KR20170135824A - 출아형 원형질 세포의 수지상 세포 신생물 또는 재발된/난치성 급성 골수성 림프종의 치료를 위한 cd123에 결합하는 키메라 항원 수용체들을 지닌 것으로 여겨지는, t 세포 수용체 넉 아웃 조작된 면역 세포들 - Google Patents

출아형 원형질 세포의 수지상 세포 신생물 또는 재발된/난치성 급성 골수성 림프종의 치료를 위한 cd123에 결합하는 키메라 항원 수용체들을 지닌 것으로 여겨지는, t 세포 수용체 넉 아웃 조작된 면역 세포들 Download PDF

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KR20170135824A
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바브라 존슨 사수
아르빈드 라팔
필리페 두차토
알렉산드레 줄리어릿
줄리안 발통
로망 갈레토
마타유 시몬
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셀렉티스
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Abstract

본 발명은 더욱 특히 거기에서 세포외 리간드 결합이, CD123 양성 세포들에 대항한 특이적 면역을 부여하는, CD123 단일클론 항체로부터 유래된 scFV이고, CD123-발현시키는 세포들를 향한 반응성 및 면역 세포 특이성을 방향전환시킬 수 있는 재조합 키메라 단백질인 CD123 에 특이적인 키메라 항원 수용체들 (CAR)을 발현시키는 TCR KO - 또는 TCR KO and dCK KO - 조작된 면역 세포들에 대한 것이다. 이러한 CD123 CAR들을 지닌 것으로 여겨지는 조작된 면역 세포들은 재발된 난치성 AML 및 출아형 원형질 세포의 수지상 세포 신생물을 치료하는데, 그리고 골수 이식 전 치료로서 이용하는데 특히 적합하다.

Description

출아형 원형질 세포의 수지상 세포 신생물 또는 재발된/난치성 급성 골수성 림프종의 치료를 위한 CD123에 결합하는 키메라 항원 수용체들을 지닌 것으로 여겨지는, T 세포 수용체 넉 아웃 조작된 면역 세포들
본 발명은 일반적으로, 인터루킨(interleukin) 3 수용체(receptor) 알파(alpha) 체인(chain) (IL-3Ra, 분화(differentiation) 123 CD123의 클러스터(cluster))에 특이적인 키메라(Chimeric) 항원(Antigen) 수용체(Receptor) (CAR)를 발현시키도록 조작된 TCR 유전자 넉아웃(Knock out) T 세포, 및 예컨대, L-3Ra, CD123의 발현과 관련된 질환 또는 질병, 즉, 급성(acute) 골수성(myeloid) 백혈병(leukemia) (AML) 및 출아형(Blastic) 원형질 세포의(plasmacytoid) 수지상(dendritic) 세포(cell) 신생물(neoplasm) (BPDCN),의 치료를 위한 , 그것들의 용도에 대한 것이다.
본 발명은 하기를 발현시키기 위하여 조작된 T 세포 수용체 (TCR알파(alpha) 또는 베타 유전자) 및/또는 인간 디옥시사이티딘(deoxycytidine) 키나제(kinase) (dCK 유전자 또는 dck 유전자) 넉아웃(Knock out) (KO) 면역 T 세포들에 대한 것이다:
- 선택적으로 인간화된, Klon43로부터의 힌지(hinge), 세포내 도메인 및 공자극(costimulatory) 도메인을 포함함는 분화(differentiation) 123 (CD123)의 클러스터(cluster)에 특이적인 키메라 항원 수용체 (CAR)
- 선택적으로 상기 힌지 내에 삽입된 자살 도메인,
인간 CD123에 특이적이고 CD123 양성 세포들에 대항하여 특이적 면역력을 부여하는 상기 CD123 CAR,
한 예에서; 급성 골수성 백혈병 AML, 또는 AML의 합병증의 치료를 위하여 사용되는 이 목적이 제공된다,
한 예에서; 이 목적은 출아형 원형질 세포의 수지상 세포 신생물 (BPDCN)의 치료를 위하여 제공된다.
한 예에서; 이 목적은 이식의 브릿지(bridge)로서 골수 이식 전 치료로서 제공된다.
본 발명에 따른 CD123 CAR들을 지닌 것으로 여겨지는 조작된 면역 세포들은 이전의 CD123 CAR에 비교하여 림프종들 및 백혈병들을 치료하는 측면에서 높은 효율을 보이며, 환자들에게서 전의 치료보다 더 적은 부작용들을 갖는 퓨린 유사체(analogue)의 존재 하 사용될 수 있다.
백혈병과 같은, 특히 급성 골수성 백혈병 (AML)을 위한 림프구증식성(lymphoproliferative) 질병들의 유도 치료들이 거의 50 년 동안 크게 변하지 않고 남아 왔다. 이러한 표준 유도 화학요법은 완전한 차도들을 유도할 수 있으나, 많은 환자들은 결국 재발하고, 질병으로 쓰러져, AML, 특히 재발된 난치성 AML에 대한 에 대한 신규 치료법의 개발이 필요하다.
유사한 관찰들이 BPDCN과 같은 공격적인 림프구증식성 질병들에 대하여 보고되어 왔다. 이들 질병들은 좋지 않은 예후로 남아 있다. 이들 암 세포들의 면역표현형들은 인터루킨 3 수용체 알파 체인 (IL-3Rα; CD123 - NCBI reference: NP_001254642)이 잠재적 면역치료 타겟이란 것을 보여 왔는데, 이는 정상 세포들에 비하여 이들 종양 세포들 상에서 그것이 과발현되기 때문이다. 추가적으로 CD123-특이적 치료법을 위한 이(two) 상(phase) I 시험들(trials)이 좋은 안전성 프로파일들을 보이는 약물들 둘 다에서 완료되었다 (ClinicalTrials.gov ID: NCT00401739 및 NCT00397579). 불행히도, 이들 CD123을 타겟팅하는 약물들은 제한된 약효를 갖고, 그리고 항-백혈병 활성을 관찰하기 위하여 CD123을 타겟팅하는 대체의, 그리고 더 강하고 특이적인 치료들이 요구된다.
아마 백혈병 치료를 위한 더 강한 대체 요법은 MHC-독립적 방식으로 세포 표면 종양 관련(associated) 항원들 (TAA들)을 향하여 면역 세포 특이성을 선택적으로 향하게 하고 그것들을 파괴하는 키메라 항원 수용체들 (CAR들)을 발현시키는 면역 세포들의 사용일 수 있다.
CAR들은 단일 또는 복수의 융합 분자(들)에서 하나 이상의 신호전달(signaling) 도메인들과 관련된 타겟팅 모이어티로 구성되는 합성 수용체들이다. 일반적으로, CAR의 결합 모이어티(moiety)는 가요성(flexible) 링커에 의하여 연결된 가벼운 그리고 가변 단편들을 포함하는 단일(single)-체인(chain) 항체(antibody) (scFv)의 항원-결합 도메인으로 구성된다. 수용체 또는 리간드 도메인들에 기초한 결합 모이어티들 또한 성공적으로 사용되어 왔다. 일 세대 CAR들을 위한 신호전달(signaling) 도메인들은 CD3제타(zeta) 또는 Fc 수용체 감마 체인들의 세포지리 영역으로부터 유래된다. 일 세대 CAR들은 T 세포 세포독성으로 성공적으로 방향전환(redirec)하는 것으로 보여져 왔으나, 그것들은 체내에서 항-종양 활성 및 연장된 확장을 제공하는데 실패하였다. OX-40 (CD134), and 4-1BB (CD137)을 포함하는 공(co)-자극(stimulatory) 분자들로부터의 신호전달(signaling) 도메인들은 시험관에서(in vitro) CAR 변형된 T 세포들의 증식을 증가시키고 생존을 증강시키기 위하여 단독 또는 조합으로 첨가되어 왔다. 그러나, 도메인들의 모든 조합이 체내에서 세포들을 타겟으로 하도록 면역 세포들을 향하게 할 수 있는 CAR를 야기하지는 않았다.
인간 암의 마우스 모델들에서 CAR들은 각 도메인의 길이 및 특성에 의존적인 효율을 갖고 종양 세포들의 표면에서 발현되는 항원들에 대항하는 CAR-발현시키는 세포들을 방향전환시킬 수 있다 (Condomine M.et al., 2015 Plos One 10(6):e0130518). 지금까지 CAR-발현시키는 특이적 T 세포들, 단독의 자가(autologous) 이동은 사이토카인 발작(storm), 세포 군집들의 비특이적 파괴 또는 원하지 않은 특이적 면역 반응들과 같은 몇몇 부작용에도 불구하고 암의 특이적 형태들을 치료하는데 성공적으로 보여져 왔다 (Park, Rosenberg et al. 2011). 동종이계(allogenic) CD123 CAR engineered T 세포들이 AML의 치료에 안전하고 효율적으로 이용될 수 있을지 여부는 알려지지 않았다 (ClinicalTrials.gov ID:NCT02159495).
이런 식으로, 소위 CAR를 발현시키는 동종이계(allogenic) T 세포들 치료들의 이익을 볼 수 있는 환자들의 군은 암으로 고통받는 인간에서 그것들의 사용을 위하여 제조되어 왔다. 그 경우, 면역 세포들은 기증자들로부터 분리되고, 조작되고, 그 다음에 그것을 필요로 하는 몇몇 선택된 환자들에게서 치료로서 사용되었다.
그 목적을 위하여 그리고 이식편대 숙주 질병의 위함을 감소시키기 위하여 선택된 유전자들이 면역 반응에 수반되는 분자들의 감소된 발현을 갖는 조작된 CAR-발현시키는 면역 세포들, 예컨대 MHC 분자들의 그것 또는 TCR 분자들의 서브유닛들,을 제공하기 위하여 주의깊게 넉아웃되었다. 이러한 조작된 세포들이 임의의 숙주들에서 여전히 증식하고 생존할 때까지, 특히, 화학치료 제제들로 이미 치료된 환자들에게서, 대체로 알지 못한 채로 남아 있다.
항-암 치료들에 보통 이용되는 치료로서 세포독성 화학요법 제제들과 조합하여 CD123을 타겟으로 하는 이러한 CAR를 발현시키는 면역 T 세포의 사용이 항-암 치료들로서 문제로 남아 있고 T 세포들의 증식 및/또는 생존에 또한 영향을 미친다.
이와 같이, 증식할 수 있고, 그것들의 타겟 (암 세포들)에 도달할 때까지 생존할 수 있을, 세포 증식에 영향을 미치는 것들과 같은, 특히 항-암 화학요법들의 약물들의 사용과 양립 가능하고 특이적으로 효과적인, CD123을 타겟팅하는 T 세포들을 개발할 필요가 또한 있다.
화학요법과 함께 "기성품인(off-the-shelf)" 동종이계 치료적 세포들을 사용하기 위하여, 본 발명자들은 암으로 고통받고 그리고/또는 이미 화학요법 제제들로 치료된 환자들의 면역 시스템에 관대하고, 덜 동종이계(allogenic)인 동종이계(allogenic) 조작하는 T-세포를 제공하기 위한 수단들을 확인하였다. 치료적 이점들은 청구된 목적들의 화학요법 및 면역요법 사이의 시너지 효과들에 의하여 제공된다.
본 발명은 또한 세포 분류 및 세포 소모(depletion) 둘다를 가능하게 하는 식으로 세포외 결합 도메인 (scFv)이 변형된 항-CD123 키메라 항원 수용체들 (항-CD123 CAR)에 대한 것이다. 이것을 가능하게 하는 구조체는 단일클론 항체에 의하여 인식되는 에피토프 (특이적 단일클론 항체 또는 유사체(mimotope))에 의하여 인식되는 에피토프 또는 유명한 mAb-주도의(driven) 분류/소모 시스템)이고 scFv 및/또는 힌지 내 세포외 도메인 내로 삽입된 선택된 에피토프를 포함한다. 이 에피토프는 특이적 항체 (바람직하게는, 선택적으로 인간화된, 단일클론 항체 (mAb))에 의하여 인식되는 특이성을 갖는다. 주로 CAR의 외부의 리간드 결합 도메인이 에피토프를 포함하도록 변형되는 것을 고려할 때, 다른 CAR 아키텍쳐들 (아키텍쳐들은 상상될 수 있다: PCTUS2013/058005 에 개시된 대로의 단일-체인 또는 복수-체인.
VH 및 VL 폴리펩타이드들로 이루어진, 본 발명의 키메라 scFv 및 특이적 에피토프(들)은 그것 자체가 에피토프의 삽입의 위치에 의존하는 다른 구조체들 및 링커들의 사용을 갖는다 (도 3). 본 발명은 또한 변형된 CAR들을 지닌 것으로 여겨지는 조작된 면역 세포들을 분류 및/또는 소모하는 그 결과인 방법에 대한 것이다.
몇몇 에피토프-mAb 커플들은 이러한 시스템을 만드는데 사용될 수 있다; 특히 제한되지 않는 예로서, CD20/리툭시맙과 같은, 의학적 용도로 이미 승인된 것들.
결국, 본 발명은 항-CD123 CAR들을 지닌 것으로 여겨지는 조작된 면역 세포들의 수, 활성 및 생존이 상기 CAR들의 외부의 리간드 결합 도메인을 향하는 항체를 이용함으로써 세포들을 소모시킴으로써 조절되는 치료적 방법들을 포함한다.
도 1: 본 발명에 따른 조작된 면역 세포의 개략적인 대표도. 이 도면에 제시된 조작된 면역 세포는 CAR를 코드하는 레트로바이러스 폴리펩타이드로 형질도입된 T-세포이다. 이 T-세포는 환자 내로 더 좋고 더 안전한 이식을 가능하게 하도록 더 조작되며, 이는 본 발명의 범위 내의 부분이다. X 유전자는 TCR의 요소를 발현시키는 유전자이고 (TCRalpha 또는 TCRbeta 유전자), Y는 퓨린 유사체들에 대한 T-세포들의 민감성을 수반하는 유전자, dCK이다.
도 2: CD123 scfv, 선택적으로 인간화된, FcRIII 또는 CD8알파로부터의 힌지, CD8알파로부터의 막관통 도메인, 및 4-1BB로부터의 세포내 도메인들 및 CD3제타를 포함하는 본 발명의 두 개의 CAR (123 CAR) 의 개략적인 대표도.
도 3: 본 발명에 따른 CAR의 예들을 보여준다.
L: (GGGGS)n이고 n=1 내지 4이고, 바람직하게는 n=3 (서열번호 : 10)인, VH 및 VL 사이의 링커.
Li: GGGS 또는 SGGGGS 또는 GSGGGGS에 대응되는 링커 서열, TM: 막관통 도메인.
Klon 43로부터의 VH, 선택적으로 인간화된, 링커 L, Klon 43로부터의 VL, 선택적으로 인간화된, 자살 도메인 (예컨대 서열 CPYSNPSLCS (서열번호 161)의 CD20 유사체(mimotope)의 두 개의 카피들, 및 서열번호 169의 카피)를 포함하는 본 발명의 CD123 CAR가 제조되었고, 상기 유사체들(mimotopes)은 바람직하게는 scfv, CD8 힌지 또는 그 부분, CD8알파로부터의 막관통 도메인 (CD8 TM) 공-자극 도메인 (4-1BB) 및 자극성 도메인 (ITAM CD3 zeta)에 위치된다.
본 발명의 CD123 CAR에서, 서로에게 그리고 링커 Li에 의하여 VL에 연결된, 서열 CPYSNPSLCS의 CD20 유사체(mimotope)의 두 개의 카피들이 항-CD123 scFv 및 CD8알파로부터의 힌지 사이에 삽입되었고, 선택적 링커 LI가 힌지 에 유사체들(mimotopes)을 결합(join) 시킨다 (서열번호 160).
에피토프 (eg in scfv) 삽입의 다른 가능성들이 고려되고 도 3에 원으로 표시된다.
도 4: CAR+ T-세포들이 CD123을 발현시키는 세포들 (RPMI8226)과, 또는 CD123을 발현시키지 않는 세포들 (K562)과 6 시간 동안 공-배양되었을 때, 하나의 아키텍쳐 (v3: CD8-hinge/CD8-transmembrane)를 위한 본 발명에 따른 다른 scFv의 탈과립 활성.
도 5: CD123을 다른 수준들로 발현시키는 세포들 (KG1a 또는 RPMI8226), 또는 CD123을 발현시키지 않는 세포들 (K562)과 24 시간 동안 공-배양될 때 T-세포들에 의한 IFN 감마.
도 6: PNA (20 mg/kg) ip로 처리된 마우스들에서 생체내 CAR-T 세포들의 특이적 세포용해 활성의 투여량-반응
도 7: PNA (20 mg/kg) ip로 처리된 마우스들에서 생체내 CAR-T 세포들의 특이적 세포용해 활성의 투여량-반응
<표 1>
Figure pct00001

<표 2>
Figure pct00002

표 2: 본 발명의 CD123 CAR를 위한 본 발명의 항-CD123 scfv에서 사용되는 Klon 43으로부터의 항체 단편들의 서열
<표 3>
Figure pct00003

Figure pct00004

표 3: 본 발명의 CD123 CAR를 위한 본 발명의 항-CD123 scfv에서 사용되는 Klon 43으로부터의 인간화된 항체 단편들의 서열
<표 4>
Figure pct00005

표 4: 구조체 V-1의 CAR
<표 5>
Figure pct00006

표 5: 구조체 V-3의 CAR
<표 6>
Figure pct00007

표 6: 구조체 V-5의 CAR
<표 7>
Figure pct00008

표 7: 예컨대 그것들의 대응되는 mAb과 에피토프 및 유사체들(mimotopes)과 같은 본 발명의 CAR의 세포외 도메인에서 사용될 수 있는 (그것들의 대응하는 mAb들과) 유사체(mimotope)로도 불리는 mAb-특이적 에피토프들의 예. 본 발명의 항-CD123 CAR의 서열들 (서열번호 :31-160), 바람직한 서열들은 서열번호 :31, 32, 160 및 34-117이고, 34-117 중 더욱 바람직한 것은 76 내지 117이고, 더욱 더 바람직한 것은 서열번호 32, 서열번호 89, 서열번호 94, 서열번호 95, 서열번호 96, 서열번호 97이다.
발명의 개요
인터루킨 3 수용체 알파 체인 (CD123)는 특히 급성 골수성 백혈병 (AML)의 경우에, 동일한 계통의 정상 세포들에 비하여, 백혈병 종양 세포들 상에서 자주 과발현되는 것으로 확인되어 왔다.
본 발명자들은 KLON43 항체로부터의 scFV, FcγRIIIα로부터의 힌지, 및 숙주 세포들에 체내에서 증식할 수 있고, CD123 타겟 세포들에 도달하고, 그리고 그것들의 생존을 바꿀 수 있는 능력을 부여하는 세포내 도메인들을 포함하는 CD123 특이적 CAR를 발현시키도록 조작된 면역 세포를 만들어 왔고, 상기 세포는 일단 타겟 세포들이 포함되면, 그것들의 특이적 파괴를 가능하게 하는 추가적인 마커 또는 자살 도메인을 포함한다. 이들 CD123 특이적 CAR는 무차별적으로, 설계된 CD123 특이적 CAR 또는 항-CD123 CAR, 또는 123 CAR, 또는 "본 발명의 CAR"이다.
본 발명에서, 특이적이고 선택적인 면역허용(tolerogenic) TCR KO CD123 CAR를 발현시키는 T 세포는 이 IL-3 수용체 서브유닛에 특이적인 하나의 항체, 즉, AML, B-세포 림프구증식성 장애(disorder) (BC-LPD) 또는 BPDCN로 고통받는 환자들의 치료를 위한 이 klon43 항체로부터 유래된 klon43 또는 인간화된 서열들,을 이용하여 제조되었다.
부수적으로, 이들 세포들은 치성/재발된 암의 발생 및 진행을 멈추는 전암(precancerous) 세포들의 파괴를 가능하게 한다. 체내에서 증식하고 조직들 또는 틈새들에 도달하는 그것들의 능력 때문에, 이들 세포들은 암 세포들 그것들 자신들보다 더 빠르게 작용하고, 공격성 림프구증식성 장애를 뿌리뽑을 수 있다.
(예컨대 항 CD3/CD28 코팅된 비드들 및 재조합 IL2로) 시험관에서 비-특이적 활성화 후, 기증자들로부터의 T-세포들은 바이러스 형질도입(transduction)을 이용하여 본 발명의 CAR들을 발현시키는 폴리뉴클레오타이드들로 형질전환(transform)되어 왔다. T-세포들은 더욱 특이적으로 이식편숙주(Graft versus host) 반응을 감소시키기 위하여 T 세포 수용체 TCR (αβ - T-세포 수용체들)의 요소의 파괴에 의하여, 덜-동종반응성(alloreactive) T-세포들을 만들기 위하여 더 조작되었다.
바람직한 예에서, T-세포들은 항-암 약물들에 내성인 면역허용원(tolerogene) T 세포들을 만들기 위하여, 상기 전통적인 항-암 약물들, 즉 퓨린 유사체들(analogs)과 조합하여 사용되기 위하여, 표 9에서 확인된 유전자들의 특이적 조합(들)을 결실시킴으로써 더 조작되었다.
그 결과인 조작된 T-세포들은 CD123 양성 세포들에 대항한 반응성을 보여주었는데, 이는 본 발명의 CAR들이 또한 T-세포들의 증식 및 항원 의존적 활성화에 공헌하여, 그것들을 면역요법에 유용하게 만든다는 것을 보여준다.
그 결과인 조작된 T-세포들은 CD123 양성 세포들에 대항하여 체내에서 반응성을 보였고, 체내에서 암 세포들의 수를 상당히 감소시킨다.
특정 예에서, 본 발명의 조작된 T-세포들의 몇몇 투여들은 첫 치료 (유도)로서, 강화(consolidation) 치료로서, 전통적인 항암 화학요법과 조합인 치료로서, 수행되어, 그것들을 면역요법에 유용하게 만들 수 있다.
본 발명의 CAR들을 코드하는 폴리뉴클레오타이드 및 폴리펩타이드들 서열들은 본 명세서에 기재된다.
본 발명의 조작된 면역 세포들은 B-세포 림프종 또는 백혈병과 같은 치료적 적용들에 특히 유용하며, 생물로부터 선택적으로 제거될 수 있다. R
본 발명의 상세한 기재
본 발명은 하기를 제공한다:
1. ■ 연속적으로, a VH 선택적으로 인간화된 링커, 바람직하게는 서열 (GGGGS)n으로 n = 1 -4이고, 바람직하게는 n=3인 링커, 및 VL 선택적으로 인간화된 힌지를 포함하는 세포외 리간드 결합-도메인을 포함하는 세포외 도메인,
■ 막관통 도메인 및
■ 세포질 도메인.
■ 단일클론 항체 (유사체(mimotope))에 특이적인 적어도 하나의 에피토프
를 포함하는 A CD123 특이적 키메라 항원 수용체 (CD123 CAR).
2. 제 1에 있어서,
■ 연속적으로, 서열번호 12, 서열번호 24, 서열번호 25, 서열번호 26, 서열번호 27, 서열번호 28, 서열번호 29 and 서열번호 30로부터 선택된 VH, 선택적으로 인간화된 링커, 바람직하게는 서열 (GGGGS)n으로 n = 1 -4이고, 바람직하게는 n=3인, 링커, 및 서열번호 11, 서열번호 18, 서열번호 19, 서열번호 20, 서열번호 21, 서열번호 22 및 서열번호 23으로부터 선택된 VL, 선택적으로 인간화된 힌지를 포함하는 세포외 리간드 결합-도메인을 포함하는 세포외 도메인,
■ CD8 알파로부터의 막관통 도메인, 및
■ 4-1BB로부터의 공-자극 도메인 및 CD3 제타 신호전달(signaling) 도메인을 포함하는 세포질 도메인
을 포함하는 CD123 CAR.
3. 인간 CD28 NP_006130.1.과 동일성(identity)을 갖는 서열을 포함하지 않는, 1 또는 2의 CD123 CAR.
4. 서열번호 172, 서열번호 173, 서열번호 174, 서열번호 175, 서열번호 176, 서열번호 177, 서열번호 178, 서열번호 179, 서열번호 180, 서열번호 181, 서열번호 182, 서열번호 183, 서열번호 184, 서열번호 185, 서열번호 186 및 서열번호 187로부터 선택되는 서열을 포함하고, 선택적으로 적어도 하나의 서열번호 161을 더 포함하는, 1 내지 3 중 어느 하나의 CD123 CAR.
5. 1 내지 4 중 어느 하나에 있어서, 이때 상기 세포외 도메인은 서열번호 161, 서열번호 162, 서열번호 163, 서열번호 164, 서열번호 165, 서열번호 166, 서열번호 167 , 서열번호 168, 서열번호 169 및 서열번호 170로 구성되는 군으로부터 선택되는, 바람직하게는 of 서열번호 161의 그리고 서열번호 169의, 단일클론 항체 (유사체(mimotope))에 특이적인 적어도 하나의 에피토프를 포함하는 CD123 CAR.
6. 서열번호 160, 서열번호 171, 서열번호 188,. 서열번호 189, 서열번호 190, 서열번호 191, 서열번호 192, 서열번호 193, 서열번호 194, 서열번호 195, 서열번호 196, 및 서열번호 197로부터 선택되는 서열을 포함하는 1 내지 5 중 어느 하나에 따른 CD123 CAR.
7. 제 1항 내지 제 6항 중 어느 한 항에 따른 CD123 특이적 키메라 항원 수용체 (CD123 CAR)를 코드하는 폴리뉴클레오타이드.
8. 제 7항에 따른 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현 벡터.
9. 제 1항 내지 제 6항 중 어느 한 항에 정의된 CD123 CAR 중 어느 하나를 코드하는 적어도 하나의 서열 및 백본(backbone)을 포함하는 발현 벡터.
10. 백본, EF1 프로모터, RQR8 오픈 리딩 프레임 (RQR8 ORF), 1 내지 6의 CD123 CAR 중 어느 하나를 코드하는 서열을 포함하는 발현 벡터.
11. 1 내지 6 중 어느 하나에 따른 CD123 CAR을 세포 표면 막에서 발현시키는, T 세포 수용체 (TCR) 넉-아웃 (KO) 또는 TCR 및 인간 디옥시사이티딘 키나제 (dCK) KO 조작된 면역 세포.
12. 1 내지 6 중 어느 하나에 따른 CD123 특이적 키메라 항원 수용체 (CD123 CAR)를 코드하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는, TCR KO 또는 TCR 및 dCK KO 조작된 면역 세포.
13. 세포 표면에서 자살 도메인을 더 발현시키는, 4에 따른, TCR KO 또는 TCR KO 및 dCK KO CD123 CAR -발현시키는 조작된 면역 세포.
14. 11 내지 13 중 어느 하나에 있어서, 이때 적어도 하나의 MHC 단백질의 발현이 억제된, TCR KO 또는 TCR KO 및 dCK KO CD123 CAR -발현시키는 조작된 면역 세포.
15. 치료에의 사용을 위한, 11 내지 14 중 어느 하나에 따른 TCR KO 또는 TCR KO 및 dCK KO CD123 CAR -발현시키는 조작된 면역 세포.
16. 15에 있어서, 질환은 급성 급성(acute) 골수성(myelogenous) 백혈병 (AML), 바람직하게는 난치성/재발된 AML, BPDNL, 또는 골수 이식 전 또는 골수 이식 동안 사용을 위한 것인, TCR KO 또는 TCR KO 및 dCK KO CD123 CAR -발현시키는 조작된 면역 세포.
17. 15에 있어서, 치료로서 사용을 위한, 바람직하게는 림프구증식성 장애의 치료로서, 더욱 바람직하게는 림프종의 백혈병을 위한, 또는 급성 골수성 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 골수형성이상(myelodysplastic) 증후군, 급성 림프성(lymphoid) 백혈병, 만성 림프성 백혈병, 및 골수형성이상(myelodysplastic) 증후군 and BPDNL으로 구성되는 군으로부터 선택되는 치료를 위한, TCR KO 또는 TCR KO 및 dCK KO CD123 CAR -발현시키는 조작된 면역 세포.
18. 15에 있어서, AML의 치료로서 사용을 위한 TCR KO 또는 TCR KO 및 dCK KO CD123 CAR -발현시키는 조작된 면역 세포.
본 발명은 또한 하기를 제공한다:
1a. 적어도 하나의 세포외 결합 도메인을 포함하는 CD123에 특이적인 키메라 항원 수용체 (CAR)을 코드하고, 상기 세포외 도메인은 적어도 하나의 scFv를 포함하고, 상기 scfv는 적어도 CD123에 특이적으로 결합하는 VH 체인 and a VL 체인을 포함하고, 이때 상기 세포외 결합 도메인은 적어도 하나의 mAb-특이적 에피토프 또는 유사체(mimotope)를 포함하는, 폴리펩타이드.
2a. 1a에 있어서, 이때, 상기 mAb-특이적 에피토프는 VH 및 VL 체인들 사이에, 또는 VH 및 VL 앞에 위치되는 폴리펩타이드.
한 예에서, CD123에 특이적인 키메라 항원 수용체 (CAR) 을 코드하는 폴리펩타이드는 막관통 도메인 (TM) 및 힌지을 포함하고, 상기 mAb-특이적 에피토프는 scfv 및 힌지 사이에 위치한다.
본 발명은 하기를 제공한다:
3a. 1a 또는 2a에 있어서, 상기 VH 및 VL 체인들, and mAb 특이적-에피토프은 적어도 하나의 링커에 의하여 서로, 그리고 힌지에 의하여 상기 CAR의 막관통 도메인에 결합된다.
4a. 3a에 있어서, mAb-에피토프는 두 개의 링커들에 있어서, VH 및 VL 체인들에 연결된다.
5a. 1a 내지 3a 중 어느 하나에 있어서, mAb-특이적 에피토프는 이러한 에피토프를 포함하는 CAR를 발현시키는 T 세포들의 시험관 내 세포 분류 및/또는 체내 세포 소모(depletion)를 위한 에피토프-특이적 mAb에 의하여 결합되는 에피토프인, 폴리펩타이드.
6a. 1a 내지 5a 중 어느 하나에 있어서, 폴리펩타이드는 하나의 세포외 결합 도메인, 막관통 도메인, 및 세포내 도메인을 포함하고, 이때
상기 세포외 결합 도메인은 적어도 하나의 mAb-특이적 에피토프를 포함하는,
폴리펩타이드.
7a. 1a 내지 6a 중 어느 하나에 있어서, 세포외 결합 도메인은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10 mAb-특이적 에피토프들을 포함하는 폴리펩타이드.
8a. 1a 내지 7a 중 어느 하나에 있어서, 세포외 결합 도메인은 1, 2, 3 또는, 4 mAb-특이적 에피토프들을 포함하는 폴리펩타이드.
9a. 1a 내지 8a 중 어느 하나에 있어서, 세포외 결합 도메인은 2, 3 또는, 4 mAb-특이적 에피토프들을 포함하는 폴리펩타이드.
10a. 1a 내지 9a 중 어느 하나에 있어서, 세포외 결합 도메인은 하기 서열을 포함하는 폴리펩타이드
V1-L1-V2-(L)x-에피토프1-(L)x-;
V1-L1-V2-(L)x-에피토프1-(L)x-에피토프2-(L)x-;
V1-L1-V2-(L)x-에피토프1-(L)x-에피토프2-(L)x-에피토프3-(L)x-;
(L)x-에피토프1-(L)x-V1-L1-V2;
(L)x-에피토프1-(L)x-에피토프2-(L)x-V1-L1-V2;
에피토프1-(L)x-에피토프2-(L)x-에피토프3-(L)x-V1-L1-V2;
(L)x-에피토프1-(L)x-V1-L1-V2-(L)x-에피토프2-(L)x;
(L)x-에피토프1-(L)x-V1-L1-V2-(L)x-에피토프2-(L)x-에피토프3-(L)x-;
(L)x-에피토프1-(L)x-V1-L1-V2-(L)x-에피토프2-(L)x-에피토프3-(L)x-에피토프4-(L)x-;
(L)x-에피토프1-(L)x-에피토프2-(L)x-V1-L1-V2-(L)x-에피토프3-(L)x-;
(L)x-에피토프1-(L)x-에피토프2-(L)x-V1-L1-V2-(L)x-에피토프3-(L)x-에피토프4-(L)x-;
V1-(L)x-에피토프1-(L)x-V2;
V1-(L)x-에피토프1-(L)x-V2-(L)x-에피토프2-(L)x;
V1-(L)x-에피토프1-(L)x-V2-(L)x-에피토프2-(L)x-에피토프3-(L)x;
V1-(L)x-에피토프1-(L)x-V2-(L)x-에피토프2-(L)x-에피토프3-(L)x-에피토프4-(L)x;
(L)x-에피토프1-(L)x-V1-(L)x-에피토프2-(L)x-V2; 또는,
(L)x-에피토프1-(L)x-V1-(L)x-에피토프2-(L)x-V2-(L)x-에피토프3-(L)x;
이때,
L1은 VL 체인에 VH 체인을 연결하는데 적합한 링커이고;
L은 글리신 및 세린 잔기들을 포함하는 링커이고, 세포외 결합 도메인에서 L의 각 발생은 동일한 세포외 결합 도메인에서 L의 다른 발생과 동일하거나 또는 다를 수 있고, 그리고,
x는 0 또는 1이고, 그리고 x의 각 발생은 다른 것들과 독립적으로 선택되고;그리고,
에피토프 1, 에피토프 2 및 에피토프 3은 mAb-특이적 에피토프들이고 동일하거나 또는 다를 수 있다.
11a. 10a에 있어서, 세포외 결합 도메인은 하기 서열을 포함하는 폴리펩타이드
V1-L1-V2-L-에피토프1; V1-L1-V2-L-에피토프1-L; V1-L1-V2-L-에피토프1-L-에피토프2; V1-L1-V2-L-에피토프1-L-에피토프2-L; V1-L1-V2-L-에피토프1-L-에피토프2-L-에피토프3; V1-L1-V2-L-에피토프1-L-에피토프2-L-에피토프3-L; V1-L1-V2-에피토프1; V1-L1-V2-에피토프1-L; V1-L1-V2-에피토프1-L-에피토프2; V1-L1-V2-에피토프1-L-에피토프2-L; V1-L1-V2-에피토프1-L-에피토프2-L-에피토프3; V1-L1-V2-에피토프1-L-에피토프2-L-에피토프3-L; 에피토프1-V1-L1-V2; 에피토프1-L-V1-L1-V2; L-에피토프1-V1-L1-V2; L-에피토프1-L-V1-L1-V2; 에피토프1-L-에피토프2-V1-L1-V2; 에피토프1-L-에피토프2-L-V1-L1-V2; L-에피토프1-L-에피토프2-V1-L1-V2; L-에피토프1-L-에피토프2-L-V1-L1-V2; 에피토프1-L-에피토프2-L-에피토프3-V1-L1-V2; 에피토프1-L-에피토프2-L-에피토프3-L-V1-L1-V2; L-에피토프1-L-에피토프2-L-에피토프3-V1-L1-V2; L-에피토프1-L-에피토프2-L-에피토프3-L-V1-L1-V2; V1-L-에피토프1-L-V2; L-에피토프1-L-V1-L-에피토프2-L-V2; V1-L-에피토프1-L-V2-L-에피토프2-L; V1-L-에피토프1-L-V2-L-에피토프2-L-에피토프3; V1-L-에피토프1-L-V2-L-에피토프2-에피토프3; V1-L-에피토프1-L-V2-L-에피토프2-L-에피토프3-에피토프4; L-에피토프1-L-V1-L-에피토프2-L-V2-L-에피토프3-L; 에피토프1-L-V1-L-에피토프2-L-V2-L-에피토프3-L; L-에피토프1-L-V1-L-에피토프2-L-V2-L-에피토프3; L-에피토프1-L-V1-L1-V2-L-에피토프2-L; L-에피토프1-L-V1-L1-V2-L-에피토프2-L-에피토프3; L-에피토프1-L-V1-L1-V2-L-에피토프2-에피토프3, 또는 에피토프1-L-V1-L1-V2-L-에피토프2-L-에피토프3-에피토프4 이때
V1은 VL이고 V2는 VH이고, 또는 V1은 VH이고 V2는 VL이고;
L1은 VL 체인에 VH 체인를 연결하기에 적합한 임의의 링커이고;
L은 글리신 및 세린 잔기들을 포함하는 링커이고, 세포외 결합 도메인에서 L의 각 발생은 동일한 세포외 결합 도메인에서 L의 다른 발생과 동일하거나 또는 다를 수 있고, 그리고,
에피토프 1, 에피토프 2 및 에피토프 3은 mAb-특이적 에피토프들이고, 그리고 동일하거나 또는 다를 수 있다.
12a. 10a에 있어서, L1은 글리신 및/또는 세린을 포함하는 링커인 폴리펩타이드.
13a. 12a에 있어서, L1은 아미노산 서열 (Gly-Gly-Gly-Ser)n 또는 (Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)n을 포함하는 링커이고, 이때 n은 1, 2, 3, 4 또는 5이고 또는 링커는 아미노산 서열 (Gly4Ser)4 또는 (Gly4Ser)3을 포함한다.
14a. 10a 내지 13a 중 어느 하나에 있어서, L은 글리신 및/또는 세린을 포함하는 링커인, 폴리펩타이드.
15a. 14a에 있어서, L은 SGG, GGS, SGGS, SSGGS, GGGG, SGGGG, GGGGS, SGGGGS, GGGGGS, SGGGGGS, SGGGGG, GSGGGGS, GGGGGGGS, SGGGGGGG, SGGGGGGGS, 또는 SGGGGSGGGGS 로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 링커인 폴리펩타이드.
16a. 14a에 있어서, L은 SGGGG, GGGGS 또는 SGGGGS인 폴리펩타이드.
17a. 10a 내지 16a 중 어느 하나에 있어서, 에피토프 1, 에피토프 2, 에피토프 3 및 에피토프 4는 이브리투모맙(ibritumomab), 티우세탄(tiuxetan), 뮤노모나브(muromonab)-CD3, 토시투모마브(tositumomab), 아브식시마브(abciximab), 바실리시마브(basiliximab), 브렌툭시맙(brentuximab) 베도틴(vedotin), 세툭시맙(cetuximab), 인플릭시맙(infliximab), 리툭시맙(rituximab), 알렘투주맙(alemtuzumab), 베바시주맙(bevacizumab), 세르톨리주맙(certolizumab) 페골(pegol), 다클리주맙(daclizumab), 에쿨리주맙(eculizumab), 에팔리주맙(efalizumab), 젬투주맙(gemtuzumab), 나탈리주맙(natalizumab), 오말리주맙(omalizumab), 팔리비주맙(palivizumab), 라니비주맙(ranibizumab), 토실리주맙(tocilizumab), 트라스투주맙(trastuzumab), 베돌리주맙(vedolizumab), 아달리무맙(adalimumab), 벨리무맙(belimumab), 카나키누맙(canakinumab), 데노수맙(denosumab), 골리무맙(golimumab), 이필리무맙(ipilimumab), 오파투무맙(ofatumumab), 파니투무맙(panitumumab), QBEND-10, 및 우스테키누맙(ustekinumab)에 의하여 특이적으로 인식되는 mAb-특이적 에피토프들로부터 독립적으로 선택되는 폴리펩타이드.
바람직한 예에서, 상기 에피토프 1, 에피토프 2는 리툭시맙에 의하여 특이적으로 인식되고, 에피토프 3은 QBEND-10에 의하여 특이적으로 인식된다.
18a. 10a 내지 16a 중 어느 하나에 있어서, 에피토프 1, 에피토프 2, 에피토프 3 및 에피토프 4는 서열번호 161 내지 170의 아미노산 서열을 갖는 mAb-특이적 에피토프들로부터 독립적으로 선택되는 폴리펩타이드.
19a. 10a 내지 18a 중 어느 하나에 있어서, 에피토프 1은 서열번호 161의 아미노산 서열을 갖는 mAb-특이적 에피토프인 폴리펩타이드.
20a. 10a 내지 19a 중 어느 하나에 있어서, 에피토프 2는 서열번호 161의 아미노산 서열을 갖는 mAb-특이적 에피토프인 폴리펩타이드.
21a. 10a 내지 20a 중 어느 하나에 있어서, 에피토프 3은 서열번호 161 또는 서열번호 169의 아미노산 서열을 갖는 mAb-특이적 에피토프인 폴리펩타이드.
22a. 10a 내지 21a 중 어느 하나에 있어서, 에피토프 4는 서열번호 161의 아미노산 서열을 갖는 mAb-특이적 에피토프인 폴리펩타이드.
23a. 22a에 있어서, 에피토프 1, 에피토프 2 및 에피토프 4 는 서열번호 161의 아미노산 서열을 갖는 mAb-특이적 에피토프이고, 에피토프 3은 서열번호 169의 아미노산 서열을 갖는 mAb-특이적 에피토프인 폴리펩타이드.
24a. 1a 내지 9a 중 어느 하나에 있어서, mAb-특이적 에피토프는 표 7에 리스트된 것들로부터 선택되는 하나의 폴리펩타이드인 폴리펩타이드.
25a. 1a 내지 9a 중 어느 하나에 있어서, mAb-특이적 에피토프는 이브리투모맙(ibritumomab), 티우세탄(tiuxetan), 뮤노모나브(muromonab)-CD3, 토시투모마브(tositumomab), 아브식시마브(abciximab), 바실리시마브(basiliximab), 브렌툭시맙(brentuximab) 베도틴(vedotin), 세툭시맙(cetuximab), 인플릭시맙(infliximab), 리툭시맙(rituximab), 알렘투주맙(alemtuzumab), 베바시주맙(bevacizumab), 세르톨리주맙(certolizumab) 페골(pegol), 다클리주맙(daclizumab), 에쿨리주맙(eculizumab), 에팔리주맙(efalizumab), 젬투주맙(gemtuzumab), 나탈리주맙(natalizumab), 오말리주맙(omalizumab), 팔리비주맙(palivizumab), 라니비주맙(ranibizumab), 토실리주맙(tocilizumab), 트라스투주맙(trastuzumab), 베돌리주맙(vedolizumab), 아달리무맙(adalimumab), 벨리무맙(belimumab), 카나키누맙(canakinumab), 데노수맙(denosumab), 골리무맙(golimumab), 이필리무맙(ipilimumab), 오파투무맙(ofatumumab), 파니투무맙(panitumumab), QBEND-10, 및 우스테키누맙(ustekinumab)에 의하여 특이적으로 인식되는 mAb-특이적 에피토프들로부터 선택되는 폴리펩타이드.
26a. 1a 내지 9a 중 어느 하나에 있어서, mAb-특이적 에피토프는 서열번호 161, 서열번호 162, 서열번호 163, 서열번호 164, 서열번호 165, 서열번호 166, 서열번호 167, 서열번호 168, 서열번호 169 또는 서열번호 170의 아미노산 서열을 갖는 mAb-특이적 에피토프로부터 선택되는 폴리펩타이드.
27a. 1a 내지 9a 중 어느 하나에 있어서, mAb-특이적 에피토프는 서열번호 160의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드.
28a. 1a 내지 27a 중 어느 하나에 있어서, 상기 VH 및 VL 체인들은 서열번호 11 (CD123 항원 VH), 서열번호 12 (CD123 항원 VL)와 80% 초과(over)의 동일성, 바람직하게는 90% 초과, 그리고 더욱 바람직하게는 95% 초과의 항원 타겟 서열을 갖는 폴리펩타이드.
29a. 1a 내지 27a 중 어느 하나에 있어서, 상기 CD123 항원은 세포 표면 마커 항원인 폴리펩타이드.
30a. 1a 내지 27a 중 어느 하나에 있어서, 상기 CD123 항원은 종양-관련 표면 항원인 폴리펩타이드.
31a. 1a 내지 27a 중 어느 하나에 있어서, 상기 항원은 CD123인 폴리펩타이드.
32a. 1a 내지 27a 중 어느 하나에 있어서, VH 및 VL은 서열번호 11, 서열번호 24 내지 서열번호 30 의 VH 및 서열번호 12;- 서열번호 18 내지 서열번호 23의 VL로부터 선택되는 폴리펩타이드.
33a. 2a 내지 32a 중 어느 하나에 있어서, 힌지는 CD8알파 힌지 또는 a FcγRIII 알파 힌지를 포함하는 폴리펩타이드.
34a. 2a 내지 3a3 중 어느 하나에 있어서, 막관통 도메인은 막관통 영역(들) CD8을 포함하는 폴리펩타이드.
35a. 2a 내지 33a 중 어느 하나에 있어서, 막관통 도메인은 CD8 알파의 막관통 영역(들)을 포함하는 폴리펩타이드.
36a. 2a 내지 33a 중 어느 하나에 있어서, 막관통 도메인은 CD8 알파의 막관통 영역(들) 및 CD8 알파로부터의 힌지를 포함하는 폴리펩타이드.
37a. 2a 내지 37a 중 어느 하나에 있어서, 세포내 도메인은 CD3제타 신호전달(signaling) 도메인을 포함하는 폴리펩타이드.
38a. 2a 내지 37 중 어느 하나에 있어서, 세포내 도메인은 4-1BB 도메인을 포함하는 폴리펩타이드.
39a. 1a 내지 38a 중 어느 하나에 있어서, CAR는 단일-체인 CAR인 폴리펩타이드.
40a. 1a 내지 38a 중 어느 하나에 있어서, CAR는 복수-체인 CAR인 폴리펩타이드.
40a 1a 내지 39a 중 어느 하나에 있어서, CAR는 서열번호 189 내지 서열번호 197로부터 선택되는 서열인 비스(bis) A 폴리펩타이드.
41a. 1a 내지 40a 중 어느 하나에 따른 폴리펩타이드를 코드하는 폴리뉴클레오타이드.
42a. 상기 CAR는 CD3 제타 신호전달(signaling) 도메인 및 4-1BB로부터의 공-자극 도메인을 포함하는, 1a 내지 40a 중 어느 하나에 따른 키메라 항원 수용체를 코드하는 폴리뉴클레오타이드.
43a. 41a 또는 42a의 핵산을 포함하는 발현 벡터.
44a. 1a 내지 40a 중 어느 하나에 따른 폴리펩타이드를 그것의 세포 표면에서 발현시키는 조작된 면역 세포.
45a. 44a에 있어서, 상기 세포는 염증성 T-림프구들, 세포독성 T-림프구들 (CTL), 조절성 T-림프구들 또는 헬퍼 T-림프구들로부터 유래되고, 바람직하게는 CTL 세포인 조작된 면역 세포.
46a. 의약으로서 사용을 위한 44a 또는 45a에 따른 조작된 면역 세포.
47a. (a) 면역 세포를 제공하는 단계;
(b) 1a-40a 중 어느 하나에 따른 키메라 항원 수용체를 코드하는 적어도 하나의 폴리뉴클레오타이드를 상기 세포 내로 도입시키는 단계.
(c) 상기 세포 내로 상기 폴리뉴클레오타이드를 발현시키는 단계를 포함하는
44a-46a 중 어느 하나의 면역 세포를 조작하는 방법.
48a. 면역 세포는 T-세포인 47a의 면역 세포를 조작하는 방법.
49a. - mAb-특이적 에피토프에 특이적인 단일클론 항체과 상기 조작된 면역 세포들을 포함하는 면역 세포들의 군집을 접촉시키는 단계;
- 단일클론 항체에 결합하는 세포들을 선택하여 조작된 면역 세포에서 풍부한 세포들의 군집을 수득하는 단계
를 포함하는, 청구항들 1a 내지 40a 중 어느 하나에 따른 적어도 하나의 mAb-특이적 에피토프를 포함하는 폴리펩타이드를 그것의 세포 표면에서 발현시키는 조작된 면역 세포를 시험관에서(in vitro) 분류하는 방법.
50a. 49a에 있어서, mAb-특이적 에피토프에 특이적인 단일클론 항체가 형광단에 콘쥬게이트되고 단일클론 항체에 결합하는 세포들을 선택하는 단계가 형광(Fluorescence) 활성된(Activated) 세포(Cell) 분류(Sorting) (FACS)에 의하여 이루어지는, 방법.
51a. 49a에 있어서, mAb-특이적 에피토프에 특이적인 단일클론 항체가 자성 입자에 콘쥬게이트되고 단일클론 항체에 결합하는 세포들을 선택하는 단계가 자성(Magnetic) 활성화된(Activated) 세포(Cell) 분류(Sorting) (MACS)에 의하여 이루어지는, 방법.
52a. 49 내지 51 중 어느 하나에 있어서, 폴리펩타이드는 서열번호 160의 아미노산 서열을 갖는 mAb-특이적 에피토프를 포함하고, 단일클론 항체는 리툭시맙인 방법.
53a. 49a 내지 51a 중 어느 하나에 있어서, 폴리펩타이드는 서열번호 169 의 아미노산 서열을 갖는 mAb-특이적 에피토프를 포함하고, 면역 세포들의 군집에 접촉하기 위하여 사용되는 항체는 QBEND-10인 방법.
54a. 49a 내지 53a 중 어느 하나에 있어서, 조작된 면역 세포에서 풍부한 세포들의 군집은 CAR-발현시키는 면역 세포들의 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%를 포함하는 방법.
55a. 상기 조작된 면역 세포를 적어도 하나의 에피토프-특이적 mAb와 접촉시키는 단계를 포함하는, 환자에서 1a 내지 40a 중 어느 하나에 따른 적어도 하나의 mAb-특이적 에피토프를 포함하는 폴리펩타이드를 그것의 세포 표면에서 발현시키는 조작된 면역 세포를 체내에서 소모시키는 방법.
56a. 56a에 있어서, mAb-특이적 에피토프는 CD20 에피토프 또는 유사체(mimotope)이고, 에피토프-특이적 mAb는 리툭시맙인 방법.
57a. 57a에 있어서, mAb-특이적 에피토프는 서열번호 160의 아미노산 서열인 방법.
58a. 56a 내지 58a 중 어느 하나에 있어서, 에피토프-특이적 mAb는 보체계를 활성화시킬 수 있는 분자와 콘쥬게이트되는 방법.
59a. 56a 내지 58a 중 어느 하나에 있어서, 세포독성 약물은 에피토프-특이적 mAb에 커플링되는 방법.
60a. 상기 세포들 상에 지닌 mAb-특이적 에피토프 및 효과기 (및 세포독성) 세포 상에 지닌 표면 항원 둘 다에 결합할 수 있는 이중(bi)-특이적 mAb (BsAb)에 상기 조작된 면역 세포를 접촉시키는 단계를 포함하는, 환자에서 1a 내지 40a 중 어느 하나에 따른 적어도 하나의 mAb-특이적 에피토프를 포함하는 폴리펩타이드를 그것의 세포 표면에서 발현시키는 조작된 면역 세포를 체내에서 소모시키는 방법.
61a. 47a 내지 60a 중 어느 하나에 있어서, 상기 면역 세포는 T-세포인 방법.
특히, 본 발명은 또한
■ 연속적으로, 서열번호 12, 서열번호 24, 서열번호 25, 서열번호 26, 서열번호 27, 서열번호 28, 서열번호 29 및 서열번호 30으로부터 선택되는 VH, 선택적으로 인간화된 적어도 하나의 링커, 바람직하게는 서열 (GGGGS)n이고, n = 1 -4, 더욱 바람직하게는 n=3인 링커, 및 서열번호 11, 서열번호 18, 서열번호 19, 서열번호 20, 서열번호 21, 서열번호 22 및 서열번호 23으로부터 선택되는 VL, 선택적으로 인간화된 힌지를 포함하는 세포외 리간드 결합-도메인을 포함하는 세포외 도메인,
■ CD8 알파로부터의 막관통 도메인, 및
■ 4-1BB로부터의 공-자극 도메인 및 CD3 제타 신호전달(signaling) 도메인을 포함하는 세포질 도메인.
을 포함하는 1b CD123 특이적 키메라 항원 수용체 (CD123 CAR)를 제공한다.
■ 연속적으로, 서열번호 12, 서열번호 24, 서열번호 25, 서열번호 26, 서열번호 27, 서열번호 28, 서열번호 29 and 서열번호 30으로부터 선택되는 VH, 서열번호 10의 링커, 및 서열번호 11, 서열번호 18, 서열번호 19, 서열번호 20, 서열번호 21, 서열번호 22 and 서열번호 23로부터 선택되는 VL, 힌지를 포함하는 세포외 리간드 결합-도메인을 포함하는 세포외 도메인,
■ CD8 알파로부터의 막관통 도메인, 및
■ 4-1BB로부터의 공-자극 도메인 및 CD3 제타 신호전달(signaling) 도메인을 포함하는 세포질 도메인
을 포함하는, CD123 특이적 키메라 항원 수용체 (CD123 CAR).
2b 본 발명은 인간 CD28 NP_006130.1과 동일상을 갖는 서열을 포함하지 않는 1b에 따른 CD123 CAR을 제공한다.
3b 본 발명은 1b 또는 2b에 있어서, 상기 세포외 도메인은 서열번호 161 내지 서열번호 170, 또는 그 조합으로부터 선택되는 서열의 단일클론 항체에 특이적인 적어도 하나의 에피토프, 서열번호 161의 단일클론 항체에 특이적인 바람직하게는 적어도 하나의 에피토프를 포함하는 CD123 CAR를 제공한다.
본 발명은 CD123 CAR가 서열번호 189 내지 서열번호 197로부터 선택되는 서열을 포함하는 CD123 CAR를 제공한다.
본 발명은 CD123 CAR가 서열번호 190의 서열을 포함하는 CD123 CAR를 제공한다.
본 발명은 CD123 CAR가 서열번호 191의 서열을 포함하는 CD123 CAR를 제공한다.
본 발명은 CD123 CAR가 서열번호 192의 서열을 포함하는 CD123 CAR를 제공한다.
본 발명은 CD123 CAR가 서열번호 193의 서열을 포함하는 CD123 CAR를 제공한다.
본 발명은 CD123 CAR가 서열번호 194의 서열을 포함하는 CD123 CAR를 제공한다.
본 발명은 CD123 CAR가 서열번호 195의 서열을 포함하는 CD123 CAR를 제공한다.
본 발명은 CD123 CAR가 서열번호 196의 서열을 포함하는 CD123 CAR를 제공한다.
본 발명은 CD123 CAR가 서열번호 197의 서열을 포함하는 CD123 CAR를 제공한다.
본 발명은 1b 또는 2b 에 있어서, 상기 세포외 도메인이 서열번호 161, 서열번호 162, 서열번호 163, 서열번호 164, 서열번호 165, 서열번호 166, 서열번호 167, 서열번호 168 및 서열번호 169, 및 서열번호 170로부터 선택되는 서열의 단일클론 항체에 특이적인 적어도 하나의 에피토프를 포함하는 scfv를 포함하는 CD123 CAR를 제공한다.
바람직하게는, 본 발명은 1b 또는 2b 에 있어서, 상기 세포외 도메인이 서열번호 161을 인식하는 단일클론 항체에 특이적인 두 개의 에피토프들 및 서열번호 169를 인식하는 단일클론 항체에 특이적인 다른 두 개의 에피토프들을 포함하는 scfv를 포함하는 CD123 CAR을 제공한다.
4b. 본 발명은 서열번호 171의 서열을 포함하는 3b의 CD123 CAR을 제공한다.
5b 본 발명은 서열번호 31, 서열번호 32, 서열번호 33 및 서열번호 34 내지 서열번호 160로부터 선택되는 서열을 갖는 1b에 따른 CD123 특이적 키메라 항원 수용체 (CD123 CAR)를 제공한다.
6b 본 발명은 서열번호 34 내지 서열번호 160로부터 선택되는 서열을 갖는 1b 내지 5b 중 어느 하나에 따른 CD123 특이적 키메라 항원 수용체 (CD123 CAR)를 제공한다.
7b 본 발명은 1b 내지 6b 중 어느 하나에 따른 CD123 특이적 키메라 항원 수용체 (CD123 CAR)를 코드하는 폴리뉴클레오타이드를 제공한다.
8b 본 발명은 7에 따른 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현 벡터를 제공한다.
9b) 본 발명은 1b 내지 6b 중 어느 하나에 의하여 정의된 CD123 CAR 중 어느 하나를 코드하는 서열 및 백본을 포함하는 발현 벡터를 제공한다.
10b) 본 발명은 백본, 바람직하게는 EF1 프로모터을 포함하는 백본, RQR8 오픈 리딩 프레임 (RQR8 ORF), 상기 1 내지 8 예들의 CD123 CAR 중 어느 하나를 코드하는 서열을 포함하는 발현 벡터를 제공한다.
11b) 본 발명은 1b 내지 9b 중 어느 하나에 따른 CD123 CAR를 세포 표면 막에서 발현시키는, T 세포 수용체 (TCR) 넉-아웃 (KO) 또는 TCR 및 인간 디옥시사이티딘 키나제 (dCK) KO 조작된 면역 세포를 제공한다.
12b) 본 발명은 1b 내지 6b 중 어느 하나에 따른 CD123 특이적 키메라 항원 수용체 (CD123 CAR)를 코드하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 TCR KO 또는 TCR 및 dCK KO 조작된 면역 세포를 제공한다.
본 발명의CD123 특이적 키메라 항원 수용체 (CD123 CAR)를 코드하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현 벡터를 포함하는 TCR KO 또는 TCR 및 dCK KO 조작된 면역 세포.
본 발명의 CD123 특이적 키메라 항원 수용체 (CD123 CAR)을 코드하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 서열 및 백본을 포함하는 발현 벡터를 포함하는 TCR KO 또는 TCR 및 dCK KO 조작된 면역 세포.
백본, EF1 프로모터, RQR8 오픈 리딩 프레임 (RQR8 ORF), 본 발명의 CD123 CAR 중 어느 하나를 코드하는 서열을 포함하는 발현 벡터를 포함하는 TCR KO 또는 TCR 및 dCK KO 조작된 면역 세포.
13b) 본 발명은 세포 표면에서 자살 도메인을 더 발현시키는, 11b 또는 12b에 따른, TCR KO 또는 TCR KO 및 dCK KO CD123 CAR -발현시키는 조작된 면역 세포를 포함한다.
(14b) 본 발명은 세포 표면에서의 상기 자살 도메인은 CD123 CAR 세포외 도메인 내로 삽입되는, 10b 내지 13b 중 어느 하나에 따른 TCR KO 또는 TCR KO 및 dCK KO CD123 CAR-발현시키는 조작된 면역 T 세포를 제공한다.
dCK 유전자가 퓨린 뉴클레오타이드 유사체들(analogs) (PNA)에 대하여 부여하는 내성이 제거된, 11b 내지 14b 중 어느 하나에 따른 TCR KO 및 dCK KO CD123 CAR -발현시키는 조작된 면역 세포.
(15b) 본 발명은 적어도 하나의 MHC 단백질의 발현이 억제되는, 11b 내지 14b 중 어느 하나에 따른 TCR KO 또는 TCR KO 및 dCK KO CD123 CAR -발현시키는 조작된 면역 세포를 제공한다.
16b) 본 발명은 치료에의 사용을 위한 (11b) 내지 (15b) 중 어느 하나에 따른 TCR KO 또는 TCR KO 및 dCK KO CD123 CAR -발현시키는 조작된 면역 세포를 제공한다.
본 발명은 1b) 내지 6b)와 같은 CD123 CAR을 포함하는 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명은 11 b 내지 15b 중 어느 하나에 따른 TCR KO 또는 TCR KO 및 dCK KO CD123 CAR -발현시키는 조작된 면역 세포를 포함하는 약학적 조성물을 제공한다.
17b) 본 발명은 질환은 급성 골수성 백혈병 (AML), 바람직하게는 난치성/재발된 AML, BPDNL이고, 또는 골수 이식 동안 사용을 위한, 16b에 따른 TCR KO 또는 TCR KO 및 dCK KO CD123 CAR -발현시키는 조작된 면역 세포를 제공한다.
18b) 본 발명은 치료로서 사용을 위한, 바람직하게는 림프구증식성 장애의 치료로서, 더욱 바람직하게는 림프종의 백혈병에 대한, 또는 급성 골수성 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 골수형성이상(myelodysplastic) 증후군, 급성 림프성 백혈병, 만성 림프성 백혈병, 및 골수형성이상(myelodysplastic) 증후군 및 BPDNL로 구성되는 군으로부터 선택되는 치료를 위한, 16b에 따른 TCR KO 또는 TCR KO 및 dCK KO CD123 CAR -발현시키는 조작된 면역 세포를 제공한다.
본 발명은 치료에의 사용을 위한 상기와 같은 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명은 급성 골수성 백혈병 (AML), 바람직하게는 난치성/재발된 AML, BPDNL의 치료를 위한, 또는 골수 이식 동안 사용을 위한, 치료에의 사용을 위한 상기와 같은 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명은 치료로서 사용을 위한, 바람직하게는 림프구증식성 장애에 대한 치료로서, 더욱 바람직하게는 림프종의 백혈병에 대한, 또는 급성 골수성 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 골수형성이상(myelodysplastic) 증후군, 급성 림프성 백혈병, 만성 림프성 백혈병, 및 골수형성이상(myelodysplastic) 증후군 및 BPDNL로 구성되는 군으로부터 선택되는 치료를 위한, 약학적 조성물을 제공한다.
여기에서 특이적으로 정의되지 않는 한, 사용되는 모든 기술적 및 과학적 용어들은 유전자 치료, 약물한, 면역학, 생화학, 유전학들 및 분자 생물학의 영역에서 당업자에 의하여 보통 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다.
여기에서 기재된 그것들과 등가이거나 또는 유사한 모든 방법들 및 물질들은, 여기에 기재된 적합한 방법들 및 물질들과 함께, 본 발명을 실시 또는 시험하는데 사용될 수 있다. 여기에서 언급된 모든 공개들, 특허 출원들, 특허들 및 다른 참고문헌들은 그 전체가 참고로서 여기에 포함된다. 모순되는 경우, 정의들을 포함하는 본 명세서가 우선된다. 나아가, 물질들, 방법들, 및 예들은 설명을 위한 것일 뿐이며, 다르게 특정되지 않는한, 제한하는 것으로 의도되지 않는다.
본 발명의 실시는, 다르게 표시되지 않는 한, 당업계의 기술 내인 세포 생물학, 세포 배양, 분자 생물학, 유전자이식 생물학, 미생물학, 재조합 DNA, 및 면역학의 기존 기술들을 이용할 것이다. 이러한 기술들은 문헌 내에 완전히 설명된다.예컨대, Current Protocols in Molecular Biology (Frederick M. AUSUBEL, 2000, Wiley and son Inc, Library of Congress, USA); Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Third Edition, (Sambrook et al, 2001, Cold Spring Harbor, New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press); Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait ed., 1984); Mullis et al. U.S. Pat. No. 4,683,195; Nucleic Acid Hybridization (B. D. Harries & S. J. Higgins eds. 1984); Transcription And Translation (B. D. Hames & S. J. Higgins eds. 1984); Culture Of Animal Cells (R. I. Freshney, Alan R. Liss, Inc., 1987); Immobilized Cells And Enzymes (IRL Press, 1986); B. Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning (1984); the series, Methods In ENZYMOLOGY (J. Abelson and M. Simon, eds.-in-chief, Academic Press, Inc., New York), specifically, Vols.154 and 155 (Wu et al. eds.) and Vol. 185, "Gene Expression Technology" (D. Goeddel, ed.); Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells (J. H. Miller and M. P. Calos eds., 1987, Cold Spring Harbor Laboratory); Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology (Mayer and Walker, eds., Academic Press, London, 1987); Handbook Of Experimental Immunology, Volumes I-IV (D. M. Weir and C. C. Blackwell, eds., 1986); and Manipulating the Mouse Embryo, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1986) 참조.
본 발명은 단일클론 항-CD123 항체 KLON43로부터의 VH 및 VL, 또는 그것의 인간화된 VH 및 인간화된 VL 서열을 포함하는 세포외 리간드 결합-도메인, FcγRIIIα의 CD8 알파로부터의 힌지, CD8 알파로부터의 막관통 도메인, 4-1BB로부터의 공-자극 도메인 및 CD3 제타 신호전달(signaling) 도메인을 포함하는 세포질 도메인을 포함하는 CD123 특이적 키메라 항원 수용체 ("CD123 CAR" 또는 "CAR") 를 발현시키는 조작된 면역 세포 (TCR KO 및/또는 dck KO)를 개시하고, 상기 123 CAR는 서열번호 31, 서열번호 32, 또는 서열번호 33, 또는 서열번호 34 내지 서열번호 117, 서열번호 160, 또는 바람직하게는, 서열번호 188 내지 서열번호 197 중 어느 하나와 서열 동일성을 갖는다.
바람직하게는 본 발명은 서열번호 31, 32 또는 160의 CD123 특이적 CAR을 발현시키는 조작된 면역 세포 (TCR KO 및/또는 dck KO), 더욱 바람직하게는 서열번호 31의 CD123 특이적 CAR를 발현시키는 조작된 면역 세포 (TCR KO), 그리고 더욱 더 바람직하게는 서열번호 32의 CD123 특이적 CAR를 발현시키는 조작된 면역 세포 (TCR KO 및 dck KO)를 개시한다.
유리하게는 상기 본 발명은 서열번호 31, 32 또는 160의 CD123 특이적 CAR 및 자살 도메인을 발현시키는 조작된 면역 세포 (TCR KO 및/또는 dck KO), 더욱 바람직하게는 서열번호 31의 CD123 특이적 CAR 및 자살 도메인을 발현시키는 조작된 면역 세포 (TCR KO), 더욱 더 바람직하게는 서열번호 32의 CD123 특이적 CAR를 발현시키는 조작된 면역 세포 (TCR KO 및 dck KO), 그리고 더더욱 바람직하게는 서열번호 160의, 또는 하기 서열들 서열번호 188 내지 서열번호 197 중 하나의 CD123 특이적 CAR를 발현시키는 조작된 면역 세포 (TCR KO and dck KO)를 개시한다.
본 발명은 도 2에 나타난 대로 V1, V3로부터 선택되는 폴리펩타이드 구조체 중 하나를 갖는 CD123 특이적 CAR을 발현시키는 조작된 면역 세포 (TCR KO 및/또는 dck KO)를 개시하며, 상기 구조체는 단일클론 항-CD123 항체 KLON 43으로부터의 VH 및 VL을 포함하는 세포외 리간드 결합-도메인, CD8알파 또는 FcγRIIIα로부터의 힌지, CD8 알파로부터의 막관통 도메인, a 4-1BB로부터의 공-자극 도메인 및 CD3 제타 신호전달(signaling) 도메인을 포함하는 세포질 도메인을 포함하고, CD28으로부터의 서열은 포함하지 않고, 상기 123 CAR는 서열번호 31, 서열번호 32, 바람직하게는 서열번호 32와 적어도 80% 서열 동일성을 갖는다.
본 발명은 도 2에 나타난 대로 V1, V3로부터 선택되는 폴리펩타이드 구조체 중 하나를 갖는 CD123 특이적 CAR을 발현시키는 조작된 면역 세포 (TCR KO 및/또는 dck KO)를 개시하며, 상기 구조체는 단일클론 항-CD123 항체 KLON 43으로부터의 VH 및 VL을 포함하는 세포외 리간드 결합-도메인, CD8알파 또는 FcγRIIIα로부터의 힌지, CD8 알파로부터의 막관통 도메인, a 4-1BB로부터의 공-자극 도메인 및 CD3 제타 신호전달(signaling) 도메인을 포함하는 세포질 도메인을 포함하고 CD28로부터의 서열은 포함하지 않고, 상기 123 CAR는 서열번호 34 내지 서열번호 159, 바람직하게는 서열번호 34 to 서열번호 117, 바람직하게는 서열번호 76 to 서열번호 117과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는다.
한 예에서, 본 발명은 서열번호 34, 서열번호 76, 서열번호 36, 서열번호 78; 서열번호 37, 서열번호 79, 서열번호 41, 서열번호 83, 서열번호 42, 서열번호 8), 서열번호 43, 서열번호 85, 서열번호 46, 서열번호 47, 서열번호 48, 서열번호 49, 서열번호 88, 서열번호 89, 서열번호 90, 서열번호 91. 서열번호 52, 서열번호 53, 서열번호 54, 서열번호 55, 서열번호 94, 서열번호 95, 서열번호 96, 서열번호 97로부터 선택되는 서열을 갖는 CD123 특이적 CAR를 발현시키는 조작된 면역 세포 (TCR KO 및/또는 dck KO)를 개시한다.
바람직하게는, 본 발명은 서열번호 34, 서열번호 76, 서열번호 36, 서열번호 78; 서열번호 43, 서열번호 85, 서열번호 46, 서열번호 47, 서열번호 48, 서열번호 88, 서열번호 89, 서열번호 90, 서열번호 52, 서열번호 53, 서열번호 54, 서열번호 55, 서열번호 94, 서열번호 95, 서열번호 96 서열번호 97로부터 선택되는 서열을 갖는 CD123 특이적 CAR를 발현시키는 조작된 면역 세포 (TCR KO 및/또는 dck KO)를 개시한다.
더 바람직하게는, 본 발명은 서열번호 47, 서열번호 89,SEQ ID NO. 52, 서열번호 53, 서열번호 54, 서열번호 55, 서열번호 94, 서열번호 95, 서열번호 96, 서열번호 97로부터 선택되는 서열을 갖는 CD123 특이적 CAR를 발현시키는 조작된 면역 세포 (TCR KO 및/또는 dck KO)를 개시한다.
그리고 더욱 더 바람직하게는 본 발명은 서열번호 32, 서열번호 89, 서열번호 94, 서열번호 95, 서열번호 96, 서열번호 97로부터 선택되는 서열을 갖는 CD123 특이적 123 CAR를 발현시키는 조작된 면역 세포 (TCR KO 및/또는 dck KO)를 개시한다.
가장 바람직한 예에서 본 발명은 서열번호 161 내지 서열번호 170로부터 선택되는 특이적인 단일클론 항체, 바람직하게는 서열번호 161 중 둘, 그리고 서열번호 169로부터의 하나에 의하여 인식되는 적어도 하나의 에피토프를 포함하는 서열번호 172의 서열을 갖는 CD123 특이적 123 CAR를 발현시키는 조작된 면역 세포 (TCR KO 및/또는 dck KO)를 개시한다.
또다른 가장 바람직한 예는 서열번호 161 내지 서열번호 170로부터 선택되는 특이적 단일클론 항체, 바람직하게는 서열번호 161 중 둘 및 서열번호 169로부터의 하나에 의하여 인식되는 적어도 하나의 에피토프를 포함하는 서열번호 173의 서열을 갖는 CD123 특이적 123 CAR를 발현시키는 조작된 면역 세포 (TCR KO 및/또는 dck KO)를 개시한다.
또다른 가장 바람직한 예는 서열번호 161 내지 서열번호 170로부터 선택되는 특이적 단일클론 항체, 바람직하게는 서열번호 161 중 둘 및 서열번호 169로부터의 하나에 의하여 인식되는 적어도 하나의 에피토프를 포함하는 서열번호 174 의 서열을 갖는 CD123 특이적 123 CAR를 발현시키는 조작된 면역 세포 (TCR KO 및/또는 dck KO)를 개시한다.
또다른 가장 바람직한 예는 서열번호 161 내지 서열번호 170로부터 선택되는 특이적 단일클론 항체, 바람직하게는 서열번호 161 중 둘 및 서열번호 169로부터의 하나에 의하여 인식되는 적어도 하나의 에피토프를 포함하는 서열번호 175의 서열을 갖는 CD123 특이적 123 CAR를 발현시키는 조작된 면역 세포 (TCR KO 및/또는 dck KO)를 개시한다.
또다른 가장 바람직한 예는 서열번호 161 내지 서열번호 170로부터 선택되는 특이적 단일클론 항체, 바람직하게는 서열번호 161 중 둘 및 서열번호 169로부터의 하나에 의하여 인식되는 적어도 하나의 에피토프를 포함하는 서열번호 176의 서열을 갖는 CD123 특이적 123 CAR를 발현시키는 조작된 면역 세포 (TCR KO 및/또는 dck KO)를 개시한다.
또다른 가장 바람직한 예는 서열번호 161 내지 서열번호 170로부터 선택되는 특이적 단일클론 항체, 바람직하게는 서열번호 161 중 둘 및 서열번호 169로부터의 하나에 의하여 인식되는 적어도 하나의 에피토프를 포함하는 서열번호 177의 서열을 갖는 CD123 특이적 123 CAR를 발현시키는 조작된 면역 세포 (TCR KO 및/또는 dck KO)를 개시한다.
또다른 가장 바람직한 예는 서열번호 161 내지 서열번호 170로부터 선택되는 특이적 단일클론 항체, 바람직하게는 서열번호 161 중 둘 및 서열번호 169로부터의 하나에 의하여 인식되는 적어도 하나의 에피토프를 포함하는 서열번호 178의 서열을 갖는 CD123 특이적 123 CAR를 발현시키는 조작된 면역 세포 (TCR KO 및/또는 dck KO)를 개시한다.
또다른 가장 바람직한 예는 서열번호 161 내지 서열번호 170로부터 선택되는 특이적 단일클론 항체, 바람직하게는 서열번호 161 중 둘 및 서열번호 169로부터의 하나에 의하여 인식되는 적어도 하나의 에피토프를 포함하는 서열번호 179의 서열을 갖는 CD123 특이적 123 CAR를 발현시키는 조작된 면역 세포 (TCR KO 및/또는 dck KO)를 개시한다.
또다른 가장 바람직한 예는 서열번호 161 내지 서열번호 170로부터 선택되는 특이적 단일클론 항체, 바람직하게는 서열번호 161 중 둘 및 서열번호 169로부터의 하나에 의하여 인식되는 적어도 하나의 에피토프를 포함하는 서열번호 180의 서열을 갖는 CD123 특이적 123 CAR를 발현시키는 조작된 면역 세포 (TCR KO 및/또는 dck KO)를 개시한다.
또다른 가장 바람직한 예는 서열번호 161 내지 서열번호 170로부터 선택되는 특이적 단일클론 항체, 바람직하게는 서열번호 161 중 둘 및 서열번호 169로부터의 하나에 의하여 인식되는 적어도 하나의 에피토프를 포함하는 서열번호 181의 서열을 갖는 CD123 특이적 123 CAR를 발현시키는 조작된 면역 세포 (TCR KO 및/또는 dck KO)를 개시한다.
또다른 가장 바람직한 예는 서열번호 161 내지 서열번호 170로부터 선택되는 특이적 단일클론 항체, 바람직하게는 서열번호 161 중 둘 및 서열번호 169로부터의 하나에 의하여 인식되는 적어도 하나의 에피토프를 포함하는 서열번호 182의 서열을 갖는 CD123 특이적 123 CAR를 발현시키는 조작된 면역 세포 (TCR KO 및/또는 dck KO)를 개시한다.
또다른 가장 바람직한 예는 서열번호 161 내지 서열번호 170로부터 선택되는 특이적 단일클론 항체, 바람직하게는 서열번호 161 중 둘 및 서열번호 169로부터의 하나에 의하여 인식되는 적어도 하나의 에피토프를 포함하는 서열번호 183의 서열을 갖는 CD123 특이적 123 CAR를 발현시키는 조작된 면역 세포 (TCR KO 및/또는 dck KO)를 개시한다.
또다른 가장 바람직한 예는 서열번호 161 내지 서열번호 170로부터 선택되는 특이적 단일클론 항체, 바람직하게는 서열번호 161 중 둘 및 서열번호 169로부터의 하나에 의하여 인식되는 적어도 하나의 에피토프를 포함하는 서열번호 184의 서열을 갖는 CD123 특이적 123 CAR를 발현시키는 조작된 면역 세포 (TCR KO 및/또는 dck KO)를 개시한다.
또다른 가장 바람직한 예는 서열번호 161 내지 서열번호 170로부터 선택되는 특이적 단일클론 항체, 바람직하게는 서열번호 161 중 둘 및 서열번호 169로부터의 하나에 의하여 인식되는 적어도 하나의 에피토프를 포함하는 서열번호 185의 서열을 갖는 CD123 특이적 123 CAR를 발현시키는 조작된 면역 세포 (TCR KO 및/또는 dck KO)를 개시한다.
또다른 가장 바람직한 예는 서열번호 161 내지 서열번호 170로부터 선택되는 특이적 단일클론 항체, 바람직하게는 서열번호 161 중 둘 및 서열번호 169로부터의 하나에 의하여 인식되는 적어도 하나의 에피토프를 포함하는 서열번호 186의 서열을 갖는 CD123 특이적 123 CAR를 발현시키는 조작된 면역 세포 (TCR KO 및/또는 dck KO)를 개시한다.
또다른 가장 바람직한 예는 서열번호 161 내지 서열번호 170로부터 선택되는 특이적 단일클론 항체, 바람직하게는 서열번호 161 중 둘 및 서열번호 169로부터의 하나에 의하여 인식되는 적어도 하나의 에피토프를 포함하는 서열번호 187의 서열을 갖는 CD123 특이적 123 CAR를 발현시키는 조작된 면역 세포 (TCR KO 및/또는 dck KO)를 개시한다.
또다른 가장 바람직한 예에서, 본 발명은 서열번호 188의 서열을 갖는 CD123 특이적 123 CAR를 발현시키는 조작된 면역 세포 (TCR KO 및/또는 dck KO)를 개시한다.
또다른 가장 바람직한 예에서, 본 발명은 서열번호 189의 서열을 갖는 CD123 특이적 123 CAR를 발현시키는 조작된 면역 세포 (TCR KO 및/또는 dck KO)를 개시한다.
또다른 가장 바람직한 예에서, 본 발명은 서열번호 190의 서열을 갖는 CD123 특이적 123 CAR를 발현시키는 조작된 면역 세포 (TCR KO 및/또는 dck KO)를 개시한다.
또다른 가장 바람직한 예에서, 본 발명은 서열번호 191의 서열을 갖는 CD123 특이적 123 CAR를 발현시키는 조작된 면역 세포 (TCR KO 및/또는 dck KO)를 개시한다.
또다른 가장 바람직한 예에서, 본 발명은 서열번호 192의 서열을 갖는 CD123 특이적 123 CAR를 발현시키는 조작된 면역 세포 (TCR KO 및/또는 dck KO)를 개시한다.
또다른 가장 바람직한 예에서, 본 발명은 서열번호 193의 서열을 갖는 CD123 특이적 123 CAR를 발현시키는 조작된 면역 세포 (TCR KO 및/또는 dck KO)를 개시한다.
또다른 가장 바람직한 예에서, 본 발명은 서열번호 194의 서열을 갖는 CD123 특이적 123 CAR를 발현시키는 조작된 면역 세포 (TCR KO 및/또는 dck KO)를 개시한다.
또다른 가장 바람직한 예에서, 본 발명은 서열번호 195의 서열을 갖는 CD123 특이적 123 CAR를 발현시키는 조작된 면역 세포 (TCR KO 및/또는 dck KO)를 개시한다.
또다른 가장 바람직한 예에서, 본 발명은 서열번호 196의 서열을 갖는 CD123 특이적 123 CAR를 발현시키는 조작된 면역 세포 (TCR KO 및/또는 dck KO)를 개시한다.
또다른 가장 바람직한 예에서, 본 발명은 서열번호 197의 서열을 갖는 CD123 특이적 123 CAR를 발현시키는 조작된 면역 세포 (TCR KO 및/또는 dck KO)를 개시한다.
본 발명은 세포외 결합 도메인이 세포 분류 및 세포 소모(depletion) 둘 다를 가능하게 하는 방식으로 변형되는 CD123 특이적 123 CAR를 발현시키는 조작된 면역 세포 (TCR KO 및/또는 dck KO)를 개시한다. "mAb-주도의 분류/소모 시스템" 또는 "단일클론 항체에 특이적인 에피토프" 또는 "유사체(mimotope)"으로 명명되는 이 구조체는 본 발명의 항-CD123 CAR의 세포외 도메인 내에, 특히 항-CD123 scFv 내에; 또는 TM 및 힌지 사이에 삽입되는 선택된 에피토프이며; 이 에피토프는 특이적 항체 (바람직하게는 mAb)에 의하여 인식되는 특이성을 갖는다. CAR의 외부의 리간드 결합 도메인이 주로 에피토프를 포함하도록 변형되는 것을 고려할 때, 다른 CAR 아키텍쳐들이 상상된다: 단일-체인 또는 멀티-체인. 특이적 에피토프(들) 및 VH 및 VL 폴리펩타이드들로 이루어지는, 본 발명의 키메라 scFv은 그 자체가 에피토프의 삽입의 위치에 의존적인 다른 구조체들 및 링커들의 사용을 가질 수 있다. 본 발명은 또한 변형된 CAR들을 지닌 것으로 여겨지는 조작된 면역 세포들을 분류 및/또는 소모하는 결과인 방법에 대한 것이다.
몇몇 예들에서, 항-CD123 CAR의 세포외 결합 도메인은 하기 서열 (유사체들(mimotopes) 포함) (N말단(Nterm)은 좌측에 위치한다)을 포함하며:
V1-L1-V2-(L)x-에피토프1-(L)x;
V1-L1-V2-(L)x-에피토프1-(L)x-에피토프2-(L)x;
V1-L1-V2-(L)x-에피토프1-(L)x-에피토프2-(L)x-에피토프3-(L)x;
(L)x-에피토프1-(L)x-V1-L1-V2;
(L)x-에피토프1-(L)x-에피토프2-(L)x-V1-L1-V2;
에피토프1-(L)x-에피토프2-(L)x-에피토프3-(L)x-V1-L1-V2;
(L)x-에피토프1-(L)x-V1-L1-V2-(L)x-에피토프2-(L)x;
(L)x-에피토프1-(L)x-V1-L1-V2-(L)x-에피토프2-(L)x-에피토프3-(L)x;
(L)x-에피토프1-(L)x-V1-L1-V2-(L)x-에피토프2-(L)x-에피토프3-(L)x-에피토프4-(L)x;
(L)x-에피토프1-(L)x-에피토프2-(L)x-V1-L1-V2-(L)x-에피토프3-(L)x;
(L)x-에피토프1-(L)x-에피토프2-(L)x-V1-L1-V2-(L)x-에피토프3-(L)x-에피토프4-(L)x;
V1-(L)x-에피토프1-(L)x-V2;
V1-(L)x-에피토프1-(L)x-V2-(L)x-에피토프2-(L)x;
V1-(L)x-에피토프1-(L)x-V2-(L)x-에피토프2-(L)x-에피토프3-(L)x;
V1-(L)x-에피토프1-(L)x-V2-(L)x-에피토프2-(L)x-에피토프3-(L)x-에피토프4-(L)x;
(L)x-에피토프1-(L)x-V1-(L)x-에피토프2-(L)x-V2;
(L)x-에피토프1-(L)x-V1-(L)x-에피토프2-(L)x-V2-(L)x-에피토프3-(L)x;
V1-L1-V2-L-에피토프1;
V1-L1-V2-L-에피토프1-L;
V1-L1-V2-L-에피토프1-L-에피토프2;
V1-L1-V2-L-에피토프1-L-에피토프2-L;
V1-L1-V2-L-에피토프1-L-에피토프2-L-에피토프3;
V1-L1-V2-L-에피토프1-L-에피토프2-L-에피토프3-L;
V1-L1-V2-에피토프1;
V1-L1-V2-에피토프1-L;
V1-L1-V2-에피토프1-L-에피토프2;
V1-L1-V2-에피토프1-L-에피토프2-L;
V1-L1-V2-에피토프1-L-에피토프2-L-에피토프3;
V1-L1-V2-에피토프1-L-에피토프2-L-에피토프3-L;
에피토프1-V1-L1-V2;
에피토프1-L-V1-L1-V2;
L-에피토프1-V1-L1-V2;
L-에피토프1-L-V1-L1-V2;
에피토프1-L-에피토프2-V1-L1-V2;
에피토프1-L-에피토프2-L-V1-L1-V2;
L-에피토프1-L-에피토프2-V1-L1-V2;
L-에피토프1-L-에피토프2-L-V1-L1-V2;
에피토프1-L-에피토프2-L-에피토프3-V1-L1-V2;
에피토프1-L-에피토프2-L-에피토프3-L-V1-L1-V2;
L-에피토프1-L-에피토프2-L-에피토프3-V1-L1-V2;
L-에피토프1-L-에피토프2-L-에피토프3-L-V1-L1-V2;
V1-L-에피토프1-L-V2;
L-에피토프1-L-V1-L-에피토프2-L-V2;
V1-L-에피토프1-L-V2-L-에피토프2-L;
V1-L-에피토프1-L-V2-L-에피토프2-L-에피토프3;
V1-L-에피토프1-L-V2-L-에피토프2-에피토프3;
V1-L-에피토프1-L-V2-L-에피토프2-L-에피토프3-에피토프4;
L-에피토프1-L-V1-L-에피토프2-L-V2-L-에피토프3-L;
에피토프1-L-V1-L-에피토프2-L-V2-L-에피토프3-L;
L-에피토프1-L-V1-L-에피토프2-L-V2-L-에피토프3;
L-에피토프1-L-V1-L1-V2-L-에피토프2-L;
L-에피토프1-L-V1-L1-V2-L-에피토프2-L-에피토프3;
L-에피토프1-L-V1-L1-V2-L-에피토프2-에피토프3, 또는,
에피토프1-L-V1-L1-V2-L-에피토프2-L-에피토프3-에피토프4.
이때,
V1 및 V2는 ScFv 항-CD123의 VH 및 VL이고 (즉, V1은 VL이고 V2는 VH이고 또는 V1은 VH이고 그리고 V2는 VL이고);
L1은 ScFv에서 VL 체인에 VH 체인을 연결하기에 적합한 임의의 링커이고;
L은 링커이고, 바람직하게는 글리신 및 세린 잔기들을 포함하고, 세포외 결합 도메인에서 L의 각 발생은 동일한 세포외 결합 도메인에서 L의 다른 발생과 동일하거나 다를 수 있고, 그리고
x는 0 또는 1이고, x의 각 발생은 다른 것들과 독립적이고; 그리고,
에피토프 1, 에피토프 2 및 에피토프 3은 mAb-특이적 에피토프들 (또는 유사체들(mimotopes))이고, 동일하거나 또는 다를 수 있다.
몇몇 예들에서, 세포외 결합 도메인은 하기 서열 (N말단(Nterm)은 좌측에 위치한다)을 포함하며:
VH-L1-VL-L-에피토프1-L-에피토프2-L;
L-에피토프1-L-VH-L-에피토프2-L-VL-L-에피토프3-L;
VL-L1-VH-L-에피토프1-L-에피토프2-L; 또는,
L-에피토프1-L-VL-L-에피토프2-L-VH-L-에피토프3-L.
이때 L, L1, 에피토프 1, 에피토프 2 및 에피토프 3은 앞서 정의한 바와 같다.
L1은 글리신 및/또는 세린을 포함하는 링커이다. 몇몇 예에서, L1은 아미노산 서열 (Gly-Gly-Gly-Ser)n 또는 (Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)n을 포함하는 링커이고, n is 1, 2, 3, 4 또는 5이다. 몇 예들에서, L1은 (Gly4Ser)4 또는 (Gly4Ser)3이다.
L은 바람직하게는 글리신 및/또는 세린를 포함하는, 가요성 링커이다. 몇몇 예들에서, L은 SGG, GGS, SGGS, SSGGS, GGGG, SGGGG, GGGGS, SGGGGS, GGGGGS, SGGGGGS, SGGGGG, GSGGGGS, GGGGGGGS, SGGGGGGG, SGGGGGGGS, 또는 SGGGGSGGGGS 바람직하게는 SGG, SGGS, SSGGS, GGGG, SGGGGS, SGGGGGS, SGGGGG, GSGGGGS 또는 SGGGGSGGGGS로부터 선택되는 아미노산 서열이다. 몇몇 예들에서, 세포외 결합 도메인이 L의 몇몇 발생들을 포함할 때, L들은 모두 동일하다. 몇몇 예들에서, 세포외 결합 도메인이 L의 몇몇 발생들을 포함할 때, L들은 동일하지 않다. 몇몇 예들에서, L은 SGGGGS이다. 몇몇 예들에서, 세포외 결합 도메인은 L의 몇몇 예들을 포함하고 L들은 모두 SGGGGS이다.
몇몇 예들에서, 에피토프 1, 에피토프 2 and 에피토프 3은 동일하거나 또는 다르며, 표 7과 같은 아미노산 서열을 갖는 mAb-특이적 에피토프들로부터 선택된다.
바람직한 예들에서, 에피토프 1, 에피토프 2는 동일하거나 다르고, 이브리투모맙(ibritumomab), 티우세탄(tiuxetan), 뮤노모나브(muromonab)-CD3, 토시투모마브(tositumomab), 아브식시마브(abciximab), 바실리시마브(basiliximab), 브렌툭시맙(brentuximab) 베도틴(vedotin), 세툭시맙(cetuximab), 인플릭시맙(infliximab), 리툭시맙(rituximab), 알렘투주맙(alemtuzumab), 베바시주맙(bevacizumab), 세르톨리주맙(certolizumab) 페골(pegol), 다클리주맙(daclizumab), 에쿨리주맙(eculizumab), 에팔리주맙(efalizumab), 젬투주맙(gemtuzumab), 나탈리주맙(natalizumab), 오말리주맙(omalizumab), 팔리비주맙(palivizumab), 라니비주맙(ranibizumab), 토실리주맙(tocilizumab), 트라스투주맙(trastuzumab), 베돌리주맙(vedolizumab), 아달리무맙(adalimumab), 벨리무맙(belimumab), 카나키누맙(canakinumab), 데노수맙(denosumab), 골리무맙(golimumab), 이필리무맙(ipilimumab), 오파투무맙(ofatumumab), 파니투무맙(panitumumab), QBEND-10, alemtuzumab 또는 우스테키누맙(ustekinumab)에 의하여 특이적으로 인식되는 mAb-특이적 에피토프들, 바람직하게는 제한되지 않는 예로서 리툭시맙과 같은, 의학적 용도에 대하여 이미 승인 받은 것들로부터 선택된다.
마지막으로, 본 발명은 세포 표면에서 CD123 CAR들 내 단일클론 항체에 특이적인 적어도 하나의 에피토프에 직접적으로 결합하는 항체를 이용함으로써 CAR를 지닌 것으로 여겨지는 조작된 면역 세포들의 수, 활성화 및/또는 생존이 통제되는, 치료적 방법들을 포함한다.
본 발명은 여기에 개시된 CD123 특이적 CAR 중 어느 하나, 바람직하게는 하기 서열들 서열번호 188 내지 서열번호 197 중 하나를 개별적으로 발현시키는 조작된 면역 세포 (TCR KO 및/또는 dck KO)를 개시하는 예를 포함한다.
본 발명은 앞서 개시된 CD123 특이적 CAR 의 어느 (각각의) 하나를 개별적으로 발현시키는 조작된 면역 세포 (TCR KO 및/또는 dck KO)의 제조를 가능하게 하는 코드하는 벡터들을 개시하는 예를 포함한다. 특히 본 발명은, 바람직하게는 백본을 포함하는, 상기 CD123 특이적 CAR 공개의 (각각)의 하나를 코드하는 벡터들을 개시하는 예를 포함한다.
본 발명은 상기 CD123 특이적 CAR 개시들 중 어느 (각각의) 하나를 개별적으로, 바람직하게는 하기 서열들 서열번호 188 to 서열번호 197 중 하나를, 발현시키는 조작된 면역 세포 (TCR KO 및/또는 dck KO)의 제조를 가능하게 하는 코드하는 벡터들을 개시하는 예를 포함한다.
본 발명은 약학적으로 허용가능한 비히클(vehicle) 및 상기 CD123 특이적 CAR 개시들 중 어느 (각각의) 하나를 개별적으로 발현시키는 조작된 면역 세포 (TCR KO 및/또는 dck KO)을 포함하는 약학적 조성물을 개시하는 예를 포함한다.
본 발명은 의약으로서의 사용을 위한 약학적으로 허용가능한 비히클(vehicle) 및 상기 CD123 특이적 CAR 개시들 중 어느 (각각의) 하나를 개별적으로 발현시키는 조작된 면역 세포 (TCR KO 및/또는 dck KO)을 포함하는 약학적 조성물을 개시하는 예를 포함한다.
본 발명은 의약으로서의 사용을 위한 약학적으로 허용가능한 비히클 및 상기 CD123 특이적 CAR 개시들 중 어느 (각각의) 하나를 개별적으로 발현시키는 104부터 내지 1010 /kg부터 사이의 조작된 면역 세포들 (TCR KO 및/또는 dck KO)를 포함하는 약학적 조성물을 개시하는 예를 포함한다.
본 발명은 도 2에 나타난 대로, 그리고 상기 기재된 대로, 폴리펩타이드 구조체 V3를 갖는 특이적 CD123 CAR를 발현시키는 조작된 면역 세포 (TCR KO 및/또는 dck KO)를 개시하고, 이때 상기 CD123 CAR는 서열번호 31과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는다.
본 발명은 도 2에 나타난 대로, 그리고 상기 기재된 대로, 폴리펩타이드 구조체 V3를 갖는 특이적 CD123 CAR를 발현시키는 조작된 면역 세포 (TCR KO 및/또는 dck KO)를 개시하고, 이때 상기 CD123 CAR는 서열번호 32와 적어도 80% 서열 동일성을 갖는다.
본 발명은 도 2에 나타난 대로, 그리고 상기 기재된 대로, 폴리펩타이드 구조체 V3를 갖는 특이적 CD123 CAR를 발현시키는 조작된 면역 세포 (TCR KO 및/또는 dck KO)를 개시하고, 이때 상기 CD123 CAR는 서열번호 33과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는다.
본 발명은 도 2에 나타난 대로, 그리고 상기 기재된 대로, 폴리펩타이드 구조체 V3를 갖는 특이적 CD123 CAR를 발현시키는 조작된 면역 세포 (TCR KO 및/또는 dck KO)를 개시하고, 이때 상기 CD123 CAR는 서열번호 160과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는다.
본 발명은 하기 서열들 서열번호 188 내지 서열번호 197 중 하나를 갖는 특이적 CD123 CAR를 발현시키는 조작된 면역 세포 (TCR KO 및/또는 dck KO)를 개시한다.
본 발명은 상기 기재된 대로 CD123 CAR를 발현시키는 조작된 면역 세포 (TCR KO 및/또는 dck KO)를 개시하고, 이때 단일클론 항-CD123 항체로부터의 상기 세포외 리간드 결합-도메인 VH 및 VL은 하기 서열들 중 적어도 하나를 각각 포함한다:
Figure pct00009
및 하기 서열들 중 하나:
Figure pct00010
Figure pct00011
본 발명은 상기 기재된 대로 CD123 특이적 CAR를 발현시키는 조작된 면역 세포 (TCR KO 및/또는 dck KO)를 개시하고, 이때 단일클론 항-CD123 항체로부터의 상기 세포외 리간드 결합-도메인 VH 및 VL은 각각 하기 서열들 중 적어도 하나를 포함한다:
Figure pct00012
Figure pct00013
또는 그 조합.
유리하게는, 본 발명은 상기 기재된 대로 CD123 특이적 CAR를 발현시키는 조작된 면역 세포 (TCR KO 및/또는 dck KO)를 개시하고, 이때 단일클론 항-CD123 항체로부터의 상기 세포외 리간드 결합-도메인 VH 및 VL은 각각 하기 서열들 중 적어도 하나를 포함한다:
Figure pct00014
및 하기 서열들 중 적어도 하나:
Figure pct00015
더욱 바람직한 예에서, 본 발명은 (서열번호 172 to 서열번호 187)로부터의 각각 서열을 갖는 CAR를 제공한다:
Figure pct00016
Figure pct00017
또다른 예에서, 본 발명은 하기 CAR를 지닌 것으로 여겨지는 조작된 면역 세포를 제공한다.
Figure pct00018
Figure pct00019
Figure pct00020
본 발명은 전술한 바와 같이, CD123 특이적 CAR를 발현시키는 조작된 면역 세포 (TCR KO 및/또는 dck KO)를 개시하고, 이때 상기 구조체 V3 (도 2 참조)는 CD8 알파 힌지 및 CD8 알파 막관통 도메인를 포함하고, 바람직하게는 CD28 서열은 포함하지 않는다.
본 발명은 전술한 바와 같이, CD123 특이적 CAR를 발현시키는 조작된 면역 세포 (TCR KO 및/또는 dck KO)를 개시하고, 이때 상기 구조체 V3는 CD8 알파 힌지, 4-1BB 세포질 도메인 및 CD8 알파 막관통 도메인을 포함한다.
본 발명은 전술한 바와 같이, CD123 특이적 CAR를 발현시키는 조작된 면역 세포 (TCR KO 및/또는 dck KO)를 개시하고, 이때 상기 구조체 V3은 CD8 알파 힌지 및 4-1BB 막관통 도메인을 포함하고, CD28로부터의 서열은 포함하지 않는다.
본 발명은 전술한 바와 같이 CD123 특이적 CAR를 발현시키고, CD123에 특이적이지 않은 또다른 세포외 리간드 결합 도메인을 더 포함하는 조작된 면역 세포를 개시한다. 바람직한 예에서, CD123에 특이적이지 않은 또다른 세포외 리간드 결합 도메인은 자살 도메인이고, 더욱 바람직하게는 더욱 바람직하게는 특허출원 PA 2015 70044 표 2)에 개시된 어느 하나로서의 자살 도메인이다.
본 발명은 전술한 바와 같은 CD123 특이적 CAR를 발현시키는 조작된 면역 세포 (TCR KO 및/또는 dck KO)를 개시하고, 이때 상기 CD123 특이적 CAR는 G 및 S를 포함하는 링커 Li에 의하여 결합되는, 서열번호 : 161의 적어도 하나, 바람직하게는 적어도 두 개의 서열번호 : 161을 포함하는 자살 도메인을 포함한다.
한 예에서, 상기 자살 도메인은 본 발명의 CD123 CAR의 힌지 도메인 내로 통합된다. 하나의 더 많은 바람직한 예에서, 본 발명은 서열번호 : 160과 적어도 95% 동일성을 갖거나 또는 서열번호 : 160의 CD123 CAR를 제공한다.
그 전체가 참조로서 여기에 통합되는 특허 출원 PA201570044의 표 2에 기재된 것들로서 다른 자살 도메인들은 본 발명에 적합하다.
본 발명은 상기와 같은 조작된 면역 세포를 개시하며, 이때 적어도 하나의 MHC 단백질, 바람직하게는 β2m 또는 HLA의 발현이 상기 조작된 면역 세포에서 억제된다. β2m은 베타 2 마이크로글로불린을 나타내고, HLA은 인간 백혈구(leukocyte) 항원을 나타낸다. MHC 단백질은 클래스 I 또는 클래스 II의 MHC 단백질이다.
본 발명은 상기와 같은 조작된 면역 세포를 개시하며, 이때 상기 조작된 면역 세포는 적어도 하나의 면역 억제 약물, 화학요법 약물, 또는 항-암 약물에 대한, 바람직하게는 퓨린 유사체들(analogs)에 대한 내성(resistance)를 부여하도록 조작된다.
본 발명은 약학적으로 허용가능한 비히클 및 전술한 바와 같이 CD123 특이적 CAR를 발현시키는 조작된 면역 세포 (TCR KO 및/또는 dck KO) 중 어느 하나를 포함하는 조성물을 개시한다.
본 발명은 약학적으로 허용가능한 비히클 및 전술한 바와 같은 CD123 특이적 CAR를 발현시키는 조작된 면역 세포 (TCR KO 및/또는 dck KO) 중 어느 하나 및 또다른 약물, 바람직하게는 퓨린 유사체들 및 더욱 바람직하게는 FLAG 처리를 포함하는 조성물을 개시한다.
본 발명에 따른 퓨린 유사체들의 예들은 펜토스타틴(pentostatin), 플루다라빈(fludarabine) 2-디옥시아데노신(deoxyadenosine), 클라드리빈(cladribine), 클로파라빈(clofarabine), 넬라라빈(Nelarabine), 바람직하게는 펜토스타틴, 플루다라빈 모노포스페이트, 및 2-클로로디옥시아데노신(chlorodeoxyadenosine) (2-CDA)일 수 있다.
본 발명의 CD123 T 세포들과 관련될 수 있는 FLAG 치료들의 예들은 하기와 같다: 첨가들 없는 표준 FLAG, FLAG-IDA, Mito-FLAG, FLAMSA.
본 발명에 따른 FLAG 치료의 예는
첨가들 없는 표준 FLAG
Figure pct00021
FLAG-IDA
Figure pct00022
Mito-FLAG
Figure pct00023
FLAMSA
Figure pct00024
일 수 있다.
하기 조합 치료들이 여기에 개시된다:
본 발명은 전술한 어느 하나와 같은 조작된 면역 세포, 치료에의 사용을 위한 전술한 바와 같은 상기 조작된 면역 세포를 포함하는 조성물을 개시한다.
본 발명은 본 발명의 조작된 면역 세포, 상기와 같은 치료에의 사용을 위한, 전술한 바와 같은 상기 조작된 면역 세포를 포함하는 조성물을 개시하고, 이때 환자는 인간이다.
본 발명은 조작된 면역 세포, 상기와 같은 치료에의 사용을 위한, 전술한 바와 같은 상기 조작된 면역 세포를 포함하는 조성물을 개시하고, 이때 질환은 전암 또는 CD123-발현시키는 세포들에 의하여 특징되는 악성 암 질환이다.
본 발명은 조작된 면역 세포, 상기와 같은 치료에의 사용을 위한, 전술한 바와 같은 상기 조작된 면역 세포를 포함하는 조성물을 개시하고, 이때 질환은 CD123-발현시키는 세포들의 과잉에 의하여 특징되는 질환이다.
본 발명은 조작된 면역 세포, 상기와 같은 치료에의 사용을 위한, 전술한 바와 같은 상기 조작된 면역 세포를 포함하는 조성물을 개시하고, 이때 악성 암 질환은 혈액 암 질환이다.
본 발명은 조작된 면역 세포, 상기와 같은 치료에의 사용을 위한, 전술한 바와 같은 상기 조작된 면역 세포를 포함하는 조성물을 개시하고, 이때 혈액 암 질환은 백혈병 또는 악성 림프구증식성 장애들이다.
본 발명은 조작된 면역 세포, 상기와 같은 치료에의 사용을 위한, 전술한 바와 같은 상기 조작된 면역 세포를 포함하는 조성물을 개시하고, 이때 상기 백혈병은 급성 골수성 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 골수형성이상(myelodysplastic) 증후군, 급성 림프성 백혈병, 만성 림프성 백혈병, 및 골수형성이상(myelodysplastic) 증후군로 구성되는 군으로부터 선택된다.
본 발명은 조작된 면역 세포, 상기와 같은 치료에의 사용을 위한, 전술한 바와 같은 상기 조작된 면역 세포를 포함하는 조성물을 개시하고, 이때 백혈병은 급성 골수성 백혈병 (AML), 바람직하게는 난치성/재발된 AML이다.
한 예에서, 본 발명은 조작된 면역 세포, 상기와 같은 치료에의 사용을 위한, 전술한 바와 같은 상기 조작된 면역 세포를 포함하는 조성물을 개시하고, 이때 상기 혈액 암은 악성 림프구증식성 장애이다.
본 발명은 상기와 같은 치료에의 사용을 위한 조작된 면역 세포를 개시하고, 이때 상기 악성 림프구증식성 장애는 림프종이다.
본 발명은 상기와 같은 치료에의 사용을 위한 조작된 면역 세포를 개시하고, 이때 상기 림프종은 다발성(multiple) 골수종(myeloma), 비(non)-호지킨(Hodgkin) 림프종, 버킷(Burkitt) 림프종, 및 여포성(follicular) 림프종 (작은 세포 및 큰 세포)으로 구성되는 군으로부터 선택된다.
AML, 바람직하게는 난치성이고 재발된 AML의 치료에의 사용을 위한, 첨가 없는 FLAG 치료와 조합하여, 104 부터 108 까지 세포들/kg의, 본 발명의 TCR KO 및 dck KO T 세포들에서 발현된 서열번호 31 또는 서열번호 32 또는 서열번호 160의 CD123 CAR.
BPDCN의 치료에의 사용을 위한, 첨가 없는 FLAG 치료와 조합한, 104 부터 108 까지 세포들/kg의, 본 발명의 TCR KO 및 dck KO T 세포들에서 발현되는 서열번호 31 또는 서열번호 32 또는 서열번호 160의 CD123 CAR.
이식의 브릿지로서 골수 이식 전 치료로서 사용을 위한 첨가가 없는 FLAG 치료와 조합인, 104 부터 108 까지 세포들/kg의, 본 발명의 TCR KO 및 dck KO T 세포들에서 발현되는 서열번호 31 또는 서열번호 32 또는 서열번호 160의 CD123 CAR.
AML, 바람직하게는 난치성이고 재발된 AML의 치료에의 사용을 위한, (20 mg/kg 부터 50 mg/kg까지의) 플루다라빈과의 조합인, 104 부터 108 까지 세포들/kg의, 본 발명의 TCR KO 및 dck KO T 세포들에서 발현되는 서열번호 31 또는 서열번호 32 또는 서열번호 160의 CD123 CAR.
BPDCN의 치료에의 사용을 위한 (20 mg/kg 부터 50 mg/kg까지의) 플루다라빈과의 조합으로, (104 부터 108 까지 세포들/kg), 본 발명의 TCR KO 및 dck KO T 세포들에서 발현되는 서열번호 31 또는 서열번호 32 또는 서열번호 160의 CD123 CAR.
이식의 브릿지(bridge)로서 골수 이식 전 치료로서 사용을 위한, (20 mg/kg 부터 50 mg/kg까지의) 플루다라빈과의 조합으로, (104 부터 108 까지 세포들/kg), 본 발명의 TCR KO 및 dck KO T 세포들에서 발현되는 서열번호 31 또는 서열번호 32 또는 서열번호 160의 CD123 CAR.
본 발명은 상기 암 세포 (104 부터 108 까지 세포들/kg)의 손상을 야기하기에 충분한 양으로 본 발명에 따른 조작된 세포와 상기 혈액 암 세포를 접촉시키는 단계를 포함하는 혈액 암 세포를 손상시키는 방법을 개시한다.
본 발명은:
1. 기증자로부터 면역 세포를 제공하는 단계,
2. TCR 유전자를 넉아웃시키는 단계,
3. 상기의 것들 중 어느 하나로서 본 발명에 따른 CD123 특이적 키메라 항원 수용체에서 상기 세포의 표면에서 발현시키는 단계
를 포함하는 면역 세포의 조작 방법을 개시한다.
기증자는 그 자신이 암으로 고통받는 환자 (자가조직유래(autologous) 입양(adoptive) 이동(transfer) 또는 또다른 개인 (동종이계(allogenic) T 세포들의 입양 이동)일 수 있다.
본 발명은:
1. 기증자로부터 면역 세포를 제공하는 단계,
2. TCR 유전자, 및 dck 유전자를 넉아웃시키는 단계
3. 상기 CD123 특이적 키메라 항원 수용체를 코드하는 적어도 하나의 폴리뉴클레오타이드를 상기 세포 내에 도입시킴으로써 상기의 것들 중 어느 하나에 따른 CD123 특이적 키메라 항원 수용체를 상기 세포의 표면에서 발현시키는 단계
를 포함하는 상기와 같은 면역 세포를 조작하는 방법을 개시한다.
더 바람직한 예에서, 상기 방법은 세포 표면에서 자살 도메인을 발현시키는 단계를 포함한다.
본 발명은:
1. 면역 세포를 제공하는 단계,
2. dck 유전자 및 서열번호 : 16 및 서열번호 : 17의 반(half) TALE -뉴클레아제(nuclease) TALEN을 이용하여 TCR 유전자를 넉아웃시키는 단계
3. 상기 CD123 특이적 키메라 항원 수용체를 코드하는 상기 세포 적어도 하나의 폴리뉴클레오타이드를 상기 세포 내로 통합시킴으로써 상기에 따른 CD123 특이적 키메라 항원 수용체 중 어느 하나를 상기 세포의 표면에서 발현시키는 단계
를 포함하는 상기와 같은 면역 세포를 조작하는 방법을 개시한다.
바람직한 예에서, 상기 방법은 자살 도메인, 바람직하게는 하기 항체들 이브리투모맙(ibritumomab), 티우세탄(tiuxetan), 뮤노모나브(muromonab)-CD3, 토시투모마브(tositumomab), 아브식시마브(abciximab), 바실리시마브(basiliximab), 브렌툭시맙(brentuximab) 베도틴(vedotin), 세툭시맙(cetuximab), 인플릭시맙(infliximab), 리툭시맙(rituximab), 알렘투주맙(alemtuzumab), 베바시주맙(bevacizumab), 세르톨리주맙(certolizumab) 페골(pegol), 다클리주맙(daclizumab), 에쿨리주맙(eculizumab), 에팔리주맙(efalizumab), 젬투주맙(gemtuzumab), 나탈리주맙(natalizumab), 오말리주맙(omalizumab), 팔리비주맙(palivizumab), 라니비주맙(ranibizumab), 토실리주맙(tocilizumab), 트라스투주맙(trastuzumab), 베돌리주맙(vedolizumab), 아달리무맙(adalimumab), 벨리무맙(belimumab), 카나키누맙(canakinumab), 데노수맙(denosumab), 골리무맙(golimumab), 이필리무맙(ipilimumab), 오파투무맙(ofatumumab), 파니투무맙(panitumumab), QBEND-10, 및 우스테키누맙(ustekinumab) 중 하나에 의하여 인식되는 자살 도메인을 세포 표면에서 발현시키는 단계를 포함한다.
또다른 예에서, 상기 방법은 이브리투모맙(ibritumomab), 티우세탄(tiuxetan), 뮤노모나브(muromonab)-CD3, 토시투모마브(tositumomab), 아브식시마브(abciximab), 바실리시마브(basiliximab), 브렌툭시맙(brentuximab) 베도틴(vedotin), 세툭시맙(cetuximab), 인플릭시맙(infliximab), 리툭시맙(rituximab), 알렘투주맙(alemtuzumab), 베바시주맙(bevacizumab), 세르톨리주맙(certolizumab) 페골(pegol), 다클리주맙(daclizumab), 에쿨리주맙(eculizumab), 에팔리주맙(efalizumab), 젬투주맙(gemtuzumab), 나탈리주맙(natalizumab), 오말리주맙(omalizumab), 팔리비주맙(palivizumab), 라니비주맙(ranibizumab), 토실리주맙(tocilizumab), 트라스투주맙(trastuzumab), 베돌리주맙(vedolizumab), 아달리무맙(adalimumab), 벨리무맙(belimumab), 카나키누맙(canakinumab), 데노수맙(denosumab), 골리무맙(golimumab), 이필리무맙(ipilimumab), 오파투무맙(ofatumumab), 파니투무맙(panitumumab), QBEND-10, 및 우스테키누맙(ustekinumab)으로부터 선택되는 여기에 개시된 것들로서 특이적 단일클론 항원에 본 발명의 상기 조작된 면역 세포를 결합시키는 단계를 더 포함한다.
본 발명은:
1. 상기의 것 중 어느 하나에 따른 CD123 특이적 키메라 항원 수용체를 표면에서 발현시키는 면역 세포 또는 그것을 포함하는 조성물을 제공하는 단계
2. 상기 면역 세포들을 상기 환자에게 투여하는 단계
를 포함하는, 그것을 필요로 하는 대상의 치료 방법을 개시한다. 바람직한 예에서, 상기 조성물은 퓨린 유사체, 플루다라빈을 더 포함한다.
또다른 예에서, 상기 조성물은 FLAG 치료, 첨가 없는 FLAG 치료와 관련된다.
한 예에서, 그것을 필요로 하는 상기 대상은 AML, 바람직하게는 난치성이고 재발된 AML, BPDNL으로 고통받고, 또는 골수 이식을 받아야 한다.
본 발명은 상기와 같은 그것을 필요로 하는 대상을 치료하는 방법을 개시하고, 이때 면역 세포는 기증자로부터 제공된다.
본 발명은 상기와 같은 그것을 필요로 하는 대상을 치료하는 방법을 개시하고, 이때 면역 세포는 환자 자신으로부터 제공된다.
CD123 특이적 키메라 항원 수용체들
본 발명은 KLON 43 항체로부터 또는 그로부터 유래되는 세포외 리간드-결합 도메인체, CD8 알파로부터의 막관통 도메인, CD8 알파로부터 또는 FcγRIIIα로부터의 힌지, 자살 도메인 및 신호전달(signaling) 전달(transducing) 도메인을 포함하는 신규 항-CD123 키메라 항원 수용체 (CAR)에 대한 것이다. 바람직한 예에서, 상기 자살 도메인은 힌지 도메인 내로 통합된다. 더 바람직한 예에서, 상기 자살 도메인은 힌지 도메인 내로 통합된 서열번호 161의 적어도 두 개의 서열들을 포함한다.
바람직한 예에서, 본 발명의 상기 항-CD123 CAR는 서열번호 : 31, 32, 또는 160의 폴리펩타이드이다,
또다른 예Dp서, 본 발명의 상기 항-CD123 CAR는 서열번호 : 34 내지 서열번호 : 159, 서열번호 : 34 내지 서열번호 : 117, 서열번호 : 76 내지 서열번호 : 117의 폴리펩타이드이다,
여기에서 사용된 대로 용어 "세포외 리간드-결합 도메인"은 CD123에 결합할 수 있는 올리고- 또는 폴리펩타이드로 정의된다. 바람직하게는, 세포외 리간드-결합 도메인은 특정 질병 상태와 관련된 타겟 세포들 상에 세포 표면 마커로서 역할을 하는 CD123을 인식하도록 선택될 수 있다. 더 바람직하게는, 세포외 리간드-결합 도메인은 AML, BPDCN 또는 암 상태에 수반되는 CD123-발현시키는 세포와 관련된 타겟 세포들 상에서 세포 표면 마커로서 역할하는 CD123을 인식하도록 선택될 수 있다.
바람직한 예에서, 상기 세포외 리간드-결합 도메인은 가요성 링커에 의하여 연결된 타겟 항원 특이적 단일클론 항 CD-123 항체 KLON 43의 경쇄 (VL) 및 중쇄 (VH) 가변 단편을 포함하는 단일 체인 항체 단편 (scFv)을 포함한다. 상기 VL 및 VH는 바람직하게는 표 1 내지 2에 개시된 서열들로부터, 더욱 바람직하게는 Klon43로부터 또는 이로부터 유래된 VH, 링커 및 VL (표 2에 개시된 인간화된 VH 및 VL)을 포함하는 scfv로부터 선택된다. 그것들은 바람직하게는 서열 (GGGGS)n이고 이때 n=1 to 4, 더욱 바람직하게는 서열번호 10 서열을 포함하는, n=3인 가요성 링커에 의하여 서로 연결된다. 다시 말해서, 상기 CAR들은 우선적으로 VH에 대하여 서열번호 : 12 그리고 VL에 대하여 서열번호 : 11 그리고 인간화된 단편들에 대하여 서열번호 : 18 to 서열번호 : 30으로 구성되는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열(표 2 참조)과 100 % 동일성을 갖는 폴리펩타이드 서열을 포함하는 세포외 리간드-결합 도메인을 포함한다.
여기에서 사용된 대로 "재조합 항체" 용어에 의하여, 예컨대, 박테리오파지, 효모 발현 시스템 또는 포유류 세포 발현 시스템에 의하여 발현되는 항체 또는 항체 단편과 같은, 재조합 DNA 기술을 이용하여 만들어지는 항체 또는 항체 단편이 의미된다. 용어는 또한 항체 또는 항체 단편을 코드하는 DNA 분자의 합성에 의하여 만들어지고 DNA 분자가 항체 또는 항체 단편를 특정하는 아미노산 서열, 또는 항체 단편 단백질 또는 항체를 발현시키는 항체 또는 항체 단편을 의미하고, 이를 의미하는 것으로 해석되어야 하며, 이때 DNA 또는 아미노산 서열은 당업계에서 잘 알려지고 이용가능한 재조합 또는 합성 DNA 또는 아미노산 서열 기술을 이용하여 수득된다.
여기에서 사용되는 대로, 용어 "보존적 서열 변형들" 또는 "인간화" 또는 "인간화된 항체" 또는 "인간화된 항체 단편", "인간화된 VH 또는 인간화된 VL"은 인간 항-마우스 항체 (HAMA) 반응을 감소시키거나 또는 없애고 변형된 아미노산 서열을 포함하는 CAR의 활성에 상당히 영향을 미치지 않는 그리고/또는 CAR의 결합 특성을 상당히 바꾸거나 영향을 미치지 않는 아미노산 변형들을 가리키는 것으로 의도된다.
바람직한 예에서, 아미노산 변형들은 인간 항-마우스 항체 (HAMA) 반응을 감소시키거나 또는 없애고 변형된 아미노산 서열을 포함하는 CAR의 활성을 상당히 개선시키고 그리고/또는 CAR의 결합 특성을 상당히 개선시킨다.
이러한 보존적 변형들은 상기 CAR 내 상기 항체 단편 및/또는 상기 CAR 분자의 임의의 다른 부분들에서 아미노산 치환들, 첨가들 및 결실들을 포함한다. 변형들은 부위-지향성 돌연변이유발, PCR-매개 돌연변이유발 또는 최적화된 생식세포(germline) 서열들을 이용하는 것과 같은, 당업계에 알려진 표준 기술에 의하여, 항체 내로, 항체 단편 또는 본 발명의 CAR 분자의 임의의 다른 부분으로 도입될 수 있다.
보존적 아미노산 치환들은 그 아미노산 잔기가 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기로 대체되는 것들이다. 유사한 측쇄들을 갖는 아미노산 잔기들의 패밀리들은 당업계에 정의되어 왔다. 이들 패밀리들은 염기성 측쇄들 (예컨대, 라이신, 알기닌, 히스티딘), 산성 측쇄들 (예컨대, 아스파르트산, 글루탐산), 전하를 띠지 않은 극성 측쇄들 (예컨대, 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 티로신, 시스테인, 트립토판), 비극성 측쇄들 (예컨대, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌), 베타-가지달린 측쇄들 (예컨대, 트레오닌, 발린, 이소류신) 및 방향족 측쇄들 (예컨대, 티로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘)을 갖는 아미노산들을 포함한다. 이와 같이, 본 발명의 CAR 내 하나 이상의 아미노산 잔기들은 동일한 측쇄 패밀리로부터의 다른 아미노산 잔기들로 대체될 수 있고 변화된 CAR는 여기 기재된 기능적 분석들을 이용하여 CD 123에 결합하는 능력에 대하여 시험될 수 있다.
한 예에서, 상기 scfv는 단일클론 항체에 결합하는, 적어도 하나, 바람직하게는 두 개의 에피토프들을 포함한다. 이러한 에피토프들의 예들은 표 7에 개시된다.
본 발명에 따른 CAR의 신호 전달 도메인 또는 세포내 신호전달(signaling) 도메인은 세포외 리간드 결합 도메인의 타겟에의 결합 후 세포내 신호전달(signaling)의 원인이 되며, 그 결과 면역 세포 및 면역 반응의 활성화를 야기한다. 다시 말해서, 신호 전달 도메인은 CAR가 발현되는 면역 세포의 정상적인 효과기 기능들 중 적어도 하나의 활성화의 원인이 된다. 예를 들어, T 세포의 효과기 기능은 사이토카인의 분비를 포함하는 헬퍼 활성 또는 세포용해 활성일 수 있다. 이런 식으로, 용어 "신호(signal) 전달(transducing) 도메인"은 전문화된 기능을 수행하기 위하여 세포를 향하게 하고 효과기 신호 기능에 신호를 전달하는 단백질의 부분을 가리킨다.
CAR에서 사용을 위한 신호 전달 도메인의 바람직한 예들은 동일한 기능적 능력을 갖는 임의의 합성 서열 및 이들 서열들의 임의의 유도체 또는 변종과 더불어, 항원 수용체 이용(engagement) 후 신호 전달을 개시하기 위하여 일제히 작용하는 공-수용체들 및 T 세포 수용체의 세포질 서열들일 수 있다. 신호 전달 도메인은 세포질 신호전달(signaling) 서열의 두 개의 구별되는 종류들, 항원-의존적 일차(primary) 활성화를 개시하는 것들, 및 이차 또는 공-자극 신호를 제공하기 위하여 항원-독립적 방식으로 작용하는 것들을 포함한다. 일차 세포질 신호전달(signaling) 서열은 ITAM들의 면역수용체 티로신-기반의 활성화 모티프들로서 알려진 신호전달(signaling) 모티프들을 포함할 수 있다. ITAM들은 syk/zap70 클래스 티로신 키나제들을 위한 결합 부위들로서 작용하는 여러가지 수용체들의 세포질내 꼬리에서 발견되는 잘 정의된 신호전달(signaling) 모티프들이다. 본 발명에서 사용된 ITAM의 예들은 제한되지 않는 예들로서 TCR제타, FcR감마, FcR베타, FcR엡실론, CD3감마, CD3델타, CD3엡실론, CD5, CD22, CD79a, CD79b 및 CD66d로부터 유래한 것들을 포함한다. 바람직한 예에서, CAR의 신호전달(signaling) 전달(transducing) 도메인은 서열번호 : 9로 구성되는 군으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 70%, 바람직하게는 적어도 80%, 더욱 바람직하게는 적어도 90 %, 95 % 97 % 또는 99 % 또는 100 % 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 CD3제타 신호전달(signaling) 도메인을 포함할 수 있다.
특정 예에서, 본 발명의 CAR의 신호 전달 도메인은 공-자극 신호 분자를 포함한다. 공-자극 분자는 항원 수용체 외 세포 표면 분자 또는 효과적인 면역 반응에 요구되는 그것들의 리간드들이다. "공-자극 리간드"는 T-세포 상 동계(cognate) 공-자극 분자에 특이적으로 결합하여, 이로써, 예컨대, 펩타이드와 로딩(load)되는 MHC 분자와 TCR/CD3 복합체의 결합에 의하여, 제공되는 일차 신호에 추가하여, 증식 활성화, 분화 등을 포함하나 이에 제한되지 않는 T 세포 반응을 매개하는 신호를 제공하는, 항원 제시 세포 상 분자를 가리킨다. 공-자극 리간드는 CD7, B7-1 (CD80), B7-2 (CD86), PD-L1, PD-L2, 4-1BBL, OX40L, 유도성(inducible) 공자극(costimulatory) 리간드 (ICOS-L), 세포내(intercellular) 부착(adhesion) 분자 (ICAM, CD30L, CD40, CD70, CD83, HLA-G, MICA, M1CB, HVEM, 림포톡신 베타 수용체, 3/TR6, ILT3, ILT4, 작용제 또는 톨(Toll) 리간드 수용체에 결합하는 항체 및 B7-H3에 특이적으로 결합하는 리간드를 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 공-자극 리간드는 또한 그 중에서도, CD27, CD28, 4-1BB, OX40, CD30, CD40, PD-1, ICOS, 림프구(lymphocyte) 기능(function)-관련(associated) 항원-1 (LFA-1), CD2, CD7, LTGHT, NKG2C, B7-H3, CD83에 특이적으로 결합하는 리간드와 같은, T 세포 상에 존재하는 공-자극 분자와 특이적으로 결합하는 항체를 포함한다. "공-자극 분자"는 공-자극 리간드에 특이적으로 결합하여, 이로써 증식과 같은, 그러나 이에 제한되지 않는, 세포에 의한 공-자극 반응을 매개하는 T-세포 상 동계(cognate) 결합 파트너를 가리킨다. 공-자극 분자들은 MHC 클래스 I 분자, BTLA 및 Toll 리간드 수용체를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 공자극 분자들의 예들은 CD27, CD28, CD8, 4-1BB (CD137), OX40, CD30, CD40, PD-1, ICOS, 림프구 기능-관련 항원-1 (LFA-1), CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3 및 CD83에 특이적으로 결합하는 리간들를 포함한다.
한 예에서, 본 발명의 CAR의 신호 전달 도메인, 특히 공-자극 분자들은 CD28 (NP_006130.1)를 포함하지 않는다.
하나의 바람직한 예에서, 본 발명의 CAR는 임의의 다른 CD28 및/또는 인간 CD28의 서열 (NP_006130.1)을 포함하지 않는다.
또다른 바람직한 예에서, 본 발명의 CAR의 신호 전달 도메인은 4-1BB의 단편들로 구성된 군으로부터 선택된 공-자극 신호 분자의 부분을 포함한다 (GenBank: AAA53133.). 특히 본 발명의 CAR의 신호 전달 도메인은 서열번호 : 8로 구성되는 군으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 70%, 바람직하게는 적어도 80%, 더욱 바람직하게는 적어도 90 %, 95 % 97 % 또는 99 % 서열 동일성을 포함하는 아미노산 서열을 포함한다.
본 발명에 따른 CAR는 세포의 표면 막 상에 발현된다. 이와 같이, 이런 CAR는 막관통 도메인을 더 포함한다. 적합한 막관통 도메인들의 구별되는 특징들은 세포, 바람직하게는 본 발명에서, 면역 세포, 특히 림프구 세포들 또는 자연 살해 (NK) 세포들의 표면에서 발현되는, 그리고 미리 정해진 타겟 세포에 대항하여 면역 세포의 세포 반응을 향하도록 서로 상호작용하는, 능력을 포함한다. 막관통 도메인은 합성 소스로부터 또는 자연으로부터 유래될 수 있다. 막관통 도메인은 임의의 막-결합 또는 막관통 단백질로부터 유래될 수 있다. 제한되지 않는 예들로서, 막관통 폴리펩타이드는 Fc 수용체들, 특히 Fcγ 수용체 III 또는 CD 단백질들의 CD3 복합체, IL2 수용체 p55 (α 체인), p75 (β 체인) 또는 γ 체인, 서브유닛 체인으로 이루어지는 α, β, γ 또는 δ, 폴리펩타이드와 같은 T-세포 수용체의 서브유닛일 수 있다. 대체하여 막관통 도메인은 합성일 수 있고 대부분 류신 및 발린과 같은 소수성 잔기들을 포함할 수 있다.
바람직한 예에서, 상기 막관통 도메인 (TM)은 인간 CD8 알파 체인 (예컨대 NP_001139345.1), IgG1, IgG4, FcγRIIIα로부터 유래된다.
더 바람직한 예에서, 상기 TM 도메인은 서열번호 6의 부분 또는 서열을 포함한다. 본 발명에 따른 CD123 CAR는 일반적으로 서열번호 6의 폴리펩타이드들과 적어도 90 %, 91%, 92%, 93%, 94%, 95 %, 96%, 97 %, 98%, 99 % 또는 100% 동일성을 보이는, CD8α로부터의 막관통 도메인 (TM)을 더 포함한다.
한 예에서, 본 발명의 CD123 CAR는 바람직하게는 서열 IISFFLALTSTALLFLLFFLTLRFSVV (서열번호 7)의, 4-1BB로부터의 TM 도메인을 포함하지 않는다.
본 발명에 따른 CAR는 상기 세포외 리간드-결합 도메인 및 상기 막관통 도메인 사이의 힌지 영역을 포함한다. 여기에서 사용된 용어 "힌지 영역"은 보통 세포외 리간드-결합 도메인에 막관통 도메인을 연결하는 기능을 하는 임의의 올리고- 또는 폴리펩타이드를 의미한다. 특히, 힌지 영역은 세포외 리간드-결합 도메인에 대한 더 많은 가요성(flexibility) 및 접근성을 제공하는데 사용된다. 힌지 영역은 300 아미노산들까지, 바람직하게는 10 내지 100 아미노산들 그리고 가장 바람직하게는 25 내지 50 아미노산들을 포함할 수 있다. 힌지 영역은 CD8, CD4 또는 CD28의 세포외 영역의 전부 또는 일부, 또는 항체 불변 영역의 전부 또는 일부와 같은, 자연적으로 발생하는 분자들의 전부 또는 일부로부터 유래될 수 있다.
한 예에서, 상기 힌지 영역은 표 7에 개시된 대로, 단일클론 항체에 의하여 인식되는 적어도 하나의 에피토프들을 포함한다.
한 예에서, 상기 힌지 영역은 서열번호 161의 적어도 두 서열들을 포함하며, 바람직하게는 서열번호 171의 것이다.
한 예에서, 본 발명의 상기 CD123 CAR는 scfv에서 서열번호 161의 적어도 하나의 서열을 포함한다.
한 예에서, 본 발명의 상기 CD123 CAR는 바람직하게는 scfv의 N-말단(terminal end)에서, scfv에서 서열번호 169의 서열 및 서열번호 161의 두 서열들을 포함한다.
대체하여, 힌지 영역은 자연적으로 발생하는 힌지 서열에 상응하는 합성 서열일 수 있고, 또는 완전히 합성 힌지 서열일 수 있다. 바람직한 예에서, 상기 힌지 도메인은 이 명세서에서 서열번호 3, 서열번호 4 및 서열번호 5로 각각 언급되는 인간 CD8 알파 체인, FcγRIIIα 수용체 또는 IgG1의 부분, 또는 이들 폴리펩타이드들과 바람직하게는 적어도 80%, 더욱 바람직하게는 적어도 90 %, 95 % 97 % 또는 99 % 서열 동일성을 보이는 힌지 폴리펩타이드들을 포함한다.
더 바람직한 예에서, 상기 힌지 도메인은 인간 CD8 알파 체인의, 또는 FcγRIIIα 수용체의 부분을 포함하고, 더욱 바람직하게는 상기 힌지 도메인은 서열번호 3 또는 of 서열번호 4의 서열 또는 서열번호 3 또는 서열번호 4와 적어도 80%, 더욱 바람직하게는 적어도 90 %, 95 % 97 % 또는 99 % 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다.
다른 추가적 scfv
타겟 항원들의 하향조절 또는 돌연변이는 보통 항원-상실 탈출(escape) 변종들을 만들어내는, 암 세포들에서 관찰된다. 이런 식으로, 종양 탈출을 상쇄하고, 면역 세포를 타겟에 더욱 특이적으로 만들기 위하여, 본 발명에 따른 CD123 특이적 CAR는, 타겟에서 다른 요소들에 동시에 결합하여, 이로써 면역 세포 활성화 및 기능을 증대시키기 위하여, 또다른 세포외 리간드-결합 도메인들을 포함할 수 있다. 한 예에서, 세포외 리간드-결합 도메인들은 동일한 막관통 폴리펩타이드 상에 나란히 위치할 수 있고, 그리고 선택적으로 링커에 의하여 분리될 수 있다. 또다른 예에서, 상기 다른 세포외 리간드-결합 도메인들을 CAR을 포함하는 다른 막관통 폴리펩타이드들 상에 위치될 수 있다. 또다른 예에서, 본 발명은 각각 하나의 다른 세포외 리간드 결합 도메인들을 포함하는 CAR들의 군에 대한 것이다. 특히, 본 발명은 면역 세포를 제공하는 단계 및 각각 하나가 다른 세포외 리간드 결합 도메인들을 포함하는 CAR의 군을 상기 세포의 표면에 발현시키는 단계를 포함하는 면역 세포들을 조작하는 방법에 대한 것이다. 또다른 특정 예에서, 본 발명은 면역 세포를 제공하는 단계 및 각각 하나가 다른 세포외 리간드 결합 도메인들을 포함하는 CAR의 군을 이루는 폴리펩타이드들을 코드하는 폴리뉴클레오타이드들을 상기 세포 내로 도입하는 단계를 포함하는 면역 세포들을 조작하는 방법에 대한 것이다. CAR들의 군(population)에 의하여, 각각 하나가 다른 세포외 리간드 결합 도메인들을 포함하는 적어도 둘, 셋, 넷, 다섯, 여섯 또는 그보다 많은 CAR들이 의미된다. 본 발명에 따른 다른 세포외 리간드 결합 도메인들은 바람직하게는 타겟인 다른 요소들에 바람직하게는 동시에 결합하여, 이로써 면역 세포 활성화 및 기능을 증가시킬 수 있다.
본 발명은 또한 각각 하나가 다른 세포외 리간드 결합 도메인들을 포함하는 CAR들의 군을 포함하는 단리된 면역 세포에 대한 것이다.
바람직한 예에서, 본 발명에 따른 CD123 CAR는 서열번호 31의 폴리펩타이드 또는 서열번호 32의 폴리펩타이드를 포함하고 더욱 바람직하게는 본 발명에 따른 CD123 CAR는 서열번호 31과 적어도 80% 동일성, 바람직하게는 80% 내지 99% 동일성을 갖는 폴리펩타이드 또는 서열번호 32와 80 내지 99% 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 더욱 더 바람직하게는 본 발명에 따른 CAR는 서열번호 31의 폴리펩타이드와 또는 서열번호 32와 85 내지 99% 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다.
바람직한 예에서, 본 발명에 따른 CD123 CAR는 하기 서열들 서열번호 31을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다.
바람직한 예에서, 본 발명에 따른 CD123 CAR는 서열번호 32, 서열번호 31 및 서열번호 160으로부터 선택되는 하기 서열을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다.
하나의 바람직한 예에서, 본 발명에 따른 CAR는 하기 서열들로부터 선택되는 적어도 하나의 폴리펩타이드를 포함한다:
Figure pct00025
및 하기 서열들로부터 선택되는 적어도 하나의 서열
Figure pct00026
한 예에서, 본 발명에 따른 CD123 CAR는 하기 서열들: 서열번호 24, 서열번호 25, 서열번호 26, 서열번호 27, 서열번호 28, 서열번호 29, 및 서열번호 30로부터 선택되는 하나의 폴리펩타이드 및 하기 서열들 : 서열번호 18, 서열번호 19, 서열번호 20, 서열번호 21, 서열번호 22, 및 서열번호 23로부터 선택되는 펩타이드를 포함한다.
한 예에서, 본 발명에 따른 CD123 CAR는 서열번호 11의 폴리펩타이드와 적어도 80 %, 81%, 82%, 83%, 84 %, 85%, 86 %, 87%, 88%, 89%, 90 %, 91%, 92%, 93%, 94%, 95 %, 96%, 97 %, 98%, 또는 99 % 동일성을 갖는, 또는 서열번호 12의 폴리펩타이드와 적어도 80 %, 81%, 82%, 83%, 84 %, 85%, 86 %, 87%, 88%, 89%, 90 %, 91%, 92%, 93%, 94%, 95 %, 96%, 97 %, 98%, 또는 99 % 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다.
더 바람직한 예에서, 본 발명에 따른 CD123 CAR는 서열번호 11+ 서열번호 10 + 서열번호 12와 80 %, 81%, 82%, 83%, 84 %, 85%, 86 %, 87%, 88%, 89%, 90 %, 91%, 92%, 93%, 94%, 95 %, 96%, 97 %, 98%, 또는 99 % 동일성을 포함하는 폴리펩타이드를 포함한다.
본 발명에 따라, 본 발명의 항-CD123 CAR를 발현시키는 면역 세포들은 항-암 면역 반응을 촉발시키고, GVHD가 없거나 또는 감소시키고, FLAG 치료의 퓨린 유사체의 존재 하에서도 증식한다.
바람직한 예에서, 본 발명의 항-CD123 CAR를 지닌 것으로 여겨지는 본 발명의 CAR를 발현시키는 면역 세포들은 인간 항-마우스 항체 (HAMA) 반응을 포함하지 않는 면역 반응을 촉발시킨다.
본 발명에 따라, 본 발명의 조작된 면역 세포의 효과적인 양은 적어도 한번, 단독 또는 또다른 치료와의 조합으로, 그것을 필요로 하는 환자에게 투여될 수 있다.
폴리뉴클레오타이드들 , 벡터들
본 발명은 또한 본 발명에 따른 상기 기재한 CAR를 코드하는 벡터들, 폴리뉴클레오타이드들에 대한 것이다.
폴리뉴클레오타이드는 (예컨대 박테리아 숙주 세포 내로 도입을 위한 플라스미드, 또는 곤충 숙주 세포의 형질주입(transfection)을 위한 배큘로바이러스(baculovirus) 벡터와 같은 바이러스 벡터, 또는 포유류 숙주 세포의 형질주입을 위한 렌티바이러스(lentivirus)와 같은 바이러스 벡터) 발현 벡터 또는 발현 카세트를 포함할 수 있다.
특정 예에서, 다른 핵산 서열들은 2A 펩타이드를 코드하는 서열과 같은 라이보좀 스킵(skip) 서열을 코드하는 핵산 서열을 포함하는 벡터 또는 하나의 폴리뉴클레오타이드에 포함될 수 있다. 피코르나바이러스들(picornaviruses)의 아프토바이러스(Aphthovirus) 서브그룹(subgroup) 내로 확인된 2A 펩타이드들은 코돈들에 의하여 코드되는 두 개의 아미노산들 사이에 펩타이드 결합의 형성 없이 하나의 코돈에서 옆의 것으로 라이보좀 "스킵"을 야기한다 (((Donnelly and Elliott 2001; Atkins, Wills et al. 2007; Doronina, Wu et al. 2008) 참조). "코돈"에 의하여 하나의 아미노산 잔기 내로 라이보좀에 의하여 번역되는 mRNA 상 (또는 DNA 분자의 센스 가닥 상) 세 개의 뉴클레오타이드들이 의미된다. 이런 식으로, 두 개의 폴리펩타이드들이 폴리펩타이드들이 인 프레임(in frame)인 2A 올리고펩타이드 서열에 의하여 분리될 때 mRNA 내 단일의, 인접한 오픈 리딩 프레임으로부터 합성될 수 있다. 이러한 라이보좀 스킵 메커니즘들은 당업계에 잘 알려져 있으며, 단일 메신저 RNA에 의하여 코드되는 몇몇 단백질들의 발현을 위한 몇몇 벡터들에 의하여 사용되는 것으로 알려져 있다.
숙주 세포의 분비 경로 내로 막관통 폴리펩타이드를 향하기 위하여, 분비성 신호 서열(리더 서열, 프리프로(prepro) 서열 또는 프리(pre) 서열로도 알려짐)이 폴리뉴클레오타이드 서열 또는 벡터 서열에서 제공된다. 분비성 신호 서열은 막관통 핵산 서열로 작동적으로 연결되는데, 즉, 두 서열들이 올바른 리딩 프레임에서 연결(join)되고 숙주 세포의 분비성 경로 내로 새로 합성된 폴리펩타이드를 향하게 하기 위하여 위치된다. 분비성 신호 서열들은 특정 분비성 신호 서열들이 관심있는 핵산 서열 내 어디든 위치될 수 있는데도 불구하고, 관심있는 폴리펩타이드를 코드하는 핵산 서열로 5'에 보통 위치된다 (예컨대, Welch et al., U.S. Patent No. 5,037,743; Holland et al., U.S. Patent No. 5,143,830 참조). 선호되는 예에서, 신호 펩타이드는 아미노산 서열 서열번호: 1 및 2 또는 서열번호: 1 또는 2, 바람직하게는 서열번호 1과 적어도 90 %, 95 % 97 % 또는 99 % 서열 동일성을 포함한다.
당업자는 유전 코드의 축퇴 관점에서, 상당한 서열 변이가 이들 폴리뉴클레오타이드 분자들 중에서 가능하다는 것을 인식할 것이다. 바람직하게는, 본 발명의 핵산 서열들은 포유류 세포들에서의 발현을 위하여, 바람직하게는 인간 세포들에서의 발현을 위하여 코돈-최적화된다. 코돈-최적화는, 교환되는 코돈들로써 아미노산들을 코드하는 이러한 코돈들과 같은, 이러한 종들의 고발현된 유전자들에서 보통 빈번한 코돈들에 의한 주어진 종들의 고 발현된 유전자들에서 보통 희귀한 코돈들의 흥미있는 서열에서의 교환을 가리킨다.
한 예에서, 본 발명의 CD123 CAR를 코드하는 다른 핵산 서열들은 하나의 폴리뉴클레오타이드 또는 벡터에 포함될 수 있다.
더 바람직한 예에서, 청구된 발명은 본 발명의 CAR의 안정적인 발현을 가능하게 하는 벡터에 대한 것이다. 여기에서 안정적은 본 발명의 CAR가 주입 후 적어도 1년 후에 조작된 세포들의 세포 표면에서 검출되는 것을 의미한다.
또다른 예에서, 청구된 발명은 본 발명의 CD123 CAR의 바람직하게는 서열번호 31, 서열번호 32 또는 서열번호 160의, 안정적 발현을 가능하게 하는 벡터에 대한 것이다.
바람직한 예에서, 본 발명은 본 발명의 CD123 CAR 중 어느 하나를 코드하는 서열, 바람직하게는 서열번호 31, 서열번호 32 또는 서열번호 160의 CD123 CAR를 포함하는 pCLS27333 벡터를 제공한다.
세포들
본 발명에 따른 세포는 타고난 그리고/또는 입양 면역 반응의 개시 및/또는 실행에 기능적으로 관여되는 조혈 기원의 세포를 가리킨다. 본 발명에 따른 세포는 바람직하게는 기증자로부터 수득된 T-세포이다. 본 발명에 따른 상기 T 세포는 줄기 세포로부터 유래될 수 있다. 줄기 세포들은 성체 줄기 세포들, 배아 줄기 세포들, 더욱 특히 인간이 아닌 줄기 세포들, 제대혈 줄기 세포들, 간세포들, 골수 줄기 세포들, 전능(totipotent) 줄기 세포들 또는 조혈 줄기 세포들일 수 있다. 바람직한 예에서, 세포들은 인간 세포들, 특히 인간 줄기 세포들이다. 더 바람직한 예에서, 세포들은 인간 T 세포들, 특히 인간 조작된 T 세포들이다.
대표적인 인간 세포들은 CD34+ 세포들이다. 상기 단리된 세포는 또한 수지상 세포, 킬러 수지상 세포, 비만 세포, NK-세포, B-세포 또는 염증성 T-림프구들, 세포독성 T-림프구들, 조절성 T-림프구들 또는 헬퍼 T-림프구들로 구성된 군으로부터 선택된 T-세포일 수 있다. 또다른 예에서, 상기 세포는 CD4+ T-림프구들 및 CD8+ T-림프구들로 구성되는 군으로부터 유래될 수 있다. 바람직한 예에서, 상기 세포ㅍ는 조작된 CD4+ T-림프구들 및 조작된 CD8+ T-림프구들로 구성되는 군으로부터 유래될 수 있다.
본 발명의 세포들이 확장 및 유전적 변형 전, 세포들의 소스가 제한되지 않는 여러가지 방법들을 통하여 대상으로부터 수득될 수 있다. T-세포는 말초 혈액 단핵 세포들, 골수, 림프절 조직, 제대혈, 흉선 조직, 감염 부위로부터의 조직, 복수(ascites), 흉막(pleural) 삼출액(effusion), 비장(spleen) 조직, 및 종양들을 포함하는 여러가지 제한되지 않는 소스들로부터 수득될 수 있다. 본 발명의 특정 예들에서, 이용가능하고 업계에 알려진 많은 T 세포주들이 사용될 수 있다. 또다른 예에서, 상기 세포는 건강한 기증자로부터 유래된다. 또다른 예에서, 상기 세포는 다른 표현형 특성들을 보이는 세포들의 혼합된 군집의 부분이다.
바람직하게는 줄기 세포들의 분리 및 제조는 적어도 하나의 인간 배아의 파괴를 요구하지 않는다. 면역 세포들은 자가조직유래(autologous) 치료들을 작업하는 관점에서, 환자로부터, 또는 동종이계(allogeneic) 치료들에서 사용될 수 있는 동종이계 세포들을 생산하는 관점에서 하나 또는 몇몇 기증자들로부터 유래할 수 있다.
더 바람직하게는 본 발명의 조작된 면역 세포는 세포 표면에서 서열번호 31, 서열번호 32, 또는 서열번호 33에 대응하는 항-CD123 CAR를 발현시키고, 더욱 더 바람직하게는 본 발명의 조작된 면역 세포는 인간화된 서열번호 31, 서열번호 32, 또는 서열번호 32에 대응하는 인간화된 항-CD123 CAR를 발현시킨다.
한 예에서 본 발명의 조작된 면역 세포는 서열번호 34 내지 서열번호 159, 바람직하게는 서열번호 34 내지 서열번호 117, 더욱 바람직하게는 서열번호 76 내지 서열번호 117에 대응하는 항-CD123 CAR를 발현시킨다.
이들 항-CD123 CAR들 중에서,
VH1/VL1, VH1/VL3; VH1/VL4;
VH2/VL2, VH2/VL3, VH2/VL4;
VH3/VL1, VH3/VL2, VH3/VL3, VH3/VL4
VH4/VL1, VH4/VL2, VH4/VL3, VH4/VL4
을 포함하는 것들이 바람직하다;
VH1/VL1, VH1/VL3;
VH2/VL4;
VH3/VL1, VH3/VL2, VH3/VL3,
VH4/VL1, VH4/VL2, VH4/VL3, VH4/VL4 이 더욱 바람직하다,
그리고 VH3/VL2, VH4/VL1, VH4/VL2, VH4/VL3, VH4/VL4를 포함하는 것들이 더욱 더 바람직하다.
가장 바람직한 것은 인간화된 Klone 43 (huK43) 및
VH10a/VL1a
VH9a/VL6a
VH10a/VL3a
VH9a/VL8a
VH2a/VL3a
VH10a/VL9 a
VH9a/VL3a
VH2a/VL1 a
을 갖는 것들이다.
한 예에서 본 발명의 조작된 면역 세포는 서열번호 160 및 서열번호 172 내지 서열번호 187에 대응하는 항-CD123 CAR를 발현시킨다.
CAR들을 지닌 것으로 여겨지는 면역 세포들의 조작 방법들:
본 발명은 여기에 참조로서 포함되고 WO2014/130635WO2013176916, WO2013176915에 전에 기재된 CD123 CAR를 코드하는 벡터들 또는 폴리뉴클레오타이드들을 상기 면역 세포들 내로 생체 외(ex-vivo)에서 도입하는 단계를 포함하는 면역요법을 위한 면역 세포들의 제조 방법을 포함한다.
바람직한 예에서, 상기 폴리뉴클레오타이드들은 면역 세포들에서 안정적으로 발현되는 관점에서 렌티바이러스 벡터들에 포함된다.
더 바람직한 예에서, 상기 폴리뉴클레오타이드는 면역 세포들에서 안정적으로 발현되는 관점에서 렌티바이러스 벡터에 포함된다.
추가의 예들에 따라, 상기 방법은 그것들을 동종이계(allogeneic) 이식에 더 적합하게 만들고 GVHD 반응을 감소시키기 위하여 상기 세포를 유전적으로 변형시키는 단계를 더 포함한다.
T-세포 수용체 ( TCR ) 요소를 코드하는 적어도 하나의 유전자를 불활성시킴 으로써 T-세포를 불활성화시키는 단계
첫 번째 측면에 따라, 면역 세포는 예컨대, HLA 또는 β2m 단백질 발현을 조절하거나 또는 코드하는 유전자의 불활성화와 조합될 수 있는, WO 2013/176915에 기재된 대로 T-세포 수용체 (TCR)의 하나 이상의 요소를 발현시키는 적어도 하나의 유전자를 불활성화시킴으로써 덜 동종이계(allogeneic)로 만들어질 수 있다. 따라서, 이식편대 숙주 증후군 및 이식 거부의 위험이 상당히 감소된다.
따라서, 면역 세포들은 T-세포들일 때, 본 발명은 또한 덜 동종이계(allogeneic)인 T-세포들을 조작하는 방법들을 제공한다.
세포들을 덜 동종이계(allogenic)로 만드는 방법들은 T-세포 수용체 (TCR) 요소를 코드하는 적어도 하나의 유전자, 특히 TCR알파, TCR베타 유전자들을 불활성화시키는 단계를 포함할 수 있다.
T-세포 수용체 (TCR)의 하나 이상의 요소를 불활성화시킴으로써 동종이계(allogeneic) 이식에 적합한 면역 세포를 불활성화시키는 CAR를 제조하기 위한 WO2013/176915에 개시된 방법들은 모두 참조로서 여기에 포함된다.
본 발명은 T-세포 수용체 (TCR)의 하나 이상의 요소를 발현시키는 적어도 하나의 유전자가 불활성화된, 면역 세포를 발현시키는 항-CD123 CAR를 포함한다. 이런 식으로 본 발명은 CAR가 Klon 43으로부터 유래된, 특히, 서열번호 31과 적어도 80% 동일성을 갖고, T-세포 수용체 (TCR)의 하나 이상의 요소를 발현시키는 적어도 하나의 유전자가 불활성화된 항-CD123 CAR를 발현시키는 T 세포를 제공한다.
본 발명은 T-세포 수용체 (TCR)의 하나 이상의 요소를 발현시키는 적어도 하나의 유전자가 불활성화된, 면역 세포를 발현시키는 항-CD123 CAR를 포함한다. 이런 식으로 본 발명은 CAR가 Klon 43으로부터 유래된, 특히, 서열번호 32와 적어도 80% 동일성을 갖고, T-세포 수용체 (TCR)의 하나 이상의 요소를 발현시키는 적어도 하나의 유전자가 불활성화된 항-CD123 CAR를 발현시키는 T 세포를 제공한다.
본 발명은 T-세포 수용체 (TCR)의 하나 이상의 요소를 발현시키는 적어도 하나의 유전자가 불활성화된, 면역 세포를 발현시키는 항-CD123 CAR를 포함한다. 이런 식으로 본 발명은 CAR가 Klon 43으로부터 유래된, 특히, 서열번호 160과 적어도 80% 동일성을 갖고, T-세포 수용체 (TCR)의 하나 이상의 요소를 발현시키는 적어도 하나의 유전자가 불활성화된 항-CD123 CAR를 발현시키는 T 세포를 제공한다.
본 발명에 따라, 불활성화된 T-세포 수용체 (TCR)의 하나 이상의 요소를 갖는 항-CD123 CAR 면역 세포들이 의약으로서 사용되도록 의도된다.
TCR 유전자를 불활성화시킴으로써 관심있는 유전자가 기능적 단백질 형태로 발현되지 않는 것이 의도된다. 특정 예들에서, 하나의 희귀-절단 엔도뉴클레아제의, 조작하기 위한 제공된 세포들에서 방법의 유전적 변형은 방법에 의존하여, 상기 희귀-절단 엔도뉴클레아제는 하나의 타겟인 유전자에서 특이적으로 절단을 촉매화하여, 이로써 상기 타겟인 유전자를 불활성화시킨다. 희귀-절단 엔도뉴클레아제에 의하여 핵산 가닥 손상들은 상동(homologous) 재조합(recombination) 또는 비상동(non-homologous) 말단(end)-결합(joining) (NHEJ)의 구별되는 메커니즘들을 통하여 보통 수선된다. 그러나, NHEJ는 절단 자리에서 DNA 서열에 절단을 자주 야기하는 완전하지 않은 수선 공정이다. 메커니즘들은 직접적인 재(re)-결찰(ligation) (Critchlow and Jackson 1998)을 통하여 또는 소위 미세상동성(microhomology)-매개 말단(end) 결합(joining) (Betts, Brenchley et al. 2003; Ma, Kim et al. 2003)에 의하여 두 개의 DNA 말단들의 남은 것들의 재결합을 수반한다. 비상동(non-homologous) 말단(end)-결합(joining) (NHEJ)을 통한 수선은 작은 삽입들 또는 결실들을 야기하며, 특이적 유전자 넉아웃들(knockouts)의 창작에 사용될 수 있다. 상기 변형은 적어도 하나의 뉴클레오타이드의 치환, 결실 또는 첨가일 수 있다. 절단-유도된 돌연변이생성(mutagenesis) 이벤트, 즉 NHEJ 이벤트에 연속적인 돌연변이생성 이벤트가 발생한 세포들은 당업계에서 잘 알려진 방법에 의하여 확인 및/또는 선택될 수 있다. 특정 예에서, 각각의 샘플의 세포들 내로 T-세포 수용체 (TCR)의 요소를 코드하는 적어도 하나의 유전자를 불활성화시키는 단계는 T-세포 수용체 (TCR)의 요소를 코드하는 적어도 하나의 유전자를 방해할(disrupt) 수 있는 희귀-절단 엔도뉴클레아제를 세포 내로 도입시키는 단계를 포함한다. 더욱 특이적 예에서, 각각의 샘플의 상기 세포들은 T-세포 수용체 (TCR)의 요소를 코드하는 적어도 하나의 유전자를 방해할 수 있는 희귀-절단 엔도뉴클레아제를 코드하는 핵산으로 형질전환되어, 상기 희귀-절단 엔도뉴클레아제가 상기 세포들 내로 발현된다.
상기 희귀-절단 엔도뉴클레아제는 메가뉴클레아제, 징크 핑거 뉴클레아제, CRISPR/Cas9 뉴클레아제, 아르고노트(Argonaute) 뉴클레아제, TALE-뉴클레아제 또는 MBBBD-뉴클레아제일 수 있다. 바람직한 예에서, 상기 희귀-절단 엔도뉴클레아제는 TALE-뉴클레아제이다. TALE-뉴클레아제에 의하여 핵산 target 서열을 절단하기 위한 하나의 뉴클레아제(nuclease) 촉매적 도메인 및 전사(Transcription) 활성인자(Activator) 유사(Like) 효과기(Effector) (TALE)로부터 유래된 DNA-결합 도메인으로 구성되는 융합 단백질이 의도된다 (Boch, Scholze et al. 2009; Moscou and Bogdanove 2009; Christian, Cermak et al. 2010; Cermak, Doyle et al. 2011; Geissler, Scholze et al. 2011; Huang, Xiao et al. 2011; Li, Huang et al. 2011; Mahfouz, Li et al. 2011; Miller, Tan et al. 2011; Morbitzer, Romer et al. 2011; Mussolino, Morbitzer et al. 2011; Sander, Cade et al. 2011; Tesson, Usal et al. 2011; Weber, Gruetzner et al. 2011; Zhang, Cong et al. 2011; Deng, Yan et al. 2012; Li, Piatek et al. 2012; Mahfouz, Li et al. 2012; Mak, Bradley et al. 2012). 본 발명에서 신규 TALE-뉴클레아제들은 입양 면역요법 전략들을 위한 관련 유전자들을 정확하게 타겟팅하기 위하여 설계되어 왔다.
타겟 서열을 인식하고 절단하는 바람직한 TALE-뉴클레아제들은 PCT/EP2014/075317에 기재되어 있다. 특히, 추가적인 촉매적 도메인은 타겟된 유전자들을 불활성화시키는 그것들의 능력을 증강시키기 위하여, 돌연변이 유발을 증가시키기 위하여 상기 희귀-절단 엔도뉴클레아제와 세포 내로 더 도입될 수 있다. 더욱 특히, 상기 추가적 촉매적 도메인은 DNA 말단(end) 가공(processing) 효소(enzyme)이다. DNA 말단-가공 효소들의 제한되지 않는 예들은, 5-3' 엑소뉴클레아제들(exonucleases), 3-5' 엑소뉴클레아제들, 5-3' 알칼라인(alkaline) 엑소뉴클레아제들, 5' 플랩(flap) 엔도뉴클레아제들(endonucleases), 헬리카제들(helicases), 호스파타제(hosphatase), 하이드롤라제들(hydrolases) 및 주형-독립적 DNA 폴리메라제들이다. 이러한 촉매적 도메인의 제한되지 않는 예들은 hExoI (EXO1_HUMAN), Yeast ExoI (EXO1_YEAST), 대장균 ExoI, Human TREX2, Mouse TREX1, 인간 TREX1, Bovine TREX1, Rat TREX1, TdT (말단 디옥시뉴클레오티딜 트랜스페라제) 인간 DNA2, 효모 DNA2 (DNA2_YEAST)로 구성되는 군으로부터 선택되는 단백질 도메인의 촉매적으로 활성인 유도체 또는 단백질 도메인을 포함한다. 바람직한 예에서, 상기 추가적인 촉매적 도메인은 3'-5'-엑소뉴클레아제 활성을 갖고, 그리고 더 바람직한 예에서, 상기 추가적 촉매적 도메인은 TREX이고, 더욱 바람직하게는 TREX2 촉매적 도메인이다 (WO2012/058458). 또다른 바람직한 예에서, 상기 촉매적 도메인은 단일 체인 TREX2 폴리펩타이드에 의하여 코드된다. 상기 추가적인 촉매적 도메인은 펩타이드 링커에 의하여 선택적으로 본 발명에 따른 뉴클레아제 융합 단백질 또는 키메라 단백질에 융합될 수 있다.
엔도뉴클레오티릭(endonucleolytic) 손상들은 상동 재조합의 속도(rate)를 자극하는 것으로 알려져 있다. 이런 식으로, 또다른 예에서, 방법의 유전적 변형 단계는 적어도 타겟 핵산 서열의 부분에 상동인 서열을 포함하는 외인성 핵산의 세포들 내로의 도입 단계를 더 포함하여, 상동 재조합은 타겟 핵산 서열 및 외인성 핵산 사이에서 발생한다. 특정 예들에서, 상기 외인성 핵산은 각각 타겟 핵산 서열의 5' 및 3' 영역에 상동인 첫 번째 및 두 번째 부분들을 포함한다. 이들 예들에서 상기 외인성 핵산은 또한 타겟 핵산 서열의 5' 및 3' 영역들과 상동성(homology)을 포함하지 않는 첫 번째 및 두 번째 부분 사이에 위치하는 세 번째 부분을 포함한다. 타겟 핵산 서열의 절단 후, 상동 재조합 이벤트는 타겟 핵산 서열 및 외인성 핵산 사이에서 자극된다. 바람직하게는 적어도 50 bp의, 바람직하게는 100 bp보다 많은, 그리고 더욱 바람직하게는 200 bp보다 많은 상동 서열들이 상기 기증자 매트릭스 내에서 사용된다. 특정 예에서, 상동 서열은 200 bp부터 6000 bp까지, 더욱 바람직하게는 1000 bp부터 2000 bp까지이다. 과연, 공유되는 핵산 상동성들은 손상 부위의 측면에 위치하는 업스트림 및 다운스트림 영역들에 위치되고, 도입되는 핵산 서열은 두 개의 팔들(arms) 사이에 위치되어야 한다.
약물 내성 T-세포들
본 발명자는 면역요법을 위하여 TCR KO T-세포를 조작하는, 특히 치료적 제제 (항-암 약물)와 조합하여 사용될 수 있는 서열번호 31의, 서열번호 32의, 또는 서열번호 160의 TCR KO 항-CD123 CAR를 발현시키는 면역 세포를 조작하는 방법을 추구하였다.
여기에서 사용된 대로, 제제에 대한 "내성(resistant) 또는 잘 견디는(tolerant)" 세포는 유전적으로 변형되어, 유전적 변형 없이 세포의 증식을 억제 또는 방지하는 상당량의 제제의 존재 하, 세포가 활성이고 증식하는 세포를 의미한다.
유전자를 불활성화시킴으로써 관심있는 유전자가 기능적 단백질 형태로 발현되지 않는 것이 유도된다. 특정 예에서, 방법의 유전적 변형은, 조작하는 제공된 세포들에서, 하나의 희귀-절단 엔도뉴클레아제의 발현에 의존하여 상기 희귀-절단 엔도뉴클레아제가 하나의 타겟인 유전자에서 절단을 특이적으로 촉매화하며, 이로써 상기 타겟인 유전자를 불활성화시킨다. 특정 예에서, 적어도 하나의 약물에 민감성인 유전자를 불활성화시키는 단계는 적어도 하나의 약물에 민감성인 유전자를 방해할 수 있는 희귀-절단 엔도뉴클레아제를 세포 내에 도입하는 단계를 포함한다. 더 특정 예에서, 상기 세포들은 약물에 민감성인 유전자를 방해하는 것이 가능한 희귀-절단 엔도뉴클레아제를 코드하는 핵산으로 형질전환되고, 상기 희귀-절단 엔도뉴클레아제가 상기 세포들 내로 발현된다. 상기 희귀-절단 엔도뉴클레아제는 메가뉴클레아제, 징크 핑거 뉴클레아제, CRISPR/Cas9 뉴클레아제, MBBBD-뉴클레아제 또는 TALE-뉴클레아제일 수 있다. 바람직한 예에서, 상기 희귀-절단 엔도뉴클레아제는 TALE-뉴클레아제이다.
바람직한 예에서, 불활성화되어 T-세포에 약물 내성을 부여하는, 약물에 민감성인 유전자는 인간 디옥시사이티딘 키나제 (dCK) 유전자이다. 이 효소는 디옥시리보뉴클레오사이드들(deoxyribonucleosides) 디옥시사이티딘 (dC), 디옥시구아노신(deoxyguanosine) (dG) 및 디옥시아데노신 (dA)의 인산화에 요구된다. 퓨린 뉴클레오타이드 유사체들(analogs) (PNAs)는 dCK에 의하여 모노-, 디-, 및 트리-포스페이트 PNA로 대사된다. 그것들의 트리포스페이트 형태들 그리고 특히 클로파라빈 트리포스페이트는 DNA 합성에서 ATP와 경쟁하고, 프로아폽토틱(proapoptotic) 제제로서 작용하고, 트리뉴클레오타이드 생산에 관여되는 리보뉴클레오타이드(ribonucleotide) 리덕타제(reductase) (RNR)의 강한 억제제이다.
바람직하게는 T 세포들에서 dCK의 불활성화는 TALE 뉴클레아제에 의하여 매개된다. 이 목적을 달성하기 위하여, 몇몇 쌍들의 dCK TALE-뉴클레아제가 설계되었고, 폴리뉴클레오타이드 수준에서 조립되었고, 시퀀싱에 의하여 입증되어 왔다. 본 발명에 따라 사용될 수 있는 TALE-뉴클레아제 쌍들의 예들은 PCT/EP2014/075317에 나와 있다.
T 세포들에서 이 dCK 불활성화는 클로파라빈 및 플루다라빈와 같은 퓨린 뉴클레오사이드 유사체들(analogs) (PNAs)에 대한 내성을 부여한다.
더 바람직한 예에서, T 세포들에서 dCK 불활성화는 이들 이중 넉아웃(KO) T 세포들을 클로파라빈과 같은 약물에 모두 내성이고온전한 TCR과 동일한 세포보다 덜 동종이계(allogeneic)인 둘 다로 만드는 TRAC 유전자들의 불활성화와 조합된다. 이 이중 특성들은 특히 치료적 목적에 유용하며, 암 바람직하게는 난치성이고 재발된 AML, 또는 BPDNL 환자들을 치료하기 위하여, 화학요법과 함께 면역요법을 위한 "기성품인" 동종이계(allogeneic) 세포들을 가능하게 한다.
이 이중 KO 불활성화 dCK/TRAC는 서열번호 31의, 서열번호 32의, 또는 서열번호 160의 CD123 CAR 발현 전 또는 후에 연속적으로 또는 동시에 수행될 수 있다. 본 발명에서 성공을 주는 TALE-뉴클레아제 dCK/TRAC 쌍들의 한 예는 PCT/EP2014/075317, 특히, 2 자리들 (dCK 및 TRAC)에서 타겟 서열들,에 기재되어 있다.
또다른 측면에 따라, 본 발명의 CD123 CAR를 발현시키는 T-세포 (서열번호 31의, 서열번호 32의, 또는 서열번호 160 의 TCR KO 항-CD123 CAR-발현시키는 면역 세포들)는 암을 치료하기 위한 표준 케어로서 사용되는, 화학요법 치료들 또는 면역억제 약물들에 대한 그것의 내성을 개선시키도록 유전적으로 더 조작될 수 있다.
항-대사산물들, 알킬화제들, 안트라사이클린들(anthracyclines), DNA 메틸트랜스페라제 억제제들, 백금 화합물들 및 방추체 독들과 같은 몇몇 세포독성 제제들 (항-암 약물)들)이 암 세포들을 죽이기 위하여 개발되어 왔다. 그러나 이들 약물들이 면역 T 세포들의 기능/생존에 영향을 미치기 때문에, 면역치료들과 같은 신규 치료들과 함께 이들 제제들의 도입은 문제가 많다. 예를 들어, 화학치료 제제들은 제제의 비-특이적 독성 프로파일들 때문에 로버스트(robus) 항-종양 면역적격(immunocompetent) 세포들의 확립에 해로울 수 있다. 세포 증식 경로들을 타겟팅하는 작은 분자-기반의 치료들은 항-종양 면역력의 확립을 또한 방해할 수 있다. 만약 일시적으로 효과적인 화학요법 식이요법들(regimens)이 신규 면역적격 세포 요법들과 조합될 수 있으면, 그러면 항-신생 치료에서의 중요한 개선이 달성될 수 있다 ((Dasgupta, McCarty et al. 2011 리뷰).
암 치료 및 동종이계(allogeneic) TCR KO의 선택적 이식, 서열번호 31, 서열번호 32 또는 서열번호 160의 CD123 CAR을 발현시키는 T-세포들을 개선시키기 위하여, 약물 내성이 화학요법 제제의 독성 부작용들로부터 그것들을 보호하기 위하여 상기 동종이계(allogeneic) T 세포들에 부여된다. 약물 내성 유전자를 발현시키는 T-세포들이 생존하고 약물 민감성 세포들에 비례하여 증식하기 때문에, T-세포들의 약물 내성은 또한 체내 또는 체외에서 그것들의 풍부를 허용한다.
화학요법 제제들에 내성인 T-세포들의 조작 방법들은 여기에 참조로서 완전히 포함되는 PCT/EP2014/075317에 개시되어 있다.
특히, 본 발명은 면역요법에 적합한, 서열번호 31, 서열번호 32 또는 서열번호 160의 CD123 CAR를 발현시키는 T-세포들, 동종이계(allogeneic) TCR KO를 조작하는 방법을 개시하고, 이때 T-세포 수용체 (TCR) 요소를 코드하는 적어도 하나의 유전자가 불활성화되고 적어도 하나의 유전자는 약물 내성을 부여하도록 변형되고, 바람직하게는 dCK 유전자가 불활성화된다.
o 서열번호 31, 서열번호 32, 서열번호 160의 항-CD123 CAR를 발현시키는 T 세포를 제공하는 단계,
o T-세포 수용체 (TCR) 요소를 코드하는 적어도 하나의 유전자를 불활성화시킴으로써 상기 항-CD123 CAR를 발현시키는 T-세포를 변형시키는 단계;
o 상기 항-CD123 CAR를 발현시키는 T-세포에 약물 내성을 부여하도록; 바람직하게는 퓨린 유사체들에 대한 내성을 부여하도록 상기 항-CD123 CAR를 발현시키는 T-세포를 변형시키는 단계
o 상기 약물의 존재 하 상기 조작된 항-CD123 CAR를 발현시키는 T-세포를 확장시키는 단계로, 상기 약물은 펜토스타틴, 플루다라빈 2-디옥시아데노신(deoxyadenosine), 클라드리빈, 클로파라빈, 넬라라빈, 바람직하게는 펜토스타틴, 플루다라빈 모노포스페이트, 및 2-클로로디옥시아데노신(chlorodeoxyadenosine) (2-CDA)으로부터 선택되는 퓨린 유사체인, 단계
를 포함하는 퓨린 유사체들와 조합 치료에 적합한 서열번호 31, 서열번호 32 또는 서열번호 160의 동종이계(allogeneic) CD123 CAR를 발현시키는 T-세포들의 조작 방법.
대체하여, 본 발명은:
o 서열번호 31의, 서열번호 32의, 또는 서열번호 160의 항-CD123 CAR을 발현시키는 T 세포를 제공하는 단계,
o dck 유전자를 결실시킴으로써; 서열번호 31, 서열번호 32의, 또는 서열번호 160의 상기 항-CD123 CAR를 발현시키는 T-세포를 서열번호 31의, 서열번호 32의, 또는 서열번호 160의 상기 항-CD123 CAR를 발현시키는 T-세포에 약물 내성을 부여하도록 변형시키는 단계로, 바람직하게는 상기 약물은 퓨린 유사체인 단계
o T-세포 수용체 (TCR) 요소를 코드하는 적어도 하나의 유전자를 불활성화시킴으로써 서열번호 31의, 서열번호 32의, 또는 서열번호 160의 상기 항-CD123 CAR를 발현시키는 T-세포를 변형시키는 단계;
o 상기 약물의 존재 하 서열번호 31의, 서열번호 32의, 또는 서열번호 160의 상기 조작된 항-CD123 CAR를 발현시키는 T-세포를 확장시키는 단계로, 상기 약물은 펜토스타틴, 플루다라빈 2-디옥시아데노신, 클라드리빈, 클로파라빈, 넬라라빈, 바람직하게는 펜토스타틴, 플루다라빈 모노포스페이트, 및 2-클로로디옥시아데노신(chlorodeoxyadenosine) (2-CDA)로부터 선택되는 퓨린 유사체인 단계
를 포함하는 방법에 대한 것이다.
특히, 본 발명은 면역요법에 적합한 동종이계(allogeneic) 세포들을 조작하는 방법에 대한 것으로, 이때 T-세포 수용체 (TCR 알파) 요소를 코드하는 유전자가 불활성화되고, dCK 유전자는:
o 항-CD123 CAR를 발현시키는 T-세포; 특히 서열번호 31의, 서열번호 32의, 또는 서열번호 160의 항-CD123 CAR 를 발현시키는 T 세포를 제공하는 단계,
o T-세포 수용체 (TCR 알파) 요소를 코드하는 유전자를 불활성화시킴으로써 서열번호 31의, 서열번호 32의, 또는 서열번호 160의 상기 항-CD123 CAR를 발현시키는 T 세포를 변형시키는 단계;
o 퓨린 유사체들에 대한 내성을 부여하기 위하여 서열번호 31, of 서열번호 32, 또는 of 서열번호 160의 상기 항-CD123 CAR를 발현시키는 T-세포를 불활성화시키는 단계;
o 상기 약물의 존재 하 서열번호 31, of 서열번호 32, 또는 of 서열번호 160의 상기 조작된 항-CD123 CAR를 발현시키는 T-세포를 확장시키는 단계
를 포함하는 퓨린 유사체들에 내성을 부여하도록 변형된다.
대체하여, 본 발명은
o 항-CD123 CAR를 발현시키는 T-세포; 특히 서열번호 31의, 서열번호 32의, 또는 서열번호 160의 항-CD123 CAR를 발현시키는 T 세포를 제공하는 단계,
o 서열번호 31의, 서열번호 32의, 또는 서열번호 160의 상기 항-CD123 CAR를 발현시키는 T 세포에서 dCK 유전자를 불활성화시켜 퓨린 유사체들(analogues)에 대한 내성을 부여하는 단계
o T-세포 수용체 (TCR 알파) 요소를 코드하는 적어도 하나의 유전자를 불활성화시킴으로써 서열번호 31의, 서열번호 32의, 또는 서열번호 160의 상기 항-CD123 CAR CAR를 발현시키는 T-세포를 변형시키는 단계;
o 퓨린 유사체들의 존재 하 상기 조작된 항-CD123 CAR를 발현시키는 T-세포를 확장시키는 단계
을 포함하는 방법에 대한 것이다.
바람직한 예에서 제공되는 서열번호 31의, 서열번호 32의, 또는 서열번호 160의 dCK KO, TCR KO CD123 CAR CAR를 발현시키는 T-세포들은 펜토스타틴, 플루다라빈 2-디옥시아데노신, 클라드리빈, 클로파라빈, 또는 넬라라빈로부터 선택되는 약물에, 바람직하게는 플루다라빈 모노포스페이트에, 또는 2-클로로디옥시아데노신 (2-CDA)에 내성이다.
항-CD123 CAR-발현시키는 면역 세포들에 약물 내성을 부여하는 유전자 발현
특정 예에서, 상기 약물 내성(resistance)은 적어도 하나의 약물 내성 유전자의 발현에 의하여 본 발명의 T-세포에 부여될 수 있다. 상기 약물 내성 유전자는 화학요법 제제 (예컨대 메토트렉사트(methotrexate))와 같은 제제에 대한 "내성(resistance)"를 코드하는 핵산 서열을 가리킨다. 다시 말해서, 세포에서 약물 내성 유전자의 발현은 상기 약물의 존재 하 생존 또는 약물 내성 유전자가 없는 상응하는 세포의 증식보다 더 큰 정도로 제제의 존재 하 세포들의 증식을 가능하게 한다. 세포에서 약물 내성 유전자의 발현은 제제의 존재 하 세포들의 증식을 가능하게 하며, 그것의 활성에 영향을 미치지 않는다. 본 발명의 약물 내성 유전자는 항-대사산물, 메토트렉사트, 빈블라스틴(vinblastine), 시스플라틴(cisplatin), 알킬화제들, 안트라사이클린들(anthracyclines), 세포독성 항생제들, 항-이뮤노필린들(immunophilins), 그것들의 유사체들(analogs) 또는 유도체들에 대한 내성을 코드할 수 있다.
한 예에서, 본 발명의 약물 내성 유전자는 약물 (또는 제제), 특히 아라사이틴(aracytine), 사이토신(cytosine) 아라비노사이드(arabinoside), 암사크린, 다우노루비신(daunorubicine), 이다루비신(idarubicine), 노반트론(novantrone), 미톡산트론(mitoxantrone), 베페사이드(vepeside), 에토포시드(etoposide) (VP16), 삼산화비소(arsenic trioxyde), 트랜스레티노산(transretinoic acid), 삼산화비소(arsenic trioxyde), 트랜스레티노산(transretinoic acid)의 조합, 메클로레타민(mechlorethamine), 프로카르바진(procarbazine), 클로람부실(chlorambucil), 시타라빈(cytarabine), 안트라사이클린들, 6-티오구아닌(thioguanine), 수산화요소(hydroxyurea), 프레드니손(prednisone), 및 그 조합으로부터 선택된 항-암 약물에 내성을 부여할 수 있다.
몇몇 약물 내성 유전자들은 본 발명의 CD123 CAR를 발현시키는 T 세포들에 약물 내성을 부여하는데 잠재적으로 사용될 수 있는 것이 확인되어 왔다 (Takebe, Zhao et al. 2001; Sugimoto, Tsukahara et al. 2003; Zielske, Reese et al. 2003; Nivens, Felder et al. 2004; Bardenheuer, Lehmberg et al. 2005; Kushman, Kabler et al. 2007).
약물 내성 유전자의 한 예는 또한 디하이드로엽산(Dihydrofolate) 환원효소(reductase) (DHFR)를 코드하는 유전자의 돌연변이 또는 변형된 형태일 수 있다. DHFR은 세포에서 테트라하이드로폴레이트(tetrahydrofolate)의 양을 조절하는데 관여되는 효소이며, DNA 합성에 필수적이다. 메토트렉사트 (MTX)와 같은 엽산 유사체들은 DHFR을 억제하고, 이런 식으로 임상에서 항-신생 제제들로 사용된다. 치료에서 사용되는 항-엽산들에 의한 억제에 증가된 내성을 갖는 DHFR의 다른 형태들이 기재되어 왔다. 특정 예에서, 본 발명에 따른 약물 내성 유전자는 인간 야생형 DHFR (GenBank: AAH71996.1)의 돌연변이 형태를 코드하는 핵산 서열일수 있는데, 이는 메토트렉사트와 같은 항-엽산 치료에 내성을 부여하는 적어도 하나의 돌연변이를 포함한다. 특정 예에서, DHFR의 돌연변이 형태는 G15, L22, F31 또는 F34 위치에서, 바람직하게는 L22 또는 F31 위치들에서 적어도 하나의 돌연변이된 아미노산을 포함한다 (Schweitzer, Dicker et al. 1990); International application WO94/24277; US patent US6,642,043). 특정 예에서, 상기 DHFR 돌연변이 형태는 L22 및 F31 위치들에서 돌연변이된 두 개의 아미노산들을 포함한다. 여기에 기재된 아미노산 위치들의 관련성은 GenBank: AAH71996.1에서 제시된 야생형 DHFR 폴리펩타이드의 형태의 아미노산들의 위치들의 면에서 자주 표현된다. 특정 예에서, 15 위치에서 세린 잔기은 바람직하게는 트립토판 잔기로 대체된다. 또다른 특정 예에서, 22 위치의 류신 잔기는 바람직하게는 항엽산제들에 대한 돌연변이 DHFR의 결합을 방해할 아미노산으로, 바람직하게는 페닐알라닌 또는 티로신과 같은 전하를 띠지 않은 아미노산 잔기들로 대체된다. 또다른 특정 예에서, 31 또는 34 위치들에서 페닐알라닌 잔기는 알라닌, 세린 또는 글리신과 같은 작은 친수성 아미노산으로 대체된다.
여기에서 사용된 대로, "항엽산 제제" 또는 "엽산(folate) 유사체들"은 일정 레벨에서 엽산 대사 경로를 방해하도록 향해지는 분자를 가리킨다. 항엽산 제제들의 예들은, 예컨대, 메토트렉사트 (MTX); 아미노테린(aminopterin); 트리메트렉사트(trimetrexate) (뉴트렉신(Neutrexin)™); 에다트렉사트(edatrexate); N10-프로파길(propargyl)-5,8-디데아자폴릭산(dideazafolic acid) (CB3717); ZD1694 (Tumodex), 5,8-디데아자이소폴릭산(dideazaisofolic acid) (IAHQ); 5,10-디데아자테트라하이드로폴릭산(dideazatetrahydrofolic acid) (DDATHF); 5-데아자폴릭산(deazafolic acid); PT523 (N 알파-(4-아미노-4-디옥시테로일(deoxypteroyl))-N 델타-헤미프탈로일(hemiphthaloyl)-L-오르니틴(ornithine)); 10-에틸-10-데아자아미노프테린(deazaaminopterin) (DDATHF, lomatrexol); 피리트렉심(piritrexim); 10-EDAM; ZD1694; GW1843; 페메트렉사트(Pemetrexate) 및 PDX (10-프로파길(propargyl)-10-데아자아미노프테린(deazaaminopterin))을 포함한다.
약물 내성 유전자의 또다른 예는 또한 구아노신(guanosine 뉴클레오타이드들의 데노보(de novo) 합성에서의 속도(rate)-제한(limiting) 효소인, 이오니신(ionisine)-5'-모노포스페이트(monophosphate) 디하아드로게나제(dehydrogenase) II (IMPDH2)의 돌연변이 또는 변형된 형태일 수 있다. IMPDH2의 돌연변이 또는 변형된 형태는 IMPDH 억제제 내성 유전자이다. IMPDH 억제제들은 마이코페놀산(mycophenolic acid) (MPA) 또는 그것의 프로드러그인 마이코페놀레이트 모페틸(mycophenolate mofetil) (MMF)일 수 있다. 돌연변이 IMPDH2는 IMPDH 억제제에 대하여 상당히 증가된 내성을 이끄는 야생형 인간 IMPDH2 (NP_000875.2)의 MAP 결합 부위에서 적어도 하나, 바람직하게는 두 개의 돌연변이들을 포함할 수 있다. 돌연변이들은 바람직하게는 T333 및/또는 S351 위치들이다 (Yam, Jensen et al. 2006; Sangiolo, Lesnikova et al. 2007; Jonnalagadda, Brown et al. 2013). 특정 예에서, 333 위치에서 트레오닌 잔기는 이소류신 잔기로 대체되고 351 위치에서 세린 잔기는 티로신 잔기로 대체된다. 여기에 기재된 아미노산 위치들의 관련성은 NP_000875.2에 제시된 야생형 인간 IMPDH2 폴리펩타이드의 형태의 아미노산들의 위치들의 면에서 자주 표현된다.
또다른 약물 내성 유전자는 칼시뉴린(calcineurin)의 돌연변이 형태이다. 많은 생물학적 과정에 관여되는 아주 흔하게 발현되는 세린/트레오닌 단백질 포스파타제이며, T-세포 활성화의 중심인 칼시뉴린(PP2B). 칼시뉴린은 촉매성 서브유닛 (CnA; 세 개의 아이소형태들(isoforms)) 및 조절성 서브유닛 (CnB; 두 개의 아이소형태들)로 이루어진 헤테로다이머이다. T-세포 수용체의 참여 후, 칼시뉴린은 전사 인자 NFAT을 탈인산화하는데, 이는 그것이 핵 및 IL2와 같은 활성화된 주요 타겟 유전자로 이동하는 것을 가능하게 한다. FKBP12와 복합체인 FK506, 또는 CyPA와 복합체인 사이클로스포린(cyclosporine) A (CsA)는 NFAT가 칼시뉴린의 활성 부위로 접근하는 것을 막아, 그것의 탈인산화를 방지하고, 이로써 T-세포 활성화를 억제한다 (Brewin, Mancao et al. 2009). 본 발명의 약물 내성 유전자는 FK506 및/또는 CsA와 같은 칼시뉴린 억제제에 내성인 칼시뉴린의 돌연변이 형태를 코드하는 핵산 서열일 수 있다. 특정 예에서, 상기 돌연변이 형태는 위치들: V314, Y341, M347, T351, W352, L354, K360에서 야생형 칼시뉴린 헤테로다이머 a의 적어도 하나의 돌연변이된 아미노산, 바람직하게는 T351 및 L354 또는 V314 및 Y341 위치들에서 이중 돌연변이들을 포함할 수 있다. 특정 예에서, GenBank: ACX34092.1에 상응하는 서열의 341 위치의 발린 잔기는 리신 또는 알기닌 잔기로 대체될 수 있고, 341 위치의 티로신 잔기는 페닐알라닌 잔기로 대체될 수 있고, 347 위치의 메티오닌은 글루탐산, 알기닌 또는 트립토판(tryptophane) 잔기로 대체될 수 있고, 351 위치의 트레오닌은 글루탐산 잔기로 대체될 수 있고, 352 위치의 트립토판(tryptophane) 잔기는 시스테인, 글루탐산 또는 알라닌 잔기로 대체될 수 있고, 353 위치의 세린은 히스티딘 또는 아스파라긴들 잔기로 대체될 수 있고, 354 위치의 류신은 알라닌 잔기로 대체될 수 있고; 360 위치의 리신은 알라닌 또는 페닐알라닌 잔기로 대체될 수 있다. 여기에 기재된 아미노산 위치들의 관련성은 (GenBank: ACX34092.1)에 제시된 야생형 인간 칼시뉴린 헤테로다이머 a 폴리펩타이드의 형태의 아미노산들의 위치들의 면에서 자주 표현된다.
또다른 특정 예에서, 상기 돌연변이 형태는 V120, N123, L124 또는 K125 위치들에서 야생형 칼시뉴린 헤테로다이머 b의 적어도 하나의 돌연변이된 아미노산을, 바람직하게는 L124 및 K125 위치들에서 바람직하게는 이중 돌연변이들을 포함할 수 있다. 특정 예에서, GenBank: ACX34095.1에 상응하는 아미노산 서열에서 120 위치의 발린은 세린, 아스파르트산, 페닐알라닌 또는 류신 잔기로 대체될 수 있고; 123 위치의 아스파라긴은 트립토판, 리신, 페닐알라닌, 알기닌, 히스티딘 또는 세린으로 대체될 수 있고; 124 위치의 류신은 트레오닌 잔기로 대체될 수 있고; 125 위치의 리신은 알라닌, a 글루탐산, 트립토판으로 대체될 수 있거나, 또는 류신-알기닌 또는 이소류신-글루탐산과 같은 두 개 잔기들이 125 위치의 리신 뒤에 첨가될 수 있다. 여기에 기재된 아미노산 위치들의 관련성은 (GenBank: ACX34095.1)에 제시된 야생형 인간 칼시뉴린 헤테로다이머 b 폴리펩타이드의 형태의 아미노산들의 위치들의 면에서 자주 표현된다.
또다른 약물 내성 유전자는 인간 알킬(alkyl) 구아닌(guanine) 트랜스페라제(transferase) (hAGT)를 코드하는 0(6)-메틸구아닌(methylguanine) 메틸트랜스페라제(methyltransferase) (MGMT) 이다. AGT는 니트로소우레아들(nitrosoureas) 및 테모졸로미드(temozolomide) (TMZ)와 같은 알킬화제들의 세포독성 효과들에 내성을 부여하는 DNA 수선 단백질이다. 6-벤질구아닌(benzylguanine) (6-BG)은 니트로소우레아 독성을 강하게 하는 AGT의 억제제이며, 이 제제의 세포독성 효과들을 강하게 하기 위하여 TMZ와 함께 공-투여된다. AGT의 변종들을 코드하는 MGMT의 몇몇 돌연변이 형태들은 6-BG에 의한 불활성화에 매우 내성이지만, DNA 손상을 수선하는 그것들의 능력을 유지한다. 특정 예에서, AGT 돌연변이 형태는 서열번호: 18 (UniProtKB: P16455) 아미노산 서열에서, 야생형 AGT P140 위치의 돌연변이된 아미노산을 포함할 수 있다. 바람직한 예에서, 140 위치에서 상기 프롤린은 리신 잔기로 대체된다.
또다른 약물 내성 유전자는 다중약물(multidrug) 내성(resistance) 단백질 1 (MDR1) 유전자이다. 이 유전자는 세포 막을 가로지르는 대사 부산물들의 이동에 관여되는 P-당단백질(glycoprotein) (P-GP)로 알려진 막 당단백질을 코드한다. P-Gp 단백질은 몇몇 구조적으로 관련없는 화학요법 제제들을 향한 넓은 특이성을 보인다.
다중약물 내성 단백질 1을 과발현시키는 것은 미톡산트론과 같은 약물들에 대한 내성을 부여하는 것으로 기재되어 왔다 (Charles S. Morrow, Christina Peklak-Scott, Bimjhana Bishwokarma, Timothy E. Kute, Pamela K. Smitherman, and Alan J. Townsend. Multidrug Resistance Protein 1 (MRP1, ABCC1) Mediates Resistance to Mitoxantrone via Glutathione-Dependent Drug Efflux Mol Pharmacol April 2006 69:1499-1505).
이런 식으로, 약물 내성은 MDR-1 (NP_000918)을 코드하는 핵산 서열의 발현에 의하여 세포들에 부여될 수 있다.
본 발명에 따른 약물 내성 세포들을 제조하는 또 다른 방법은 암사크린에 대한 내성을 부여하기 위하여, 인간(Human) 토포이소메라제(Topoisomerase) II 유전자에서 Arg486 및 Glu571에서의 돌연변이들과 같은 특이적 돌연변이(들)을 가진 세포들을 제조하는 것이다 (S. PATEL, B. A. KELLER, and L. M. FISHER. 2000. MOLECULAR PHARMACOLOGY. Vol 57: p784-791 (2000).
본 발명에 따른 약물 내성 세포들을 제조하는 또 다른 방법은 다우노루비신에 대한 내성을 부여하기 위하여 microRNA-21을 과발현시키는 세포들을 제조하는 것이다 (Involvement of miR-21 in resistance to daunorubicine by regulating PTEN 발현 in the leukaemia K562 세포주 Bai, Haitao et al. FEBS Letters , Volume 585 , Issue 2 , 402 - 408).
바람직한 예에서, 본 발명의 세포들은 약물 내성을 부여한 mRNA 또는 단백질을 갖고, 그리고 또한 억제성 mRNA 또는 유전자을 포함하는데, 그것의 발현은 또다른 약물에 의하여 조절되고(conditioned), 이는 상기 다른 약물의 투여 후 또는 상기 다른 약물의 존재 하 상기 약물 내성 세포들의 선택적 파괴를 가능하게 한다.
약물 내성 유전자는 또한 세포독성 항생제들에 대한 내성을 부여할 수 있으며, ble 유전자 또는 mcrA 유전자일 수 있다. 면역 세포에서 ble 유전자 또는 mcrA의 이소성(ectopic) 발현은 각각 블레오마이신(bleomycine) 또는 마이토마이신(mitomycin) C인 화학요법 제제에 노출될 때, 선택적 이점을 준다.
유전자 요법으로의 가장 실질적인 접근은 벡터들, 바람직하게는 바이러스 벡터로 효과적인 유전자 전달을 이용함으로써 T-세포를 조작하기 위한 유전자의 첨가이다. 이런 식으로, 특정 예에서, 본 발명은 세포 내로 바람직하게는 적어도 하나의 벡터에 의하여 코드되는 이식유전자를 도입함으로써 본 발명의 CD123 면역 세포들에 약물 내성을 부여하는 방법을 제공한다.
게놈 내로 유전자들의 무작위 삽입은 삽입 부위 인근의 유전자 또는 삽입된 유전자의 부적절한 발현을 이끌 수 있다. 게놈 내 특이적 부위들에 대한 유전자들을 타겟으로 하기 위하여 내생 서열들을 포함하는 외인성 핵산의 상동 재조합을 이용한 특이적 유전자 치료는 T-세포들의 안전한 조작을 가능하게 할 수 있다. 전술한 바와 같이, 본 발명에 따른 방법의 유전적 변형 단계는 적어도 내생 유전자 및 외인성 핵산 사이에 발생하는 상동 재조합과 같은 내생 유전자의 부분 및 약물 내성 유전자를 코드하는 서열을 포함하는 외인성 핵산의 세포들 내로의 도입 단계를 포함할 수 있다. 특정 예에서, 상기 내생 유전자는 야생형 "약물 내성" 유전자일 수 있어, 상동 재조합 후, 야생형 유전자가 약물에 대한 내성을 부여하는 유전자의 돌연변이 형태에 의하여 대체된다.
엔도뉴클레오티릭(endonucleolytic) 손상들은 상동 재조합의 속도(rate)를 자극하는 것으로 알려져 있다. 이런 식으롱, 특정 예에서, 본 발명의 방법은 내생 유전자 내에서 타겟 서열을 절단하는 것이 가능한 희귀-절단 엔도뉴클레아제를 세포에서 발현시키는 단계를 더 포함한다. 상기 내생 유전자는 예컨대 DHFR, IMPDH2, 칼시뉴린 또는 AGT를 코드할 수 있다. 상기 희귀-절단 엔도뉴클레아제는 TALE-뉴클레아제, 징크 핑거 뉴클레아제, CRISPR/Cas9 엔도뉴클레아제, MBBBD-뉴클레아제 또는 메가뉴클레아제일 수 있다.
불활성화될 수 있는 효소의 또다른 예는 인간 하이포잔틴(hypoxanthine)-구아닌(guanine) 포스포리보실(phosphoribosyl) 트랜스페라제(transferase) (HPRT) 유전자 (Genbank: M26434.1)이다. 특히 HPRT는 조작된 T-세포들에서 불활성화되어 세포분열억제(cytostatic) 대사산물(metabolite), HPRT에 의하여 세포독성 티오구아닌 뉴클레오타이드으로 전환되고, 암, 특히 백혈병들 환자들을 치료하는데 현재 사용되는, 6-티오구아닌 (6TG)에 대한 내성을 부여할 수 있다 (Hacke, Treger et al. 2013). 구아닌들 유사체들은 포스포리보실 모이어티의 첨가를 촉매화하고 6 머캅토퓨린(mercapthopurine) (6MP)의 형성을 가능하게 하는 HPRT 트랜스페라제에 의하여 대사되며, 6 티오구아닌 (6TG)은 보통 ALL을 치료하기 위한 림프소모(ymphodepleting) 약물들로서 사용된다. 그것들은 포스포리보실 모이어티의 첨가를 촉매화하고 TGMP 형성을 가능하게 하는 HPRT (하이포잔틴 포스포리보실 트랜스페라제)에 의하여 대사된다. 그것들의 그 다음의 인산화들은 DNA 내로 결국 통합되는 그것들의 삼인산화된(triphosphorylated) 형태들의 형성으로 이끈다. DNA 내로 통합되면, 티오 GTP는 그것의 티올레이트(thiolate) 편성(groupment)를 통한 DNA 복제의 정확성을 손상시키고, 세포 온전성에 매우 유해한 무작위 점 돌연변이를 일으킨다.
또다른 예에서, T-세포의 표면에서 보통 발현되는 CD3의 불활성화는 테플리주맙(teplizumab)과 같은 항-CD3 항체들에 대한 내성을 부여할 수 있다.
조합 치료
여기에서 사용되는 용어들 "치료적 제제", "화학요법 제제". 또는 "약물" 또는 "항-암 약물"은 의약, 바람직하게는 암 세포와 상호작용하여, 세포의 증식 상황을 감소시키키고 그리고/또는 세포를 죽일 수 있는 화합물 또는 그 유도체를 가리킨다. 화학요법 제제 또는 "항-암 약물"의 예들은 알킬화제들 (예컨대, 부설판(busulfan), 카보플라틴(carboplatine), 클로람부실, 시스플라틴(cisplatine), 사이클로포스파미드(cyclophosphamide), 이포스파미드(ifosfamide), 멜팔란(melphalan), 메클로레타민, 옥살리플라틴(oxaliplatine), 우라무스틴(uramustine), 테모졸로미드(temozolomide), 포테무스틴(fotemustine)), 대사 길항제들(antagonists) (예컨대, 클로파라빈, 플루다라빈 또는 2'-디옥시아데노신, 메토트렉사트 (MTX), 5-플루오로우라실 또는 그 유도체들, 아자티오프린(azathioprine), 카페시타빈(capecitabine), 시타라빈, ● 플록수리딘(floxuridine), ● 플루오로우라실(fluorouracile), ● 젬시타빈(gemcitabine), ● 메토트렉사트, ● 페메트렉세드(pemetrexed)와 같은 퓨린 뉴클레오사이드 항대사물질), 항종양 항생제들 (예컨대, 마이토마이신, 아드리아마이신(adriamycin), 블레오마이신, ● 다우노루비신(daunorubicine), ● 독소루비신(doxorubicine), ● 에피루비신(epirubicine), ● 수산화요소, ● 이다루비신, ● 마이토마이신 C, ● 미톡산트론), 식물-유래 항종양 제제들 (예컨대, 빈크리스틴(vincristine), 빈데신(vindesine), 탁솔(taxol), 빈블라스틴, ● 비노렐빈(vinorelbine), ● 도세탁셀(docetaxel), ● 파클리탁셀(paclitaxel)), ● 토포이소메라제(topoisomerase) 억제제 (이리노테칸(irinotecan), ● 토포테칸(topotecan), ● 에토포시드)을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
바람직한 예에서, 여기에서 사용된 대로 치료적 제제, 화학요법 약물은 암을 치료하는데, 특히 조혈 암 세포 그리고 더욱 특히 AML, 그리고 더욱 더 특히 난치성이고 재발된 AML을 치료하는데 사용되어, 이로써 암 세포의 증식 상황을 감소시키고 그리고/또는 암 세포를 죽일 수 있는 화합물 또는 그 유도체를 가리킨다.
화학요법 제제들의 다른 예들은 아라사이틴(aracytine), 사이토카인 아라비노사이드(arabinoside), 암사크린, 다우노루비신(daunorubicine), 이다루비신, 노반트론, 미톡산트론, 베페사이드, 에토포시드 (VP16), 삼산화비소(arsenic trioxyde), 트랜스레티노산(transretinoic acid), 메클로레타민, 프로카르바진, 클로람부실, 및 그 조합을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 다른 예들에서, 본 발명의 세포들은 아라사이틴(aracytine), 사이토신 아라비노사이드, 암사크린, 다우노루비신(daunorubicine), 이다루비신, 노반트론, 미톡산트론, 베페사이드, 에토포시드 (VP16), 삼산화비소(arsenic trioxyde), 트랜스레티노산(transretinoic acid), 시타라빈, 안트라사이클린들, 6-티오구아닌, 수산화요소, 프레드니손, 및 그 조합으로부터 선택된 약물 (또는 제제)와 함께 환자에 투여된다.
이러한 제제들은 항-암 제제들 트리메토트리사트(TRIMETHOTRIXATE)™ (TMTX), 테모졸로미드(TEMOZOLOMIDE)™, 랄트리트렉세드(RALTRITREXED)™, S-(4-나이트로벤질(Nitrobenzyl))-6-티오이노신(thioinosine) (NBMPR), 6-벤지구아니딘(benzyguanidine) (6-BG), 비스(bis)-클로로니트로소우레아(chloronitrosourea) (BCNU) 및 캠프토테신(CAMPTOTHECIN)™, 또는 그것의 임의의 치료적 유도체를 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
더 바람직한 예에서, dck KO 유전자 및 TCR과 서열번호 31, of 서열번호 32, 또는 of 서열번호 160의 항-CD123 CAR를 발현시키는 T 세포는 아라사이틴(aracytine), 사이토신 아라비노사이드, 암사크린, 다우노루비신(daunorubicine), 이다루비신, 노반트론, 미톡산트론, 베페사이드, 에토포시드 (VP16), 삼산화비소(arsenic trioxyde), 트랜스레티노산 및 그 조합으로부터 선택되는 적어도 하나의 치료적 제제와 조합하여, 환자에게 투여된다.
아라사이틴(aracytine), 사이토신 아라비노사이드, 암사크린, 다우노루비신(daunorubicine), 이다루비신, 노반트론, 미톡산트론, 베페사이드, 에토포시드 (VP16), 삼산화비소(arsenic trioxyde), 트랜스레티노산 및 그 조합으로부터 선택되는 적어도 하나의 치료적 제제와 조합되어 dck KO 유전자 및 TCR과 서열번호 31의, 서열번호 32의, 또는 서열번호 160의 항-CD123 CAR를 발현시키는 T 세포가 치료적 제제로서 사용된다.
바람직하게는, 퓨린 유사체 (fludarabine)와 조합하여, dck KO 유전자 및 TCR과 서열번호 31의, 서열번호 32의, 또는 서열번호 160의 항-CD123 CAR를 발현시키는 T 세포가 치료적 제제로서 사용된다.
바람직하게는, FLAG 처리와 조합하여, dck KO 유전자 및 TCR과 서열번호 31, of 서열번호 32, 또는 of 서열번호 160의 항-CD123 CAR를 발현시키는 T 세포가 치료적 제제로서 사용된다.
한 예에서, 상기 CD123 CAR는 서열번호 76 내지 서열번호 117로부터 선택되고, 이중 TCR dCK KO T 세포들에서 발현되고 치료적 제제로서 FLAG 또는 퓨린 유사체에 조합된다.
본 발명에서 조합 치료는 분류 및/또는 소모(depletion) 목적(들)을 위한 mAb의 주입을 포함한다. 바람직한 예에서, 상기 mAb는 리툭시맙이다.
바람직하게는 정맥 루트에 의하여 투여되는 리툭시맙의 최대 용량은 2,250 mg/m2이다. 그것은 급속 정맥 주입(intravenous push or bolus)으로 투여되어서는 안된다.
항-CD123 CAR-발현시키는 면역 세포들의 다중 약물 내성
또다른 특정 예에서, 본 발명자들은 동종이계 T-세포들, 특히 환자가 다른 약물들로 치료될 때 조작된 T-세포들의 선택을 매개하기 위하여 다중 약물들에 내성인 동종이계(allogenic) 항-CD123 CAR를 발현시키는 T-세포를 이용하여 "기성품인" 면역요법 전략을 개발하는 것을 추구하였다. 치료적 효율은 다중 약물 내성 동종이계 T-세포들을 유전적으로 조작함으로써 상당히 증강될 수 있다. 이러한 전략은 시너지 효과들을 보이는 약물 조합에 반응하는 종양들의 치료에 특히 효과적이다. 게다가 다중 내성인 조작된 T-세포들은 최소 용량의 약물 제제들을 이용하여 확장되고 선택될 수 있다.
이와 같이, 본 발명에 따른 방법은 본 발명의 T-세포를 변형시켜 본 발명의 상기 T-세포에 다중 약물 내성을 부여하는 단계를 포함할 수 있다. 상기 다중 약물 내성은 하나보다 많은 약물 내성 유전자를 발현시킴으로써 또는 하나보다 많은 약물 민감성 유전자를 불활성화시킴으로써 부여될 수 있다. 또다른 특정 예에서, 다중 약물 내성은 적어도 하나의 약물 내성 유전자를 발현시킴으로써 그리고 적어도 하나의 약물 민감성 유전자를 불활성화시킴으로써 상기 T-세포에 부여될 수 있다. 특히, 다중 약물 내성은 DHFR의 돌연변이 형태, IMPDH2의 돌연변이 형태, 칼시뉴린의 돌연변이 형태, MGMT의 돌연변이 형태, ble 유전자, 및 mcrA 유전자와 같은 적어도 하나의 약물 내성 유전자를 발현시킴으로써 그리고 HPRT 유전자와 같은 적어도 하나의 약물 민감성 유전자를 불활성화시킴으로써 상기 T-세포에 부여될 수 있다. 바람직한 예에서, 다중 약물 내성은 HPRT 유전자를 불활성화시키고 DHFR의 돌연변이 형태를 발현시킴으로써; 또는 HPRT 유전자를 불활성화시키고 IMPDH2의 돌연변이 형태를 발현시킴으로써; 또는 HPRT 유전자를 불활성화시키고 칼시뉴린의 돌연변이 형태를 발현시킴으로써; HPRT 유전자를 불활성화시키고 MGMT의 돌연변이 형태를 발현시킴으로써; HPRT 유전자를 불활성화시키고 ble 유전자를 발현시킴으로써; HPRT 유전자불활성화시키고 mcrA 유전자를 발현시킴으로써 부여될 수 있다.
한 예에서, 본 발명은 하나보다 많은 약물 내성 유전자를 발현시키는, 또는 이때 하나보다 많은 약물 민감성 유전자가 불활성화된, 동종이계(allogenic) 항-CD123 CAR를 발현시키는 T-세포를 제공한다.
- 본 발명의 항-CD123 CAR-발현시키는 면역 세포들에서의 자살 유전자들
몇몇 예들에서, 조작된 T-세포들이 투여 후 몇 년 동안 확장되고 지속될 수 있기 때문에, 투여된 T-세포들의 선택적 제거를 가능하게 하는 안전한 메커니즘을 포함하는 것이 바람직하다. 이런 식으로, 몇몇 예들에서, 본 발명의 방법은 재조합 자살 유전자로 상기 T-세포들의 형질전환을 포함한다. 상기 재조합 자살 유전자는 대상에 투여될 때, 상기 T-세포들의 직접적인 독성 및/또는 통제되지 않는 증식의 위험을 감소시키는데 사용된다 (Quintarelli C, Vera F, blood 2007; Tey SK, Dotti G. , Rooney CM, boil blood marrow transplant 2007). 자살 유전자들은 인 비보에서 형질전환된 세포들의 선택적 제거를 가능하게 한다. 특히 자살 유전자는 비-독성 프로(pro)-드러그(drug)를 세포독성 약물로 전환시키거나 또는 독성 유전자 발현 산물을 발현시키는 능력을 가진다. 다시 말해서, "자살 유전자"는 산물을 코드하는 핵산인데, 이때 산물은 그 자체로 또는 다른 화합물들의 존재 하 세포사를 야기한다.
이러한 자살 유전자의 대표적인 예는 헤르페스(herpes) 심플렉스(simplex) 바이러스의 타미딘(thymidine) 키나제를 코드하는 것이다. 추가적인 예들은 바리셀라(varicella) 조스터(zoster) 바이러스의 티미딘 키나제 및 5-플루오로사이토신을 매우 독성인 화합물 5-플루오로우라실로 변환시키는 박테리아 유전자 사이토신 디아미나제(deaminase)이다. 자살 유전자들은 또한 제한되지 않는 예들로서 카스파제(caspase)-9 또는 카스파제-8 또는 사이토신 디아미나제를 포함한다. 카스파제-9는 다이머화(dimerization)의 특이적 화학적(chemical) 유도제(inducer) (CID)를 이용하여 활성화될 수 있다. 자살 유전자들은 또한 세포 표면에서 발현되는 폴리펩타이드들일 수 있고, 세포들을 치료적 단일클론 항체들에 민감하게 만들 수 있다. 여기에서 사용된 대로 "프로드러그(prodrug)"는 독성 산물로 전환될 수 있는 본 발명의 방법들에서 유용한 임의의 화합물을 의미한다. 프로드러그는 본 발명의 방법에서 자살 유전자의 유전자 산물에 의하여 독성 산물로 전환된다. 이러한 프로드러그의 대표적인 예는 HSV-티미딘 키나제에 의하여 독성 화합물로 인 비보에서 전환되는 간시클로비르(ganciclovir)이다. 간시클로비르 파생물은 나중에 종양 세포들에 독성이다. 프로드러그들의 다른 대표적 예들은 아시클로비르(acyclovir), FIAU [1-(2-디옥시-2-플루오로-β-D-아라비노퓨라노실)-5-아이오도우라실(iodouracil)], VZV-TK을 위한 6-메톡시퓨린 아라비노사이드 및 사이토신 디아미나제를 위한 5-플루오로사이토신을 포함한다.
본 발명의 하나의 바람직한 자살 유전자 시스템은 WO2013153391에 기재된 소위 RQR8 폴리펩타이드에서와 같은, 항-CD20 mAb 리툭시맙에 의하여 인식되는 항원 모티프, 특히 QBen10를 포함하는 재조합 항원 폴리펩타이드를 이용한다. 공인된 항체 약물인, 리툭시맙은 그 다음에 필요할 때 세포 소모에 이용될 수 있다.
한 예에서, 본 발명은 TCR KO - 서열번호 31 또는 32의 dCK KO 항-CD123 CAR 를 발현시키는 T-세포, 발현시키는 RQR8 자살 유전자로, 상기 세포들이 선택적으로 파괴되는 것을 가능하게 하는 것을 제공한다.
더 바람직하게는, 본 발명은 TCR KO - dCK KO 항-CD123 CAR를 발현시키는 T-세포를 제공하고, 이때 상기 CD123 CAR는 CD123 CAR 발현시키는 세포들이 선택적으로 파괴되는 것을 가능하게 하고, 바람직하게는 상기 자살 도메인은 서열번호 161의 적어도 two 도메인들을 포함했고, 더욱 바람직하게는 상기 CD123 CAR는 서열번호 171의 서열을 포함한다.
약물 내성 동종이계 ( allogenic ) CAR T 세포들의 세포독성의 시험을 위한 CD123+/luc+ 약물 내성 Daudi 세포들
본 발명은 또한 퓨린 유사체들에 내성이며 CD123 둘다를 발현시키는 타겟 세포들의 제조 방법을 포함한다. 이들 타겟 세포들은 본 발명의 CD123 CAR T 세포들의 세포독성을 테스트하는데 특히 유용하다. 이들 세포들은 임상적으로 유의미한 양의 클로파라빈에 쉽게 내성이고 루시페라제 활성을 갖는다. 이 특징들의 조합은 그것들을 마우스들 모델에서 인 비보에서 추적하는 것(traking)을 가능하게 하거나 필요할 때 그것들을 파괴한다.
더욱 특이적으로, 그것들은 클로파라빈 또는 다른 PNA들의 존재 하, 마우스들에서 세포독성 특성들 약물 내성 T 세포들을 평가하는데 사용될 수 있다. 클로파라빈 내성 Daudi 세포들은 약물 내성 B 세포 악성종양들을 갖는, 급성 림프모구(lymphoblastic) 백혈병 (ALL) 환자들 재발 형태 유도 치료의 생리학적 상태를 모방한다. 이와 같이, 이들 세포들은 약물 내성 CAR T 세포들의 세포독성 및 신뢰성을 평가하기 위하여 큰 관심이 있다. 바람직하게는, 이들 타겟 세포들은 CD123+ Luciferase+ Daudi 세포들이다.
단리된 세포
본 발명은 CD123에 결합하는 CD123 CAR를 발현시키는 단리된 세포에 대한 것이다. 이와 같이, 본 발명은 항-CD123 CAR를 발현시키는 세포에 대한 것이다. 특정 예에서, 상기 항-CD123 CAR를 발현시키는 세포는 적어도 하나의 약물에 내성이고 그리고/또는 T-세포 수용체 요소를 코드하는 적어도 하나의 방해되는 유전자를 포함한다.
바람직한 예에서, 본 발명은 CD123에 결합하고, 적어도 하나의 퓨린 유사체에 내성이며 T-세포 수용체 알파 요소를 코드하는 방해된 유전자를 포함하는, CAR를 발현시키는 단리된 T 세포에 대한 것이다.
더 바람직한 예에서, 본 발명은 CD123에 결합하고 CD123을 발현시키는 세포들을 파괴하며 적어도 하나의 퓨린 유사체에 내성이고 T-세포 수용체 알파 요소를 코드하는 방해된 유전자를 포함하는, 서열번호 31, 32 또는 160의 CAR를 발현시키는 단리된 T 세포에 대한 것이다.
더 바람직한 예에서, 본 발명은 CD123에 결합하고 CD123을 발현시키는 세포들을 파괴하며 적어도 하나의 퓨린 유사체에 내성이고 T-세포 수용체 알파 요소를 코드하는 방해된 유전자를 포함하는, 서열번호 160의 CAR를 발현시키는 단리된 T 세포에 대한 것이다.
더 바람직한 예에서, 본 발명은 CD123에 결합하고 CD123을 발현시키는 세포들을 파괴하며 적어도 하나의 퓨린 유사체에 내성이고 T-세포 수용체 베타 요소를 코드하는 방해된 유전자를 포함하는, 서열번호 160의 CAR를 발현시키는 단리된 T 세포에 대한 것이다.
또다른 특정 예에서, 상기 항-CD123 CAR를 발현시키는 T 세포는 dCK 또는 HPRT 유전자와 같은 적어도 하나의 방해된 약물 민감성 유전자를 포함한다. 더 특정 예에서, 상기 단리된 항-CD123 CAR T-세포는 방해된 HPRT 유전자를 포함하고 DHFR 돌연변이체를 발현시킨다; 상기 단리된 항-CD123 CAR T-세포는 방해된 HPRT 유전자를 포함하고 IMPDH2 돌연변이체를 발현시킨다; 상기 단리된 항-CD123 CAR T-세포는 방해된 HPRT 유전자를 포함하고 칼시뉴린 돌연변이체를 발현시킨다; 상기 단리된 항-CD123 CAR T-세포는 방해된 HPRT 유전자를 포함하고 AGT 돌연변이체를 발현시킨다.
특히, 본 발명은 단리된 T-세포, 특히 단리된 동종이계(allogeneic) 항-CD123 CAR를 발현시키는 T-세포, 그리고 바람직하게는 서열번호 31 32 또는 160의 서열을 갖는 펩타이드를 포함하는, 단리된 동종이계(allogeneic) 항-CD123 CAR를 발현시키는 T-세포에 대한 것이고, 상기 단리된 동종이계(allogeneic) 항-CD123 CAR를 발현시키는 T-세포는 더욱 특히 퓨린 유사체에 내성이고, 그리고 퓨린 유사체들의 존재 하 면역요법에 특히 적합하다.
한 측면에서, 본 발명은 단리된 면역 세포들을 조작하여 그것을 클로로파라빈(clorofarabine) 또는 플루다라빈과 같은 퓨린 유사체들(analogs) (퓨린 뉴클레오타이드 유사체들(analogs) 또는 PNA)에 내성으로 만들어, 그것들이 이들 종래 화학요법들로 미리 치료된 환자들에서 암 면역요법 치료들에 사용될 수 있는, 방법들을 제공한다.
약물들에 대한 내성은 dcK 및/또는 HPRT 유전자들과 같은, 약물 (약물 민감성 유전자(들))에 대한 세포의 민감도의 원인이 되는 하나 이상의 유전자(들)을 불활성화시킴으로써 본 발명의 단리된 T-세포에 부여될 수 있다.
면역 체크 포인트들
본 발명은 항-CD123 CAR, 특히 서열번호 31의, 또는 서열번호 32의, 또는 서열번호 160의 항-CD123 CAR를 발현시키는 동종이계(allogeneic) dCK KO T-세포들 을 제공하고, 이때 T-세포 수용체 (TCR)의 하나 이상의 요소를 발현시키는 적어도 하나의 유전자는 불활성화되고 그리고/또는 유전자들 CTLA4, PPP2CA, PPP2CB, PTPN6, PTPN22, PDCD1, LAG3, HAVCR2, BTLA, CD160, TIGIT, CD96, CRTAM, LAIR1, SIGLEC7, SIGLEC9, CD244, TNFRSF10B, TNFRSF10A, CASP8, CASP10, CASP3, CASP6, CASP7, FADD, FAS, TGFBRII, TGFBRI, SMAD2, SMAD3, SMAD4, SMAD10, SKI, SKIL, TGIF1, IL10RA, IL10RB, HMOX2, IL6R, IL6ST, CSK, PAG1, SIT1, FOXP3, PRDM1 (orblimp1), BATF, GUCY1A2, GUCY1A3, GUCY1B2, GUCY1B3로부터 선택되는 하나의 유전자가 WO2014/184741에 언급된 대로 불활성화된다.
본 발명의 추가의 측면에 따라, 면역 세포들은 더 처리되어 그것들을 더욱 활성으로 만들 수 있거나, 또는 CTLA4, PPP2CA, PPP2CB, PTPN6, PTPN22, PDCD1, LAG3, HAVCR2, BTLA, CD160, TIGIT, CD96, CRTAM, LAIR1, SIGLEC7, SIGLEC9, CD244, TNFRSF10B, TNFRSF10A, CASP8, CASP10, CASP3, CASP6, CASP7, FADD, FAS, TGFBRII, TGFBRI, SMAD2, SMAD3, SMAD4, SMAD10, SKI, SKIL, TGIF1, IL10RA, IL10RB, HMOX2, IL6R, IL6ST, CSK, PAG1, SIT1, FOXP3, PRDM1 (orblimp1), BATF, GUCY1A2, GUCY1A3, GUCY1B2, GUCY1B3 로부터 선택되는 하기 유전자와 같은, T-세포들 활성화의 조절인자들로서 작용하는 "면역 체크포인트들"로서 작용하는 단백질들을 코드하는 유전자들을 불활성화시킴으로써 고갈을 제한할 수 있고, 바람직하게는, 상기 유전자는 PDCD1 또는 CTLA-4이다. 발현이 본 발명의 T 세포들에서 감소 또는 억제될 수 있었던 유전자들의 예들은 표 9에 표시된다.
한 예에서 상기 유전자는 베타 2 마이크로글로불린 단백질을 코드하는 T-세포들 활성화의 조절인자로서 작동하는 유전자이다.
본 발명의 추가적 측면에 따라, 본 발명의 항-CD123 CAR-면역 세포들은 더 조작되어 그것들을 약물, 특히, 암, 특히 AML과 같은 CD123-발현시키는 세포-매개되는 암에 대항하는 화학요법 동안 사용되는 약물에 내성으로 만들 수 있다. 이것은 상기 약물에 대한 내성을 부여하는 유전자를 도입함으로써 달성될 수 있다. 이 동일한 유전자는 전술한 대로 유전자 유도성 억제/발현 시스템을 이용하여 켜지고 꺼질 수 있다 (Garcia EL, Mills AA (2002) Getting around lethality with inducible Cre-mediated excision. Semin Cell Dev Biol 13:151-8 , Lewandoski M (2001) Conditional control of gene expression in the mouse. Nat Rev Genet 2:743-55 ; Scharfenberger L, Hennerici T, Kirly G et al. (2014) Transgenic mouse technology in skin biology: Generation of complete or tissue-specific knockout mice. J Invest Dermatol 134:e16 ; Schwenk F, Kuhn R, Angrand PO et al. (1998) Temporally and spatially regulated somatic mutagenesis in mice. Nucleic Acids Res 26:1427-32.
서열번호 31에, 서열번호 32에, 또는 서열번호 160에 대응되는 서열의 항-CD123 CAR -발현시키는, PNA 내성 면역 T 세포가 본 발명의 목적이고, 이때 이런 식으로, (i) T-세포 수용체 (TCR)의 하나 이상의 요소를 발현시키는 적어도 하나의 유전자가 불활성화되고 (ii) (PNA 외) 약물에 내성을 부여하는 적어도 하나의 유전자가 통합되거나 또는 (PNA 외) 상기 약물에 민감성을 부여하는 유전자가 결실되거나 또는 불활성화되도록 돌연변이되고 (iii) 표 9에 개시된 유전자로부터 선택되는 또다른 유전자가 선택적으로 불활성화된다.
본 발명은 본 발명의 방법에 의하여 수득가능한 단리된 항-CD123 CAR-면역 세포들 또는 세포주들, 더욱 특히 여기에 기재된 단백질들, 폴리펩타이드들, 대립형질(allelic) 변종들, 변화된(altered) 또는 결실된(deleted) 유전자들 또는 벡터들 중 임의의 것을 포함하는 단리된 세포들을 포함한다.
이 목적은 암, 특히 AML, 난치성 재발 AML, BPDNL의 치료를 위하아ㅕ 제공된다.
본 발명의 면역 세포들 또는 세포주들은 외인성 재조합 폴리뉴클레오타이드들, 특히 CAR들 또는 (서열번호 161을 코드하는) 자살 유전자(들)을 더 포함할 수 있고, 이상적으로는 "기성품인" 제품으로서, 치료적 제품으로서 그것들의 효율에 공헌하는, 체크포인트 단백질들 또는 그것들의 리간드들을 코드하는, 변화된 또는 결실된 유전자들을 포함할 수 있다.
또다른 측면에서, 본 발명은 상기 방법들에 의하여 수득가능한 조작된 면역 세포를 적어도 한 번 투여함으로써 환자에게서 암을 예방 또는 치료하는 방법에 대한 것이다.
<표 8>
Figure pct00027
Figure pct00028
표 5: 본 발명의 조작된 T 세포들에서 변형된 면역 체크포인트 단백질들을 코드하는 유전자들의 리스트
상기 유전자들의 하나, 바람직하게는 두 개의 대립형질들이 본 발명의 조작된 T 세포들에서 변형되고, 자리는 KO 상기 유전자/대립형질에 사용된 TALEN의 각 제조를 위해 확인된다.
바람직한 예에서, 면역 세포들을 더 조작하는 상기 방법은 DNA 절단에 의하여 상기 언급된 유전자들을 선택적으로 불활성화시키기 위하여, 폴리뉴클레오타이드들, 특히 특이적 희귀-절단 엔도뉴클레아제를 코드하는 mRNA들을, 상기 T 세포들 내로 도입시키는 단계를 포함한다. 더 바람직한 예에서, 상기 희귀-절단 엔도뉴클레아제들은 TALE-뉴클레아제들 또는 Cas9 엔도뉴클레아제이다. TAL-뉴클레아제들은 지금까지 다른 타입들의 희귀-절단 엔도뉴클레아제들을 넘는 더 높은 특이성 및 절단 효율을 입증하여 왔고, 이는 그것들을 불변(constant) 턴오버(turn-over)와 대규모로 조작된 면역 세포들의 생산 용으로 선택되는 엔도뉴클레아제들로 만든다.
전달 방법들
전술한 다른 방법들은 약물 내성 유전자, 희귀-절단 엔도뉴클레아제, 키메라 항원 수용체 (CAR), 특히 항-CD123 CAR 그리고 더 특히 서열번호 31, 또는 32 또는 160을 포함하는 CAR와 같은 관심있는 단백질을 발현시키는 단계 및 /단리된 세포 내로 자살 도메인을 포함하는 단계를 수반한다.
제한되지 않는 예로서, 관심있는 상기 단백질은 바람직하게는 적어도 하나의 플라스미드 벡터에 의하여 코드되는 이식유전자로서 그것의 도입에 의하여 세포에서 발현될 수 있다. 폴리펩타이드들은 세포 내로 상기 폴리펩타이드들을 코드하는 폴리뉴클레오타이드들의 도입의 결과로서 세포에서 발현될 수 있다. 대체하여, 상기 폴리펩타이드들은 세포 밖에서 생산되고 그 다음에 거기로 도입될 수 있었다.
세포들 내로 폴리뉴클레오타이드 구조체를 도입시키는 방법들은 당업계에 알려져 있고 제한되지 않는 예들로서 이때 폴리뉴클레오타이드 구조체는 세포의 게놈 내로 통합되는 안정적인 형질전환 방법들, 폴리뉴클레오타이드 구조체가 세포의 게놈 내로 통합되지 않는 일시적 형질전환 방법들 및 바이러스 매개되는 방법들을 포함한다.
상기 폴리뉴클레오타이드들은 예컨대, 재조합 바이러스 벡터들 (예컨대 레트로바이러스들, 아데노바이러스들), 리포좀 등에 의하여 세포 내로 도입될 수 있다.예를 들어, 일시적 형질전환(transformation) 방법들은 예를 들어 미세주입(microinjection), 전기천공법(electroporation) 또는 입자 총(particle bombardment), 세포 융합을 포함한다. 상기 폴리뉴클레오타이드들은 세포들에서 발현되는 관점에서, 벡터들, 더욱 특히 플라스미드들 또는 바이러스 내에 포함될 수 있다. 상기 플라스미드 벡터는 상기 벡터를 받는 세포들의 확인 및/또는 선택을 위하여 제공하는 선택 마커를 포함할 수 있다.
다른 이식유전자들은 하나의 벡터 내 포함될 수 있다. 상기 벡터는 2A 펩타이드를 코드하는 서열과 같은 라이보좀 스킵 서열을 코드하는 핵산 서열을 포함할 수 있다. 피코르나바이러스들(picornaviruses)의 아프트로바이러스(Aphthovirus) 서브그룹으로 확인된 2A 펩타이드들은 코돈들에 의하여 코드되는 두 아미노산들 사이에서 펩타이드 결합의 형성 없이 하나의 코돈에서 옆의 것으로 라이보좀 "스킵"을 야기한다 (Donnelly et al., J. of General Virology 82: 1013-1025 (2001); Donnelly et al., J. of Gen. Virology 78: 13-21 (1997); Doronina et al., Mol. And. Cell. Biology 28(13): 4227-4239 (2008); Atkins et al., RNA 13: 803-810 (2007) 참조).
"코돈"에 의하여 하나의 아미노산 잔기 내로 라이보좀에 의하여 번역되는 mRNA (또는 DNAㅇ 분자의 센스 가닥 상) 세 개의 뉴클레오타이드들이 의미된다. 이런 식으로, 두 개의 폴리펩타이드들이 폴리펩타이드들이 인 프레임인 2A 올리고펩타이드 서열에 의하여 분리될 때, mRNA 내에서 단일의, 인접한 오픈 리딩 프레임으로부터 합성될 수 있다. 이러한 라이보좀 스킵 메커니즘들은 업계에 잘 알려져 있으며, 단일 메신저 RNA에 의하여 코드되는 몇몇 단백질들의 발현을 위한 몇몇 벡터들에 의하여 사용되는 것으로 알려져 있다.
본 발명의 더 바람직한 예에서, 본 발명에 따른 폴리펩타이드들을 코드하는 폴리뉴클레오타이드들은 예를 들어, 전기천공에 의하여 세포들 내로 직접 도입되는 mRNA일 수 있다. 본 발명자들은 T-세포에서 mRNA 전기천공을 위한 최적 조건을 결정하였다. 본 발명자는 세포들 내로 물질의 전달을 위하여 살아있는 세포들을 일시적으로 투과성으로 만드는 것을, 펄스된(pulsed) 전기장들의 이용에 의하여, 가능하게 하는 사이토펄스(cytoPulse) 기술을 사용하였다. PulseAgile (BTX Havard Apparatus, 84 October Hill Road, Holliston, MA 01746, USA)의 이용에 기초한 그 기술, 전기천공 파형들은 펄스 기간(duration), 강도와 더불어 펄스들 간의 간격(interval)의 자세한 통제를 허락한다 (U.S. patent 6,010,613 및 International PCT application WO2004083379). 이들 파라미터들 모두는 최소 치사율(mortality)로 높은 형질주입(transfection) 효율을 위한 최고의 조건들에 도달하기 위하여 변형될 수 있다. 기본적으로, 첫 번째 높은 전기장 펄스들은 포어(pore) 형성을 가능하게 하는 반면, 그 다음의 더 낮은 전기장 펄스들은 세포 내로 폴리뉴클레오타이드를 옮기는 것을 가능하게 한다.
전술한 다른 방법들은 세포 내로 서열번호 31, 서열번호 32 또는 서열번호 160의 CD123 CAR을 도입하는 단계를 포함한다. 제한되지 않는 예로서, 상기 CAR는 하나의 플라스미드 벡터에 의하여 코드되는 이식유전자들로서 도입될 수 있다. 상기 플라스미드 벡터는 또한 상기 벡터를 받는 세포들의 확인 및/또는 선택을 위하여 제공하는 선택 마커를 포함할 수 있다.
폴리펩타이드들은 세포 내로 상기 폴리펩타이드들을 코드하는 폴리뉴클레오타이드들의 도입의 결과로서 세포에서 인 시추(in situ)로 합성될 수 있다. 대체하여, 상기 폴리펩타이드들은 세포 밖에서 생산되고 그 다음에 거기로 도입될 수 있었다. 세포들 내로 폴리뉴클레오타이드 구조체를 도입하는 방법들은 업계에 알려져 있으며, 제한되지 않는 예들로, 폴리뉴클레오타이드 구조체가 세포의 게놈 내로 통합되는 안정적인 형질전환(transformation) 방법들, 폴리뉴클레오타이드 구조체가 세포 게놈 내로 통합되지 않는 일시적인 형질전환 방법들 및 바이러스 매개 방법들을 포함한다. 상기 폴리뉴클레오타이드들은 예를 들어, 재조합 바이러스 벡터들 (예컨대 레트로바이러스들, 아데노바이러스들), 리포좀(liposome) 등에 의하여 세포 내로 도입될 수 있다. 예를 들어, 일시적 형질전환 방법들은 미세주입, 전기천공법 또는 입자 총을 포함한다. 상기 폴리뉴클레오타이드들은 벡터들, 더욱 특히 세포들에서 발현되는 관점에서 플라스미드들 또는 바이러스 내 포함될 수 있다.
조작된 면역 세포들
본 발명은 또한 세포들을 조작하기 위하여 상기 방법에 의하여 수득되는 것을 할 수 있는 단리된 세포들 또는 세포주들에 대한 것이다. 특히 상기 단리된 세포는 전술한 바와 같이 적어도 하나의 CAR를 포함한다. 또다른 예에서, 상기 단리된 세포는 각각이 다른 세포외 리간드 결합 도메인들을 포함하는 CAR들의 군집을 포함한다. 특히 상기 단리된 세포는 CAR를 코드하는 외인성 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 본 발명의 유전적으로 변형된 면역 세포들은 활성화되고 항원 결합 메커니즘들에 독립적으로 증식한다.
본 발명의 범위에는 또한 단리된 면역 세포, 바람직하게는 전술한 방법들 중 어느 하나에 따라 수득되는 T-세포가 포함된다. 상기 면역 세포는 선천적 및/또는 입양 면역 반응의 개시 및/또는 실행에 기능적으로 수반되는 조혈 기원의 세포를 가리킨다. 본 발명에 따른 상기 면역 세포는 줄기 세포로부터 유래될 수 있다. 줄기 세포들은 성체 줄기 세포들, 인간이 아닌 배아 줄기 세포들, 더욱 특히 인간이 아닌 줄기 세포들, 제대혈 줄기 세포들, 간세포들, 골수 줄기 세포들, 유도 다능성(pluripotent) 줄기 세포들, 전능(totipotent) 줄기 세포들 또는 조혈 줄기 세포들일 수 있다. 대표적인 인간 세포들은 CD34+ 세포들이다. 상기 단리된 세포는 또한 수지상 세포, 킬러 수지상 세포, 비만 세포, NK-세포, B-세포 또는 염증성 T-림프구들, 세포독성 T-림프구들, 조절성 T-림프구들 또는 헬퍼 T-림프구들로 구성된 군으로부터 선택된 T-세포일 수 있다. 또다른 예에서, 상기 세포는 CD4+ T-림프구들 및 CD8+ T-림프구들로 구성되는 군으로부터 유래될 수 있다. 본 발명의 세포들이 확장 및 유전적 변형 전, 세포들의 소스가 제한되지 않는 여러가지 방법들을 통하여 대상으로부터 수득될 수 있다. T-세포는 말초 혈액 단핵 세포들, 골수, 림프절 조직, 제대혈, 흉선 조직, 감염 부위로부터의 조직, 복수(ascites), 흉막(pleural) 삼출액(effusion), 비장(spleen) 조직, 및 종양들을 포함하는 여러가지 제한되지 않는 소스들로부터 수득될 수 있다. 본 발명의 특정 예들에서, 이용가능하고 업계에 알려진 많은 T 세포주들이 사용될 수 있다. 또다른 예에서, 상기 세포는 건강한 기증자, 암으로 진단받은 환자 또는 감염으로 진단받은 환자로부터 유래될 수 있다. 또다른 예에서, 상기 세포는 다른 표현형 특성들을 보이는 세포들의 혼합된 군집의 부분이다. 본 발명의 범위는 또한 전술한 방법에 따라 형질전환된 T- 세포로부터 수득된 세포주를 포함한다. 면역억제 치료에 내성이며 상기 방법에 의하여 수득될 수 있는 변형된 세포들은 본 발명의 범위에 포함된다.
바람직한 예에서, 본 발명은 전술한 대로 서열번호 31, 서열번호 32 또는 서열번호 160에 대응하는 서열을 갖는 CD123 CAR를 지닌 것으로 여겨지는 T-세포들의 군집 또는 T-세포들을 제공하고, 그것은 기능적 TCR을 발현시키지 않고 PNA에 내성이고 그리고 환자들 내로, 바람직하게는 AML, 난치성 재발 AML, BPDNL 또는 림프구증식성 장애으로 고통받는 환자들 내로, 또는 골수 이식 전 치료로서, 그것들의 입양 이동을 위하여, CD123 양성 세포들을 향하여 반응성이다.
더 바람직한 예로서, 본 발명은 CD123 CAR을 지닌 것으로 여겨지는 T-세포들의 군집 또는 T-세포들을 제공하고, 이때 CD123 CAR은 서열번호 31, 서열번호 32 또는 서열번호 160에 대응하는 서열을 갖고, 전술한 바와 같이, CD123 양성 세포들을 향하여 반응성이고, 기능적 TCR을 발현시키지 않고 선택된 PNA에 내성이며, 상기 선택된 PNA로 치료된 환자들 내로 그것들의 동종이계(allogeneic) 이식을 위하한 것이다.
더욱 더 바람직한 예로서, 본 발명은 또다른 치료와 조합하여 서열번호 31, 서열번호 32 또는 서열번호 160에 대응하는 서열을 갖는 CD123 CAR의 폴리펩타이드를 포함하는 항-CD123 CAR를 지닌 것으로 여겨지는 TRC KO dCK KO T-세포들의 군집 또는 T-세포들을 제공한다.
T 세포들의 활성화 및 확장
T-세포들의 유전적 변형 전 또는 후에, T-세포들은 예를 들어, 본 발명의 유전적으로 변형된 면역 세포들이 항원 결합 메커니즘들에 독립적으로 활성화되고 증식되는데도 불구하고, 면역 세포들, 특히 본 발명의 T-세포들은 예를 들어 U.S. 특허들 6,352,694; 6,534,055; 6,905,680; 6,692,964; 5,858,358; 6,887,466; 6,905,681; 7,144,575; 7,067,318; 7,172,869; 7,232,566; 7,175,843; 5,883,223; 6,905,874; 6,797,514; 6,867,041; 및 U.S. 특허 출원 공개 No. 20060121005 에 기재된 대로 방법들을 이용하여 일반적으로 더 활성화되고 확장될 수 있다. T-세포들은 인 비트로 또는 인 비보에서 확장될 수 있다.
일반적으로, 본 발명의 T 세포들은 T 세포를 위한 활성화 신호를 만들기 위하여, T-세포들의 표면 상 공-자극 분자 및 CD3 TCR 복합체를 자극하는 제제와의 접촉에 의하여 확장된다. 예를 들어, 칼슘 이노포어(ionophore) A23187, 포르볼(phorbol) 12-미리스테이트(myristate) 13-아세테이트(acetate) (PMA), 또는 피토헤마글루티닌(phytohemagglutinin) (PHA) 같은 분열촉진(mitogenic) 렉틴들(lectins)과 같은 화학물질들이 T-세포의 활성화 신호를 만들기 위하여 사용될 수 있다.
제한되지 않는 예들로서, T-세포 군집들(populations)은 항-CD3 항체 또는 그것의 항원-결합 단편과의 접촉에 의한 것과 같이 인 비트로로, 또는 표면에 고정된 항-CD2 항체, 또는 칼슘 이노포어와 함께 단백질 키나아제 C 활성화제(activator) (예컨대, 브리오스타틴(bryostatin))과의 접촉에 의하여, 자극될 수 있다. T-세포들의 표면에서 악세서리(accessory) 분자의 공-자극을 위하여, 악세서리 분자에 결합되는 리간드가 사용된다. 예를 들어, T-세포들의 군집은 T-세포들의 증식을 자극하기에 적합한 조건들 하, 항-CD3 항체 및 항-CD28 항체와 접촉될 수 있다. T 세포 배양에 적합한 조건들은 혈청 (예컨대, 소태아 또는 인간 혈청), 인터루킨-2 (IL-2), 인슐린, IFN-g, 1L-4, 1L-7, GM-CSF, -10, - 2, 1L-15, TGFp, 및 TNF- 또는 당업자에게 알려진 세포들의 성장을 위한 다른 임의의 첨가제들을 포함하는, 증식 및 생존 능력에 필요한 인자들을 포함할 수 있는, 적합한 배지(예컨대, 최소(Minimal) 필수(Essential) 배지(Media) 또는 RPMI Media 1640 또는, X-vivo 5, (Lonza))를 포함한다. 세포들의 성장을 위한 다른 첨가제들은 계면활성제, 플라스마네이트(plasmanate) 및 N-아세틸-시스테인(cysteine) 및 2-머캅토에탄올(mercaptoethanoi)과 같은 환원제들을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 배지는 RPMI 1640, A1M-V, DMEM, MEM, a-MEM, F-12, X-Vivo 1, 및 X-Vivo 20, 및 첨가된 아미노산들과 함께, Optimizer, 나트륨(sodium) 피루베이트(pyruvate) 및 비타민들, 혈청-없이, 또는 적합한 양의 혈청(또는 혈장)이 보충되어, 또는 호르몬들의 정의된 세트, 및/또는 T-세포들의 성장 및 확장에 충분한 양의 사이토카인(들)을 포함할 수 있다. 예컨대, 페니실린 및 스트렙토마이신과 같은 항생제들이 실험 배양에만 포함되고, 대상에 주입되는 세포들의 배양에는 포함되지 않는다. 타겟 세포들은 성장을 지지하는데 필요한 조건들, 예컨대, 적당한 온도 (즉, 37 ℃) 및 대기 (즉, 공기 플러스 5% C02) 하 유지된다. 여러가지 자극 시간들에 노출되어 온 T 세포들은 다른 특성들을 보일 수 있다.
또다른 특정 예에서, 상기 세포들은 조직 또는 세포들과 공-배양함으로써 확장될 수 있다. 상기 세포들은 또한 인 비보, 예를 들어 대상 내로 상기 세포를 투여한 후 대상의 혈액에서 확장될 수 있다.
약학적 조성물들
여기에 본 발명의 유전적으로 조작된 면역 세포들, 예컨대, 서열번호 31, 서열번호 32 또는 서열번호 160에 대응하는 서열을 갖는 유전적으로 조작된 TCR KO- dCK KO CD123 CAR T 세포들,을 포함하는 약학적 조성물들이 제공된다.
여기에 본 발명의 유전적으로 조작된 면역 세포들, 예컨대, 서열번호 188 to 서열번호 197로부터 선택되는 서열들 중 어느 하나에 대응하는 서열을 갖는 유전적으로 조작된 TCR KO- dCK KO CD123 CAR T 세포들,을 포함하는 약학적 조성물들이 제공된다.
또다른 예에서, 본 발명의 유전적으로 조작된 면역 T 세포들, 예컨대, 서열번호 34 to 서열번호 159, 바람직하게는 서열번호 34, 서열번호 76, 서열번호 36, 서열번호 78; 서열번호 37, 서열번호 79, 서열번호 41, 서열번호 83, 서열번호 42, 서열번호 8), 서열번호 43, 서열번호 85, 서열번호 46, 서열번호 47, 서열번호 48, 서열번호 49, 서열번호 88, 서열번호 89, 서열번호 90, 서열번호 91, 서열번호 52, 서열번호 53, 서열번호 54, 서열번호 55, 서열번호 94, 서열번호 95, 서열번호 96, 및 서열번호 97로부터 선택된 서열을 갖는 것으로부터 선택된 서열 중 어느 하나를 갖는 유전적으로 조작된 TCR KO dCK KO CD123 CAR가 제공된다.
이 공개에 따라, 용어 "약학적 조성물"은 개인에게 투여를 위한 조성물에 대한 것이다. 바람직한 예에서, 약학적 조성물은 장관외(parenteral), 경피(transdermal), 관내(intraluminal), 동맥 내(intra-arterial), 척추 강내(intrathecal) 또는 정맥(intravenous) 투여 (iv) 또는 암으로 직접 주사를 위한 조성물을 포함한다. 특히 상기 약학적 조성물은 주입 또는 주사 iv를 통하여 개인에게 투여되는 것이 예상된다. 적합한 조성물들의 투여는 다른 방법들, 예컨대, 정맥 (iv), 피하, 복강내, 근육내, 국소 또는 피내(intradermal) 투여에 의하여 영향을 받을 수 있다.
본 공개의 약학적 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체를 더 포함할 수 있다. 적합한 약학적 담체들의 예들은 당업계에 잘 알려져 있으며, 인산 완충 식염수 용액들, 물, 오일/물 에멀젼들과 같은 에멀젼들, 여러 종류의 습윤제들, 멸균 용액들 등을 포함한다. 이러한 담체들을 포함하는 조성물들은 잘 알려진 종래 방법들에 의하여 조제될 수 있다. 이들 약학적 조성물들은 적합한 용량으로 대상에 투여될 수 있다.
투여량(dosage) 식이요법(regimen)은 임상적 요인들 및 담당 의사에 의하여 결정될 것이다. 의학 분야에서 잘 알려져 있듯이, 어느 한 환자에 대한 투여량은 환자의 크기, 신체 표면 면적, 연령, 투여되는 특정 화합물, 성별, 투여의 시간 및 루트, 일반적 건강 및 동시에 투여되는 다른 약물들을 포함하는 많은 요인들에 의존한다. 투여를 위한 투여량의 예는 하루에 체중 킬로그램 당 본 발명에 따른 세포들의 0.24 μg 내지 48 mg, 바람직하게는 0.24 μg 내지 24 mg, 더욱 바람직하게는 0.24 μg 내지 2.4 mg, 더욱 더 바람직하게는 0.24 μg 내지 1.2 mg 그리고 가장 바람직하게는 0.24 μg 내지 240 mg 단위의 범위 내일 수 있다. 특히 바람직한 투여량들은 여기 하기에 나열된다. 진행은 주기적인 평가에 의하여 모니터링될 수 있다.
개시된 CAR 세포 조성물들은 국부적으로 또는 온몸에 투여될 수 있다. 투여는 일반적으로 장관외, 예컨대, 정맥일 것이다; DNA는 또한 타겟 부위에 직접적으로, 예컨대, 내부 또는 외부의 타겟 부위로 유전자총주입(biolistic) 전달에 의하여 또는 동맥에서 카테터에 의하여 부위로, 투여될 수 있다. 바람직한 예에서, 약학적 조성물은 피하로 그리고 더욱 더 바람직한 예에서 정맥으로 투여된다. 장관외 투여의 제조는 멸균 수성 또는 비-수성 용액들, 현탁액들 및 에멀젼들을 포함한다. 비-수성 용매들의 예들은 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 오일들, 및 올레산 에틸(ethyl oleate)과 같은 주사 가능한 유기 에스터들이다. 수성 담체들은 물, 알코올/수성 용액들, 에멀젼들 또는 식염수 및 버퍼인 매질(media)들을 포함하는 현탁액들을 포함한다. 장관외 비히클들은 염화나트륨 용액, 링거(Ringer) 덱스트로스(dextrose), 덱스트로스 및 염화나트륨, 링거 젖산(lactated Ringer) 또는 고정유들을 포함한다. 정맥내 비히클들은 유체 및 영양 보충물들(replenishes), 전해질 보충물들(replenishers) (링거 덱스트로스에 기반한 것들과 같은), 등을 포함한다. 방부제들 및 다른 첨가제들은 또한 예컨대, 항균제들, 항-산화제들, 킬레이팅 제제들, 및 불활성 기체들 등과 같이 존재할 수 있다. 추가로, 본 개시의 약학적 조성물은 예컨대, 바람직하게는 인간 기원의, 혈청 알부민 또는 면역글루불린과 같은 단백성 담체들을 포함할 수 있다. 본 개시의 약학적 조성물은 (이 공개에서 기재된 대로) 단백성 이중특이적 단일 체인 항체 구조체들, 또는 그것을 코드하는 벡터들 또는 핵산 분자들에 추가하여, 약학적 조성물의 의도되는 용도에 의존하여, 더 생물학적으로 활성인 제제들을 포함할 수 있다.
여기에 기재된 조성물들 중 임의의 것이 키트에 포함될 수 있다. 제한되지 않는 예에서, 재조합 발현 벡터들을 이용하는(harbor) 세포 치료에의 사용을 위한 하나 이상의 세포들을 만들기 위한 시약들 및/또는 세포 치료에의 사용을 위한 본 발명에 따른 하나 이상의 세포들이 키트에 포함될 수 있다. 키트 요소들은 적합한 용기 수단들로 제공된다.
키트들의 몇몇 요소들은 수성 매질 또는 감압 하 동결건조된(lyophilized) 형태 및 동결된 포장재 하 포장될 수 있다. 키트들의 용기 수단들은 일반적으로 적어도 하나의 바이알들, 테스트 튜브, 플라스크, 병, 시린지 또는 요소가 위치될 수 있는 다른 용기 수단들을 포함할 것이고, 그리고 바람직하게는, 부분시료(aliquoted)일 것이다. 키트에 하나 초과의 요소가 있을 때, 키트는 또한 일반적으로 추가적인 요소들이 분리되어 그 안에 위치될 수 있는 두 번째, 세 번째 또는 다른 추가적 용기를 포함한다. 그러나 요소들의 여러가지 조합들이 바이알에 포함될 수 있다. 키트들은 또한 상업적 규모를 위하여 철저하게 가둬두는 요소들을 포함하기 위한 수단들을 전형적으로 포함할 것이다. 이러한 용기들은 원하는 바이알들이 유지되는 주입 또는 취입성형된 플라스틱 용기들을 포함할 수 있다.
키트의 요소들이 하나 및/또는 그보다 많은 액체 용액들 내에 제공될 때, 액체 용액은 특히 유용한 멸균 수성 용액과, 수성 용액이다. 몇몇 경우들에서, 용기는 이로부터 제형이 신체의 감염된 부위에 적용되고, 동물에게 주사되고, 그리고/또는 거기에 적용되고 그리고/또는 키트의 다른 요소들과 함께 혼합되는, 시린지, 피펫 및/또는 다른 이러한 유사한 기구들을 의미한다.
바람직한 예에서, 하나 및/또는 이보다 많은 액체 용액들은 한랭저항성(cryoresistant)이다.
그러나, 키트의 요소들 또는 그것의 부분은 태블릿 또는 건조 분말(들)로서 제공될 수 있다. 시약들 및/또는 요소들이 건조 분말로서 제공될 때, 분말은 적합한 용매의 첨가에 의하여 재구성될 수 있다. 용매는 또한 또다른 용기 수단들에 제공될 수 있는 것이 예상된다. 키트들은 또한 멸균된, 약학적으로 허용가능한 버퍼 및/또는 다른 희석제를 위한 두 번째 용기 수단들을 포함할 수 있다.
특정 예들에서, 세포 치료에 사용되는 세포들은 키트로서 제공되고, 몇몇 예들에서 세포들은 기본적으로 키트의 단독 요소이다. 키트는 원하는 세포를 만들기 위한 시약들 및 물질들을 포함할 수 있다. 특정 예들에서, 시약들 및 물질들은 원하는 서열들을 증폭시키기 위한 프라이머들, 뉴클레오타이드들, 적합한 버퍼들 또는 버퍼 시약들, 염 등을 포함하며, 몇몇 예들에서 시약들은 벡터들 및/또는 여기에 기재한 CAR 분자를 코드하는 DNA 또는 그것들을 위한 조절 요소들을 포함한다.
특정 예들에서, 개인으로부터 하나 이상의 샘플들을 추출하기에 적합한 키트 내 하나 이상의 기구들이 있다. 기구들은 시린지, 메스 등등일 수 있다.
몇몇 경우들에서, 세포 치료 예들에 추가하여, 키트는 또한 예를 들어, 화학요법, 호르몬 요법, 및/또는 면역요법과 같은 이차 암 치료를 포함한다. 키트(들)은 개인들을 위한 특정 암에 맞추어질 수 있고 개인들을 위한 각각의 두 번째 암 치료들을 포함할 수 있다. 바람직하게는 상기 다른 암 치료는 퓨린 유사체이고, FLAG 치료이다.
본 발명의 CD123 CAR를 포함하는 조작된 T-세포들의 치료적 용도들.
여러가지 예들에서, 여기에서 고려되는 것으로서, CAR 구조체들, 핵산 서열들, 벡터들, 숙주 세포들 및/또는 그것을 포함하는 약학적 조성물들은 종양 질환들과 같은 암 질병들의 예방, 치료 또는 개선에 사용된다. 특정 예들에서, 본 공개의 약학적 조성물은 특히 예를 들어, 고형 종양들을 갖는 암을 포함하는, 암의 예방, 개선 및/또는 치료에 유용할 수 있다.
특정 예들에서, 개인에게 공개의 임의의 수많은 세포들의 치료적으로 효과적인 양을 제공하는 단계를 포함하는, 암에 대하여 개인을 치료하는 방법이 제공된다.
특정 측면들에서, 암은 고형 종양이고, 그리고 종양은 임의의 크기일 수 있으나, 특정 예들에서는, 고형 종양들은 지름이 약 2 mm 또는 이보다 크다. 특정 측면들에서, 방법은 개인에게 추가적인 암 치료의 치료적으로 효과적인 양을 제공하는 단계를 더 포함한다.
여기에서 사용한 대로 "치료" 또는 "치료하는"은 병적인 질병 또는 질병의 병적 측면 또는 증상들에 임의의 이로운 또는 바람직한 효과를 포함하며, 예컨대, 암인 치료되는 질병 또는 질환의 하나 이상의 측정가능한 마커들에서 심지어 최소의 감소들을 포함할 수 있다. 치료는 질병 또는 질환의 증상들의 감소 또는 개선 또는 질병 또는 질환의 진행의 지연을 선택적으로 수반할 수 있다. "치료"는 반드시 질병 또는 질환의, 또는 그것의 증상들과 관련된, 완전한 소거 또는 치유를 가리키는 것은 아니다.
여기에서 사용된 대로, "예방," 및 "예방되는", "예방하는" 등과 같은 유사한 단어들은 질병 또는 질환, 예컨대, 암의 발생 또는 재발 가능성을 예방, 억제 또는 감소시키기 위한 접근을 가리킨다. 그것은 또한 질병 또는 질환의 시작 또는 재발의 지연 또는 질병 또는 질환의 증상의 발생 또는 재발의 지연을 가리킨다. 여기에서 사용된 대로 "예방" 및 유사한 단어들은 또한 질병 또는 질환의 시작 또는 재발 전 질병 또는 질환의 강도, 효과, 증상 및/또는 부담을 감소시키는 것을 포함한다.
특정 예들에서, 본 발명은, 부분적으로는, 몇몇 측면에서는, 약학적으로 허용가능한 담체 또는 첨가제와 함께, 표준 벡터들 및/또는 유전자 전달 시스템들을 이용하여 임의의 조합으로, 또는 단독으로 투여되는, 세포들, CAR 구조체들, 핵산 분자들 및 벡터들을 고려한다. 특정 예들에서, 투여 다음에, 상기 핵산 분자들 또는 벡터들은 대상의 게놈 내로 안정적으로 통합될 수 있다.
특정 예들에서, 바이러스 벡터들은 특정 세포들 또는 조직들에 특이적으로 사용될 수 있으며, 상기 세포들에서 지속될 수 있다. 적합한 약학적 담체들 및 첨가제들이 당업계에 잘 알려져 있다. 이 공개에 따라 제조되는 조성물들은 상기 확인된 질병들을 예방 또는 치료 또는 지연시키는데 사용될 수 있다.
게다가, 이 공개는 면역 세포들, 예컨대, T 세포들 또는 세포독성 T 림프구들의 효과적인 양을 그것을 필요로 하는 대상 또는 개인에게 투여하는 단계, 서열번호 31의 CD123 CAR 또는 서열번호 32의 CD123 CAR 또는 서열번호 160의 CD123 CAR; 그것을 코드하는 핵산 서열; 전술한 대로의 공정에 의하여 생산되는 그리고/또는 여기에 기재된 대로 상기 CD123 CAR를 코드하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 벡터를 품는(harbor) 단계를 포함하는 종양성 질병의 예방, 치료 또는 개선 방법에 대한 것이다.
모범적인 CD123 CAR 세포들의 조성물(들)의 투여를 위한 가능한 지시들은 하기를 포함하는, 종양성 질병들을 포함하는, 암 질병들이다:
이 공개의 조성물(들)의 투여는 최소 잔여 질병, 초기 암, 진행 암, 및/또는 재발된 및/또는 난치성 암을 포함하는, 림프구증식성 장애의 모든 단계들 및 종류들에 유용하다.
이 공개는 다른 화합물들, 예컨대 이중특이적 항체 구조체들, 타겟인 독들 또는 면역 세포들을 거쳐 작용하는 다른 화합물들,과 함께 공-투여 프로토콜들을 더 포함한다.
본 발명의 화합물(들)의 공-투여를 위한 임상적 식이요법은 다른 요소의 투여와 동시, 그 전 또는 그 후의 공-투여를 포함할 수 있다. 특정 조합 치료들은 화학요법, 방사선, 수술, 호르몬 요법 또는 다른 타입들의 면역요법을 포함한다.
치료의 특정 용량들은 당업계의 통상적인 방법들을 이용하여 결정될 수 있다. 그러나, 특정 예들에서, 몇몇 경우에는 그것이 2, 3, 4, 5, 6, 또는 그 보다 많은 횟수를 포함하는, 복수 회이긴 하지만, 본 발명의 조작된 CD123 T 세포들이 한 번 그것을 필요로 하는 개인에게 전달된다. 복수 투여량이 주어질 때, 투여량들 사이의 기간은 적절한 임의의 시간일 수 있으나, 특정 예들에서, 그것은 투여량들 사이에서 며칠, 또는 몇주 또는 몇 달이다. T 세포 기증자의 기원들 및 투여량들은 임의의 원하지 않는 부작용들을 피하기 위하여 선택된다. 투여량들 사이의 시간은 단일 식이요법에서 다를 수 있고, (그것을 필요로 하는 환자) 받는 사람(recipient)에 의존적일 수 있다. 특정 예들에서, 투여량들 사이의 시간은 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 또는 그보다 많은 날들(days) 또는 주들(weeks)이다. 특정 예들에서, 그것은 예를 들어, 4-8 또는 6-8 주이다.
특정 예들에서, 하나의 식이요법(regimen)은 본 발명의 CD123 T 세포의 하기 투여량 식이요법 중 하나를 포함한다:
11 x 104/m2 ,
11 x 10 5/m2 ,
11 x 106/m2 ,
23 x 106/m2 ,
31 x 107/m2 43 x 107/m2 ,
51 x 108/m2 ,
또는 104 부터 1010 부터까지의 세포들 /kg.
대체의 예에서, T 세포들은 하기 투여량 식이요법으로 개인에게 제공된다:
투여량 수준 CD123 CTL 투여량
11 x 106/m2 ,
21 x 107/m2 ,
31 x 108/m2 ,
6 104 내지 5.108 까지 세포들 /kg,
본 발명의 CD123 CAR 조작된 면역 세포의 효과적인 양은 각 처리된 개인의 상태에 의존하여 조정될 수 있는 그러한 투여량에 대응된다.
치료적 적용들
또다른 예에서, 본 발명의 상기 단리된 세포로부터 유래된 (일 내지 50의 시험관 내 패시지(passages) 세포 또는 다른 방법에 의하여 수득된 단리된 세포(들)이 의약으로서 사용될 수 있다. 의약으로서 사용될 수 있는 본 발명의 유전적으로 조작된 TCR KO dCK KO CD123 CAR T 세포들은 서열번호 31, 서열번호 32, 서열번호 160, 서열번호 34 중 어느 하나에, 서열번호 159에, 대응하는 서열을 갖는 CD123 CAR를 갖는 것들일 수 있다.
바람직한 예에서, 서열번호 31, 서열번호 32 또는 서열번호 160에 대응하는 서열을 갖는 유전적으로 조작된 TCR KO dCK KO CD123 CAR T 세포들이 의약으로서 사용을 위하여 제공된다.
또다른 바람직한 예에서, 서열번호 34, 서열번호 76, 서열번호 36, 서열번호 78, 서열번호 37, 서열번호 79, 서열번호 41, 서열번호 83, 서열번호 42, 서열번호 8), 서열번호 43, 서열번호 85, 서열번호 46, 서열번호 47, 서열번호 48, 서열번호 49, 서열번호 88, 서열번호 89, 서열번호 90, 서열번호 91, 서열번호 52, 서열번호 53, 서열번호 54, 서열번호 55, 서열번호 94, 서열번호 95, 서열번호 96, 서열번호 97로부터 선택된 서열을 갖는 것으로부터 선택된 서열 중 어느 하나를 갖는 유전적으로 조작된 TCR KO dCK KO CD123 CAR T 세포들이 의약으로서 사용을 위하여 제공된다.
또다른 바람직한 예에서, 서열번호 160, 서열번호 188, 서열번호 189, 서열번호 190, 서열번호 191; 서열번호 192, 서열번호 193,SEQ ID NO. 194, 서열번호 195, 서열번호 196, 서열번호 197로부터 선택되는 서열 중 어느 하나를 갖는 유전적으로 조작된 TCR KO dCK KO CD123 CAR T 세포들이 의약으로서 사용을 위하여 제공된다.
또다른 예에서, 상기 의약은 그것을 필요로 하는 환자에게서 암을 치료하는 데, 특히 B-세포 림프종들 및 백혈병의 치료에 사용될 수 있다.
또다른 예에서, 본 발명에 따른 상기 단리된 세포 또는 상기 단리된 세포 유래의 세포주는 그것을 필요로 하는 환자에게서 암 치료를 위한 의약의 제조에 사용될 수 있다.
특정 예에서, 항-CD123 CAR를 발현시키는 T 세포가 AML의, AML 특수형(subtype)의, AML-관련된 합병증의, AML-관련된 질병의 치료를 위한 의약으로서 제공된다. 바람직한 예에서, 항-CD123 CAR를 발현시키는 T 세포가 의약으로서 제공되고, 이때 상기 항-CD123 CAR는 서열번호 31, 서열번호 32 또는 서열번호 160을 포함한다.
또다른 예에서, 상기 의약은 CD123-발현시키는 세포-매개되는 병적인 질환 또는 CD123-발현시키는 세포의 직접적 또는 간접적 활성에 의하여 특징되는 질환을 치료하는데 사용될 수 있다. 다시 말해서, 본 발명은 CD123-발현시키는 세포들의 해로운 활성에 연결된 질환을 치료하기 위한, 특히 AML, AML 특수형, AML-관련된 합병증, 및 AML-관련된 질환들로부터 선택되는 질환을 치료하기 위한, 의약으로서 그것의 사용을 위한, 서열번호 31, 서열번호 32 또는 서열번호 160의 80% 내지 100%를 포함하는 항-CD123 CAR를 발현시키는 T 세포에 대한 것이다;
또다른 측면에서, 본 발명은 그것을 필요로 하는 환자들을 치료하는 방법들에 의존하며, 상기 방법은 하기 단계들 중 적어도 하나를 포함한다:
(a) 전술한 방법들 중 임의의 하나에 의하여 수득가능한 면역-세포를 제공하는 단계;
(b) 상기 환자에게 상기 형질전환된 면역 세포들을 투여하는 단계,
한 예에서, 본 발명의 상기 T 세포들은 활발한(robust) 인 비보에서 T 세포 확장을 겪을 수 있고, 연장된 시간 동안 계속할 수 있다.
바람직한 예에서, 상기 T 세포는 상기 T 세포들을 선택적으로 파괴하는 항체 또는 약물의 투여에 의하여 파괴된다.
더 바람직한 예에서, 서열번호 31, 서열번호 32, 서열번호 160, 서열번호 34, 중 어느 하나에, 서열번호 159에, 대응되는 서열을 갖는 CD123 CAR를 갖는 본 발명의 유전적으로 조작된 TCR KO dCK KO CD123 CAR T 세포들은 의약/치료로서 사용되고 그 다음에 자살 도메인 RQR8, 또는 CD20 도메인, 또는 서열번호 161을 인식하는 항체를 이용하여, 바람직하게는 리툭시맙을 이용하여, 환자로부터 없어진다.
상기 치료는 개선, 치유 또는 예방일 수 있다. 그것은 자가 면역요법의 일부 또는 동종이계(allogenic) 면역요법 치료의 일부일 수 있다. 자가에 의하여, 환자들을 치료하는데 사용되는 세포들, 세포주 또는 세포들의 군집이 상기 환자로부터 또는 인간(Human) 백혈구(Leucocyte) 항원(Antigen) (HLA) 양립성(compatible) 기증자로부터 유래된다는 것이 의미된다. 동종이계에 의하여, 환자들을 치료하는데 사용되는 세포들, 또는 세포들의 군집이 상기 환자가 아닌 기증자로부터 유래된다는 것이 의미된다.
공개된 방법들과 사용될 수 있는 본 발명의 세포들은 앞선 부분에서 기재된다. 상기 치료는 진단받은 환자들을 치료하는데 사용되고, 이때 전암 또는 악성 암 질환이 CD123-발현시키는 세포들에 의하여, 특히 CD123-발현시키는 세포들의 과잉에 의하여 특징된다. 이러한 질환들은 백혈병 또는 악성 림프구증식성 장애들과 같은 혈액 암들에서 발견된다. 림프구증식성 장애는 림프종, 특히 다발성 골수종, 비-호지킨 림프종, 버킷 림프종, 및 여포성(follicular) 림프종 (작은 세포 및 큰 세포)일 수 있다.
본 발명의 세포들 또는 상기 세포를 포함하는 약학적 조성물을 이용하여 치료될 수 있는 암들은 골수 이식 전, 또는 프리(pre)-B ALL (소아과(pediatric) 지시(indication)), 성인 ALL, 맨틀(mantle) 세포 림프종, 광범위(diffuse) 큰(large) B-세포 림프종, BPDNL, AML, 난치성 재발된 AML을 포함하나 이에 제한되지 않는 혈액 종양들과 같은) 비고형 종양들,을 포함할 수 있다.
본 발명의 CAR들을 발현시키는 CD123 세포로 치료되는 암들의 종류들은, 백혈병 또는 림프구성 악성종양을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 성인 종양들/암들 및 소아 종양들/암들 또한 포함된다.
한 예에서, 본 발명은 CD123를 발현시키는 세포-매개된 질병, 특히 CD123을 발현시키는 세포들-매개된 혈액 암을 포함하고, 상기 조성물은 본 발명의 상기 항-CD123 CAR를 발현시키는 T 세포를 포함하고, 바람직하게는 상기 항-CD123 CAR 는 서열번호 31, 서열32 또는 서열번호 160의 것이고, 더욱 바람직하게는 서열번호 160, 서열번호 188, 서열번호 189, 서열번호 190, 서열번호 191; 서열번호 192, 서열번호 193, 서열번호 194, 서열번호 195, 서열번호 196, 서열번호 197로부터 선택되는 서열을 갖는다. 여기에 개시된 임의의 다른 CD123-매개하는 또는 CD123-수반하는 악성 림프구증식성 장애들은 본 발명의 항-CD123 CAR-발현시키는 세포들로 개선될 수 있다.
바람직한 예에서, 본 발명의 항-CD123 CAR -발현시키는 세포들을 이용하여 치료될 수 있는 암은 백혈병 (AML), 백혈병과 관련된 질병 또는 그것의 합병증이다.
본 발명의 항-CD123 CAR -발현시키는 세포들 을 이용하여 치료될 수 있는 백혈병들은 급성 골수성 백혈병 (AML), 만성 골수성 백혈병, 멜로디스플라스틱(melodysplastic) 증후군, 급성 림프성 백혈병, 만성 림프성 백혈병, 및 골수형성이상(myelodysplastic) 증후군일 수 있다.
본 발명의 항-CD123 CAR-발현시키는 세포들을 이용하여 치료될 수 있는 AML 또는 AML 특수형들은 특히, 급성 골수아구성(myeloblastic) 백혈병, 최소로 분화된 급성 골수아구성 백혈병, 성숙 없는 급성 골수아구성 백혈병, 과립구의 성숙이 있는 급성 골수아구성 백혈병, 전골수성 또는 급성 전골수성(promyelocytic) 백혈병 (APL), 급성 골수단핵구(myelomonocytic) 백혈병, 골수 호산구증가(eosinophilia)와 함께 골수단핵구(myelomonocytic), 급성 단아구(monoblastic) 백혈병 (M5a) 또는 급성 단핵구(monocytic) 백혈병 (M5b), 급성 적혈구(erythroid) 백혈병들으로, 적백혈병(erythroleukemia) (M6a)을 포함하고, 매우 희귀한 순수한 적혈구(erythroid) 백혈병 (M6b), 급성 거핵아구성(megakaryoblastic) 백혈병, 급성 호염기성(basophilic) 백혈병, CD123-양성 세포들을 수반하든, 골수섬유증을 가진 급성 범골수증(panmyelosis)이다.
본 발명의 항-CD123 CAR-발현시키는 세포들을 이용하여 치료될 수 있는 AML의 특수형은 또한 모양(hairy) 세포 백혈병, 필라델피아 염색체-양성 급성 림프모구(lymphoblastic) 백혈병을 포함한다.
AML은 특이적 유전적 비정상들을 갖는 AML으로 분류될 수 있다. 분류는 유도 치료, 재발 위험, 생존에 대한 반응을 예상하는 핵형의 능력에 기초한다.
따라서, 서열번호 31, 서열번호 32 또는 서열번호 160의 본 발명의 항-CD123 CAR-발현시키는 세포들을 이용하여 치료될 수 있는 AML은 염색체들 8 및 21 사이의 전좌 를 갖는 AML, 염색체 16에서 전좌 또는 역위(inversion)를 갖는 AML, 염색체들 9 및 11 사이에서 전좌를 갖는 AML, 염색체들 15 및 17 사이에서 전좌를 갖는 AML (M3), 염색체들 6 및 9 사이에서 전좌를 갖는 AML, 염색체 3에서 전좌 또는 역위를 갖는 AML, 염색체들 1 및 22 사이에서 전좌를 갖는 AML (거핵모구의(megakaryoblastic))일 수 있다.
본 발명은 이들 특정 세포유전학적 마커들과 관련된 AML의 치료에 특히 유용하다.
본 발명은 또한 올(all)-트랜스(trans) 레티노산(retinoic acid) (ATRA)16-19을 이용하여 확인된 t(15;17)(q22;q21)를 가진 환자들과 같은, AML의 특이적 세포유전학적 하위집합들로 환자들의 치료를 위하여, t(8;21)(q22;q22)으로 환자들의 치료를 위하여, 고용량 시타라빈의 반복적인 투여량을 이용하여 확인된 t(8;21)(q22;q22) 또는 inv(16)(p13q22)/t(16;16)(p13;q22)으로 환자들의 치료를 위하여, 서열번호 31, 서열번호 32 또는 서열번호 160의 항-CD123 CAR를 발현시키는 T 세포를 제공한다.
바람직하게는, 본 발명은 FLAG과 조합하여, 열등한 완전 저하(remission) 비율 및 생존을 갖는 것으로 보여져 온, -5/del(5q), -7, 3q의 비정상, 또는 복합적 핵형과 같은 이상들을 갖는 환자들의 치료를 위한, 서열번호 31, 서열번호 32 또는 서열번호 160의 항-CD123 CAR를 발현시키는 T 세포를 제공한다.
환자들의 그룹
바람직한 예에서, 본 발명은 20살 미만의 환자들 또는 60세 초과의 환자들에서 AML의 치료로서 서열번호 31, 서열번호 32 또는 서열번호 160의 항-CD123 CAR를 발현시키는 T 세포를 제공한다.
더 바람직한 예에서, 본 발명은 소아과 치료, 특히 AML, 또는 AML-관련된 질병들 또는 합병증들에 대항한 소아과 치료로서 사용을 위하여 서열번호 31, 서열번호 32 또는 서열번호 160의 항-CD123 CAR를 발현시키는 T 세포을 제공한다.
또다른 바람직한 예에서, 본 발명은 다시 말해서 5년 생존율 미만의 예상되는 생존인 낮은, 나쁜 또는 선호되지 않는 상황을 가진 AML 환자들의 치료로 사용된다. 이 그룹에서, 하기 세포유전학적 특성들: -5; 5q; -7; 7q-;11q23; 비(non) t(9;11); inv(3); t(3;3); t(6;9); t(9;22)을 가진 AML으로 고통받는 환자들은 나쁜 위험 상황과 관련되고 (Byrd J.C. et al., December 15, 2002; Blood: 100 (13)본 발명의 목적으로 또는 본 발명에 따라 치료될 것으로 특히 예상된다.
한 예에서, 본 발명의 항-CD123 CAR를 발현시키는 T 세포는 유도 치료로서, AML의 차도 후 치료로서 또는 AML 환자에서 통합 치료로서 사용될 수 있다. 바람직하게는 서열번호 31, 서열번호 32 또는 서열번호 160의 항-CD123 CAR를 발현시키는 TRC KO 세포들 또는 TCR KO and dck KO T 세포들이 AML의 차도 후 치료로서 또는 AML 환자에서 통합 치료로서 사용된다.
한 예에서, 본 발명의 서열번호 31, 서열번호 32 또는 서열번호 160의 TCR KO, dck KO, 항-CD123 CAR를 발현시키는 T 세포는 AML 재발의 경우, 또는 난치성 또는 내성 AML의 경우에 사용될 수 있다. 바람직하게는 본 발명의 서열번호 31, 서열번호 32 또는 서열번호 160의 TCR KO T dck KO, 항-CD123 CAR를 발현시키는 T 세포는 AML 재발, 또는 난치성 또는 내성 AML을 가진 환자들에게서, 더욱 바람직하게는, 적어도 하나의 다른 항-암 약물과 조합하여, 사용된다.
또다른 바람직한 예에서, 본 발명의 서열번호 31, 서열번호 32 또는 서열번호 160의 TCR KO, dck KO, 항-CD123 CAR를 발현시키는 T 세포는 특히 항-암 치료 후, 골수 소모(depletion) 도중 또는 골수 이식 전, 골수 파괴 후, 발생하는 암 세포들 발달을 예방하기 위하여 사용된다.
AML 합병증들
한 특정 예에서, 본 발명은 환자, 특히 AML 관련 합병증을 겪는 환자의 건강 상태를 개선하는 의약을 제공한다. 더 바람직하게는, 상기 서열번호 31, 서열번호 32 또는 서열번호 160의 TCR KO, dck KO, 항-CD123 CAR를 발현시키는 T 세포는 바람직하게는 FLAG과, AML 관련 합병증의 치료를 위한 의약으로서 사용된다.
합병증 또는 AML 관련 질환은 앞선(preceding) 척수형성이상(myelodysplasia) 기(phase), 이차(secondary) 백혈병, 특히 이차(secondary) AML, 높은 백혈구 수, 및 아우어(Auer) 막대들의 부재를 포함할 수 있다. 다른 것들 중에서, 백혈구울혈 및 중추신경계 (CNS)의 관련, 백혈구 증가, 잔존 질병은 또한 AML 관련 질환 또는 합병증으로 고려된다.
AML 관련된 질병들
한 예에서, 본 발명은 또한 AML과 관련된 병적인 질환의 치료를 위하여 서열번호 31, 서열번호 32 또는 서열번호 160의 TCR KO, dck KO, 항-CD123 CAR를 발현시키는 T 세포를 제공한다. 바람직하게는, 본 발명은 AML과 관련된 병적인 질환의 치료를 위하여 서열번호 31, 서열번호 32 또는 서열번호 160의 TCR KO, dck KO, 항-CD123 CAR를 발현시키는 T 세포를 제공한다.
본 발명은 재발된 또는 난치성 급성 골수성 백혈병의 치료, 성인들에게서 재발된 또는 난치성 급성 전골수성 백혈병, 급성 예비골수성(promyeloid) 백혈병 치료, 60세 초과의 성인들에게서 급성 골수성 백혈병 치료, AML 관련된 골수성 신생물들을 위한, 급성 골수성 백혈병 및 골수형성이상(myelodysplastic) 증후군을 위한, (바람직하게는 서열번호 160, 서열번호 188, 서열번호 189, 서열번호 190, 서열번호 191; 서열번호 192, 서열번호 193, 서열번호 194, 서열번호 195, 서열번호 196, 서열번호 197로부터 선택되는 서열을 갖는, 서열번호 31, 서열번호 32 또는 서열번호 160의 TCR KO, dck KO, 항-CD123 CAR를 발현시키는 T 세포 ) 치료를 제공한다.
또다른 측면에 따라, 본 발명은 AML 관련 질환들, 특히 AML 관련 혈액학적 악성종양(malignancy)의 치료용 조성물을 제공한다.
AML 질병들 관련 혈액학적 악성종양은 AM에 대한 형질전환의 위험 및 골수 혈액 세포들의 비효과적인 생산 (또는 형성장애)에 의하여 결속되는 혈액학적 질병들의 다양한 종류인 척수형성이상(myelodysplasia) 증후군들(syndromes) (MDS, 예전에는 "전백혈병"으로 알려짐) 을 포함한다.
또다른 예에서, 본 발명은 다발성 골수종으로 고통받는 환자의 건강 상태를 개선하는 의약을 제공한다.
AML의 위험과 관련된 다른 병적인 상태들 또는 유전적 증후군들은 본 발명의 적절한 사용으로 개선될 수 있고, 상기 유전적 증후군들은 다운 증후군, 삼염색체성(trisomy), 판코니(Fanconi) 빈혈(anemia), 블룸(Bloom) 증후군, 모세혈관확장성 운동실조(Ataxia-telangiectasia), 블랙팬 다이아몬드(Diamond-Blackfan) 빈혈, 슈바흐만(Schwachman)-다이아몬드(Diamond) 증후군, 리프라우메니(Li-Fraumeni) 증후군, 신경섬유종증(Neurofibromatosis) 타입 1, 심각한(Severe) 선천적 호중구감소증(congenital neutropenia) (코스트만(Kostmann) 증후군으로도 불림)을 포함한다.
다른 CD123-매개된 병적인 질환들
또다른 측면에 따라, 본 발명은 CD123+세포-매개된 질병들의 치료용 조성물을 제공한다. 이들 CD123+세포-매개된 질병들은 염증, 자가면역 질병들을 포함한다.
특히, 본 발명은 위장 점막의 염증 및 더욱 특히, 염증성 장 질병들, 비강 알레르기, 청소년 피부근염과 같은 피부 염증, 혈정액증(hematodermia)과 같은 CD123+세포 매개된 질병들의 치료를 위하여 사용될 수 있다.
본 발명은 자가면역 질병들 특히 키쿠쉬(Kikushi) 질병과 같은 CD123+세포 매개된 질병들의 치료를 위한 의약으로서 사용될 수 있다.
바람직하게는, 본 발명은 엡스타인(Epstein)-바(Barr) 바이러스, 헤르페스 심플렉스 바이러스, 특히 발암(oncogenic) 바이러스들, HHV-8, HHV-6, HTLV 또는 HIV과 같은 바이러스들 때문인 감염, 플라스모디움(plasmodium) 팔시파룸( falciparum), 플라스모디움(Plasmodium) 비박스(vivax), 플라스모디움(Plasmodium) 오발(ovale), 또는 플라스모디움(Plasmodium) 말라리애(malariae) 때문인 감염과 같은 기생충 감염을 포함하는 재발성 감염의 치료를 제공한다.
특히, 본 발명은 엡스타인(Epstein)-바(Barr) 바이러스 림파데니티스(lymphadenitis), 헤르페스 심플렉스 림파데니티스를 위한 치료를 제공한다.
또다른 측면에서, 본 발명은 전신 홍반성 루수스 림파데니티스, 결핵, 낭포성 섬유증, 간염, 담관 폐쇄증, 특히 어린이들에게서 바이러스-유도된 간염 또는 담관 폐쇄증, 자가면역 간염; 원발성 쓸개관 간경화의 치료를 위한 조성물을 제공한다.
의약으로서 사용 및 방법을 위한 본 발명에 따른 조작된 T 세포들을 포함하는 조성물
본 발명은 또한 서열번호 160, 서열번호 188, 서열번호 189, 서열번호 190, 서열번호 191; 서열번호 192, 서열번호 193, 서열번호 194, 서열번호 195, 서열번호 196, 서열번호 197로부터 선택되는 서열을 지닌 것으로 여겨지는 또는, 서열번호 31, 서열번호 32 또는 서열번호 160에 대응하는 서열을 갖는 유전적으로 조작된 면역 TCR KO - dCK KO - CD123 CAR T 세포들, 또는
서열번호 34 내지 서열번호 159로부터, 바람직하게는 서열번호 34, 서열번호 76, 서열번호 36, 서열번호 78; 서열번호 37, 서열번호 79, 서열번호 41, 서열번호 83, 서열번호 42, 서열번호 8), 서열번호 43, 서열번호 85, 서열번호 46, 서열번호 47, 서열번호 48, 서열번호 49, 서열번호 88, 서열번호 89, 서열번호 90, 서열번호 91, 서열번호 52, 서열번호 53, 서열번호 54, 서열번호 55, 서열번호 94, 서열번호 95, 서열번호 96 및 서열번호 97로부터 선택되는 서열 중 어느 하나를 갖는 유전적으로 조작된 면역 TCR KO - dCK KO CD123 CAR, T 세포들
을 포함하는 조성물을 제공한다.
바람직하게는, 본 발명은 서열번호 31에 대응하는 서열을 갖는 유전적으로 조작된 면역 TCR KO - dCK KO - CD123 CAR T 세포들을 포함하는 조성물을 제공한다.
바람직하게는, 본 발명은 서열번호 32에 대응하는 서열을 갖는 유전적으로 조작된 면역 TCR KO - dCK KO - CD123 CAR T 세포들을 포함하는 조성물을 제공한다.
바람직하게는, 본 발명은 서열번호 160에 대응하는 서열을 갖는 유전적으로 조작된 면역 TCR KO - dCK KO - CD123 CAR T 세포들
또는 서열번호 160, 서열번호 188, 서열번호 189, 서열번호 190, 서열번호 191; 서열번호 192, 서열번호 193,SEQ ID NO. 194, 서열번호 195, 서열번호 196, 서열번호 197로부터 선택되는 서열 중 어느 하나를 포함하는 조성물을 제공하며,
이는 그것의 사용 또는 BPDNL과 같은 암의 치료 방법 또는 골수 이식 전 이식을 위한 것이다. 한 측면에서, 질병은 혈액 암, 특히 (급성 골수성 백혈병 (AML), 만성 골수성 백혈병, 급성 림프성 백혈병, 만성 림프성 백혈병 및 척수형성이상 증후군과 같은) 백혈병 및 (다발성 골수종, 비-호지킨 림프종, 버킷 림프종, 및 작은 세포- 및 큰 세포-여포성 림프종과 같은) 림프종을 포함하는 악성 림프구증식성 질환들, 또는 그것의 합병증 (재발 난치(refractor) AML)을 포함하는 줄기 세포 암이다.
본 발명은 또한 환자에게서 CD123-발현시키는 세포 군집 또는 활성을 감소 또는 증식 억제시키는 방법 또는 그것의 사용을 위한 상기와 같은 조성물을 제공한다. 모범적인 방법은 CD123-발현시키는 세포를 포함하는 세포들의 군집을 CD123-발현시키는 세포에 결합하는 본 발명의 CD 123 CART 세포와 접촉시키는 단계를 포함한다.
더욱 특이적 측면에서, 본 발명은 환자에게서 CD 123을 발현시키는 암 세포들 의 군집을 감소 또는 증식을 억제하는 방법 또는 그것의 사용을 위한 조성물을 제공하며, 그 방법들은 CD123-발현시키는 암 세포 군집을 CD123-발현시키는 세포에 결합하는 본 발명의 CD 123 CART 세포에 접촉시키는 단계, CD123-발현시키는 암 세포에 본 발명의 CD 123 CART 세포를 결합시켜, CD123-발현시키는 암 세포들의 파괴를 야기하는 단계를 포함한다.
특정 측면들에서, 본 발명의 CD123 CART 세포는 음성 대조군에 비하여, 골수성 백혈병 또는 CD123-발현시키는 세포들과 관련된 다른 암에 대한 동물 모델 또는 이를 갖는 대상에서 세포들 및/또는 암 세포들의 양(quantity), 수, 총량(amount) 또는 퍼센트를 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 65%, 적어도 75%, 적어도 85%, 적어도 95%, 또는 적어도 99% (검출할 수 없는 수준까지)까지 감소시킨다.
본 발명은 CD123-발현시키는 세포들과 관련된 장애 또는 질병 (예컨대, 혈액암 관련)을 예방, 치료 및/또는 관리하는 방법 또는 그것의 사용을 위한 조성물을 제공하며, 방법들은 CD123-발현시키는 세포에 결합하는 본 발명의 CD123 CART 세포를 필요로 하는 대상에게 투여하는 단계를 포함한다. 한 측면에서, 대상은 인간이다. CD123-발현시키는 세포들과 관련된 장애들의 제한되지 않는 예들은 (루푸스와 같은) 자가면역 장애들, (알러지들, IBD, 및 천식과 같은) 염증성 장애들 및 (혈액암들, 특히 AML 또는 AML 합병증들과 같은) 암들을 포함한다.
본 발명은 또한 CD123-발현시키는 세포들과 관련된 질병을 예방, 치료, 및/또는 관리하는 방법 또는 그것의 사용을 위한 조성물을 제공하며, 그 방법은 CD123-발현시키는 세포에 결합하는 본 발명의 CD 123 CART 세포를 필요로 하는 대상에게 투여하는 단계를 포함한다. 한 측면에서, 대상은 인간이다. CD123-발현시키는 세포들과 관련된 질병들의 제한되지 않는 예들은, 급성 골수성 백혈병 (AML), 척수형성이상, B-세포 급성 림프성 백혈병, T-세포 급성 림프성 백혈병, 모양 세포 백혈병, 출아형 원형질 세포의 수지상 세포 신생물 (BPDCN), 만성 골수성 백혈병, 호지킨(Hodgkin) 림프종을 포함한다.
본 발명은 CD123-발현시키는 세포들과 관련된 암의 치료 또는 예방 방법 또는 그것의 사용을 위한 조성물을 제공하며, 방법은 CD123-발현시키는 세포에 결합하는 본 발명의 CD123 CART 세포를 그것을 필요로 하는 대상에게 투여하는 단계를 포함한다. 또다른 측면에서, 방법들은 또다른 치료의 효과적인 양과 조합하여 CD123-발현시키는 세포에 결합하는 본 발명의 CD123 CART 세포의 효과적인 양을 그것을 필요로 하는 대상에게 투여하는 단계를 포함한다.
한 측면에서, CD123은 AML에서 "암 줄기 세포" 마커로 고려된다. 그러므로, 본 발명의 CD123 CART 세포는 AML의 재발을 예방할 수 있고, 또는 CD123+ 세포들 (CD123-발현시키는 세포들)의 "줄기" 군집과 함께 주로 CD123-음성인 AML을 치료도 할 수 있다.
한 측면에서, 본 발명은 CD 19의 높은 발현 수준들과 관련된 질환 또는 장애의 치료를 겪어 온 대상을 치료하기 위한 방법들 및 조성물들을 제공하며, CD123의 높은 수준들과 관련된 질환 또는 장애를 보여준다.
한 측면에서, B-세포 급성 림프성 백혈병 (ALL)은 CART 세포들을 이용하여 연속적 치료를 요구하는 질병의 예이다. 예를 들어, 항-CD 19 CAR T 세포들로 하는 치료는 가끔 본 발명의 항-CD123 CAR T 세포들로 치료될 수 있는 CD19-음성 재발을 야기할 수 있다. 대체하여, 본 발명은 항-CD 19 CAR 및 항-CD 123 CAR를 포함하는 CART 세포들을 이용하여 B- ALL을 이중 타겟팅하는 것을 포함한다.
본 발명에 따른 조작된 면역 세포들로 하는 치료는 항체들 치료, 화학요법, 사이토카인들 치료, 수지상 세포 치료, 유전자 치료, 호르몬 치료, 레이저 광 치료 및 방사선 요법의 군으로부터 선택되는 암에 대항한 하나 이상의 치료들과 조합될 수 있다.
바람직하게는, 본 발명에 따른 조작된 면역 세포들로 하는 치료는 아라사이틴(aracytine), 사이토신 아라비노사이드, 암사크린, 다우노루비신(daunorubicine), 이다루비신, 노반트론, 미톡산트론, 베페사이드, 에토포시드 (VP16), 삼산화비소(arsenic trioxyde), 트랜스레티노산(transretinoic acid), 삼산화비소(arsenic trioxyde)의 조합, 트랜스레티노산(transretinoic acid), 메클로레타민, 프로카르바진, 클로람부실, 및 그것의 조합으로부터 선택되는 암에 대항한 하나 이상의 치료들과 (예컨대, 그 전, 동시에 또는 그 후에) 조합으로 투여될 수 있다.
본 발명의 바람직한 예에 따라, 상기 치료는 면역억제제 치료를 겪는 환자들에게 투여될 수 있다. 정말로, 본 발명은 바람직하게는 이러한 면역억제 제제와 같은 수용체를 코드하는 유전자의 불활성화 때문에 적어도 하나의 면역억제 제제에 내성으로 만들어진, 세포들 또는 세포들의 군집에 의존한다. 이 측면에서, 면역억제 치료는 선택 및 환자 내에서 본 발명에 따른 T-세포들의 확장을 도와야 한다.
본 발명에 따른 세포들 또는 세포들의 군집의 투여는 에어로졸 흡입, 주사, 섭취, 투입(transfusion), 임플란트(implantation) 또는 이식(transplantation)을 포함하는, 임의의 종래 방식으로 수행될 수 있다. 여기에서 기재된 조성물들은 환자에게 피하로, 피내로, 종양내로, 절내로(intranodally), 척수내로(intramedullary), 근육내로, 정맥 또는 림프절(intralymphatic) 주사에 의하여, 또는 복강내로 환자에게 투여될 수 있다. 한 예에서, 본 발명의 세포 조성물들은 바람직하게는 정맥 주사에 의하여 투여된다.
세포들 또는 세포들의 군집의 투여는 kg 체중 당 104-109 세포들, 바람직하게는 그 범위 내 세포 수들의 모든 정수 값들을 포함하는 105 내지 106 세포들/kg 체중으로부터의 투여로 구성될 수 있다. 세포들 또는 세포들의 군집은 하나 이상의 투여량으로 투여될 수 있다. 또다른 예에서, 상기 효과적인 양의 세포들은 일회량으로 투여된다. 또다른 예에서, 상기 효과적인 양의 세포들은 일정 시간의 기간 동안 한 복용량보다 많이 투여된다. 투여 타이밍은 담당 의사의 판단 내이며, 환자의 임상적 상태에 의존한다. 세포들 또는 세포들의 군집은 혈액 은행 또는 기증자와 같은, 임의의 소스로부터 수득될 수 있다. 개인의 필요들이 다른 반면, 당업계에서 특정 질병 또는 질환들에 대한 정해진 세포 타입의 효과적인 양의 최적 범위의 결정. 효과적인 양은 치료적 또는 예방적(prophylactic) 이점을 제공하는 양을 의미한다. 투여되는 복용량은 받는 사람(recipient)의 연령, 건강 및 무게, 함께 이루어지는 치료의 종류, 만약 있다면, 치료의 빈도 및 바람직한 효과의 특성에 의존할 것이다.
또다른 예에서, 상기 효과적인 양의 세포들 또는 그 세포들을 포함하는 조성물은 비경구로 투여된다. 상기 투여는 정맥 투여일 수 있다. 상기 투여는 종양 내로 주사에 의하여 직접적으로 이루어질 수 있다.
본 발명의 특정 예들에서, 세포들은 항바이러스 치료, 시도포비르 및 인터루킨-2와 같은 제제들로 하는 치료, MS 환자들을 위한 나탈리지맙(natalizimab) 또는 시트라빈 (ARA-C로도 알려짐) 치료 또는 건선 환자들을 위한 에팔리즈티맙(efaliztimab) 치료 또는 PML 환자들을 위한 다른 치료들을 포함하나 이에 제한되지 않는 많은 관련 치료 양식들과 함께 (예컨대, 그 전, 동시에 또는 그 후) 환자에게 투여된다. 추가의 예들에서, 본 발명의 T 세포들은 사이클로스포린, 아자티오프린, 메토트렉사트, 마이코페놀레이트(mycophenolate), 및 FK506, 항체들과 같은, 면역억제 제제들, 방사선, 화학요법, 또는 CAMPATH과 같은 다른 면역제거 제제들, 항-CD3 항체들 또는 다른 항체 요법들, 사이톡신, 플루다라빈, 사이클로스포린, FK506, 라파마이신(rapamycin), 마이코프리에놀산(mycoplienolic acid), 스테로이드들, FR901228, 사이토카인들, 및 방사선요법과 조합하여 사용될 수 있다. 이들 약물들은 칼슘 의존적 포스파타제 칼시뉴린 (사이클로스포린 및 FK506)을 억제하거나 또는 성장인자 유도된 신호전달에 중요한 p70S6 키나제 (라파마이신)을 억제한다 (Henderson, Naya et al. 1991; Liu, Albers et al. 1992; Bierer, Hollander et al. 1993). 추가의 예에서, 본 발명의 세포 조성물들은 플루다라빈과 같은 화학요법 제제들, 외부-빔 방사 요법(XRT), 사이클로포스파미드, 또는 CAMPATH 또는 OKT3와 같은 항체들을 이용한 T 세포 제거 요법, 골수 이식과 함께 (예컨대, 그 전, 동시에 또는 그 후) 환자에 투여된다. 또다른 예에서, 본 발명의 세포 조성물들은 CD20와 반응하는 제제들과 같은, 예컨대, Rituxan, B-세포 제거 요법 후 투여된다. 그 경우, 본 발명의 T 세포에서 발현된 CD123 CAR은, 그것이 리툭산 전에 투여되지 않는 한, 서열번호 160으로 구성되지 않는다.
예를 들어, 한 예에서, 대상은 고용량 화학요법으로 표준 치료를 겪을 수 있고 뒤이어 말초혈액 줄기 세포 이식이 이어진다. 특정 예들에서, 이식 후, 대상은 본 발명의 확장된 면역 세포들의 주입을 받는다. 추가적인 예에서, 확장된 세포들은 수술 전 또는 후에 투여된다.
본 발명의 특정 예들에서, 항-CD123 CAR 발현시키는 세포들은 아라사이틴(aracytine), 사이토신 아라비노사이드, 암사크린, 다우노루비신(daunorubicine), 이다루비신, 노반트론, 미톡산트론, 베페사이드, 에토포시드 (VP16), 삼산화비소(arsenic trioxyde), 트랜스레티노산(transretinoic acid), 삼산화비소(arsenic trioxyde)의 조합, 트랜스레티노산(transretinoic acid), 메클로레타민, 프로카르바진, 클로람부실, 및 그 조합으로부터 선택되는 약물과 함께 (예컨대, 그 전, 동시에 또는 그 후) 환자에 투여된다. 이들 예들에서, 항-CD123 CAR를 발현시키는 세포들은 특정 약물 또는 항-CD123 CAR를 발현시키는 세포들과 함께 투여되는 약물들의 조합에 내성일 수 있다.
본 발명의 다른 예들에서, 항-CD123 CAR를 발현시키는 세포들은 시타라빈, 안트라사이클린들, 6-티오구아닌, 수산화요소, 프레드니손, 및 그 조합으로부터 선택되는 약물과 함께 환자에 투여된다.
다른 정의들
- 다르게 특정되지 않는 한, "하나(a)", "하나(an)", "그(the)" 및 "적어도 하나"는 교환가능하게 사용되며 하나보다는 하나 이상을 의미한다. - 폴리펩타이드 서열에서 아미노산 잔기들은 한-문자 코드에 따라 여기에 설계되며, 여기에서 예를 들어, Q는 Gln 또는 글루타민(Glutamine) 잔기를 의미하고, R은 Arg 또는 알기닌(Arginine) 잔기를 의미하고 그리고 D는 Asp 또는 아스파르트산(Aspartic acid) 잔기를 의미한다.
- 아미노산 치환은 하나의 아미노산 잔기의 또다른 것으로의 대체를 의미하며, 예를 들어 펩타이드 서열에서 알기닌 잔기의 글루타민 잔기로의 대체는 아미노산 치환이다.
- 뉴클레오타이드들은 하기와 같이 설계된다: 일-문자 코드가 뉴클레오사이드의 염기를 지시하는데 사용된다: an은 아데닌, t는 티민, c는 사이토신 그리고 g는 구아닌이다. 축퇴된 뉴클레오타이드들에 대하여, r은 g 또는 a (퓨린 뉴클레오타이드들)을 나타내고, k는 g 또는 t를 나타내고, s는 g 또는 c를 나타내고, w는 a 또는 t를 나타내고, m은 a 또는 c를 나타내고, y는 t 또는 c (피리미딘 뉴클레오타이드들)를 나타내고, d는 g, a 또는 t를 나타내고, v는 g, a 또는 c를 나타내고, b는 g, t 또는 c를 나타내고, h는 a, t 또는 c를 나타내고, 그리고 n은 g, a, t 또는 c를 나타낸다.
- 여기에서 사용된 대로, "핵산" 또는 "폴리뉴클레오타이드들"은 디옥시리보핵산 (DNA) 또는 리보핵산 (RNA), 올리고뉴클레오타이드들, 폴리메라제 체인 반응 (PCR)에 의하여 만들어지는 단편들, 라이게이션, 분리(scission), 엔도뉴클레아제 작용, 및 엑소뉴클레아제 작용 중 임의의 것에 의하여 만들어진 단편들과 같은, 뉴클레오타이드들 및/또는 폴리뉴클레오타이드들을 가리킨다. 핵산 분자들은 (DNA 및 RNA와 같은) 자연적으로-발생하는 뉴클레오타이드들, 또는 자연적으로-발생하는 뉴클레오타이드들 (예컨대, 자연적으로-발생하는 뉴클레오타이드들의 거울상이성질체 형태들), 또는 그 둘의 조합인 모노머들로 이루어질 수 있다. 변형된 뉴클레오타이드들은 당 모이어티들 및/또는 피리미딘 또는 퓨린 염기 모이어티들에서 변형을 가질 수 있다. 당 변형들은 예를 들어, 하나 이상의 하이드록실기들의 할로겐들, 알킬기들, 아민들, 및 아다이도(azido) 기들로의 대체를 포함하고, 또는 당들은 에테르 또는 에스터들과 같이 기능적일 수 있다. 게다가, 전체 당 모이어티는 아자(aza)-당들 및 카르복실 당 유사체들과 같은, 입체구조적으로 그리고 전기적으로 유사한 구조들로 대체될 수 있다. 염기 모이어티에서의 변형들의 예들은 알킬화된 퓨린들 및 피리미딘들, 아크릴화된 퓨린들 또는 피리미딘들, 또는 다른 잘 알려진 헤테로사이클릭 치환들을 포함한다. 핵산 모노머들은 포스포다이에스터 연결들 또는 이러한 연결들의 유사체들에 의하여 연결될 수 있다. 핵산들은 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있다.
- 키메라 항원 수용체 (CAR) 에 의하여 특이적 항-타겟 세포 면역 활성을 보이는 키메라 단백질을 만들어내는 T 세포 수용체-활성화시키는 세포내 도메인과, 원하는 항원 (예컨대, 종양 항원)에 대한 예컨대 항체-기반의 특이성인, 타겟 세포 상에 존재하는 요소에 대항하여 결합 도메인을 결합하는 분자들이 의도된다. 일반적으로 CAR는 T 세포 항원 수용체 복합체 제타 체인 (scFv Fc:ζ)의 세포내 신호전달(signaling) 도메인에 융합되는 세포외 단일 체인 항체 (scFv Fc)으로 구성되고, T 세포들에서 발현될 때, 단일클론 항체의 특이성에 기초한 항원 인식으로 방향전환하는 능력을 갖는다. 본 발명에서 사용되는 CAR의 한 예는 CD123 항원에 대항하여 향하는 CAR이고, 제한되지 않는 예로서 아미노산 서열들 : 서열번호 : 23 내지 48 및 160를 포함할 수 있다.
- 용어 "엔도뉴클레아제"는 DNA 또는 RNA 분자, 바람직하게는 DNA 분자 내 핵산들 사이의 결합의 가수분해 (절단)을 촉매화할 수 있는 임의의 야생형 또는 변종 효소를 가리킨다. 엔도뉴클레아제들은 그것의 서열에 관계없이 DNA 또는 RNA 분자를 절단하는 것이 아니라, "타겟 서열들" 또는 "타겟 부위들"로도 언급되는 특이적 폴리뉴클레오타이드 서열들에서 DNA 또는 RNA 분자를 인식하고 절단한다. 엔도뉴클레아제들은 전형적으로 12 염기 쌍들 (bp) 길이보다 더 큰, 더욱 바람직하게는 14-55 bp의 폴리뉴클레오타이드 인식 부위를 가질 때, 희귀-절단 엔도뉴클레아제들로 분류될 수 있다. 희귀-절단 엔도뉴클레아제들은 정의된 자리에서 DNA 이중-가닥 손상들(breaks) (DSBs)을 유도함으로써 상당히 증가한다 (Perrin, Buckle et al. 1993; Rouet, Smih et al. 1994; Choulika, Perrin et al. 1995; Pingoud and Silva 2007). 희귀-절단 엔도뉴클레아제들은 예컨대 호밍(homing) 엔도뉴클레아제 (Paques and Duchateau 2007), FokI 와 같은 제한 효소의 촉매적 도메인과 조작된 징크-핑거 도메인들의 융합으로문터 생긴 키메라 징크-핑거 뉴클레아제 (ZFN) (Porteus and Carroll 2005), CRISPR 시스템으로부터의 Cas9 엔도뉴클레아제 (Gasiunas, Barrangou et al. 2012; Jinek, Chylinski et al. 2012; Cong, Ran et al. 2013; Mali, Yang et al. 2013) 또는 화학적 엔도뉴클레아제 (Eisenschmidt, Lanio et al. 2005; Arimondo, Thomas et al. 2006)일 수 있다. 화학적 엔도뉴클레아제들, 화학적 또는 펩타이드 절단인자는 특이적 타겟 서열을 인식하는 또다른 DNA 또는 핵산들의 폴리머에 콘쥬게이트되고, 이로써 특이적 서열에 대한 절단 활성을 타겟팅한다. 화학적 엔도뉴클레아제들은 또한 특이적 DNA 서열들에 결합하는 것으로 알려진, 오소페난트롤린(orthophenanthroline), DNA 절단(cleaving) 분자, 및 트리플렉스(triplex)-형성(forming) 올리고뉴클레오타이드들(oligonucleotides) (TFOs)의 콘쥬게이트들 같은 합성 뉴클레아제들을 포함한다 (Kalish and Glazer 2005). 이러한 화학적 엔도뉴클레아제들은 본 발명에 따라 "엔도뉴클레아제" 용어 내에 포함된다.
- "TALE-뉴클레아제(nuclease)" (TALEN)에 의하여 핵산 타겟 서열을 절단하기 위하여 하나의 뉴클레아제 촉매적 도메인 및 전사(Transcription) 활성인자(Activator) 유사(Like) 효과기(Effector) (TALE)로부터 보통 유래된 핵산-결합 도메인으로 구성된 융합 단백질이 의도된다. 촉매적 도메인은 바람직하게는 뉴클레아제 도메인이고 더욱 바람직하게는 예를 들어 I-TevI, ColE7, NucA 및 Fok-I와 같은 엔도뉴클레아제 활성을 갖는 도메인이다. 특정 예에서, TALE 도메인은 예를 들어 I-CreI 및 I-OnuI 또는 그것의 기능적 변종(variant)과 같은 메가뉴클레아제(meganuclease)에 융합될 수 있다. 더 바람직한 예에서, 상기 뉴클레아제는 모노머인 TALE-뉴클레아제이다. 모노머인 TALE-뉴클레아제는 WO2012138927에 기재된 I-TevI의 촉매적 도메인과 조작된 TAL 반복들(repeats)의 융합들과 같은, 특이적 인식 및 절단을 위한 다이머화를 요구하지 않는 TALE-뉴클레아제이다. 전사(Transcription) 활성인자(Activator) 유사(Like) 효과기(Effector) (TALE)은 박테리아 종 잔토모나스(Xanthomonas)로부터의 단백질로 각 반복이 핵산 타겟된 서열의 각 뉴클레오타이드 염기에 특이적인 위치 12 및 13 (RVD)에서 두(di)-잔기들을 포함하는, 다수의 반복된 서열들을 포함한다. 유사한 모듈식(modular) 염기 당 염기(base-per-base) 핵산(nucleic acid) 결합(binding) 특성들(properties) (MBBBD)을 가진 결합 도메인들은 또한 다른 박테리아 종들에서 본 출원인에 의하여 최근에 발견된 새로운 모듈식 단백질들로부터 유래될 수 있다. 새로운 모듈식 단백질들은 TAL 반복들보다 더 많은 서열 변동성을 보이는 이점을 가진다. 바람직하게는, 다른 뉴클레오타이드들의 인식과 관련된 RVD들은 C의 인식을 위한 D, T의 인식을 위한 NG, A의 인식을 위한 NI, G 또는 A의 인식을 위한 NN, A, C, G 또는 T의 인식을 위한 NS, T의 인식을 위한 HG, T의 인식을 위한 IG, G의 인식을 위한 NK, C의 인식을 위한 HA, C의 인식을 위한 ND, C의 인식을 위한 HI, G의 인식을 위한 HN, G의 인식을 위한 NA, G 또는 A의 인식을 위한 SN 및 T의 인식을 위한 YG, A의 인식을 위한 TL, A 또는 G의 인식을 위한 VT 및 A의 인식을 위한 SW이다. 또다른 예에서, 대단히 중요한 아미노산들 12 및 13은 뉴클레오타이드들 A, T, C 및 G를 향한 그것들의 특이성을 조절하기 위하여, 특히 이 특이성을 증강시키기 위하여 다른 아미노산 잔기들을 향해 돌연변이될 수 있다. TALE-뉴클레아제는 유전자 변형들 및 유전자 타겟팅을 자극하기 위하여 사용되고 이미 기재되어 왔다 (Boch, Scholze et al. 2009; Moscou and Bogdanove 2009; Christian, Cermak et al. 2010; Li, Huang et al. 2011). 조작된 TAL-뉴클레아제들은 TALENTM 상표로 상업적으로 이용 가능하다 (Cellectis, 8 rue de la Croix Jarry, 75013 Paris, France).
본 발명에 따른 희귀-절단 엔도뉴클레아제는 또한 Cas9 엔도뉴클레아제이다. 최근에, 새로운 게놈 조작 수단이 타입 II 원핵세포 CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short palindromic Repeats) 입양 면역 시스템으로부터 RNA-가이드된 Cas9 뉴클레아제 (Gasiunas, Barrangou et al. 2012; Jinek, Chylinski et al. 2012; Cong, Ran et al. 2013; Mali, Yang et al. 2013)에 기초하여 개발되어 왔다 (리뷰를 위하여 (Sorek, Lawrence et al. 2013) 참조). CRISPR 관련(Associated) (Cas) 시스템은 박테리아에서 처음 발견되었으며 외래(foreign) DNA, 바이러스 또는 플라스미드에 대항하여 방어로서 기능한다. CRISPR-매개 게놈 조작은 짧은 서열 모티프에 의하여 자주 측면에 위치하는(flanked) 타겟 서열의 선택에 의하여 먼저 진행되는데, 이를 프로토(proto)-스페이서(spacer) 인접(adjacent) 모티프(motif (PAM)라고 부른다. 타겟 서열 선택 후, 타겟 서열에 상보적인 특이적 crRNA이 조작된다. CRISPR 타입 II 시스템들에 요구되는 트랜스(Trans)-활성화되는(activating) crRNA (tracrRNA)는 crRNA와 쌍을 이루고(pair) 제공되는 Cas9 단백질에 결합된다. Cas9는 cRNA와 tracRNA의 염기 쌍 형성을 가능하게 하는 모듈식 앵커(anchor)로 작용한다 (Deltcheva, Chylinski et al. 2011). 이 삼원(ternary) 복합체에서, 이중 tracrRNA:crRNA 구조들은 동족(cognate) 타겟 서열로 엔도뉴클레아제 Cas9을 향하게 하는 가이드 RNA로 작용한다. Cas9-tracrRNA:crRNA 복합체에 의한 타겟 인식은 타겟 서열 및 crRNA 사이의 상동성(homology)를 위한 타겟 서열의 스캐닝(scanning)에 의하여 개시된다. 타겟 서열-crRNA 상보성에 추가하여, DNA 타겟팅은 프로토스페이서(protospacer)에 인접한 짧은 모티프(프로토스페이서 인접 모티프 - PAM)의 존재를 요구한다. 이중(dual)-RNA 및 타겟 서열 사이의 쌍 형성(pairing) 후, Cas9는 그 뒤에 PAM 모티프의 3 염기들 업스트림에 무딘(blunt) 이중 가닥 파손(break)을 도입한다 (Garneau, Dupuis et al. 2010).
희귀-절단 엔도뉴클레아제는 호밍 엔도뉴클레아제일 수 있고, 또한 메가뉴클레아제의 이름으로 알려질 수 있다. 이러한 호밍 엔도뉴클레아제들은 당업계에 잘 알려져 있다 (Stoddard 2005). 호밍 엔도뉴클레아제들은 DNA 타겟 서열을 인식하고 단일- 또는 이중-가닥 손상을 만들어낸다. 호밍 엔도뉴클레아제들은 매우 특이적이며, 12 내지 45 염기 쌍들 (bp) 길이들로부터 범위의, 보통 14 내지 40 bp 길이로부터 범위의 DNA 타겟 부위들을 인식한다. 본 발명에 따른 호밍 엔도뉴클레아제는 예컨대 LAGLIDADG 엔도뉴클레아제에, HNH 엔도뉴클레아제에, 또는 GIY-YIG 엔도뉴클레아제에 대응될 수 있다. 본 발명에 따른 바람직한 호밍 엔도뉴클레아제는 I-CreI 변종일 수 있다.
- "전달 벡터" 또는 "전달 벡터들"에 의하여 본 발명에서 필요로 하는, 제제들/화학물질들 및 분자들 (단백질들 또는 핵산들)을 세포 접촉 내로 넣기 위하여 (즉, "접촉하는") 또는 세포들 또는 세포이하(subcellular) 구획들(compartments) (즉, "도입하는") 내로 전달하기 위하여 본 발명에서 사용될 수 있는 임의의 전달 벡터가 의도된다. 그것은 리포좀 전달 벡터들, 바이러스 전달 벡터들, 약물 전달 벡터들, 화학적 담체들, 폴리머 담체들, 리포플렉스들(ipoplexes), 폴리플렉스들(polyplexes), 덴드리머들, 마이크로버블들 (초음파 조영제들), 나노입자들, 에멀젼들 또는 다른 wjrekdf한 이동(transfer) 벡터들을 포함하나 이에 제한되는 것은 아니다. 이들 전달 벡터들은 분자들, 화학물질들, 거대분자들 (유전자들, 단백질들), Diatos에 의하여 개발된 펩타이드들, 플라스미드들과 같은 다른 벡터들의 전달을 가능하게 한다. 이들 경우들에서, 전달 벡터들은 분자 담체들이다. "전달 벡터" 또는 "전달 벡터들"에 의하여, 형질주입을 수행하는 전달 방법들이 또한 의도된다.
- 용어들 "벡터" 또는 "벡터들"은 그것이 연결된 또다른 핵산을 이동시킬 수 있는 핵산 분자를 가리킨다. 본 발명에서 "벡터"는 염색체, 비(non) 염색체, 반-합성 또는 합성 핵산들로 구성될 수 있는 선형 또는 원형 DNA 또는 RNA 분자, 바이러스 벡터, a 플라스미드, a RNA 벡터를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 바람직한 벡터들은 그것들이 연결되는 핵산들의 발현 (발현 벡터들) 및/또는 자동적인 복제 (에피솜 벡터)가 가능한 것들이다. 많은 수의 적당한 벡터들이 당업자들에게 알려져 있고 상업적으로 이용가능하다.
바이러스 벡터들은 예컨대, 레트로바이러스, 아데노바이러스, 파보바이러스 (예컨대 아데노관련 바이러스들), 코로나바이러스, 오르소믹소바이러스(orthomyxovirus) (예컨대, 인플루엔자 바이러스)와 같은 음성 가닥 RNA 바이러스들, 랍도바이러스(rhabdovirus) (예컨대, 광견병 및 수포성 구내염(vesicular stomatitis) 바이러스), 파라믹소바이러스(paramyxovirus) (예컨대 홍역 및 센다이), 피코르나바이러스 및 알파바이러스와 같은 양성 가닥 RNA 바이러스들, 및 including 아데노바이러스 헤르페스바이러스 (예컨대, 헤르페스 심브ㅍ렉스 바이러스 타입들 1 및 2을 포함하는 이중 가닥 DNA 바이러스들, 엡스타인(Epstein)-바(Barr) 바이러스, 시토메갈로바이러스(cytomegalovirus)), 및 수두 방이러스 (예컨대, 우두, 계두 및 카나리아두창)을 포함한다. 다른 바이러스들은 노워크(Norwalk) 바이러스, 토가바이러스 플라비바이러스, 레오바이러스들(reociruses), 파포바바이러스(papovavirus), 헤파드나바이러스(hepadnavirus), 및 간염 바이러스를 포함한다. 레트로바이러스들의 예들은 하기를 포함한다: 새의 백혈증 육종, 포유류 C-타입, B-타입 바이러스들, D 타입 바이러스들, HTLV-BLV 그룹, 렌티바이러스, 스푸마바이러스(spumavirus)(Coffin, J. M., Retroviridae: The viruseses and their replication, In Fundamental Virology, Third Edition, B. N. Fields, et al., Eds., Lippincott-Raven Publishers, Philadelphia, 1996).
- "렌티바이러스 벡터"에 의하여 그것들의 상대적으로 큰 포장 용량, 감소된 면역원성 및 넓은 범위의 다른 세포 타입들에 높은 효율로 안정적으로 형질도입시킬 수 있는 그것들의 능력 때문에 유전자 전달을 위한 매우 유망한 HIV-기반의 렌티바이러스 벡터들이 의미된다. 렌티바이러스 벡터들은 생산자 세포들 내로 셋 (포장, 봉투(envelope) 및 이동) 또는 그보다 많은 플라스미드들의 일시적 형질주입(transfection) 후 보통 만들어진다. HIV처럼, 렌티바이러스 벡터들은 세포 표면 상 수용체들과 바이러스 표면 당단백질들의 상호작용을 통하여 타겟 세포에 들어간다. 들어가면, 바이러스 RNA는 바이러스 역전사효소 복합체에 의하여 매개되는, 역전사를 겪는다. 역전사 산물은 감염된 세포들의 DNA에 바이러스 통합의 기질인, 이중가닥 선형 바이러스 DNA이다. "통합하는(integrative) 렌티바이러스 벡터들 (또는 LV)"에 의하여, 제한되지 않는 예로서, 타겟 세포의 게놈에 통합될 수 있는 이렇나 벡터들이 의미된다. "통합하지 않는(non-integrative) 렌티바이러스 벡터들 (또는 NILV)"에 의하여 반대로 바이러스 인테그라제(integrase)의 작용을 통한 타겟 세포의 게놈에 통합되지 않는 효과적인 유전자 전달 벡터들이 의미된다.
- 전달 벡터들 및 벡터들은 초음파천공(sonoporation) 또는 전기천공 또는 이들 기술들의 유도체들과 같은 임의의 세포 투과화와 조합 또는 관련될 수 있다.
- 세포 또는 세포들에 의하여 임의의 진핵 살아있는 세포들, 인 비트로 배양들을 위한 이들 생물들로부터 유래되는 일차(primary) 세포들 및 세포주들이 의도된다.
- "일차(primary) 세포" 또는 "일차(primary) 세포들"에 의하여 살아있는 조직에서 직접 취해지고 (즉, 생검 물질) 인 비트로에서 성장을 위하여 확립된, 매우 적은 개체군 배가들을 겪고, 그리고, 그러므로, 연속적인 종양형성성인(tumorigenic) 또는 인공적으로 불멸화된 세포주들에 비교하여, 그것들이 유래된 조직의 특성들 및 주된 기능적 요소들의 더 대표적인, 세포들이 의도된다.
제한되지 않는 예들로서, 세포주들은 CHO-K1 세포들; HEK293 세포들; Caco2 세포들; U2-OS 세포들; NIH 3T3 세포들; NSO 세포들; SP2 세포들; CHO-S 세포들; DG44 세포들; K-562 세포들, U-937 세포들; MRC5 세포들; IMR90 세포들; Jurkat 세포들; HepG2 세포들; HeLa 세포들; HT-1080 세포들; HCT-116 세포들; Hu-h7 세포들; Huvec 세포들; Molt 4 세포들로 구성되는 군으로부터 선택될 수 있다.
이들 세포주들 모두는 본 발명의 방법에 의하여 변형되어 생산, 발현, 정성화, 검출, 관심있는 유전자 또는 단백질 연구를 위한 세포주 모델들을 제공할 수 있고; 이들 모델들은 또한 제한되지 않는 예들로서 화학물질들, 바이오연료들, 치료법들 및 농업경제학들과 같은 여러가지 영역들에서 생산 및 연구에서 관심있는 생물학적으로 활성인 분자들을 스크리닝하는데 사용될 수 있다.
- "돌연변이"에 의하여 폴리뉴클레오타이드 (cDNA, 유전자) 또는 폴리펩타이드 서열에서 하나, 둘, 셋, 넷, 다섯, 여섯, 일곱, 여덟, 아홉, 열, 열하나, 열둘, 열셋, 열넷, 열다섯, 스물, 스물다섯, 서른, 마흔, 쉰, 또는 그보다 많은 뉴클레오타이드들/아미노산들의 치환, 결실, 삽입이 의도된다. 돌연변이는 유전자의 서열 또는 그것의 조절 서열을 코드하는데 영향을 미칠 수 있다. 그것은 또한 코드되는 mRNA의 구조/안정성 또는 게놈 서열의 구조체에 영향을 미칠 수 있다.
- 변종(들)"에 의하여 부모 분자의 아미노산 서열에서 적어도 하나의 잔기의 대체 또는 돌연변이에 의하여 수득되는 폴리펩타이드 변종, 반복 변종, 변종, DNA 결합 변종, TALE-뉴클레아제 변종이 의도된다.
- "기능적 변종"에 의하여 단백질 또는 단백질 도메인의 촉매적으로 활성인 돌연변이체가 의도된다; 이러한 돌연변이체는 그것의 부모 단백질 또는 단백질 도메인에 비하여 동일한 활성 또는 추가적인 특성들, 또는 더 높은 또는 더 낮은 활성을 가질 수 있다.
- "동일성"은 두 핵산 분자들 또는 폴리펩타이드들 사이의 서열 동일성(identity)이 가리킨다. 동일성은 비교 목적으로 정렬될 수 있는 각 서열에서의 위치의 비교에 의하여 결정될 수 있다. 비교되는 서열에서의 위치가 동일 염기에 의하여 차지될 때, 그러면 분자들은 그 위치에서 동일하다. 핵산 또는 아미노산 서열들 사이에서 유사도(similarity) 또는 동일성(identity)의 정도는 핵산 서열들에 의하여 공유되는 위치들에서 동일하거나 또는 매칭되는 뉴클레오타이드들의 수의 기능이다. 여러가지 정렬 알고리즘들 및/또는 프로그램들이 두 서열들 사이의 동일성을 계산하는데 사용될 수 있고, GCG 서열 분석 패키지의 부분으로서 이용가능한 BLAST 또는 FASTA를 포함하고 (University of Wisconsin, Madison, Wis.), 에컨대, 디폴트 세팅으로 사용될 수 있다. 예컨대, 여기에 기재된 특정 폴리펩타이드들에 적어도 70%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 동일성을 갖고 바람직하게는 이러한 폴리펩타이드들를 코드하는 폴리뉴클레오타이드와 더불어, 대체로 동일한 기능들을 보여주는 폴리펩타이드들이 고려된다.
- "유사도"는 둘 또는 이보다 많은 폴리펩타이드들의 아미노산 서열들 사이의 관계를 기재한다. BLASTP는 BLOSUM45, BLOSUM62 또는 BLOSUM80와 같은 유사도 매트릭스를 이용하여 참조 아미노산 서열에 대하여 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 87.5%, 90%, 92.5%, 95%, 97.5%, 98%, 99% 서열 유사도를 갖는 아미노산 서열을 확인하는데 사용될 수 있다. 다르게 표시하지 않는 한, 유사도 지수는 BLOSUM62의 이용에 기초할 것이다. BLASTP이 사용될 때 퍼센트 유사도는 BLASTP 양성 지수에 기초하고 퍼센트 서열 동일성은 BLASTP 동일성들 지수에 기초한다. BLASTP "동일성들"은 동일한 지수가 높은 서열쌍들에서 총 잔기들의 부분(fraction) 및 수를 보여준다; 그리고 BLASTP "양성들"은 그것들을 위한 정렬 지수들이 서로 유사하고 양성 값들을 갖는 잔기들의 부분 및 수를 보여준다. 여기에 개시된 아미노산 서열들의 유사도의 동일성의 임의의 중간 정도 또는 동일성 또는 유사도의 이들 정도를 갖는 아미노산 서열들이 고려되고 이 공개에 포함된다. 유사한 폴리펩타이드들의 폴리뉴클레오타이드 서열들은 유전적 코드를 이용하여 도출되고 종래 수단들에 의하여 수득될 수 있다. 예를 들어, pTalpha의 기능적 변종은 서열번호 : 107의 아미노산 서열에 70%, 75%, 80%, 85%, 87.5%, 90%, 92.5%, 95%, 97.5%, 98%, 99% 서열 유사도를 가질 수 있다. 이러한 기능적 변종을 코드하는 폴리뉴클레오타이드은 유전적 코드를 이용하여 그것의 아미노산 서열를 역번역함으로써 생산될 수 있을 것이다.
- "신호(siganl)-전달(transducing) 도메인" 또는 "공-자극 리간드"는 T-세포 상 동계(cognate) 공-자극 분자에 특이적으로 결합하는 항원 제시 세포 상의 분자를 가리키며, 이로써, 예컨대, 펩타이드가 로딩된 MHC 분자와 TCR/CD3 복합체의 결합에 의하여, 제공되는 일차(primary) 신호에 추가하여, 증식 활성화, 분화 등을 포함하나 이에 제한되지 않는 T 세포 반응을 매개하는 신호를 제공한다. 공-자극 리간드는 CD7, B7-1 (CD80), B7-2 (CD86), PD-L1, PD-L2, 4-1BBL, OX40L, 유도성(inducible) 공자극(costimulatory) 리간드(igand) (ICOS-L), 세포간(intercellular) 부착(adhesion) 분자 (ICAM, CD30L, CD40, CD70, CD83, HLA-G, MICA, M1CB, HVEM, 림포톡신(lymphotoxin) 베타 수용체, 3/TR6, ILT3, ILT4, Toll 리간드 수용체에 결합하는 작용제(agonist) 또는 항체 및 B7-H3에 특이적으로 결합하는 리간드를 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 공-자극 리간드는 또한 그 중에서도, CD27, CD28, 4-IBB, OX40, CD30, CD40, PD-1, ICOS, 림프구 기능-관련 항원-1 (LFA-1), CD2, CD7, LTGHT, NKG2C, B7-H3, 특이적으로 CD83에 결합하는 리간드와 같은, 그러나 이에 제한되지 않는 T 세포 상에 존재하는 공-자극 분자에 특이적으로 결합하는 항체를 포함한다.
"공-자극 분자"는 공-자극 리간드와 특이적으로 결합하는 T 세포 상 동계(cognate) 결합 파트너를 가리키며, 이로써 증식과 같은, 그러나 이에 제한되지 않는 세포에 의한 공-자극 반응을 매개한다. 공-자극 분자들은 MHC 클래스 I 분자, BTLA 및 Toll 리간드 수용체를 포함하나 이에 제한되는 것은 아니다.
여기에서 사용된 "공-자극 신호"는 TCR/CD3 라이게이션과 같은 일차 신호와 결합하여, T 세포 증식 및/또는 주요(key) 분자들의 상향조절 또는 하향조절을 이끄는 신호를 가리킨다.
여기에서 사용된 용어 "세포외 리간드-결합 도메인"은 리간드에 결합할 수 있는 올리고- 또는 폴리펩타이드로 정의된다. 바람직하게는, 도메인은 세포 표면 분자와 상호작용할 수 있을 것이다. 예를 들어, 세포외 리간드-결합 도메인은 특정 질병 상태와 관련된 타겟 세포들 상에 세포 표면 마커로서 작용하는 리간드를 인식하도록 선택될 수 있다. 이와 같이 리간드들로서 작용할 수 있는 세포 표면 마커들은 바이러스, 박테리아 및 기생충 감염들, 자가면역 질병 및 암 세포들과 관련된 것들을 포함한다.
여기에서 사용된 대로 용어 "대상" 또는 "환자"는 인간이 아닌 영장류들 및 인간들을 포함하는 동물계의 모든 멤버들을 포함한다.
용어 "재발된"은 치료 후 암의 차도가 있었으나 암 세포들이 복귀한, 대상 또는 포유동물에서의 상황을 가리킨다.
용어 "난치성(refractory) 또는 내성"은 집중 치료 후에도, 그 신체 내에 잔여 암 세포들을 가진 대상 또는 포유동물에서의 정황을 가리킨다.
용어 "약물 내성"은 질병들이 약물 또는 약물들의 치료에 반응하지 않을 때 상태를 가리킨다. 약물 내성은 내재적(intrinsic) (또는 주로 내성)일 수 있는데, 이는 질병이 약물 또는 약물들에 응답적인 적 없었던 것을 의미하고, 또는 그것은 수득될 수 있는데, 이는 전에는 질병이 응답하였던 약물 또는 약물들에 대하여 질병이 반응을 멈춘 것을 의미한다(이차 내성). 특정 예들에서, 약물 내성은 내재적이다. 특정 예들에서, 약물 내성은 수득된다.
용어 "혈액 악성종양" 또는 "혈액 암"은 신체의 골수 및/또는 림프 조직의 암을 가리킨다. 혈액 악성종양들의 예들은, 예컨대, 척수형성이상, 백혈병, 피부 림프종들과 같은, 림프종들, 비-호지킨 림프종, 호지킨 질병 (호지킨 림프종으로도 불림), 및 급성 림프구성(lymphocytic) 백혈병 (ALL), 급성 골수성 백혈병 (AML), 급성 전골수성 백혈병 (APL), 만성 림프구성 백혈병 (CLL), 만성 골수성(myeloid) 백혈병 (CML), 만성 호중성(neutrophilic) 백혈병 (CNL), 급성 미분화된(undifferentiated) 백혈병 (AUL), 역형성(anaplastic) 큰(large)-세포 림프종 (ALCL), 전림프구성(prolymphocytic) 백혈병 (PML), 청소년(juvenile) 골수단핵구성(myelomonocyctic) 백혈병 (JMML), 성인 T-세포 ALL, 삼계통(trilineage) 척수형성이상(myelodysplasia)이 있는 AML (AML/TMDS), 혼합된(mixed) 계통(lineage) 백혈병 (MLL), 골수형성이상(myelodysplastic) 증후군들 (MDSs), 척수 증식성(myeloproliferative) 장애들 (MPD), 및 다발성(multiple) 골수종(myeloma) (MM)과 같은 골수종을 포함한다.
용어 "백혈병"은 만성 림프구성 백혈병 또는 만성 림프성 백혈병, 만성 골수구성(myelocytic) 백혈병, 또는 만성 골수성 백혈병, 급성 림프아구성(lymphoblastic) 백혈병, 급성 골수성 백혈병 또는 급성 골수성 백혈병 (AML) 및 급성 골수아구성 백혈병을 포함하나, 이에 제한되지 않는 혈액-형성 조직들의 악성 신생물들을 가리킨다.
일반적으로, 일차(primary) 세포는 혈액 샘플 또는 생체 검사로부터 단리된 세포이고, 그 다음에 선택적으로 시험관에서 더 배양된다. 세포주는 형질전환된 즉 암 세포의 세포 배양물이고, 바람직하게는 형질전환된 즉 암 세포의 균질한 세포 배양물 (이때 마커는 Gaussian 커브에 의하여 나타내어진다)이다.
본 발명의 상기 기재된 기재는 그것을 만들고 이용하는 공정 및 방식을 제공하여, 당업자가 이를 만들고 사용하는 것을 가능하게 하는 것이며, 이 구현은 특히 원래 기재의 부분을 이루는, 첨부된 특허청구범위의 주제를 위하여, 제공된다.
숫자 제한 또는 범위가 여기에 기재될 때, 그 단점들(endpoints)이 포함된다. 또한 숫자 제한 또는 범위 내 모든 값들 및 하위범위들은 명백히 적혀있는 것처럼, 특이적으로 포함된다.
상기 기재는 당업자가 본 발명을 이용하고 만드는 것을 가능하게 하도록 제시되며, 특정 적용 및 그것의 요구들의 맥락에서 제공된다. 바람직한 예들에 대한 여러가지 변형들이 당업자에게 쉽게 분명할 것이며, 여기에 정의된 유전적 원칙들은 본 발명의 범위 및 정신에서 벗어나는 것 없이 다른 예들 및 적용들에 적용될 수 있다. 이런 식으로 이 발명은 보여지는 예들로 제한되는 것으로 의도되지 않고, 여기에 개시된 특성들 및 원칙들과 일치하는 가장 넓은 범위에 따른다.
이 발명에 일반적으로 기재된 것, 추가의 이해가 특정 특이적 예들을 참조로 하여 수득될 수 있는데, 이는 설명 목적을 위하여만 여기에 제공되는 것이며, 다르게 명시하지 않는 한 제한하는 것으로 의도되지 않는다.
일반적 방법
일반적으로, 본 발명의 CD123 CAR T 세포들은 다른 기증자들로부터의 버피 코트 샘플들로부터 정제된 T 세포들을 이용하여 제조되었다. 공정 및 산물들은 Good Manufacturing Practices (FDA 21 CFR 및 EU GMP)의 요구를 만족시킨다.
임상 과제물들은 Good Clinical Practices (UK GCP 또는 USA GCP) Blood 2014; 124(21):4689 하 수행되었다.
임상전 연구
일차 T-세포 배양들
T 세포들들은 Ficoll 농도 구배 배지를 이용하여 EFS (Etablissement Francais du Sang, Paris, France)에 의하여 제공된 버피 코트 샘플들로부터 정제되었다. PBMC 층이 제거되었고 T 세포들이 상업적으로 이용가능한 T-세포 풍부 키트를 이용하여 정제되었다. 정제된 T 세포들이 비드: 세포 비율 1:1에서 20ng/mL 인간 IL-2, 5% Human, 및 Dynabeads 인간 T 활성인자 CD3/CD28로 보충된 X-VivoTM-15 배지 (Lonza)에서 활성화되었다 (Life Technologies).
- CAR mRNA 형질주입( transfection )
형질주입은 -세포 정제 및 활성화 4일 또는 11일 후에 이루어졌다. 5 백만의 세포들이 다른 CAR 구조체들을 코드하는 mRNA 15μg으로 형질주입되었다. CAR mRNA들은 두 개의 0.1 mS 펄스들을 3000V/cm 에서 적용하고, 뒤이어 최종 부피 200μl의 "사이토포레이션(Cytoporation) 버퍼 T" (BTX Harvard Apparatus)에서 0.4cm 갭 큐벳에서 네 개의 0.2 mS 펄스들 at 325V/cm이 이어짐으로써 Cytopulse 기술을 이용한 T7 mRNA 폴리메라제 형질주입들을 이용하여 생산되었다. 세포들은 X-VivoTM-15 배지에서 즉시 희석되었고 5% CO2와 37℃에서 배양되었다. IL-2가 20ng/mL에서 전기천공 2 시간 후 첨가되었다.
T-세포 형질도입
재조합 렌티바이러스 벡터들 발현과 T-세포들의 형질도입 CAR는 T-세포 정제/활성화 삼 일 후 수행되었다. 렌티바이러스 벡터들은 HEK-293 세포들에서 게놈 및 헬퍼 플라스미드들의 형질주입에 의하여 Vectalys SA (Toulouse, France)에 의하여 생산되었다. 형질도입들은 형질도입 당 106 세포들을 이용하여 다수의 5,의 감염에서 수행되었다. T-세포들의 표면에서 CAR 검출은 (LakePharma에 의하여 생산된) 쥐 IgG1 Fc 단편과 함께 인간 CD123 단백질 의 세포외 도메인의 융합으로 구성되는 재조합 단백질을 이용하여 이루어졌다. CAR 분자에 이 단백질의 결합은 단백질의 마우스 Fc 부분들을 타겟팅하는 PE-콘쥬게이트된 이차 항체 (Jackson Immunoresearch)로 검출되었고, 유동세포분석법에 의하여 분석되었다.
- 탈과립화 분석 ( CD107a 동원)
T-세포들은 여러가지 수준들의 CD123 단백질을 발현시키는 동일한 양의 세포들과 함께 96-웰 플레이트들 (40,000 세포들/웰)에서 배양되었다. 공-배양은 5% CO2로 37 ℃에서 6 시간 동안 최종 부피 100μl의 X-VivoTM-15 배지 (Lonza)에서 유지되었다. CD107a 염색은, 1μg/ml의 항-CD49d, 1μg/ml의 항-CD28, 및 1x Monensin 용액과 함께, 공-배양의 시작부터 형광 항-CD107a 항체의 첨가에 의하여, 세포 자극 동안 이루어졌다. 6 시간 배양 기간 후, 세포들은 고정가능한 생존능력(viability) 염료 및 플루오로크롬(fluorochrome)-콘쥬게이트된 항-CD8으로 염색되었고 유동세포 분석법에 의하여 분석되었다. 탈과립화 활성은 CD8+/CD107a+ 세포들의 %로서 그리고 CD8+ 세포들 중 CD107a 염색을 위한 평균(mean) 형광(fluorescence) 강도(intensity) 신호(signal) (MFI)을 결정함으로써 결정되었다. 탈과립화 분석들은 mRNA 형질주입(transfection) 24 시간 후 수행되었다.
- IFN 감마 방출 분석
T-세포들은 여러 수준들의 CD123 단백질을 발현시키는 세포주들과 함께 96-웰 플레이트들 (40,000 세포들/웰)에서 배양되었다. 공-배양들은 최종 부피 100μl의 X-VivoTM-15 배지 (Lonza)에서 5% CO2와 37 ℃에서 24 시간 동안 유지되었다. 이 배양 기간 후, 플레이트들은 5 분 동안 1500 rpm에서 원심분리되었고 상청액들이 새 플레이트에서 회수되었다. 세포 배양 상청액들에서 IFN 감마 검출은 ELISA 분석에 의하여 이루어졌다. IFN 감마 방출 분석들은 mRNA 형질주입 24시간 후 세포 공-배양을 시작함으로써 수행되었다.
-세포독성 분석
T-세포들은 동일한 웰에서 10,000 대조군 (CD123neg) 세포들 및 (CD123을 발현시키는) 10,000 타겟 세포들과 함께 96-웰 플레이트들 (100,000 세포들/웰)에서 배양되었다. 타겟 및 대조군 세포들은 CAR+ T-세포들과 그것들의 공-배양 전에 형광 세포내 염료들 (CFSE 또는 Cell Trace Violet)로 표지되었다. 공-배양들은 5% CO2와 37 ℃에서 4 시간 동안 배양되었다. 이 배양 기간 후, 세포들은 고정가능한 생존능 염료로 염색되었고 유동세포 분석법에 의하여 분석되었다. 각 세포 군집의 생존능 (타겟 세포들 또는 CD123neg 대조군 세포들)이 결정되었고 특이적 세포 용해의 %가 계산되었다. 세포독성 분석들은 mRNA 형질주입 48 시간 후 수행되었다.
- T-세포 형질도입
CAR를 발현시키는 재조합 렌티바이러스 벡터들로 하는 T-세포들의 형질도입은 T-세포 정제/활성화 3일 후 수행되었다. T-세포들의 표면에서 CAR 검출은 쥐 IgG1 Fc 단편과 함께 인간 CD123 단백질의 세포외 도메인의 융합으로 구성되는 재조합 단백질을 이용하여 이루어졌다. CAR 분자에의 이 단백질의 결합은 단백질의 마우스 Fc 부분을 타겟팅하는 플루오로크롬-콘쥬게이트된 이차 항체로 검출되었고, 유동세포 분석법에 의하여 분석되었다.
-항-종양 마우스 모델
면역결핍 NOG 마우스들이 AML 이종이식 마우스 모델로서 (CD123 발현시키는_MOLM13-루시페라제 세포들로 정맥주사되었다(iv). 선택적으로, 마우스들은 PNA 또는 FLAG인 항-암 치료를 받았다. 마우스들은 그 다음에 테스트되는 CAR+ T-세포들을 다른 용량들로 또는 CAR 렌티바이러스 벡터로 형질도입되지 않는 T-세포들로 (종양 세포주의 주입 2일 또는 7일 후) 정맥주사 주입되었다. 생물발광 신호들이 다른 동물들에서 종양 진행을 따라잡기 위하여 T-세포 주입일 (D0)에, T-세포 주입 7, 14, 21, 28 및 40일에, 결정되었다.
임상 연구
I 상(phase) 투여량 단계적 증가 시험이 재발된/난치성 급성 골수성 백혈병 (AML), 출아형 원형질 세포의 수지상 세포 신생물, 이식으로의 브릿지를 가진 환자들에게서 CD123 분자 (CD123CAR)을 타겟팅하는 인공 T-세포 수용체들 (CAR)를 발현시키도록 유전적으로 변형된 동종이계(allogeneic) TCR KO 특이적 세포독성 T -림프구들 (CTL)의 생물학적 약효 및 안전성을 평가하기 위하여 설계되었다.
각각의 환자는 기증자 유래의 적어도 하나의 투여량, 유전적으로 변형된 CTL을 받고, 독성 및 질병 특이적 마커들과 더불어 형질도입된 CTL의 검출에 대하여 모니터링될 것이다.
하기의 것 중 임의의 것은 의학적 지시에 따라 개별적으로 다를 수 있다.
Figure pct00029
연구 타입 :
중재(Interventional)
연구 설계:
종료점 분류 : 안전/약효 연구
중재 모델 : 단일 그룹 위임
마스킹: 오픈 라벨
일차 목적: 치료
공식적 명칭:
이식으로의 브릿지 동안, B-세포 특이적 항원 CD123 양성 잔여 또는 재발된 급성 골수성 백혈병, 출아형 원형질 세포의 수지상 세포 신생물에 유전적으로 타겟된 시험관 내 확장된 동종이계 세포독성 T-림프구들 (CTLs)을 이용한 I 상 투여량 단계적 증가 시험.
주요 단어들 급성 골수성 백혈병, 출아형 원형질 세포의 수지상 세포 신생물, 이식으로의 브릿지
일차 결과 측정들:
AML의 지속 또는 재발, 출아형 원형질 세포의 수지상 세포 신생물을 위하여 또는 이식으로의 브릿지에서 주어진 CD123 분자를 타겟팅하는 인공적인 T 세포 수용체들을 발현시키도록 변형된 동종이계(allogeneic) 특이적 CTL의 단계적 증가하는 투여량들의 안전/지속성을 평가.
이차 결과 측정:
● AML의 진행에 대한 입양적으로(adoptively) 이동된 CD123 특이적 T-세포들의 영향들을 평가하는 것.
● 숙주에서 그것들의 생존 및 증식을 결정하기 위하여 투입 후 정의된 간격들로 혈액 내 CD123 키메라 항원 수용체 (CD123 CAR) 양성 T-세포들의 수를 정량하는 것.
리툭시맙 (375 mg/m2)의 투입 후 정의된 간격들로 혈액 내 CD123 키메라 항원 수용체 (CD123 CAR) 양성 T-세포들의 수를 정량하는 것.
Figure pct00030
적격
연구에 적격인 성: 양쪽 다
건강한 지원자들 수용들: 없음
기준들
포함 기준들:
● 골수 재발 또는 지속의 증거를 갖는 CD123+ 백혈병의 이력,
● 지속성 최소 잔여 질병은 적어도 1 주에 의하여 분리되는 적어도 2 개의 순차적인 시험들로 형태학, FISH, 유동세포 분석법 또는 RT-PCR에 의하여 입증되어야 한다.
● 환자들에게 연령 제한은 없다
● KPS 또는 Lansky 점수 > 또는 = 40과
● (컨디셔닝 화학요법 전 측정된) 신장 기능
● (컨디셔닝 화학요법 전 측정된) 간 기능:
● AST ≤ 5 x 백혈병 수반에 대한 이차 기관(institutional) ULN 단계적 증가는 제외 기준이 아니다. 백혈병 수반은 아는 간독성 약(예컨대 아졸들(azoles)의 개시의 부존재 및 지난달 내 골수 또는 말초혈액 백혈병 폭발(blasts)을 단계적으로 증가시킴으로써 정의되는 진행형인 재발의 존재에 의하여 결정될 것이다.
● 총 빌리루빈 ≤ 2.5 x 기관(institutional) ULN
● 등록 1일 내 수행된 ECHO 또는 MUGA 또는 다른 유사한 심장(cardia) 이미징에 의하여 평가된 적절한 심장(cardiac) 기능 (예컨대 LVEF ≥ 40%)
● (컨디셔닝 화학요법 전 측정된) 폐 기능 :
● 실내 공기에서 산소 포화도 ≥ 90%
기증자 적격:
● 제삼자 기증자를 포함하는, 기증자는 전체적으로, 성인들에게서 거의 총 250 ml이며 소아과 기증자들로부터 드로(draw) 당 5ml/kg 이내인 하나 이상의 정맥절개술들에서 수득되는 전혈 또는 백혈구성분채집(leukapheresis) 기증에 동의해야 한다.
● 백혈구성분채집 카테터를 놓는 것을 요구하는 < 18 세의 연령의 관련된 기증자들은 (중량이 허용한다면 혈액 단위를 포함하는) 정맥절개술에 의하여 수집된 말초혈액을 기증할 것이며, 이것이 기증자에 대한 최소한의 위험을 넘어 고려되기 때문에 백혈구성분채집의 카테터 놓는 것을 고려하지 않는다.
● 기증자에 대한 상한 연령 제한은 없다. 그러나 관련된 기증자에 대한 최소 연령은 7세인데, 이는 사람이 조사 연구에 참가하기 위하여 동의할 수 있다고 생각되는 가장 어린 연령이기 때문이다.
● HLA 타입핑에 대한 기증자의 높은 결단력은 리뷰를 위하여 이용가능하여야 한다.
● 기증 1주 내 CBC. 시험 결과들은 백혈구성분채집을 겪거나 또는 혈액 기증을 못하게 하지 않는 범위 내여야 한다.
● 전염성 질병들에 대한 혈청학적 테스트는 현존하는 NMDP 및 FACT 가이드라인들로부터 채택된 기관의 가이드라인들에 따라 수행될 것이다. 기증자들은 이들 가이드라인들 (즉, 혈액 기증 가이드라인들)에 기초하여 혈액 또는 백혈구성분채집을 기증할 수 있는 것으로 고려되어야 한다.
제외 기준:
● 활성 HIV, B형 간염 또는 C형 간염 감염된 환자들.
● 기대하는 관찰 외 임의의 치료를 요구하는 악성종양들로 정의된 대로 임의의 동시에 발생하는 활성 악성종양들을 가진 환자들.
● 임신한 여성들.
● ALL의 분리된 골수외 재발을 가진 환자들은 제외될 것이다.
● 치료로서 당질피질스테로이드 치료 (>0.5 mg/kg/일 프레드니손 또는 그것의 등가물)을 요구하는 활성 (2-4 급) 급성 이식편대 숙주 질병 (GVHD), 만성 GVHD 또는 명시적인 자가면역 질환 (예컨대 용혈성 빈혈)을 가진 환자들.
● 치료 28일 내 뇌척수액 (CSF)에서 림프아구들의 명백한 형태적 증거 또는 증상을 보이는 CNS 백혈병 (즉, 뇌(cranial) 신경(nerve) 마비들(palsies) 또는 다른 중요한 신경학적 기능장애)로 정의되는 활성 중추신경계 (CNS) 백혈병. 예방적 척추강내 약은 제외의 이유가 아니다.
● 하기 심장 질환들을 가진 (≥18 세) 성인 환자들은 배제될 것이다:
● 뉴욕심장학회 (NYHA) 단계 III 또는 IV 울혈성 심부정
● 심근경색 ≤ 등록 전 6개월
● 탈수 때문이거나 또는 자연적인 혈관미주신경으로 믿어지지 않는, 임상적으로 중요한 심실부정맥 또는 설명되지 않은 실신의 이력.
● EF ≤20%인 심각한 비(non)-허혈성 심근증의 이력
첫 번째 데이터는 본 발명의 조작된 T 세포는 재발된 난치성 AML 환자들에게 107 세포들/kg의 투여량으로 iv 주입될 수 있고, 적어도 11 개월 동안 선택적으로 명백한 CD123-발현시키는 암 세포들이라는 것을 입증한다.
실시예들
실시예 1: CD123-CAR를 발현시키는 TCR알파 불활성화된 세포들의 증식
T-세포 수용체 알파 불변(constant) 체인 영역 (TRAC) 유전자 내 15-bp 스페이서(spacer)에 의하여 분리된 (반(half) 타겟들로 불리는) 두 개의 17-bp 길이 서열들을 타겟팅하는 헤테로다이머 TALE-뉴클레아제가 설계되었고 생산되었다. 각각의 반 타겟은 표 10에 목록화된 반 TALE-뉴클레아제들의 반복들에 의하여 인식된다.
<표 10>
Figure pct00031
: TCR알파 유전자를 타겟팅하는 TAL-뉴클레아제들
각 TALE-뉴클레아제 구조체가 T7 프로모터의 통제 하 포유류 발현 벡터에서 제한효소 소화를 이용하여 서브클로닝(subclone)되었다. TRAC 게놈 서열을 절단하는 TALE-뉴클레아제을 코드하는 mRNA가 T7 프로모터로부터 코딩 서열 다운스트림을 나르는 플라스미드로부터 합성되었다.
항CD3/CD28 코팅된 비드들로 72 시간 동안 미리 활성화된(preactivated) 정제된 T 세포들이 반 TRAC_T01 TALE-뉴클레아제들 둘다를 코드하는 2 개의 mRNA들 각각으로 형질주입되었다. 형질주입 48 시간 후, 동일 기증자로부터의 T 세포들의 다른 그룹들이 각각 전술한 CD123 CAR 중 하나를 코드하는 렌티바이러스 벡터로 형질도입되었다 (서열번호: 23 내지 48). 형질도입 2 일 후, CD3NEG 세포들이 항-CD3 자성 비드들을 이용하여 정제되었고, 형질도입 5 일 후, 가용성 항-CD28 (5 μg/ml)으로 재활성화되었다.
계산하면 매주 2 배 세포로, 재활성화 30일 후까지 세포 증식이 이어졌다. 특히 항-CD28로 재활성화될 때, CD-123 CAR들을 발현시키는 TCR 알파 불활성화된 세포들에서 증가된 증식이 형질도입되지 않은 세포들에 비하여 관찰되었다.
CD123-CAR를 발현시키는 인간 T 세포들이 활성화 상태를 보이는지 여부를 조사하기 위하여, 활성화 마커 CD25의 발현이 형질도입 7일 후 FACS에 의하여 분석된다. 형질도입되지 않은 세포들에 비하여 그것들의 활성화를 평가하기 위하여 그것들의 표면에서 CD25 발현에 대하여 분석된 CD-123 CAR을 코드하는 렌티바이러스 벡터로 형질도입된 정제된 세포들. 증가된 CD25 발현이 CD28 재활성화 또는 재활성화 없는 조건들 둘 다에서 예상된다.
실시예 2:
Klon43으로부터 유래된 항-CD123 scFv 항체 단편들을 이용한 CD123 CAR의 구축, TCR KO 및 dCK KO TCR CD123 발현시키는 세포들에서의 기능적 분석
Klon 43 또는 인간화된 scFv로부터의 scFv가 VH (서열번호 12, L (서열번호 10), VL 서열번호 11, 또는 서열번호 24 내지 서열번호 30로부터 선택된 VH, 링커 L 및 서열번호 18 내지 서열번호 23로부터 선택된 VL의 조합을 이용하여 제조되었으며, 이들은 각각 CD123 키메라 항원 수용체들 (본 발명의 CD123 CAR들)을 만들어내고 (덜한 부작용들 및 항-tumoral 활성을 갖는) 성능기준에 맞는 것(performant)을 선택하기 위하여 스크리닝하기 위하여 사용되었다.
아키텍쳐들 V1 또는 V3, 바람직하게는 V3가 사용되었고 (도 2 및 도 3) 인간 T-세포들에서 발현 상에서 활성이 결정되었다 (도 4, 도 5, 도 6 및 도 7).
도 4에 나타난 결과들은, CAR+ T-세포들이 CD123을 발현시키지 않는 세포들과 (K562), 또는 CD123을 발현시키는 세포들(RPMI8226)과 6시간 동안 공-배양되었을 때, 하나의 아키텍쳐 (v3: CD8-힌지/CD8-막관통)에 대한 본 발명에 따른 다른 scFv의 탈과립 활성을 보여준다. 흰 막대들은 단독으로 배양된 T-세포들 에서 관찰되는 탈과립 신호들에 대응하고, 검은 막대들은 T-세포들이 RPMI8226 세포들과 공-배양되었을 때 관찰되는 신호들을 나타내며, 회색 막대들은 K562 세포들과 공-배양된 T-세포들의 탈과립 신호들을 보여준다.
도 5는 CD123을 다른 수준들로 발현시키는 세포들과 (KG1a 또는 RPMI8226), 또는 CD123을 발현시키지 않는 세포들(K562)과 24시간 동안 공-배양될 때 T-세포들에 의하여 방출되는 IFN 감마의 양을 보여준다. 공-배양되는 질환들에서 단독으로 배양된 T-세포들로부터 방출된 IFN 감마 또한 보여진다. 실험들은 세 명의 독립적인 기증자들에 대해 수행되었으며, 대표적 기증자로부터의 결과들이 여기에 보여진다.
도 6 및 7은 PNA (20 mg/kg) ip로 처리된 생체내 CAR-T 세포들의 특이적 세포용해 활성의 투여량-반응을 보여준다.
면역결핍(Immunodefficient) 마우스들은 다른 투여량들의 항-CD123 CAR+ T-세포들 또는 형질도입되지 않은 인간 T-세포들의 주사 2일 전 MOLM13-루시페라제 세포들로 주사되었다. 결과들은 T-세포 주사 후 다른 시간 포인트들에서 관찰된 생물발광 신호를 나타낸다.
실시예 3: 임상적 연구
임상적 연구는 여기에 기재된 임상적 연구의 실행 가능성을 입증하는 데이터들을 제공한다.
난치성/재발된 AML로 고통받는 적어도 한 환자가 16 개월 초과로 기대 수명을 상당히 증가시키는 본 발명에 따른 치료를 받았고. 적어도 6 개월 동안 검출 수준 밑으로 암 세포들을 감소시켰다.
CD123을 증가시키는 조작된 면역 세포들이 주사 적어도 3 개월 후 검출되었다.
리툭시맙의 투여 (Rituxan (R).
375 mg/m2의 초기 리툭시맙 투여량 후 4일 동안 정맥 루트에 의하여 투여된 리툭시맙의 총 투여량이 2,250 mg/m2였다.
예비투약(premedication)이 각각 아세트아미노펜 및 항히스타민제의 투입 전에 수행되었다.
또다른 예에서, 첫 번째 투입이 50 mg/시간의 속도로 개시되었다. 투입 독성의 부존재 하, 투입 속도는, 최대 400 mg/시간까지, 매 30분마다 증가하는 50 mg/시간이었다.
그 다음의 투입을 위하여, 그것은 100 mg/시간의 속도에서 수행되었다. 투입 독성의 부존재 하, 최대 400 mg/시간까지 2,250 mg/m2까지 증가하였다.
결과들은 마지막 투입 24시간 후에 환자들의 혈액 내 CD123 CAR 세포들의 수준이 검출 미만이었다는 것을 보여준다.
Figure pct00032
Figure pct00033
본 발명의 인간화된 CD123 CAR는 하기 서열들 중 하나를 포함한다 :
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본 발명에 따라 이들 항-CD123 CAR는 적어도 하나의 유사체(mimotope)를 포함할 수 있다.
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Leu Cys Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser 50 55 60 Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys 65 70 75 80 Ala Ser Gly Tyr Ile Phe Thr Asn Tyr Gly Met Asn Trp Val Lys Gln 85 90 95 Ala Pro Gly Lys Ser Phe Lys Trp Met Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr 100 105 110 Gly Glu Ser Thr Tyr Ser Ala Asp Phe Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser 115 120 125 Leu Glu Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr Leu His Ile Asn Asp Leu Lys 130 135 140 Asn Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala Arg Ser Gly Gly Tyr Asp 145 150 155 160 Pro Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Gly 165 170 175 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile 180 185 190 Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly Gln Arg 195 200 205 Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Asn Tyr Gly Asn 210 215 220 Thr Phe Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu 225 230 235 240 Leu Ile Tyr Arg Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe 245 250 255 Ser Gly Ser Gly Ser Arg Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn Pro Val 260 265 270 Glu Ala Asp Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn Glu Asp 275 280 285 Pro Pro Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg Ser Asp 290 295 300 Pro Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile 305 310 315 320 Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala 325 330 335 Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr 340 345 350 Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu 355 360 365 Val Ile Thr Leu Tyr Cys Arg Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile 370 375 380 Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp 385 390 395 400 Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu 405 410 415 Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly 420 425 430 Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr 435 440 445 Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys 450 455 460 Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys 465 470 475 480 Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg 485 490 495 Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala 500 505 510 Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg 515 520 525 Glu

Claims (17)

  1. ■ 연속적으로, VH 선택적으로 인간화된 링커로, 바람직하게는 서열 (GGGGS)n이고 n = 1 -4이고, 바람직하게는 n=3인 링커, 및 VL 선택적으로 인간화된 힌지를 포함하는 세포외 리간드 결합-도메인을 포함하는 세포외 도메인,
    ■ 막관통 도메인 및
    ■ 세포질 도메인.
    ■ 단일클론 항체 (mimotope)에 특이적인 적어도 하나의 에피토프를 포함하는
    CD123 특이적 키메라 항원 수용체 (CD123 CAR).
  2. 제 1항에 있어서,
    ■ 연속적으로, 서열번호 12, 서열번호 24, 서열번호 25, 서열번호 26, 서열번호 27, 서열번호 28, 서열번호 29 및 서열번호 30으로부터 선택되는 VH, 선택적으로 인간화된 링커, 바람직하게는 서열 (GGGGS)n으로 n = 1 -4, 바람직하게는 n=3인 링커, 및 서열번호 11, 서열번호 18, 서열번호 19, 서열번호 20, 서열번호 21, 서열번호 22 및 서열번호 23로부터 선택되는 VL, 선택적으로 인간화된 힌지를 포함하는 세포외 리간드 결합-도메인을 포함하는 세포외 도메인,
    ■ CD8 알파로부터의 막관통 도메인, 및
    ■ 4-1BB로부터의 공-자극 도메인 및 CD3 제타 신호전달(signaling) 도메인을 포함하는 세포질 도메인.
    를 포함하는 CD123 CAR.
  3. 제 1항 또는 제 2항에 있어서,
    인간 CD28 NP_006130.1과 동일성을 갖는 서열을 포함하지 않는 CD123 CAR.
  4. 제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 있어서,
    서열번호 172, 서열번호 173, 서열번호 174, 서열번호 175, 서열번호 176, 서열번호 177, 서열번호 178, 서열번호 179, 서열번호 180, 서열번호 181, 서열번호 182, 서열번호 183, 서열번호 184, 서열번호 185, 서열번호 186 및 서열번호 187로부터 선택되는 서열을 포함하고, 선택적으로 적어도 하나의 서열번호 161을 더 포함하는 CD123 CAR.
  5. 제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 세포외 도메인은 서열번호 161, 서열번호 162, 서열번호 163, 서열번호 164, 서열번호 165, 서열번호 166, 서열번호 167, 서열번호 168, 서열번호 169 및 서열번호 170로, 바람직하게는 서열번호 161로, 그리고 서열번호 169로 구성되는 리스트로부터 선택되는 단일클론 항체 (유사체(mimotope))에 특이적인 적어도 하나의 에피토프를 포함하는 CD123 CAR.
  6. 제 1항 내지 제 5항 중 어느 한 항에 있어서,
    서열번호 160, 서열번호 171, 서열번호 188, 서열번호 189, 서열번호 190, 서열번호 191, 서열번호 192, 서열번호 193, 서열번호 194, 서열번호 195, 서열번호 196, 및 서열번호 197로부터 선택되는 서열을 포함하는 CD123 CAR.
  7. 제 1항 내지 제 6항 중 어느 한 항에 따른 CD123 특이적 키메라 항원 수용체 (CD123 CAR)를 코드하는 폴리뉴클레오타이드.
  8. 제 7항에 따른 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현 벡터.
  9. 제 1항 내지 제 6항 중 어느 한 항에서 정의된 CD123 CAR 중 어느 하나를 코드하는 적어도 하나의 서열 및 백본(backbone)을 포함하는 발현 벡터.
  10. 백본, EF1 프로모터, RQR8 오픈 리딩 프레임 (RQR8 ORF), 제 1항 내지 제 6항의 CD123 CAR 중 어느 하나를 코드하는 서열을 포함하는 발현 벡터.
  11. 제 1항 내지 제 6항 중 어느 한 항에 따른 CD123 CAR를 세포 표면 막에서 발현시키는, T 세포 수용체 (TCR) 넉-아웃 (KO) 또는 TCR 및 인간 디옥시사이티딘 키나제 (dCK) KO 조작된 면역 세포.
  12. 제 1항 내지 제 6항 중 어느 한 항에 따른 CD123 특이적 키메라 항원 수용체 (CD123 CAR)를 코드하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는, TCR KO 또는 TCR 및 dCK KO 조작된 면역 세포.
  13. 세포 표면에서 자살 도메인을 더 발현시키는 제 4항에 따른, TCR KO 또는 TCR KO 및 dCK KO CD123 CAR-발현시키는 조작된 면역 세포.
  14. 제 11항 내지 제 13항 중 어느 한 항에 있어서,
    적어도 하나의 MHC 단백질의 발현이 억제된, TCR KO 또는 TCR KO 및 dCK KO CD123 CAR-발현시키는 조작된 면역 세포.
  15. 치료에의 사용을 위한 제 11항 내지 제 14항 중 어느 한 항에 따른 TCR KO 또는 TCR KO 및 dCK KO CD123 CAR-발현시키는 조작된 면역 세포
  16. 제 15항에 있어서,
    질환은 급성 골수성 백혈병 (AML), 바람직하게는 난치성/재발된 AML, BPDNL이거나, 또는 골수 이식 동안, 또는 그 전에 사용을 위한 것인, TCR KO 또는 TCR KO 및 dCK KO CD123 CAR-발현시키는 조작된 면역 세포
  17. 치료로서, 바람직하게는 림프구증식성 장애의 치료로서, 더욱 바람직하게는 림프종의 백혈병의 치료로서 사용을 위한, 또는 급성 골수성 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 골수형성이상(myelodysplastic) 증후군, 급성 림프성 백혈병, 만성 림프성 백혈병, 및 골수형성이상(myelodysplastic) 증후군 및 BPDNL로 구성되는 군으로부터 선택되는 치료를 위한, TCR KO 또는 TCR KO 및 dCK KO CD123 CAR-발현시키는조작된 면역 세포.
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