核酸內切酶、連接酶、重組位點等的任何適當組合皆可用於產生不可逆轉換的啟動子。本文所述用於進行位點特異性重組的方法、機制及要件可用於產生不可逆轉換的啟動子，並為本領域所熟知，參見例如Grindley et al.Annual Review of Biochemistry（2006）567-605、及Tropp, Molecular Biology（2012）（Jones & Bartlett Publishers,Sudbury,MA）中所述內容，其揭示內容藉由引用併入本文。

在一些實施方式中，本文所述核酸進一步包含編碼CAR可誘導表現匣之核酸序列。在一實施方式中，CAR可誘導表現匣係用於製造CAR信號傳導的轉基因多肽產物，參見例如，Chmielewski and Abken, Expert Opin. Biol. Ther.（2015）15（8）：1145-1154；及 Abken, Immunotherapy（2015）7（5）：535-544。

本文所述核酸可存在於表現載體及/或選殖載體中，表現載體可包括可篩選標記、複製起始序列及提供載體複製及/或維持的其他特徵。適當的表現載體包括例如質體、病毒載體等。大量適當的載體和啟動子為本領域技術人員已知的；目前已有許多市售用於產生標的重組構建體。透過實例提供以下載體，且不應解釋為對本發明之限制：細菌：pBs、phagescript、PsiX174、pBluescript SK、pBs KS、pNH8a、pNH16a、pNH18a、pNH46a（Stratagene, La Jolla, Calif., USA）；pTrc99A、pKK223-3、pKK233-3、pDR540及pRIT5（Pharmacia, Uppsala, Sweden）。真核生物：pWLneo、pSV2cat、pOG44、PXR1、pSG（Stratagene）pSVK3、pBPV、pMSG及pSVL（Pharmacia）。

表現載體通常具有位於啟動子序列附近的方便的限制性位點，以提供插入編碼異源性蛋白質的核酸序列，可存在在表現宿主中操作的可篩選標記，合適的表現載體包括，但不限於病毒載體（例如，基於痘瘡病毒、小兒麻痺病毒、腺病毒（參見例如，Li et al.,Invest. Opthalmol. Vis. Sci. （1994）35：2543-2549；Borras et al.,Gene Th er.（1999）6：515-524；Li and Davidson,Proc. Natl. Acad. Sci. USA （1995）92：7700-7704；Sakamoto et al., H. Gene Ther.（1999）5：1088-1097；WO 94/12649, WO 93/03769；WO 93/19191；WO 94/28938；WO 95/11984及WO 95/00655）；腺相關病毒（參見例如，Ali et al.,Hum. Gene Ther .（1998）9：81-86, Flannery et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA （1997）94：6916-6921；Bennett et al.,Invest. Opthalmol. Vis. Sci. （1997）38：2857-2863；Jomary et al.,Gene Ther. （ 1997）4:683 690, Rolling et al.,Hum. Gene Ther. （1999）10：641-648；Ali et al.,Hum. Mol. Genet .（1996）5：591-594；Srivastava in WO 93/09239, Samulski et al.,J. Vir .（1989）63：3822-3828；Mendelson et al.,Virol. （1988）166：154-165；及Flotte et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA （1993）90：10613-10617）；SV40；單純皰疹病毒；人類免疫缺失病毒（參見例如，Miyoshi et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA（1997）94：10319-23；Takahashi et al.,J. Virol .（1999）73：7812-7816）；反轉錄病毒載體（例如，鼠類白血病病毒、脾臟壞死病毒及衍生自反轉錄病毒的載體，例如勞氏肉瘤病毒（Rous sarcoma virus）、哈維肉瘤病毒（Harvey Sarcoma Virus）、家禽白血病病毒、人類免疫缺陷病毒、骨髓增生性肉瘤病毒及乳癌病毒）；等等的病毒載體。

另外適於使用的表現載體為，例如，但不限於慢病毒載體、γ反轉錄病毒載體、泡沫病毒（foamy virus）載體、腺相關病毒載體、腺病毒載體、痘病毒載體、皰疹病毒載體、工程化雜合病毒載體、轉位子（transposon）調控載體等。病毒載體技術為技術領域中所熟知，且敘述於例如，Sambrook et al., 2012, Molecular Cloning：A Laboratory Manual, volumes 1-4, Cold Spring Harbor Press, NY），及在在其他病毒學和分子生物學手冊中。可用作載體的病毒包括，但不限於反轉錄病毒、腺病毒、腺相關病毒、皰疹病毒和慢病毒。

一般而言，適當的載體含有在至少一種生物中具有功能的複製起始序列、啟動子序列、方便的限制性核酸內切酶位點及一或多個可篩選標記（例如，WO 01/96584；WO 01/29058；及 U.S. Pat. No. 6,326,193）。

在一些實施方式中，表現載體（例如，慢病毒載體）可用於將CAR導入免疫細胞或其前驅細胞（例如T細胞）中。因此，本發明的表現載體（例如，慢病毒載體）可包含編碼CAR的核酸。在一些實施方式中，表現載體（例如，慢病毒載體）將包含有助於編碼於其中的CAR之功能性表現的額外元件。在一些實施方式中，包含編碼CAR之核酸的表現載體進一步包含哺乳動物啟動子。在一實施方式中，載體進一步包含延長因子-1-α啟動子（EF-1α啟動子）。使用EF-1α啟動子可增加下游轉基因（例如CAR編碼核酸序列）的表現效率。生理啟動子（例如，EF-1α啟動子）可能較不會誘發由嵌入所調控之遺傳毒性，並可消除反轉錄病毒載體轉化幹細胞的能力。適用於載體（例如，慢病毒載體）的其他生理學啟動子為本領域技術人員已知的，並可併入本發明的載體中。在一些實施方式中，載體（例如，慢病毒載體）進一步包含可改善力價和基因表現之非必要順式作用序列（non-requisite cis acting sequence）。非必要順式作用序列的一個非限制性實例是中心多嘌呤管道和中心終止序列（central polypurine tract and central termination sequence，cPPT/CTS），其對於有效的反轉錄和細胞核輸入是重要的。其他非必要的順式作用序列為本領域技術人員已知的，並可併入本發明的載體（例如，慢病毒載體）中。在一些實施方式中，載體進一步包含轉錄後調節元件，該轉錄後調節元件可改善RNA轉譯、改善轉基因表現並穩定RNA轉錄物。轉錄後調節元件的一個實例是土撥鼠肝炎病毒轉錄後調節元件（woodchuck hepatitis virus posttranscriptional regulatory element，WPRE）。因此，在一些實施方式中，用於本發明的載體進一步包含WPRE序列。各種轉錄後調節元件為本領域技術人員已知的，並可併入本發明的載體（例如，慢病毒載體）中。本發明的載體可進一步包含額外元件，例如用於RNA轉運的rev反應元件（rev response element，RRE）、包裝序列和5'和3'長末端重複（LTR）。術語「長末端重複」或「LTR」係指位於反轉錄病毒DNA末端的鹼基對的域，其包含U3、R和U5區域。LTR通常提供表現反轉錄病毒基因所需的功能（例如，基因轉錄物的促進、起始及多腺苷酸化）及病毒複製。在一實施方式中，本發明之載體（例如，慢病毒載體）包括3' U3刪除的LTR。因此，本發明之載體（例如，慢病毒載體）可包含本文所述元件的任何組合，以增強轉基因的功能性表現的效率。例如，除了編碼CAR的核酸之外，本發明之載體（例如，慢病毒載體）可包含WPRE序列、cPPT序列、RRE序列、5'LTR、3' U3刪除的LTR'。

本發明之載體可為自我滅活載體。如本文所使用，術語「自我滅活載體」係指其中3' LTR增強子啟動子區（U3區）已被修飾（例如，藉由刪除或取代）的載體。自我滅活載體可在病毒第一次複製後阻止病毒轉錄。因此，自我滅活載體可僅感染一次，然後嵌入宿主基因體（例如，哺乳動物基因體）中，且不能進一步被傳遞。因此，自我滅活載體可大幅的降低產生出具有複製能力病毒的風險。

在一些實施方式中，本發明之核酸可為RNA，例如活體外合成的RNA。關於活體外合成RNA的方法為本領域技術人員已知的；任何已知的方法皆可於合成含編碼本文CAR序列的RNA。用於將RNA導入宿主細胞的方法為技術領域中已知的。參見例如，Zhao et al. Cancer Res.（2010）15：9053。將含編碼本發明CAR之核苷酸序列的RNA導入宿主細胞可在活體外或離體或活體內進行。例如，宿主細胞（例如，NK細胞、細胞毒性T淋巴細胞等）可以含編碼本文CAR之核苷酸序列的RNA在活體外或離體進行電穿孔。

為了評估多肽或其部分的表現，欲導入細胞的表現載體亦可包含可篩選標記基因或報導基因，或兩者皆有，以便從被病毒載體所轉染或感染的細胞群中鑑定和選擇有表現的細胞。在一些實施方式中，可篩選標記可攜帶於DNA的分離片段上，並用於共轉染程序。可篩選標記和報導基因的兩側可接有適當的調控序列，以使其能夠在宿主細胞中表現。有用的可篩選標記包括，但不限於抗生素抗性基因。

報導基因係於鑑定潛在被轉染的細胞及用於評估調節序列的功能。一般而言，報導基因是一種在接受者之生物體或組織中不存在或不表現的基因，且其編碼一多肽，該多肽的表現可藉由一些易於檢測的特性（例如酵素活性）顯現出來。在將DNA引入接受者細胞後，在適當的時間評估報導基因的表現。適當的報導基因可包括，但不限於編碼螢光素酶、β-半乳糖苷酶、氯黴素乙醯轉移酶、分泌性鹼性磷酸酶或綠螢光蛋白的基因（例如，Ui-Tei et al., 2000 FEBS Letters 479：79-82）。

產生經修飾之免疫細胞的方法

本發明提供製造/產生經修飾之免疫細胞或其前驅細胞（例如，經修飾的T細胞/NK細胞/NKT細胞）的方法，通常藉由導引編碼標的CAR（例如，MUC1 CAR）的核酸來工程化細胞。

將核酸引入細胞的方法包括物理、生物及化學方法。用於將多核苷酸（例如，RNA）導入宿主細胞的物理方法包括磷酸鈣沉澱、脂質體轉染（lipofection）、粒子撞擊（particle bombardment）、顯微注射、電穿孔等。可以使用市售方法將RNA導入標靶細胞中，該方法包括電穿孔（Amaxa Nucleofector-II（Amaxa Biosystems, Cologne, Germany）、ECM 830（BTX, Harvard Instruments, Boston, Mass.）或Gene Pulser II（BioRad, Denver, CO）、Multiporator（Eppendort, Hamburg Germany））。RNA亦可使用陽離子脂質體調控之脂質體轉染、使用聚合物包覆、使用肽調控之轉染或使用例如「基因槍（gene guns）」的生物顆粒遞送系統引入細胞中（參見例如Nishikawa, et al. Hum Gene Ther., 12（8）：861-70（2001））。

用於將感興趣之多核苷酸導入宿主細胞的生物方法包括使用DNA及RNA載體。病毒載體，尤其是反轉錄病毒載體，已成為將基因插入哺乳動物中（例如，人類細胞）最廣泛使用的方法，其他病毒載體可源自慢病毒、痘病毒、單純皰疹病毒I、腺病毒及腺相關病毒等。參見例如，美國專利號5,350,674及5,585,362。

在一些實施方式中，藉由表現載體將編碼本發明之標的CAR的核酸導入細胞中。本文提供含編碼標的CAR（例如，MUC1 CAR）之核酸的表現載體，適當的表現載體包括慢病毒載體、γ反轉錄病毒載體、泡沫病毒載體、腺相關病毒（AAV）載體、腺病毒載體、工程化雜合病毒、裸DNA，包括，但不限於轉位子調控的載體，例如Sleeping Beauty、Piggybak及Integrases（如Phi31）。一些其他適當之表現載體包括單純皰疹病毒（HSV）及反轉錄病毒表現載體。

腺病毒表現載體係基於腺病毒，而腺病毒嵌入基因體DNA中的能力不佳，但轉染宿主細胞的效率高。腺病毒表現載體含有的腺病毒序列足以：（a）支持表現載體的包裝，及（b）最終在宿主細胞中表現標的CAR。在一些實施方式中，腺病毒基因體為36 kb的線性雙股DNA，其中，為了製造本發明的表現載體，可插入外源DNA序列（例如，編碼標的CAR的核酸）以取代大片段的腺病毒DNA（參見例如，Danthinne and Imperiale, Gene Therapy（2000）7（20）：1707-1714）。

另一種表現載體係基於腺相關病毒的，其利用腺病毒偶合系統，此AAV表現載體嵌入到宿主基因體中的頻率很高，它可感染非分裂的細胞，因此使其可用於遞送基因至哺乳動物細胞中，例如，在組織培養物中或活體內。AAV載體具有廣泛的感染宿主範圍，關於AAV載體的產生和使用的細節敘述於美國專利號5,139,941及4,797,368中。

反轉錄病毒表現載體能夠整合至宿主基因體中，遞送大量外來遺傳物質，感染廣泛的物種和細胞類型並被包裝在特定細胞株中。藉由在某些位置將核酸（例如，編碼標的CAR的核酸）插入病毒基因體中產生具有複製缺陷的病毒來構築反轉錄病毒載體。儘管反轉錄病毒載體能夠感染廣泛不同的細胞類型，但標的CAR的整合及穩定表現需要宿主細胞的分裂。

慢病毒載體源自慢病毒，其為複雜的反轉錄病毒，除了常見的反轉錄病毒基因gag、pol和env之外，含有具調節或結構功能的其他基因（參見例如，美國專利號6,013,516和5,994,136）。慢病毒的一些實例包括人類免疫缺失病毒（HIV-1、HIV-2）和猿猴免疫缺失病毒（Simian Immunodeficiency Virus，SIV）。藉由將HIV毒力基因進行多次減毒以產生慢病毒載體，例如，刪除env、vif、vpr、vpu和nef基因使載體具備生物安全性。慢病毒載體能夠感染非分裂中的細胞，並可用於例如編碼標的CAR之核酸的活體內和離體的基因轉移和表現（參見例如美國專利號5,994,136）。

可藉由本領域技術人員已知的任何方法將包括本文的核酸的表現載體導入宿主細胞中。如果需要，表現載體可包括用於轉染的病毒序列。或者，可藉由融合、電穿孔、基因槍、轉染、脂質轉染等導入表現載體。宿主細胞可在導入表現載體之前，在培養基中生長和擴增，接著進行適當的處理以導入並整合載體。然後可將宿主細胞擴增，並可藉助載體中存有的標記來進行篩選。可使用技術領域中已知的各種標記，並且可包括hprt、新黴素（neomycin）抗性、胸苷激酶、潮黴素（hygromycin）抗性等。如本文所使用，術語「細胞」、「細胞株」和「細胞培養物」可交替使用。在一些實施方式中，宿主細胞為免疫細胞或其前驅細胞，例如T細胞、NK細胞或NKT細胞。

本發明亦提供基因工程化細胞，其包括並穩定表現本文之標的CAR。在一些實施方式中，基因工程化細胞是基因工程化T-淋巴細胞（T細胞）、調節T細胞（Tregs）、初始T細胞（TN）、記憶T細胞（例如，中樞性記憶T細胞（TCM）、作用記憶細胞（effector memory cell，TEM））、天然殺手細胞（NK細胞）及能夠產生治療相關子代的巨噬細胞。在一實施方式中，基因工程化細胞為自體細胞。

以包括本文核酸的表現載體穩定的轉染宿主細胞可製造出經修飾之細胞（例如，包含標的CAR）。另外產生本文經修飾之細胞的方法包括，但不限於化學轉化方法（例如，使用磷酸鈣、樹枝狀聚合物（dendrimer）、脂質體及/或陽離子聚合物）、非化學轉化方法（例如，電穿孔、光學轉化、基因電轉移及/或流體動力學遞送）及/或基於顆粒的方法（例如，使用基因槍及/或磁性轉染進行的穿刺感染（impalefection））。表現本文之標的CAR的轉染細胞可離體擴增。

用於將表現載體導入宿主細胞的物理方法包括磷酸鈣沉澱、脂質體轉染、粒子撞擊、顯微注射、電穿孔等。用於產生包括載體及/或外源核酸之細胞的方法是技術領域中所熟知的。參見例如，Sambrook et al.（2001）, Molecular Cloning：A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York。

用於將多核苷酸導入宿主細胞的化學方法包括膠體分散系統（例如巨分子複合物、奈米膠囊、微球體、珠子）和基於脂質的系統（包括水包油乳劑、微胞（micelle）、混合微胞及脂質體）。作為活體外和活體內用遞送媒劑的例示性膠體系統為脂質體（例如，人造膜囊泡）。

適用的脂質可由商業來源獲得，例如，二肉荳蔻醯磷脂醯膽鹼（dimyristyl phosphatidylcholine，「DMPC」），可獲自Sigma，St.Louis，MO；雙二十六烷基磷酸（dicetyl phosphate，「DCP」）可獲自K&K實驗室（Plainview，NY）；膽固醇（cholesterol，「Choi」）可購自Calbiochem-Behring；二肉荳蔻醯磷脂醯甘油酯（dimyristyl phosphatidylglycerol，「DMPG」）和其他脂質可購自Avanti Polar Lipids,Inc.（Birmingham，AL）。含脂質之氯仿或氯仿/甲醇儲備原液可儲存在約-20℃，因為氯仿比甲醇更容易蒸發，因此被用作唯一的溶劑。「脂質體」是通用術語，其係指藉由產生封閉的脂質雙層物或聚集體所形成的各種單層及多層脂質媒介物。脂質體之特徵為具有囊泡結構，其具有雙層磷脂膜且內部為水性介質的。多層脂質體具有藉由水性介質所分隔的多個脂質層。當磷脂懸浮在過量的水溶液中時，它們會自然形成。在形成封閉結構之前，脂質組分會進行自我重排，並在雙層脂質之間截留水和溶於水中的溶質（Ghosh et al., 1991Glycobiology 5：505-10）。然而，本還包括在溶液中具有與正常囊泡結構不同結構的組成物。例如，脂質可呈現微胞結構或僅以脂質分子之不均勻聚集體的形式存在。本實施方式亦包括脂質轉染試劑-核酸複合物（lipofectamine-nucleic acid complexes）。

無論是將外源核酸導入宿主細胞或是以其他使細胞暴露於本發明抑制劑的方法，為了要證實核酸存在於宿主細胞中，可以進行各種分析。前述分析包括，例如，本領域技術人員所熟知的「分子生物學」分析（例如南方墨點法和北方墨點法、RT-PCR和PCR；「生物化學」分析，例如檢測特定肽之存在或不存在，例如藉由免疫學方法（ELISA和西方墨點法），或藉由本文所述的分析法鑑定落入本發明範圍內的試劑。

此外，可藉由任何方式導入核酸，例如轉導擴增的T細胞、轉染擴增的T細胞和電穿孔擴增的T細胞。可藉由一種方法導入一種核酸，並且可藉由另一種不同的方法將另一種核酸導入T細胞中。 RNA

在一實施方式中，導入宿主細胞的核酸是RNA。在另一實施方式中，RNA是mRNA，其包含活體外轉錄RNA或合成RNA。RNA係利用聚合酶連鎖反應（PCR）所產生的模板藉由活體外轉錄產生。任何來源的感興趣之DNA可藉由PCR直接轉化成模板，利用適合的引子和RNA聚合酶進行活體外mRNA合成。DNA的來源可為例如，基因體DNA、質體DNA、噬菌體DNA、cDNA、合成DNA序列或任何其它適當的DNA來源。

PCR可用於產生用於mRNA活體外轉錄的模板，然後將其導入細胞。進行PCR的方法為技術領域中所熟知的。用於PCR的引子係經設計而具有與可作為PCR模板的DNA區域實質上互補的區域。如本文所使用，「實質上互補的」係指引子序列中核苷酸序列大部分或全部鹼基為互補，或一或多個鹼基為非互補或錯誤配對的。實質上互補的序列能夠在PCR的黏合（annealing）條件下與預期的DNA目標發生黏合或雜交。引子可經設計成與DNA模板的任何部分實質上互補。例如，可設計引子以擴增一基因在細胞中通常會發生轉錄的部分（開放閱讀框），其包括5'和3' UTR。引子亦可經設計成擴增編碼感興趣之特定域之基因的一部分。在一實施方式中，引子被經設計成擴增人類cDNA的編碼區，包括全部或部分的5'和3' UTR。適用於PCR的引子可藉由技術領域中所熟知的合成方法產生。「正向引子」為含有一核苷酸區域的引子，該核苷酸區域與待擴增DNA序列上游的DNA模板上的核苷酸實質上互補。本文所使用之「上游」係指相對於編碼股中待擴增DNA序列的5'位置。「反向引子」為含有一核苷酸區域的引子，該核苷酸區域與待擴增DNA序列下游的雙股DNA模板實質上互補。本文所使用之「下游」係指相對於編碼股中待擴增DNA序列的3'位置。

亦可使用能夠促進RNA穩定性及/或轉譯效率的化學結構，RNA較佳具有5'及3' UTR。在一實施方式中，5' UTR的長度為0至3000個核苷酸之間。待添加到編碼區的5'和3' UTR序列的長度可以不同方法來改變，包括，但不限於設計會黏合至UTR不同區域的PCR引子。使用此方法，本發明所屬技術領域具有通常知識者可修飾所需的5'和3' UTR的長度以在所轉錄出的RNA於轉染後有最佳的轉譯效率。

5'和3' UTR可為天然存在之感興趣基因的內源性5'及3'端的UTR。或者，可藉由在正向和反向引子中併入UTR序列，或藉由模板的其他任何修飾，來添加對感興趣之基因為非內源性的UTR序列。使用對感興趣之基因為非內源性的UTR序列有助於修飾RNA的穩定性及/或轉譯效率。例如，已知3' UTR序列中的富含AU之元件（AU-rich elements）可降低mRNA的穩定性。因此，基於技術領域中所熟知的UTR特性來選擇或設計3'UTR，以增加所轉錄出的RNA穩定性。

在一實施方式中，5' UTR可含有內源基因的克紮克（Kozak）序列。或者，當如上所述藉由PCR添加對感興趣之基因為非內源性的5'UTR時，可藉由添加5' UTR序列來重新設計一致性克紮克序列。克紮克序列可提高一些RNA轉錄物的轉譯效率，但似乎並非所有的RNA都能效率轉譯，許多mRNA需要克紮克序列為技術領域中所已的。在其他實施方式中，5' UTR可衍生自RNA病毒，其等之RNA基因體在細胞中是穩定的。在其他實施方式中，各種核苷酸類似物可用於3'或5' UTR中以阻止mRNA的核酸外切酶降解。

為了能夠在無需基因選殖也能從DNA模板合成RNA，轉錄啟動子應連接到待轉錄序列上游的DNA模板上。當作為RNA聚合酶之啟動子功能的序列被添加至正向引子的5'端時，RNA聚合酶啟動子在PCR產物中會被併入待轉錄的開放閱讀框的上游。在一實施方式中，啟動子為T7聚合酶啟動子，如本文他處所述。其他有用的啟動子包括，但不限於T3及SP6 RNA聚合酶啟動子。T7、T3和SP6啟動子的一致性核苷酸序列為技術領域中已知的。

在一實施方式中，mRNA具有5'端封帽及3'端Poly（A）（多腺苷酸）尾，其確定細胞中核醣體結合、轉譯起始及mRNA的穩定性。在環狀DNA模板上，例如質體DNA、RNA聚合酶會產生長的多聯體（concatemeric）產物，其不適於在真核細胞中表現。質體DNA的轉錄物在3' UTR末端的線性化會產生正常尺寸之mRNA，其即使在轉錄後經聚腺苷酸化，在真核細胞轉染亦不發生作用。

在線性DNA模板上，噬菌體T7 RNA聚合酶可將轉錄物的3'端延伸超出模板的最後一個鹼基（Schenborn and Mierendorf, Nuc Acids Res., 13:6223-36（1985）；Nacheva and Berzal-Herranz, Eur. J. Biochem., 270:1485-65（2003））。

將polyA/T片段整合至DNA模板中的習知方法是分子選殖。然而，整合至質體DNA中的polyA/T延申片段可能導致質體不穩定，這就是造成從細菌所獲得的質體DNA模板經常具有刪除和其他畸變（aberration）的汙染，這種情況不僅會讓轉殖程序費力且耗時，而且穩定度通常不高。因此現仍亟需一種方法，可在無需選殖而構築具有polyA/T 3'延申片段的DNA模板。

在PCR期間使用含有polyT（多胸腺嘧啶核苷）尾（例如，100個T尾，尺寸可為50至5000個T）之反向引子，或在PCR之後藉由其他任何方法-包括但不限於DNA接合或活體外重組，可生成轉錄DNA模板之polyA/T片段。Poly（A）尾亦可提供RNA穩定性並減少其降解。一般而言，Poly（A）尾的長度與經轉錄RNA之穩定性呈正相關。在一個實施方式中，Poly（A）尾為100至5000個腺苷酸。

在使用Poly（A）聚合酶（例如大腸桿菌polyA聚合酶，E-PAP）活體外轉錄後，可進一步延長RNA的Poly（A）尾。在一實施方式中，將Poly（A）尾的長度從100個核苷酸增加至300至400個核苷酸可導致RNA的轉譯效率增加約2倍。另外，不同化學基團與3'端的附接可增加mRNA穩定性，這種附接可含有修飾的/人工的核苷酸、適配體和其他化合物。例如，可使用poly（A）聚合酶將ATP類似物併入poly（A）尾，ATP類似物可進一步增加RNA的穩定性。

5'端帽亦提供RNA分子穩定性，在某些例示性實施方式中，本文揭示之方法所產生的RNA包括5'端帽。使用技術領域中已知及本文所描述的技術來提供5'帽（Cougot, et al.,Trends in Biochem. Sci ., 29:436-444（2001）；Stepinski, et al.,RNA , 7:1468-95（2001）；Elango, et al.,Biochim. Biophys. Res. Commun ., 330:958-966（2005））。

藉由本文揭示之方法所產生的RNA亦可含有內部核醣體進入位點（internal ribosome entry site，IRES）序列。IRES序列可為任何病毒、染色體或人工設計序列，其會引發端帽非依賴性（cap-independent）核糖體結合至mRNA，並促進轉譯的起始。本發明可包括任何適用於細胞電穿孔的溶質，其可含有促進細胞滲透性和活性的因子，例如糖類、肽類、脂類、蛋白質、抗氧化劑和介面活性劑。

在一些實施方式中，RNA被電穿孔至細胞中，例如活體外轉錄的RNA。

本文所揭示之方法可在癌症、幹細胞、急性和慢性感染及自體免疫疾病領域中施用於宿主細胞活性調節的基礎研究和治療，包括分析經遺傳修飾的宿主細胞殺死目標癌細胞的能力。

該方法亦提供廣範圍地控制表現水平的能力，其藉由改變例如啟動子或輸入RNA的量，使各別調節表現水明成為可能。此外，基於PCR的mRNA生產技術大大促進了具有不同結構及其域之組合的mRNA設計。

本發明RNA轉染方法的一個優點是RNA轉染實質上是暫時性且無需載體的。RNA轉基因可被遞送至淋巴球，並在簡短的活體外細胞活化後於其中表現，其係作為最小表現匣而不需要任何額外的病毒序列。在這些條件下，轉基因不太可能會整合至宿主細胞基因體中。由於RNA轉染的效率及其一致性地修飾整個淋巴球族群的能力，故無須進行細胞選殖。

以活體外轉錄的RNA（in vitro-transcribed RNA，IVT-RNA）的宿主細胞基因修飾利用兩種不同的策略，這兩種策略皆已在各種動物模型中成功測試。藉由脂質體轉染或電穿孔方式的體外轉錄的RNA來轉染細胞，理想的是能夠使用各種修飾來穩定IVT-RNA，以便達到轉移之IVT-RNA的延長表現。

在文獻中已知有一些IVT載體，其以標準化方式用作活體外轉錄的模板，並以產生穩定RNA轉錄物的方式進行基因修飾。目前，本領域所使用的規程是基於具有下列結構的質體載體：能使RNA轉錄的5' RNA聚合酶啟動子，其後是3'及/或5’端側接非轉譯區（UTR）的感興趣之基因，及含有50至70個A（腺苷酸）核苷酸的3'端多腺苷酸匣。在活體外轉錄之前，藉由第二型限制酶將環狀質體在多腺苷酸匣的下游進行線性化（辨識序列對應於切割位點）。因此，多腺苷酸匣對應於轉錄物中後面的poly（A）序列。此程序的結果，一些核苷酸在線性化後保留成為酶切割位點的一部分，並在3'端延伸或掩蔽poly（A）序列。目前尚不清楚這種非生理性突出物是否會影響這種構築體在細胞內所產生的蛋白質量。

與傳統的質體或病毒途徑相比，RNA具有許多優點。來自RNA來源的基因表現不需要轉錄，且在轉染後會快速產生蛋白質產物。此外，因為RNA僅需進入細胞質，而無需進入細胞核，故典型的轉染方法能就會產生極高的轉染率。另外，在基於質體的途徑中，在研究時，驅動感興趣之基因表現的啟動子在細胞中需具有活性。

另一方面，藉由電穿孔將RNA構建體遞送到細胞中。參見例如，US 2004/0014645、US 2005/0052630A1、US 2005/0070841A1、US 2004/0059285A1、US 2004/0092907A1中所教示的將核酸構築體電穿孔至哺乳動物細胞中的調配物及方法。包括任何已知細胞類型所需的電穿孔電場強度的各種參數，基本上已揭露於相關研究文獻以及本領域許多專利案及申請案中。參見例如，美國專利號6,678,556、美國專利號7,171,264及美國專利號7,173,116。用於電穿孔治療應用的裝置為商業上可獲得的，例如MedPulser^TM DNA電穿孔療法系統（Inovio/Genetronics, San Diego, Calif.），並描述於下列專利案中，例如，美國專利號6,567,694、美國專利號6,516,223、美國專利號5,993,434、美國專利號6,181,964、美國專利號6,241,701及美國專利號6,233,482。電穿孔亦可用於活體外細胞轉染，例如在US 20070128708A1中所述。電穿孔亦可應用於活體外遞送核酸至細胞中。因此，利用本領域技術人員已知的多種可用裝置和電穿孔系統的任何一種，將核酸（包括表現構建體）以電穿孔調控進入細胞提供了一種將感興趣之RNA遞送至標靶細胞的新穎方法。

因此，本發明提供一種用於生成經修飾之免疫細胞或其前驅細胞的方法，包含使用任何本文所述或本領域技術人員已知的遞送方法，將編碼本文所述標的CAR的分離核酸（例如，表現構建體）導入細胞。

免疫細胞來源

在擴增之前，免疫細胞的來源是從受試者獲得，用於離體操作。用於離體操作之標靶細胞的來源亦可包括例如，自體的或異源性供體的血液、臍帶血或骨髓。例如，免疫細胞的來源可來自以本發明經修飾之免疫細胞治療之受試者，例如，受試者之血液，受試者之臍帶血或受試者之骨髓。受試者的非限制性實例包括人類、狗、貓、小鼠、大鼠及其轉基因物種。在某些例示性實施方式中，受試者為人類。

免疫細胞可以從許多來源獲得，包括血液、周邊血液單核細胞、骨髓、淋巴結組織、脾組織、臍帶、淋巴或淋巴樣器官。免疫細胞是免疫系統的細胞，例如先天性或適應性的免疫的細胞，例如骨髓或淋巴樣細胞，包括淋巴球，通常是T細胞及/或NK細胞及/或NKT細胞。其他示例性細胞包括幹細胞，例如全能性幹細胞和多能幹細胞，多功能幹細胞包括誘導性多功能幹細胞（induced pluripotent stem cell，iPSC）。在某些方面，細胞為人類細胞。關於待治療的受試者，細胞可為同種異體的及/或自體的。細胞通常為初代細胞，例如直接從受試者分離及/或從受試者分離並冷凍的細胞。

在某些實施方式中，免疫細胞為T細胞，例如，CD8+ T細胞（例如，CD8+初始T細胞、中樞性記憶T細胞或作用型記憶T細胞）、CD4+T細胞、天然殺手T細胞（NKT細胞s）、調節T細胞（Treg）、幹細胞記憶T細胞、淋巴樣前驅細胞、造血幹細胞、天然殺手細胞（NK細胞）、天然殺手T細胞（NK細胞）或樹突細胞。在一些實施方式中，細胞為單核球或顆粒球，例如，骨髓細胞、巨噬細胞、嗜中性球、樹突細胞、肥大細胞，嗜酸性球及/或嗜鹼性球。在一實施方式中，標靶細胞為誘導性富潛能幹（iPS）細胞或源自iPS細胞之細胞，例如，受試者產生之iPS細胞、操縱改變（例如，引起突變）或操縱一或多種標靶基因表現，並分化成例如，T細胞，例如，CD8+ T細胞（例如，CD8+初始T細胞、中樞性記憶T細胞或作用型記憶T細胞）、CD4+ T細胞、幹細胞記憶T細胞、淋巴樣前驅細胞或造血幹細胞。

在一些實施方式中，細胞包括T細胞或其他細胞類型的一或多種子集合，例如整個T細胞族群、CD4+細胞、CD8+細胞及其亞群，例如其等可藉由功能、活化狀態、成熟度、分化的潛力、擴增、再循環、定位及/或持續性能力、抗原專一性、抗原受體類型、在特定器官或腔室中的存在、標記或細胞激素分泌圖譜及/或分化程度所定義。

在T細胞及/或CD4+及/或CD8+ T細胞的亞型和亞群中，有初級T（TN）細胞、作用性T細胞（TEFF）、記憶T細胞及其亞型，例如幹細胞記憶T（TSCM）細胞、中樞性記憶T（TCM）細胞、作用性記憶T（TEM）細胞或終極分化作用性記憶T細胞（terminally differentiated effector memory T cell）、腫瘤浸潤淋巴細胞（TIL）、未成熟T細胞、成熟T細胞、輔助T細胞、細胞毒性T細胞、黏膜相關不變T（mucosa-associated invariant T，MAIT）細胞、天然存在和適應性調節T（Treg）細胞、輔助T細胞，例如TH1細胞、TH2細胞、TH3細胞、TH17細胞、TH9細胞、TH22細胞、濾泡輔助型細胞T細胞、α/β T細胞及δ/γ T細胞。在某些實施方式中，可使用技術領域中可獲得的任何數量的T細胞株。

在一些實施方式中，該方法包括從受試者中分離免疫細胞、製備、加工、培養及/或工程化該細胞。在一些實施方式中，製備經工程化之細胞包括一或多個培養及/或製備步驟。用於工程化之細胞可從樣本中分離，例如生物樣本，例如從受試者獲得、或源自受試者的樣本。在一些實施方式中，分離細胞的受試者為具有疾病或症狀、或需要細胞療法、或將施用細胞療法的受試者。在一些實施方式中，受試者是需要特定治療干預的人類，例如授受性細胞療法，其中細胞被分離、加工及/或工程化。因此，在一些實施方式中，細胞為初代細胞，例如初代人類細胞。樣本包括直接來自受試者的組織、液體和其他樣本，以及來自一或多個處理步驟的樣本，例如分離、離心、基因工程（例如以病毒載體轉導）、清洗及/或培養。生物樣本可為直接由生物來源所獲得的樣本或經過處理的樣本。生物樣本包括，但不限於體液樣本，例如血液、血漿、血清、腦脊液、滑液、尿液及汗液，組織樣本和器官樣本，也包括由其衍生的加工樣本。

在某些方面，衍生出或分離出細胞的樣本是血液或血液衍生樣本，或為或源自血球分離術或白血球分離術的產物。例示性的樣本包括全血、周邊血液單核細胞（PBMC）、白血球、骨髓、胸腺、組織生檢、腫瘤、白血病、淋巴瘤、淋巴結、腸相關淋巴樣組織、黏膜相關淋巴樣組織、脾臟、其他淋巴組織、肝臟、肺臟、胃、小腸、大腸、腎臟、胰臟、乳房、骨、前列腺、子宮頸、睾丸、卵巢、扁桃腺或其他器官及/或由其衍生之細胞。在例如授受性細胞療法之細胞療法的情況下，樣本包括來自自體和同種異體來源的樣品。

在一些實施方式中，細胞衍生自細胞株，例如T細胞株。在一些實施方式中，細胞獲取自異種來源，例如，來自小鼠、大鼠、非人類靈長類動物及豬。在一些實施方式中，細胞的分離包括一或多種製備及/或基於非親和力的細胞分離步驟。在一些實例中，細胞係在一或多種試劑的存在下進行清洗、離心及/或培養，以例如除去不需要的成分、富集所需之成分、裂解，或除去對特定試劑敏感的細胞。在一些實例中，基於一或多種性質來分離細胞，例如密度、黏附性質、尺寸、靈敏度及/或對特定成分的抗性。

在一些實例中，來自受試者循環血液的細胞例如為藉由血球分離術或白血球分離術而獲得。在某些方面，樣本含有淋巴細胞（包括T細胞、單核球、顆粒球、B細胞，其他有核白血球）、紅血球及/或血小板，且在某些方面包含紅血球和血小板以外的細胞。在一些實施方式中，從受試者收集的血球細胞被清洗以例如除去血漿部分，並將細胞置於適當緩衝液或培養液中用於後續處理步驟。在一些實施方式中，以磷酸鹽緩衝鹽水（PBS）洗滌細胞。在某些實施方式中，根據製造商的說明書藉由切向流過濾（tangential flow filtration，TFF）完成洗滌步驟。在某些實施方式中，在洗滌後將細胞再懸浮於各種生物相容性緩衝液中。在某些實施方式中，去除血液細胞樣本的成分並將細胞直接再懸浮於培養液中。在一些實施方式中，該方法包括基於密度的細胞分離法，例如，裂解紅血球並透過Percoll或Ficoll梯度離心而從周邊血液製備白血球。

在一實施方式中，獲自個體之循環血液的免疫細胞為為藉由血球分離術或白血球分離術而獲得。血球分離術產物一般含有淋巴球（包括T細胞、單核球、顆粒球、B細胞，其他有核白血球）、紅血球及/或血小板，由血球分離術所收集之細胞可被清洗以例如除去血漿部分，並將細胞置於適當緩衝液或培養液中，例如磷酸鹽緩衝鹽水（PBS），或洗滌溶液缺少鈣，可缺少鎂，或可缺少許多（如果不是全部）二價陽離子，用於後續處理步驟。如本領域中具有通常知識者將容易理解，洗滌步驟可藉由本領域技術人員已知的方法完成，例如根據製造商的說明書，藉由使用半自動「順流（flow-through）」離心機（例如Cobe 2991細胞處理器、Baxter CytoMate或Haemonetics Cell Saver 5）。洗滌後，可將細胞再懸浮於各種生物相容性緩衝液中，例如，無Ca²⁺ 、無Mg²⁺ PBS、PlasmaLyte A或具有或不具有緩衝液之其他鹽水溶液。在一些實施方式中，可移除血球分離術樣本的非所欲之成分並將細胞直接再懸浮於培養介質中。

在一些實施方式中，分離方法包括基於細胞中一或多種特定分子的表現或存在，來分離不同細胞類型，該特定分子例如表面標記物（例如，表面蛋白）、細胞內標記物或核酸。在一些實施方式中，可使用用於分離基於這些標記的任何已知方法。在一些實施方式中，分離為基於親和性或免疫親和性之分離。例如，在某些方面，分離包括基於細胞的表現或一或多種標記物（通常是細胞表面標記物）的表現水平分離細胞和細胞族群，例如，藉由與此標記物特異性結合的抗體或結合配偶體一起培養，接著，通常藉由清洗步驟並將已結合抗體或結合配偶體的細胞與未結合抗體或結合配偶體的細胞分離。此分離步驟可基於正向選擇及/或負向選擇，正向選擇中保留已結合試劑之細胞供進一步使用，負向選擇中保留未與抗體或結合配偶體結合的細胞。在一些實例中，兩部分皆被保留供進一步使用。在某些方面，當無法取得能在非均質群體中特異性識別出細胞類型的抗體時，此時負向篩選特別有用，從而，因此，最好根據所欲群體以外之細胞所表現的標記物進行分離。分離並不需要導致100%富集或去除特定細胞族群或表現特定標記物的細胞。例如，用於特定類型細胞（例如，該些表現標記物的細胞）的正向篩選或富集係指增加此類細胞的數量或百分比，但不需造成完全去除不表現該標記物的細胞。同樣地，特定類型細胞（例如，表現有標記物的細胞）的負向篩選、去除或耗盡係指減少此類細胞的數量或百分比，但不需造成完全去除所有此類細胞。

在某些例示性實施方式中，進行多次分離步驟，其中來自一步驟的正向或負向選擇部分進行另一次的分離步驟，例如隨後的正向或負向選擇。在某些例示性實施方式中，單一分離步驟可同時剔除表現多種標記物的細胞，例如藉由將細胞與多個抗體或結合配偶體一起培養，各抗體或結合配偶體對於負向選擇用的靶定標記物具有特異性。同樣地，藉由將細胞與多種抗體或在各種細胞類型上表現的結合配偶體一起培養，可同時對多種細胞類型進行正向選擇。

在一些實施方式中，一或多種T細胞族群為富含有或被剔除掉對一或多種特定標記物（例如表面標記物）呈陽性（標記物⁺ ）或表現高水平（標記物^高）的細胞，或者為富含或被剔除掉對一或多種標記物呈陰性（標記物^- ）或表現相對低水平（標記物^低）。例如，在某些方面，藉由正向或負向選擇技術來分離出T細胞的特定亞群，例如，對一或多種表面標記物呈陽性或高表現量的細胞，例如CD28+、CD62L+、CCR7+、CD27+、CD127+、CD4+、CD8+、CD45RA+及/或CD45RO+ T細胞。在某些情況，此類標記物是在某些T細胞族群（例如非記憶細胞）上不存在或其表現量相對較低，但這些標記物存在在某些其他T細胞族群（如記憶細胞）中或其表現量相對較高。在一實施方式中，細胞（例如CD8+細胞或T細胞，例如CD3+細胞）富含（即正向選擇出）CD45RO、CCR7、CD28、CD27、CD44、CD127及/或CD62L為陽性或高表面表現量的細胞，及/或剔除（例如，用負向選擇出）CD45RA為陽性或高表面表現量的細胞。在一些實施方式中，細胞富含有或剔除掉CD122、CD95、CD25、CD27及/或IL7-Ra（CD127）為陽性或高表面表現量的細胞。在某些例示性實施方式中，CD8+ T細胞富含對CD45RO呈陽性（或CD45RA為陰性）和CD62L呈陽性的細胞。例如，可使用CD3/CD28共軛的磁珠（例如，DYNABEADS® M-450 CD3/CD28 T Cell Expander）正向選擇CD3+、CD28+ T細胞。

在一些實施方式中，藉由在非T細胞（例如，B細胞、單核球或其他白血球）上表現的標記物（例如，CD14）的負向選擇，T細胞可自PBMC樣本中分離。在某些方面，CD4+或CD8+篩選步驟係用於分離CD4+輔助細胞與CD8+細胞毒性T細胞。藉由對於在一或多個初始、記憶和/或作用T細胞亞群上有表現或表現量較高的標記物進行正向或負向選擇，將此類CD4+和CD8+族群進一步分選成亞群。在一些實施方式中，例如藉由基於與對應亞群相關的表面抗原進行正向或負向選擇，CD8+細胞被進一步富含或剔除初始、中樞性記憶、作用記憶及/或中樞性記憶幹細胞。在一些實施方式中，進行對中樞性記憶T（TCM）細胞的富集以增加功效，例如改善投與後的長期存活、擴增程度及/或植入狀況，在某些方面，這類亞群的療效尤其顯著。在一些實施方式中，合併富含TCM之CD8+ T細胞及CD4+ T細胞會進一步增強功效。

在一些實施方式中，記憶T細胞存在於CD8+周邊血液淋巴球的CD62L+和CD62L-子集中。PBMC可富含或剔除CD62L-CD8+及/或CD62L+CD8+部分，例如使用抗CD8和抗CD62L抗體。在一些實施方式中，CD4+ T細胞族群和CD8+ T細胞族群富含中樞性記憶（TCM）細胞。在一些實施方式中，中樞性記憶T（TCM）細胞的富集是基於CD45RO、CD62L、CCR7、CD28、CD3及/或CD127的陽性或高表面表現；在某些方面，其係基於對於表現或有高度表現的CD45RA及/或顆粒酶B之細胞的負向選擇。在某些方面，藉由剔除表現CD4、CD14、CD45RA之細胞，並對表現CD62L的細胞正向選擇或富集，進行分離富含TCM細胞的CD8+族群。一方面，進行富集中樞性記憶T（TCM）細胞係以基於CD4表現選擇陰性部分之細胞開始，將其以基於CD14和CD45RA的表現進行負向選擇，並以基於CD62L進行正向選擇。在某些方面，此類選擇是同時進行，而在其他方面是依序進行，但其順序不拘。在一些方面，用於製備CD8+細胞族群或亞群所使用的相同的基於CD4表現之選擇步驟亦會被用於產生CD4+細胞族群或亞群，從而基於CD4之分離的陽性和陰性部分兩者都會被保留，並在可選擇地一或多個進一步的正向或負向選擇步驟之後，用於該方法的後續步驟中。

藉由鑑定具有細胞表面抗原的細胞族群，將CD4+ T輔助型細胞分類為初級、中樞性記憶和作用性細胞。CD4+淋巴球可藉由標準方法獲得。在一些實施方式中，初級CD4+ T淋巴細胞為CD45RO-、CD45RA+、CD62L+、CD4+ T細胞。在一些實施方式中，中樞性記憶CD4+細胞為CD62L+和CD45RO+。在一些實施方式中，作用性CD4+細胞是CD62L-和CD45RO。在一實例中，為了以負向選擇富集CD4+細胞，單株抗體混合物通常包括抗CD14、CD20、CD11b、CD16、HLA-DR及CD8之抗體。在一些實施方式中，該抗體或結合配偶體被結合至固體支撐體或基質（例如，磁珠或順磁珠），以允許在正向及/或負向選擇中分離細胞。

在一些實施方式中，在基因工程化之前或之中，將細胞進行孵育及/或培養。孵育步驟可包括培養、養殖、刺激、活化及/或繁殖。在一些實施方式中，組成物或細胞在刺激條件或刺激劑存在下進行孵育，此條件包括被設計在族體中誘導細胞的增殖、擴增、活化及/或存活、模擬抗原暴露及/或啟動細胞進行基因工程化（例如，導入重組抗原受體）的那些條件，該條件可包括一或多種特定介質、溫度、氧含量、二氧化碳含量、時間、試劑，例如營養素、胺基酸、抗生素、離子及/或刺激因子，例如細胞激素、趨化因子、抗原、結合配偶體、融合蛋白、重組可溶性受體及欲用於活化細胞的任何其他試劑。在一些實施方式中，刺激條件或試劑包括一或多種試劑，例如配體，其能夠活化TCR複合物的細胞內信號傳導域。在某些方面，該試劑在T細胞中開啟或啟動TCR/CD3細胞內信號傳導級聯，此類試劑可包括抗體，例如對TCR成分及/或共刺激受體具有專一性的那些抗體，例如抗CD3、抗CD28，例如與固體支撐體（例如，珠子）結合的抗體及/或一種或多種細胞激素。可選擇地，擴增方法可進一步包括在培養基中加入抗CD3及/或抗CD28抗體的步驟（例如，濃度至少約0.5 ng/ml）。在一些實施方式中，刺激劑包括IL-2及/或IL-15，例如，濃度為至少約10個單位/mL的IL-2。

在另一實施方式中，藉由裂解紅血球並剔除單核球以從周邊血液中分離T細胞，例如，藉由經PERCOLL^TM 梯度之離心。或者，T細胞可從臍帶中分離出來。在任何情況下，以正向或負向選擇技術可進一步分離T細胞的特定亞群。

如此所分離出的臍帶血單核細胞可被剔除表現某些抗原的細胞，包括，但不限於CD34、CD8、CD14、CD19及CD56。剔除這些細胞可使用經分離的抗體、含抗體的生物樣本（如腹水）、結合物理性支撐體的抗體及結合抗體的細胞來完成。

經負向選擇富集T細胞族群可使用針對被負向選擇過的細胞所特有的表面標記物的抗體組合來完成，例示之方法是藉由負向磁性免疫黏附或流式細胞儀來進行細胞分選及/或選擇，其使用針對存在於經負向選擇的細胞上之細胞表面標記物的單株抗體混合物。例如，為了以負向選擇富集CD4+細胞，單株抗體混合物通常包括抗CD14、CD20、CD11b、CD16、HLA-DR及CD8之抗體。

為了藉由正向或負向選擇來分離所欲知細胞族群，可改變細胞濃度和表面（例如珠子等顆粒）。在某些實施方式中，可能需要顯著降低珠子和細胞混合在一起的體積（即，增加細胞濃度），以確保細胞和珠子的最大接觸。例如，在一實施方式中，使用20億個細胞/毫升的濃度。在另一實施方式中，使用10億個細胞/毫升的濃度。在另一實施方式中，使用大於1億個細胞/毫升。在另一實施方式中，使用1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500或5000萬個細胞/毫升的細胞濃度。在另一實施方式中，使用7500、8000、8500、9000、9500萬或1億個細胞/毫升的細胞濃度。在另一的實施方式中，可使用1.25或1.5億個細胞/毫升的濃度。使用高濃度可導致細胞產量、細胞活化和細胞擴增的增加。

在洗滌步驟後亦可冷凍T細胞，其不需單核球移除步驟。雖然不希望受理論約束，但冷凍和隨後的解凍步驟可藉由移除細胞族群中的顆粒球和一定程度的單核球而提供更均勻的產物。在移除血漿和血小板的洗滌步驟後，可將細胞懸浮於冷凍溶液中。雖然許多冷凍溶液和參數在本技術領域中是已知的並且在此情況下是有用的，但在非限制性實例中，一種方法涉及使用含20% DMSO及8%人類血清白蛋白的PBS或其他適當的細胞冷凍介質。然後，將細胞以每分鐘1℃的速率冷凍至-80℃，並將其儲存在液態氮儲存槽的氣相中。可使用控制冷凍的其他方法，及立即在-20℃或液氮中非控制性地冷凍。

在一實施方式中，T細胞族群被包含於下列細胞內，例如周邊血液單核細胞、臍帶血細胞、純化的T細胞族群及T細胞株。在另一實施方式中，周邊血液單核細胞包含T細胞族群。在另一實施方式中，純化的T細胞包含T細胞族群。免疫細胞之擴增

免疫細胞的擴增

無論在修飾細胞以表現標的CAR之前或之後，皆可使用如下列文獻所述之方法對細胞在數量上進行活化和擴增，例如美國專利號6,352,694、6,534,055、6,905,680、6,692,964、5,858,358、6,887,466、6,905,681、7,144,575、7,067,318、7,172,869、7,232,566、7,175,843、5,883,223、6,905,874、6,797,514、6,867,041、及美國專利公開號20060121005。例如，本發明之免疫細胞可藉由與附著有試劑及配體的表面接觸來擴增，該試劑刺激CD3/TCR複合物相關信號，而該配體刺激免疫細胞表面上的共刺激分子。具體而言，刺激免疫細胞族群可藉由與抗CD3抗體或其抗原結合片段接觸，或固定在表面上的抗CD2抗體接觸，或藉由與鈣離子運載物（ionophore）接合的蛋白質激酶C活化劑（例如，苔蘚蟲素（bryostatin））接觸。為了共刺激免疫細胞表面上的輔助分子，使用結合輔助分子的配體。例如，可在適於刺激免疫細胞增殖的條件下，將免疫細胞與抗CD3抗體及抗CD28抗體接觸，抗CD28抗體的實例包括9.3、B-T3、XR-CD28（Diaclone，Besancon，France），其等皆可用於本發明，亦可使用本技術領域已知的其他方法和試劑（參見例如，ten Berge et al.,Transplant Proc .（1998）30（8）：3975-3977；Haanen et al., J. Exp. Med .（1999）190（9）：1319-1328；及 Garland et al.,J. Immunol .Methods （1999）227（1-2）：53-63）。

藉由本文所揭示之方法擴增免疫細胞可增加約10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍、200倍、300倍、400倍、500倍、600倍、700 fold, 800倍、900倍、1000倍、2000倍、3000倍、4000倍、5000倍、6000倍、7000倍、8000倍、9000倍、10,000倍、100,000倍、1,000,000倍、10,000,000倍或更多，及其等倍數間的任一、所有、全部，或部分整數。在一實施方式中，免疫細胞的擴增範圍約20倍至約50倍之間。

培養後，免疫細胞可在培養裝置中的細胞培養基中培養一段時間，或直到細胞達到融合滿度（confluency）或高細胞密度，用於在將細胞過繼至另一培養裝置之前到達最佳繼代。培養裝置可為一般用於活體外培養細胞的任何培養裝置。在某些例示性實施方式中，在將細胞過繼至另一培養裝置之前，融合滿度為70%或更高。在特定例示性實施方式中，融合滿度為90%或更高。一段時間可為適於活體外培養細胞的任何時間。免疫細胞培養基可在免疫細胞培養期間的任何時間被替換在某些例示性實施方式中，免疫細胞培養基每2至3天更換一次，然後從培養裝置中收取免疫細胞，免疫細胞可立即使用或冷凍保存以備後續使用。在一實施方式中，本發明包括冷凍保存的擴增的免疫細胞，在將核酸引入免疫細胞之前，會將冷凍保存的免疫細胞解凍。

在另一實施方式中，該方法包括分離免疫細胞及擴增免疫細胞。在另一實施方式中，本發明進一步包含在擴增前冷凍保存免疫細胞以保存之。在另一實施方式中，將冷凍保存的免疫細胞解凍用於以編碼嵌合膜蛋白的RNA進行電穿孔。

離體擴增細胞的另一方法係描述於美國專利號5,199,942中（其藉由引用併入本文）。例如美國專利號5,199,942中所述的擴增可為本文所述的擴增方法的替代形式或以外的方法。簡而言之，離體培養及免疫細胞的擴增包含添加例如美國專利號5,199,942中所述之細胞生長因子或其他因子，例如flt3-L、IL-1、IL-3及c-kit配體。在一實施方式中，擴增免疫細胞包含以選自flt3-L、IL-1、IL-3及c-kit配體所組成群組之因子培養免疫細胞。

如本文所述之培養步驟（與本文所述之試劑接觸或在電穿孔後接觸）時間可非常短暫，例如小於24小時，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22或23小時。如本文進一步描述的培養步驟（與本文所述知試劑接觸）可較長，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或更多天。

有各種術語用於描述培養中的細胞，細胞培養通常指稱自活體生物中取出並在控制條件下生長的細胞。初代細胞培養物為一種直接自生物體中取出的細胞、組織或器官並在第一次繼代培養前的培養物。當在促進細胞生長及/或分裂的條件下，將細胞置於生長培養基中時，在培養下擴增細胞，產生更大的細胞群。當在培養下擴增細胞時，細胞增殖速率通常藉由細胞在數量上倍增所需的時間量來測量，也稱為倍增時間。

每一輪的繼代培養稱為一次繼代。當細胞進行繼代培養時，其等被歸類為已經繼代。特定的細胞群或細胞株有時被歸類為繼代的次數或以其繼代的次數來表徵。例如，已繼代十次的培養細胞群歸類為P10培養物。初代培養物，即從組織中所分離出之細胞的第一次培養物，命名為P0。在第一次繼代培養後，將細胞稱為次級培養物（P1或第1代）。在第二次繼代培養後，該些細胞變成三級培養物（P2或第2代），依此類推。本領域技術人員將可理解，在繼代期間可能存在許多群體倍增。因此，培養物的群體倍增的次數會大於繼代次數。在繼代與繼代之間的期間，細胞的擴增（即群體倍增的數量）取決於許多因素，包括，但不限於接種密度、基質、培養基和繼代之間的時間。

在一實施方式中，可培養細胞數小時（約3小時）至約14天或之間的任何整數值小時數。適於免疫細胞培養的條件包括適當的培養基（例如，低基礎培養基（Minimal Essential Media）或RPMI 1640培養基或X-vivo 15，（Lonza）），其可包含增殖和活性所必需的因子，包括血清（例如，胎牛或人類血清）、介白素-2（IL-2）、胰島素、IFN-γ、IL-4、IL-7、GM-CSF、IL-10、IL-12、IL-15、TGF-β和TNF-α或本領域技術人員已知的用於細胞生長的任何其他添加劑。其他用於細胞生長的添加劑包括，但不限於介面活性劑、血漿蛋白（plasmanate）及還原劑，例如N-乙醯基-半胱胺酸及2-巰基乙醇。培養基可包括RPMI 1640、AIM-V、DMEM、MEM、α-MEM、F-12、X-Vivo 15和X-Vivo 20、Optimizer，並可添加胺基酸、丙酮酸鈉和維生素，且可不含血清，或可補充適當量的血清（或血漿）或一組確定的激素，及/或足以使免疫細胞生長並擴增的細胞激素的量。僅在實驗培養物中包括例如青黴素和鏈黴素之抗生素，而不包括於欲注入受試者之細胞培養物中。標靶細胞係維持在支持生長所需的條件下，例如適當溫度（例如37℃）及氣體環境下（例如空氣加5% CO₂ ）。

用於培養免疫細胞的培養基可包括可共刺激免疫細胞的試劑，例如，可刺激CD3的試劑維抗CD3的抗體，可刺激CD28的試劑是抗CD28的抗體。這是因為，如經由本文揭示之數據所證實，藉由本文揭示之方法所分離的細胞可擴增大約10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍、200倍、300倍、400倍、500倍、600倍、700倍、800倍、900倍、1000倍、2000倍、3000倍、4000倍、5000倍、6000倍、7000倍、8000倍、9000倍、10,000倍、100,000倍、1,000,000倍、10,000,000倍或更大。在一實施方式中，藉由培養經電穿孔處理之群體，免疫細胞擴增至範圍約2倍至約50倍或更多。在一實施方式中，藉由抗CD3抗體披覆的KT64.86人工抗原呈現細胞（aAPC）擴增人類T調節細胞。擴增和活化免疫細胞的方法可在美國專利號7,754,482、8,722,400及9,555,105中找到，並以其整體併入本文。

在一實施方式中，擴增免疫細胞的方法可進一步包含分離經擴增的免疫細胞以供進一步的應用。在另一實施方式中，擴增方法可進一步包含將擴增過的免疫細胞進行後續的電穿孔，然後進行培養。後續的電穿孔可以包括將編碼試劑的核酸導入經擴增的免疫細胞群中，例如轉導經擴增的免疫細胞、轉染經擴增的免疫細胞，或用電穿孔方式將核酸導入經擴增之知免疫細胞，其中前述試劑會進一步刺激免疫細胞。該試劑可刺激免疫細胞，例如藉由刺激進一步擴增、反應功能或其他免疫細胞功能。

治療方法

黏夜蛋白是高分子量的醣化蛋白，在正常、健康的細胞中的功能是當在上皮細胞中過度表達時，對毒素和誘變劑起物理化學性保護。在其他健康細胞類型中被注意到，黏液蛋白可作為黏附調節劑或在信號轉導及細胞生長調節中發揮作用。（Winterford et al.（1999）J Histochem Cytochem , 47（8）:1063-1074）。腫瘤形成和轉移已顯示出隨著各種蛋白質的黏液蛋白之細胞表面醣基化（添加糖部分至特定胺基酸後的蛋白質修飾）的變化而增加（Ren et al.（2014）Tumour Biol , 35（10）:9603-9612；Tarp et al.（2008）Glycobiology , 17（2）:197-209；Taylor-Papadimitriou et al.（1999）1455（2-3）:301-313），20種胺基酸中的至少9種可被多種碳水化合物修飾（Stowell et al.（2015）Annu Rev Pathol , 10:473-510），Tn（GalNAca1-O-Ser/Thr）及唾液酸化Tn（STn）（NeuAca2-6-GalNAca1-O-Ser/Thr）是癌症中發現最普遍的異常醣型之一（Springer（1984）Science , 224（4654）:1198-1206），此異常醣基化亦導致全長黏液蛋白1糖蛋白（稱為TnMUC1）的腫瘤特異性形式，據認為在致癌作用中起關鍵作用（Ju et al.（2005）Nature , 437（7063）:1252；Ju et al.（2008）Cancer Res , 68（6）:1636-1646；Ju et al.（2014）Cancer Biomark , 14（1）:63-81；Varki et al.（2017）Essentials of Glycobiology [Internet]. 3rd edition. Cold Spring Harbor（NY）：Cold Spring Harbor Laboratory Press；2015-2017）。Tn/sTn醣型的異常表現特別在細胞膜結合黏液蛋白（MUC1）上發現，MUC1是一種大型蛋白質，具有攜帶在大多數腺癌中過表現之O-多醣的串列重複序列（Cascio et al.（2017）Oncotarget , 8（62）:105284-98；Finn et al.（2011）Immunol Research , 50（2-3）:261-268）。一些上皮來源之健康組織在細胞表面表現MUC1（Winterford et al.（1999）J Histochem Cytochem , 47（8）:1063-1074）；異常糖化形式（TnMUC1）在高基氏體（Golgi）中表現，而且是在細胞表面觀察到的全長MUC1的前體（Posey et al.（2016）Immunity , 44（6）:1444-1454）。腫瘤相關TnMUC1在一部分多發性骨髓瘤病例中過表現（Andrulis et al.（2014）Histopathology , 64:799-806；Cloosen et al.（2006）British Journal of Haematology , 135:513-516），及在各種實質固態瘤中過表現，包括：乳腺、結腸、肺臟，胃、卵巢和胰腺，其中膜極性的喪失和異常O-醣基化導致腫瘤細胞表面上的Tn和STn糖型的表現（Lavrsen et al.（2013）Glycoconjugates , 30（3）:227-236；Pinto et al.（2012）J Cellular Mol Medicine , 16:1474-1484；Sørensen et al.（2006）Glycobiology , 16:96-107）。

一方面，本發明包括一種在所需受試者中治療MUC1相關癌症的方法。另一方面，本發明包括一種在受試者中治療MUC1相關癌症的方法，包含投予受試者所需之治療有效的本發明經修飾之免疫細胞群。在一些實施方式中，MUC1相關癌症選自多發性骨髓瘤、乳癌、結腸癌、肺癌、胃癌、卵巢癌及胰臟癌所組成之群組。在一些實施方式中，MUC1相關癌症選自MUC1相關乳癌、MUC1相關多發性骨髓瘤、MUC1相關非小細胞肺癌、MUC1相關胰腺癌、MUC1相關卵巢及輸卵管癌所組成之群組。

該方法包含投予受試者本發明之經修飾之免疫細胞（例如，MUC1 CAR T細胞）。

如本文所使用，術語「受試者」和「病患」係指本發明方法欲治療之生物體。術語「受試者」和「病患」在本文中可以互換使用，這些生物體包括，但不限於哺乳動物（例如，鼠類、猿猴、馬、牛、豬、犬、貓等），且在例示性實施方式中包括人類。如本文所使用，術語「處理」及「治療」包括導致症狀、疾病、失調等的改進或改善其徵狀的任何效果，例如，減輕、減少、調節、改善或消除，例如，減少癌細胞數量、減少腫瘤大小、減輕腫瘤負擔、減少癌細胞向周圍器官的浸潤率或減少腫瘤轉移或腫瘤生長速度。

可以多種方法衡量癌症的正向治療作用（參見，W. A. Weber, J. Null. Med. 50:1S-10S（2009）；Eisenhauer et al., Eur. J. Cancer 45:228-247（2009））。在一些實施方式中，對於標的CAR T細胞療法（例如，TN-MUC1 CAR T細胞療法）的緩解係使用RECIST 1.1標準評估（參見，Eisenhauer et al.,supra ）。在一些實施方式中，藉由治療有效量（例如，TN-MUC1 CAR T細胞療法之量）達成治療為部分緩解（PR）、完全緩解（CR）、無惡化存活期（PFS）、無疾病存活期（DFS）、客觀緩解（OR）、緩解持續時間的變化（例如，緩解持續時間增加）、緩解時間的變化（例如，縮短至緩解的時間）或整體存活（OS）中的任一者。本文所述之治療有效量係有效治療病患之乳癌，其可根據各種因素而變化，例如，病患的疾病狀態、年齡和體重，以及該療法在受試者中中引起抗癌反應的能力。

如本文所述，「RECIST 1.1反應標準」意指載於Eisenhauer et al.（2009）Eur J Cancer , 45（2）:228-247中之定義，對於目標病變或非目標病變，基於測量反應的背景下視情況而定。

「腫瘤」當其用於被診斷具有癌症或被懷疑具有癌症（例如，MUC1相關乳癌、MUC1相關多發性骨髓瘤、MUC1相關非小細胞肺癌、MUC1相關胰腺癌、MUC1相關卵巢及輸卵管癌）之受試者時，係指任何大小的惡性或潛在惡性腫瘤或組織塊。

「腫瘤負擔」亦指「腫瘤負荷」，其係指分佈在全身的腫瘤物質的總量，腫瘤負擔係指包括淋巴結和骨髓的整個體內癌細胞的總數或腫瘤的總大小。腫瘤負擔可藉由本技術領域已知的各種方法確定，具例而言，例如，藉由測量從受試者中取出的腫瘤的尺寸，例如，使用卡尺或在體內使用成像技術（例如，超音波、骨掃描、電腦斷層掃描（CT）或磁共振成像（MRI）掃描）。

術語「腫瘤大小」係指腫瘤的總大小，可測量腫瘤的長度和寬度。腫瘤大小可藉由本技術領域已知的各種方法確定，舉例而言，如藉由測量從受試者中取出後的腫瘤尺寸，例如，使用卡尺，或在體內使用成像技術（例如，骨掃描，超聲，CT或MRI掃描）。

一方面，本發明包括一種在所需受試者中治療MUC1相關乳癌的方法，包含投予該受試者治療有效之經修飾之免疫細胞群，其中經修飾之免疫細胞包含嵌合抗原受體（CAR）。在某些實施方式中，CAR包含MUC1-特異性抗原結合域、跨膜域、共刺激信號傳導域及細胞內信號傳導域。

一方面，本發明包括一種在所需受試者中治療MUC1相關多發性骨髓瘤的方法，包含投予受試者治療有效之經修飾之免疫細胞群，其中經修飾之免疫細胞包含嵌合抗原受體（CAR）。在某些實施方式中，CAR包含MUC1-特異性抗原結合域、跨膜域、共刺激信號傳導域及細胞內信號傳導域。

一方面，本發明包括一種在所需受試者中治療MUC1相關非小細胞肺癌的方法，包含投予受試者治療有效之經修飾之免疫細胞群，其中經修飾之免疫細胞包含嵌合抗原受體（CAR）。在某些實施方式中，CAR包含MUC1-特異性抗原結合域、跨膜域、共刺激信號傳導域及細胞內信號傳導域。

一方面，本發明包括一種在所需受試者中治療MUC1相關胰腺癌的方法，包含投予受試者治療有效之經修飾之免疫細胞群，其中經修飾之免疫細胞包含嵌合抗原受體（CAR）。在某些實施方式中，CAR包含MUC1-特異性抗原結合域、跨膜域、共刺激信號傳導域及細胞內信號傳導域。

一方面，本發明包括一種在所需受試者中治療MUC1相關卵巢及/或輸卵管癌症的方法，包含投予受試者治療有效之經修飾之免疫細胞群，其中經修飾之免疫細胞包含嵌合抗原受體（CAR）。在某些實施方式中，CAR包含MUC1-特異性抗原結合域、跨膜域、共刺激信號傳導域及細胞內信號傳導域。

在某些實施方式中，MUC1-特異性抗原結合域結合MUC1之醣化形式，即，對於MUC1之醣基表位具有特異性。在某些實施方式中，MUC1-特異性抗原結合域對於MUC1之截斷醣基表位具有特異性。在某些實施方式中，MUC1-特異性抗原結合域對於TnMUC1具有特異性。在某些實施方式中，MUC1-特異性抗原結合域可包含SEQ ID NO：22、23及24之重鏈互補性決定區（CDR）序列及/或SEQ ID NO:19、20及21之輕鏈互補性決定區（CDR）序列。在某些實施方式中，MUC1-特異性抗原結合域可包含所有SEQ ID NO：19-24六個互補性決定區（CDR）序列。在某些實施方式中，MUC1-特異性抗原結合域可包含SEQ ID NO：5之重鏈可變域（VH）序列及/或SEQ ID NO：6之輕鏈可變域（VL）序列。在某些實施方式中，MUC1-特異性抗原結合域包含SEQ ID NO：2胺基酸序列。

用於本發明方法的CAR可包含跨膜域，其選自人工疏水性序列、第1型跨膜蛋白質跨膜域、T細胞受體之α、β或ζ鏈、CD28、CD3 ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、OX40（CD134）、4-1BB（CD137）及CD154所組成之群組。在某些例示性實施方式中，跨膜域包含CD8a跨膜域。

CAR可包含共刺激信號傳導域，該共刺激信號傳導域包含選自TNFR超家族成員、CD27、CD28、4-1BB（CD137）、X40（CD134）、CD30、CD40、PD-1、ICOS、淋巴細胞功能相關抗原-1（LFA-1）、CD2、CD5、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、特異性結合CD83之配體、DAP10、DAP12、Lck、Fas及其等之任何組合所組成群組之蛋白質的共刺激域。在某些例示性實施方式中，共刺激信號傳導域包含4-1BB共刺激域。

細胞內信號傳導域可包含蛋白質之信號傳導域，該蛋白質之信號傳導域選自CD3 ζ、FcyRIII、FcsRI、Fc 受體之胞質尾、攜帶細胞質受體的免疫受體酪胺酸系活化基序（ITAM）、TCR ζ、FcR γ、FcR β、CD3 γ、CD3 δ、CD3 ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b及CD66d所組成之群組。在某些例示性實施方式中，細胞內信號傳導域包含CD3 ζ 信號傳導域。

CAR可進一步包含CD8a前導子序列及/或細胞外鉸鏈域，該CD8a前導子序列及/或細胞外鉸鏈域選自抗體Fc片段、抗體鉸鏈區、抗體CH2區、抗體CH3區、人工間隔子序列、含CD8之胺基酸序列的鉸鏈及其等之任何組合所組成之群組。在某些例示性實施方式中，細胞外鉸鏈域包含CD8a細胞外鉸鏈域。

在某些實施方式中，藉由含核苷酸序列SEQ ID. NO：1、38、40、42、44或46的核酸序列編碼CAR。在某些實施方式中，CAR包含胺基酸序列SEQ ID NO：2、39、41、43、45或47。

在某些例示性實施方式中，藉由含核苷酸序列SEQ ID NO：46之核酸序列編碼CAR。在某些例示性實施方式中，CAR包含胺基酸序列SEQ ID NO：47。

本文CAR當存在於T淋巴球或NK細胞時，可調控對目標的細胞毒性。本文CAR結合存在於標靶細胞上的抗原，因此藉由經遺傳修飾產生CAR的T淋巴球或NK細胞調控殺滅標靶細胞。CAR之抗原-結合域（例如，抗-TN-MUC1 scFv）結合存在於標靶細胞上的抗原（例如，TN-MUC1抗原）。標靶細胞包括，但不限於癌細胞，例如，乳癌細胞。因此，本文提供殺滅標靶癌細胞或抑制其生長的方法，該方法涉及接觸細胞毒性免疫效應細胞（例如，細胞毒性T細胞或NK細胞），其經遺傳修飾產生標的CAR，從而T淋巴球或NK細胞識別存在於標靶癌細胞上的抗原，並調控殺滅標靶細胞。

本文提供一種在具有癌症之受試者中治療癌症的方法，該方法包含：i）導入本文之嵌合抗原受體或導入本文之表現載體至細胞，以製造經修飾之細胞；及ii）投予經修飾之細胞至受試者。在一些實施方式中，該細胞獲自受試者（即，該細胞是自體的）、離體工程化及投予至相同受試者。在一些實施方式中，細胞獲自一受試者、離體工程化及投予至第二位適當的受試者（即，該細胞是同種異體的）。

在一些實施方式中，所提供之方法包括從受試者收回細胞毒性細胞，藉由導入本發明CAR基因至細胞毒性細胞以基因修飾細胞毒性細胞，及投予經修飾之細胞毒性細胞至受試者。在一些實施方式中，細胞毒性細胞選自T細胞、初始T細胞、記憶T細胞、作用T細胞、天然殺手細胞及巨噬細胞。在一實施方式中，細胞毒性細胞為T細胞。

在一實施方式中，T細胞獲自受試者，T細胞可獲自數種來源，包括周邊血液單核細胞、骨髓、淋巴結組織、臍帶血、胸腺組織、感染部位組織、腹水、胸腔積液、脾組織和腫瘤的組織。在一些本發明之實施方式中，可使用本技術領域可獲得之任何數量的T細胞株。在一些本發明之實施方式中，可使用本領域技術人員已知的多種技術，例如Ficoll^TM 分離，自受試者收集的血液中獲得T細胞。

例如，在一實施方式中，T細胞藉由與抗CD3/抗CD28（即，3x28）-共軛珠子（例如DYNABEADS® M-450 CD3/CD28 T）一起孵育一段足以正向選擇所需T細胞的時間而予以分離。在一實施方式中，該一段時間約為30分鐘。在一實施方式中，該一段時間範圍在30分鐘至36小時或更長以及之間的所有整數值。在一實施方式中，該一段時間為至少1、2、3、4、5或6小時。在一實施方式中，該一段時間為10至24小時。在一實施方式中，孵育時間為24小時。為了從患有白血病的病患中分離T細胞，使用較長的孵育時間（例如24小時）可增加細胞產量。當與其他細胞類型相比，在T細胞很少的任何情況下，例如從腫瘤組織或免疫功能低下的個體中分離腫瘤浸潤淋巴球（TIL）的情況下，可使用較長的孵育時間來分離T細胞。此外，使用較長的孵育時間可增加捕獲CD8+ T細胞的效率。因此，藉由簡單地縮短或延長時間，可使T細胞與CD3/CD28珠結合及/或藉由增加或減少珠子與T細胞的比例（如本文進一步描述的），可以在培養起始時或過程中其他時點優先選擇T細胞亞群。另外，藉由增加或減少珠子或其他表面上抗CD3和/或抗CD28抗體的比例，可以在培養起始時或在其他所需時間點優先選擇T細胞亞群。技術人員將認識到，在本發明上下文中亦可使用多輪選擇。在一些實施方式中，可能需要執行選擇過程並在活化和擴增過程中使用「未選擇的」細胞，亦可將「未選擇的」細胞用於進一步的選擇。

然後如本文所述之修飾所獲得的細胞，將通常位於表現載體中的編碼標的CAR（例如，TN-MUC1 CAR）的多核苷酸導入細胞毒性細胞，從而該細胞毒性細胞將表現，較佳為穩定地表現CAR。在一些實施方式中，編碼CAR的多核苷酸亦編碼用於轉基因多肽產物之CAR可誘導表現匣，該產物在CAR信號傳導時產生並釋放。在一些實施方式中，編碼CAR的多核苷酸亦編碼可操作地連接至T-細胞活化反應啟動子的細胞介素（例如，IL-12）。在一些實施方式中，表現載體包含編碼CAR的多核苷酸及編碼可操作地連接至T-細胞活化反應啟動子的細胞介素的多核苷酸二者，參見例如，Chmielewski and Abken,Expert Opin. Biol. Ther. （ 2015）15（8）：1145-1154；及Abken,Immunotherapy （ 2015）7（5）：535-544。在一些實施方式中，以含編碼CAR的多核苷酸之表現載體及含編碼細胞介素（例如，IL-12）的多核苷酸之表現載體將細胞基因工程化，該細胞介素可操作地連接至T-細胞活化反應啟動子。在一些實施方式中，多核苷酸的導入不必導致整合，而只是短暫維持導入的多核苷酸就足夠。在此方式中，可能具有短期作用，即，可將細胞毒性細胞導入宿主，然後在預定時間（例如，在細胞能夠遷移到特定部位進行治療後）開啟。

根據細胞毒性細胞的性質及欲治療的疾病，可將經修飾之細胞毒性細胞（例如，經修飾之T細胞）以廣泛不同的方式導入受試者中，例如，哺乳動物。可將基因工程化細胞毒性細胞導入腫瘤位置處。在一實施方式中，基因工程化的細胞毒性細胞導引至癌症或被修飾以導引至癌症。所施用的經修飾的細胞毒性細胞的數量將依據因子的數量，例如情況、引入之目的、細胞壽命、所使用的方案而定。例如，所施用的經修飾的細胞毒性細胞的數量可根據給藥次數、細胞增殖能力及重組構建體的穩定性而定。經修飾之細胞毒性細胞可作為分散液注射於感興趣之部位或附近。在一實施方式中，細胞可在生理上可接受的培養基中。

應當理解，治療方法受制於很多變量，例如對CAR的細胞反應（例如，TN-MUC1 CAR）、細胞毒性細胞表現CAR的效率，以及如果適用，分泌的水平、經表現之CAR的活性、受試者的特定需求（可能隨時間和環境而變化）、由於經修飾之細胞毒性細胞或個別細胞的表現活性的喪失所引起的細胞活性喪失速率等。因此，期望對於每位個別病患，即使存在可對整個人群施用的通用細胞，也將監測每位病患的個體合適劑量，且這種監測病患的做法在技術領域中是常規的。

因此，在一例示性實施方式中，本發明提供一種在所需受試者中治療MUC1相關癌症的方法，包含投予受試者治療有效之含經修飾之T細胞的組成物，該T細胞包含：含重鏈可變（VH）域及輕鏈可變（VL）域之MUC1-特異性抗原結合域，其中VH域包含SEQ ID NO：22、23及24所述之重鏈互補性決定區（CDR）序列，且其中VL域包含SEQ ID NO：19、20及21所述之輕鏈互補性決定區（CDR）序列；可選擇地鉸鏈域；跨膜域；共刺激信號傳導域；及細胞內信號傳導域。

在一例示性實施方式中，本發明提供一種在所需受試者中治療MUC1相關癌症的方法，包含投予受試者治療有效之含經修飾之T細胞的組成物，該T細胞包含：含重鏈可變（VH）域及輕鏈可變（VL）域之MUC1-特異性抗原結合域，其中VH域包含SEQ ID NO：22、23及24所述之重鏈互補性決定區（CDR）序列，且其中VL域包含the SEQ ID NO：19、20及21所述之輕鏈互補性決定區（CDR）序列；可選擇地CD8α 鉸鏈域；CD8α跨膜域；CD2共刺激信號傳導域；及CD3 ζ細胞內信號傳導域。

欲以經修飾之細胞毒性細胞（例如，含TN-MUC1 CAR之經修飾之T細胞）或本發明之醫藥組成物治療的癌症種類例示類型包括乳癌。在某些實施方式中，以本發明之任何方法治療的乳癌的特徵在於MUC1的異常醣基化。

在組織學上被診斷為激素受體（HR，雌激素受體，ER或助孕酮受體，PR）陰性和人類表皮生長因子受體2（HER2）陰性的乳癌被稱為三陰性乳癌（TNBC）且約佔所有乳癌的15％。由於該疾病的侵襲性和高增殖指數，TNBC總體上效果較差；此乳腺癌子集的護理標准通常與其他子集不同（Gradishar et al.（2018）NCCN Guidelines v.2018 Breast Cancer. https://www.nccn.org/professionals /physician_gls/pdf/breast.pdf（accessed Feb. 2019））。如同所有乳癌，局部療法同時使用外科手術和放射療法，然而，儘管局部療法足夠，但許多患有TNBC的病患仍持續發展出遠端轉移性疾病。這些病患中的大多數對習知化學療法的反應不佳，迄今為止，幾乎沒有明確、確定可有效治療TNBC的藥物目標（Gerratana et al.（2018）Cancer Treat Rev , 68:102-110）。

轉移性TNBC的需求尚未得到滿足，從轉移性疾病初步診斷開始的中位數OS為6個月，而激素受體陽性及/或Her2陽性轉移性乳癌的病患為20個月。以不同的生物學和靶標，轉移性HER2陽性及激素受體陽性乳癌的療效持續改善，然而，TNBC仍未得到滿足（Ganesan et al.（2014）Mol Cancer Ther , 12:3175-3184），以抑制PD-1/PD-L1的免疫治療已在臨床研究中證明對晚期TNBC有希望的結果，阿特珠單抗（Atezolizumab）與標準化學療法藥物（nab-紫杉醇）的組合在晚期TNBC中表現出PFS（所有病患）和OS的顯著改善（PD-L1陽性，Schmid et al.（2018）New England J Med , 379（22）:2108-2121）。

在一些實施方式中，乳癌為激素受體陽性（HR-陽性）。在一些實施方式中，乳癌為激素受體陰性。在一些實施方式中，乳癌為雌激素受體陰性。在一些實施方式中，乳癌為助孕酮受體陰性。在一些實施方式中，乳癌為Her2受體陰性。在一些實施方式中，乳癌為轉移性乳癌。在一些實施方式中，乳癌為三陰性乳癌（ER-陰性、PR-陰性及HER2-陰性）。在一些實施方式中，乳癌為三陽性乳癌（ER-陽性、PR-陽性及HER2-陽性）。在一些實施方式中，乳癌為三陰性、轉移性乳癌。在一些實施方式中，乳癌為無法治愈、無法切除、局部發展或轉移性乳癌（LA/MBC）。在一些實施方式中，乳癌為ER-陰性及/或PR-陽性及HER2-陰性乳癌。在一些實施方式中，乳癌為HER2-陽性及LA/MBC。在一些實施方式中，乳癌為三陰性乳癌及LA/MBC。

例示的乳癌是在表現癌症（即，TnMUC1-表現癌症）中異常表現醣化MUC1（例如，TnMUC1）的那些乳癌。在某些例示性實施方式中，乳癌係選自癌、肉瘤、葉狀瘤、柏哲德（Paget）氏病和血管肉瘤所組成之群組。在某些例示性實施方式中，乳癌係選自下列所組成之群組：導管原位癌、浸潤性導管癌或其亞型（例如，乳腺管狀癌、乳腺髓樣癌、黏液蛋白乳腺癌、乳腺乳突狀癌，乳腺篩板狀癌等）、浸潤性小葉癌、炎性乳癌、原位小葉癌、男性乳癌，乳頭柏哲德氏病、乳腺葉狀腫瘤、轉移性乳癌及某些分子亞型（例如，管狀A型（Luminal A）乳癌、管狀B型乳癌、三陰性/基底樣乳癌、HER2富集乳癌、正常樣乳腺）。

乳癌之特徵可為表現數種標記物，例如，乳癌可為雌激素受體陽性（ER+）乳癌、助孕酮受體陽性（PR+）乳癌、激素受體陰性（HR-）乳癌、HER2基因過表現（HER2+）乳癌、HER2基因野生型或表現不足（HER2-）乳癌。乳癌可為第1族（管狀A型）乳癌，即，ER+/PR+/HER2-、第2族（管狀B型）乳癌，即，ER+/PR-/HER2+、第3族（HER2+）乳癌，即，ER-/PR-/HER2+或第4族（基底樣或三陰性（TN））乳癌，即，ER-/PR-/HER2-。

乳癌可分為1級、2級或3級。1級或分化程度高（分數3、4或5）的乳癌包含生長較慢的細胞，與較高乳癌等級相比，看起來更像是正常的乳腺組織。2級或中度分化（分數6、7）的乳癌包含的細胞以介於1級與3級之間的速度增長並看起來像其等某處的細胞。3級或分化差（分數8、9）的乳癌包含看起來與正常細胞非常不同的細胞，通常比1或2級的細胞生長和擴散更快。

因此，在一例示性實施方式中，本發明提供一種在所需受試者中治療MUC1相關三陰性乳癌的方法，包含投予受試者治療有效之含經修飾之T細胞的組成物，該T細胞包含：含重鏈可變（VH）域及輕鏈可變（VL）域之MUC1-特異性抗原結合域，其中VH域包含SEQ ID NO：22、23及24所述之重鏈互補性決定區（CDR）序列，且其中VL域包含SEQ ID NO：19、20及21所述之輕鏈互補性決定區（CDR）序列；可選擇地鉸鏈域；跨膜域；共刺激信號傳導域；及細胞內信號傳導域。

在一例示性實施方式中，本發明提供一種在所需受試者中治療MUC1相關三陰性乳癌的方法，包含投予受試者治療有效含經修飾之T細胞的組成物，該T細胞包含：含重鏈可變（VH）域及輕鏈可變（VL）域之MUC1-特異性抗原結合域，其中VH域包含SEQ ID NO：22、23及24所述之重鏈互補性決定區（CDR）序列，且其中VL域包含SEQ ID NO：19、20及21所述之輕鏈互補性決定區（CDR）序列；可選擇地CD8α鉸鏈域；CD8α跨膜域；4-1BB共刺激信號傳導域；及CD3 ζ細胞內信號傳導域。

在一例示性實施方式中，本發明提供一種在所需受試者中治療MUC1相關三陰性乳癌的方法，包含投予受試者治療有效含經修飾之T細胞的組成物，該T細胞包含：含重鏈可變（VH）域及輕鏈可變（VL）域之MUC1-特異性抗原結合域，其中VH域包含SEQ ID NO：22、23及24所述之重鏈互補性決定區（CDR）序列，且其中VL域包含SEQ ID NO：19、20及21所述之輕鏈互補性決定區（CDR）序列；可選擇地CD8α鉸鏈域；CD8α跨膜域；CD2共刺激信號傳導域；及CD3 ζ細胞內信號傳導域。

欲以經修飾之細胞毒性細胞（例如，含TN-MUC1 CAR之經修飾之T細胞）或本發明之醫藥組成物治療的癌症種類例示類型包括多發性骨髓瘤，多發性骨髓瘤（MM）定義為是一種由無性繁殖骨髓漿細胞的積累及發展臨床併發症的疾病，該併發症包括高鈣血症、腎功能不全、徵狀性貧血、破壞性溶解性骨病變及對感染的易感性。根據美國國家癌症研究所的監測，流行病學和最終結果（National Cancer Institute Surveillance, Epidemiology, and End Results，NCI SEER）數據庫的估計，有超過30,000名病患被診斷出患有多發性骨髓瘤，死亡率超過12,000（Siegel（2016）CA Cancer J Clin , 66:7-30）。在過去的十年中，多發性骨髓瘤的治療取得了顯著進展，並且越來越多的藥物靶向多發性骨髓瘤血漿細胞，包括蛋白酶體抑製劑、免疫調節藥物（IMiD）、類固醇及烷化劑現已在臨床上使可，從而大多數新近診斷出的病患者對初始療法產生反應。在誘導療法之後進行大劑量化學療法和自體幹細胞移植（ASCT）時，約有三分之一的病患會完全緩解，且更多的人會遇到具有臨床意義的反應（San Miguel et al.（2013）Lancet Oncol , 14:1055-1066）。儘管取得了這些進展，甚至在藉由敏感的分子或流式細胞術檢測法達到深度緩解的病患中，幾乎所有病患都隨著疾病的複發而變得對逐次療法越來越難治療（Martinez-Sanchez et al.（2008）Br J Haematology , 142:766-774；Paiva et al.（2012）Blood , 119:687-691）。

在硼替佐米（bortezomib）和IMiD的抗藥性疾病患者中，中位數無惡化生存期（progression free survival）和總體生存期（OS）一般被報告為6到9個月（Kumar et al.（2012）Leukemia , 26:149-157）。第二代蛋白酶體抑製劑（例如，卡非佐米（carfilzomib））、IMiD（例如，（泊馬度胺）pomalidomide）和單株抗體（例如，達雷木單抗（daratumumab））是有用的添加物，但只能逐步改善結果（中位數無惡化生存期[PFS] 3至4個月）（Siegel（2016）CA Cancer J Clin , 66:7-30；San Miguel et al.（2013）Lancet Oncol , 14:1055-1066；Lonial et al.（2016）Lancet , 387（10027）:1551-1560）。使用抑制PD-1/PD-L1檢查點的免疫治療已在許多骨髓瘤試驗中得到評估。PD-1靶向藥物與IMiD的組合導致了有希望的臨床活性，且持續的研究評估以IMiD-PD1組合的可能的安全信號（Costa et al.（2018）Frontiers Immunol , 9:2204）。CAR-T療法的試驗正在進行，並且有望開展前期準備工作，在正在進行的研究中，靶向的主要抗原是B細胞成熟抗原或BCMA（Costa et al.（2018）Frontiers Immunol , 9:2204）。儘管有最近的進展，但復發/難治的多發性骨髓瘤仍然是一種需要滿足的疾病。

多發性骨髓瘤（MM）可以各種方法界定特徵，包括實驗室試驗、成像及生檢。實驗室試驗包括：全血細胞計數，以測量血液中的紅細胞、白細胞和血小板水平；血液化學測試，以測量血液中的肌酐、白蛋白、鈣、乳酸脫氫酶和其他電解質的水平；尿液檢查以檢測骨髓瘤的存在蛋白質，例如，班瓊斯（Bence Jones）蛋白質（例如，尿蛋白電泳、尿液免疫固定）；定量免疫球蛋白試驗，用於測量不同抗體的血液水平，其中某種類型的抗體的水平可能高於患有MM的患者；血液試驗以評估骨髓瘤細胞產生的異常蛋白質的存在和水平，例如，單株免疫球蛋白、單株蛋白（M蛋白質）、M蛋白濃度異常升高（M spike）、副蛋白；血液試驗以測量血液中的輕鏈水平；血液測試以評估β-2微球蛋白的存在和水平。

診斷多發性骨髓瘤通常需要：（1）骨髓中的血漿細胞腫瘤（經生檢證實）或至少10％的血漿細胞；及（2）至少一項高血鈣水平、腎功能不佳、低紅血球計數（貧血）、在影像學研究（CT，MRI，PET掃描）中發現來自腫瘤的骨骼中的孔、血液中一種輕鏈增加，因此一種類型比另一種類型常見100倍，及骨髓中的漿細胞60％或更多。

可根據四個因素根據修訂的國際分期系統（Revised International Staging System，RISS）進行多發性骨髓瘤的分期：血液中白蛋白的量、血液中β-2-微球蛋白的量、血液中乳酸脫氫酶（LDH）的量及癌症的特定基因異常（細胞遺傳學）。RISS第1期別的特徵為血清β-2-微球蛋白低於3.5 mg/L，白蛋白水平在3.5 g/dL或更大，細胞遺傳學認為並非高風險，LDH水平正常，RISS第2期別的特徵為不屬於第1期別或第3期別，RISS第3期別的特徵為血清β-2-微球蛋白在5.5 mg/L或更高，細胞遺傳學認為具高風險及/或LDH水平高。

因此，在一例示性實施方式中，本發明提供一種在所需受試者中治療MUC1相關多發性骨髓瘤的方法，包含投予受試者治療有效之含經修飾之T細胞的組成物，該T細胞包含：含重鏈可變（VH）域及輕鏈可變（VL）域之MUC1-特異性抗原結合域，其中VH域包含SEQ ID NO：22、23及24所述之重鏈互補性決定區（CDR）序列，且其中VL域包含SEQ ID NO：19、20及21所述之輕鏈互補性決定區（CDR）序列；可選擇地鉸鏈域；跨膜域；共刺激信號傳導域；及細胞內信號傳導域。

在一例示性實施方式中，本發明提供一種在所需受試者中治療MUC1相關多發性骨髓瘤的方法，包含投予受試者治療有效含經修飾之T細胞的組成物，該T細胞包含：含重鏈可變（VH）域及輕鏈可變（VL）域之MUC1-特異性抗原結合域，其中VH域包含SEQ ID NO：22、23及24所述之重鏈互補性決定區（CDR）序列，且其中VL域包含SEQ ID NO：19、20及21所述之輕鏈互補性決定區（CDR）序列；可選擇地CD8α鉸鏈域；CD8α跨膜域；CD2共刺激信號傳導域；及CD3 ζ細胞內信號傳導域。

欲以經修飾之細胞毒性細胞（例如，含TN-MUC1 CAR之經修飾之T細胞）或本發明之醫藥組成物治療的癌症種類例示類型包括非小細胞肺癌。肺癌是全世界與癌症相關的死亡率的主要原因，儘管該療法取得了進步，但仍然是一個未滿足的重要需求。非小細胞肺癌（NSCLC）占美國所有肺癌病例的85%，其餘15%中的很大比例是小細胞肺癌（SCLC）（Zappa et al.（2016）Transl Lung Cancer Res , 5（3）:288-300; Alvarado-Luna et al.（2016）Transl Lung Cancer Res , 5（1）:26-38）。對於NSCLC，手術切除仍然是最一貫、最成功的選擇；然而，在診斷時，有將近70%的肺癌病患有局部晚期或轉移性疾病（Molina et al.（2008）Mayo Clin Proc , 83（5）:584-594）。總體而言，肺癌病患的預後較差，5年相對生存率不到18%。第4期NSCLC病患的中位數OS時間為4個月，而1年和5年生存率分別低於16%和2%（Cetin et al.（2011）Clin Epidemiol , 3:139-148）。

鉑係療法（雙重療法，例如，順鉑（cisplatin）與吉西他濱（gemcitabine）或卡鉑（carboplatin）與紫杉醇（paclitaxel）/吉西他濱）除了用於第3期或第4期肺癌放射治療外，仍然是不可切除之NSCLC的主要治療方法之一（Ettinger et al.（2019）website：nccn.org/professionals/physician_gls/pdf/nscl.pdf（accessed Feb. 2019））。對於患有退行性性淋巴瘤激酶（anaplastic lymphoma kinase，ALK）或致敏表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）突變或其他驅動突變/變異的病患，將單一藥劑靶向療法增加至雙重藥物中（Ettinger et al,supra ；Yoon et al.（2017）World J Clin Oncol , 8（1）:1-20）。這些靶向治療對具有基因變異的病患的NSCLC治療產生了重大影響，並導致治療效果大大改善（Ettinger et al,supra ）。然而，對TKI的耐藥性已成為一種重要未滿足的醫學需求，最近的證據表明，對TKI之耐藥性具有獨特的機制（Lin et al.（2014）J Cancer Res , 4（5）:411-435）。對免疫檢查點PD-1/PD-L1的抑制在患有局部晚期或轉移性NSCLC病患的一線和二線環境中均得到利用。與單獨的化學療法相比，PD-1/PD-L1途徑抑制作用已證實改善的總生存期、更長的反應持續時間和更少的不良事件。目前，NCCN指南建議在第一線（與腫瘤中PD-L1的強表現有關）和第二線中都抑制PD-1（不論PD-L1表現如何；Ettinger et al,supra ）。儘管靶向藥劑和檢查點抑制的最新進展，NSCLC仍然是未滿足需求的重要領域。

NSCLC包括腺癌、鱗狀細胞癌和大細胞癌，NSCLC可藉由各種方法來確定特徵，包括實驗室試驗、成像和活檢。例如，診斷NSCLC可能需要進行骨掃描、影像學試驗（MRI、CT掃描、PET掃描）、對痰液進行顯微鏡檢以檢查是否有癌細胞及肺生檢。

NSCLC可根據美國癌症聯合委員會（American Joint Committee on Cancer，AJCC）腫瘤、贅生物、轉移（Tumor, Node, Metastasis，TNM）系統進行分期，其基於三個主要因素：（1）主要腫瘤的大小和程度；（2）擴散到附近的淋巴結；及（3）擴散到遠端。最早期的NSCLC是第0期（也稱為原位癌），其他階段從第1期到第4期，更高的期數意味著癌症的傳播範圍更大。

因此，在一例示性實施方式中，本發明提供一種在所需受試者中治療MUC1相關非小細胞肺癌的方法，包含投予受試者治療有效之含經修飾之T細胞的組成物，該T細胞包含：含重鏈可變（VH）域及輕鏈可變（VL）域之MUC1-特異性抗原結合域，其中VH域包含SEQ ID NO：22、23及24所述之重鏈互補性決定區（CDR）序列，且其中VL域包含SEQ ID NO：19、20及21所述之輕鏈互補性決定區（CDR）序列；可選擇地鉸鏈域；跨膜域；共刺激信號傳導域；及細胞內信號傳導域。

在一例示性實施方式中，本發明提供一種在所需受試者中治療MUC1相關非小細胞肺癌的方法，包含投予受試者治療有效含經修飾之T細胞的組成物，該T細胞包含：含重鏈可變（VH）域及輕鏈可變（VL）域之MUC1-特異性抗原結合域，其中VH域包含SEQ ID NO：22、23及24所述之重鏈互補性決定區（CDR）序列，且其中VL域包含SEQ ID NO：19、20及21所述之輕鏈互補性決定區（CDR）序列；可選擇地CD8α鉸鏈域；CD8α跨膜域；CD2共刺激信號傳導域；及CD3 ζ細胞內信號傳導域。

欲以經修飾之細胞毒性細胞（例如，含TN-MUC1 CAR之經修飾之T細胞）或本發明之醫藥組成物治療的癌症種類例示類型包括胰腺癌。胰管腺癌是高度致死性惡性腫瘤，它是美國癌症相關死亡的第四大主要原因，每年約有45,000例新病例。手術切除是唯一可能治癒的治療方法，然而，具有晚期疾病的大多數病患只有15–20%的病患是手術干預的候選人（Fogel et al.（2017）Am J Gastroenterology , 112（4）:537-555）。總體而言，即使採用外科手術干預，預後亦不良：淋巴結陰性的以外科手術干預五年之生存率約為25％，淋巴結陽性的疾則為10%。由於大多數病患都患有無法切除的疾病，化學療法是治療的主要手段，在最近的化學療法組合治療之前，已經觀察到適度的療效提高。與單獨的吉西他濱相比，FOLFIRINOX治療顯示中位數OS和PFS升高，雖然組合療法觀察到毒性增加。替代組合療法包括吉西他濱和nab-紫杉醇，儘管中位數OS較差，但由於其良好的毒性輪廓，其使用範圍比FOLFIRINOX更為廣泛。

儘管靶向療法和免疫治療途徑在其他實質固態瘤中取得成功，但胰臟癌的療效尚無類似改善（Amanam et al.（2018）Cancers , 10（2）. pii:E36）。有趣的是，免疫檢查點抑制劑在胰腺癌中取得了更大的成功。總體而言，胰臟癌仍然是一個亟待滿足的領域，臨床試驗被認為是在該疾病背景中護理標準的一部分（Tempero et al.（2019）website：nccn.org/professionals/physician_gls/pdf/pancreatic.pdf.（Accessed Feb 2019））。

可使用影像學檢查（CT掃描、MRI、超音波、膽管造影、PET掃描、血管造影），血液檢查和生檢來確定胰腺癌特徵。用於檢測胰腺癌的血液檢查包括肝功能檢查，及評估是否存在腫瘤標誌物，例如CA 19-9和癌胚抗原（CEA）。

胰腺癌可根據美國癌症聯合委員會（American Joint Committee on Cancer，AJCC）腫瘤、贅生物、轉移（Tumor, Node, Metastasis，TNM）系統進行分期，其基於三個主要因素：（1）主要腫瘤的大小和程度；（2）擴散到附近的淋巴結；及（3）擴散到遠端。最早期的胰腺癌是第0期（也稱為原位癌），其他階段從第1期到第4期，更高的期數意味著癌症的傳播範圍更大。

因此，在一例示性實施方式中，本發明提供一種在所需受試者中治療MUC1相關胰腺癌的方法，包含投予受試者治療有效之含經修飾之T細胞的組成物，該T細胞包含：含重鏈可變（VH）域及輕鏈可變（VL）域之MUC1-特異性抗原結合域，其中VH域包含SEQ ID NO：22、23及24所述之重鏈互補性決定區（CDR）序列，且其中VL域包含SEQ ID NO：19、20及21所述之輕鏈互補性決定區（CDR）序列；可選擇地鉸鏈域；跨膜域；共刺激信號傳導域；及細胞內信號傳導域。

在一例示性實施方式中，本發明提供一種在所需受試者中治療MUC1相關胰腺癌的方法，包含投予受試者治療有效含經修飾之T細胞的組成物，該T細胞包含：含重鏈可變（VH）域及輕鏈可變（VL）域之MUC1-特異性抗原結合域，其中VH域包含SEQ ID NO：22、23及24所述之重鏈互補性決定區（CDR）序列，且其中VL域包含SEQ ID NO：19、20及21所述之輕鏈互補性決定區（CDR）序列；可選擇地CD8α鉸鏈域；CD8α跨膜域；CD2共刺激信號傳導域；及CD3 ζ細胞內信號傳導域。

欲以經修飾之細胞毒性細胞（例如，含TN-MUC1 CAR之經修飾之T細胞）或本發明之醫藥組成物治療的癌症種類例示類型包括上皮性卵巢癌。上皮性卵巢癌通常包括輸卵管惡性腫瘤及原發性腹膜癌。首次診斷時，超過70%患有上皮性卵巢癌的女性具有晚期疾病。儘管患有晚期疾病的病患可在減積手術（surgical cytoreduction）及鉑系和紫杉烷系化學療法治療後完全緩解，但最終有80%的患者會復發（Herzog et al.（2017）Gynecol Oncol Res Pract , 4:13）。

晚期上皮性卵巢癌復發的治療選擇通常以無惡化期（progression-free interval）為指導原則。儘管含鉑誘導化學療法仍然是標準的一線治療方法，但大多數病患最終都會產生抗藥性，通常定義為在含鉑療法完成後或6個月內進展（Armstrong et al.（2018）website：nccn.org/professionals/physician_gls/pdf/ovarian.pdf（accessed Feb. 2019）），晚期卵巢癌對鉑的耐藥性仍是未滿足需求的領域（Oronsky et al.（2017）Medical Oncology , 34（6）:103）。除鉑系療法外，血管內皮生長因子的分子靶向抑製劑（VEGF；即貝伐單抗（bevacizumab））及聚ADP核糖聚合酶（PARP，即，奧拉帕尼（olaparib）、蘆卡帕尼（rucaparib）及尼拉帕利（niraparib））在先前的化學療法之後已成為病患的治療選項。在免疫治療選項中，按照標準腫瘤學指南，派姆單抗（pembrolizumab）被認為可用於MSI-H或dMMR實質固態瘤之複發性疾病患者（Armstrong et al.,supra ；Fan et al.（2018）Curr Treat Options Oncol , 19（12）:74）。晚期上皮性卵巢癌的病患的標準照護仍為鉑系療法，一旦病患發展出抗藥性疾病，未滿足的需求就很高，並且需要新的療法選項。

特定上皮性卵巢癌之特徵可藉由影像學檢查、血液測試及生檢，用以檢測上皮性卵巢癌的血液測試包括測量CA-125、人體絨毛膜促性腺激素（HCG），α-胎兒蛋白質（AFP）及/或乳酸脫氫酶（LDH）的水平，一些上皮性卵巢癌之特徵可為抑制素和激素（例如雌激素和睪固酮）水平升高。

可根據國際婦產科聯合會（International Federation of Gynecology and Obstetrics，FIGO）或美國癌症聯合委員會（American Joint Committee on Cancer，AJCC）腫瘤、淋巴結、轉移（TNM）系統進行上皮性卵巢癌的分期，其系基於三個主要因素：（1）主要腫瘤的大小和程度；（2）擴散到附近的淋巴結；及（3）擴散到遠端。最早期的胰腺癌是第0期（也稱為原位癌），其他階段從第1期到第4期，更高的期數意味著癌症的傳播範圍更大。

因此，在一例示性實施方式中，本發明提供一種在所需受試者中治療MUC1相關卵巢及/或輸卵管癌症的方法，包含投予受試者治療有效之含經修飾之T細胞的組成物，該T細胞包含：含重鏈可變（VH）域及輕鏈可變（VL）域之MUC1-特異性抗原結合域，其中VH域包含SEQ ID NO：22、23及24所述之重鏈互補性決定區（CDR）序列，且其中VL域包含SEQ ID NO：19、20及21所述之輕鏈互補性決定區（CDR）序列；可選擇地鉸鏈域；跨膜域；共刺激信號傳導域；及細胞內信號傳導域。

在一例示性實施方式中，本發明提供一種在所需受試者中治療MUC1相關卵巢及/或輸卵管的方法，包含投予受試者治療有效含經修飾之T細胞的組成物，該T細胞包含：含重鏈可變（VH）域及輕鏈可變（VL）域之MUC1-特異性抗原結合域，其中VH域包含SEQ ID NO：22、23及24所述之重鏈互補性決定區（CDR）序列，且其中VL域包含SEQ ID NO：19、20及21所述之輕鏈互補性決定區（CDR）序列；可選擇地CD8α鉸鏈域；CD8α跨膜域；CD2共刺激信號傳導域；及CD3 ζ細胞內信號傳導域。

在某些實施方式中，投予至受試者之經修飾之免疫細胞群包含免疫細胞選自天然殺手（NK）細胞，NKT細胞及T細胞所組成之群組。在某些例示性實施方式中，經修飾之免疫細胞群包含經修飾之T細胞。在某些實施方式中，經修飾之T細胞是自體的。

本發明之細胞可藉由本技術領域中具有通常技術者已知的任何方式投予，例如，在某些實施方式中，可藉由腫瘤內遞送、靜脈內遞送或腹膜內遞送進行投予。

欲投予至所需受試者的經修飾之免疫細胞（例如，經修飾之T細胞）的數量通常為治療有效量。如本文所使用，「治療有效量」係指在受試者可產生細胞毒性殺滅癌細胞（例如，乳癌細胞）的經修飾之免疫細胞的劑量。在一些實施方式中，當投予適當劑量的經修飾之免疫細胞後，可降低癌症。降低癌症可為產生出一或多種表示癌症的參數的形式，並且可藉由本技術領域已知的各種方法來進行，例如，藉由檢測循環腫瘤細胞、檢測血液中某些癌症-特異性標誌物、檢測生檢中的標誌物、腫瘤成像等。一般而言，經修飾之免疫細胞之適當劑量當投予至受試者時，導致減少一或多個參數基線之至少約5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%或更多。

如本文所使用，術語「有效量」或「治療有效量」係指足以產生有益或期望結果的藥劑（例如TN-MUC1 CAR T細胞組成物）的量。可以一或多種給藥、施用或劑量投予，且不限於特定調配物或給藥途徑。治療有效量可依據已知因素而變化，例如給藥方式和途徑；接受者的年齡、健康和體重；欲治療之疾病或適應症的類型和程度、徵狀的性質和程度、同時治療的種類、治療的頻率及所欲之效果。

本發明之細胞可以適當的臨床前及臨床實驗和試驗時所確定的劑量和途徑給藥，並可以在這些範圍內的劑量多次給藥。如本領域技術人員所確定的，本發明之細胞的投予可與可用於治療所欲之疾病或症狀的其他方法合併。

關於受試者所接受的療法，欲投予之本發明的細胞可為自體的。

投予本發明之細胞可以本領域技術人員已知的任何方便的方式進行，本發明之細胞可藉由氣霧吸入、注射、攝入、輸血、植入或移植來投予。本文所述之組成物可經動脈、皮下、皮內、腫瘤內、結節內、髓內、肌肉內、靜脈內（i.v.）注射或腹膜內給藥。在其他情況下，將本發明的細胞直接注射到受試者的炎症部位、受試者的局部疾病部位、淋巴結、器官、腫瘤等中。

在一些實施方式中，細胞以所需的劑量施用，其在某些方面包括細胞或細胞類型的所需劑量或數量及/或細胞類型的所需比例。因此，在一些實施方式中，細胞的劑量基於細胞總數（或每公斤體重的數量）及個別群體或亞型的所需比例，例如CD4+與CD8+的比例。在一些實施方式中，細胞劑量基於個別群體或個別細胞類型中所需的細胞總數（或每公斤體重的數量）。在一些實施方式中，劑量基於前述特徵的組合，例如總細胞的所需數量、所需比例和個別群體中所需的細胞總數。

在一些實施方式中，細胞的群體或亞型，例如CD8+和CD4+ T細胞，在所需劑量的總細胞（例如所需劑量的T細胞）的耐受差異之內被投予。在某些方面，所需劑量為所需細胞數或被投予細胞的受試者的每單位體重所需之細胞數，例如細胞數/公斤。在某些方面，所需劑量等於或高於最小細胞數或每單位體重的最小細胞數。在某些方面，在以所需劑量投予之總細胞中，個別群體或亞型以所需或接近的輸出比例（例如CD4+與CD8+之比例）存在，例如，在某些耐受差異或誤差內的比例。

在一些實施方式中，細胞在一或多種細胞之個別群體或亞型的所需劑量的耐受差異之內被投予，例如所需劑量的CD4+細胞及/或所需劑量的CD8+細胞。在某些方面，所需劑量是細胞的亞型或群體的所需數量，或被投予細胞之受試者其每單位體重所需的前述細胞的數量，例如細胞數/公斤。在某些方面，所需劑量等於或高於群體或亞型的最小細胞數，或每單位體重的群體或亞型的最小細胞數。因此，在一些實施方式中，劑量基於所需的總細胞的固定劑量和所需的比例及/或基於一或多個（例如每個）各亞型或亞群體的所需固定劑量。因此，在一些實施方式中，劑量基於所需的T細胞的固定或最小劑量和所需的CD4+與CD8+細胞的比例，及/或基於所需的CD4+及/或CD8+細胞的固定或最小劑量。

在某些實施方式中，細胞或細胞亞型的個別群體以約100萬至約1000億個細胞的範圍投予受試者，例如，100萬至約500億個細胞（例如，約500萬個細胞、約2500萬個細胞、約5億個細胞、約10億個細胞、約50億個細胞、約200億個細胞、約300億個細胞、約400億個細胞或上述任意兩個值所定義的範圍），例如，約1000萬至約1000億個細胞（例如，約2000萬個細胞、約3000萬個細胞、約4000萬個細胞、約6000萬個細胞、約7000萬個細胞、約8000萬個細胞、約9000萬個細胞、約100億個細胞、約250億個細胞、約500億個細胞、約750億個細胞、約900億個細胞或上述任意兩個值所定義的範圍），在某些情況下約1億個細胞至約500億個細胞（例如，約1.2億個細胞、約2.5億個細胞、約3.5億個細胞、約4.5億個細胞、約6.5億個細胞、約8億個細胞、約9億個細胞、約30億個細胞、約300億個細胞、約450億個細胞）或這些範圍之間的任何值。

在一些實施方式中，總細胞的劑量及/或個別亞群的細胞的劑量等於或約1x10⁵ 個細胞/kg至約1x10¹¹ 個細胞/kg的範圍內、10⁴ ，等於或約10¹¹ 個細胞/公斤（kg）體重之間，例如10⁵ 至10⁶ 個細胞/kg體重，例如，等於或約1 x 10⁵ 個細胞/kg、1.5 x 10⁵ 個細胞/kg、2 x 10⁵ 個細胞/kg或1 x 10⁶ 個細胞/kg體重。例如，在一些實施方式中，細胞在等於或在一定誤差範圍內被施用，等於或約為10⁴ 及等於或約10⁹ 個T細胞/公斤（kg）體重，例如10⁵ 至10⁶ 個T細胞/kg體重之間，例如，等於或約1 x 10⁵ 個T細胞/kg、1.5 x 10⁵ 個T細胞/kg、2 x 10⁵ 個T細胞/kg或1 x 10⁶ 個T細胞/kg體重。在另一例示性實施方式中，用於本發明的方法的經修飾的細胞的適當劑量範圍包括，但不限於約1x10⁵ 個細胞/kg至約1x10⁶ 個細胞/kg、約1x10⁶ 個細胞/kg至約1x10⁷ 個細胞/kg、約1x10⁷ 個細胞/kg至約1x10⁸ 個細胞/kg、約1x10⁸ 個細胞/kg至約1x10⁹ 個細胞/kg、約1x10⁹ 個細胞/kg至約1x10¹⁰ 個細胞/kg、約1x10¹⁰ 個細胞/kg至約1x10¹¹ 個細胞/kg。在一例示性實施方式中，用於本文之方法的適當劑量為約1x10⁸ 個細胞/kg。在一例示性實施方式中，用於本文之方法的適當劑量為約1x10⁷ 個細胞/kg。在其他實施方式中，適當劑量約1x10⁷ 個總細胞至約5x10⁷ 個總細胞。在一些實施方式中，適當劑量為約1x10⁸ 個總細胞至約5x10⁸ 個總細胞。在一些實施方式中，適當劑量為約1.4x10⁷ 個總細胞至約1.1x10⁹ 個總細胞。在一例示性實施方式中，用於本文之方法的適當劑量為約7x10⁹ 個總細胞。在一例示性實施方式中，適當劑量為約1x10⁷ 個總細胞至約3x10⁷ 個總細胞。

在一些實施方式中，總細胞劑量及/或細胞個別亞群的劑量在約1x10⁵ 個細胞/m² 至約1x10¹¹ 個細胞/m² 之間的範圍內。在一例示性實施方式中，總細胞劑量及/或細胞個別亞群的劑量在約1x10⁷ /m² 至約3x10⁷ /m² 的範圍內。在一例示性實施方式中，總細胞的劑量及/或細胞個別亞群的劑量在約1x10⁸ /m² 至約3x10⁸ /m² 的範圍內。在一些實施方式中，總細胞的劑量及/或細胞個別亞群的劑量是給予患者的最大耐受劑量。

在一些實施方式中，細胞在等於或約10⁴ 個至等於或約10⁹ 個CD4⁺ 及/或CD8⁺ 細胞/kg體重之間的一定誤差範圍內被施用，例如10⁵ 至10⁶ 個CD4⁺ 及/或CD8⁺ 細胞/kg體重之間，例如，等於或約1 x 10⁵ 個CD4⁺ 及/或CD8⁺ 細胞/kg、1.5 x 10⁵ 個CD4⁺ 及/或CD8⁺ 細胞/kg、2 x 10⁵ 個CD4⁺ 及/或CD8⁺ 細胞/kg或1 x 10⁶ 個CD4⁺ 及/或CD8⁺ 細胞/kg體重。在一些實施方式中，細胞在等於或在一定誤差範圍內、或大於、及/或至少約1 x 10⁶ 、約2.5 x 10⁶ 、約5 x 10⁶ 、約7.5 x 10⁶ 或約9 x 10⁶ 個CD4⁺ 細胞，及/或至少約1 x 10⁶ 、約2.5 x 10⁶ 、約5 x 10⁶ 、約7.5 x 10⁶ 或約9 x 10⁶ 個CD8+細胞，及/或至少約1 x 10⁶ 、約2.5 x 10⁶ 、約5 x 10⁶ 、約7.5 x 10⁶ 或約9 x 10⁶ 個T細胞。在一些實施方式中，細胞在等於或約為10⁸ 至10¹² 個之間或約10¹⁰ 至10¹¹ 個T細胞之間，約10⁸ 至10¹² 個或約10¹⁰ 至10¹¹ 個CD4⁺ 細胞之間，及/或約10⁸ 至10¹² 個或約10¹⁰ 至10¹¹ 個CD8⁺ 細胞之間的一定誤差範圍內被施用。

在一些實施方式中，細胞在多種細胞群或亞型（例如CD4+和CD8+細胞或亞型）的所需輸出比例的耐受範圍或其範圍內被施用。在一些方面，所需比例可為特定比例或可為比例範圍，例如，在一些實施方式中，所需比例（例如，CD4⁺ 與CD8⁺ 細胞之比例）在等於或約5：1及等於或約5：1（或大於約1：5且小於約5：1），或或等於或約1:3及等於或約3：1（或大於約1：3且小於約3：1），例如等於或約2：1至等於或約1:5之間（或大於約1：5且小於約2：1，例如等於或約5：1、4.5：1、4：1、3.5：1、3：1、2.5：1、2：1、1.9：1、1.8：1、1.7：1、1.6：1、1.5：1、1.4：1、1.3：1、1.2：1、1.1：1、1：1、1：1.1、1：1.2、1：1.3、1:1.4、1：1.5、1：1.6、1：1.7、1：1.8、1：1.9：1:2、1:2.5、1:3、1:3.5、1:4、1:4.5或1:5。在一些方面，所需比例的耐受差異在約1%、約2%、約3%、約4%、約5%、約10%、約15%、約20%、約25%、約30%、約35%、約40%、約45%、約50%之間，或包括其範圍內的任何值。

在一些實施方式中，以單劑量或多劑量的經修飾之細胞之劑量投予所需受試者。在一些實施方式中，經修飾之細胞之劑量以多劑量投予，例如，每週一次或每7天一次、每2週一次或每14天一次、每3週一次或每21天一次、每4週一次或每28天一次。在一例示性實施方式中，將單劑量的經修飾之細胞投予所需受試者。在一例示性實施方式中，藉由快速靜脈內輸注將單劑量的經修飾之細胞投予至所需受試者。在一些實施方式中，以分次劑量或分割劑量之經修飾之細胞的劑量投予所需受試者。在此類實施方式中，投予第一劑量，然後在第一劑量後投予後序劑量1天或更多天、2天或更多天、3天或更多天、4天或更多天、5天或更多天、6天或更多天、7天或更多天、8天或更多天、9天或更多天、10天或更多天、11天或更多天、12天或更多天、13天或更多天、2週或更多週、3週或更多週、4週或更多週、5週或更多週、或之間之任何期間。

對於預防或治療疾病，適當的劑量可取決於待治療的疾病類型、細胞或重組受體的類型、疾病的嚴重程度和病程，細胞是否用於預防或治療目的、先前的治療、受試者的臨床病史和對細胞的反應，及主治醫師的自由裁量權。在一些實施方式中，組成物及細胞適於一次或在一系列治療中投予受試者。

在一些實施方式中，以作為組合治療的一部分投予細胞，例如與另一種治療性干預同時或依序、或任何順序投予，該另一治療性干預例如抗體或工程化細胞或受體或試劑，例如細胞毒性劑或治療劑。在一些實施方式中，細胞與一或多種額外的治療劑共同投予或與另一種治療干預同時或以任何順序依序投予。在一些情況下，細胞與另一種療法係以足夠接近的時間共同投予，從而細胞群增強一或多種額外的治療劑的作用，或反之亦然。在一些實施方式中，在一或多種額外的治療劑之前施用細胞。在一些實施方式中，在一或多種額外的治療劑之後施用細胞。在一些實施方式中，該一或多種額外的藥劑包括細胞激素（例如IL-2）以增強持續性。在一些實施方式中，該方法包含施用化學治療劑。

在施用細胞後，在一些實施方式中，例如藉由許多已知方法中的任何一種進行測量工程化細胞群的生物活性，要評估的參數包括在活體內（例如藉由成像）或離體（例如藉由ELISA或流式細胞儀）經工程化或天然T細胞或其他免疫細胞對抗原的特異性結合。在某些實施方式中，可使用本技術領域已知的任何適當方法測量經工程化細胞破壞標靶細胞的能力，例如敘述於Kochenderfer et al., J. Immunotherapy, 32（7）：689-702（2009）及Herman et al., J. Immunological Methods, 285（1）：25-40（2004）的方法。在某些實施方式中，藉由分析一或多種細胞激素（例如CD 107a、IFNγ、IL-2和TNF的表現及/或分泌來測量細胞的生物活性。在某些方面，藉由評估臨床結果（例如腫瘤負擔或負荷的減少）來測量生物活性。

在某些實施方式中，除了CAR以外，可投予受試者第二治療。

在一些實施方式中，在CAR T細胞療法之前投予受試者調理治療，在一些實施方式中，該調理治療包含投予有效量之環磷醯胺至受試者。在一些實施方式中，該調理治療包含投予有效量之氟達拉濱至受試者。在某些例示性實施方式中，該調理治療包含投予有效量之環磷醯胺與氟達拉濱之組合至受試者。因此，本文提供一種包含在投予CAR T療法（例如，含本文TN-MUC1 CAR之經修飾之T細胞）之前投予調理治療至受試者之治療方法，該調理治療含有效量之環磷醯胺與氟達拉濱之組合。在CAR T細胞療法之前投予調理治療可增加CAR T細胞療法之功效，用於T細胞療法之調理病患的方法敘述於美國專利號9,855,298，其藉由引用將其整體併入本文。

在某些實施方式中，受試者被提供第二治療，第二治療包括，但不限於化學療法放射線、手術及藥物。

在一些實施方式中，本文具體劑量方案包括在投予經修飾之T細胞之前的淋巴細胞清除（lymphodepletion）步驟。在一例示性實施方式中，淋巴細胞清除步驟包括投予環磷醯胺及/或氟達拉濱。

在一些實施方式中，淋巴細胞清除步驟包括以約200 mg/m² /天至約2000 mg/m² /天之間（例如，200 mg/m² /天、300 mg/m² /天或500 mg/m² /天）的劑量投予環磷醯胺。在一例示性實施方式中，環磷醯胺的劑量為約300 mg/m² /天。在一些實施方式中，淋巴細胞清除步驟包括以約20 mg/m² /天至約900 mg/m² /天之間（例如，20 mg/m² /天、25 mg/m² /天、30 mg/m² /天或60 mg/m² /天）的劑量投予氟達拉濱。在一例示性實施方式中，氟達拉濱之劑量約為30 mg/m² /天。

在一些實施方式中，淋巴細胞清除步驟包括以約200 mg/m² /天至約2000 mg/m² /天之間（例如，200 mg/m² /天、300 mg/m² /天或500 mg/m² /天）的劑量投予環磷醯胺，及以約20 mg/m² /天至約900 mg/m² /天之間（例如，20 mg/m² /天、25 mg/m² /天、30 mg/m² /天或60 mg/m² /天）的劑量投予氟達拉濱。在一例示性實施方式中，淋巴細胞清除步驟包括投予劑量約300 mg/m² /天之環磷醯胺及劑量約30 mg/m² /天之氟達拉濱。

在一例示性實施方式中，在三天內，環磷醯胺的給藥為300 mg/m² /天，及在三天內，氟達拉濱的給藥為30 mg/m² /天。

相對於第0天的TnMUC1 CAR-T輸注，可安排在-6至-4天（即-1天窗口，即在-7至-5天給藥）進行淋巴細胞清除化學療法的預定。

本領域已知，輸注CAR T細胞後的一種副作用是免疫激活的開始，稱為細胞激素釋放症候群（CRS）。CRS是免疫激活，導致發炎性細胞激素升高，CRS是一種已知的針對靶標毒性，其發展可能與功效有關。臨床和實驗室測量範圍從輕度CRS（全身症狀及/或2級器官毒性）到嚴重CRS（sCRS）（3級以上器官毒性、攻擊性臨床干預及/或可能危及生命）。臨床特徵包括：高燒、不適、疲勞、肌痛、噁心、厭食、心跳過速/低血壓、微血管滲漏、心功能不全、腎損害、肝衰竭和廣泛性血管內凝固。在CAR T細胞輸注後，已顯示細胞激素顯著的升高，包括干擾素-γ、顆粒球巨噬細胞群落刺激生長因子、IL-10及IL-6。CRS的一個特徵是細胞激素的升高，包括IL-6（嚴重提高）、IFN-γ、TNF-α（中等）及IL-2（輕度）。亦已觀察到包括鐵蛋白和C反應蛋白（CRP）在內的臨床可用炎症標誌物的升高與CRS綜合徵相關。CRS的存在通常與授受性轉移細胞的擴增和進行性免疫激活相關。目前已經證明CRS的嚴重程度取決於輸注時的疾病負荷，因為具有高腫瘤負荷的患者經歷更多的sCRS。

因此，本發明在CRS診斷後提供適當的CRS管理策略以減輕不受控制的炎症的生理症狀，而不會抑制經改造的細胞（例如CAR T細胞）的抗腫瘤功效。CRS管理策略在本領域中是已知的，例如，可施用全身性皮質類固醇以快速逆轉sCRS（例如，3級CRS）的症狀而不損害初始抗腫瘤反應。

在一些實施方式中，可投予抗IL-6R抗體，抗IL-6R抗體的實例是經食品與藥物管理局（Food and Drug Administration）批准的單株抗體托珠單抗（tocilizumab），亦稱為阿替珠單抗（atlizumab）（以Actemra或RoActemra銷售），托珠單抗是針對介白素-6受體（IL-6R）的人源化單株抗體，投予托珠單抗已證實幾乎立即逆轉CRS。

通常根據所觀察到的徵候群的嚴重程度來管理CRS，並據此調整干預措施，CRS管理決策可能基於臨床體徵和徵狀以及對干預措施的反應，而不僅僅是基於實驗室的數值。

對於輕至中度的病例，通常可根據需要採用液體療法、非類固醇抗炎藥（NSAID）和抗組織胺類進行徵狀治療，以充分緩解徵狀。更嚴重的病例包括具有任何程度的血液動力學不穩定的病患；任何血液動力學不穩定的患者，建議服用托珠單抗。CRS的第一線治療可為托珠單抗，在一些實施方式中，在60分鐘內標記的劑量為8 mg/kg IV（不超過800 mg/劑量）；托珠單抗可重複Q8小時。若對托珠單抗的第一劑量反應欠佳，可考慮額外劑量的托珠單抗。托珠單抗可單獨使用或與皮質類固醇療法組合使用。具有持續或進行性CRS徵狀的病患，在12-18小時內臨床改善不足或對托珠單抗的不良反應可以大劑量皮質類固醇療法治療，通常使用氫皮質酮100 mg IV或甲基培尼皮質醇（methylprednisolone）1-2 mg/公斤。在具有更嚴重的血液動力學不穩定或更嚴重的呼吸徵狀的病患中可在CRS的早期就對病患進行大劑量的皮質類固醇療法，CRS管理指南可基於已公布的標準（Lee et al.（2019）Biol Blood Marrow Transplant , doi.org/10.1016 /j.bbmt.2018.12.758；Neelapu et al.（2018）Nat Rev Clin Oncology , 15:47；Teachey et al.（2016）Cancer Discov , 6（6）:664-679）。

在以CAR-T療法治療的病患中已觀察到與巨噬細胞活化徵候群（macrophage activation syndrome，MAS）或嗜血淋巴細胞組織細胞增生症（hemophagocytic lymphohistiocytosis，HLH）一致的特徵（Henter，2007），與CRS的臨床表現相吻合。MAS似乎是對於自CRS發生的免疫活化的反應，因此應被視為CRS的一種表現，MAS相似於HLH（亦對免疫刺激的反應），MAS的臨床徵候群的特徵為高惡性非弛張熱、影響三個細胞系中的至少兩個的血球減少、肝脾腫大。它與高血清鐵蛋白、可溶性介白素-2受體及甘油三酸酯有關，並與循環的天然殺手細胞（NK）活性降低有關。

病患選擇

本文提供的方法涉及選擇和治療適於治療的受試者。因此，本文提供使用本文所述方法適於治療之受試者的納入和排除標準。

在一例示性實施方式中，適當的受試者必須被確診為轉移性治療抗性卵巢癌（包括輸卵管癌）、胰腺癌、激素受體（HR）-陰性及HER2-陰性（三陰性）乳癌（TNBC）或非小細胞肺癌（NSCLC）或復發/難治多發性骨髓瘤。

在一些實施方式中，適當的受試者具有ECOG積分為0或1。

在一些實施方式中，適當的受試者已接受多發性骨髓瘤的預先療法：以下任一項之後復發或難治性疾病：（i）至少3種先前的治療方案，其中必須包含烷化劑、蛋白酶體抑製劑及沙利多邁（thalidomide）類似物（來那度胺（lenalidomide）或泊馬度胺（pomalidomide）），（ii）如果對蛋白酶體抑製劑和沙利多邁類似物「雙重耐受性」（定義為在以這些藥物治療後或治療後60天或之內的進展），至少有2種先前的治療方案，及/或（iii）如果進行自體幹細胞移植（ASCT），則患者必須經至少90天。

在一些實施方式中，如果連續給藥而無干預的話，誘導療法、自體幹細胞移植（ASCT）及維持療法被視為1個「方案」。

在一些實施方式中，適當的受試者已接受非小細胞肺癌（NSCLC）的先前療法。在一實施方式中，已對NSCLC具有先前療法的適當受試者已接受標準療法，包括檢查點抑制（PD-1/PD-L1導向療法）及鉑系化學療法二者，或不能接受這些標準療法。在一實施方式中，已對具有EGFR或ALK變異之NSCLC具有先前療法的適當受試者除了上述標準療法類別外，已接受針對特定已識別之突變的先前靶向療法。

在一些實施方式中，適當的受試者已接受胰腺癌的先前療法。在一實施方式中，已對胰腺癌具有先前療法的適當受試者在針對轉移性或不可切除的疾病的至少一種護理系統化學療法標準之後經歷了疾病進展。

在一些實施方式中，適當的受試者已接受三陰性乳癌（TNBC）之先前療法。在一實施方式中，已對TNBC具有先前療法的適當受試者在至少接受一種先前的全身抗癌治療方案作為轉移性乳腺癌治療的一部分後經歷了疾病進展。

在一些實施方式中，適當的受試者已接受卵巢癌的先前療法。在一實施方式中，已對卵巢癌具有先前療法的適當受試者如果被認為是鉑抗性（最初對鉑療法敏感）且已經接受至少兩線轉移性卵巢癌的療法，包括含含鉑治療方案的至少一線先前療法，則是適當的。

在一些實施方式中，適當的受試者具有可評估的疾病。

在一實施方式中，具有多發性骨髓瘤之適當受試者是適當的，如果：受試者在治療（研究）項目上有可測量的疾病，包括以下至少一項：（1）血清M蛋白濃度異常升高（M spike）≥ 0.5 g/dL；（2）24小時尿液M蛋白濃度異常升高 ≥ 200 mg；（3）涉及的血清游離輕鏈（free light chain，FLC）≥ 50 mg/L，比例異常；（4）檢查或影像檢查可測量的漿細胞瘤；（5）骨髓漿細胞≥ 20%。

在一些實施方式中，只要血清總IgA水平升高到正常範圍以上，由於正常血清蛋白與副蛋白在β區共遷移而導致血清蛋白電泳不可靠的IgA骨髓瘤患者可能是合適的。

在一實施方式中，根據實質固態瘤標準的反應評估標準（Response Evaluation Criteria In Solid Tumors Criteria），對具有實體瘤的適當受試者的疾病狀態進行評估（RECIST v.1.1；參見，Eisenhauer et al.（2009）Eur J Cancer , 45（2）:228-247）。至少在血球分離術前28天內進行腫瘤成像。期-特異性標準包括：第1期：受試者在RECIST v.1.1的第1期必須具有可評估的疾病；第1a期擴展：受試者在RECISTv.1.1的第1a期必須具有可測量的疾病。

在一些實施方式中，適當的受試者具有TnMUC1 +疾病，由先前或保存的腫瘤生檢中藉由集中測試的TnMUC1表現確定。若沒有保存的腫瘤生檢樣本，則僅以採用非重大風險生檢程序篩檢是否符合資格為目的，可對該受試者進行可選擇的生檢。

在一些實施方式中，適當的受試者至少要在篩選前2週完成抗癌療法，且任何先前療法的毒性必須恢復到1或0級（除禿髮、電解質或內分泌異常控制良好、周圍神經病變和白斑病（vitiligo）控制良好）。

在一些實施方式中，適當的受試者預期壽命超過3個月。

在一些實施方式中，適當的受試者具有以下定義的適當的重要器官功能：（1）血清肌酐 ≤ 1.5 mg/dL或或估計肌酐清除率 ≥ 30 ml/min（按機構標準計算）；（2）丙胺酸胺基轉移酶（ALT）及天門冬胺酸胺基轉移酶（AST）≤ 3x正常上限（ULN）且總膽紅素 ≤ 2.0 mg/dL，併為對患有肝病的病患進行特定排除；（3）血清總膽紅素＜ 1.5 x ULN；（4）血清白蛋白 ≥ 3.0 g/dL（僅在組1（Arm 1）和第1a期之實質固態瘤病患，不適用於患有多發性骨髓瘤之病患）；（5）左心室射出分率（Left ventricular ejection fraction，LVEF）≥45％，LVEF評估必須在篩檢的8週內進行。

在一些實施方式中，適當的受試者具有充足的血液儲備（在血球分離術後4週內未使用支持性輸血或造血生長因子），定義如下：（1）血紅素 ≥ 9 g/dL；（2）絕對嗜中性球計數 ≥ 1000/μL；（3）血小板計數 ≥ 50,000/μL（≥ 30,000/μL，若骨髓瘤病患的骨髓血漿細胞的細胞率≥50％）；（4）絕對嗜淋巴球計數＞ 500/μL。

在一實施方式中，適當的受試者必須不依賴輸血以維持血液學參數。

在一些實施方式中，生殖潛在性的適當受試者同意按照協議使用批准的避孕方法。

在一些實施方式中，考慮使用本文所述方法進行治療的適當受試者不得符合以下任何標準：（1）主動浸潤性癌症，但治療（研究）中未包括擬議的癌症；（2）目前以使用全身性高劑量皮質類固醇治療（定義為大於相當於強體松（prednisone）20 mg/天的劑量），在治療（研究）項目時患有多發性骨髓瘤受試者必須在血球分離術之前先完成活性高劑量皮質類固醇療法，並保持低劑量皮質類固醇療法或不進行皮質類固醇療法，以相當於強體松20 mg/天或更低劑量的皮質類固醇低劑量生理替代療法是適當的；（3）主動性自體免疫性疾病（包括結締組織疾病、葡萄膜炎、類肉瘤病、炎症性腸病或多發性硬化症），或有嚴重自體免疫性疾病病史，需要長期的免疫抑制性療法（任何免疫抑制性療法應在篩檢訪視前6週內停止）；（4）當前的活性HIV、HCV、HBV感染，在所有受試者中都需要在篩檢時進行病毒測試以排除亞臨床感染；（5）排除參與治療方案的其他活性或不受控制的醫學或精神病學症狀；（6）先前有同種異體的幹細胞移植；（7）活性和未經治療的中樞神經系統（CNS）惡性腫瘤，若經過明確治療後穩定至少1個月，則可認為經治療之病灶無活性，受試者必須不需皮質類固醇療法或抗癲癇藥物治療腦轉移；（8）對單株抗體或生物療法或研究產品賦形劑（例如人血清白蛋白、DMSO、葡聚醣40）具有嚴重輸注反應的病史，這將阻止病患安全地接受CART-TnMUC1細胞；（9）活性或最近的（在血球分離術之前的六個月內）心臟疾病，定義為（i）紐約心臟協會（New York Heart Association，NYHA）第3級或第4級心臟衰竭，（ii）不穩定型心絞痛或（iii）最近的（六個月內）心肌梗塞或持續性（＞ 30秒）心室性心搏過速的病史；（10）對於血球分離術程序具有靜脈通路不足或禁忌；（11）妊娠或哺乳期婦女。

在另一例示性實施方式中，適當的受試者必須具有確診的轉移性治療抗性卵巢癌（包括輸卵管癌）、胰腺癌、激素受體（HR）-陰性及HER2-陰性（三陰性）乳癌（TNBC）或非小細胞肺癌（NSCLC）或復發/難治多發性骨髓瘤。

在一些實施方式中，適當的受試者具有美國東岸癌症臨床研究合作組織（Eastern Cooperative Oncology Group，ECOG）積分為0或1。

在一些實施方式中，適當的受試者已接受如本文所述之腫瘤類型定義之先前療法。

在一些實施方式中，適當的受試者具有可評估之如本文所述之腫瘤類型所定義的疾病。

在一些實施方式中，適當的受試者具有TnMUC1+ 疾病，藉由在先前或保存的腫瘤生檢中集中測試的TnMUC1表現確定。

在一些實施方式中，適當的受試者在篩檢和毒性試驗之前已經完成先前抗癌療法至少2週。

在一些實施方式中，適當的受試者的預期壽命超過3個月。

在一些實施方式中，適當的受試者具有血清肌酐 ≤ 1.2 mg/dL或經計算的肌酐清除率 ≥ 60 ml/min（使用Cockroft & Gault方程式）之水平。

在一些實施方式中，適當的受試者具有天門冬胺酸胺基轉移酶（AST）或丙胺酸胺基轉移酶（ALT）水平 ≤ 2.5 x正常的機構上限值，下列情況除外：具有已知肝擴散之病患，AST或ALT ≤ 3 x 正常的機構上限值。

在一些實施方式中，適當的受試者具有血清總膽紅素水平＜ 1.5 mg/dL，下列情況除外：病患具有吉爾伯特（Gilbert）氏病，血清總膽紅素＜ 3 mg/dL。

在一些實施方式中，適當的受試者具有血清白蛋白水平 ≥ 3.0 g/dL（實質固態瘤病患僅在組1及第1a期，並不適用於具有多發性骨髓瘤之病患）。

在一些實施方式中，適當的受試者已被評估左心室射出分率（LVEF）≥ 50%，LVEF評估必須在篩檢的8週內進行。

在一些實施方式中，適當的受試者具有血紅素水平 ≥ 9 g/dL。

在一些實施方式中，適當的受試者具有絕對嗜中性球計數水平 ≥ 1500/μL。

在一些實施方式中，適當的受試者具有血小板計數水平 ≥ 100,000/μL（≥ 30,000/μL，若骨髓瘤病患的骨髓血漿細胞的細胞率（cellularity）≥50％）。

在一些實施方式中，適當的受試者具有絕對嗜淋巴球計數水平＞ 500/μL。

在一些實施方式中，考慮使用本文所述方法進行治療的適當受試者不得具有或為下列任何一者：（1）治療（研究）中所建議之癌症以外的主動侵襲性癌症；（2）目前以使用全身性高劑量皮質類固醇治療（定義為大於相當於強體松（prednisone）20 mg/天的劑量）；（3）主動性自體免疫性疾病（包括結締組織疾病、葡萄膜炎、類肉瘤病、炎症性腸病或多發性硬化症）或有嚴重自體免疫性疾病病史，需要長期的免疫抑制性療法（任何免疫抑制性療法應在篩檢訪視前6週內停止）；（4）當前的活性人類免疫缺陷病毒（HIV）、C型肝炎病毒（HCV）、B型肝炎病毒（HBV）感染；（5）先前有同種異體的幹細胞移植；（6）活性和未經治療的中樞神經系統（CNS）惡性腫瘤；（7）對單株抗體或生物療法或研究產品賦形劑（例如人血清白蛋白、二甲基亞碸（DMSO）、葡聚醣40）具有嚴重輸注反應的病史，這將阻止病患安全地接受CART-TnMUC1細胞；（8）活性或最近的（在血球分離術之前的六個月內）心臟疾病，定義為（1）紐約心臟協會（NYHA）第3級或第4級心臟衰竭，（2）不穩定型心絞痛或（3）最近的（六個月內）心肌梗塞或持續性（＞ 30秒）心室性心搏過速的病史；（9）對於血球分離術程序具有靜脈通路不足或禁忌；及/或（10）妊娠或哺乳期婦女。

臨床試驗分析

在一些實施方式中，臨床試驗分析將用於篩選和選擇參與臨床試驗的病患。在一例示性實施方式中，臨床試驗分析為TnMUC1臨床試驗測定（CTA），TnMUC1 CTA可為免疫組織化學分析（參見本文實驗實施例8），並且可結合到活體外伴隨診斷裝置（CDx）中。

醫藥組成物

本文所述經修飾之免疫細胞（例如，Tn-MUC1 CAR T細胞）可被包含於用於免疫治療的組成物中，特別適用於治療MUC1相關癌症，該組成物可包括醫藥組成物，並可進一步包括醫藥可接受之載劑。可投予治療有效量之含經修飾之免疫細胞的醫藥組成物。

本發明之醫藥組成物可包含本文所述之經修飾之免疫細胞，組合一或多種醫藥或生理可接受之載劑、稀釋劑或賦形劑，此類組成物可包含緩衝液，例如中性緩衝液，磷酸鹽緩衝液等；碳水化合物，例如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚醣、甘露醇；蛋白質；多肽或胺基酸，例如甘胺酸；抗氧化劑；螯合劑，例如EDTA或麩胱甘肽；佐劑（例如，氫氧化鋁）；及防腐劑。在某些例示性實施方式中，本文所述之組成物被調配用於靜脈內投予。

本發明之醫藥組成物可以適於待治療（或預防）之疾病的方式投予，儘管適當的劑量可藉由臨床試驗確定，投予之數量和頻率將由例如病患的狀況及病患之疾病的類型及嚴重性等因素決定。

對於要進行療法的受試者，待投予之本發明的細胞可為自體的、同種異體的或異種的。

可以適當的臨床前和臨床實驗及試驗中確定的劑量和途徑投予本發明之細胞，細胞組成物可在這些範圍內的劑量多次施用。如本領域技術人員所確定的，本發明之細胞的投予可組合有用於治療所欲疾病或症狀的其他方法。

本文亦提供免疫細胞群、含有此類細胞及/或富含此類細胞的組成物，例如表現重組受體的細胞占組成物內總細胞數的比例，或占某特定類型細胞（如調節T細胞）的比例為至少50%、60%、70%、80%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多。這些組成物中包為用於投予的醫藥組成物及調配物，例如用於授受性細胞療法。本文亦提供用於投予細胞及組成物至受試者（例如病患）的治療方法。

本文亦提供包括用於投予之細胞的組成物，其包括醫藥組成物及調配物，例如單位劑量形式組成物，其包括用於以給定劑量或部分投予的細胞數量。醫藥組成物及調配物通常包括一或多種可選擇的醫藥可接受之載劑或賦形劑。在一些實施方式中，組成物包括至少一種額外的治療劑。

術語「醫藥調配物」係指一種製劑，其所呈形式允許所含活性成分之生物活性得以有效發揮，且不含有其他會對投與該調配物之受試者產生不可接受毒性之成分。

「醫藥可接受之載劑」係指醫藥調配物中除了活性成分以外的成分，其對受試者是無毒的。醫藥可接受之載劑包括，但不限於緩衝劑、賦形劑、穩定劑或防腐劑。在某些方面，載劑的選擇在某種程度上係由特定細胞及/或透過投予方法來決定。因此，有多種適當之調配物。例如，醫藥組成物可含有防腐劑。適當的防腐劑可包括例如，對羥苯甲酸甲酯、羥苯甲酸丙酯、苯甲酸鈉及羥基氯苯胺。在某些方面，其係使用兩種或更多種防腐劑的混合物，防腐劑或其混合物通常佔總組成物之約0.0001重量%至約2重量%。載劑係描述於例如Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed.（1980）中。

醫藥可接受之載劑通常在所使用之劑量和濃度下對受試者是無毒性的，且包括，但不限於：緩衝劑，例如磷酸鹽、檸檬酸鹽及其他有機酸；抗氧化劑，包括抗壞血酸及甲硫胺酸；防腐劑（如十八烷基二甲基芐基氯化銨、氯化六甲雙銨、羥基氯苯胺、氯化本索寧、苯酚、丁基或芐基醇、對羥苯甲酸酯類，例如對羥基苯甲酸甲酯或對羥基苯甲酸丙酯、兒茶酚、間苯二酚、環己醇、3-戊醇及間甲酚）；低分子量（少於約10個殘基）的多肽；蛋白質，例如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水性聚合物，例如聚乙烯吡咯烷酮；胺基酸，例如甘胺酸、麩醯胺酸、天冬醯胺酸、組胺酸、精胺酸或離胺酸；單醣、雙醣和其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合劑，例如EDTA；醣類，例如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨糖醇；成鹽抗衡離子（salt-forming counterion），例如鈉；金屬複合物（例如鋅-蛋白質複合物）；及/或非離子介面活性劑，例如聚乙二醇（PEG）。

緩衝劑在某些方面包括在組成物中，適當的緩衝劑包括例如檸檬酸、檸檬酸鈉、磷酸、磷酸鉀及各種其他酸和鹽類。在某些方面，使用兩種或更多種緩衝劑的混合物。緩衝劑或其混合物的量通常佔總組成物的約0.001重量%至約4重量%。製備可投予之醫藥組成物的方法是已知的，例示性方法更詳細地描述於例如Remington：The Science and Practice of Pharmacy, Lippincott Williams & Wilkins；21st ed.（May 1, 2005）中。

本文所述之調配物可包括水溶液。調配物或組成物亦可含有一種以上適用以細胞治療的特定適應症、疾病或症狀的活性成分，例如，具有與細胞互補活性的那些活性成分，其中各活性不會相互作用影響。此類活性成分適合以對預期目的有效的劑量組合存在。因此，在一些實施方式中，醫藥組成物進一步包含其他醫藥活性劑或藥物，例如化學治療劑，例如天冬醯胺酸酶、硫酸布他卡因（busulfan）、卡鉑、順鉑、道諾黴素（daunorubicin）、阿黴素（doxorubicin）、氟尿嘧啶（fluorouracil）、吉西他濱、羥基脲（hydroxyurea）、胺甲喋呤（methotrexate）、紫杉醇（paclitaxel）、利妥昔單抗（rituximab）、長春花鹼（vinblastine）及/或長春花新鹼（vincristine）。在一些實施方式中，醫藥組成物含有有效治療或預防疾病或症狀的細胞量，例如治療有效量或預防有效量。在一些實施方式中的治療或預防功效係藉由定期評估接受治療的受試者來進行監測。所需劑量可藉由單次推注投予細胞，或藉由多次推注投予細胞，或藉由連續輸注投予細胞來遞送。

調配物包括口服、靜脈內、腹腔內、皮下、肺、經皮、肌肉內、鼻腔內、口腔、舌下或栓劑投予的調配物。在一些實施方式中，以非經腸胃道投予細胞群。本文所使用的術語「非經腸胃道」包括靜脈內、肌肉內、皮下、直腸、陰道及腹腔內投予。在一些實施方式中，藉由靜脈內、腹腔內或皮下注射等周邊全身遞送方式將細胞投予至受試者。一些實施方式中的組成物係以無菌液體製劑來提供，例如等張性水溶液、懸浮液、乳液、分散體或黏性組成物，在某些方面其可緩衝至選定的pH值。液體製劑通常比凝膠、其他黏性組成物及固體組成物更容易製備。另外，液體組成物在某些程度上更便於投予，特別是藉由注射。另一方面，黏性組成物可被調配在適當的黏度範圍內以提供與特定組織更久的接觸期間。液體或黏性組成物可包含載劑，其可為溶劑或分散介質，包含例如水、鹽水、磷酸鹽緩衝鹽水、多元醇（例如甘油、丙二醇、液體聚乙二醇）及其等適當之混合物。

無菌注射溶液可藉由將細胞摻入溶劑中來製備，例如與適當載劑、稀釋劑或賦形劑（如無菌水、生理食鹽水、葡萄糖、右旋糖等）混合。組成物可含有輔助物質，例如潤濕劑、分散劑或乳化劑（例如甲基纖維素）、pH緩衝劑、凝膠或黏度增強添加劑、防腐劑、調味劑及/色素，其取決於投予途徑和所需製劑。在某些方面，可參考標準文本來製備適當製劑。

組成物中可添加各種增強組成物穩定性和無菌性的添加劑，包括抗微生物防腐劑、抗氧化劑、螯合劑及緩衝劑。藉由各種抗細菌劑和抗真菌劑，例如對羥苯甲酸酯類、氯丁醇、苯酚和山梨酸，可用來確保防止微生物的作用。可藉由使用延遲吸收的試劑（如單硬脂酸鋁和明膠）來促使可注射醫藥形式的延長吸收。

用於活體內投予之調配物一般是無菌的，例如，可藉由無菌過濾膜過濾而容易地達到無菌。

一般而言，含本文所述的經修飾之免疫細胞的醫藥組成物可以10⁴ 至10⁹ 個細胞/kg體重的劑量投予，在一些情況下為10⁵ 至10⁶ 個細胞/kg體重，包括這些範圍內之所有整數值，免疫細胞組成物亦可以這些劑量多次投予。可藉由使用免疫治療中一般所知的輸注技術投予細胞（參見例如，Rosenberg et al.,New Eng. J. of Med . 319:1676, 1988）。特定病患的最佳劑量和治療方案可藉由監測病患的疾病徵兆並相應地調整治療來容易地確定。

本發明經修飾之免疫細胞的投予可藉由至少一種模式來投予，其選自腸胃道外、皮下、肌肉內、靜脈內、關節內（intrarticular）、支氣管內、腹內（intraabdominal）、關節囊內（intracapsular）、軟骨內（intracartilaginous）、體腔內（intracavitary）、體室內（intracelial）、小腦內、腦室內（intracerebroventricular）、結腸內、子宮頸內、胃內、肝內、心肌內、心內、骨內、骨盆內（intrapelvic）、心包內（intrapericardiac）、腹膜內、胸膜內、前列腺內、肺內、直腸內、腎內、視網膜內、脊椎內、滑膜內、胸腔內、子宮內、膀胱內、大丸劑（bolus）、陰道、直腸、口腔、舌下、鼻內或經皮方式。在一些實施方式中，本發明經修飾之免疫細胞的投予可以本領域技術人員已知的任何便利方式進行。本發明之細胞可藉由霧化吸入、注射、攝入、輸血、植入或移植投予至受試者。本文所述之組成物可經動脈、皮下、皮內、腫瘤內、結節內、髓內、肌肉內、靜脈內（i.v.）注射或腹膜內給藥。在其他情況下，將本發明的細胞直接注射到受試者的炎症部位、受試者的局部疾病部位、淋巴結、器官、腫瘤等中。

應當理解，在本發明中將有用的方法和組成物不限於實施例中所述之特定調配物。提出以下實施例以提供本技術領域中具有通常知識者關於如何製備及使用本發明的細胞、擴增及培養方法以及治療方法的完整揭示及描述，且無意限制發明人認為其發明的範圍。

除非另有說明，否則本發明的實施採用分子生物學、微生物學、細胞生物學、生物化學和免疫學的習知技術（包括重組技術），這些技術在本領域技術人員的能力範圍內。此類技術已在文獻中得到充分說明，例如，“Molecular Cloning: A Laboratory Manual”, 第四版（Sambrook, 2012）；“Oligonucleotide Synthesis” （Gait, 1984）；“Culture of Animal Cells” （Freshney, 2010）；“Methods in Enzymology” “Handbook of Experimental Immunology” （Weir, 1997）；“Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells” （Miller and Calos, 1987）；“Short Protocols in Molecular Biology” （Ausubel, 2002）；“Polymerase Chain Reaction: Principles, Applications and Troubleshooting”, （Babar, 2011）；“Current Protocols in Immunology” （Coligan, 2002）。這些技術適用於本發明的多核苷酸及多肽的生產，並因此可在製造及實施本發明時考慮。在下面的部分中將討論用於特定實施方式的特別有用的技術。

本文提及或引用的文章、專利案和專利申請案的內容以及所有其他文獻和電子可用資訊在此藉由引用而將其整體併入本文，其程度如同每個單獨的公開文獻被具體且單獨指明為以引用方式納入本文。申請人保留將任何此類文章、專利案、專利申請案或其他實體文獻和電子文獻中任何和所有材料與資訊實際併入本申請案的權利。

雖然已經參考本發明的特定實施方式描述本發明，但是本領域技術人員應該理解，在不悖離本發明的真實精神和範圍下，可進行各種改變並可替換等同物。對於本領域技術人員而言顯而易見的是，在不悖離本文所揭示之實施方式的範圍下，可使用適當的等同物進行本文所述方法的其他適當的修改和改變。另外，可進行許多修改以使特定情況、材料、物質組成、製程、製程步驟或步驟適用本發明的目的、精神和範圍。所有此類修改都包括在後附之申請專利範圍內。現已詳細描述某些實施方式，藉由參考以下實施例將更清楚地理解前述實施方式，前述實施方式僅用於說明而無意限制本發明。

實驗例

本發明現以參照下列實施例描述，這些實施例僅用於說明之目的，本發明並不受這些實施例之限制，而是涵蓋由本文提供的教示而顯而易見的所有變型。

這些實驗中所使用的材料和方法現敘述如下。

癌症基因體圖譜分析：查詢癌症基因體圖譜（Cancer Genome Atlas，TCGA）之956-病患乳癌群組（cohort）的MUC1 及感興趣之醣基化酶的正常基因表現：C1GalT1 、 C1GalT1C1 、 ST6GalNAc1 及B3GNT6 。比較臨床和腫瘤特徵。腫瘤根據其Her-2/neu（Her2）受體表現狀態分為Her2+或Her2-和激素受體（HR），即，雌激素或助孕酮受體，表現狀態為HR +或HR-。使用單向ANOVA根據亞型分析基因表現。

定量聚合酶鏈反應（qPCR）：幾種市售的乳癌細胞株、MCF10A（cat. no）、MCF7（cat. no）、BT20（cat. no）、MDA-MB-231（cat. no）及MDA-MB-453（cat no）購自ATCC，根據製造商說明書擴增並維持，在本發明的分析中，所有細胞株均以盡可能低的繼代數擴增，且所有對黴漿菌均呈陰性。各乳癌細胞株之基因表現與MCF10A（一種非致瘤性乳腺上皮細胞株）之表現相比較。

以收集自存在可手術的、可觸知的乳癌病患的樣本來維持預期的乳腺癌組織庫，在準備進行病理分析時收集腫瘤和正常乳房組織的樣本，並在液氮中急凍，樣本儲存於-80˚C直至使用。

自預期採購的組織庫選擇50個乳房腫瘤及10個匹配的正常乳房組織樣本的一群組，將樣本解凍、機械分離並使用Lysing Matrix D試管（MP Biomedicals, Santa Ana, CA）勻質化。將五種細胞株（MCF10A – 非致瘤性乳房上皮細胞、MCF7 – HR⁺ Her2^- 、BT20 – TNBC、MDA-MB-231 – TNBC及MDA-MB-453 – TNBC）的冷凍庫存解凍，使用RNeasy Mini Kit（Qiagen, Germantown, MD）自所有樣本純化RNA，並使用SuperScript III First-Strand Synthesis System（Invitrogen, Carlsbad, CA）藉由RT-PCR製備cDNA。

使用TaqMan探針及Viia7 Real-Time PCR系統（Applied Applied Biosystems, Carlsbad, CA）分析樣本的GAPDH 、MUC1 、C1GalT1 、 C1GalT1C1 、 ST6GalNAc1 及B3GNT6 基因表現，將所有基因的表現標準化為GAPDH表現。在腫瘤（n = 50）與匹配的正常組織（可用時，n = 10）之間比較各基因的相對RNA表現水平。使用用於分析的雙δ方法計算倍數變化，並為各基因計算平均倍數變化（mean fold change，MFC）。

免疫組織化學：藉由在所有參加者的福爾馬林固定石蠟包埋（FFPE）乳癌組織樣本上的標準免疫組織化學（IHC）染色技術，評估雌激素（ER）、助孕酮（PR）及Her-2/neu（Her2）受體表現，作為標準病理學評估的一部分。

來自上述群組的保存的福爾馬林固定石蠟包埋（FFPE）腫瘤樣本亦可用於使用5E5 mAb及HRP-共軛抗小鼠Ig之免疫組織化學（IHC）染色分析以評估Tn-MUC1之表現。IHC染色的結果由不知情的董事會認證之病理學家評估，並記錄為H-積分，定義為使用下列方程式：[1 ×（%細胞1+）+ 2 ×（%細胞2+）+ 3 ×（%細胞3+）]，Tn-MUC1染色陽性的腫瘤細胞強度和比例的乘積。評估H-積分（0-300）的分佈，發現它是非正常態的，以H-積分數值為142為中心的雙峰分佈，然後將此數值（142）用作臨界值，將結果分為正數或負數，使用獨立的t-試驗，比較乳癌亞型之間的H-積分，並使用卡方檢驗（chi-square）和Kaplan-Meier生存測試比較H-積分組別之間的臨床特徵和生存率。

人類CAR T細胞生成及細胞毒性分析：如先前所述，激活並轉導正常供體人類之T細胞以產生對照CD19-BBz CAR及5E5-BBz CAR T細胞（Posey et al.,（2016）Immunity 44, 1444-1454）。如先前所述，使用xCELLigence（ACEA Biosciences）即時細胞阻抗分析進行細胞毒性分析（Watanabe et al.,（2018）JCI Insight 3）。簡而言之，將腫瘤細胞以低密度接種在e-平盤（e-plate）中，在以效應物-標靶比例10：1接種100小時後，將T細胞與腫瘤細胞株共孵育~24小時，並每15分鐘記錄一次細胞指數。

CAR T細胞遞送之異體移植小鼠模型：乳癌異體移植模型的建立是藉由以100 μL PBS中的100萬個螢光素酶表現MDA-MB-453細胞注入乳腺脂肪墊或以200 μL之50:50 PBS：基底膠（matrigel）注射於小鼠右側腹中。接種腫瘤後一週，當脂肪墊模型的腫瘤平均總通量約為10⁹ ，皮下模型的腫瘤為10⁸ 時，以500萬個NTD、CD19 CAR或5E5 CAR T細胞以尾靜脈注射、腫瘤內注射至脂肪墊內或至皮下腫瘤或腹膜內治療小鼠。使用Xenogen IVIS-200 Spectrum對小鼠進行腫瘤生物發光之系列成像。

鼠類CAR T細胞生成、活體外細胞毒性分析及同源小鼠模型：如先前所述，鼠類CAR骨架構建體係以與人類CAR骨架（CD8a前導子、CD8a細胞外鉸鏈及跨膜域、4-1BB共刺激域及CD3ζ）同源之鼠類元件合成，並選殖入MSGV反轉錄病毒載體中（Watanabe et al.,（2018）JCI Insight 3），通過限制性酶切位點BamHI和BspEI將5E5 scFv及HMFG1 scFv次選殖至鼠類CAR骨架中，並使用Plat E細胞株包裝反轉錄病毒以產生親嗜性反轉錄病毒（ecotropic retrovirus）。關於鼠類T細胞轉導，從hMUC1.tg供體小鼠收穫脾臟，並以抗小鼠CD3及抗小鼠CD28抗體包覆之磁珠（Dynabeads，Thermo Fisher Scientific）活化T細胞。在以磁珠刺激後的第一天，以CAR編碼之反轉錄病毒轉導之T細胞發生在經RetroNectin包覆之平盤上。在50U/mL人類IL-2存在下進行轉導後，將小鼠CAR T細胞擴增4天，並在T細胞活化後的第5天注入hMUC1.tg小鼠。

在小鼠注射當天，以效應物與標靶之比例為20：1，將小鼠CAR T細胞與Jurkat螢光素酶表現細胞株共培養16小時，然後將細胞以PBS洗滌一次，在螢光素酶細胞培養物裂解試劑（Promega）中溶解，然後與螢光素酶分析試劑（Promega）混合。使用平盤分光光度計分析裂解物的發光，使用單獨標靶細胞和Triton-X裂解的標靶細胞的發光來計算各樣本的特異性裂解，分別對應於0％裂解和100％裂解。

統計分析：使用SPSS 24（IBM, Armonk, NY）及Prism（GraphPad）進行統計分析，若P值＜0.05，則認為是顯著的。

現描述實驗結果。

實施例 1 ： MUC1 及相關醣基轉移酶於乳癌之基因表現分析 – 乳癌樣本之 TCGA 基因表現分析

腫瘤中表面糖蛋白上異常O-醣基化的一種已知機制是所涉及的醣基轉移酶突變或表觀靜默，而亦提出另一個是過表現糖蛋白（例如MUC1）的機制，從而是細胞醣基化機制的飽和。藉由詢問MUC1或任何直接的O-醣基轉移酶（和伴護蛋白C1GalT1C1）是否在TCGA之956-病患乳癌群組樣本中具有差異基因表現而啟動對乳癌Tn-MUC1表現分析的研究。當以小種（race）、淋巴結階段、轉移性狀態或總體癌症階段對病患進行分層時，基因表現並無差異（所有p＞ 0.05），MUC1 表現因腫瘤階段不同而不同，其中T1和T2腫瘤的表現低於T3和T4腫瘤（p ＜0.001）。除T合成酶伴護蛋白C1GalT1C1外，當群組以腫瘤亞型分類時，MUC1 及所有O-醣基轉移酶分析呈現差異表現。當與HR-癌症比較時，HR+癌症具有較高表現的MUC1 （p＜0.001）及較低表現的C1GalT1 （p＜0.001），ST6GalNAc1 及B3GNT6 在HR-、Her2+癌症中表現最高（both p＜0.001）。結果表明，無論Her2或HR表現狀態如何，所有腫瘤亞型均具有MUC1醣基化異常。

實施例 2 ：在 乳癌細胞株及在匹配的正常及乳癌組織樣本中的 MUC1 及相關 醣基轉移酶 基因 表現分析

MUC1及相關O-醣基轉移酶之基因表現在幾種市售具有不同HR或Her2表現狀態的乳癌細胞株中分析。MCF10A為一種HR-非侵入性乳房上皮細胞株，MCF7為一種HR⁺ Her2^- 乳癌細胞株，BT20、MDA-MB-231及MDA-MB-453為HR-Her2-乳癌細胞株。所有乳癌細胞株具有較低表現的B3GNT6 （ MFC 0.04）、C1GALT1 （MFC 0.07）及C1GALT1C1 （ 0.44），及較高表現的MUC1 （142.85）及ST6GALNAC1 （ 61.06）（圖2A），與異常的O-聚醣表現的兩種機制一致。同樣地，與匹配的正常乳房組織相比，乳房腫瘤樣本具有較低表現的B3GNT6 （MFC 0.16）及較高表現的MUC1 （ MFC 31.62）（圖7A-7C），表現基本上等同於C1GALT1 （MFC 0.93）、C1GALT1C1 （MFC 0.95）及ST6GALNAC1 （MFC 1.02），乳癌亞型之間的MFC在病患來源之群組中所有5個基因的表現均無差異（皆為p＞ 0.05）。這些結果表明，MUC1的過表現和Core 3 O-多醣的缺失是乳癌的共同特徵，Core 3合成的封鎖是截短Tn抗原表現的一種途徑。

實施例 3 ： Tn-MUC1 醣基表位 在乳癌中而不是在鄰近正常乳房組織中特異性表現 – 在正常和惡性乳腺組織中的免疫組織化學（ IHC ）分析

使用5E5抗Tn-MUC1抗體藉由IHC定量Tn-MUC1糖表位表現（圖3A及3B）。52個乳房腫瘤組織切片中有7個存在正常的鄰近乳房組織。腫瘤上皮細胞對TN-MUC1的染色強烈，而鄰近正常乳腺上皮細胞對TN-MUC1的染色則缺乏或H-積分明顯較低，腫瘤組織的平均H-積分為183.8 ± 95.7，而正常乳房組織為34.9 ± 32.8（p＜0.001）。當根據HR或Her2受體表現狀態按乳癌亞型分層時，與HR+/Her2-（228.0 ± 86.5）及HR+或HR-/Her2+（220.5 ± 65.4）樣本（p = 0.04）相比，HR-/Her2-（或通常稱為三陰性）乳房腫瘤樣本具有最低平均H-積分（157.7 ± 96.9）。腫瘤組織的一半樣本（n = 26）同時呈現細胞質和膜染色，而純細胞質染色的有18個（34.6％），而純膜染色有8個（15.4％）。值得注意的是，Tn-MUC1的細胞質染色通常在產生MUC1的組織中發現，因為Tn抗原是高基氏體中完全O-醣基化的自然發生的生化步驟；Tn-MUC1的膜染色被認為是異常的且為癌症特定的。乳癌亞型之間的染色位置分佈並無差異（p = 0.72）。藉由H-積分組別（陽性或陰性）分析時，年齡、種族、腫瘤大小、腫瘤等級、結節分期、淋巴血管浸潤、囊外擴張、當前疾病狀況、無疾病生存期或總體生存期在各組之間並無差異（皆為p＞ 0.05）。

實施例 4 ： Tn-MUC1- 特異性 CAR T 細胞於活體外及異體移植模型中是有效的

抗Tn-MUC1 CAR T細胞（利用5E5 mAb的scFv開發的）對於乳癌細胞株BT20、MDA-MB-231、MCF7及TB129（一種於賓夕法尼亞大學研發的源自病患之TNBC細胞株）呈現有效的細胞毒性，在所有情況下，與陰性對照（單獨的培養基，非轉導（NTD）T細胞及抗CD19 CAR T細胞）相比，抗Tn-MUC1 CAR T細胞共培養後，腫瘤的生長受到阻礙。在共培養100小時內，腫瘤生長的減少亦達到或接近以Triton X-100處理過的陰性對照之細胞（圖4）。

有鑑於此活體外細胞毒性和評估腫瘤內注射瞬時表現的cMet-特異性CAR T細胞至具有TNBC之病患的先前臨床研究（Tchouet a l.,（2017）Cancer Immunol Res 5, 1152-1161），確定了TNBC異體移植小鼠模型中CAR T細胞的功效和最佳遞送途徑。小鼠在乳腺脂肪墊或右脅皮下接種表現螢光素酶的MDA-MB-453細胞。腫瘤接種後一週，通過靜脈（尾靜脈）、腫瘤內或腹膜內遞送，以500萬個NTD、抗CD19 CAR或抗Tn-MUC1（5E5）CAR T細胞治療小鼠，其中CAR表現於50%的細胞。對小鼠進行腫瘤生物發光之系列成像，且當與靜脈內遞送相比，在經腹膜內CAR T細胞（p = 0.0115）或腫瘤內（p = 0.0076）治療帶有乳腺脂肪墊腫瘤之小鼠觀察到腫瘤負擔急劇下降。類似地，還觀察到5E5 CAR T細胞的腹膜內和腫瘤內遞送的抗腫瘤功效趨勢也可用於帶有皮下腫瘤的小鼠（圖5A-5C）。這些數據支持臨床前工作，證實CAR T細胞遞送途徑可以增強抗腫瘤功效。

實施例 5 ：表現人類 MUC1 之轉基因小鼠中 Tn-MUC1 的脫靶（ Off-tumor ， on-target ）評估

為了避免劑量限制的毒性，CAR T細胞標靶的腫瘤特異性很重要，這將使臨床醫生達到預期的抗腫瘤功效的治療劑量。臨床研究中已報導靶向Her2及碳酸酐酶IX的CAR T細胞以及在臨床前研究中靶向EGFR和GD2的脫靶毒性史。

為了評估Tn-MUC1的潛在脫靶毒性，研發出利用CD8α前導子、細胞外鉸鏈及跨膜之鼠類結構域、4-1BB共刺激域及CD3ζ的完全鼠類CAR，其與先前的作業一致（Watanabeet al .,（2018）JCI Insight 3）， 5E5 mAb及兩種市售抗MUC1 mAb與公開scFv序列（HMFG1及SM3）的反應性被評估用於對MUC1 60mer肽及MUC1-Tn 60mer肽的反應性。觀察到，在醣基化存在與否的情況下，5E5 mAb對於MUC1-Tn的特異性及高親和性，但HMFG1及SM3 mAb對MUC1 60mer 肽的低親和性。假設HMFG1對MUC1呈現的反應性強於SM3，則生成鼠類5E5系和HMFG1系的CAR，並擴增表現各CAR的小鼠T細胞。鼠類5E5-CAR T細胞比HMFG1-CAR T細胞及NTD T細胞呈現出較大的Jurkat細胞活體外溶解，可能是由於Jurkat細胞中的C1GalT1C1截斷（圖6A and 6B）。在非腫瘤壓迫（non-tumor bearing）人類MUC1轉基因（hMuc1.tg）小鼠中，以500萬個T細胞（NTD，5E5-CAR，或HMFG1-CAR）注射入腹膜腔。注射3天後， HMFG1-CAR組別的小鼠預期死亡，因此對剩下的小鼠進行屍檢。觀察到以HMFG1-CAR治療的小鼠腎小球破壞和腎與肺之出血，但以NTD或5E5-CAR治療的小鼠組織中未觀察到組織學毒性。這些數據指出，針對正常MUC1的策略可能會導致脫靶毒性，如同腫瘤內注射pSM3-CAR T細胞至患有儲精囊癌之病患後所觀察到的那樣（Youet al .,（2016）Sci China Life Sci 59, 386-397），而抗Tn-MUC1-CARs可增加靶向表現MUC1枝腫瘤的治療窗口。

實施例 6 ：討論

在此研究中，由於基因表現分析無法確定MUC1異常醣化形式的表現，因此對MUC1的表現及其醣基化中所涉及的酶進行研究，以確定基因表現形式是否支持Tn-MUC1或STn-MUC1的蓄積。

在TCGA中，MUC1在所有乳癌亞型中均高度表現。如所預期，HR+乳癌具有最高表現，因為MUC1受類固醇激素的轉錄控制。qPCR研究證實，腫瘤細胞具有比正常乳房組織更高的MUC1表現。不希望受特定理論的束縛，MUC1的蓄積能壓倒醣基化途徑，導致醣化黏液蛋白在細胞表面異常表達，支持腫瘤細胞的Tn-MUC1和STn-MUC1表達。

Core 1合成酶C1GalT1及其伴護蛋白C1GalT1C1（Cosmc）在乳房腫瘤組織中的表現低於在正常乳房組織中。相似地，Core 3合成酶（B3GNT6）在乳房腫瘤組織中表現降低，乳房腫瘤組織亦具有較高表現的唾液酸轉移酶，ST6GALNac，此種抑制Core 1及Core 3合成酶及唾液酸轉移酶的增強表現將阻止MUC1醣基化途徑的進展，導致Tn-MUC1的蓄積及STn-MUC1的合成增加（圖7A-7C）。

免疫治療的抗原標靶的一個重要特徵為它是由腫瘤組織而不是正常組織表現的，以限制CAR T細胞的脫靶識別。使用抗Tn-MUC1抗體證實，儘管正常乳房組織異常醣化MUC1的表現非常有限，但所有乳房腫瘤樣本均以較高的程度表現它們，此表現與乳癌亞型無關，這表明與乳癌目前存在的那些不同，此靶向療法可能不是亞型依賴性。

在使用各種亞型的乳癌細胞株的活體外研究中，抗Tn-MUC1 CAR最顯著地導致標靶特異性細胞毒性。Tn-MUC1表現於所有乳癌亞型中，無論其HR或Her2表達狀態如何，使其成為一種多功能的乳癌特異性抗原，並且是一種CAR T細胞療法在乳癌中的可行目標。

實施例 7 ： TnMUC1 CAR 臨床前研究

生成含各種共刺激域之TnMUC1（5E5）系嵌合抗原受體（CARs）並用於測試人類 T細胞中之轉基因表現，藉由流式細胞分析量測轉基因表現，該流式細胞分析使用生物素化蛋白L及鏈黴親和素（streptavidin）-PE或生物素-山羊抗小鼠和鏈黴親和素-PE。各種CAR之表現顯示於圖8。

如圖8所示，關於TnMUC1 CAR的轉導效率，CD19BBz（含4-1BB和CD3ζ細胞內信號傳導域的CD19定向CAR）為69.3%；5E5BBz（含4-1BB及CD3ζ細胞內信號傳導域之5E5 scFv系CAR）為46.8%；5E528z（含CD28及CD3ζ細胞內信號傳導域之5E5 scFv系CAR）為68.3%；5E528z YMFM（含CD28變體（YMFM）域及CD3ζ細胞內信號傳導域之5E5 scFv系CAR）為51.6%；5E527z（含CD27及CD3ζ細胞內信號傳導域之5E5 scFv系CAR）為47.9%；5E5Ox40z（含OX40及CD3ζ細胞內信號傳導域之5E5 scFv系CAR）為39%；及5E5CD2z（含CD2及CD3ζ細胞內信號傳導域之5E5 scFv系CAR）為48.9%。

使用MCF7乳癌細胞株對各種TnMUC1 CAR進行增殖及細胞介素分泌研究。

在羧基螢光素琥珀醯亞胺酯（CFSE）分析中評估各種TnMUC1 CAR，該分析測量子細胞之間染料的稀釋度。在CFSE分析中，將TnMUC1陽性MCF7細胞與各種TnMUC1 CAR轉導T細胞共培養，於D10培養基中製備0.5 x 10⁶ /mL之MCF7細胞，並添加100uL至各孔中（約50,000個腫瘤細胞/每孔）。計數T細胞並以1 × 10⁶ 個細胞/mL再懸浮R10培養基。使用NTD細胞將CAR T細胞的轉導效率標準化為30%。CFSE染色溶液以1:1000稀釋於PBS（5µM），並將1 × 10⁶ 個總T細胞（標準化至30% scFv）再懸浮於1 mL CFSE/PBS染色溶液。將細胞於室溫培養5分鐘，避光。培養後，使用10 mL R10培養基以洗滌細胞，之後將其再懸浮於1 mL R10培養基，將100 µL細胞添加至具有腫瘤細胞之各孔中至最終E:T比例為2:1（100,000個T細胞：50,000個腫瘤細胞）。關於流式細胞分析，將細胞轉移至96孔圓底平盤中並以100 µL螢光活化細胞分類計（FACS）緩衝液洗滌，於2000 rpm離心5分鐘。將每孔細胞再懸浮於100 µL FACS緩衝液，並在冰上以5 µL/100 µL生物素化的山羊抗小鼠抗體染色20分鐘。細胞以FACS緩衝液洗滌二次並在冰上各以1 µL/100µL鏈黴親和素-PE及CD3-BV605染色20分鐘。然後將細胞於PBS中洗滌並在室溫下以含L/D紫色0.1 µL/100 µL之PBS染色20分鐘。染色後，將細胞以FACS緩衝液洗滌，每孔再懸浮於350 µL FACS緩衝液 + 50 µL（0.54 x 10⁵ 個珠/mL）CountBright絕對計數珠，並使用BD LSRFortessa獲得。藉由相對於CountBright絕對計數珠的流式細胞儀測量T細胞，以確定相對細胞計數。

圖9顯示CFSE分析結果，證實各種TnMUC1 CAR-T細胞會對MCF7細胞反應而增殖。CD19BBz-T細胞及非轉導細胞（NTD）均未對MCF7細胞反應而增殖。

藉由與MCF7細胞共培養，測試對刺激反應的各種TnMUC1 CAR-T細胞的細胞介素分泌。圖10顯示如所指出的各種TnMUC1 CAR-T細胞的IL-2、TNFa及IFNg分泌水平。

在TnMUC1+ hs766T胰腫瘤NSG免疫缺陷小鼠模型中測試各種TnMUC1 CAR-T細胞的活體內功效。由於鼠類MUC1欠缺對5E5 scFv的表位，因此各種TnMUC1 CAR的功效反映了非轉導（NTD）細胞所見的背景，以及TnMUC1 CAR與TnMUC1+腫瘤相互作用所衍生的任何特定功效。Hs766T腫瘤是藉使用5 x 10⁵ 個帶有Click Beetle Green（CBG）標記的Hs766T胰臟癌細胞株，由IP途徑在小鼠中建立的。當腫瘤負擔的平均總流量為4.5 x 10⁸ p/s時，以各種TnMUC1 CAR-T細胞給小鼠IV投藥，如圖11所示，其顯示在IV投予TnMUC1 CAR-T細胞後的小鼠中所測得之總通量，其為T細胞輸注後天數的函數。

在輸注後第42天，藉由眼眶後出血測量輸注小鼠周邊血液中各種TnMUC1 CAR-T細胞的水平。如圖12A及12B中所示，5E5CD2z CAR-T輸注小鼠周邊血液中具有較高平均數的人類 CD4+ T細胞（圖12A）及CD8+ T細胞（圖12B）。

CART-TnMUC1 的非臨床研究

為了創建可識別並殺滅表現TnMUC1抗原之細胞的T細胞，創建CD2ζ系CAR。本文描述了於基於對Tn-MUC1醣肽表位具有特異性的單株抗體（5E5）的CAR，此CAR由細胞外靶向區（基於5E5單株Ab）、CD8a鍊及跨膜域以及CD2ζ與CD3ζ的兩個細胞內信號傳導域組成。在自體免疫性疾病的背景下，觀察到CD2信號與T細胞的強持續性有關，且可導致病患內CART細胞產物更佳的持續性（McKinney et al.（2015）Nature , 523:612; Bridgman et al.（2014）Clin Exp Immunol , 175（2）:258-267; Zhao et al.（2015）Cancer Cell , 28（4）:415-428）。建構含5E5系CAR之慢病毒載體以轉導白血球分離術所獲得之自體T細胞來生成CART產物。在臨床試驗中，自我滅活慢病毒載體（LV）將被用於藉由離體轉導轉移CAR構建體至自體T淋巴球中。淋巴球將從白血球分離術產品中富集並以LV轉導，從周邊血液中分離的T淋巴球之經LV介導的轉導已在其他臨床試驗中測試過。

為了證實這些工程化CART細胞識別TnMUC1抗原（CART-TnMUC1）的活性及安全性，已進行非臨床藥理學研究和非臨床毒理學研究。

已使用CART-TnMUC1（含CD2及CD3ζ細胞內信號傳導域之5E5 scFv系CAR）進行非臨床研究，以證實此途徑對多種腫瘤模型之作用的潛在機制及探討CART-TnMUC1細胞靶向正常人類組織之潛力的研究。此處描述的數據用於證實以CART-TnMUC1之抗腫瘤活性的潛力及靶向正常人類組織的限制潛力，表2描述這些研究中使用的T細胞的說明及組成。表2：用於非臨床研究之T細胞的說明及組成

命名	嵌合抗原受體成分	T細胞腫類
鼠類scFv	鉸鏈及跨膜	信號傳導
CART-TnMUC1	抗TnMUC1 5E5	人類CD8α	人類CD2及CD3ζ	人類
CART-TnMUC1-BBz	抗TnMUC1 5E5	人類CD8α	人類 4-1BB及CD3ζ	人類
mCART-TnMUC1-BBz	抗TnMUC1 5E5	鼠類CD8α	鼠類4-1BB及CD3ζ	小鼠
CART-19	抗CD19 FMC63	人類 CD8α	人類4-1BB及CD3ζ	人類
NTD細胞	-	-	-	人類
鼠類NTD（mNTD）細胞	-	-	-	小鼠

CART = 嵌合抗原受體T-cell；CD =分化簇；NTD = 無轉導T（細胞）；scFV = 單鏈Fv片段

用於非臨床研究之標靶細胞

由於CART細胞以藉由CAR的scFv部分之特異性所決定的抗原依賴性方式作用，因此可看到針對抗原陽性靶標的活性，而與表現抗原的細胞類型無關。選擇標靶細胞株（表3）以代表實體及血液惡性腫瘤，並評估針對具有低和高抗原表現水平之標靶細胞的藥理學，該抗原表現水平例如藉由聚合酶鏈反應（PCR）和流式細胞分析確定（參見，Posey et al.（2016）Immunity , 44:1444-1454）。表3：用於非臨床研究之標靶腫瘤細胞株

細胞株^a	說明	MUC1 RNA^b	TnMUC1狀態^c	來源
Capan-2	胰導管腺癌細胞株，源自人類胰臟，分離自56歲的男性高加索人（Caucasian）。	11	++	ATCC
Hs766T	胰臟癌上皮細胞株，源自轉移性位置（淋巴結），分離自64歲的男性高加索人。	0.18	+	ATCC
Jurkat E6-1	急性T細胞白血病淋巴母細胞細胞株，源自周邊血液。	0.03	+++	ATCC
Jurkat CD19t-P2A-COSMC （Jurkat COSMC）	以慢病毒載體轉導之Jurkat E6-1細胞，該載體編碼COSMC及欠缺細胞內域（CD19t）之CD19，其作為選擇標記，由P2A信號傳導肽（CD19t-P2A-COSMC）分隔。COSMC為一種T合成酶表現所需之伴護蛋白，其能夠將Tn多醣轉化為用於正常醣基化的Core 1多醣。由於Tn抗原的缺失，COSMC的恢復提供一個控制細胞株。	NT	-	UPenn Posey lab（源自Jurkat E6-1細胞）
MCF7	源自轉移性位置（胸腔積液）之乳癌細胞株，分離自69歲的女性高加索人。	1.6	++	ATCC

ATCC = 美國菌種保存中心；CD = 分化簇；MUC1 = 黏液蛋白，細胞表面相關；NT – 未測試；RNA = 核糖核酸；UPenn =賓夕法尼亞大學^a 除非明確聲明使用未修飾的親本，否則列出的各細胞類型均經過工程化以表現綠螢光蛋白和叩頭蟲（Click Beetle）綠螢光素酶，用於流式細胞分析和生物發光分析。^b % GAPDH管家參考基因^c 由流式細胞分析確定（Posey et al. 2016）：‘-‘ 無信號，‘+’ ＜ 10倍，‘++’ ＜ 100倍及‘+++’ ＜ 1000倍同型對照

非臨床藥理學

非臨床藥理學研究旨在證實CART-TnMUC1細胞特異性地識別TnMUC1+腫瘤標靶細胞的能力，而不會被抗原陰性標靶激活。

將CART-TnMUC1、CART-TnMUC1-BBz及對照T細胞以TnMUC1陽性及陰性標靶細胞刺激，並研究了主要和次要的藥理特性。CART細胞的主要藥理作用是測量其直接的抗腫瘤活性，並被評估為活體外裂解TnMUC1陽性標靶細胞的能力，及評估為活體內控制NSG小鼠中擴散的TnMUC1陽性腫瘤的能力。CART細胞的次要的藥理學是它們增殖、分泌細胞激素及趨化因子的能力，以及對於CD4子集反應TnMUC1陽性標靶細胞表達CD40L的能力。CART細胞的增殖特性導致CART群體中抗原-特異性的增加，其促進了腫瘤的控制，分泌細胞激素和趨化因子的能力可以直接影響腫瘤以及協調整合的免疫反應。同樣地，經活化的CD4 T細胞表現的CD40L是關鍵機制，藉由該機制CD4 T細胞對於整合免疫反應提供「幫助」，其中宿主的內源性免疫細胞有助於腫瘤的控制。

CART-TnMUC1對於TnMUC1陽性腫瘤細胞的活體外細胞毒性活性：

如前所述，使用xCELLigence（ACEA Biosciences）即時細胞阻抗分析評估CART-TnMUC1細胞殺滅TnMUC1+ MCF7乳癌細胞株及胰臟癌細胞株Hs766T及Capan-2（Watanabe et al.（2018）JCI Insight , 3）。將CART細胞與腫瘤細胞（MCF7、Hs766T、Capan2）培養24小時然後測試細胞阻抗，當與陰性對照（單獨的培養基，NTD細胞，CART-19 T細胞）相比，與CART-TnMUC1細胞共培養阻礙了腫瘤的生長。CART-TnMUC1細胞及CART-TnMUC1-BBz細胞顯示相似的對Hs766T細胞之細胞毒性動力學（圖13），CART-TnMUC1亦顯示對MCF7（在二個分析中）及Capan2細胞之細胞毒性；然而，當直接比較時，CART-TnMUC1的細胞毒性動力學比CART-TnMUC1-BBz細胞較慢且效力較低。不受任何理論的束縛，這可能是由於差異的CAR表現水平和/或差異的信號傳導路徑活化的結果。

圖13為說明CART-TnMUC1、CART-TnMUC1-BBz及陰性對照細胞（CART-19及NTD）對於Hs766T胰臟癌細胞株的細胞毒性的圖，額外的對照組是單獨培養基，及Triton X-100（一種非離子表面活性劑，可迅速裂解細胞膜導致細胞死亡）。

使用NTD細胞作為對照，在螢光素酶系分析中對Jurkat E6-1、MCF7及Hs766T細胞進一步研究CART-TnMUC1細胞的細胞毒性（圖14A-14C）。在此分析中，CART-TnMUC1細胞形式證實Jurkat E6-1細胞以3:1及10:1之E:T比例的有效殺滅力（圖14A），亦偵測MCF7乳癌細胞之有效殺滅力，其隨著E：T比例而增加（圖14B），Hs766T細胞亦有殺滅的趨勢，儘管這不夠顯著（圖14C）。

圖14A-14C證明實CART-TnMUC1細胞的靶向細胞殺滅。將CART-TnMUC1或NTD細胞與Jurkat E6-1細胞（左）、MCF7乳癌細胞（中）或Hs766T胰臟癌細胞（右）以指定的效應物對標靶之比例進行培養。關於MCF7，將E：T比例為3：1和10：1的所使用腫瘤細胞總數減少一半，以分別達到6：1和20：1之E：T比例。關於Hs766T，將E：T比例為3：1和10：1的所使用腫瘤細胞總數增加一倍，以分別達到1.5：1和5：1之E：T比例。使用多個t試驗對CART-TnMUC1和NTD細胞進行統計學比較。* = p ＜ 0.05，** = p ＜ 0.01，*** = p ＜ 0.001，**** = p ＜ 0.0001。

在針對野生型TnMUC1+ Jurkat E6-1細胞及TnMUC1- Jurkat CD19t-P2A-COSMC細胞（這些細胞表達伴護蛋白COSMC，並進行完整的醣基化，使其在細胞表面上呈TnMUC1-的形式）的螢光素酶系分析系統中亦建立了CART-TnMUC1細胞毒性之特異性。在3∶1和10∶1的兩個E∶T比例觀察到顯著的細胞毒性，同時針對Jurkat CD19t-P2A-COSMC細胞並無細胞毒性（圖15A為關於Jurkat E6-1；且圖15B為關於Jurkat CD19t-P2A-COSMC）。

圖15A及15B顯示CART-TnMUC1細胞在反應Tn抗原的靶向細胞殺滅。在T細胞之活體外細胞毒性分析，以指示的效應物對標靶的比率，將CART-TnMUC1或NTD細胞與Jurkat E6-1（圖15A）或Jurkat CD19t-P2A-COSMC（圖15B）細胞株培養，* = p ＜ 0.05。5E5-CD2z CAR T細胞呈現對Jurkat細胞有效的細胞毒性，NTD細胞並未呈現對相同標靶細胞株之細胞毒性。

CART-TnMUC1之活體內抗腫瘤活性：

在免疫缺陷NSG小鼠中以腹膜內（IP）TnMUC1 + Hs766T腫瘤之動物模型研究CART-TnMUC1細胞。NSG模型是廣泛用於人類腫瘤及T細胞移植的異種移植模型（Barrett et al.（2011）Hum Gene Ther , 22:1575-1586）。表4及表5描述在此腫瘤攻擊模型中測試的條件， Hs766T腫瘤藉由使用5 x 10⁵ 個以叩頭蟲綠（Click Beetle Green，CBG）標記之Hs766T胰臟癌細胞株以小鼠腹膜內（IP）途徑建立。1個月後，當腫瘤負擔的平均總流量為4.5 x 10⁸ p/s時，將小鼠在治療組之間隨機分配，並靜脈投予CART-TnMUC1細胞、或CART-TnMUC1-BBz，或兩個陰性對照：CART-19及NTD細胞。表4：活體內藥理實驗研究參數摘要

研究	研究期間^a	T細胞正常供體ID	T細胞治療組別	總細胞劑量	每組小鼠數量^b
Hs766T：於NSG小鼠中之胰臟癌異體移植研究	63天	ND473	CART-TnMUC1 CART-TnMUC1-BBz CART-19 NTD細胞	5 x 10⁶ 5 x 10⁶ 5 x 10⁶ 5 x 10⁶	10（1F9M） 10（6F4M） 9（3F6M）^c 10（7F3M）

CART = 嵌合抗原受體T細胞；F =雌性；M =雄性；NSG = NOD scid γ；NTD =未轉導T（細胞）^a 定義為自輸注T細胞至最終犧牲之時間。^b F/M：根據腫瘤負擔將動物隨機分組。^c 一隻小鼠在施用T細胞時死亡。

表5總結這些小鼠中的CART表現及注射的CAR+ T細胞之總數。在未轉導的對照中觀察到2.89%的染色水平，其反映分析的背景而不是CAR表現，因為這些細胞未暴露於編碼CAR的慢病毒載體。表5：治療組定義

組別	T細胞治療組別	CAR+ T細胞注射數量	T細胞注射總數
1	未修飾（NTD）	N/A	5 x 10⁶
2	CART-19細胞	1.5 x 10⁶	5 x 10⁶
3	CART-TnMUC1細胞	1.5 x 10⁶	5 x 10⁶
4	CART-TnMUC1-BBz細胞	1.5 x 10⁶	5 x 10⁶

CART = 嵌合抗原受體T細胞；N/A = 不適用；NTD =未轉導T（細胞）

藉由生物發光成像測量CBG+ Hs766T腫瘤的植入和進展。活體小鼠中的生物發光成像從第-1天開始，且每週持續進行研究；在第60天獲得最終的生物發光測量結果，這些結果如圖16所示。

圖16顯示繪製在胰臟癌之小鼠模型中腫瘤負擔的生物發光成像的圖。將NSG小鼠注射CBG+ Hs766T細胞並以具有CART-TnMUC1、CART-TnMUC1-BBz、CART-19或NTD細胞的5 x 10⁶ 個總T細胞（1.5 x 10⁶ CAR+細胞於CART-治療組別）治療。如所示，在多個時間點測量腫瘤負擔的生物發光成像，顯示為光子每秒（p/s），小圖代表個別小鼠的結果，及平均值±SD，統計數據藉由非成對、雙尾T試驗及單向ANOVA確定。

藉由生物發光成像測量，所有接受CBG+Hs766T腫瘤細胞的動物在腫瘤細胞接種後1個月（T細胞輸注的第0天）都具有相似的腫瘤負擔，並且將動物隨機分為治療組。與以CART-19細胞及NTD細胞治療之小鼠相比，證實經CART-TnMUC1及CART-TnMUC1-BBz細胞治療之小鼠在腫瘤生長上顯著降低，其表明5E5系CAR調控了Hs766T腫瘤細胞之TnMUC1抗原特異性清除。在整個研究過程中，CART-TnMUC1組的腫瘤清除率沒有顯著提高的趨勢，此證實CART-TnMUC1在活體內的抗腫瘤功效。

綜上所述，CART-TnMUC1的非臨床數據及CART-TnMUC1-BBz的先前發現證實抗原依賴性的活體內抗腫瘤活性，並證明此活性的劑量依賴性。

抗原依賴性增殖：在二種基於有絲分裂期間將子細胞之間稀釋的染料標記CART細胞之原理的流式細胞分析系分析形式中，確定了CART-TnMUC1細胞對同源抗原反應的增殖的傾向，從而提供增殖程度的測量方法。在一種分析形式中，T細胞以CellTrace Violet標記，在另一測定中，其以CFSE標記。

在CellTrace Violet分析中，將CART-TnMUC1及對照NTD細胞與TnMUC1+ Hs766T胰臟腫瘤細胞及Jurkat E6-1白血病細胞培養，及與對照TnMUC1- Jurkat CD19t-P2A-COSMC細胞培養（圖17A-17C），CART-TnMUC1細胞對Hs766T細胞反應進行實質性增殖，對Jurkat E6-1細胞反應而適度增殖，但暴露於Jurkat CD19t-P2A-COSMC細胞（其缺乏表面表達的TnMUC1抗原）並沒有增殖，此證實抗原-特異性增殖。分析中僅在T細胞的CAR+部分中觀察到增殖，進一步證實反應的抗原-特異性。在羧基螢光素琥珀醯亞胺酯（CFSE）分析中，觀察到針對TnMUC1+ MCF7乳癌標靶細胞的增殖。

圖17A-17C證實CART-TnMUC1細胞對表現抗原之標靶細胞反應的增殖。藉由CellTrace Violet信號的降低和CellTrace Violet低T細胞百分比的增加來量測增殖。（圖17A）直方圖顯示計數與CellTrace Violet信號，T細胞被閘向為GFP-、CD3+、L/D-近紅外線（IR）低的淋巴球。（圖17B）在CellTrace Violet高（無增殖）與CellTrace Violet低（增殖）組別之內的T細胞百分比。（圖17C）顯示CAR表現與CellTrace Violet信號的圖。T細胞被閘向為GFP-、CD3+、L/D-近紅外線低的淋巴球。使用雙向方差分析（ANOVA test），對CellTrace Violet高或CellTrace Violet低之組別中的CART-TnMUC1（5E5-CD2ζ）及NTD細胞進行統計比較。*** = p = 0.0001，**** = p ＜ 0.0001。

CART-TnMUC1增殖的反應被注意到針對TnMUC1陽性MCF7、Hs766T及Jurkat E6-1細胞，而不針對TnMUC1陰性Jurkat CD19-P2A-COSMC細胞，此證實抗原依賴性增殖。

抗原依賴性細胞介素及趨化因子的生產：藉由Luminex分析評估CART-TnMUC1細胞對TnMUC1反應產生細胞激素及趨化因子的能力，Luminex分析是一種基於微珠的流式細胞分析，可同時量化一系列分泌因子的產生（圖18）。在第0天解凍擴增的CART-TnMUC1、類似物CART-TnMUC1-BBz及兩種陰性對照細胞類型CART-19及NTD細胞，並孵育隔夜以恢復。在第1天，以呈2:1的效應物與標靶之比例的TnMUC1+ 標靶細胞株：MCF7（乳癌）、Hs766T（胰臟癌）及Jurkat E6-1（T細胞白血病）三者再刺激細胞，且24小時後評估細胞生長培養基中的細胞介素輪廓。所使用Luminex分析特異性地量測下列細胞激素及可溶性細胞介素受體：EGF、HGF、G-CSF、GM-CSF、IL-1β、IL‑1R、IL-2、IL-2R、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-10、IL-12、IL-13、IL-15、IFN-γ、TNF-α及VEGF；以及下列趨化因子：Eotaxin、IL-8、IP10、MCP-1、MIG、MIP-1α、MIP-1β及RANTES。

圖18顯示在各種細胞株中細胞激素及趨化因子的生產。對TnMUC1+標靶反應以CART-TnMUC1、CART-TnMUC1-BBz類似物及對照細胞（CART-19及NTD）生產的細胞激素及趨化因子藉由Luminex量測，效應物細胞與標靶以2:1之比例共孵育24小時後，分析上清液。

Luminex數據證實CART-TnMUC1細胞對TnMUC1+細胞株的反應以高於陰性對照的水平產生大量細胞激素及趨化因子，而兩個5E5系CART細胞在細胞介素譜上大致相似，儘管與CART-TnMUC1-BBz相比，CART-TnMUC1各個因素的總體水平都有降低的趨勢（圖18）。不受理論的束縛，這可能是由於CART-TnMUC1的CAR表現較低及/或信號傳導途徑不同所致。在所有測試的三個細胞株中，特定細胞介素的生產都是明顯的。與Th17型（IL-17）和Th2型（IL-4、IL-5、IL-13及IL-10）細胞激素相比，細胞介素的生產偏向Th1偏向性反應，因為包括IFNg、TNFa及IL-2的Th1型細胞激素以甚高的水平分泌。除了傾向於降低每個因素的產量外， CART-TnMUC1細胞與CART-TnMUC1-BBz細胞不同之處在於IL 13的生產極少或不存在，而後者針對所有三個標靶分泌IL-13（圖18）。先前已觀察到IL-13作為BBz系CAR的細胞介素輪廓的一部分（Xue et al.（2017）J Immunother Cancer , 5:85）。

在將CART-TnMUC1與TnMUC1+ Hs766T、Jurkat E6-1細胞及TnMUC1- Jurkat 19COSMC細胞共孵育後，在酶聯免疫吸附分析（ELISA）中測量IFNγ的生產（圖19）。顯著的IFNγ生產見於對CART-TnMUC1反應而不對NTD對照細胞反應的TnMUC1+細胞株而非TnMUC1-細胞株。這些數據進一步支持CART-TnMUC1的特異性及潛在抗腫瘤活性。

圖19顯示獲自IFNγ ELISA實驗的數據。在將CART-TnMUC1細胞或NTD細胞以2:1之E:T比例與抗原陽性（Hs766T、Jurkat E6-1）或抗原陰性（Jurkat CD19-P2A-COSMC）細胞株或單獨之培養基共培養24小時後量測所分泌的細胞介素，共培養上清液中的IFNγ量化為pg/mL。

總體而言，這些數據表明當CART-TnMUC1或CART-TnMUC1-BBz細胞暴露於TnMUC1+標靶時，細胞激素和趨化因子的特異性產生。不受理論的束縛，由於IL-2、IFN-γ及TNF-α相對於IL‑4、IL-5、IL-13及IL-17的優勢，此輪廓暗示Th1偏向性反應，尤其是CART-TnMUC1細胞，其與CART-TnMUC1-BBz細胞相比，顯示非常少的IL-13生產。已知Th1偏向性免疫反應可支持各方面的抗腫瘤免疫，包括CD8 T細胞的增殖及細胞毒性。

源自單核球/巨噬細胞之細胞激素IL-6及IL-1可在CART相關毒性（例如CRS）的發病上發揮作用，單核球/巨噬細胞對T細胞細胞激素及包括GM-CSF、MIP 1a及IFNg之趨化因子反應產生這些細胞激素，且亦可能通過CD40L–CD40相互作用，由CD4+ CART細胞直接激活單核細胞/巨噬細胞（Giavridis et al.（2018）Nature Medicine , 24:731-738；Norelli et al.（2018）Nature Medicine 24:739-748；Rooney et al.（2018）Nature Medicine , 24:705-706；Teachey et al.（2016）Cancer Discov , 6:664-679）。圖18顯示當與CART-TnMUC1-BBz比較時，對於每一個標靶細胞株，CART-TnMUC1細胞都闡明較低的GM-CSF、MIP-1a及IFNg（以及IL-1B/IL-1RA及IL-6）含量。

兩種形式的經測試CAR-T細胞（CART-TnMUC1和CART-TnMUC1-BBz）的非臨床數據一起證實Th1偏向性細胞激素和趨化因子的抗原-特異性生產，其可支持CART細胞活體內之功能以及內源性腫瘤特異性免疫反應。

抗原依賴性CD40L表現：經活化的CD4 T細胞表現CD40L可藉由CD40刺激包括樹突細胞、B細胞及巨噬細胞的抗原呈現細胞，並有助於對腫瘤的整合免疫反應。實際上，藉由CD40-CD40L途徑活化抗原呈遞細胞T細胞「幫助」免疫反應的關鍵機制，包括抗腫瘤CD8 T細胞的發展（Toes et al.（1998）Semin Immunol , 10（6）:443-448）。儘管活化此途徑可能有益於腫瘤控制，但經CD4 + CART細胞活化單核球及巨噬細胞亦可能有助長毒性，例如CRS（Giavridis et al.（2018）Nature Medicine , 24:731-738；Norelli et al.（2018）Nature Medicine 24:739-748；Rooney et al.（2018）Nature Medicine , 24:705-706）。

藉由將CD4+ CART-TnMUC1及CART-19（BBz）細胞與TnMUC1及CD19陽性及陰性細胞株共孵育24小時後藉由流式細胞分析研究經表現之CD40L，兩種CART都以抗原-特異性方式上調CD40L。雖然基本水平的CD40L相似，但CART-19對CD19陽性標靶的反應顯示的CD40L上調是CART-TnMUC1對TnMUC1陽性標靶的反應的兩倍。結果證實，CART-TnMUC1及CART-19皆能對其各自的抗原反應而藉由CD4 T細胞上調CD40L表現，且CART-TnMUC1的CD40L表現水平低於CART-19。

動物中的藥物動力學及產物代謝

鼠類模型中CART-TnMUC1的擴增：在Hs766T胰腫瘤NSG免疫缺陷小鼠模型中測定CART-TnMUC1細胞的擴增及持續性。由於鼠類MUC1欠缺對scFv 5E5的表位 for（Spicer et al.（1991）Journal of Biological Chemistry , 266:15099-15109），此模型中的擴增、持續性和輸送反映了NTD細胞加上源自與TnMUC1+腫瘤相互作用的任何特定信號的背景。

在此實驗中，藉由在兩個時間點：CART輸注後第21天和第42天的眼眶後採血來測量周邊血液中CART-TnMUC1細胞的水平（圖20）。

圖20顯示T細胞輸注後第21天和第42天小鼠周邊血液中的定量。以CBG+ Hs766T細胞注射NSG小鼠，並以CART-TnMUC1、CART-TnMUC1-BBz、CART-19或NTD細胞治療。藉由眼眶後出血收集血液，裂解並染色以便檢測人類T細胞。使用TruCount珠以定量每微升（µl）血液中的CD4+及CD8+ T細胞的數量。***=p＜0.005；**=p＜0.01；*=p＜0.05藉由單向ANOVA與杜凱氏（Tukey）多重比較測試，橫槓代表標準差。

在輸注後21天，與所有其他組別相比，包括以CART-TnMUC1-BBz（290.4個細胞/mL，~ 10倍差異）治療的小鼠及以NTD細胞（614.8個細胞/mL，~ 4.5倍差異）治療的小鼠，以CART-TnMUC1治療的小鼠具有較高的周邊血液人類CD4+ T細胞之平均數（2,774個細胞/mL）。在CD8區間中，CD8+ CART-TnMUC1-BBz細胞與CD8+ CART-TnMUC1細胞相比，有一個較小的〜3倍增加的相對趨勢。

在第42天，CD4或CD8 T細胞無明顯差異。除CD8 + CART-TnMUC1-BBz細胞外，在第21天至第42天之間，各組的平均細胞均數皆增加。由於對照組亦為擴增，這可能表明非特異性異種反應有助於小鼠宿主的MHC，並可能對於Hs766T腫瘤細胞株的任何不匹配HLA等位基因有同種異體反應。在第42天，於周邊血液中CART-19及CART-TnMUC1具有最大平均人類T細胞均數，CART-19為9,767 CD4+及6,798 CD8+與8,254 CD4+及6,293 CD8+，其水平大約是在CART-TnMUC1-BBz所見的975.3 CD4 +和896.4 CD8 +的7-10倍。因此，在第42天，CART-TnMUC1具有優異的擴增及持續性趨勢。

總之，這些數據表明CART-TnMUC1細胞在活體內反應TnMUC1 +標靶細胞而增殖，且與其他測試組相比，在第21天，CART-TnMUC1產物的CD4細胞組分的擴增顯著改善，與第42天的CART-TnMUC1-BBz相比，CART-TnMUC1 CD4和CD8細胞具有更優異的擴增趨勢。由於實驗在第63天終止，因此未追蹤長期作用，所有組別中的同種異體反應性人類T細胞將繼續在NSG小鼠介導的xGVHD中擴增。

毒物學

mAb 5E5及5E5系CART之特異性：5E5 scFv衍生自mAb 5E5，先前已顯示其結合由Tn或STn 多醣組成之表位，該Tn或STn多醣連接至MUC1變數目串聯重複序列（variable number tandem repeat，VNTR）域之GSTA胺基酸序列的Ser和Thr殘基。mAb 5E5不與MUC1的其他醣型結合，包括非糖化、其他異常糖型或生合成中間體（T、ST、Core 3）或完全糖化形式，且在高不完全抗原濃度下顯示對Tn不完全抗原的最小結合，且當5E5 scFv以CART形式使用時，具有此特異性複製。（Posey et al.（2016）Immunity , 44:1444-1454；Sørensen et al.（2006）Glycobiology , 16:96-107；Tarp et al.（2007）Glycobiology , 17:197-209）。

對腫瘤細胞的全細胞裂解物進行的免疫墨點研究進一步顯示，mAb 5E5僅與DU145前列腺癌細胞中＞200 kDa的單個條帶結合，其亦被抗MUC1 mAb HMFG1檢測，其已知與MUC1 VNTR的APDTR胺基酸序列結合並識別所有MUC1醣型（Price et al.（1997）Tumor Biology , 19:1-20；Taylor-Papadimitriou et al.（1981）Biochim Biophys Acta , 1455:301-313）。mAb 5E5對整個細胞裂解物中單個條帶的識別支持了欠缺對於DU145細胞蛋白質組中其他抗原的交叉反應，因此脫靶風險有限。將CART-TnMUC1細胞與強烈表現MUC1的初代人類細胞類型孵育，並觀察到最小的細胞毒性或細胞介素產生，這表明MUC1的正常醣型無法被識別，且TnMUC1是健康MUC1陽性細胞中所干預的細胞內生合成。

綜上所述，這些證據表明，源自mAb 5E5的CAR對MUC1的VNTR域之GSTA胺基酸序列的Tn或STn糖型保留了特異性。在細胞表面上不表現TnMUC1抗原的活體外細胞株模型並不受CART-TnMUC1細胞系途徑靶向，對此抗體的表位包括特定聚醣不完全抗原及MUC1之肽骨架二者，在此情況外，對Tn/STn不完全抗原具有最少的結合，且並不結合至MUC1，其中不存在多醣，僅限於T-、ST-或Core 3-聚醣，或代表在健康細胞中所觀察到的正常複合物多醣。已證實mAb 5E5未有脫靶反應性，預期此對於MUC1異常醣型的特異性會增加對腫瘤細胞的選擇性。

mAb 5E5的正常組織交叉反應：為了確定CART-TnMUC1的潛在標靶組織，在36位正常人類組織中使用mAb 5E5進行優良實驗室操作規範（Good Laboratory Practice，GLP）組織交叉反應研究，此研究平均每個組織類型使用四個供體，三種濃度的mAb 5E5及同型對照。正常人類組織的調查對象包括：腎上腺、膀胱、血管、骨髓、腦（小腦、大腦皮層和垂體）、乳房、心肌、食道、眼睛、輸卵管，胃腸道（胃、小腸、結腸）、心臟、腎臟（皮質、髓質）、肝臟、肺臟、淋巴結、間皮細胞、卵巢、胰臟、胎盤、前列腺、唾液腺、骨骼肌、皮膚、脊髓、脾臟、睾丸、胸腺、甲狀腺、扁桃體、輸尿管和子宮（子宮頸、子宮內膜）。研究的目的在對於CART-TnMUC1的靶向/脫靶活性的觀察以確定在臨床中可能有危險的組織。

在組織交叉反應性研究中，以最高濃度的抗體測試時，在超過75%的檢測供體中觀察到5個組織具有TnMUC1表現：（1）胃，100%；（2）腎臟，89%；（3）胰臟，86%；（4）結腸，83%；及（5）肺臟，75%。考慮到作用機制，認為對CART-TnMUC1的可及性有限，在所有這些組織中僅注意到細胞質表現，在較小比例的情況中染色的組織亦僅顯示細胞質染色。

總而言之，以mAb 5E5進行的研究證實，在被報導為MUC1於蛋白質表現中呈陽性的組織中，藉由5E5 IHC的TnMUC1表現很明顯（（Uhlen et al.（2015）Science , 347（6220））, Human Protein Atlas www.proteinatlas.org），及基因表現（（Carithers et al.（2015）Biopreserve Biobank , 13（5）:311-319）https://gtexportal.org/）數據庫，在胃的上皮和腎臟的腎小管中表現出更強烈的細胞質表現。表現模式主要是細胞內，而沒有膜表現的確切證據，且此被共聚焦顯微鏡所支持，而且與TnMUC1在正常的完全醣化MUC1的合成中作為生合成中間體相一致。

活體外毒物學：基於公開數據庫中所報導涵蓋MUC1轉錄及蛋白質表現水平的範圍，以及基於GLP組織交叉反應研究的結果，使用一組選定的細胞確定對最低限度培養的初代人類細胞反應的CART-TnMUC1細胞毒性及細胞介素表現。腫瘤細胞株Hs766T（胰臟癌）及MCF7（乳癌）作為陽性對照，而膀胱平滑肌細胞作為抗原陰性對照。所有細胞藉由qPCR評估MUC1轉錄表現，及藉由免疫細胞化學使用mAb 5E5評估TnMUC1表現，並產生預期的MUC1和TnMUC1表現模式。

活體外細胞毒性：為了測量細胞毒性，實施xCELLigence方法之24小時評估，然後以一定的E：T比例添加CART-TnMUC1和NTD細胞，然後再進行6天的阻抗。將清潔劑Triton-X用作陽性裂解對照，一旦減去具有NTD細胞的背景活性，特異性裂解信號就被確定為與Triton-X相比較的裂解百分比。在每個E：T比例處減去背景活性可控制潛在的同種異體反應介導的裂解及在培養物中由於添加各種量的T細胞而引起的任何干擾。

CART-TnMUC1細胞在高E:T比例有效殺滅Hs766T腫瘤細胞，其等並未誘導針對初代人類胃上皮細胞、食道上皮細胞及結腸上皮細胞的細胞裂解或僅表現出最低反應性。CART-TnMUC1細胞裂解了膀胱平滑肌細胞和腎臟上皮細胞，但僅在高E：T比例且裂解程度比Hs766T細胞低。由於選擇膀胱平滑肌細胞作為陰性對照，但其具有較低的MUC1 RNA水平（比上皮細胞少70-870倍）且5E5染色極少，因此未引起許多高水平的細胞激素/趨化因子的誘導，對此假設的陰性對照標靶的裂解活性難以闡釋。乳腺及胰腺上皮細胞在數種不同的E：T比例觀察到低水平的CART細胞介導的細胞裂解。

這些數據表明，儘管在xCELLigence分析中發現CART-TnMUC1對腎臟上皮細胞的一些裂解活性，但其程度與陰性對照膀胱平滑肌細胞相似，且在使用CART-TnMUC1-BBz進行的典型51Cr釋放分析中，對於腎臟上皮細胞或腎皮質上皮細胞並沒有裂解活性。

活體外趨化因子/細胞介素產生：為了測量細胞介素和趨化因子的產生，標靶細胞、CART-TnMUC1及NTD細胞以3：1之E：T比例共孵育24小時，並藉由Luminex測定上清液中細胞激素和趨化因子的濃度。

一般而言，在暴露於CART-TnMUC1細胞24小時後，幾種主要的正常人類細胞類型會產生低至中等水平的各種細胞激素、趨化因子及生長因子。就產生的細胞激素/趨化因子的種類和水平而言，與陽性對照Hs766T細胞相比，CART-TnMUC1細胞對任何初代正常人類細胞皆無反應。類似地，在細胞內細胞介素染色分析中，CART-TnMUC1-BBz細胞在健康細胞平盤上並不表現高於CART-19細胞對健康細胞平盤所見之背景水平的IL-2、TNFa或CD107a水平。

總之，活體外毒物學數據表明，5E5系CART細胞並不會對正常健康的細胞具有明顯細胞激素水平的反應，而且觀察到對選定細胞類型的細胞毒性很小。

NSG小鼠腫瘤模型中的活體內毒物學：如上所述，在Hs766T胰臟腫瘤NSG免疫缺陷小鼠模型中測定CART-TnMUC1細胞的潛在脫靶毒物學，記錄每隻研究動物的臨床觀察、體重及存活率。在以TnMUC1-靶向CART細胞療法治療後，並無預期以外的毒性報告。在所有動物中，除了NTD組中的二隻外，在大多數受檢查的器官和組織中均觀察到免疫細胞浸潤（主要由淋巴球組成），這些浸潤的嚴重性和分佈在受影響的動物之間有所不同，幾乎所有進行屍檢的小鼠都觀察到病灶，其顯示異種/同種異體的GvHD的典型特徵，此為NSG小鼠模型被承認的人工產物特徵（Garcia, et al.（1997）Blood , 89（1）:329-336），並非是以CART-TnMUC1治療的直接效果。

實施例 8 ： TnMUC1 臨床試驗分析

使用mAb 5E5開發出一種TnMUC1-特異性免疫組織化學（IHC）原型分析，該mAb 5E5藉由融合瘤方法從經含3個VNTR域重複序列的Tn 醣化60-mer MUC1肽免疫之小鼠體內純化而成（Sørensen et al.（2006）Glycobiology , 16:96-107）。

使用具有陽性（Jurkat）和陰性（Jurkat CD19t-P2A-COSMC）對照樣本的此分析，進行分析以確定所選定之惡性腫瘤中有膜染色的病例比例。此分析及已公開之研究結果表明，TnMUC1可被表現於約~25%– 40%的多發性骨髓瘤病例（Andrulis et al.（2014）Histopathology , 64:799-806；Cloosen et al.（2006）British Journal of Haematology , 135:513-516），及表現於至少50%之乳房、肺臟、胰臟及卵巢之腺癌病例（Pinto et al.（2012）J Cellular Mol Medicine , 16:1474-1484; Sørensen et al.（2006）Glycobiology , 16:96-107）。

基於原型分析，TnMUC1 CTA建立在在Thermo Scientific LabVision Autostainer上開發，並在DAKO Autostainer Link 48上驗證以檢測源自人類癌症組織之FFPE組織塊中的TnMUC1醣蛋白，TnMUC1 CTA將用作臨床試驗分析（CTA）以幫助選擇進入治療CART-TnMUC1之首次人類（FIH）第1期臨床研究的病患（參見實施例9）。

如本文所述，FIH研究將具有卵巢癌（包括輸卵管癌）、非鱗狀非小細胞肺癌（NSCLC）、胰腺癌、乳癌及多發性骨髓瘤的招募TnMUC1陽性病患。預計該試驗的第一期部分將招募大約共40名病患（組1約22名病患，組2約18名病患）。在採用Simon（Simon（1989）Control Clin Trials , 10:1-10）兩階段設計的第1a期擴展中，預計將招募約40名具有鉑抗性卵巢癌的病患，TnMUC1 CTA將用於支持該研究的第1期部分，並進一步開發以支持該研究在卵巢癌病患中的第1a期部分。

材料及試劑：

TnMUC1 CTA使用完成DAKO Autostainer Link 48自動染色平台上的FFPE樣本的IHC染色程序所需的數種試劑，如表6所示：表6：TnMUC1 CTA的材料和試劑清單

方法	細節
切片	4 µm由FFPE封阻
脫蠟及表位復原	EnVision™ FLEX Target Retrieval Solution（TRS）低pH（Agilent K8005）於DAKO PT Link Module上
阻斷劑	EnVision™ FLEX Peroxidase Block（SM801）
一級抗體	- 抗-TnMUC1鼠類單株抗體殖株5E5（Wuxi Biologics） - 鼠類IgG1，κ（kappa）單株[MG1-45] -同型對照（Abcam ab18448）
抗體稀釋劑	Dako REAL™ 抗體稀釋劑（Agilent S2022）
檢測系統和可視化	EnVision™ FLEX /HRP檢測試劑（Agilent SM802）, EnVision™ FLEX DAB+ Chromogen（Agilent DM827）, EnVision™ FLEX Substrate Buffer（Agilent SM803）
複染	EnVision™ FLEX Hematoxylin（Agilent K8008，SM806）
洗滌緩衝液	EnVision™ FLEX Wash Buffer（Agilent K8007，DM831）
脫水	乙醇96% 無水乙醇二甲苯
封片	Sakura Tissue Tek Prisma自動玻片染色機及膠片封片機

儀器和軟體：

TnMUC1 CTA將在配備軟體的DAKO Autostainer Link 48自動染色系統上執行，該軟體被設計成模擬實驗室技術人員手動執行的染色步驟，TnMUC1 CTA染色方案經編程可識別及一起使用所有系統試劑。

每台DAKO Autostainer Link 48儀器均可獲得校准證書/數據表，以證明該儀器已經過測試並符合所有規格。在測試實驗室安裝後，所有DAKO Autostainer Link 48系統均經過內部認證，並根據供應商的說明進行維護，儀器由安裝在專用PC上的4.0版本Dako Link軟體驅動。

樣本製備：

保存的腫瘤生檢樣本將提交給中央實驗室以確定TnMUC1的狀態，必須適當處理腫瘤樣本以保存組織進行IHC染色。FFPE組織加工的標準方法適用於所有樣品，組織切片、在帶電的顯微鏡載玻片上安裝及存放必須遵循TnMUC1 CTA標準操作程序（SOP），將FFPE組織塊切成4 µm的切片，安裝在帶電的顯微鏡載玻片上，在染色前於60°C烘烤2小時，然後在2-8 °C的黑暗中保存。作為TnMUC1 CTA開發的一部分，將進行老化研究以確定載玻片穩定性，以支持CART-TnMUC1的開發。

分析運行控制：

使用一個運行控制塊，其含有TnMUC1陽性和TnMUC1陰性細胞株以及帶有相鄰正常組織（TnMUC1陰性）的TnMUC1陽性腫瘤，TnMUc1陽性和TnMUC1陰性細胞株的代表性圖像顯示於圖21。

在每次運行中，均包括2個運行對照的載玻片，其中一個以一級抗體染色作為陽性對照，另一個以IgG同型作為陰性對照，對照玻片的評估表明染色運行的正確性。

操作原理：

建立標準操作程序（SOP）以描述經驗證的TnMUC1 CTA，SOP提供整個測試系統上詳細信息，包括儀器、材料、試劑及用於執行染色方案的逐步說明。

使用Dako Autostainer Link 48平台執行IHC染色程序，並針對TnMUC1 CTA分析驗證自動染色方案。使用三合一程序在PT Link模組（Dako PT100）中執行脫蠟、再水化和目標物回收。與單株鼠類抗體、選殖株5E5或陰性對照試劑（鼠類免疫球蛋白G1同型對照）一起孵育後，首先將樣本與對該一級抗體宿主種類具有特異性之抗小鼠連接子抗體一起孵育，然後使用由二級抗體分子及耦合至葡聚醣聚合物骨架的山葵過氧化物酶（horseradish peroxidase）分子所組成的現成可視化試劑。隨後添加的3,3-二胺基聯苯胺四鹽酸鹽色素原（chromogen）的酶促轉化，然後3,3-二胺基聯苯胺四鹽酸鹽增強子導致在抗原部位沉澱出可見的反應產物。然後將樣本以蘇木精（hematoxylin）複染並蓋玻片，使用光學顯微鏡詮釋結果。

染色方案的概述提供於表7：表7：染色方案的概述

DAKO PT Link模組上的三合一樣本製備： - 脫蠟 - 再水化 - 表位預處理	EnVision™ FLEX Target Retrieval Solution（TRS）低pH
於65°C預熱
於97°C 20分鐘
冷卻至65°C
在Dako Autostainer Link 48上進行玻片染色（3個滴劑區（drop zone））	以EnVision™ FLEX Wash Buffer沖洗
EnVision™ FLEX Peroxidase Block - 5分鐘
以EnVision™ FLEX Wash Buffer沖洗
一級抗體 - 30分鐘
以EnVision™ FLEX Wash Buffer沖洗
以EnVision™ FLEX Wash Buffer沖洗
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5E5染色的解釋：

TnMUC1 CTA染色結果的解釋將由中心實驗室的認證病理學家、CAP-CLIA認證和BELAC（ISO15189）認證的全球實驗室進行，該實驗室具有完善的質量管理系統（QMS）。

僅評估可行的腫瘤細胞並將其包括在評估中，樣本中至少應存在100個可存活的腫瘤細胞才能被認為足以進行評估。特定細胞形式排除在計分之外，包括：（1）任何類型的腫瘤相關免疫細胞（淋巴球、巨噬細胞、漿細胞、嗜中性顆粒球等等）；（2）腫瘤相關基質細胞；（3）壞死區域；及（4）與腫瘤細胞相鄰之正常細胞。

為了成功確定陽性染色，需要確定信號的正確次細胞定位（subcellular localization），考慮到CART-TnMUC1的作用機制，對TnMUC1 IHC圖像的評估將集中在膜染色（部分或完整周圍）上，將測量具有任何膜表現的腫瘤細胞的數量（計數為100）。

納入試驗的分界點（cut-point）是基於具有膜表現的腫瘤細胞的計數/百分比。在試驗開始時，如果至少有10%計數的腫瘤細胞證實有膜表現，則將腫瘤標本視為TnMUC1陽性。隨著更多臨床數據的積累提高了CART-TnMUC1的進展，分界點值將繼續被評估。

TnMUC1 CTA驗證：

記錄分析開發和驗證的過程，並預先規定TnMUC1 CTA關於特異性、靈敏度、可重複性及再現性的可接受標準。

特異性：

使用前列腺癌細胞株DU145的全細胞裂解物藉由西方墨點法（Western Blot）研究卻認mAb 5E5的特異性，mAb 5E5對於代表成熟TnMUC1之＞200 kDa的單一條帶進行染色，該條帶亦使用抗MIC1 VNTR蛋白質骨架定向之mAb HMFG1染色。

藉由對具有已知TnMUC1表現模式的FFPE細胞團塊和已知為TnMUC1陰性（脂肪組織）以及TnMUC1陽性（健康胰臟細胞質染色）的FFPE對照組織進行測試，證實TnMUC1 CTA之特異性。

敏感度：

為了測試分析的靈敏度，已對一級抗體的稀釋系列進行測試以獲得最佳的信噪比。

可重複性（運行中（intra-run）變異性）及再現性（運行間（inter-run）變異性）：

在三個不同的運行中，在五個不同組織塊上評估分析的可重複性，實驗設置顯示於圖22。

總之，已開發出TnMUC1 CTA並分析驗證用於檢測癌症組織中的TnMUC1醣蛋白抗原，該分析旨在幫助篩選腫瘤樣本中具有可接受水平的細胞膜TnMUC1表現的病患。具有定義的TnMUC1+腫瘤樣本的病患可被視為參加本文所述的CART-TnMUC1-01 FIH試驗，然後將根據本文所述的研究納入/排除標准進行評估。

實施例 9 ： CART-TnMUC1-01 臨床研究

選殖策略

本節敘述為產生慢病毒載體pTRPE_5E5（H2L）_CD2z而執行的選殖策略，該慢病毒載體 pTRPE_5E5（H2L）_CD2z是GMP質體生產的來源，可用於轉導細胞以創建用於臨床研究的CART-TnMUC1細胞。使用開放閱讀框分析藉由、確認限制酶切消化（restriction digest）以及定序整體載來驗證pTRPE_5E5（H2L）_CD2z載體（參見，圖23關於pTRPE_5E5（H2L）_CD2z質體圖譜）。表8顯示載體之轉基因元件。表8：轉基因元件之起源及來源

轉基因元件	起源	來源
人類CD8a前導子序列	人類	UPenn CD19 CAR構建體（IND 13960）之重新合成序列
5E5 scFv	鼠類	自融合瘤序列重新合成
人類 CD8a 鉸鏈及跨膜（TM）	人類	自UPenn CD19 CAR構建體（IND 13960）之序列重新合成
CD2細胞內信號傳導域（ICD）	人類	最初自正常供體人類T細胞cDNA中擴增，並通過重疊PCR選殖至pGEM-SS1CD2z載體中
CD3ζ信號傳導鏈	人類	自UPenn CD19 CAR構建體（IND 13960）之序列重新合成

pTRPE 慢病毒載體係基於pELPS慢病毒載體重新合成，pTRPE慢病毒載體是第三代自我滅活慢病毒表現載體pRRL-SIN-CMV-eGFP-WPRE的衍生物（參見，Dull et al. 1998），其藉由以EF-1α置換CMV啟動子修飾並添加cPPT序列。pTRPE慢病毒載體亦包含用於RNA運送的rev反應元件（RRE）、用於改善RNA轉譯的土撥鼠肝炎病毒轉錄後調節元件（WPRE）、5’ LTR和3’ U3刪除LTR及包裝序列。

基於先前的觀察結果，在慢病毒轉導的初代CD4及CD8細胞中，報導子的基因表現在EF-1α啟動子的控制下較高，因此EF-1α啟動子的選擇高於其他真核啟動子（參見，Milone et al.（2009）Mol Ther , 17:1453-1464）。與一組生理性啟動子相比，EF-1α啟動子已顯示在初代T細胞中轉基因的表現最有效（Milone et al.（2009）Mol Ther , 17:1453-1464）。EF-1α啟動子源自市售的pTracer-CMV2質體（Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA）（Kim et al. 1990），並使用PCR及標準分子生物學技術選殖至Dull載體中。

從NL4-3分子選殖中擴增gag基因中一個長序列，稱為中心多嘌呤管道/中心終止序列（cppt（central polypurine tract）/CTS（central termination sequence）），並摻入Dull載體骨架中，已發現cppt/CTS序列對於有效的逆轉錄和核導入很重要（Sirven et al. 2000）。

pTRPE_5E5（H2L）_CD2z 載體自pGEM-SS1CD2z及pTRPE_5E5-BBz生成，含CD8TM、CD2 ICD及CD3ζ之片段自pGEM-SS1CD2z載體消化，並藉由凝膠萃取純化（參見，圖24為pGEM-SS1-CD2z之質體圖譜）。載體pTRPE_5E5（H2L）載體骨架自消化pTRPE_5E5-BBz生成（參見，圖25為質體圖譜）。藉由連接CD8TM、CD2 ICD及CD3ζ片段至pTRPE_5E5（H2L）載體骨架中生成pTRPE_5E5（H2L）_CD2z 載體（參見，圖26）。

研究設計

CART-TnMUC1-01研究是一項開放標籤、多中心的首次人類（FIH）第1期研究，在評估投予基因修飾的自體T細胞（CART-TnMUC1細胞）的安全性、耐受性、可行性及初步功效，該T細胞經工程化以表現能夠識別腫瘤抗原TnMUC1之嵌合抗原受體（CAR）並激活T細胞。

在第1期研究的劑量遞增部分中，將招募兩組並行的小組，目的是根據LD化學療法方案確定CART-TnMUC1的推薦第2期劑量（recommended Phase 2 dose，RP2D），以在兩組病患群體的進一步群組中試驗（1）具有TnMUC1+實質脂質瘤的病患，及（2）具有TnMUC1+復發/難治多發性骨髓瘤（MM）的病患。預期試驗的第1期將招募約40名病患（組1約22名病患，組2約18名病患；第1期的確切樣本量取決於觀察到的毒性）。

設計第1a期擴展群組是為了遵循LD化學療法給藥使用靜脈內方法投予，在TnMUC1+鉑抗性卵巢癌病患中評估CART-TnMUC1細胞的初步療效。在第1a期擴展中，預計將招募40名病患。該組採用Simon 2-Stage設計，其中階段1招募13名病患（只要觀察到適當的反應），在第1期成功之後，第1期和第2期總共約為40名病患以達到可評估ORR主要終點的36名病患。

病患應計入研究的第1期階段的期間預計持續12-16個月，病患應計入研究的第1a期階段的期間預計持續12-16個月。個體病患預計將參加大約24個月的治療，並進行長期安全性追蹤評估，病患被追蹤更長的時間以進行最終安全性及總體生存（OS）分析，第1期將在大約3-5個中心進行，第1a期擴展群組部分將增加額外的臨床試驗站點（大約3-5個附加站點）。

圖27提供第1期及第1a期部分的研究設計。如圖27所示，試驗第1期部分將在由疾病環境所定義的兩個並行組中進行，組別1：具有TnMUC1+ 實質固態瘤之病患，及組別2：具有TnMUC1+ 多發性骨髓瘤之病患。組別2的評估將從劑量水平2開始，然後在劑量水平1的組別1中證明安全性。第1a期擴展群組將招募具有TnMUC1+鉑抗性卵巢癌之病患。 i.v.表示靜脈注射；RP2D表示推薦的第2期劑量。

病患路徑

第1期中病患路徑和試驗的擴展群組將遵循類似的模式。在簽署預篩選知情同意書以確定在獲得主要研究之同意前的腫瘤生檢的TnMUC1狀態（藉由中央IHC分析確定，所有受招募的病患都必須具有TnMUC1+腫瘤樣本）後，將病患首先進行預篩選，然後集中確定之具有TnMUC1+腫瘤樣本的病患可簽署主要研究知情同意書並進行篩選。符合所有相關資格標準的病患將經由電子郵件將資格表提交給主持者。若在試驗的第1期部分中可進行群組分配，則將病患納入研究並分配至指定劑量水平群組中。在此時，以臨床試驗地點/研究中心，安排患者透過CART-TnMUC1輸注進行白血球分離術和淋巴細胞清除。

在臨床試驗場地指定的血球分離術中心完成白血球分離術程序後，將白血球分離術產物冷凍並運送到生產集合地（University of Pennsylvania Clinical Cell and Vaccine Production Facility, CVPF），CART-TnMUC1產物的生產週期大約需要4-6週。在之後4-6週的製造時間內，由主要研究者可酌情決定並在治療方案得到主持醫療監護人的批准後，可採用橋接化學療法治療病患。在製造之後，將冷凍的CART-TnMUC1產物運送到治療機構。

一旦在臨床試驗場地收到冷凍的CART-TnMUC1產物，便可開始排定的LD化學療法，除群組1（及PSMC建議的任何可選擇的非LD群組）外，所有群組中的病患都將在第-6天至第-4天接受為期3天的淋巴細胞清除（LD）化學療法（窗口為-1天，即從第-7或-6天開始為期3天的LD療程）。在所有病患中，CART-TnMUC1細胞輸注均在第0天投予。CART輸注後，將根據方案開始進行追蹤以監測安全性及疾病狀態，在疾病進展或開始使用其他抗癌療法後，病患將被繼續追蹤長期安全性評估和生存終點。

圖28是顯示整個病患途徑的示意圖。如所示，試驗的第1期和第2期部分均從確定提交的腫瘤樣本中的TnMUC1狀態開始，並以OS終點及死亡日期為結束。CART-TnMUC1輸注後，將繼續根據協定評估病患的疾病狀態。一旦證實疾病進展或開始新的抗癌療法，病患將進入長期FU期。Ctx表示橋接化學療法；LD表示淋巴細胞清除；FU表示追蹤；PD表示進行性疾病。

第一階段劑量遞增設計

研究的第1期部分將是設計為確定最大耐受劑量（MTD）之並行的兩組劑量遞增研究及/或CART-TnMUC1細胞的推薦第2期劑量（RP2D）可與氟達拉濱及環磷醯胺的淋巴細胞清除方案組合安全地投予病患。第1期試驗的兩組由兩個病患群組組成： • 組1：靜脈內（i.v.）投予CART-TnMUC1細胞至罹患實質固態瘤之病患，包括TnMUC1+ 治療抗性卵巢癌（包括輸卵管癌）、胰腺癌、激素受體（HR）-陰性及HER2-陰性（三陰性）乳癌（TNBC）和非小細胞肺癌（NSCLC） • 組2：i.v.投予CART-TnMUC1細胞至TnMUC1+ 復發/難治多發性骨髓瘤

修正的3+3設計：兩組受招募的病患將在經修正之3 + 3劑量遞增設計中以CART-TnMUC1細胞進行給藥（Martin et al.（2018）Cancer Chemother Pharmacol , epub. Doi. 10.1007/s00280-018-3689-2; Crowley et al.（2017）CRC Press , Boca Raton, FL）。該試驗將從劑量水平1的第一群組（表9）開始，該群組招募3名罹患實質實體瘤（組1）的病患。在此群組，病患將在沒有事先LD的情況下輸注CART-TnMUC1，且罹患多發性骨髓瘤（組2）的病患不會被招募至此第一無LD群組。將按照與第1期安全監察委員會（PSMC）進行的劑量遞增電話會議的協議指定過程來確定群組1（劑量水平1，實質固態瘤）的安全性，以確定適當的下一步驟。若依據劑量遞增電話會議（dose escalation teleconference，DETC）建立第一劑量群組的安全性，則可將下一劑量群組（劑量水平2，參閱表9）納入組1（實質固態瘤）和組2中（多發性骨髓瘤）。在劑量水平2，LD方案將以劑量水平1中所測試的相同劑量水平實施。依據LD化學療法方案投予劑量水平2，然而劑量水平1是在無LD方案下投予。表9：CART-TnMUC1-01之劑量水平

劑量水平^a	CART-TnMUC1劑量	淋巴細胞清除	招募
1^b	1-2 x 10⁷ 個轉導細胞	無	3-6
2	1-2 x 10⁷ 個轉導細胞	第-6至-4天	3-6
3	5-6 x 10⁷ 個轉導細胞	第-6至-4天	3-6
4	1-2 x 10⁸ 個轉導細胞	第-6至-4天	3-6
5	5-6 x 10⁸ 個轉導細胞	第-6至-4天	3-6
6^c	1-2 x 10⁹ 個轉導細胞	第-6至-4天	3-6

LD = 淋巴細胞清除；MTD =最大耐受劑量；PSMC =第1期安全監察委員會^a 由PSMC酌情決定，在無LD方案下可擴展個體劑量水平以評估觀察到的脫靶毒性^b 劑量水平1將僅納入組1（實質固態瘤），而不會納入組2（多發性骨髓瘤），從劑量水平2開始，組1和組2將並行招募（參見圖29）。^c 在沒有確定劑量水平5之後的MTD的情況下，若PSMC建議，則劑量可以半對數增量遞增。

然後，兩個第1期組將繼續並行招募（圖29），圖29顯示劑量遞增流程圖。如所示，LD意指淋巴細胞清除；MM意指多發性骨髓瘤；及tr細胞意指經轉導細胞。劑量遞增遵循從左到右的步驟。將群組1先被招募3名罹患實質實體瘤之病患，並在無LD方案下投予CART-TnMUC1。一旦群組1的安全性建立，組2（MM）就開始，並從群組2（劑量水平2）開始，根據表9的劑量水平，招募超出指定群組4的群組。

劑量遞增準則：招募至第1期的每個個體病患之劑量限制性毒性（dose limiting toxicity，DLT）觀察期將始於（1）LD化學療法方案開始（在所有接受LD方案的病患中）中的較早者，或（2）CART-TnMUC1細胞輸注（在所有未接受LD方案的病患中）中的較早者。CART-TnMUC1細胞輸注後（第0天），所有病患的DLT期將在28天結束，因此，在所有投予LD化學療法方案的群組中，DLT觀察期將包括LD化學療法的時間範圍（3天的化學療法從第-6天開始至第-4天，以第-1天為窗口）。相反地，在群組1（組1）及未投予LD化學療法方案的所有群組中，DLT觀察期始於投予CART-TnMUC1細胞。當群組中最後一個被招募之病患完成DLT觀察期（在投予CART細胞後28天）或病患經歷DLT（以較早發生者為準）時，對於任何給定群組的DLT觀察期結束。

為了本研究之目的，最大耐受劑量（maximum tolerated dose，MTD）定義為觀察到的DLT速率被認為是可接受時的最高劑量水平（至少3名可評估患中0位DLT病患，或6名可評估病患中最多1名DLT病患）。考慮到在試驗的第1期部分中的所有可用數據，PSMC將確定在擴展群組中用於進一步測試的劑量，定義為CART-TnMUC1細胞的建議第2期劑量（RP2D）以在試驗的第1a期擴展部分進行研究，RP2D可與MTD相同劑量，或可為第1期研究的較低劑量水平。在第1期的兩個並行組中所確認的RP2D在兩個組中可不同，在此情況下，在組1（實質固瘤，ST）中確認的RP2D為RP2D-ST，而在組2（多發性骨髓瘤，MM）中確認的RP2D為RP2D-MM。

確定MTD的過程將遵循以下用於劑量遞增或遞減的協定準則直至MTD被定義或PSMC定義RP2D。

PSMC負責在試驗第1期部分中決定劑量增量，每個劑量水平的決定將制定以下其中一項：（1）遞增至下一劑量水平；（2）遞減至較低劑量；（3）擴大個人劑量水平群組；或（4）聲明MTD及/或RP2D。PSMC將在針對每個劑量水平群組決策過程的決策中考慮所有可用的安全性、耐受性和可行性數據。

在研究之第1期劑量決定部分之期間，劑量遞增或遞減將由PSMC決定並實施以下措施： • 若在至少3名可評估病患中發生1次DLT（1次DLT/3名病患），則根據PSMC的斟酌，在此劑量水平下可將群組擴增到6名可評估病患。群組被擴增後，若在6位可評估病患中出現2次DLT，則應由PSMC決定將其遞減至先前的劑量水平。 • 若3位可評估病患中有0次DLT或6位可評估病患中有1次DLT，則PSMC可決定將劑量遞增至下一劑量水平群組。 • 若在給定的劑量群組內發生2次DLT，則將停止在此群組的招募，並將劑量遞減至先前的耐受劑量水平。 • 在PSMC的決定，在給定劑量水平上觀察DLT後，若認為適合較佳表徵所觀察到的脫靶DLT，則可將群組擴大以包括無淋巴細胞清除的病患（參見「a」群組，圖30），在此類非淋巴細胞清除群組中治療的病患將不會有助於劑量決策計算。在劑量水平高於劑量水平1且無淋巴細胞清除治療的病患（圖30中的「a」群組）是為了更佳理解給定劑量水平下的安全性，而不是為了整體潛在的劑量遞增。 • 在確定潛在的RP2D後，由PSMC決定，可將額外3-6名病患以確定的RP2D納入第1期的一或兩組中，以在正式確定RP2D-ST及/或RP2D-MM之前進一步確認DLT率及初步安全性和耐受性。

圖30顯示劑量遞增群組，如所示，tr細胞意指經傳導CART-TnMUC1細胞；且LD意指淋巴細胞清除。試驗的第1期劑量遞增部分將依據如概述的劑量遞增群組按經修正的3+3進行，如果PSMC認為適當可更佳地評估所觀察到的脫靶毒性，則可在未投予LD方案下招募可選擇的群組。在招募無LD的群組後（左側的「a」群組），PSMC可決定繼續擴大具有LD方案的群組，或遞減劑量。

若（1）病患經歷DLT或（2）病患在CART-TnMUC1細胞給藥後整個28天被觀察到未經歷DLT且其等已接受每群組協定所指定的劑量水平，則病患被認為對於目的在MTD/RP2D確定是可評估的。

若基於任何原因，無法為給定的病患製造協定所指定的劑量，而產生並輸注較低劑量的細胞，則在以下情況下該病患將被視為可被做出劑量決定的評估： • 病患經歷DLT卻未接受協定指定的劑量水平但已接受較低劑量之CART-TnMUC1細胞，將被認為對於目的在確定DLT的劑量水平是可評估的。 • 病患未經歷DLT，且所接受的劑量低於協定指定的群組劑量水平，將被認為對於進行決策之目的是無法評估，並在需要進行劑量決策時PSMC酌情決定予以替換。

劑量限制性毒性的定義：CART-TnMUC1-01研究中將DLT定義為3級或在1週內以適當醫療管理而不能消退成1級或0級的更高級別的任何與CART治療相關的非血液學不良事件，且除上述標準外，在以CART-TnMUC1細胞的初始劑量後28天內發生。下表10中敍述該定義的例外。

在此研究中，除CRS外，根據CTCAE 5.0版進行AE分級，CRS事件的分級係基於已公佈的CRS準則（Lee et al.（2014）Blood , 124（2）:188-195）並在表11中進行調整，CRS是CART療法的公認併發症。

在接受LD方案的病患中，用於DLT觀察的28天後CART輸注窗口包括LD化學療法方案（因此，整個DLT的觀察時間將約為35天）。在未接受LD方案治療的病患中，DLT觀察期從CART-TnMUC1輸注開始（因此，DLT觀察為28天）。表10：劑量限制性毒性準則

器官系統	DLT標準
非血液學DLT準則
DLT由可能與CART-TnMUC1治療有關的任何3級或更高的非血液學毒性組成，除了以下指出的例外。被認為可能或可能與導致終止治療之CART-TnMUC1治療相關的任何不良事件將被視為DLT。任何經歷DLT之病患將從研究中移除，而不會被替換。
神經學的	任何在72小時內未消退成1級的2級或更高級別的神經毒性將被視為DLT。
胃腸道（胰腺炎）	3級或任何持續的胰腺炎將被視為DLT。無胰腺炎症狀且有胰腺炎症陰性成像^a 的3級澱粉酶及/或脂肪酶無症狀升高將不視為DLT。
血液學DLT準則
DLT由可能與CART-TnMUC1治療有關的任何4級血液學毒性組成。被認為可能或可能與導致終止治療之CART-TnMUC1治療相關的任何不良事件將被視為DLT。任何經歷DLT之病患將從研究中移除，而不會被替換。
血小板減少症	具有出血的3級或更高的血小板減少症將被視為DLT。

CART意指嵌合抗原受體T細胞；DLT意指劑量限制性毒性^a 所有無症狀2級或更高的澱粉酶及/或脂肪酶升高的患者均應進行胰臟成像表11：CRS事件的分級量表

等級	毒性
1級	CRS徵狀不會危及生命，需要對症治療（發燒、噁心、疲勞、頭痛、肌痛、全身不適）
2級	徵狀需要且應作出中度干預 • 需氧量＜ 40% • 對於液體或單一低劑量升壓藥有反應的低血壓 • 2級器官毒性
3級	徵狀需要且應作出積極干預 • 需氧 ≥ 40% •低血壓需要大劑量或多種升壓藥 • 3級器官毒性或4級轉胺酶升高
4級	威脅生命徵狀 • 需要呼吸機支持 • 4級器官毒性
5級	死亡

CRS意指細胞激素釋放症候群

第1a期擴展群組設計

此部分研究將評估初步療效，並進一步表徵在患有TnMUC1 +鉑抗性卵巢癌之病患中進行LD化學療法後，經靜脈內投予CART-TnMUC1細胞之建議第2期劑量（RP2D）的安全性、耐受性和可行性。CART-TnMUC1細胞之RP2D將基於試驗第1期部分的組1（實質固態瘤）中不同群組的安全性及可行性結果確定。

將在試驗的單臂第1a期擴展群組中連續招募病患，在試驗的第1a期部分，考慮到安全性，將不會有任何延誤。

被招募至第1a期擴展群組之病患將具有TnMUC1+鉑抗性卵巢癌。

第1a期擴展群組的安全數據將由一個獨立的數據監察委員會（independent data monitoring committee，IDMC）監控，該委員會由4名獨立成員、3名醫學腫瘤學家和1名統計學家組成，IDMC將監控研究的進行，並特別強調對安全問題的評估以及對活動的觀察，IDMC將由IDMC章程管轄。

IDMC的主要職責是定期審查和評估過度期間的數據，重點在試驗中所招募之病患的安全性、研究的整體進行情況以及對療效的初步觀察。

IDMC將審查所有安全數據，重點在於2級或更大的毒性，以及在試驗中所觀察到的2級或更大的神經毒性及3級或更大的CRS病例，IDMC將監視安全數據並評估毒性的中止規則，並規定暫停招募。簡而言之，IDMC會酌情決定暫停招募至少可能與CART-TnMUC1有關的單個病患的新的4級毒性（在試驗的第1期部分未觀察到），先前在第1期中觀察到的任何4級毒性都被認為至少與在第1a期中兩個或多個病患中所觀察到的CART細胞輸注有關（有待進一步評估毒性原因）。在協定中也監控DLT考量的毒性，且若DLT率被認為大於30％，則將暫停招募並召開IDMC。不歸因於疾病進展且被認為至少與CART細胞輸注有關的任何在投予CART細胞後30天內的死亡，將導致IDMC考慮重新開始註冊的安全性而延後招募。

研究期間：

簽署預篩選知情同意書的病患將具有保存的腫瘤樣本，提供於經由IHC之中央TnMUC1檢測。不具有保存樣本的病患可進行生檢，其僅使用非重大風險程序進行預篩選待收集之腫瘤樣本。經中央免疫組織化學（IHC）分析測試之患有TnMUC1+ 腫瘤的病患可簽署主要研究知情同意書而進入篩選。經中央分析而篩選失敗之患有TnMUC1+腫瘤的病患將無需提交第二份腫瘤樣本，且再次進行預篩選程序以重新篩選研究。

預篩選：簽署預篩選知情同意書之病患將具有保存的腫瘤樣本，提供於經由IHC之中央TnMUC1檢測。不具有保存樣本的病患可進行生檢，其僅使用非重大風險程序進行預篩選待收集之腫瘤樣本。經中央免疫組織化學（IHC）分析測試之患有TnMUC1+腫瘤的病患可簽署主要研究知情同意書而進入篩選。經中央分析而篩選失敗之患有TnMUC1+腫瘤的病患將無需提交第二份腫瘤樣本，且再次進行預篩選程序以重新篩選研究。

篩選：符合所有納入準則且無任何排除準則的病患將完成合格準則並被提交群組分配。在第1期劑量遞增期間，病患將被分配到開放投劑群組中的可用位置；在群組分配時，病患被視為已納入研究。在第1a擴展期，病患根據資格和製造可用性分配。在招募時，安排病患進行白血球分離術程序及CART-TnMUC1的製造。

白血球分離術及CART細胞製造：納入研究之病患（參見上述定義）將被安排白血球分離術程序、淋巴細胞清除化學療法（若協定指定）及CART-TnMUC1輸注，然後病患將根據協定及血球分離術和輸注手冊中所詳述進行試驗白血球分離術程序。完成該程序後，將白血球分離術產物冷凍並運送到製造場所（University of Pennsylvania CVPF），白血球分離術產物被運送到CVPF進行製程。

橋接抗癌療法：在一些病患中，在白血球分離術程序之後和投予LD化學療法方案之前（在CART生產程序期間），適當提供抗癌療法方案。在這種情況下，首席研究員應就提議的橋接療法方案選擇及給藥時機與主持醫學監控單位進行協商。一般而言，在方案中具有（1）在特定疾病環境中證實活性性的療法和（2）可投予而無干擾LD方案給藥之長期毒性，可考慮作為病患的白血球分離術後及LD治療方案前的橋接療法給藥。在LD方案投予之前，病患必須至少有2週沒有任何全身性療法，在投予橋接療法之前，先諮詢主持醫學監控單位。

淋巴細胞清除化學療法：如前所述，在CART輸注之前，病患將接受由第-6天開始於第-4天完成的LD化學療法方案（可將投予LD化學療法方案的治療時間窗口擴展至第-7天至第-5天，而CART輸注固定在第0天）。在淋巴細胞清除（LD）方案投予之前，必須對照LD前給藥檢查清單（表12）對病患進行評估，主要研究員可酌情決定將病患住院進行LD化學療法。在第1期群組1及在可選擇之第1期群組中無LD的受招募病患（表12）將不會接受LD方案，而是將進行CART輸注（第0天）。表12：淋巴細胞清除檢查清單

No.	類別	說明
1	疾病反應	病患必須不能經歷新研究者認會使接受LD方案和CART輸注不安全的疾病併發症、腫瘤反應或徵狀。在LD化學療法或第0天CART輸注之前，預期第0天（自篩選疾病評估以來大於6週）的病患必須進行重複的疾病分期。
2	抗腫瘤療法	病患在投予LD方案之前2週內必須沒有接受任何抗腫瘤療法，橋接抗癌療法必須在LD化學療法投予前至少2週完成。
3	ECOG狀態	當與篩選時的狀態相比，病患必須沒有已經歷表現或臨床狀態的明顯改變，研究者認為這會增加CART細胞輸注的風險。
4	呼吸道病毒檢驗套組（Respiratory viral panel）	病患必須進行呼吸道病毒檢驗套組檢查，並在計劃的CART輸注之前10天之內獲得結果。若病患在病毒檢驗套組上對任何病毒呈陽性，則應開始治療，並在治療後延遲至少7天輸注CART細胞。若存在臨床徵狀，則應延遲LD化學療法及CART細胞輸注直至解決。若病患在接受LD方案後4週內不能接受CART輸注，則應重複LD化學療法，在這種情況下，諮詢主辦醫療監控單位。
5	區間毒性評估	病患不得具有以下任何毒性（由於橋接化學療法）： a. 肺臟：需要補充氧氣以保持氧氣飽和大於95％或存在肺影像學研究的新發現（毒性LD或CART輸注前無需進行影像學檢查，除非需要進行毒性管理） b. 心臟：無新的心律不整 c. 需要醫療（強心）支持的低血壓 d.主動感染定義為需要抗生素的細菌、病毒或真菌的陽性培養物。在輸注前期期間、LD前時間框架內需要抗生素療法的病患應在LD化學療法及CART輸注前完成抗生素療法。

CART意指嵌合抗原受體T細胞；ECOG意指Eastern Cooperative Oncology Group；LD意指淋巴細胞清除

CART-TnMUC1細胞輸注：完成LD化學療法後約3-4天開始CART輸注（進行LD化學療法的地方）。在投予CART細胞之前，將根據CART-TnMUC1輸注檢查清單對病患進行評估（表13），CART-TnMUC1之輸注日期為研究第0天。病患將接受CART輸注，並在CART細胞輸注後至少2個晚上作為強制性觀察期作為病患管理（輸注後第0天隔夜觀察最少，第1天隔夜觀察且可能免除第2天）。對於在CART輸注後觀察到的毒性，可能需要進行額外的病患管理。CART細胞輸注將住院病患或在有住院觀察的細胞療法單位中進行（至少2個晚上的觀察）。表13：CART-TnMUC1輸注檢查清單

No.	類別	說明
1	疾病反應	病患必須不能經歷新研究者認會使接受LD方案和CART輸注不安全的新的疾病併發症、腫瘤反應或徵狀。在LD化學療法或第0天CART輸注之前，預期第0天（自篩選疾病評估以來大於6週）的病患必須進行重複的疾病分期。
2	抗腫瘤療法	病患在投予LD方案之前2週內必須沒有接受任何抗腫瘤療法，橋接抗癌療法必須在LD化學療法投予前至少2週完成。
3	ECOG狀態	當與篩選時的狀態相比，病患必須沒有已經歷表現或臨床狀態的明顯改變，研究者認為這會增加CART細胞輸注的風險。
4	呼吸道病毒檢驗套組	病患必須進行呼吸道病毒檢驗套組檢查，並在計劃的CART輸注之前10天之內獲得結果。若在LD化學療法之前評估，則無需在LD化學療法之後重新評估RVP。若病患在病毒檢驗套組上對任何病毒呈陽性，則應開始治療，並在治療後延遲至少7天輸注CART細胞。若存在臨床徵狀，則應延遲LD化學療法及CART細胞輸注直至解決。若病患在接受LD方案後4週內不能接受CART輸注，則應重複LD化學療法，在這種情況下，諮詢主辦醫療監控單位。
5	LD方案毒性	病患在LD 化學療法期間必須不能經歷以下任何毒性： a. 肺臟：需要補充氧氣以保持氧氣飽和大於95％或存在肺影像學研究的新發現（毒性LD或CART輸注前無需進行影像學檢查，除非需要進行毒性管理） b. 心臟：無新的心律不整 c. 需要醫療支持的低血壓 d. 主動感染定義為需要抗生素的細菌、病毒或真菌的陽性培養物。在輸注前期期間需要抗生素療法的病患應在淋巴細胞清除及CART輸注前完成療法。經歷來自LD化學療法之毒性的病患應在CART細胞輸注前根據研究者自行決定對這些毒性進行管理和解決。若病患在4週內不能接受CART輸注，則應重複LD化學療法，在這種情況下，諮詢主辦醫療監控單位。

病患群

納入準則:

用於研究的第1期及第1a期擴展部分的納入標準概述如下，受招募的病患必須符合以下所有各個納入標準才能納入研究中。 1.病患必須是18歲以上的成人，並簽署主要研究知情同意書。 2. 病患必須具有確診的轉移性治療抗性卵巢癌（包括輸卵管癌）、胰腺癌、激素受體（HR）-陰性及HER2-陰性（三陰性）乳癌（TNBC）或非小細胞肺癌（NSCLC）或復發/難治多發性骨髓瘤。 3. 病患必須具有ECOG積分為0或1。 4. 病患必須以接受下列先前療法： a. 多發性骨髓瘤：以下任一情況導致復發或難治性疾病 i. 至少有3種先前療法，其中必須已含烷基化劑、蛋白酶體抑製劑及沙利多邁類似物（來那度胺或泊馬度胺（pomalidomide）），或 ii. 若對蛋白酶體抑製劑及沙利多邁類似物「雙重耐藥」，則至少有2種先前方案，定義為以這些藥物治療在60天或60天內的進展。注意：誘導療法、自體幹細胞移植（ASCT）及維持療法如果連續給藥而無干預，則被視為1個「方案」。 iii. 病患自ASCT起（若執行），必須至少90天。 b. NSCLC iii. 病患必須接受標準療法，包括檢查點抑制（PD-1/PD-L1導向療法）及鉑系化學療法，或對這些標準療法不耐受。 iv. 除上述標準療法類別外，患有EGFR或ALK變異的病患還必須接受針對特定已識別之突變的先前靶向療法。 c. 胰腺癌：對於轉移性或不可切除的疾病，病患至少必須遵循至少一種護理性全身化學療法標準後才經歷疾病進展。 d. 三陰性乳癌（TNBC）：患者必須在至少一種先前全身性抗癌療法方案作為其管理轉移性乳癌之治療之一部分後經歷疾病進展。 e. 卵巢癌：如果考慮到鉑抗性（最初對鉑療法敏感），病患是合格的，且必須已經接受至少兩線關於轉移性卵巢癌的先前療法，包括至少一線包括含鉑方案的先前療法。 5. 病患必須具有可評估的疾病，且符合以下條件： a. 多發性骨髓瘤 iii.病患進入研究時必須患有可測量的疾病，其中必須包括以下至少一項 1. 血清M蛋白濃度異常升高（M spike）≥ 0.5 g/dL 2. 24小時尿液M spike ≥ 200 mg 3. 具有比率異常的相關血清游離輕鏈（FLC）≥ 50 mg / L， 4.檢查或成像中可測量的漿細胞瘤 5. 骨髓漿細胞≥ 20% 注意：由於正常血清蛋白質與副蛋白質在β區的共同遷移，血清蛋白電泳被認為不可靠的IgA骨髓瘤病患只要總血清IgA水平升高至正常水平以上，就可以認為該病患是合格的。 b. 實質固態瘤：疾病狀態將根據Response Evaluation Criteria In Solid Tumors Criteria（RECIST v.1.1, see, Eisenhauer et al.（2009）Eur J Cancer , 45（2）:228-247）進行評估，腫瘤成像應在血球分離術前至少28天內進行，期別-特異性準則如下述 ii. 第1期：根據RECIST v.1.1，病患必須在第1期具有可評估的疾病。 iv. 第1a擴展期：根據RECIST v.1.1，病患必須在第1a擴展期具有可評估的疾病。 6. 所有病患都必須患有TnMUC1+疾病，其藉由先前或保存的腫瘤生檢中經集中測試TnMUC1表現而確定。若沒有保存的腫瘤生檢樣本，則病患可進行僅以非重大風險生檢程序之篩選合格為目的的可選擇性生檢。 7. 病患必須在篩選前至少2週之前完成先前抗癌療法，且任何以前的療法的毒性必須恢復到1或0級（除落髮，電解質或內分泌異常控制良好，周圍神經病變和白斑病控制良好）。 8. 預期壽命大於3個月。 9. 足夠的重要器官功能，如以下定義 a. 血清肌酐 ≤ 1.5 mg/dL或估計肌酐清除率 ≥ 30 ml/min（根據機構標準計算） b. 丙胺酸胺基轉移酶（ALT）及天門冬胺酸胺基轉移酶（AST）≤ 3x正常上限（ULN）及總膽紅素 ≤ 2.0 mg/dL，沒有針對肝病病患的特殊排除 c. 血清總膽紅素＜ 1.5 x ULN d.血清白蛋白 ≥ 3.0 g/dL（僅組1及第1a期中之實質固態瘤病患，不適用於患有多發性骨髓瘤的病患） e. 左心室射血分率（Left ventricular ejection fraction，LVEF）≥ 45%，LVEF評估必須在篩選的8週內進行 10. 足夠的血液學儲備（在血球分離術後4週內不使用支持性輸血或造血生長因子），如以下定義 a. 血紅素 ≥ 9 g/dL b. 絕對嗜中性球計數 ≥ 1000/μL c. 血小板計數≥ 50,000/μL（≥ 30,000/μL，若骨髓瘤病患之骨髓漿細胞之細胞xm4率 ≥ 50%） d. 絕對嗜淋巴球計數＞ 500/μL 注意：病患不得依賴輸血來維持血液學參數 11. 生殖潛在性的病患同意按協定使用批准的避孕方法。

排除準則:

用於第1期及第1a擴展期的排除標準如下所述，被考慮納入研究的病患必須不符合以下任何準則。 1. 除所提議包括於本研究中之癌症以外的主動侵襲性癌症。 2. 現以全身性高劑量皮質類固醇治療（定義為大於強體松20 mg/天等效量之劑量）。在進入研究時患有多發性骨髓瘤的病患必須在血球分離術之前完成先前活性高劑量的皮質類固醇療法，並保持低劑量皮質類固醇療法或無皮質類固醇療法。以相當於強體松20 mg/天或更低劑量的皮質類固醇之低劑量生理替代療法是合適的。 3. 主動自體免疫性疾病（包括結締組織疾病、葡萄膜炎、類肉瘤病、炎症性腸病或多發性硬化症）或具有嚴重自體免疫性疾病病史，需要延長免疫抑制性療法（任何免疫抑制性療法應在篩選訪查前6週內停止）。 4.當前有活性HIV、HCV、HBV感染，所有病患都必須在篩選中進行病毒測試以排除亞臨床感染。 5. 其他活動或不受控制的醫學或精神病學症狀，其可能會妨礙參與主辦者或主要研究者的見解。 6. 先前同種異體的幹細胞移植。 7. 活性且未經治療之中樞神經系統（CNS）惡性腫瘤。若在明確治療後穩定至少1個月，則可認為治療後的病變不具活性，病患不得要求使用皮質類固醇療法或抗癲癇藥治療腦轉移。 8. 對單株抗體或生物療法或對研究產物賦形劑（例如，人類血清白蛋白、DMSO、葡聚醣40）有嚴重輸注反應的病史，這將阻止病患安全地接受CART-TnMUC1細胞。 9. 活性或近期的（在血球分離術之前的六個月內）心臟疾病，定義為（1）紐約心臟協會（New York Heart Association，NYHA）第3級或第4級心臟衰竭，（2）不穩定型心絞痛，或（3）最近的（6個月內）心肌梗塞或持續性（＞ 30秒）心室性心搏過速之病史。 10. 具有血球分離術程序的靜脈通路不足或禁忌症。 11. 妊娠或哺乳期婦女。

在另一實施方式中，病患族群將符合以下準則：關鍵納入準則: 1. 確診的轉移性治療抗性卵巢癌（包括輸卵管癌）、胰腺癌、激素受體（HR）-陰性及HER2-陰性（三陰性）乳癌（TNBC）或非小細胞肺癌（NSCLC）或復發/難治多發性骨髓瘤。 2. 美國東岸癌症臨床研究合作組織（ECOG）積分為0或1。 3.如本文所述之腫瘤類型定義之先前療法。 4.可評估之如本文所述之腫瘤類型所定義的疾病。 5. TnMUC1+疾病，藉由在先前或保存的腫瘤生檢中集中測試的TnMUC1表現確定。 6. 在篩檢和毒性試驗之前已經完成先前抗癌療法至少2週。 7. 預期壽命超過3個月。 8. 血清肌酐 ≤ 1.2 mg/dL或經計算的肌酐清除率 ≥ 60 ml/min（使用Cockroft & Gault方程式）。 9. 天門冬胺酸胺基轉移酶（AST）或丙胺酸胺基轉移酶（ALT）≤ 2.5 x正常的機構上限值，下列情況除外：具有已知肝擴散之病患，AST或ALT ≤ 3 x 正常的機構上限值。 10. 血清總膽紅素＜ 1.5 mg/dL，下列情況除外：病患具有吉爾伯特（Gilbert）氏病，血清總膽紅素＜ 3 mg/dL。 11.血清白蛋白 ≥ 3.0 g/dL（實質固態瘤病患 in 組1 and Phase 1a only, not applicable to 病患 with 多發性骨髓瘤）.（實質固態瘤病患僅在組1及第1a期，並不適用於具有多發性骨髓瘤之病患）。 12. 左心室射出分率（LVEF）≥ 50%，LVEF評估必須在篩檢的8週內進行。 13. 血紅素 ≥ 9 g/dL。 14. 絕對嗜中性球計數 ≥ 1500/μL。 15. 血小板計數≥ 100,000/μL（若骨髓瘤病患的骨髓血漿細胞的細胞率（cellularity）≥50％）。 16. 絕對嗜淋巴球計數 of ＞ 500/μL。

關鍵排除準則： 1. 研究治療中所建議之癌症以外的主動侵襲性癌症。 2. 目前以使用全身性高劑量皮質類固醇治療（定義為大於相當於強體松20 mg/天的劑量）。 3. 主動性自體免疫性疾病（包括結締組織疾病、葡萄膜炎、類肉瘤病、炎症性腸病或多發性硬化症）或有嚴重自體免疫性疾病病史，需要長期的免疫抑制性療法（任何免疫抑制性療法應在篩檢訪視前6週內停止）。 4. 當前的活性人類免疫缺陷病毒（HIV）、C型肝炎病毒（HCV）、B型肝炎病毒（HBV）感染。 5. 先前有同種異體的幹細胞移植。 6. 活性和未經治療的中樞神經系統（CNS）惡性腫瘤。 7. 對單株抗體或生物療法或研究產品賦形劑（例如人血清白蛋白、二甲基亞碸（DMSO）、葡聚醣40）具有嚴重輸注反應的病史，這將阻止病患安全地接受CART-TnMUC1細胞。 8. 活性或最近的（在血球分離術之前的六個月內）心臟疾病，定義為（1）紐約心臟協會（NYHA）第3級或第4級心臟衰竭，（2）不穩定型心絞痛或（3）最近的（六個月內）心肌梗塞或持續性（＞ 30秒）心室性心搏過速的病史。 9. 對於血球分離術程序具有靜脈通路不足或禁忌。 10. 妊娠或哺乳期婦女。

研究治療

研究用藥劑： • CART-TnMUC1細胞：以編碼抗TnMUC1 CAR之慢病毒轉導之自體T細胞，該抗TnMUC1 CAR由組成鼠類抗人類TnMUC1 scFv（源自單株Ab 5E5）、CD8a鉸鏈及跨膜域、CD2及CD3ζ組成，CART-TnMUC1-細胞藉由靜脈內途徑投予。 • 環磷醯胺：一種在CART- TnMUC1細胞給藥之前與氟達拉濱合併靜脈內投予用於淋巴細胞清除之細胞毒性化療劑，除群組1（及在第1期中納入可選擇的非LD群組之病患）之病患外，所有的病患都投予環磷醯胺，環磷醯胺的給藥將為300 mg/m² /天，合併氟達拉濱為期3天。 • 氟達拉濱：一種在CART- TnMUC1細胞給藥之前與環磷醯胺合併用於淋巴細胞清除之化療劑。除群組1（及在第1期中納入可選擇的非LD群組之病患）之病患外，所有的病患都投予氟達拉濱，氟達拉濱的給藥將為30 mg/m² /天共計3天，淋巴細胞清除化學療法的給藥將安排在第-6天至第-4天（與第-1天窗口，即，在第-7至-5天投劑）。

淋巴細胞清除方案：在第1期劑量群組水平2及在第1a期擴展群組中所有病患，在第-6至-4天（與第-1天窗口，即，在第-7至-5天投劑）病患將以LD化學療法方案至療，並在第0天CART-TnMUC1輸注（例外為PSMC決定不採用LD方案的劑量遞增群組），所有病患將接受相同LD方案：環磷醯胺：300 mg/m2/天為期3天，合併氟達拉濱：30 mg/m2/天為期3天。

環磷醯胺/氟達拉濱服藥前：預期接受環磷醯胺的病患可能會經歷噁心和嘔吐之治療副作用，可根據機構標準在化學療法輸注前使用止吐藥預防噁心（包括皮質類固醇），具體藥劑的選擇將由研究者自行決定。

環磷醯胺：環磷醯胺的耐受性一般良好並應根據機構實作規範給藥，包括由主要研究員自行決定進行住院病患監測。在處方資訊（環磷醯胺標籤）中描述在LD方案中使用的劑量範圍的環磷醯胺在病患中所觀察到的不良事件，這些劑量下的不良事件包括：（1）皮膚反應（脫髮開始3-6週）；（2）所見到的血小板減少症和貧血之骨髓毒性一般比白血球減少症和嗜中性球減少症少見，發病時間為7天， 10-14天為最低點，大約21天即可恢復；（3）大劑量時更容易發生噁心和嘔吐，通常在給藥後6-10小時開始；將按照機構標準為病患提供止吐預防及療法；及（4）急性出血性膀胱炎被認為是環磷醯胺代謝產物（丙烯醛（acrolein））對膀胱產生化學刺激的結果，在大約10%的病患且在某些系列中最高為40%的病患中可以觀察到，根據機構實作規範，建議使用適當的美斯納（Mesna）（i.v.）進行水合。

氟達拉濱：在LD化學療法中，氟達拉濱與環磷醯胺組合投予。氟達拉濱的耐受性一般良好並應根據機構實作規範給藥，包括由主要研究員自行決定進行住院病患監測。在處方資訊（氟達拉濱標籤）中描述在氟達拉濱投劑所觀察到的不良事件（AE），這些AE一般包括（1）骨髓抑制，包括貧血、血小板減少症、嗜中性球減少症及淋巴球減少症。病患可感受嚴重但通常是可逆的，儘管這通常發生在氟達拉濱的累積劑量（每28天連續3天投予）之後。在此研究中，病患將接受為期3天的氟達拉濱單次給藥。（2）自體免疫性血液學不良事件，包括溶血性貧血或免疫性血小板減少症，可能會在氟達拉濱1或多個週期後發生，將評估接受氟達拉濱治療的病患，並密切監測其血球減少症及/或溶血情況。（3）氟達拉濱可能會引起噁心及嘔吐，並將根據機構實作規範提供病患止吐預防及療法。

組合LD方案（Flu/Cy）：氟達拉濱及環磷醯胺之組合（Flu/Cy）是CAR-T試驗中公認的標準LD方案。根據以上所述，該組合最常見的潛在AE包括骨髓抑制，其中低嗜中性球/顆粒球或淋巴球可能導致感染及/或血小板減少症可能導致瘀傷或出血的增加。與該組合相關的其他AE包括嗜中性白血球減少症合併高體溫、出血性膀胱炎、疲勞、噁心、嘔吐及脫髮。

環磷醯胺及氟達拉濱的投予應遵循機構標準實作規範，並遵守指示的支持性護理指南。

CART-TnMUC1細胞之製備：細胞製造進行於University of Pennsylvania Clinical Cell and Vaccine Production Facility（CVPF），根據在冷袋（cryobag）中轉導細胞的劑量調配用於給藥之CART-TnMUC1細胞劑量，轉導細胞的劑量使用流式細胞分析測試計算以決定表現CAR之CD3+ T細胞的百分比，在輸注袋中所含的總細胞數目及用於輸注的細胞懸浮液總體積取決於慢病毒轉導效率。

每袋將包含等分的低溫介質（cryomedia），其中包含以下難溶性等級試劑（%v/v）： • 31.25%（v/v）之PlasmaLyte-A • 含31.25%（v/v）之5%右旋醣（Dextrose）的0.45%氯化鈉 • 含10%（v/v）之10%葡聚醣40的5%右旋醣 • 20%（v/v）之25%人類血清白蛋白（HSA） • 7.5%（v/v）二甲基亞碸（DMSO）

預防和支持性照護：服藥前：T細胞輸注後的副作用包括短暫發燒、發冷及/或噁心，建議在CART-TnMUC1細胞輸注之前，以乙醯胺苯酚及抗組胺藥預先用藥於病患，這些藥物可根據所需每六小時重複一次，若病患持續出現對乙醯胺苯酚無法緩解的發燒，可開立一個非類固醇類消炎藥療程之藥方。

皮質類固醇療法：若在威脅生命的毒性或對投予托珠單抗無反應的毒性下，病患應接受全身性皮質類固醇，例如氫皮質酮、強體松、去氫皮質醇（甲基培尼皮質醇）或地塞米松（dexamethasone）（Decadron）。不建議以LD化學療法方案預防嘔吐或危及生命的毒性以外的其他原因而投予皮質類固醇療法，因為這可能會對CART-TnMUC1細胞的擴張和功能產生不利影響。

支持性照護：在因最近的LD化學療法方案給藥而在CAR-T輸注當天發生嗜中性球減少症的病患中，將根據機構標準及/或Neelapu et al.（2018）Nat Rev Clin Oncology , 15:47中之建議施用預防性抗生素，通常從輸注之日開始，直到嗜中性球計數恢復，或直到研究者斷定不再有增加感染的風險。

現場藥局必須確認2劑托珠單抗在輸注之前已在現場並可用於給藥以便管理可懷的毒性。在輸注期間，若病患對輸注有過敏/過敏性反應，或嚴重的低血壓危機或其他任何反應，則必須可獲得緊急醫療設備（即，急救推車）。

CART-TnMUC1細胞靜脈內投予：將遵循血球分離術和輸注手冊（Apheresis and Infusion Manual）中概述的程序，將CART-TnMUC1細胞產物於研究之第0天（無窗）以i.v.輸注投予，輸注中心的研究人員應為免疫抑制的病患使用預防措施。T細胞輸注應由研究中心的一名合格註冊護士在研究人員或指定醫師在場的情況下進行，在輸注中需要延緩CART細胞輸注應與研究的主持醫療監控單位討論。

在CART輸注後的第一個小時每15分鐘（±5分鐘）測量一次生命徵象，然後在接下來的2小時每30分鐘（±10分鐘）測量一次生命徵象。如果在CART-TnMUC1細胞輸注後3小時內病患的生命徵像不令人滿意且不穩定，則將每30分鐘（±10分鐘）或根據臨床指示對生命徵象繼續監測直至穩定。若生命徵象在輸注後起初3小時穩定，則應每小時監控病患生命徵象至CART輸注後12小時。若生命徵象持續穩定，則可遵循機構標準每2-4小時監控病患生命徵象直至出院。在CART-TnMUC1輸注後2晚期間內，將病患作為住院病患進行監控，若此病患在第二個隔夜觀察期後穩定，則該病患可出院回家。

在CART-TnMUC1輸注後，所有病患必須留在臨床試驗地點附近的地理區域內至少30天，並返回臨床試驗地點評估任何毒性反應，包括（但不限於）發燒至38℃、噁心、嘔吐、呼吸困難、不適或任何新的神經系統徵狀。該本地地理位置被定義為到臨床試驗地點的行進距離不超過60分鐘。

可根據需要執行額外的評估，以評估特定的不良事件直到其等被解決為基線或CTCAE v5.0等級＜1。

結果測量

主要結果測量：

主要結果測量包括（1）第1期：以劑量鑑定為目的鑑定組1和組2群組中的劑量限制性毒性（DLT）發生率；及（2）第1a期：t鑑定具有客觀反應的鉑抗性卵巢癌的病患比例。

次要結果測量：

次要結果測量包括（1）CART-TnMUC1的安全性、耐受性和可行性：未接受CART-TnMUC1細胞的受招募病患之治療突發性不良事件（AE）的發生率、偏離基線實驗室結果、異常值及變化、生命徵象及比例；（2）CART的初步抗腫瘤療效：整體存活期（OS）、無惡化存活期（PFS）、客觀緩解率（ORR）、反應持續時間和反應時間；（3）TnMUC1的表現：TnMUC1的表現水平與功效參數的相關性；及（4）CART-TnMUC1細胞的週邊擴展和持續性：與相關療效和安全性參數的相關性。

實施例 10 ：轉導及 T 細胞擴展協定

在一實施方式中，使用來自正常供體ND473、ND474、ND502及ND525之細胞，生成CART-TnMUC1、CART-TnMUC1-BBz、CART-19及NTD細胞。

轉導：第0天，將獲自人類免疫學中心（Human Immunology Core）的大批T細胞（CD4及CD8）稀釋成1 x 10⁶ 個細胞/mL，並以CD3/28珠在1：3之細胞：珠的比例下進行刺激。T細胞被培養於補充U/mL IL-2之R10培養基，經包裝的慢病毒載體（TnMUC1 CAR、TnMUC1-BBz CAR、CD19 CAR）的轉導在使用3 MOI刺激後第1天進行，並使其在37°C/5% CO2培養箱中擴增，培養NTD細胞作為對照。

T細胞擴展：以新鮮T細胞培養物培養基每2天餵飼細胞及分配成0.75 × 10⁶ 個細胞/mL，細胞在第5天被去除珠子，並保持在培養基中。在擴張階段結束時，細胞休止，這取決於細胞分裂速率的降低和平均細胞體積的減少至約〜350至〜300 fL。將細胞以5×10⁷ 個細胞/mL（每小瓶1 mL的體積）等分試樣在冷凍保存培養基中冷凍，並保存在液氮中備用。

細胞計數：在整個擴增過程中的各個時間點，將細胞輕輕混合，並從已知培養體積中收集40 µL等分試樣的細胞，並將其與20 mL Isoton II Diluent Buffer一起置於光析槽（Beckman Coulter）中，以使用Coulter Multisizer 3（Beckman Coulter）按照TRP實驗室標準操作程序計數，這些分析確定細胞濃度、總細胞數、生長速率及細胞體積，並用於計算稀釋體積並用於確定何時細胞休止進行冷凍。

從刺激後第5天到第23天計數存活細胞，當紅血球平均體積（mean corpuscular volume，MCV）平均達300 fL時，T細胞停止擴增。從T細胞活化到休止MCV的時間可受CAR轉導以及供體變異性的影響。

在另一實施方式中，CART-TnMUC1和NTD細胞是使用來自正常供體ND489的細胞所生成。

轉導：在第0天，將獲自人類免疫學中心（Human Immunology Core）的大批T細胞（CD4及CD8）稀釋成1 x 10⁶ 個細胞/mL，並以CD3/28珠在1：3之細胞：珠的比例下進行刺激，於補充100 U/mL IL-2之CTS™ OpTmizer™ T Cell Expansion培養基中培養T細胞，經包裝的慢病毒載體（TnMUC1 CAR）的轉導在使用2.5 MOI刺激後第1天進行，並使其在37°C/5% CO2培養箱中擴增，培養NTD細胞作為對照。

T細胞擴展：在第3天開始，以新鮮T細胞培養物培養基每隔一天餵飼細胞並分配成0.5 × 10⁶ 個細胞/mL，將細胞保持在培養狀態經過第9天，此時收穫並去除珠子。將細胞以5×10⁷ 個細胞/mL（每小瓶1 mL的體積）等分試樣在冷凍保存培養基中冷凍，並保存在液氮中備用。

細胞計數：在整個擴增過程中的各個時間點，將細胞輕輕混合，並從已知培養體積中收集等分試樣的細胞，並在添加吖啶橙（acridine orange）及碘化丙啶（propidium iodide）細胞生存染劑後，置於LUNA™ Cell計數玻片（Logos Biosystems）中，然後使用Luna Automated Cell Counter（Logos Biosystems）計數細胞。

流式細胞分析：藉由流式細胞分析測量新鮮細胞等分試樣的轉基因表現，為了決定轉導效率，離心所需數量的細胞，再懸浮於100 µL螢光活化細胞分類計（fluorescence activated cell sorter，FACS）緩衝液（具有2%胎牛血清[FBS]之1x磷酸鹽緩衝液鹽水[PBS]）中，並在冰上以1.0 µg/100 µL生物素化蛋白L或5 µL/100 µL山羊抗小鼠染色20分鐘。將細胞以FACS 緩衝液洗滌2次，並在冰上以1 µL/100 µL of 鏈黴親和素-PE染色20分鐘，然後以PBS洗滌細胞，並在冰上以含L/D紫羅藍紫0.1 µL/100 µL之PBS於室溫染色20分鐘。染色後，再次清洗細胞，再懸浮於400 µL of FACS緩衝液，並使用BD LSRFortessa捕獲。

T細胞擴增：

使用五種不同的正常供體以SIN慢病毒載體生成CART-TnMUC1細胞。簡而言之，從單核細胞中分離初代人類T細胞，在經補充IL-2的培養基中培養，並以CD3/CD28珠（Invitrogen）以1：3的細胞與珠的比率進行刺激。活化後約16小時，以含TnMUC1 CAR、TnMUC1-BBz CAR或CD19 CAR的慢病毒轉導T細胞，並孵育隔夜。培養NTD細胞作為對照。在擴增期間，每隔一天用新鮮培養基稀釋T細胞，以保持最佳生長。

與MUC1-BBz CAR、CD19 CAR及NTD細胞相比，Tn MUC1 CAR的轉導對生長沒有負面影響。計算總細胞數及群體倍增水平（population doubling level，PDL）並與MCV一起作圖。MCV僅針對使用Multisizer 3（ND473、ND474、ND502、ND525）的列舉樣本確定。結果如圖31-32所示。

圖31顯示來自5個不同正常健康供體的T細胞以所示的CAR轉導並在活體外擴增的及培養活細胞後的總細胞數，（A）ND473、（B）ND474、（C）ND502、（D）ND525、（E）ND489，在各時間點計算總細胞數並繪製在y軸上。

圖32顯示來自5個不同正常健康供體的T細胞以所示的CAR轉導並在活體外擴增的及培養活細胞後的群體倍增，（A）ND473、（B）ND474、（C）ND502、（D）ND525、（E）ND489，在各時間點計算群體倍增並繪製在y軸上。

圖33顯示來自4個不同正常健康供體的T細胞以所示的CAR轉導並在活體外擴增的及培養活細胞後的平均細胞體積，（A）ND473、（B）ND474、（C）ND502、（D）ND525，在各時間點的平均細胞體積繪製在y軸上。並未記錄ND489的平均細胞體積。

對於ND473、ND474、ND502及ND525，培養持續時間取決於細胞分裂速率的降低和平均細胞體積的降低，約為〜350至〜300fL，CAR轉導可影響T細胞的活化狀態並增加細胞產物保持超過300 fL之MCV的時間，平均細胞體積在5天到8天之間達到峰值，並因供體而異。關於ND473，對於TnMUC1 CAR及TnMUC1-BBz CAR組在第23天而對於CD19 CAR及NTD組在第19天將細胞冷凍保存。關於ND474，除了TnMUC1-BBz CAR組（其在第19天冷凍保存），所有組別皆在第17天冷凍保存。關於ND502及ND525，TnMUC1 CAR組在第14天冷凍保存，而NTD組各在第11天及第10天冷凍保存。

相反地，關於ND489，TnMUC1 CAR和NTD組在第9天冷凍保存，STIL將在9天的過程中製備T細胞，以配合9-11天的CAR-T細胞生產。

在收穫時，經TnMUC1 CAR轉導之組別達到8.7（14天培養，ND502）至169.6（17天培養，ND474）的總倍數擴增，以9天培養的供體總倍數擴增達到36.3（ND489）。TnMUC1 CAR轉導組別的收穫PDL範圍從4.85（14天培養，ND502）至7.4（17天培養，ND474）。以9天培養的供體具有4.97（ND489）的收穫PDL。對於所有供體，收穫時收穫PDL均不會受到超過10%的供體匹配NTD細胞的抑制。

人類T細胞之CAR表現：

藉由使用生物素化的蛋白質L及鏈黴親和素-PE或生物素-山羊抗小鼠及鏈黴親和素-PE的流式細胞分析量測轉基因表現，表現顯示於圖34。在圖34中，正常供體T細胞以所指之慢病毒表現載體轉導，並藉由流式細胞分析量測scFv+ T細胞之百分比。

對於TnMUC1 CAR之轉導效率為72%（ND473；平均螢光強度[MFI] 779）、46.8%（ND474；MFI 683）、58.3%（ND502；MFI 2617）、69.0%（ND525；MFI 2678）及52.2%（ND489；MFI 2116），這些結果證實載體成功驅使TnMUC1 CAR轉基因的表現，5個正常供體的平均轉基因表現為59.7%，平均MFI為1775，而在亦用於生產CART-TnMUC1-BBz及CART-19的2個供體的子集中，平均轉導效率為59.4%，平均MFI為731。

關於ND473，TnMUC1-BBz CAR及CD19 CAR之供體匹配轉導效率各為69.6%（MFI 4442）及64.9%（MFI 2773），且關於ND474，各為55.6%（MFI 4342）及67.2%（MFI 1971）。TnMUC1-BBz CAR之平均轉導效率為62.6%（平均MFI 4392），而CD19 CAR為66.1%（平均MFI 2372）。ND502、ND525及ND489並未以TnMUC1-BBz CAR或CD19 CAR載體轉導。

儘管供體匹配的TnMUC1 CAR和TnMUC1-BBz CAR轉導細胞的總百分比相似，但MFI的差異指出TnMUC1 CAR轉基因的強度降低。

其他實施方式

本文列舉任何變量定義中的元件列表包括將該變量定義為所列元件的任何單個元件或組合（或子組合）。本文對實施方式的描述包括作為任何單一實施方式或與任何其他實施方式或其部分組合的實施方式。

本文所引用之各專利案、專利申請案及公開文獻的揭露，藉由引用其全文而併入本文。本發明雖已參照特定實施方式揭露，但很顯然對於其他本發明所屬技術領域具有通常知識者而言仍可設計出未背離本發明精神與範疇的其他實施例與變形，所附之申請專利範圍意在被解釋為包括所有此類實施方式及同等變型。

無

當結合所附圖式閱讀時，將更佳理解本發明的具體實施方式的下列詳細描述。為了說明本發明的目的，在圖式中顯示例示性實施方式。然而，應理解，本發明並不限於圖式中所示之實施方式的精確配置和手段。

圖1為說明開始O-聚醣生物合成醒目之核心多醣及相關醣基轉移酶（glycotransferase）的示意圖。圖2A及2B為一組曲線圖，說明藉由qPCR的MUC1及醣基化酶的基因表現分析，在4株乳癌細胞株（BT-20、MCF7、MDA-MB-231及MDA-MB-453）中量測基因表現，並與MCF10A（一種非致瘤性乳房上皮細胞細胞株）比較。圖3A及3B描繪藉由抗5E5抗體免疫組織化學評估Tn-MUC1在乳癌組織中之表現的一組影像，圖3A說明在乳癌組織中的3+染色而無周圍基質染色。圖3B說明在乳癌組織中的2+染色而無周圍基質染色。圖4為說明使用抗Tn-MUC1 CAR T細胞及四種乳癌細胞株之細胞毒性分析結果的一系列圖表。5E5-CAR、CD19-特異性CAR或NTD T細胞與乳癌細胞株在10:1之效應物對標靶之比例共培養，在添加T細胞後的100小時內，每15分鐘藉由即時阻抗測量細胞溶解。圖5A-5C為說明腹膜內及腫瘤內遞送5E5-CAR T細胞增強抗腫瘤功效的發現的一系列圖表及影像。圖6A及6B為說明在人類MUC1轉基因小鼠中腹膜內遞送鼠類HMFG1-CAR T細胞導致從鼠類5E5-CAR T細胞中並未觀察的脫靶毒性的發現之一系列圖表及影像。圖7A-7C為一系列圖表，說明相較於源自10位匹配病患正常乳房組織樣本的平均基因表現，MUC1、ST6GALNAC1、B3GNT6、C1GALT1及C1GALT1C1在50名源自病患之乳癌樣本中的基因表現。圖8為顯示各種所指之TnMUC1 CAR轉基因表現的一組流式細胞分析圖表。圖9顯示CFSE分析結果，證實各種所指之TnMUC1 CAR-T細胞會對MCF7細胞反應而增殖。圖10為一組三個圖表，由左至右顯示各種所指之TnMUC1 CAR-T細胞的IL-2、TNFa及IFNg分泌水平。圖11為顯示在靜脈內投予各種所指之TnMUC1 CAR-T細胞後的小鼠中隨著時間推移所測得之每秒光子的總通量之圖表。圖12A及12B為顯示在輸注後第42天經輸注之小鼠周邊血液中所測得之各種TnMUC1 CAR-T細胞水平的圖表。圖13為證實CART-TnMUC1、CART-TnMUC1-BBz及陰性對照細胞（CART-19和NTD）對Hs766T胰臟癌細胞株的細胞毒性的圖表。圖14A-14C為顯示藉由各種所指之細胞株的CART-TnMUC1細胞的靶向細胞殺滅之一系列圖表。圖15A及15B為顯示藉由CART-TnMUC1細胞對於各種所指之細胞株的Tn抗原的反應之靶向細胞殺滅之一系列圖表。圖16顯示繪製胰臟癌小鼠模型中腫瘤負擔的生物發光成像的一系列圖表。圖17A-17C為顯示CART-TnMUC1細胞對抗原表現標靶細胞反應的增殖的一系列圖表及影像。圖18為在所指之各種細胞株中製造細胞介素及趨化因子之一系列圖表。圖19為顯示由IFNγ ELISA實驗所獲得之數據的圖表。圖20為顯示於T細胞輸注後第21天及第42天，定量在小鼠周邊血液中所指之各種T細胞的一系列圖表。圖21為以抗TnMUC1抗體染色的Jurkat CBG/GFP CD19-P2A-Cosmc細胞（左）及MCF-7細胞（右）的顯微照片。圖22為顯示用於測試TnMUC1 CTA分析之可重複性的實驗裝置示意圖。圖23為pTRPE_5E5（H2L）_CD2z質體圖譜之示意圖。圖24為pGEM-SS1-CD2z質體圖譜之示意圖。圖25為pTRPE_5E5-BBz質體圖譜之示意圖。圖26為顯示pTRPE_5E5（H2L）載體骨架之示意圖。圖27為顯示了臨床試驗的第1期及第1a期部分的研究設計示意圖。圖28為顯示臨床試驗之整體病患途徑之示意圖。圖29為顯示臨床試驗之劑量遞增方案的示意圖。圖30為顯示臨床試驗之劑量遞增群組的示意圖。圖31為顯示以所指之CAR轉導的5種不同正常健康供體的T細胞總細胞數的一系列圖表。圖32為顯示以所指之CAR轉導的5種不同正常健康供體的T細胞群體倍增的一系列圖表。圖33為顯示以所指之CAR轉導的4種不同正常健康供體的T細胞之平均細胞體積的一系列圖表。圖34為顯示所指之CAR在5種不同的正常健康供體之T細胞中表現的一組流式細胞分析圖表。

Claims

一種經修飾之免疫細胞或其前驅細胞，其包含一特異性結合MUC1之嵌合抗原受體（CAR），其中該CAR包含：一MUC1-特異性抗原結合域，其包含一重鏈可變（VH）域及一輕鏈可變（VL）域，其中該VH域包含SEQ ID NO：22、23及24所述之重鏈互補性決定區（CDR）序列，且其中該VL域包含SEQ ID NO：19、20及21所述之輕鏈互補性決定區（CDR）序列：一跨膜域；一共刺激信號傳導域；及一細胞內信號傳導域。
如請求項1所述之經修飾之免疫細胞，其中該MUC1-特異性抗原結合域對MUC1之醣基表位具有特異性。
如請求項1或2所述之經修飾之免疫細胞，其中該MUC1-特異性抗原結合域對MUC1之截斷醣基表位具有特異性。
如前述任何請求項所述之經修飾之免疫細胞，其中該VH域包含SEQ ID NO：5所述之胺基酸序列。
如前述任何請求項所述之經修飾之免疫細胞，其中該VL域包含SEQ ID NO：6所述之胺基酸序列。
如前述任何請求項所述之經修飾之免疫細胞，其中該VH域包含SEQ ID NO：5所述之胺基酸序列，且該VL域包含SEQ ID NO：6所述之胺基酸序列。
如前述任何請求項所述之經修飾之免疫細胞，其中該MUC1-特異性抗原結合域包含SEQ ID NO：4所述之胺基酸序列。
如前述任何請求項所述之經修飾之免疫細胞，其中該跨膜域包含選自下列所組成群組之蛋白質的跨膜區：第1型跨膜蛋白質、T細胞受體之α鏈、T細胞受體之β鏈、T細胞受體之ζ鏈、CD28、CD2、CD3 ε、CD45、CD4、CD5、CD7、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134（OX-40）、CD137（4-1BB）、CD154（CD40L）、CD278（ICOS）、CD357（GITR）、類鐸受體1（TLR1）、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8及TLR9。
如前述任何請求項所述之經修飾之免疫細胞，其中該跨膜域包含CD8跨膜區。
如前述任何請求項所述之經修飾之免疫細胞，其中該跨膜域包含SEQ ID NO：7所述之胺基酸序列。
如前述任何請求項所述之經修飾之免疫細胞，其中該共刺激信號傳導域包含選自下列所組成群組之蛋白質的共刺激域：TNFR超家族成員、CD27、CD28、4-1BB（CD137）、OX40（CD134）、CD30、CD40、PD-1、ICOS、淋巴細胞功能相關抗原-1（LFA-1）、CD2、CD5、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、特異性結合CD83之配體、DAP10、DAP12、Lck、Fas及任何其等之衍生物或變體。
如前述任何請求項所述之經修飾之免疫細胞，其中該共刺激信號傳導域為CD2共刺激信號傳導域。
如前述任何請求項所述之經修飾之免疫細胞，其中該共刺激信號傳導域包含SEQ ID NO：28所述之胺基酸序列。
如前述任何請求項所述之經修飾之免疫細胞，其中該細胞內信號傳導域包含選自下列所組成群組之蛋白質的信號傳導域：CD3 ζ、FcyRIII、FcsRI、Fc受體之胞質尾、攜帶細胞質受體的免疫受體酪胺酸系活化基序（ITAM）、TCR ζ、FcR γ、FcR β、CD3 γ、CD3 δ、CD3 ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b及CD66d。
如前述任何請求項所述之經修飾之免疫細胞，其中該細胞內信號傳導域包含CD3 ζ之信號傳導域。
如前述任何請求項所述之經修飾之免疫細胞，其中該細胞內信號傳導域包含SEQ ID NO：30所述之胺基酸序列。
如前述任何請求項所述之經修飾之免疫細胞，其中該CAR進一步包含一前導子序列。
如請求項17所述之經修飾之免疫細胞，其中該前導子序列為CD8前導子序列。
如請求項17或18所述之經修飾之免疫細胞，其中該前導子序列包含SEQ ID NO：48所述之胺基酸序列。
如前述任何請求項所述之經修飾之免疫細胞，其中該CAR進一步包含一鉸鏈域。
如請求項20所述之經修飾之免疫細胞，其中該鉸鏈域來自選自下列所組成群組之蛋白質：抗體之Fc片段、抗體之鉸鏈區、抗體之CH2區、抗體之CH3區、人工間隔子序列、CD8之胺基酸鉸鏈序列及其等之任何組合。
如請求項20或21所述之經修飾之免疫細胞，其中該鉸鏈域為CD8鉸鏈域。
如請求項20至22中任一項所述之經修飾之免疫細胞，其中該鉸鏈域包含SEQ ID NO：13所述之胺基酸序列。
如前述任何請求項所述之經修飾之免疫細胞，其中該經修飾之細胞為經修飾之天然殺手（NK）細胞、經修飾之天然殺手T（NKT）細胞或經修飾之T細胞。
如前述任何請求項所述之經修飾之免疫細胞，其中該經修飾之免疫細胞為經修飾之T細胞。
如前述任何請求項所述之經修飾之免疫細胞，其中該經修飾之免疫細胞為自體的。
一種包含一嵌合抗原受體（CAR）的經修飾之T細胞，該嵌合抗原受體（CAR）特異性結合MUC1，其中該CAR包含：一MUC1-特異性抗原結合域，其包含一重鏈可變（VH）域及一輕鏈可變（VL）域，其中該VH域包含SEQ ID NO：22、23及24所述之重鏈互補性決定區（CDR）序列，且其中該VL域包含SEQ ID NO：19、20及21所述之輕鏈互補性決定區（CDR）序列；一鉸鏈域；一跨膜域；一CD2共刺激信號傳導域；及一細胞內信號傳導域。
一種包含一嵌合抗原受體（CAR）的經修飾之T細胞，該嵌合抗原受體（CAR）特異性結合MUC1，其中該CAR包含：一MUC1-特異性抗原結合域，其包含一重鏈可變（VH）域及一輕鏈可變（VL）域，其中該VH域包含SEQ ID NO：22、23及24所述之重鏈互補性決定區（CDR）序列，且其中該VL域包含SEQ ID NO：19、20及21所述之輕鏈互補性決定區（CDR）序列；一鉸鏈域；一膜域；一CD2共刺激信號傳導域，其包含SEQ ID NO：28所述之胺基酸序列；及一細胞內信號傳導域。
一種包含一嵌合抗原受體（CAR）的經修飾之T細胞，該嵌合抗原受體（CAR）特異性結合MUC1，其中該CAR包含：一MUC1-特異性抗原結合域，其包含一重鏈可變（VH）域及一輕鏈可變（VL）域，其中該VH域包含SEQ ID NO：22、23及24所述之重鏈互補性決定區（CDR）序列，且其中該VL域包含SEQ ID NO：19、20及21所述之輕鏈互補性決定區（CDR）序列；一CD8鉸鏈域；一CD8跨膜域；一CD2共刺激信號傳導域，其包含SEQ ID NO：28所述之胺基酸序列；及一CD3 ζ細胞內信號傳導域。
一種包含特異性結合MUC1之嵌合抗原受體（CAR）的經修飾之T細胞，該嵌合抗原受體（CAR）包含SEQ ID NO：2、39、41、43、45或47所述之胺基酸序列。
一種編碼一嵌合抗原受體的經分離之核酸序列，該嵌合抗原受體包含：一MUC1-特異性抗原結合域，其包含一重鏈可變（VH）域及一輕鏈可變（VL）域，其中該VH域包含SEQ ID NO：22、23及24所述之重鏈互補性決定區（CDR）序列，且其中該VL域包含SEQ ID NO：19、20及21所述之輕鏈互補性決定區（CDR）序列；一跨膜域；一共刺激信號傳導域；及一細胞內信號傳導域。
如請求項31所述之經分離之核酸序列，其中該MUC1-特異性抗原結合域對MUC1之醣基表位具有特異性。
如請求項31或32所述之經分離之核酸序列，其中該MUC1-特異性抗原結合域對MUC1之截斷醣基表位具有特異性。
如請求項31至33中任一項所述之經分離之核酸序列，其中該VH域包含SEQ ID NO：5所述之胺基酸序列。
如請求項31至34中任一項所述之經分離之核酸序列，其中該VL域包含SEQ ID NO：6所述之胺基酸序列。
如請求項31至35中任一項所述之經分離之核酸序列，其中該VH域包含SEQ ID NO：5所述之胺基酸序列，且該VL域包含SEQ ID NO：6所述之胺基酸序列。
如請求項31至36中任一項所述之經分離之核酸序列，其中藉由含SEQ ID NO：3所述之核苷酸序列的核酸序列編碼該MUC1-特異性抗原結合域。
如請求項31至37中任一項所述之經分離之核酸序列，其中該跨膜域包含選自下列所組成群組之蛋白質的跨膜區：第1型跨膜蛋白質、T細胞受體之α鏈、T細胞受體之β鏈、T細胞受體之ζ鏈、CD28、CD2、CD3 ε、CD45、CD4、CD5、CD7、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134（OX-40）、CD137（4-1BB）、CD154（CD40L）、CD278（ICOS）、CD357（GITR）、類鐸受體1（TLR1）、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8及TLR9。
如請求項31至38中任一項所述之經分離之核酸序列，其中該跨膜域包含一CD8跨膜區。
如請求項31至39中任一項所述之經分離之核酸序列，其中藉由含SEQ ID NO：8所述之核苷酸序列的核酸序列編碼該跨膜域。
如請求項31至40中任一項所述之經分離之核酸序列，其中該共刺激信號傳導域包含選自下列所組成群組之蛋白質的共刺激域：TNFR超家族成員、CD27、CD28、4-1BB（CD137）、OX40（CD134）、CD30、CD40、PD-1、ICOS、淋巴細胞功能相關抗原-1（LFA-1）、CD2、CD5、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、特異性結合CD83之配體、DAP10、DAP12、Lck、Fas及任何其等之衍生物或變體。
如請求項31至41中任一項所述之經分離之核酸序列，其中該共刺激信號傳導域為一CD2共刺激信號傳導域。
如請求項31至42中任一項所述之經分離之核酸序列，其中藉由含SEQ ID NO：29所述之核苷酸序列的核酸序列編碼該共刺激信號傳導域。
如請求項31至43中任一項所述之經分離之核酸序列，其中該細胞內信號傳導域包含一CD3 ζ之信號傳導域。
如請求項31至44中任一項所述之經分離之核酸序列，其中藉由含SEQ ID NO：31所述之核苷酸序列的核酸序列編碼該細胞內信號傳導域。
如請求項31至45中任一項所述之經分離之核酸序列，其中該CAR進一步包含一CD8前導子序列。
如請求項46所述之經分離之核酸序列，其中該前導子序列包含SEQ ID NO：48所述之胺基酸序列。
如請求項31至47中任一項所述之經分離之核酸序列，其中該CAR進一步包含一CD8鉸鏈域。
如請求項48所述之經分離之核酸序列，其中藉由含SEQ ID NO：14所述之核苷酸序列的核酸序列編碼該鉸鏈域。
一種編碼嵌合抗原受體之經分離之核酸序列，該嵌合抗原受體包含：一MUC1-特異性抗原結合域，其包含一重鏈可變（VH）域及一輕鏈可變（VL）域，其中該VH域包含SEQ ID NO：22、23及24所述之重鏈互補性決定區（CDR）序列，且其中該VL域包含SEQ ID NO：19、20及21所述之輕鏈互補性決定區（CDR）序列；一鉸鏈域；一跨膜域；一CD2共刺激信號傳導域；及一細胞內信號傳導域。
一種編碼嵌合抗原受體之經分離之核酸序列，該嵌合抗原受體包含：一MUC1-特異性抗原結合域，其包含一重鏈可變（VH）域及一輕鏈可變（VL）域，其中該VH域包含SEQ ID NO：22、23及24所述之重鏈互補性決定區（CDR）序列，且其中該VL域包含SEQ ID NO：19、20及21所述之輕鏈互補性決定區（CDR）序列；一鉸鏈域；一跨膜域；一CD2共刺激信號傳導域，其包含含SEQ ID NO：29所述之核苷酸序列的核酸序列；及一細胞內信號傳導域。
一種編碼嵌合抗原受體之經分離之核酸序列，該嵌合抗原受體包含：一MUC1-特異性抗原結合域，其包含一重鏈可變（VH）域及一輕鏈可變（VL）域，其中該VH域包含SEQ ID NO：22、23及24所述之重鏈互補性決定區（CDR）序列，且其中該VL域包含SEQ ID NO：19、20及21所述之輕鏈互補性決定區（CDR）序列；一CD8鉸鏈域；一CD8跨膜域；一CD2共刺激信號傳導域，其包含SEQ ID NO：29所述之核苷酸序列的核酸序列；及一CD3 ζ細胞內信號傳導域。
一種編碼嵌合抗原受體之經分離之核酸序列，其包含含SEQ ID NO：1、38、40、42、44或46所述之核苷酸序列的核酸序列。
一種編碼ICOS共刺激信號傳導域之經分離之核酸序列，其包含含SEQ ID NO：27所述之核苷酸序列的核酸序列。
一種特異性結合MUC1之嵌合抗原受體（CAR），其藉由請求項31-53中任一項所述之核酸所編碼。
一種特異性結合MUC1之嵌合抗原受體（CAR），其包含：一MUC1-特異性抗原結合域，其包含一重鏈可變（VH）域及一輕鏈可變（VL）域，其中該VH域包含SEQ ID NO：22、23及24所述之重鏈互補性決定區（CDR）序列，且其中該VL域包含SEQ ID NO：19、20及21所述之輕鏈互補性決定區（CDR）序列；一鉸鏈域；一跨膜域；一共刺激信號傳導域；及一細胞內信號傳導域。
一種特異性結合MUC1之嵌合抗原受體（CAR），其包含：一MUC1-特異性抗原結合域，其包含一重鏈可變（VH）域及一輕鏈可變（VL）域，其中該VH域包含SEQ ID NO：22、23及24所述之重鏈互補性決定區（CDR）序列，且其中該VL域包含the SEQ ID NO：19、20及21所述之輕鏈互補性決定區（CDR）序列；一鉸鏈域；一跨膜域；一CD2共刺激信號傳導域，其包含SEQ ID NO：28所述之胺基酸序列；及一細胞內信號傳導域。
一種特異性結合MUC1之嵌合抗原受體（CAR），其包含：一含重鏈可變（VH）域及輕鏈可變（VL）域之MUC1-特異性抗原結合域，其中該VH域包含SEQ ID NO：22、23及24所述之重鏈互補性決定區（CDR）序列，且其中該VL域包含SEQ ID NO：19、20及21所述之輕鏈互補性決定區（CDR）序列；一CD8鉸鏈域；一CD8跨膜域；一CD2共刺激信號傳導域，其包含SEQ ID NO：28所述之胺基酸序列；及一CD3 ζ細胞內信號傳導域。
一種特異性結合MUC1之嵌合抗原受體（CAR），其包含SEQ ID NO：2、39、41、43、45或47所述之胺基酸序列。
一種表現構建體，其包含請求項31-53中任一項所述之經分離之核酸。
如請求項60所述之表現構建體，其中該表現構建體進一步包含一EF-1α啟動子。
如請求項60或61所述之表現構建體，其中該表現構建體進一步包含一rev反應元件（RRE）。
如請求項60-62中任一項所述之表現構建體，其中該表現構建體進一步包含一土撥鼠肝炎病毒轉錄後調節元件（WPRE）。
如請求項60-63中任一項所述之表現構建體，其中該表現構建體進一步包含一cPPT序列。
如請求項60-64中任一項所述之表現構建體，其中該表現構建體進一步包含一EF-1α啟動子、一rev反應元件（RRE）、一土撥鼠肝炎病毒轉錄後調節元件（WPRE）及一cPPT序列。
如請求項60-65中任一項所述之表現構建體，其中該表現構建體為選自反轉錄病毒載體、慢病毒載體、腺病毒載體及腺相關病毒載體所組成群組之病毒載體。
如請求項60-66中任一項所述之表現構建體，其中該表現構建體為慢病毒載體。
如請求項60-67中任一項所述之表現構建體，其中該表現構建體為自我滅活慢病毒載體。
一種生成如請求項1-30中任一項所述之經修飾之免疫細胞或其前驅細胞的方法，其包含將請求項31-53中任一項所述之經分離之核酸或請求項60-67中任一項所述之表現構建體導入免疫細胞或其前驅細胞中。
一種在所需受試者中治療MUC1相關癌症的方法，其包含投予受試者治療有效之組成物，該組成物包含請求項1-30中任一項所述之經修飾之免疫細胞。
如請求項70所述的方法，其中該MUC1相關癌症係選自多發性骨髓瘤、非小細胞肺癌、乳癌、胰腺癌及卵巢及輸卵管癌所組成之群組。
如請求項71所述的方法，其中該MUC1相關癌症為乳癌。
如請求項72所述的方法，其中該乳癌之特徵為MUC1異常醣基化。
如請求項71或72所述的方法，其中該乳癌係選自激素受體陽性乳癌、激素受體陰性乳癌、雌激素受體陰性乳癌、助孕酮受體陰性乳癌及Her2受體陰性乳癌所組成之群組。
如請求項71-74中任一項所述之方法，其中該乳癌為轉移性乳癌。
如請求項71-75中任一項所述之方法，其中該乳癌為三陰性乳癌。
一種在所需受試者中治療MUC1相關癌症的方法，其包含：投予該受試者治療有效之含經修飾之T細胞的組成物，該經修飾之T細胞包含：一MUC1-特異性抗原結合域，其包含一重鏈可變（VH）域及一輕鏈可變（VL）域，其中該VH域包含SEQ ID NO：22、23及24所述之重鏈互補性決定區（CDR）序列，且其中該VL域包含SEQ ID NO：19、20及21所述之輕鏈互補性決定區（CDR）序列；一可選擇地鉸鏈域；一跨膜域；一共刺激信號傳導域；及一細胞內信號傳導域。
一種在所需受試者中治療MUC1相關多發性骨髓瘤的方法，其包含：投予該受試者治療有效之含經修飾之T細胞的組成物，該經修飾之T細胞包含：一MUC1-特異性抗原結合域，其包含一重鏈可變（VH）域及一輕鏈可變（VL）域，其中該VH域包含SEQ ID NO：22、23及24所述之重鏈互補性決定區（CDR）序列，且其中該VL域包含SEQ ID NO：19、20及21所述之輕鏈互補性決定區（CDR）序列；可選擇地一鉸鏈域；一跨膜域；一共刺激信號傳導域；及一細胞內信號傳導域。
一種在所需受試者中治療MUC1相關非小細胞肺癌的方法，其包含：投予該受試者治療有效之含經修飾之T細胞的組成物，該經修飾之T細胞包含：一MUC1-特異性抗原結合域，其包含一重鏈可變（VH）域及一輕鏈可變（VL）域，其中該VH域包含SEQ ID NO：22、23及24所述之重鏈互補性決定區（CDR）序列，且其中該VL域包含SEQ ID NO：19、20及21所述之輕鏈互補性決定區（CDR）序列；可選擇地一鉸鏈域；一跨膜域；一共刺激信號傳導域；及一細胞內信號傳導域。
一種在所需受試者中治療MUC1相關三陰性乳癌的方法，其包含：投予該受試者治療有效之含經修飾之T細胞的組成物，該經修飾之T細胞包含：一MUC1-特異性抗原結合域，其包含一重鏈可變（VH）域及一輕鏈可變（VL）域，其中該VH域包含SEQ ID NO：22、23及24所述之重鏈互補性決定區（CDR）序列，且其中該VL域包含SEQ ID NO：19、20及21所述之輕鏈互補性決定區（CDR）序列；可選擇地一鉸鏈域；一跨膜域；一共刺激信號傳導域；及一細胞內信號傳導域。
一種在所需受試者中治療MUC1相關胰腺癌的方法，其包含：投予該受試者治療有效之含經修飾之T細胞的組成物，該經修飾之T細胞包含：一MUC1-特異性抗原結合域，其包含一重鏈可變（VH）域及一輕鏈可變（VL）域，其中該VH域包含SEQ ID NO：22、23及24所述之重鏈互補性決定區（CDR）序列，且其中該VL域包含SEQ ID NO：19、20及21所述之輕鏈互補性決定區（CDR）序列；可選擇地一鉸鏈域；一跨膜域；一共刺激信號傳導域；及一細胞內信號傳導域。
一種在所需受試者中治療MUC1相關卵巢及輸卵管癌的方法，其包含：投予該受試者治療有效之含經修飾之T細胞的組成物，該經修飾之T細胞包含：一MUC1-特異性抗原結合域，其包含一重鏈可變（VH）域及一輕鏈可變（VL）域，其中該VH域包含SEQ ID NO：22、23及24所述之重鏈互補性決定區（CDR）序列，且其中該VL域包含SEQ ID NO：19、20及21所述之輕鏈互補性決定區（CDR）序列；可選擇地一鉸鏈域；一跨膜域；一共刺激信號傳導域；及一細胞內信號傳導域。
如請求項70-82中任一項所述之方法，其進一步包含投予該受試者一淋巴細胞清除性化療。
如請求項83所述之方法，其中該淋巴細胞清除性化療包含投予該受試者治療有效量之環磷醯胺(cyclophosphamide)。
如請求項83或84所述之方法，其中該淋巴細胞清除性化療包含投予受試者治療有效量之氟達拉濱(fludarabine)。
如請求項83-85中任一項所述之方法，其中該淋巴細胞清除性化療包含投予受試者治療有效量之環磷醯胺及治療有效量之氟達拉濱。
如請求項70-86中任一項所述之方法，其進一步包含投予該受試者一細胞激素釋放症候群（CRS）管理方案。
如請求項87所述之方法，其中該CRS管理方案包含治療有效量之托珠單抗(tocilizumab)。
如請求項87或88中任一項所述之方法，其中該CRS 管理方案包含治療有效量之托珠單抗及/或皮質類固醇。
如請求項70-89中任一項所述之方法，其中該經修飾之免疫細胞或經修飾之T細胞為自體的。
如請求項70-90中任一項所述之方法，其中藉由腫瘤內遞送進行投予經修飾之免疫細胞或經修飾之T細胞係。
如請求項70-90中任一項所述之方法，其中藉由靜脈內遞送進行投予經修飾之免疫細胞或經修飾之T細胞。
如請求項70-90中任一項所述之方法，其中藉由腹膜內遞送進行投予經修飾之免疫細胞或經修飾之T細胞。