ES2302726T3

ES2302726T3 - Estimulacion y concentracion simultanea de celulas.

Info

Publication number: ES2302726T3
Application number: ES01916241T
Authority: ES
Inventors: Ron Berenson; Che Law; Mark Bonyhadi; Narinder Saund; Stewart Craig; Dale Kalamasz; Alan Hardwick; David Mcmillen
Original assignee: Invitrogen Corp
Current assignee: Life Technologies Corp
Priority date: 2000-02-24
Filing date: 2001-02-26
Publication date: 2008-08-01
Anticipated expiration: 2021-02-26
Also published as: US6905874B2; DK1257632T3; IL151287A; HK1052372A1; CN1419597A; JP2004500095A; KR20030032922A; US20020058019A1; BR0108545A; EP1257632B1; CA2406864A1; MXPA02008265A; DE60130435T2; HK1047770A1; DE60130435D1; AU4328801A; ATE373078T1; WO2001062895A3; IL151287A0; AU2001243288B2

Abstract

Método para estimular in vitro una población de células T mediante concentración de las células T y ligación de la fracción de superficie celular simultáneamente que comprende: (a) proporcionar una población de células en la que una parte como mínimo de ellas son células T (b) poner en contacto la mencionada población de células con una superficie, en la que la mencionada superficie tenga adherido uno o más agentes que ligue(n) una fracción de superficie celular de como mínimo una porción de las mencionadas células T y estimule(n) como mínimo la mencionada porción de células T. (c) aplicar una fuerza que fuerce principalmente la concentración de células T y la ligación de la fracción de superficie celular, induciendo de esta forma la estimulación de células T.

Description

Estimulación y concentración simultánea de células.

Sector técnico

La presente invención está relacionada en términos generales con métodos para la estimulación de células, y más en particular, con métodos para concentrar y estimular células que maximicen la estimulación celular. La presente invención también está relacionada con composiciones de células, incluyendo células T estimuladas, con características fenotípicas específicas.

Antecedentes de la invención

Muchas células son activadas o reguladas a través de receptores incrustados en balsas lipídicas o "lipid rafts" que se encuentran en las membranas de la superficie celular (véase K. Simons y D. Toomre, Nature Rev. 1:31; 2000). Los balsas lipídicas forman plataformas de concentración para receptores individuales que se activan por la unión del ligando. Los balsas lipídicas están implicados en los procesos de señalización celular, incluyendo la señalización de la inmunoglobulina E durante la respuesta inmune alérgica, la señalización del factor neurotrófico derivado de células gliales (importante para el desarrollo y mantenimiento del sistema nervioso), la señalización Ras (básica para muchos procesos de transducción de señal) y la señalización del receptor de antígeno de las células T
(TCR).

El receptor de antígeno de las células T (TCR) es un receptor de reconocimiento inmune multisubunidades que se asocia con el complejo CD3 y se enlaza con los péptidos presentados por las proteínas del Complejo Principal de Histocompatibilidad (MHC) clases I y II de la superficie de las células presentadoras de antígeno (APC). El enlace del TCR al péptido antigénico de la APC es el acontecimiento principal de la activación de una célula T, acción que se produce durante la sinapsis inmunológica en el punto de contacto entre la célula T y la célula APC. Además, los datos sugieren que el agrupamiento de los balsas lipídicas es básico para la formación de la sinapsis inmunológica. (Krawczyk et al., Immunity 13(4):463-73, 2000).

Para sostener la activación de las células T, los linfocitos T necesitan habitualmente una segunda señal estimuladora. La coestimulación es necesaria típicamente para que una célula T colaboradora (helper) produzca los suficientes niveles de citocina que induzcan la expansión clonal. (Bretscher, Immunol. Today 13:74, 1992; June et al., Immunol. Today 15:321, 1994). La señal coestimuladora principal se produce cuando un miembro de la familia B7 de ligandos (CD80 (B7.1) o CD86 (B7.2)) de una célula presentadora de antígeno (APC) activada se une al CD28 de una célula T.

Los métodos para estimular la expansión de determinados subgrupos de células T tienen la capacidad de generar diversas composiciones de células T útiles en inmunoterapia. Una inmunoterapia satisfactoria puede reforzarse aumentando la reactividad y la cantidad de células T por medio de una estimulación eficaz.

Las diversas técnicas disponibles para multiplicar células T humanas se han basado principalmente en el uso de células accesorias o factores de crecimiento exógenos, como Interleucina-2 (IL-2). La IL-2 se ha utilizado con un anticuerpo anti-CD3 para estimular la proliferación de células T, principalmente, aumentando la subpoblación CD8^{+} de células T. Se cree que para una óptima activación y expansión de las células T y su supervivencia durante la reinfusión son necesarias ambas señales APC. El requisito de que las células APC concuerden con el complejo MHC como células accesorias presenta un importante problema para los sistemas de cultivo a largo plazo, pues las células APC tienen una vida relativamente corta. Por lo tanto, en un sistema de cultivo a largo plazo, estas células APC se deben obtener de una fuente continua y se deben reponer. La necesidad de un suministro renovable de células accesorias resulta problemático para el tratamiento de inmunodeficiencias en las que queden afectadas las células accesorias. Además, cuando se trata una infección viral, si las células accesorias son portadoras del virus, pueden contaminar toda la población de células T durante un cultivo a largo plazo.

En ausencia de factores de crecimiento exógenos o de células accesorias, a una población de células T se le puede enviar una señal coestimuladora, por ejemplo, exponiendo las células a un ligando CD3 y a un ligando CD28 adheridos a una superficie de fase sólida, como por ejemplo una perla (véase C. June, et al., patente U.S. Nº 5.858.358; C. June et al. WO 99/953823). Aunque estos métodos son capaces de lograr poblaciones de células T útiles terapéuticamente, la posibilidad preparar células T con mayor vigor y facilidad sigue siendo inferior a la ideal.

Además, los métodos disponibles actualmente en la técnica no se han concentrado en la expansión a corto plazo de las células T, ni en obtener una población de células T más fuertes y en los beneficiosos resultados de ello, ni en la expansión de subclases/fenotipos específicos de células T. Por otro lado, la aplicabilidad de las células T expandidas ha quedado limitada a sólo unas pocas enfermedades. Para obtener la máxima eficacia in vivo, teóricamente, una población de células T activadas generadas ex vivo o in vivo debe estar en un estado que permita orquestar al máximo una respuesta inmune al cáncer, a enfermedades infecciosas u a otros estados de enfermedad. La presente invención proporciona métodos que resultan más sanos y naturales que otros métodos de expansión para generar un mayor número de células T más activadas y más puras que tengan características de producción de citocina y de receptores de superficie.

Además, la presente invención proporciona composiciones de poblaciones con fenotipo personalizado de cualquier célula diana, incluyendo poblaciones de células T y parámetros para su producción, así como otras ventajas relacionadas.

Resumen de la invención

La presente invención proporciona métodos para estimular una población de células T mediante la concentración de células T y la ligación de la fracción de superficie celular simultáneas, lo que incluye proporcionar una población de células en la que una porción como mínimo de ellas sean células T, poner en contacto la población de células con una superficie, superficie a la que está adherido uno o más agentes que ligan una fracción de superficie celular de, como mínimo, una porción de las células T, y estimula como mínimo esa porción de células T o una subpoblación de ellas, y aplicar una fuerza que fuerce predominantemente la concentración de células T y la ligación de la fracción de superficie de células T, induciéndose así la estimulación de estas células.

En una realización de los métodos, la superficie tiene adherido un primer agente que liga una primera fracción de superficie celular de una célula T, y la misma o una segunda superficie tiene adherido un segundo agente que liga una segunda fracción de la mencionada célula T, ligación en la que el primer y el segundo agente inducen la proliferación de la mencionada célula T. En realizaciones relacionadas, la superficie puede ser biocompatible, natural o sintética, comprender un polímero, colágenos, proteínas purificadas, péptidos purificados, polisacáridos, glicosaminoglicanos o composiciones de matriz extracelular. En determinadas realizaciones, los polisacáridos se seleccionan entre quitosán, alginato, dextrano, ácido hialurónico y celulosa, y el polímero se selecciona entre poliestireno, poliésteres, poliéteres, polianhídridos, polialquilcianoacrilatos, poliacrilamidas, poliortoésteres, polifosfacenos, polivinilacetatos, copolímeros de bloque, polipropileno, politetrafluoroetileno (PTFE) o poliuretanos. En todavía otras realizaciones, el polímero puede comprender ácido láctico o un copolímero. Y en otras realizaciones, el polímero puede ser un copolímero. Esos copolímeros pueden ser diversos copolímeros conocidos y pueden incluir ácido láctico o ácido glicólico (PLGA).

En relación con las superficies biocompatibles, esas superficies pueden ser biodegradables o no biodegradables. En realizaciones relacionadas, aunque no quedando limitadas a ellas, las superficies no biodegradables pueden comprender poli(dimetisiloxano) o poli(etileno-vinilo acetato). Además, la superficie biocompatible, aunque no quedando limitado a ello, puede incluir colágeno, metal, hidroxiapatita, cristal, aluminato, materiales biocerámicos, polímeros de ácido hialurónico, alginato, polímero de éster acrílico, polímero de ácido láctico, polímero de ácido glicólico, polímero de ácido láctico/ácido glicólico, proteínas purificadas, péptidos purificados o composiciones de matriz extracelular.

En otras realizaciones adicionales, la superficie biocompatible está asociada a un dispositivo implantable. El dispositivo implantable puede ser cualquiera que se desee utilizar y puede incluir un stent (endoprótesis), un catéter, una fibra, una fibra hueca, un parche o una sutura. En realizaciones relacionadas, la superficie puede ser cristal, sílice, silicio, colágeno, hidroxiapatita, hidrogeles, PTFE, polipropileno, poliestireno, nilón o poliacrilamida. Otras realizaciones incluyen aquellas en que la superficie incluye un lípido, una placa, una bolsa, una varilla, una perla, una fibra o una malla. Otras realizaciones incluyen aquellas en que la superficie es una partícula y en las que además, la partícula comprende una perla, una microesfera, una nanopartícula o una partícula coloidal. También se pueden elegir los tamaños de partícula y de perla y pueden tener distintos tamaños, incluyendo aquéllos en que la perla tiene aproximadamente de 5 nanometros a aproximadamente 500 micrones de diámetro.

En otras realizaciones, los agentes utilizados en los métodos se pueden seleccionar de forma independiente entre un ligando de proteína, un ligando natural o un ligando sintético. Además, los agentes también pueden incluir un anticuerpo, un fragmento de anticuerpo, un péptido, un polipéptido, un glicopéptido, un receptor soluble, un esteroide, una hormona, un mitógeno, un antígeno, un superantígeno, un factor de crecimiento, una citocina, una lectina, una proteína viral, una molécula de adhesión o una quimoquina. En realizaciones específicas, un agente como mínimo es un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo. Mientras que en otras realizaciones, un primer agente es un anticuerpo y un fragmento del mismo, y un segundo agente es un anticuerpo o un fragmento del mismo. Debería naturalmente entenderse que los agentes primero y segundo podrían ser tanto el mismo anticuerpo o anticuerpos distintos.

En realizaciones seleccionadas, el primer agente es un anticuerpo anti-CD3, un anticuerpo anti-CD2 o un fragmento de anticuerpo de un anticuerpo anti-CD3 o anti-CD2. Realizaciones seleccionadas adicionales incluyen aquéllas en que el segundo agente es un anticuerpo anti-CD28 o un fragmento de anticuerpo del mismo. Otras realizaciones incluyen aquéllas en que el segundo agente se compone de un ligando natural para CD28, como por ejemplo, B7-1 o B7-2. Además, se podrían utilizar otros agentes estimuladores.

En ciertas realizaciones, la fuerza utilizada para impulsar las células puede incluir diversas fuerzas que funcionen de manera similar e incluye una fuerza superior a la fuerza de la gravedad, una fuerza hidráulica, una fuerza de filtrado generada mediante presión transmembrana, una fuerza centrífuga o una fuerza magnética. Cuando se utilizan fuerzas magnéticas, algunas realizaciones utilizan una fuerza magnética generada por un imán con una potencia de campo magnético que oscila entre aproximadamente 200 gauss a aproximadamente 12.000 gauss en la superficie del imán.

Otras realizaciones incluyen superficies en la que ésta es una superficie de una partícula paramagnética. En las realizaciones que utilizan superficies (incluyendo una superficie de una partícula paramagnética), la adhesión de los agentes a la superficie puede ser covalente, no covalente, electrostática, de adhesión intermolecular o hidrofóbica.

En otras realizaciones adicionales, las células T que son ligadas quedan separadas de las células T que no son ligadas. En otras realizaciones, las células T mejoran la disfunción de la respuesta inmune.

Otros aspectos que se revelan que se pueden combinar con las realizaciones arriba señaladas incluyen, por ejemplo, métodos para la estimulación de células T mediante ligación de la fracción de superficie celular y agregación de células T simultáneamente, incluyendo proporcionar una población celular que incluye células T, poniendo en contacto la mencionada población celular con una superficie, superficie que tiene adheridos uno o más ligandos específicos para una fracción de superficie celular, aplicando una fuerza que provoca la concentración de células T y superficie e incubando las mencionadas células durante un periodo de tiempo suficiente para lograr la estimulación deseada. En realizaciones relacionadas, el tiempo suficiente para lograr la estimulación deseada puede oscilar entre 1 minuto y 10 días, con todos los valores enteros intermedios. En determinadas realizaciones, el intervalo de tiempo puede oscilar entre aproximadamente 1 día a aproximadamente 8 días, mientras que en otras realizaciones adicionales el tiempo puede oscilar entre aproximadamente 3 días a aproximadamente 5 días, o entre aproximadamente 1 día a aproximadamente 5 días. En realizaciones relacionadas, la temperatura de incubación puede oscilar entre aproximadamente 2 a aproximadamente 38ºC.

Otras realizaciones que se pueden utilizar con todos los métodos expuestos incluye aquéllas en que la superficie se selecciona entre cristal, sílice, silicio, colágeno, hidroxiapatita, hidrogeles, PTFE, polipropileno, poliestireno, nilón, dextrano o poliacrilamidas o mezclas de cualquiera de ellos. Además, las realizaciones incluyen, antes o simultáneamente con cualquiera de los pasos indicados anteriormente, separar las células T concentradas con superficie de las células no concentradas.

En otros aspectos se revelan métodos de inducción de la activación de células T in vivo, incluyendo la administración de partículas paramagnéticas a un animal, teniendo adheridos las mencionadas partículas ligandos específicos para una fracción de superficie de células T que induce la activación de éstas, la aplicación de un campo magnético a una región determinada del animal, induciendo de esta forma la localización y activación de las células T unidas a las mencionadas partículas en la mencionada región específica.

Se revela un aspecto adicional que incluye métodos para estimular una población de células diana mediante la simultánea concentración de la célula diana y la ligación de la fracción de superficie celular de ésta, lo que incluye proporcionar una población de células en la que una porción como mínimo de ella sean células diana, poner en contacto la mencionada población de células con una superficie, superficie a la que está adherido uno o más agentes que ligan una fracción de la superficie celular de, como mínimo, una porción de las mencionadas células diana, y estimula como mínimo esa porción de células diana, aplicando una fuerza que impulsa predominantemente la concentración de la célula diana y la ligación de la fracción de superficie de la célula diana, induciéndose así la estimulación de esta célula.

En determinadas realizaciones, los métodos aquí descritos utilizan una superficie que tiene adherido un primer agente que liga una primera fracción de superficie celular de una célula diana, y la misma o una segunda superficie tiene adherido un segundo agente que liga una segunda fracción de la mencionada célula diana, ligación en la que el primer y el segundo agente inducen la transducción de señal en la mencionada célula diana.

Como se ha indicado anteriormente, la superficie puede incluir diversos componentes, incluido colágeno, proteínas purificadas, péptidos purificados, polisacáridos, glicosaminoglicanos o composiciones de matriz extracelular. Algunos polisacáridos que se utilizan en realizaciones específicas pueden incluir quitosán, alginato, dextrano, ácido hialurónico o celulosa. Además, los polímeros indicados anteriormente y aplicables a todos los métodos se pueden seleccionar del grupo formado por poliésteres, poliéteres, polianhídridos, polialquilcianoacrilatos, poliacrilamidas, poliortoésteres, polifosfacenos, polivinilacetatos, copolímeros de bloque, polipropileno, politetrafluoroetileno (PTFE) o poliuretanos y mezclas de ellos.

En otros aspectos que se revelan se facilitan métodos para estimular células diana mediante la ligación de la fracción de superficie celular y la concentración de la célula diana, incluyendo proporcionar una población celular que comprenda células diana, poniendo en contacto la mencionada población celular con una superficie, superficie que tiene adherido uno o más ligandos específicos para una fracción de superficie celular, aplicando una fuerza que impulsa la concentración de las células diana y la concentración de las mencionadas células sobre la mencionada superficie, e incubando las mencionadas células durante un periodo de tiempo suficiente para lograr la estimulación deseada.

En realizaciones relacionadas, las células diana pueden ser células T, células B o células madre.

Otro aspecto que se revela proporciona métodos de inducción de la estimulación de células diana in vivo, incluyendo la administración de partículas paramagnéticas a un animal, teniendo adheridos las mencionadas partículas ligandos específicos para una fracción de superficie de la célula diana que inducen la estimulación de ésta, aplicando un campo magnético a una región determinada del animal, induciendo de esta forma la localización y activación de las células diana unidas a las mencionadas partículas en la región específica mencionada.

Se revelan todavía otros aspectos que incluyen métodos para inducir la polarización del receptor en células portadoras de receptor que comprenden proporcionar una población celular, poner en contacto la mencionada población con una superficie sólida, superficie sólida que tiene adherido uno o más ligandos específicos para un receptor de superficie celular presente en, como mínimo, una porción de la mencionada población celular, y aplicar una fuerza que impulsa la concentración celular y la ligación del receptor de superficie celular.

Otros aspectos revelados incluyen métodos para inducir la agregación de moléculas de superficie celular, incluyendo proporcionar una población de células que tienen una molécula de superficie de la célula diana, poner en contacto la mencionada población de células con una superficie sólida, superficie sólida que tiene adherido un ligando para, como mínimo, una molécula de la superficie de la célula diana, aplicando una fuerza que fuerza la agregación de las moléculas de la superficie de la célula diana.

En ciertas realizaciones, la población celular incluye linfocitos.

En otras realizaciones determinadas, el enlace de la fracción de superficie celular o el receptor conduce a una regulación descendente o a la supresión de un evento celular. Realizaciones relacionadas incluyen aquéllas en que el enlace del receptor conduce a una regulación ascendente o activación de un evento celular, que puede incluir, por ejemplo, la transducción de la señal mediada por el receptor.

Otra realización de la invención contempla el uso de una fuerza para impulsar la orientación de concentración de fracciones de superficie celular.

Otras realizaciones adicionales reveladas proporcionan poblaciones de células diana con fenotipo a la medida o composiciones que incluyen composiciones de células T. Además, se facilitan métodos para activar esas células mediante ligación de una fracción de superficie celular. También se proporcionan otros métodos para inducir la proliferación de una población de células T, incluyendo la puesta en contacto de las células T con una superficie sólida durante un periodo de tiempo de entre aproximadamente dos horas y aproximadamente nueve días, superficie sólida en la que está inmovilizado un primer agente y un segundo agente, primer agente que proporciona una señal de activación y segundo agente que proporciona una señal coestimuladora a las mencionadas células T.

Éstos y otros aspectos de la presente invención resultarán evidentes consultando la siguiente descripción detallada y las Figuras anexas.

Breve descripción de las figuras

La Figura 1 es una representación gráfica que compara el número total de células T activadas y expandidas al día 8 empezando con aproximadamente 0,5 x 10^{9} células T con (XCELLERATE II^{TM}) o sin (XCELLERATE I^{TM}) estimulación y concentración magnética.

La Figura 2 es una representación gráfica que compara la expansión de células T activadas y multiplicadas medida al octavo día con (XCELLERATE II^{TM}) o sin (XCELLERATE I^{TM}) estimulación y concentración magnética.

La Figura 3 es una representación gráfica que representa el análisis de citometría de flujo de la expresión de CD154 en comparación con la re-estimulación de células T cultivadas previamente durante 8 días tras estimulación y concentración magnética (XCELLERATE II^{TM}) o sin estimulación y concentración magnética (XCELLERATE I^{TM}).

La Figura 4 es una representación gráfica que representa el análisis de citometría de flujo de la expresión de CD154 después de 3 días en cultivo comparando la estimulación y concentración magnética (XCELLERATE II^{TM}) con células activadas sin estimulación y concentración magnética (XCELLERATE I^{TM}).

Las Figuras 5A-5B son representaciones gráficas que muestran la activación y expansión de células T PBMC (Células Mononucleares de Sangre Periférica) con XCELLERATE I^{TM} (5A) o PBMC congeladas y descongeladas (5B) para iniciar el proceso XCELLERATE I^{TM}.

Las Figuras 6A-6B son representaciones gráficas que muestran el análisis en el transcurso del tiempo de la expresión de CD25 tras la activación de células T en una muestra donante (PC071) durante los procesos XCELLERATE I o II^{TM}. La re-estimulación se realizó a la marca del día 8 para simular la activación in vivo. La Figura 6A muestra la expresión de CD25 en células CD4^{+}, mientras que la Figura 6B muestra la expresión de CD25 en células CD8^{+}.

Las Figuras 7A-7B son representaciones gráficas que muestran el análisis en el transcurso del tiempo de la expresión de CD154 tras la activación de células T en una muestra donante (PC071) durante los procesos XCELLERATE I o II^{TM}. La re-estimulación se realizó a la marca del día 8 para simular la activación in vivo. La Figura 7A muestra la expresión de CD154 en células CD4^{+}, mientras que la Figura 7B muestra la expresión de CD154 en células
CD8^{+}.

Las Figuras 8A y 8B son representaciones gráficas que ilustran el crecimiento de células T de sangre periférica humana después de la estimulación con perlas coinmovilizadas de anti-CD3 y anti-CD28 utilizando el proceso descrito en el Ejemplo IX.

La Figura 9 es una representación gráfica que ilustra el crecimiento de células T de sangre periférica humana tras la estimulación con perlas coinmovilizadas de anti-CD3 y anti-CD28/IL-2 recombinante humana a 10 u/ml y +/- disminución de monocitos. Todas las células se cultivaron en matraces Baxter Lifecell (300 ml). "Scale up" hace referencia a un cultivo en matraz de 300 ml (sin IL-2/disminución de monocitos) que se amplió hasta un matraz Baxter Lifecell de 3 litros.

La Figura 10 es una representación gráfica que muestra el análisis cinético del tamaño celular según determinación mediante perfiles de citometría de flujo por dispersión frontal de la luz Forward Scatter (FSC) con el transcurso del tiempo.

Las Figuras 11A y 11B son representaciones gráficas de la expresión de CD25 con el transcurso del tiempo tras la estimulación inicial con perlas coinmovilizadas de anti-CD3 y anti-CD28. La Figura 11A representa el perfil de la expresión de CD25 en células CD4^{+}, mientras que la Figura 11B representa la expresión de CD25 en células
CD8^{+}.

La Figura 12 es una representación gráfica que ilustra los cambios en el tamaño celular según determinación mediante perfiles de citometría de flujo de dispersión frontal de la luz forward scatter en el transcurso del tiempo tras las estimulaciones primaria y secundaria.

Las Figuras 13A y 13B son representaciones gráficas de la expresión de CD25 con el transcurso del tiempo tras las estimulaciones primaria y secundaria.

La Figura 13A representa el perfil de la expresión de CD25 en células CD4^{+}, mientras que la Figura 13B representa la expresión de CD25 en células CD8^{+}.

Las Figuras 14A y 14B son representaciones gráficas de datos de citometría de flujo que muestran la expresión de CD154 tras la estimulación secundaria en la que se variaron las fuentes de las estimulaciones primaria y secundaria. La Figura 14A representa el perfil de la expresión de CD154 en células CD4^{+}, mientras que la Figura 14B representa el perfil de la expresión de CD154 en células CD8^{+}.

La Figura 15 es una representación gráfica de datos de citometría de flujo que muestra la expresión de CD137 en todas las células T multiplicadas en la muestra tras la estimulación secundaria.

Las Figuras 16A y 16B son representaciones gráficas de datos de citometría de flujo que muestran la expresión de CD54 tras la estimulación secundaria en la que se variaron las fuentes de estimulación. La Figura 16A representa la expresión de CD54 en células CD4^{+}, mientras que la Figura 16B representa la expresión de CD54 en células CD8^{+}.

Las Figuras 17A-17D son representaciones gráficas de datos de citometría de flujo que muestran los fenotipos celulares, así como las expresiones de CD154 y de CD137, tras la estimulación secundaria mediante perlas acopladas a anti-CD3 y anti-CD28 de células T obtenidas de un paciente con leucemia linfocítica crónica de células B. Las Figuras 17A y 17B representan células CD4^{+} y CD8^{+} presentes en muestras 13 días después de la estimulación con perlas (17A) acopladas a anti-CD3 y anti-CD28, y 18 días después de la estimulación primaria y 7 días tras la estimulación secundaria con perlas (17B) acopladas a anti-CD3 y anti-CD28. Las Figuras 17C y 17D son representaciones gráficas de datos de citometría de flujo que muestran las expresiones de CD154 y de CD137 tras la estimulación secundaria de células obtenidas de un paciente con leucemia linfocítica crónica de células B.

Las Figuras 18A-18C son representaciones gráficas que muestra la expresión con el transcurso del tiempo de IL-2 (18A), Interferon gamma (IFN-) (18B) y IL-4 (18C) tras las estimulaciones primaria y secundaria de células T de donantes normales.

Las Figuras 19A-19B son representaciones gráficas que muestran la expresión con el tiempo de CD62L tras la estimulación con perlas acopladas a anti-CD3 y anti-CD28.

La Figura 20 es una representación gráfica que muestra el porcentaje de células CD4 o CD8 tras la estimulación con perlas coinmovilizadas de anti-CD3 y anti-CD28.

Las Figuras 21A-21B son representaciones gráficas que muestran datos de la citometría de flujo como función de la intensidad fluorescente media de las expresiones de CD25 y de CD154 respectivamente tras la estimulación con perlas coinmovilizadas de anti-CD3 y anti-CD28 y +/- reestimulación utilizando el proceso del Ejemplo IX.

Las Figuras 22A-22B son representaciones gráficas que muestran análisis de citometría de flujo de tinción de CD154 en comparación con tinción de control (p.ej., fondo) en células con subpoblaciones (22A) de CD4 y CD8 o poblaciones (22B) enriquecidas de CD4 antes de la estimulación con perlas coinmovilizadas de anti-CD3 y anti-CD28.

Las Figuras 23A-23B son representaciones gráficas que muestran el análisis ELISA (Ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas) de TNF- (23A) y IFN- (23B) en medios tras la estimulación de linfocitos de sangre periférica con perlas coinmovilizadas de anti-CD3 y anti-CD28.

Las Figuras 24A-24B son representaciones gráficas que muestran el análisis ELISA de IL-4 (24A) y IL-2 (24B) en medios tras la estimulación de linfocitos de sangre periférica con perlas coinmovilizadas de anti-CD3 y anti-CD28.

La Figura 25 es una representación gráfica que muestra el aumento de tamaño de las células T tras la estimulación de linfocitos de sangre periférica con perlas coinmovilizadas de anti-CD3 y anti-CD28 y utilizando análisis de dispersión frontal de la luz forward scatter.

Las Figuras 26A-26L son gráficas de barras que representan los datos de citometría de flujo de la expresión de CD62L (Intensidad de fluorescencia media, MFI) (26A), CD49d (MFI) (26B), CD25 (MFI) (26C), CD69 (MFI) (26D), CD154 (MFI) (26E), dispersión frontal de la luz (tamaño) (26F), viabilidad (% "live gate") (26G); todas tras estimulación con perlas coinmovilizadas de anti-CD3 y anti-CD28 y re-estimulación con las mismas al octavo día. Las Figuras 26H-26L muestran CD62L, CD69, CD49d, CD154 y CD25 a las 4 y 18 horas después de la estimulación respectivamente.

Descripción detallada de la invención

Antes de exponer la invención puede resultar útil para su comprensión establecer definiciones de ciertos términos que se utilizarán posteriormente.

El término "biocompatible", en la forma aquí utilizada, hace referencia a la propiedad de ser principalmente no tóxico para células vivas.

El término "estimulación", en la forma aquí utilizada, hace referencia a una respuesta primaria inducida por la ligación de una fracción de superficie celular. Por ejemplo, en el contexto de los receptores, esa estimulación implica la ligación de un receptor y un evento posterior de transducción de señal. En relación con la estimulación de una célula T, esa estimulación hace referencia a la ligación de una fracción de superficie de una célula T que en una realización posterior induce un evento de transducción de señal, como el enlace del complejo TCR/CD3. Además, el evento de estimulación puede activar una célula o regular ascendente o descendentemente la expresión o la secreción de una molécula, como la regulación descendente de TGF-\beta. Así, la ligación de fracciones de superficie celular, incluso en ausencia de un evento de transducción directa de señal, puede resultar en la reorganización de las estructuras del citoesqueleto o en la fusión de las fracciones de superficie celular, cada uno de los cuales podría servir para amplificar, modificar o alterar posteriores respuestas de la célula.

El término "activación", en la forma aquí utilizada, hace referencia al estado de una célula tras suficiente ligación de la fracción de superficie celular para inducir un cambio morfológico perceptible. En el contexto de las células T, esa activación hace referencia al estado de una célula T que haya sido estimulada suficientemente para inducir la proliferación celular. La activación de una célula T también puede inducir la producción de citocina y la ejecución de funciones reguladoras o de efector citolítico. En el contexto de otras células, este término infiere una regulación bien ascendente o descendente de un proceso físico-químico particular.

El término "fuerza", en la forma aquí utilizada, hace referencia a una fuerza artificial o externa aplicada a las células que se van a estimular y que induce la concentración celular y la concentración de células con el agente que se une a una fracción de superficie celular. Por ejemplo, el término "fuerza" incluye cualquier fuerza superior a la gravedad (es decir, además de la gravedad y no exclusivamente ésta) que induzca la concentración celular o la ligación de la fracción de superficie celular. Esas fuerzas incluyen presión transmembrana como el filtrado, una fuerza hidráulica, una fuerza eléctrica, una fuerza acústica, una fuerza centrífuga o una fuerza magnética. De forma ideal, la fuerza utilizada impulsa la concentración de la célula diana de interés con un agente que liga una fracción de superficie celular. En distintos contextos, la fuerza puede ser ejercida por impulsos, es decir, aplicada una y otra vez (p.ej., una fuerza magnética que se pudiera activar y desactivar, aplicando impulsos en la población de células en combinación con una partícula paramagnética).

El término "simultáneo/a", en la forma aquí utilizada, hace referencia al hecho de que intrínsecamente a la concentración de células en una superficie que tenga adheridos agentes de unión de fracciones de superficie celular, el resultado es la concentración de células entre sí y con la superficie, de este modo, ligandos (es decir, agentes). Sin embargo, el uso del término "simultáneo/a" no implica un enlace previo de las células diana con una superficie que tenga adherida agentes de unión de fracciones de superficie celular, pues la concentración y posterior unión del ligando ocurren simultáneamente en la superficie de concentración. Por ejemplo, en el contexto de la activación de células T, estas células pueden ser expuestas a una superficie, como una perla paramagnética que tenga adheridos anticuerpos anti-CD3 y anti-CD28, y ser posteriormente concentradas por un campo magnético. Así, en este contexto, aunque las células y perlas tengan contacto previo y ligación, la ligación adicional de las células se produce sin embargo durante la concentración.

El término "célula diana", en la forma aquí utilizada, hace referencia a cualquier célula que se pretenda estimular mediante ligación de la fracción de superficie celular.

Un "anticuerpo", en la forma aquí utilizada, incluye anticuerpos policlonales y monoclonales, primatizados (p.ej., humanizados), murina, ratón-humano, ratón-primate y quiméricos; y puede ser una molécula intacta, un fragmento de ella (como fragmentos scFv, Fv, Fd, Fab, Fab' y F(ab)'_{2}), o multímeros o conglomerados de moléculas intactas o fragmentos; y puede ocurrir de forma natural o ser producido, p.ej., mediante inmunización, síntesis o ingeniería genética; un "fragmento de anticuerpo", en la forma aquí utilizada, hace referencia a fragmentos derivados de o relacionados con un anticuerpo, que se unen a antígenos y que en algunas realizaciones pueden ser derivatizados para tener características estructurales que faciliten la eliminación y absorción, p.ej., incorporando residuos de galactosa. Se incluyen por ejemplo F(ab), F(ab)'_{2}, scFv, región variable de la cadena ligera (V_{L}), región variable de la cadena pesada (V_{H}) y combinaciones de ellos.

El término "proteína", en la forma aquí utilizada, incluye proteínas, polipéptidos y péptidos, y puede ser una molécula intacta, un fragmento de ella, o multímeros o conglomerados de moléculas intactas o fragmentos; y puede ocurrir de forma natural o ser producida, p.ej., mediante síntesis (incluyendo química o enzimática) o ingeniería genética.

El término "agente", "ligando" o "agente que se une una fracción de superficie celular", en las formas aquí utilizadas, hacen referencia a una molécula que se une a una población definida de células. El agente puede unir cualquier fracción de superficie celular, como un receptor, un determinante antigénico u otro punto de enlace presente en la población de células diana. El agente puede ser una proteína, un péptido, un anticuerpo y fragmentos del mismo, proteínas de fusión, moléculas sintéticas, una molécula orgánica (p.ej., una molécula pequeña) o similares. Dentro de la especificación y en el contexto de la estimulación de células T, los anticuerpos se utilizan como ejemplo prototipo de un agente así.

Los términos "agente que se une a una fracción de superficie celular" y "fracción de superficie celular", en las formas aquí utilizadas, se utilizan en el contexto de una pareja ligando/anti-ligando. Por lo tanto, estas moléculas se deben contemplar como un juego complementario/anti-complementario de moléculas que muestran una unión específica, generalmente de afinidad relativamente alta.

Una "señal coestimuladora", en la forma aquí utilizada, hace referencia a una señal que en combinación con una señal primaria, como la ligación TCR/CD3, provoca una proliferación de células T.

Una "pareja ligando/anti-ligando", en la forma aquí utilizada, hace referencia a un juego complementario/anti-complementario de moléculas que muestran una unión específica, generalmente de afinidad relativamente alta. Ejemplos de parejas ligando/anti-ligando son enzima/inhibidor, hapteno/anticuerpo, lectina/carbohidrato, ligando/receptor y biotina/avidina o estreptavidina. En el contexto de la presente invención, receptores de especificación y otras fracciones de superficie celular son anti-ligandos, mientras que los agentes (p.ej., anticuerpos y fragmentos de anticuerpos) que son reactivos con ellos son ligandos.

"Separación", en la forma aquí utilizada, incluye cualquier medio para purificar de manera sustancial un componente de otro (p.ej., mediante filtrado o atracción magnética).

"Inactivo", en la forma aquí utilizada, hace referencia al estado de la célula en que ésta no se está proliferando de forma activa.

Una "superficie", en la forma aquí utilizada, hace referencia a cualquier superficie que tenga adherido un agente e incluye sin limitación metales, cristal, plásticos, copolímeros, coloides, lípidos, superficies celulares y similares. Básicamente, cualquier superficie que sea capaz de retener un agente unido o adherido a ella.

Un aspecto de la presente invención está dirigido al sorprendente descubrimiento de que la combinación de una fuerza que induzca la concentración de células y la ligación de fracciones de superficie celular resulta en un gran aumento de la estimulación de estas células. En la presente invención se utilizan células T. Sin embargo, una persona versada en la técnica llegaría rápidamente a la conclusión de que la presente revelación tiene una gran aplicabilidad en cualquier tipo de célula en la que se desee una agregación o ligación de la fracción de superficie celular o en la que esa unión conduzca a un posterior evento de señalización celular (p.ej., receptores). Como no existe el deseo de limitarse a la teoría, la presente invención puede funcionar aprovechando un fenómeno que implica la formación de balsas lipídicas o la polarización del receptor. Los fenómenos son similares en que sugieren, bien el inicio/mejora de la transducción de señal por la agregación de balsas lipídicas que comprendan fracciones de superficie celular o una transducción de señal mejorada debido a la localización (es decir, polarización) de los receptores en una o incluso varias zonas de una célula. Así, no sólo esa ligación de la fracción de superficie celular conduce a una activación inesperadamente enérgica de la célula y a la proliferación de las células T, sino también se puede aplicar para amplificar el evento de transducción de señal de muchos tipos de célula. De esta forma, la presente revelación se podría utilizar en combinación con un dispositivo implantable para inducir un evento de transducción de señal en una ubicación determinada del cuerpo utilizada para estimular células ex vivo para la posterior infusión a un paciente, y para ampliar sustancialmente el estudio de eventos de transducción de señal en células amplificando las señales de transducción de señal, lo que ayudaría al cribado de medicamentos que influyan en esos eventos de transducción (p.ej., receptores acoplados a proteínas G, relacionados con esquizofrenia, sueño y otras indicaciones neurológicas; receptores de fragmento Fc en células madre y basófilos relacionados con la respuesta alérgica). En consecuencia, en el contexto de las células T, la presente invención proporciona diversas ventajas no esperadas; en primer lugar, elimina la necesidad de un paso independiente de disminución de monocitos que utilice partículas "no recubiertas", simplifica la expansión de células T al necesitar menos transferencias y menos reactivos, mayor nivel de activación de células T durante el proceso de activación, reduce el tiempo y trabajo implicados en el procesamiento de las células, reduce los costes de fabricación y aumenta la flexibilidad de la programación de procesamiento de pacientes y de infusiones.

En un aspecto adicional de la presente revelación se utiliza una primera y segunda o más superficies con o sin ligandos/agentes adheridos a ellas. En esta realización, las distintas superficies pueden tener adheridos los mismos o diferentes agentes para unir fracciones de superficie celular de células diana. Por ejemplo, una perla paramagnética puede tener adherido un anticuerpo para un receptor de una célula diana y esa perla se puede mezclar con una población de células que contenga la célula diana. Además, la población celular se puede mezclar con una segunda o más perlas con los mismos o distintos agentes de unión de la fracción de superficie celular adheridos a ella(s). Cuando se ha producido la concentración inducida por fuerza, las perlas y las células se juntan en un volumen más pequeño y así se amplifica la señalización. En otro ejemplo, las perlas paramagnéticas que tienen un agente específico para un carbohidrato u otra fracción de superficie celular no receptora adherido a ellas se mezclan con una población de células que contenga la célula diana. Después se utiliza un campo magnético para arrastrar las células adheridas a perla a otra superficie que tenga adheridos agentes de ligación del receptor. De esta forma, el agente inductor de la transducción de señal está en la segunda superficie. En otro ejemplo todavía, un agente que se une una fracción de superficie celular de la célula diana puede ser adherido a una partícula lo suficientemente grande para ser retenida en una malla o filtro que pueda tener ligandos adheridos.

Como se ha indicado anteriormente, la presente invención proporciona métodos para estimular una población de células concentrando y ligando simultáneamente fracciones de las superficies de células de esa población. Poner en contacto una población de células con un agente (p.ej., un ligando) que se una a una fracción de superficie celular puede estimular la población celular. El ligando puede estar en disolución, pero también se puede adherir a una superficie. La ligación de fracciones de superficie celular, como un receptor, puede inducir generalmente un camino específico de señalización. Estudios recientes sugieren que para que se produzca la señalización se debe producir la agregación de concentraciones críticas de balsas lipídicas que contengan los receptores necesarios. A modo de ejemplo, la agregación de balsas lipídicas se puede facilitar in vivo o in vitro adhiriendo ligandos para fracciones de superficie celular específicas a partículas paramagnéticas, exponiendo las partículas portadoras de ligando a las células y aplicando poco después o simultáneamente una fuerza, como un campo magnético, para ayudar a la polarización de las fracciones ligadas (p.ej., receptores) y concentrando las células en un volumen pequeño. La aplicación de una fuerza magnética concentra las células, y concentra las células con la superficie que tenga adheridos agentes que liguen fracciones de superficie celular, aportando así mayor contacto de las células con los ligandos, resulta en una activación acelerada y más potente. Son posibles muchas aplicaciones de la presente invención, por ejemplo si las células tienen un bajo número de receptores o sin éstos son disfuncionales, el método puede concentrar suficientemente esos receptores en los balsas lipídicas para superar esas deficiencias y permitir una correcta actividad de señalización. Un ejemplo de esa corrección del repertorio de superficies celulares está en pacientes con determinados tipos de leucemia en las que antes de la estimulación de la fracción de superficie celular con agentes como los anticuerpos anti-CD3 y anti-CD28, diversos marcadores de superficie celular normales son inusualmente bajos, como el complejo CD3/TCR. Estimulando esta población celular con agentes (como los anticuerpos anti-CD3 y anti-CD28), los marcadores de superficie celular de estas células vuelven a un nivel que aparenta ser normal, y por lo tanto pueden proporcionar un producto más potente para la terapia oncológica cuando se devuelven al paciente. En todavía otra aplicación de la presente invención, las células pueden ser concentradas y activadas de manera eficaz, incluyendo inducción de la polarización del receptor, maximizando así los eventos de señalización del receptor. Estas aplicaciones tienen gran utilidad, incluyendo el uso en ensayos de `screening' dirigidos a receptores o recogiendo balsas (rafts) celulares de la superficie de una célula para inducir la activación, como la inducción de la apoptosis ligando moléculas Fas o similares en una célula tumoral.

En un ejemplo de esos ensayos de `screening' se podría utilizar células portadoras de receptores acoplados a proteínas G y ponerlas en contacto con agentes que se unan a ellos, quedando unidos estos agentes a una superficie que permite la concentración inducida por fuerza. En consecuencia, a medida que los receptores se reúnen en forma de balsas, el evento de transducción de señal sería amplificado. Esta circunstancia podría ser importante en el estudio de eventos de transducción de señal que tienen un nivel muy bajo en los experimentos típicos y cribar compuestos de medicamentos para inhibir o de alguna forma modificar esos eventos de transducción de señal.

A. Estimulación de una población celular

Los métodos de la presente invención están relacionados con la estimulación de una población de células T introduciendo un ligando o agente que se una a una fracción molecular, lo que induce un evento celular. El enlace del ligando o agente con la célula puede desencadenar un camino de señalización que activa cambios específicos de fenotipo o biológicos en la célula. La activación de la célula puede mejorar las funciones celulares normales o iniciar funciones de célula normal en una célula anormal. El método aquí descrito facilita la estimulación forzando la concentración de las células con el ligando o agente que liga una fracción de superficie celular. Se puede mejorar la estimulación de la célula o se puede estimular un evento celular específico introduciendo un segundo agente o ligando que ligue una segunda fracción de superficie celular. Este método se puede aplicar a cualquier célula para la que la ligación de una fracción de superficie celular conduzca a un evento de señalización. La invención proporciona también medios para seleccionar o cultivar las células estimuladas. La invención descrita es la estimulación de células T, pero una persona que los conocimientos habituales en la técnica apreciará rápidamente que el método se puede aplicar a otros tipos de célula. Como ejemplo, los tipos de célula que se pueden estimular y seleccionar incluyen fibroblastos, neuroblastos, células madre hematopoiéticas y células progenitoras de la hematopoyesis (células CD34^{+}), células madre mesenquimales, células dendríticas, células T citolíticas (células CD8^{+}), otras poblaciones de leucocitos, células madre pluripotentes, células madre multipotentes, células isleta, etc. En consecuencia, la presente revelación facilita también poblaciones de células resultantes de esta metodología, así como poblaciones celulares con características fenotípicas distintivas, incluyendo células T con características fenotípicas específicas.

Como se ha indicado anteriormente, en el contexto de la presente revelación se pueden utilizar diversos tipos de célula. Por ejemplo, se pueden utilizar tipos de célula como células B, células T, células NK, otras células de la sangre, células neuronales, células glandulares (endocrinas), células de formación de huesos (osteoclastos, etc.), células germinales (p.ej., oocitos), células epiteliales que recubren órganos reproductores y otros. Las parejas fracción de superficie celular-ligando podrían incluir (pero no exclusivamente): receptores de antígeno de células T (TCR) y mAb anti-CD3, TCR y Complejo Principal de Histocompatibilidad (MHC)+antígeno, TCR y superantígenos (p.ej., enterotoxina estafilocócica B (SEB), toxina del síndrome de shock tóxico (TSST), etc., receptores de antígeno de células B (BCR) y anti-Ig, BCR y LPS, BCR y antígenos específicos (univalentes o polivalentes), y anticuerpos de receptor NK y de receptor anti-NK, receptores FAS (CD95) y ligandos FAS, receptores FAS y anticuerpos anti-FAS, anticuerpos CD54 y anti-CD54, anticuerpos CD2 y anti-CD2, CD2 y LFA-3 (antígeno 3 asociado a la función de los linfocitos), receptores de citocina y sus respectivos anticuerpos de receptores de citocina y de receptores anti-citocina, miembros de la familia TNF-R (receptor del factor de necrosis tumoral) y anticuerpos dirigidos contra ellos, miembros de la familia TNF-R y sus respectivos ligandos, receptores de adhesión/guiado o `homing' y sus ligandos, receptores de adhesión/`homing' y anticuerpos contra ellos, receptores de oocitos u oocitos fertilizados y sus ligandos, receptores de oocitos u oocitos fertilizados y anticuerpos contra ellos, receptores del recubrimiento endometrial del útero y sus ligandos, receptores de hormonas y sus hormonas respectivas, receptores de hormonas y anticuerpos dirigidos contra ellos y otros.

La naturaleza del enlace de un receptor por un ligando resultará en la multimerización de los receptores o en la agregación/orientación de los receptores, de forma que la señalización o respuesta celular se acelera, mejora o se modifica para conferir un beneficio particular, como división celular, secreción de citocinas, migración celular, mayor interacción célula-célula, etc.

A continuación se facilitan dos ejemplos que ilustran cómo podrían tener beneficios prácticos esa multimerización, agregación o reorientación controlada de fracciones de superficie celular.

En un ejemplo, la activación normal de las células T por antígenos o células presentadoras de antígeno resulta habitualmente en la agregación de balsas de TCR, en la reorganización del citoesqueleto, en la polarización de las señales de "activación" y en la división celular, por ejemplo. Utilizando enfoques desarrollados por el hombre, como los que aquí se describen, en ausencia de activación "normal" de células T in-vivo, se podría acelerar, mejorar o influir en las funciones antes descritas, en particular mediante la ligación acelerada, controlada y orientada espacialmente de TCR y CD28. Los beneficios podrían ser una mejor expansión celular in vitro que resultaría en un número más alto de células susceptibles de infusión y más robustas para aplicaciones terapéuticas. Otros beneficios podrían ser una mejor "agregación" del receptor para células con defectos, como una densidad TCR inferior a la normal en la superficie de la célula. De forma similar, las aplicaciones in vivo podrían ser beneficiosas cuando se deban activar poblaciones de células T, como células T específicas de tumores en determinados sitios de tumor. Una mejor orientación y agregación del receptor podría proporcionar una señal de activación de otra forma difícil de obtener para células T tolerizadas funcionalmente. Además, esa activación se podría utilizar en el contexto de células T de antígeno específico. A este respecto, las células T de un tumor se podrían aislar y expandir y ser administradas por infusión al paciente. De forma similar, las células T expuestas a un antígeno bien in vivo o in vitro se podrían expandir con las metodologías presentes.

En otro ejemplo, a través del camino FAS se produce una mejor inducción de muerte celular. La capacidad para acelerar la multimerización de FAS, de FAS "activados" con orientación espacial en superficies de células diana o promover una ligación de FAS acumulativa que no se podría conseguir de otra forma, podrían facilitar importantes beneficios in vivo, en particular, para el tratamiento del cáncer, respuestas autoinmunes o enfermedad injerto contra huésped. Por ejemplo, una célula tumoral puede expresar bajos niveles de FAS in vivo, y el huésped puede expresar bajos niveles de FAS-L en sitios de tumor (debido a citocinas supresivas, etc.). Debido a esos bajos niveles no se puede generar una señal FAS adecuada, lo que permite la supervivencia y crecimiento del tumor. Una posible forma de superar esta deficiencia FAS/ligando-FAS podría ser dirigirse a tumores/sitios de tumor con ligandos monovalentes o multivalentes para FAS (FAS-L, anticuerpos, etc.) unidos a partículas paramagnéticas. La aplicación de un campo magnético potente utilizando la presente en sitios de tumor (p.ej., melanomas, sarcomas de Kaposi, carcinomas de cuello de células escamosas, etc.) podría proporcionar la orientación espacial de las partículas paramagnéticas en sitios de tumor como FAS unida a partículas unidas en células tumorales, adaptadas para la activación del receptor o la activación y expansión de las células T. Una mayor agregación FAS acompañada de la polarización de señal podría proporcionar la señal adecuada para inducir ahora la muerte celular en las células tumorales.

En una realización particular de la invención, una población de células T puede ser estimulada mediante concentración y ligación simultáneas de las superficies de las células T. En un aspecto de la presente invención, en una superficie se coinmovilizan anticuerpos de CD3 y CD28. Una superficie preferente para esa inmovilización incluye partículas, y en ciertos aspectos, perlas, como perlas paramagnéticas. En otro aspecto de la presente invención, cualquier ligando que una el complejo TCR/CD3 e inicie una señal de estimulación primaria se puede utilizar como agente primario de activación en la superficie. Cualquier ligando que se enlace con CD28 e inicie el camino de transducción de señal de CD28, lo que provoca la coestimulación de la célula con un ligando CD3 y potencia la activación de una población de células T, es un ligando CD28 y en consecuencia, es un agente coestimulador en el contexto de la presente invención. En otro aspecto de la invención, se aplica una fuerza a la mezcla de células T y superficies revestidas de anti-CD3 y anti-CD28 para concentrar las células T, llevando así al máximo la ligación de la superficie de la célula T. Aunque en una realización particular la fuerza de concentración es fuerza magnética aplicada donde las superficies revestidas de anti-CD3 y anti-CD28 son perlas paramagnéticas, en la técnica hay disponibles otros medios para reunir las células y los ligandos de una forma concentrada. Esos métodos de estimular la población de células T proporciona un importante contacto perla-célula o célula-célula que induce de forma sorprendente una mayor activación o proliferación de las células T. Además, los métodos de la inventiva alteran el perfil del marcador de la superficie celular en la que las células T activadas expresan marcadores de superficie celular que indican un producto final menos variable y un fenotipo más normal en comparación con el perfil de las células T cuando fueron aisladas inicialmente de un sujeto con una enfermedad.

1. La Señal Primaria

A continuación se exponen brevemente los eventos bioquímicos responsables de la estimulación ex vivo de las células T. La interacción entre el complejo TCR/CD3 y el antígeno presentado, en conjunción con las moléculas MHC clase I o clase II en una célula presentadora de antígeno, inicia una serie de eventos bioquímicos denominados "activación de células T de antígeno específico". En consecuencia, se puede conseguir la activación de las células T estimulando el complejo TCR/CD3 de la célula T o estimulando la proteína de superficie CD2. Para activar una población de células T vía complejo TCR/CD3 se puede utilizar un anticuerpo monoclonal anti-CD3. En el mercado hay disponibles distintos anticuerpos monoclonales CD3 anti-humano; ejemplos son OKT3, preparados a partir de células hibridomas obtenidas de la Colección Americana de Cultivos Tipo, y anticuerpo monoclonal G19-4. También se conocen y están disponibles formas estimuladoras de anticuerpos anti-CD2. La estimulación mediante CD2 con anticuerpos anti-CD2 se consigue típicamente utilizando una combinación de, como mínimo, dos anticuerpos anti-CD2 distintos. Se han descrito combinaciones estimuladoras de anticuerpos anti-CD2, incluidas las siguientes: el anticuerpo T11.3 en combinación con el anticuerpo T11.1 o T11.2 (Meuer et al., Cell 36:897-906,1984), y el anticuerpo 9.6 (que reconoce el mismo epitopo que T11.1) en combinación con el anticuerpo 9.1 (Yang et al., J. Immunol. 137:1097-1100, 1986). También se pueden utilizar otros anticuerpos que se unen a los mismos epítopos que cualquiera de los anticuerpos descritos anteriormente. Se pueden identificar y preparar anticuerpos adicionales, o combinaciones de anticuerpos, mediante técnicas estándares.

También se puede enviar una señal primaria de activación a una célula T a través de otros mecanismos. Por ejemplo, una combinación que se puede usar incluye un activador de proteína quinasa C (PKC), como un éster de forbol (p.ej., forbol miristato acetato) y un ionóforo de calcio (p.ej., ionomicina, que eleva las concentraciones de calcio citoplásmico) o similares. El uso de esos agentes evita el complejo TCR/CD3, pero envía una señal estimuladora a las células T. Otros agentes que actúan como señales primarias pueden incluir ligandos naturales y sintéticos. Un ligando natural puede incluir MHC con o sin un péptido presentado. Otros ligandos pueden incluir, pero no quedando limitados a, un péptido, polipéptido, factor de crecimiento, citocina, quimoquina, glicopéptido, receptor soluble, esteroide, hormona, mitógeno (como PHA) u otros superantígenos. En el contexto de la presente invención, el uso de la concentración y estimulación puede resultar en tal alta polarización del receptor que no se necesite ninguna señal secundaria para inducir la proliferación de células T.

En otras realizaciones, cualquier evento de transducción de señal puede ser amplificado o analizado utilizando la presente invención. Por ejemplo, los receptores acoplados a proteínas G pueden ser estimulados y medidos utilizando los métodos de concentración de la presente invención.

2. La Señal Secundaria

Aunque parece ser necesaria la estimulación del complejo TCR/CD3 o de la molécula CD2 para proporcionar una señal primaria de activación en una célula T, un cierto número de moléculas de la superficie de las células T, denominadas moléculas accesorias o coestimuladoras, han sido implicadas en la regulación de la transición de una célula T en reposo a una transformación explosiva y posterior proliferación y diferenciación. Así, además de la señal primaria de activación, la inducción de respuestas de las células T necesita una segunda señal coestimuladora. Una de esas moléculas coestimuladoras o accesorias, CD28, se cree que inicia o regula un camino de transducción de señal que es distinta a cualquiera otra estimulada por el complejo TCR.

Por lo tanto, para mejorar la activación y proliferación de una población de células T en ausencia de factores de crecimiento exógenos o de células accesorias, una molécula accesoria de la superficie de la célula T, como CD28, se estimula con un ligando que une la molécula accesoria. En una realización, la estimulación de la molécula accesoria CD28 y la activación de la célula T se producen simultáneamente poniendo en contacto una población de células T con una superficie a la que están adheridos un ligando que une CD3 y un ligando que une CD28. Por ejemplo, la activación de las células T con un anticuerpo anti-CD3 y la estimulación de la molécula accesoria CD28 resulta en la proliferación selectiva de células T CD4^{+}.

En consecuencia, una persona con conocimientos normales en la técnica reconocerá que para estimular células T se puede utilizar cualquier agente, incluyendo un anticuerpo anti-CD28 o un fragmento del mismo capaz de realizar el entrecruzamiento de la molécula CD28, o un ligando natural para CD28. Ejemplos de anticuerpos anti-CD28 o fragmentos del mismo útiles en el contexto de la presente invención son: anticuerpo monoclonal 9.3 (IgG2_{a}) (Bristol-Myers Squibb, Princeton, NJ), anticuerpo monoclonal KOLT-2 (IgG1) 15E8 (IgG1), 248.23.2 (IgM) y EX5.3D10 (IgG2_{a}) (ATCC HB11373). Ejemplos de ligandos naturales son familia de proteínas B7, como B7-1 (CD80) y B7-2 (CD86) (Freedman et al., J. Immunol. 137:3260-3267, 1987; Freeman et al., J. Immunol. 143:2714-2722, 1989; Freeman et al., J. Exp. Med. 174:625-631, 1991; Freeman et al., Science 262:909-911, 1993; Azumaetal., Nature 366:76-79,1993; Freeman et al., J. Exp. Med 178:2185-2192, 1993). Además, de acuerdo con la presente invención, también se pueden utilizar homólogos de unión de un ligando natural, sea nativo o sintetizado mediante técnicas químicas o de recombinación. Otros agentes que actúan como señales secundarias pueden incluir ligandos naturales y sintéticos. Los agentes pueden incluir, pero no quedando limitados a, otros anticuerpos o fragmentos de ellos, un péptido, polipéptido, factor de crecimiento, citocina, quimoquina, glicopéptido, receptor soluble, esteroide, hormona, mitógeno, como PHA u otros superantígenos.

En una realización adicional de la revelación, la activación de una población de células T se puede mejorar mediante coestimulación de otras proteínas integrales de membrana de células T. Por ejemplo, unir la integrina LFA-1 de células T a su ligando natural, ICAM-1, puede mejorar la activación de las células. Otra molécula de superficie celular que puede actuar de elemento coestimulador de células T es VCAM-1 (CD106) que une el antígeno muy tardío-4 (VIA-4) de las células T.

Una persona diestra en la técnica apreciará que se pueden estimular otras células además de las células T uniendo un agente que ligue una fracción de superficie celular e induzca la agregación de la fracción, lo que resulta en la activación de un camino de señalización. Otras de esas fracciones de superficie celular incluyen, pero no quedan limitadas a, folato receptor anclado a GPI (CD59), receptor IgE humana (receptor Fc\varepsilonRi), BCR, receptor EGF, receptor de insulina, receptor de efrina 31, neurotrofina, factor neutrófico derivado de células gliales (GNDF), proteínas erizo y otras proteínas vinculadas al colesterol y palmitoilatadas, H-Ras, integrinas, sintasa endotelial de óxido nítrico (eNOS), FAS, miembros de la familia del receptor TNF, proteínas ancladas a GPI, proteínas doblemente aciladas, como las quinasas de la familia Src, la alfa-subunidad de proteínas G heterotriméricas y proteínas del citoesqueleto.

B. Expansión de una población de células T

En un aspecto de la presente revelación, la expansión ex vivo de células T se puede realizar mediante aislamiento de las células y posterior estimulación. En una realización de la invención, las células T pueden ser estimuladas por un solo agente. En otra realización, las células T son estimuladas con dos agentes: uno que induce una señal primaria y un segundo que es una señal coestimuladora. Los ligandos útiles para estimular una sola señal o estimular una señal primaria y una molécula accesoria que estimula una segunda señal se pueden utilizar en forma soluble, adheridos a la superficie de una célula o inmovilizados en una superficie como aquí se describe. Un ligando o un agente adherido a una superficie sirve como célula presentadora de antígeno (APC) "suplente". En una realización preferente, los agentes primario y secundario son coinmovilizados en una superficie. En una realización, la molécula que proporciona la señal primaria de activación (como un ligando CD3) y la molécula coestimuladora (como un ligando CD28) están acoplados a la misma superficie, por ejemplo, a una partícula. Además, como se ha indicado anteriormente, en las mismas u otras superficies se pueden utilizar una, dos o más moléculas estimuladoras.

Antes de la expansión se obtiene una fuente de células T de un sujeto. El término "sujeto" pretende incluir organismos vivos en los que se pueda provocar una respuesta inmune (p.ej., mamíferos). Ejemplos de sujetos son humanos, perros, gatos, ratones, ratas y especies transgénicas de los mismos. Las células T se pueden obtener de muchas fuentes distintas, incluyendo células mononucleares de sangre periférica, médula ósea, tejido de nodo linfático, tejido del bazo y tumores. Preferiblemente, las células de la sangre circulatoria de un individuo se obtienen mediante aféresis o leucaféresis. El producto de la aféresis contiene normalmente linfocitos (incluidas células T), monocitos, granulocitos, células B, otros glóbulos blancos nucleados, glóbulos rojos y plaquetas. En una realización, se pueden lavar las células recogidas mediante aféresis para eliminar la fracción de plasma y colocarlas en un tampón o medio apropiado para los siguientes pasos del proceso. En una realización de la invención, las células se lavan con solución salina de tampón fosfato (PBS). En una realización alternativa, la solución de lavado no tiene calcio y puede no tener magnesio o puede no tener muchos de, si no todos, los cationes divalentes. De nuevo y de forma sorprendente, los pasos inicial de activación en ausencia de calcio conducen a una mayor activación. Como las personas con conocimientos normales en la técnica apreciarían rápidamente, un paso de lavado se puede realizar mediante métodos conocidos, como utilizando una centrifugadora semiautomatizada de "flujo continuo" (por ejemplo, el procesador celular Cobe 2991, Baxter) siguiendo las instrucciones del fabricante. Después del lavado, las células se pueden resuspender en diversos tampones biocompatibles, como por ejemplo, PBS sin Ca ni Mg. De forma alternativa, los componentes no deseables de la muestra de la aféresis se pueden eliminar y resuspender directamente las células en el medio de cultivo.

En otra realización, las células T se aíslan de linfocitos de sangre periférica realizando la lisis de los glóbulos rojos y disminuyendo los monocitos, por ejemplo, mediante centrifugación a través de un gradiente de PERCOLL^{TM}. Se puede aislar además una subpoblación específica de células T, como CD28^{+}, CD4^{+}, CD8^{+}, CD45RA^{+} y CD45R0^{+} mediante técnicas de selección positiva o negativa. Por ejemplo, el enriquecimiento de una población de células T mediante selección negativa se puede conseguir con una combinación de anticuerpos dirigidos a los marcadores de superficie exclusivos para las células seleccionadas negativamente. Un método preferente es la clasificación o selección de células vía inmunoadherencia magnética negativa o citometría de flujo que utilice un coctail de anticuerpos monoclonales dirigidos a los marcadores de superficie celular presentes en las células seleccionadas negativamente. Por ejemplo, para enriquecer para células CD4^{+} mediante selección negativa, un cóctel de anticuerpos monoclonales incluye típicamente anticuerpos para CD14, CD20, CD11b, CD16, HLA-DR y CD8.

En relación con la disminución de monocitos indicada anteriormente, las poblaciones de monocitos (es decir, células CD14^{+}) pueden ser disminuidas a partir de preparados sanguíneos antes de la expansión ex vivo mediante distintas metodologías, incluyendo columnas o perlas recubiertas de anti-CD14 o la utilización de la actividad fagocitótica de estas células para facilitar la eliminación. En consecuencia, en una realización, la invención utiliza partículas paramagnéticas de tamaño suficiente para ser tragadas por los monocitos fagocitóticos. En ciertas realizaciones, las partículas paramagnéticas son perlas disponibles comercialmente, por ejemplo, las producidas por Dynal AS bajo el nombre comercial Dynabeads^{TM}. Ejemplos de Dynabeads^{TM} a este respecto son M-280, M-450 y M-500. En un aspecto, otras células no específicas son eliminadas recubriendo las partículas paramagnéticas con proteínas "irrelevantes" (p.ej., proteínas en suero o anticuerpos). Anticuerpos y proteínas irrelevantes incluyen aquellas proteínas y anticuerpos o fragmentos de ellos que no se dirigen específicamente a las células T que se van a expandir. En determinadas realizaciones, las perlas irrelevantes incluyen perlas recubiertas con anticuerpos anti-ratón de oveja, anticuerpos anti-ratón de cabra y albúmina de suero humano.

En resumen, la disminución de monocitos se realiza mediante pre-incubación de sangre total sometida a gradiente de Ficol o sangre periférica sometida a aféresis con una o más variedades de partículas paramagnéticas irrelevantes o no acopladas a anticuerpo (aprox. 1 vial de perlas o 4x10^{9} perlas por lote de células, típicamente, de aproximadamente 5x10^{8} a aproximadamente 2x10^{10} células) durante aproximadamente de 30 minutos a 2 horas a una temperatura de 22 a 37 grados C, seguido de eliminación magnética de las células que se han adherido a las partículas paramagnéticas o han sido envueltas por éstas. Esa separación se puede realizar utilizando métodos estándares disponibles en la técnica. Por ejemplo, se puede utilizar cualquier metodología de separación magnética, incluyendo una variedad disponible comercialmente (p.ej., DYNAL® Magnetic Particle Concentrator, DYNAL MPC®)). El aseguramiento de la disminución requerida se puede supervisar con diversas metodologías conocidas para las personas diestras en la técnica, incluyendo análisis de citometría de flujo de células positivas CD14 antes y después de la mencionada disminución.

Otro método para preparar las células T para estimulación es congelarlas después del paso de lavado, operación que no requiere el paso de eliminación de monocitos. No queriendo limitarse a la teoría, la congelación y posterior paso de descongelación proporcionan un producto más uniforme al eliminar los granulocitos, y en cierta medida los monocitos, de la población celular. Después del paso de lavado que elimina el plasma y las plaquetas, las células pueden ser suspendidas en una solución de congelación. Aunque en la técnica se conocen muchas soluciones de congelación y parámetros que serán útiles en este contexto, otro método implica el uso de PBS que contenga 20% DMSO y 8% de albúmina de suero humana (u otro medio apropiado de congelación de células), siendo congeladas posteriormente las células hasta -80ºC a un ritmo de 1º por minuto y almacenadas en la fase de vapor de un depósito de almacenamiento de nitrógeno líquido.

La población celular se puede estimular de la forma aquí descrita, como mediante contacto con un anticuerpo anti-CD3 o un anticuerpo anti-CD2 inmovilizado en una superficie, o mediante contacto con un activador de la proteína quinasa C (p.ej., briostatina) en conjunción con un ionóforo de calcio Para la coestimulación de una molécula accesoria de la superficie de las células T se utiliza un ligando que une la molécula accesoria. Por ejemplo, para estimular la proliferación de células T se puede poner en contacto una población de células CD4^{+} con un anticuerpo anti-CD3 o un anticuerpo anti-CD28 en condiciones apropiadas. De forma similar, para estimular la proliferación de células T CD8+ se puede utilizar un anticuerpo anti-CD3 y el anticuerpo monoclonal ES5.2D8 (ATCC), así como otros métodos conocidos comúnmente en la técnica (Berg et al., Transplant Proc. 30(8):3975-3977, 1998; Haanen et al., J. Exp. Med. 190(9):1319-1328, 1999; Garland et al., J. Immunol Meth. 227(1-2):53-63, 1999).

La señal estimuladora primaria y la señal coestimuladora para las células T se puede proporcionar mediante distintos protocolos. Por ejemplo, los agentes que faciliten cada señal pueden estar en disolución o acoplados a una superficie. Cuando se acoplan a una superficie, los agentes se puede acoplar a la misma superficie (es decir, en formación "cis") o a superficies independientes (es decir, en formación "trans"). De manera alternativa, un agente se puede acoplar a una superficie y el otro agente estar en disolución. En una realización, el agente que proporciona la señal coestimuladora está unido a una superficie celular y el agente que da la señal primaria de activación está en disolución o acoplado a una superficie. En una realización preferente, los dos agentes son inmovilizados en perlas, bien en la misma perla, es decir, "cis" o en perlas independientes, es decir "trans". A modo de ejemplo, el agente que facilita la señal primaria de activación es un anticuerpo anti-CD3 y el agente que da la señal coestimuladora es un anticuerpo anti-CD28, y ambos agentes están coinmovilizados en la misma perla en cantidades moleculares equivalentes. En una realización se utiliza una relación 1:1 de cada anticuerpo unido a las perlas para expansión de células T CD4^{+} y crecimiento de células T. Sin embargo, para estimular células T u otras células diana se pueden utilizar relaciones partículas-células entre 1:500 y 500:1 y cualquier valor entero intermedio. Una persona con conocimientos normales en la técnica puede apreciar rápidamente que la relación partículas-células puede depender del tamaño de las partículas en relación con la célula diana. Por ejemplo, perlas de pequeño tamaño sólo podrían unir unas pocas células, mientras que perlas más grandes podrían unir muchas. En ciertas realizaciones, la relación células-partículas oscila entre 1:100 y 100:1 y cualquier valor entero intermedio, y en otras realizaciones, para estimular células T también se puede utilizar una relación entre 1:9 y 9:1 y cualquier valor entero intermedio. La relación entre perlas acopladas anti-CD3- y anti-CD28 y células T que provoca una estimulación de las células T puede variar como se ha indicado anteriormente; sin embargo, ciertos valores preferentes incluyen como mínimo 1:4, 1:3, 1:2, 2:1, 3:1, 4:1 hasta 6:1, siendo una relación preferente como mínimo 2:1 perlas por célula T.

Utilizando determinadas metodologías puede ser ventajoso mantener la estimulación a largo plazo de una población de células T después de la activación y estimulación inicial separando las células T del estímulo transcurrido un periodo aproximado de 12 a 14 días. El índice de proliferación de células T se supervisa periódicamente (p.ej., de forma diaria) mediante, por ejemplo, el examen del tamaño o la medición del volumen de las células T, como con un Contador Coulter. A este respecto, una célula T en reposo tiene un diámetro medio de 6,8 micrones aproximadamente, y a la activación y estimulación inicial en presencia del ligando de estimulación, el diámetro medio de la célula T aumentará hasta más de 12 micrones al 4º día y empezará a disminuir al 6º día aproximadamente. Cuando se reduce el diámetro medio de una célula T hasta aproximadamente 8 micrones, las células T pueden ser reactivadas y reestimuladas para inducir una proliferación adicional de las células T. Alternativamente, el índice de proliferación de células T y el tiempo de su re-estimulación se pueden supervisar realizando un ensayo para detectar la presencia de moléculas de superficie celular, como B7-1 y B7-2, que son inducidas en células T activadas.

Para inducir la estimulación a largo plazo de una población de células T CD4^{+} o CD8^{+} puede ser necesario reactivar y re-estimular las células con un agente estimulador (como un anticuerpo anti-CD3 o un anticuerpo anti-CD28 o el anticuerpo monoclonal ES5.2D8) varias veces para producir una población con mayor número de células CD4^{+} o CD8^{+} de entre aproximadamente 10 a aproximadamente 1.000 veces la población de células T original. Utilizando la presente metodología es posible alcanzar cifras de células T de entre aproximadamente 100 a aproximadamente 100.000 veces. Además, como se describe en el EJEMPLO XII, las células T expandidas con el método de la presente invención secretan altos niveles de citocinas (p.ej., IL-2, IFN-\gamma, IL-4, GM-CSF y TNF-\alpha) en los supernatantes del cultivo. Por ejemplo, en comparación con la estimulación con IL-2, las células T CD4^{+} expandidas utilizando coestimulación de anti-CD3 y anti-CD28 secretan altos niveles de GM-CSF y TNF-\alpha en el medio de cultivo. Estas citocinas se pueden purificar de los supernatantes del cultivo o se pueden utilizar éstos directamente para mantener células en cultivo. De forma similar, las células T expandidas con el método de la presente invención junto con los supernatantes del cultivo y las citocinas se pueden administrar para dar apoyo al crecimiento de células in vivo.

En una realización, la estimulación de células T se realiza con anticuerpos anti-CD3 y anti-CD28 coinmovilizados en perlas (3x28 perlas) durante un periodo de tiempo suficiente para que las células vuelvan al estado inactivo (baja proliferación o sin proliferación) (aproximadamente de 8 a 14 días después de la estimulación inicial). La señal de estimulación se elimina después de las células y éstas son lavadas y suministradas por infusión de nuevo al paciente. Las células, al finalizar la fase de estimulación, se han vuelto "super-inducibles" con los métodos de la presente invención, como demuestra su capacidad para responder a antígenos y la capacidad de estas células para demostrar un fenotipo similar al memoria, como se evidencia con los ejemplos. En consecuencia, cuando se realiza la re-estimulación, bien de forma exógena o mediante un antígeno in vivo tras la infusión, las células T activadas demuestran una sólida respuesta caracterizada por propiedades fenotípicas exclusivas, como la expresión de CD154 sostenida, mayor producción de citocina, etc.

En otras realizaciones de la presente invención, las células, como células T, son combinadas con perlas recubiertas de agente, siendo separadas después las perlas y las células y cultivadas posteriormente las células. En una realización alternativa, antes del cultivo, las perlas recubiertas de agente y las células no son separadas, sino cultivadas juntas. En una realización adicional, las perlas y las células son concentradas primero aplicando una fuerza, lo que resulta en la ligación de la fracción de superficie celular, induciendo así la estimulación celular.

A modo de ejemplo, cuando la población de células diana son células T, las fracciones de superficie celular se pueden ligar permitiendo que perlas paramagnéticas que tengan adheridos anti-CD3 y anti-CD28 (perlas CD3xCD28) entren en contacto con las células T preparadas. En una realización, las células (por ejemplo, 10^{4} a 10^{9} por ml de células T) y las perlas (por ejemplo, 1,5 x 10^{9} perlas paramagnéticas CD3xCD28) se combinan en un tampón, preferiblemente PBS (sin cationes divalentes como calcio y magnesio). De nuevo, las personas diestras en la técnica pueden apreciar fácilmente que se puede utilizar cualquier concentración celular. Por ejemplo, la célula diana puede ser muy rara en la muestra y significar sólo el 0,01% de la muestra, o toda la muestra (es decir, el 100%) puede incluir la célula diana de interés. Por lo tanto, la presente invención contempla cualquier número de células.

El tampón en el que están suspendidas las células puede ser cualquiera que sea apropiado para el tipo específico de célula. Cuando se utilizan ciertos tipos de célula, el tampón puede contener otros componentes, p.ej., 1-5% suero, necesarios para mantener la integridad de la célula durante el proceso. En otra realización, las células y las perlas se pueden combinar en el medio de cultivo celular. Las células y perlas se pueden mezclar, por ejemplo, mediante giro, agitación o cualquier medio de mezclado, durante un periodo de tiempo que oscila entre un minuto y varias horas. El contenedor de perlas y células es concentrado después mediante una fuerza, como al colocarlo en un campo magnético. Se retira el medio y las células no unidas, se lavan las células adheridas a las perlas (por ejemplo, mediante bombeo con bomba peristáltica) y se resuspenden después en el medio apropiado para cultivo celular.

En una realización de la presente invención, la mezcla se puede cultivar durante varias horas (aprox. 3 h) hasta catorce días o cualquier valor horario entero intermedio. En una realización de la invención, las perlas y las células T se cultivan juntas durante ocho días aproximadamente. En otra realización, las perlas y las células T se cultivan juntas durante 2-3 días. Condiciones apropiadas para el cultivo de células T son un medio apropiado (p.ej., Minimal Essential Media o RPMI Media 1640 o X-vivo 15, (Bio Whittaker)) que puedan contener los factores necesarios para la proliferación y viabilidad, incluyendo suero (p.ej., suero fetal bovino o humano) o interleucina-2 (IL-2). Los antibióticos (p.ej., penicilina y estreptomicina) sólo se incluyen en cultivos experimentales, no en cultivos de células que se vayan a administrar por infusión a un sujeto. Las células diana son mantenidas en las condiciones necesarias para apoyar el crecimiento, por ejemplo, una apropiada temperatura (p.ej., 37ºC) y atmósfera (p.ej., aire más 5% CO_{2}).

Cuando se utiliza un campo magnético como fuerza de concentración, la potencia del campo magnético aplicada a las células antes del cultivo celular puede oscilar entre 200 y 12.000 gauss en la superficie magnética. La forma y tamaño del imán se pueden adaptar al tamaño y forma de las vasijas de mezclado o cultivo celular o a cualquier otro parámetro que facilite o aumente el contacto célula-célula y la concentración celular. La fuerza magnética se puede repartir colocando un material que actúe de amortiguador o separador entre el imán y las perlas paramagnéticas contenidas en la mezcla con células. Una fuerza magnética fuerte se considera generalmente que es como mínimo 7.500 gauss en la superficie, mientras que una fuerza débil se encuentra en el intervalo entre 2.000 y 2.500 gauss en la superficie. La fuerza magnética aproximada aplicada por un imán o una perla paramagnética depende del volumen de la perla y de la fuerza del campo magnético según la siguiente fórmula:

F_{mag} = (\upsilon) (\phi) (B) (dB/dx)

donde F_{mag} es la fuerza magnética, \upsilon es el volumen de la perla paramagnética, \phi es la susceptibilidad magnética de una perla paramagnética (valor que proporciona el fabricante), B es la fuerza del campo magnético y (dB/dx) es el gradiente de la fuerza del campo. Una persona diestra en la técnica apreciará que los factores de la derecha de la ecuación se pueden obtener o medir, lo que permite calcular la fuerza magnética aplicada.

Las células estimuladas mediante los métodos de la presente invención son activadas como se ha mostrado induciendo la transducción de señal, la expresión de los marcadores de superficie celular o la proliferación. Uno de esos marcadores apropiados para células T es CD154, que es una molécula inmunomoduladora importante cuya expresión es extremadamente beneficiosa para amplificar la respuesta inmune. CD154 interactúa con la molécula CD40 expresada en muchas células B, células dendríticas, monocitos y algunas células endoteliales. En consecuencia, este inesperado y sorprendente incremento en la expresión de CD154 es probable que lleve a composiciones de células T más eficaces. La estimulación de células CD3^{+} que aquí se describe facilita células T que expresan crecimientos de 1,1 a 20 veces los niveles de ciertos marcadores de superficie celular, como la expresión de CD154 a los días 1, 2, 3 o 4 después de la estimulación. (Véanse EJEMPLO 5, Tabla 2 y Figura 4). La expresión de otro marcador de superficie celular, CD25, también fue mayor en células T tras la concentración y estimulación que en células antes del cultivo o en células estimuladas por otros métodos. (Véase la Tabla 2).

Una persona diestra en la técnica apreciará que cualquier célula diana que se pueda estimular mediante ligación de la fracción de superficie celular se puede combinar con una superficie recubierta de agente, como perlas. Además, las superficies recubiertas de agente, como las perlas, se pueden separar de las células antes del cultivo, en cualquier momento en el transcurso de éste o a su finalización. Además, las superficies recubiertas de agente ligadas a las células diana se pueden separar de las células no enlazantes antes del cultivo o las otras células pueden permanecer también en cultivo. En una realización, antes del cultivo, las perlas recubiertas de agente y las células diana no son separadas, sino cultivadas juntas. En una realización adicional, las perlas y las células diana son concentradas aplicando una fuerza, lo que resulta en la ligación de la fracción de superficie celular, lo que induce la estimulación y posterior activación.

La presente invención también contempla otros medios para aumentar la concentración de las células T, por ejemplo, una fracción de célula T unida a una superficie recubierta con moléculas estimuladoras primaria y secundaria. Además de la aplicación de una fuerza magnética, se pueden aplicar otras fuerzas más grandes que la fuerza de la gravedad, por ejemplo, pero no quedando limitadas a, fuerza centrífuga, presión transmembrana y una fuerza hidráulica. La concentración también se puede lograr mediante filtrado.

Una persona diestra en la técnica apreciará rápidamente que el contacto entre las perlas recubiertas de agente y las células que se van a estimular se puede aumentar mediante concentración utilizando otras fuerzas. Por ello, será suficiente cualquier medio para concentrar células con ligandos que unan fracciones de superficie celular siempre que la concentración reúna células y agentes de forma que se supere la gravedad o la difusión.

Se debe entender que en diversas realizaciones, la superficie recubierta de agente puede ser una partícula, como una perla que se mezcle con las células y se concentre en un volumen pequeño en un campo magnético, arrastrando así todas las partículas y las células unidas a las partículas a una zona definida y concentrada. En ciertas realizaciones, la superficie recubierta de agente se puede reunir mediante fuerza en un periodo de entre unos segundos a cuatro horas desde el momento de quedar expuesta a las células diana. En otras realizaciones, el tiempo puede oscilar entre 1 minuto y 2 horas y todos los intervalos enteros intermedios. La aplicación de una fuerza a una población celular con células portadoras de receptor que se mezcle con una superficie a la que esté adherido como mínimo un ligando de superficie celular puede inducir la polarización del receptor celular, lo agrega las moléculas de la superficie celular. Esto significa que inducir polarización de la superficie celular puede mejorar la señalización dentro de la célula agregando moléculas de superficie celular que tengan balsas lipídicas. Esta agregación puede inducir un camino de señal, el cual puede provocar una regulación descendente o la supresión de un evento celular. De forma alternativa, la agregación de moléculas de la superficie celular puede llevar a una regulación ascendente o activación de un evento
celular.

Un evento celular puede incluir por ejemplo la transducción de señal mediada por receptor que induzca o suprima un camino particular (incluyendo un camino apoptótico), que induzca la fosforilación de proteínas o que estimule o suprima señales de crecimiento. En una realización, las células pueden ser linfocitos, en particular una célula T, y el ligando de superficie celular puede ser un anticuerpo anti-CD3 adherido a una superficie, por ejemplo, una partícula. La partícula puede ser una perla paramagnética y la fuerza aplicada una fuerza magnética. La aplicación de una fuerza magnética a una mezcla de los linfocitos y a la superficie recubierta de anti-CD3 de la perla paramagnética puede provocar que los receptores CD3 de la célula T se polaricen con más rapidez que en ausencia de una fuerza externa. Este método de estimular la célula T fomenta una activación más rápida de los caminos de la respuesta inmune de la célula T y la proliferación de células.

En otra realización, el tiempo de exposición a los agentes estimuladores, como perlas recubiertas de anti-CD3/anti-CD28 (es decir, CD3xCD28), se puede modificar o hacer a medida para obtener un fenotipo de célula T deseado. Se podría desear una población superior de células T colaboradoras (T_{H}), típicamente CD4^{+} en oposición a CD8^{+} citotóxicas, o de o células T supresoras (T_{C}), pues una expansión de células T_{H} podría mejorar o recuperar la capacidad de respuesta inmune global. Aunque muchas respuestas inmune específicas son mediadas por células T CD8^{+} específicas de antígeno (que pueden lisar o matar directamente células diana), la mayoría de respuestas inmune necesitan la ayuda de células T CD4^{+}, las cuales expresan importantes moléculas inmunorreguladoras, como GM-CSF, CD40L y IL-2 por ejemplo. Cuando se prefiera la ayuda mediada por CD4, un método como el que aquí se describe que preserve o mejore la relación CD4:CD8 podría ser un importante beneficio. Cifras más altas de células T CD4^{+} pueden aumentar la cantidad de CD40L expresado en células que se introduce en los pacientes, mejorando potencialmente la visibilidad de la célula diana (función APC mejorada). Se pueden observar efectos similares aumentando el número de células administradas por infusión que expresen GM-CSF o IL-2, los cuales son expresados principalmente por las células T CD4^{+}. De forma alternativa, en situaciones en que se necesite menos la ayuda de CD4 y se desee un mayor número de células T CD8^{+}, también se puede utilizar el enfoque XCELLERATE que aquí se describe, por ejemplo, pre-seleccionando células CD8^{+} antes de la estimulación o el cultivo. Esas situaciones se pueden presentar cuando se prefieran mayores niveles de IFN o una mayor citólisis de una célula diana.

Para efectuar el aislamiento de poblaciones de células T distintas se pueden variar o ejecutar por impulsos los tiempos de exposición a la fuerza de concentración. Por ejemplo, cuando esa fuerza es un imán, se puede variar la exposición a la fuerza del imán o del campo magnético o se pueden variar los tiempos de expansión para obtener el fenotipo específico de interés. La expresión de diversos marcadores fenotípicos cambia con el tiempo, por lo que se puede elegir un momento en particular para obtener una población específica de células T. En consecuencia, dependiendo del tipo de célula que se vaya a estimular, el tiempo de estimulación o de expansión puede ser cuatro semanas o menos, 2 semanas o menos, 10 días o menos u 8 días o menos (cuatro semanas o menos incluye todos los intervalos de tiempo entre 4 semanas hasta 1 día (24 horas)). En algunas realizaciones, la estimulación y expansión se pueden llevar a cabo durante 6 días o menos, 4 días o menos y 2 días o menos; y en otras realizaciones, durante tan solo 24 horas o menos, y preferiblemente, de 4 a 6 horas o menos (estos intervalos incluyen los valores enteros intermedios). Cuando se realiza la estimulación de células T durante periodos más cortos de tiempo, la población de células T puede no aumentar de número de forma tan drástica, pero la población facilitará células T activadas más robustas y sanas que pueden seguir proliferando in vivo y que se asemejan más al `pool' de células T efectoras naturales. Como la disponibilidad de ayuda de células T es a menudo el factor limitador de la respuesta de los anticuerpos a los antígenos de proteínas, la capacidad de expandir de forma selectiva o de administrar por infusión de forma selectiva una población de células T ricas en CD4^{+} a un sujeto es extremadamente beneficiosa. Otros beneficios de esas poblaciones enriquecidas son evidentes por el hecho de que las células T colaboradoras activadas que reconocen antígenos presentados por los linfocitos B generan dos tipos de estímulo (contacto físico y producción de citocina) que resultan en la proliferación y diferenciación de células B.

Las células T que han sido expuestas a distintos tiempos de estimulación pueden presentar características diferentes. Por ejemplo, los productos de células mononucleares de sangre periférica o de sangre normal tienen una población de células T colaboradoras (T_{H}, CD4^{+}) mayor que la población de células T citotóxicas o supresoras (T_{C} CD8^{+}). La expansión ex vivo de células T estimulando los receptores CD3 y CD28 produce una población de células T que antes de aproximadamente 8-9 días está compuesta principalmente de células T_{H}, mientras que transcurridos aproximadamente 8-9 días, la población de células T comprende una población cada vez más grande de células T_{C}. Por ello, dependiendo del propósito del tratamiento, administrar por infusión a un sujeto una población de células T compuesta principalmente de células T_{H} puede ser ventajoso. De forma similar, si se ha aislado un subgrupo de células T de antígeno específico, puede resultar beneficioso expandir este subgrupo a un grado superior.

Por otro lado, además de los marcadores CD4 y CD8, otros marcadores fenotípicos varían de forma significativa, pero en gran medida reproducible, en el transcurso del proceso de expansión celular. Así, esa reproducibilidad aporta la capacidad de hacer a medida un producto de célula T activada para fines específicos.

En uno de esos ejemplos, entre los marcadores fenotípicos importantes que varían con el tiempo de forma reproducible están el receptor de alta afinidad IL-2 (CD25), el ligando CD40 (CD154) y CD45RO (una molécula que por asociación preferencial con el TCR puede aumentar la sensibilidad de la unión del TCR al antígeno). Como una persona diestra en la técnica aprecia inmediatamente, esas moléculas son importantes por distintas razones. Por ejemplo, CD25 constituye una parte importante del bucle autocrino que permite una rápida división de las células T. Se ha demostrado que CD 154 juega un papel clave en estimular la maduración de las células dendríticas presentadoras de antígeno, en la activación de las células B para la producción de anticuerpos, en la regulación de la proliferación de células T_{H}, en la mejora de la diferenciación de las células T_{C}, en la regulación de las citocinas, en la secreción de las células T_{H} y de las células presentadoras de antígeno y en la estimulación de la expresión de ligandos coestimuladores, incluidos CD80, CD86 y CD154.

La producción de citocina alcanza el máximo en los primeros días del proceso de expansión ex vivo. En consecuencia, como se sabe que las citocinas son importantes para mediar la activación y funcionamiento de las células T, así como en la modulación de la respuesta inmune, esas citocinas son probablemente críticas para el desarrollo de un producto de células T terapéutico que sea capaz de ser sometido a reactivación entrando en contacto con un antígeno adicional. Citocinas de importancia a este respecto incluyen, pero no quedan limitadas a, IL-2, IL-4, TNF- y IFN-. Así, obteniendo una población de células T durante los primeros días de expansión y administrándoselas por infusión a un sujeto se puede producir un beneficio terapéutico en que se produzca in vivo una activación y expansión adicionales de las células T.

Además de las citocinas y los marcadores discutidos anteriormente, la expresión de las moléculas de adhesión que se sabe que son importantes para la mediación de la activación de células T y la modulación de la respuesta inmune también cambian drásticamente (pero de forma reproducible) en el transcurso del proceso de expansión ex vivo. Por ejemplo, CD62L es importante para guiar (`homing') las células T hacia tejidos linfoides y para trasladarlas a sitios de inflamación. En determinadas circunstancias de enfermedad y lesión, la presencia de células T activadas en esos sitios puede ser una desventaja. Como la regulación descendente de CD62L se produce poco después de la activación, las células T se podrían expandir durante periodos de tiempo más cortos. Por el contrario, periodos más largos de tiempo en cultivo generarían una población de células T con niveles más altos de CD62L, y así, una mayor capacidad para dirigir las células T activadas a estos sitios bajo otras condiciones preferentes. Otro ejemplo de un polipéptido cuya expresión varía con el tiempo es CD49d, una molécula de adhesión implicada en el traslado de linfocitos desde la sangre a los espacios de tejidos en sitios de inflamación. La unión del ligando CD49d a CD49d también permite que las células T reciban señales coestimuladoras de activación y proliferación mediante la unión por VCAM-1 o ligandos de fibronectina. La expresión de la molécula de adhesión CD54 (implicada en las interacciones célula T-APC y célula T-célula T, así como en el guiado hacia sitios de inflamación) también cambia en el transcurso de la expansión. En consecuencia, se podrían estimular células T durante periodos seleccionados de tiempo que coincidan con el perfil del marcador de interés y ser posteriormente recogidas y administradas por infusión. Así, las poblaciones de células T se podrían hacer a medida para expresar el marcador que se crea que proporciona los mayores beneficios terapéuticos para la indicación que se vaya a tratar.

En las distintas realizaciones, una persona diestra en la técnica entiende que la eliminación de la señal de estimulación de las células depende del tipo de superficie utilizada. Por ejemplo, si se utilizan perlas paramagnéticas, entonces la opción viable es la separación magnética. Las técnicas de separación vienen descritas en detalle en las instrucciones de los fabricantes de perlas paramagnéticas (por ejemplo, DYNAL Inc., Oslo, Noruega). Además, se puede utilizar el filtrado si la superficie es una perla lo suficientemente grande para ser separada de las células. Además, en el mercado hay disponibles diversos filtros de transfusión, incluidos filtros de 20 y 80 micrones (Baxter). Por ello, cuando las perlas sean más grandes que el tamaño de malla del filtro, ese filtrado resulta muy eficaz. En una realización relacionada, las perlas pueden pasar a través del filtro, pero las células pueden quedarse, lo que permite la separa-
ción.

Aunque los anticuerpos utilizados en los métodos que aquí se describen se pueden obtener con facilidad en proveedores públicos, como los ATCC, con técnicas estándares se pueden producir anticuerpos para moléculas accesorias de células T y el complejo CD3. En la técnica se conocen metodologías de generación de anticuerpos para uso en los métodos de la invención, las cuales aquí se describen en mayor detalle.

C. Inmovilización del ligando sobre una superficie

Como se ha indicado anteriormente, los métodos de la presente invención utilizan preferiblemente ligandos unidos a una superficie. La superficie puede ser cualquier superficie capaz de tener unido o integrado un ligando y que sea biocompatible, es decir, sustancialmente no tóxica para las células diana que se vayan a estimular. La superficie biocompatible puede ser biodegradable o no biodegradable. La superficie puede ser natural o sintética, y una superficie sintética puede ser un polímero. La superficie puede contener colágeno, proteínas purificadas, péptidos purificados, polisacáridos, glicosaminoglicanos o composiciones de matriz extracelular. Un polisacárido puede incluir por ejemplo celulosa, agarosa, dextrano, quitosán, ácido hialurónico o alginato. Otros polímeros pueden incluir poliésteres, poliéteres, polianhídridos, polialquilcianoacrilatos, poliacrilamidas, poliortoésteres, polifosfacenos, polivinilacetatos, copolímeros de bloque, polipropileno, politetrafluoroestileno (PTFE) o poliuretanos. El polímero puede ser ácido láctico o un copolímero. Un copolímero puede comprender ácido láctico y ácido glicólico (PLGA). Superficies no biodegradables pueden incluir polímeros, como poli(dimetilsiloxano) y poli(etileno-vinilo acetato). Superficies biocompatibles pueden incluir, por ejemplo, cristal (p.ej., biocristal), colágeno, metal, hidroxiapatita, aluminato, materiales biocerámicos, polímeros de ácido hialurónico, alginato, polímeros de éster acrílico, polímero de ácido láctico, polímero de ácido glicólico, polímero de ácido láctico/ácido glicólico, proteínas purificadas, péptidos purificados o composiciones de matriz extracelular. Otros polímeros con una superficie pueden incluir cristal, sílice, silicio, hidroxiapatita, hidrogeles, colágeno, acroleína, poliacrilamida, polipropileno, poliestireno, nilón, cualquier número de plásticos o polímeros orgánicos sintéticos o similares. La superficie puede tener una estructura biológica, como un liposoma. La superficie puede ser en forma de lípido, placa, bolsa, perla, fibra, malla o partícula. Una partícula puede incluir una partícula coloidal, una microesfera, una nanopartícula, una perla o similares. En las distintas realizaciones son útiles superficies disponibles comercialmente, como perlas u otras partículas (p.ej., Miltenyi Particles, Miltenyi Biotec, Alemania; Sepharose beads, Pharmacia Fine Chemicals, Suecia; DYNABEADS^{TM}, Dynal Inc., Nueva York; PURABEADS^{TM}, Prometic Biosciences).

Cuando se utilizan perlas, éstas pueden ser de cualquier tamaño que efectúe la estimulación de la célula diana. En una realización, las perlas son preferentemente de entre 5 nanometros a aproximadamente 500 \mum de tamaño. En consecuencia, la elección del tamaño de perla depende del uso específico que se vaya a dar a la perla. Por ejemplo, si se utiliza la perla para disminución de monocitos, se elige un tamaño pequeño para facilitar la ingestión de los monocitos (p.ej., 2,8 \mum y 4,5 \mum de diámetro o cualquier tamaño que pueda ser ingerido, como tamaños de nanometro); sin embargo, cuando se desea la separación de las perlas mediante filtrado, típicamente se usan tamaños de perla no inferiores a 50 \mum. Además, cuando se utilizan perlas paramagnéticas, el tamaño de las perlas oscila típicamente de aproximadamente 2,8 \mum a aproximadamente 500 \mum, y más preferiblemente, de aproximadamente 2,8 \mum a aproximadamente 50 \mum. Para finalizar, se puede optar por utilizar nanopartículas super-paramagnéticas que pueden tener un tamaño tan reducido como 10 nm. Por ello, como resulta evidente de lo anteriormente expuesto, se puede utilizar virtualmente cualquier tamaño de partícula.

Un agente puede ser adherido, acoplado a o integrado en una superficie por diversos métodos conocidos y disponibles en la técnica. El agente puede ser un ligando natural, un ligando de proteína o un ligando sintético. La adherencia puede ser covalente o no covalente, electrostática o hidrofóbica, y se puede lograr mediante distintos medios de adherencia, incluyendo por ejemplo química, mecánica, enzimática u otros medios mediante los cuales un ligando sea capaz de estimular las células. Por ejemplo, el anticuerpo para un ligando puede ser adherido primero a una superficie, o se puede adherir a la superficie avidina o estreptavidina para unirse a un ligando biotinilatado. El anticuerpo del ligando se puede adherir a la superficie vía un anticuerpo anti-idiotipo. Otro ejemplo incluye el uso de proteína A o proteína G (u otro anticuerpo no específico que una moléculas) adherida/o a superficies para unir un anticuerpo. De forma alternativa, el ligando puede ser adherido a la superficie por medios químicos, como el entrecruzamiento con la superficie, utilizando reactivos de entrecruzamiento disponibles comercialmente (Pierce, Rockford, IL) u otros medios. En ciertas realizaciones, los ligandos están unidos covalentemente a la superficie. En otra realización, se incuban DYNABEADS^{TM} tosil-activadas o DYNABEADS^{TM} con grupos reactivos de superficie epoxi con el ligando polipéptido de interés siguiendo las instrucciones del fabricante. En pocas palabras, estas condiciones implican habitualmente la incubación en un tampón fosfato con pH de 4 a 9.5 a temperaturas que oscilan entre 4 y 37
grados C.

En un aspecto, el agente, como ciertos ligandos, puede tener un origen singular o múltiples orígenes y pueden ser anticuerpos o fragmentos de ellos, mientras que en otro aspecto, cuando se utilizan células T, el ligando coestimulador es una molécula B7 (p.ej., B7-1 y B7-2). Estos ligandos se acoplan a la superficie mediante alguno de los distintos medios de adherencia expuestos anteriormente. La molécula B7 que se vaya a acoplar a la superficie puede ser aislada de una célula que exprese la molécula coestimuladora o se puede obtener utilizando la tecnología de ADN recombinante estándar y sistemas de expresiones que permitan la producción y aislamiento de la(s) molécula(s) coestimuladora(s) como aquí se describe. También se pueden utilizar fragmentos, mutantes o variantes de una molécula B7 que retengan la capacidad para activar una señal coestimuladora en células T cuando se acoplan a la superficie de una célula. Además, una persona diestra en la técnica reconocerá que también se puede inmovilizar en perlas o en superficies de vasijas de cultivo o en cualquier superficie cualquier ligando útil en la activación e inducción de la proliferación de un subgrupo de células T. Asimismo, aunque la unión covalente del ligando a la superficie sea una de las metodologías preferentes, también se puede utilizar la adsorción o captura por un segundo anticuerpo monoclonal. La cantidad de un ligando en particular adherido a una superficie se puede determinar fácilmente mediante análisis de citometría de flujo (FACS) si la superficie es de perlas, o se puede establecer mediante ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA) si la superficie es un plato de cultivo de tejidos, una malla, fibras, o bolsas por ejemplo.

En una realización específica, la forma estimuladora de una molécula B7 o un anticuerpo anti-CD28 o un fragmento del mismo se adhiere a la misma superficie de fase sólida que el agente que estimula el complejo TCR/CD3, como un anticuerpo anti-CD3. Además de los anticuerpos anti-CD3, se pueden utilizar otros anticuerpos que se unan a receptores que imiten señales de antígeno. Por ejemplo, las perlas u otras superficies se pueden recubrir con combinaciones de anticuerpos anti-CD2 y una molécula B7, y en particular, anticuerpos anti-CD3 y anticuerpos anti-CD28.

D. Agentes

Los agentes contemplados por la presente invención incluyen ligandos de proteína, ligandos naturales y cualquier ligando sintético. Agentes que se pueden unir a fracciones de superficie celular (y bajo determinadas condiciones, provocar ligación y agregación que conduzcan a una señalización) incluyen, pero no quedan limitados a, lectinas (por ejemplo, PHA, lectinas de lenteja, concanavalina A), anticuerpos, fragmentos de anticuerpos, péptidos, polipéptidos, glicopéptidos, receptores, ligandos de receptores de células B y de células T, componentes de matriz extracelular, esteroides, hormonas (por ejemplo, del crecimiento, corticoesteroides, prostaglandinas, tetrayodo tironina), fracciones bacterianas (como lipopolisacáridos), mitógenos, antígenos, superantígenos y sus derivados, factores de crecimiento, citocina, proteínas virales (por ejemplo, HIV gp-120), moléculas de adhesión (como selectina L, LFA-3, CD54, LFA-1), quimoquinas y moléculas pequeñas. Los agentes se pueden aislar de fuentes naturales, como células, productos hemoderivados y tejidos, o aislados de células propagadas in vitro, o se pueden preparar por recombinación u otros métodos conocidos para las personas diestras en la técnica.

En un aspecto de la presente invención, cuando se desea estimular células T, entre los agentes útiles se encuentran ligandos que sean capaces de unir el complejo CD3/TCR, CD2 o CD28 e iniciar la activación de la proliferación, respectivamente. Por lo tanto, el término ligando incluye aquellas proteínas que sean el ligando "natural" para la proteína de la superficie celular, como una molécula B7 para CD28, así como ligandos artificiales, como anticuerpos dirigidos a la proteína de la superficie celular. Esos anticuerpos y fragmentos de ellos se pueden producir de acuerdo con las técnicas convencionales, como métodos de hibridoma y ADN recombinante y técnicas de expresión de proteínas. Los anticuerpos y fragmentos útiles pueden derivarse de cualquier especie, incluyendo la humana, o se pueden formar como proteínas quiméricas, que emplean secuencias de más de una especie.

En la técnica son bien conocidos los métodos para generar anticuerpos, antisueros policlonales o anticuerpos monoclonales que sean específicos para un ligando. Los anticuerpos también se pueden producir como inmunoglobulinas (Ig) por ingeniería genética o fragmentos de Ig diseñados para tener las propiedades deseables. Por ejemplo y a modo de ilustración y no de limitación, los anticuerpos pueden incluir una IgG recombinante que sea una proteína quimérica de fusión que tenga como mínimo un dominio en la región variable (V) de una primera especie de mamífero, y como mínimo un dominio en la región constante de una segunda especie de mamífero distinta. Más habitualmente, un anticuerpo quimérico tiene secuencias de región variable murina y secuencias de región constante humana. Esa inmunoglobulina quimérica murina/humana puede ser "humanizada" injertando las regiones determinantes de complementaridad (CDR), las cuales confieren especificidad de unión para un antígeno, derivadas de un anticuerpo murina en regiones marco de la región V derivada de humano y regiones constantes derivadas de humano. Se pueden generar fragmentos de estas moléculas mediante digestión proteolítica, u opcionalmente, digestión proteolítica seguida de reducción suave de enlaces de disulfuros y proceso de alquilatado, o mediante técnicas de ingeniería genética recombinante.

Los anticuerpos se califican de "inmunoespecíficos" si se unen específicamente al ligando con una constante de afinidad (K_{a}) superior o igual a aproximadamente 10^{4} M^{-1}, preferiblemente mayor o igual a aproximadamente 10^{5} M^{-1}, más preferiblemente, superior o igual a 10^{6} M^{-1}, y de forma todavía más preferente, superior o igual a aproximadamente 10^{7} M^{-1}. La afinidad de socios o anticuerpos de unión se puede determinar fácilmente utilizando técnicas convencionales, por ejemplo las descritas por Scatchard et al. (Ann. N.Y. Atad. Sci. USA 51:660, 1949) o mediante resonancia de plasmón de superficie (BIAcore, Biosensor, Piscataway, NJ). Véase por ejemplo, Wolff et al., Cancer Res., 53:2560-2565, 1993).

Los anticuerpos se puede preparar generalmente con alguna de las diversas técnicas conocidas para las personas diestras en la técnica (véase por ejemplo, Harlowetal., Anticuerpos: Un manual de laboratorio, 1988, Cold Spring Harbor Laboratory). En una de esas técnicas, un animal es inmunizado con el ligando como antígeno para generar antisueros policlonales. Animales apropiados serían conejo, oveja, cabra, cerdo, ganado vacuno, y puede incluir especies de mamíferos más pequeñas, como ratón, rata y hamster.

Un inmunogen puede estar formado por células que expresen el ligando, polipéptidos ligando purificados parcialmente o variantes o fragmentos de ellos, o péptidos ligando. Los péptidos ligando se pueden generar mediante escisión proteolítica o se pueden sintetizar químicamente. Los péptidos para la inmunización se pueden seleccionar analizando la estructura primaria, secundaria o terciaria del ligando con métodos conocidos para las personas diestras en la técnica a fin de determinar las secuencias de aminoácidos que más probablemente generarán una respuesta antigénica en un animal huésped (véase por ejemplo, Novotny, Mol. Immunol. 28:201-207, 1991; Berzoksky, Science 229:932-40, 1985).

La preparación del inmunogen puede incluir acoplamiento covalente del polipéptido ligando, variantes o fragmentos de él o el péptido a otra proteína inmunogénica, como hemocianina KLH o seroalbúmina bovina. Además, el péptido, polipéptido o las células se pueden emulsionar en un adyuvante (véase Harlow et al., Anticuerpos: Un manual de laboratorio, 1988, Cold Spring Harbor Laboratory). En general, tras la primera inyección, los animales reciben una o más inmunizaciones de refuerzo según la programación preferible para la especie animal. La respuesta inmune se puede supervisar extrayendo periódicamente sangre del animal, separando el suero y analizándolo en un inmunoensayo (como un ensayo Ouchterlony) para evaluar el título específico del anticuerpo. Una vez determinado el título del anticuerpo, a los animales se les puede extraer sangre periódicamente para acumular el antisuero policlonal. Los anticuerpos policlonales que se unen específicamente al polipéptido o péptido ligando se pueden purificar después a partir de ese antisuero, por ejemplo, mediante cromatografía de afinidad utilizando proteína A o utilizando el polipéptito o péptido ligando acoplado a un soporte sólido apropiado.

Se pueden preparar anticuerpos monoclonales que unan específicamente polipéptidos ligando (o fragmentos o variantes de ellos) utilizando por ejemplo la técnica de Kohler y Milstein (Nature, 256:495-497, 1975; Eur. J. Immunol. 6:511-519, 1976) y las mejoras introducidas en ella. Se pueden generar hibridomas, que son líneas celulares eucarióticas inmortales, que produzcan anticuerpos que tengan la especificidad deseada para un polipéptido ligando o variante o fragmento de él. Un animal (por ejemplo, una rata, hamster o preferiblemente ratón) es inmunizado con el inmunogen ligando preparado como se ha descrito anteriormente. Las células linfoides, más comúnmente, células del bazo, obtenidas de un animal inmunizado se pueden inmortalizar mediante fusión con un socio de fusión de célula de mieloma sensibilizado a drogas, preferiblemente uno que sea singénico con el animal inmunizado. Las células del bazo y las células de mieloma se pueden combinar durante unos minutos con un agente de promoción de fusión de membrana, como glicol de polietileno o un detergente no iónico, y ser recubierto a baja densidad en un medio selectivo que dé apoyo al crecimiento de células hibridoma, pero no células de mieloma. Un medio preferente de selección es HAT (hipoxantina, aminopterina, timidina). Transcurrido suficiente tiempo, habitualmente entre 1 y 2 semanas, se observan colonias de células. Se aíslan colonias individuales, y se puede comprobar la actividad de unión de los anticuerpos producidos por las células al polipéptido ligando o variante o fragmento de él. Son preferibles hibridomas que produzcan anticuerpos con alta afinidad y especificidad para el antígeno ligando. La presente invención contempla hibridomas que producen anticuerpos monoclonales que se unen específicamente a un polipéptido ligando o variante o fragmento de él.

Los anticuerpos monoclonales se pueden aislar de los supernatantes de los cultivos de hibridoma. Un método alternativo para la producción de un anticuerpo monoclonal murina es inyectar las células hibridoma en la cavidad peritoneal de un ratón singénico. El ratón produce fluido ascitis que contiene el anticuerpo monoclonal. Los contaminantes se pueden eliminar del anticuerpo mediante técnicas convencionales, como cromatografía, filtrado de gel, precipitación o extracción.

Los anticuerpos monoclonales humanos se pueden generar con cualquier técnica. Los métodos incluyen, pero no quedan limitados a, transformación Epstein Barr Virus (EBV) de células de sangre periférica humana (véase la Patente U.S. n.º 4,464,456), inmunización in vitro de células B humanas (véase, p.ej., Boerner et al., J. Immunol. 147:86-95, 1991), fusión de células de bazo de ratón transgénico inmunizado que porte genes de inmoglobulina humana y fusión de células de bazo de ratón transgénico inmunizado que porte genes de inmoglobulina insertados mediante cromosoma artificial de levadura (YAC) (véase, p.ej., la Patente U.S. n.º 5,877,397; Bruggemann et al., Curr. Opin. Biotechnol. 8:455-58, 1997; Jakobovits et al., Ann. N. Y. Acad. Sci. 764: 525-35, 1995), o aislamiento a partir de librerías de fagos de región V de inmunoglobulina humana.

Se pueden generar anticuerpos quiméricos y anticuerpos humanizados para utilizar en la presente invención. Un anticuerpo quimérico tiene como mínimo un dominio de región constante derivado de una primera especie de mamífero, y un segundo dominio de región variable derivado de una segunda especie de mamífero distinta (véase por ejemplo, Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-55, 1984). De forma más habitual, un anticuerpo quimérico se puede construir clonando las secuencias de polinucleótidos que codifiquen como mínimo un dominio de región variable derivado de un anticuerpo monoclonal no-humano (como la región variable derivada de un anticuerpo murina o monoclonal de rata o de hamster) en un vector que contenga secuencias que codifiquen como mínimo una región constante humana. (Véase, p.ej. Shin et al., Methods Enzymol. 178:459-76, 1989; Walls et al., Nucleic Acids Res. 21:2921-29, 1993). La región constante humana elegida depende de las funciones de efector deseadas para el anticuerpo en particular. Otro método conocido en la técnica para generar anticuerpos quiméricos es la recombinación homóloga (patente U.S. n.º 5,482,856). Preferiblemente, los vectores serán transfectados en células eucarióticas para una expresión estable del anticuerpo quimérico.

Un anticuerpo quimérico no-humano/humano puede ser tratado adicionalmente con ingeniería genética para crear un anticuerpo "humanizado". Ese anticuerpo tiene varias regiones determinantes de complementariedad (CDR) derivadas de una inmoglobulina de una especie de mamífero no humano, como mínimo, una región marco variable humana, y como mínimo, una región constante de inmunoglobulina humana. La humanización puede producir un anticuerpo que tenga una menor afinidad de unión cuando se compara con el anticuerpo quimérico o el anticuerpo monoclonal no-humano. Las personas diestras en la técnica utilizarán por lo tanto una o más estrategias para diseñar anticuerpos humanizados.

En determinadas realizaciones puede ser preferible el uso de los fragmentos de unión a antígenos de los anticuerpos. Esos fragmentos incluyen fragmentos Fab o fragmentos F(ab')_{2}, que se pueden preparar mediante digestión proteolítica con papaína o pepsina respectivamente. Los fragmentos de unión al antígeno se pueden separar de los fragmentos Fc mediante cromatografía de afinidad, utilizando por ejemplo proteína A inmovilizada o polipéptidos ligando inmovilizados o una variante o fragmento de ellos. Un método alternativo para generar fragmentos Fab incluye reducción suave de fragmentos F(ab')_{2} seguida de alquilación (véase por ejemplo, Weir, Manual de Inmunología Experimental, 1986, Blackwell Scientific, Boston).

Las regiones variables de la cadena pesada y de la cadena ligera no-humanas, humanas o humanizadas de cualquiera de las moléculas Ig anteriormente descritas se pueden construir como fragmentos Fv (sFv) de cadena simple (anticuerpos de cadena simple). Véase, p.ej. Bird et al., Science 242:423-426, 1988; Huston et al., Proc. Natl. Atad. Sci. USA 85:5879-5883, 1988. Las proteínas de fusión multifuncional se pueden generar enlazando secuencias de polinucleótidos que codifiquen un sFv de trama entrante (`in-frame') con secuencias de polinucleótidos que codifiquen diversas proteínas efectoras. Estos métodos son conocidos en la técnica y se revelen, por ejemplo, en las patentes EP-B1-0318554, U.S. nº 5,132,405, U.S. nº 5,091,513 y U.S. nº 5,476,786.

Un método adicional para seleccionar anticuerpos que se unan específicamente a un polipéptido ligando o variante o fragmento de él es mediante visualización del fago (véase, p.ej., Winter et al., Annul. Rev. Immunol. 12:433-55, 1994; Burton et al., Adv. Immunol. 57:191-280, 1994). Se pueden crear librerías combinatorias de genes de la región variable de inmunoglobulina humana o murina en vectores fago que se puedan cribar para seleccionar fragmentos Ig (Fab, Fv, sFv o multímeros de ellos) que se unan específicamente a un polipéptido ligando o variante o fragmento de él (véase, p.ej., Patente U.S. nº 5,223,409; Huse et al., Science 246: 1275-81, 1989; Kang et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:4363-66, 1991; Hoogenboom et al.)., J. Molec. Biol. 227:381-388, 1992; Schlebusch et al., Hybridoma 16:47-52, 1997 y las referencias en este documentos citadas).

Poblaciones Celulares

Como se ha tratado anteriormente, la presente revelación tiene una gran aplicabilidad a cualquier tipo de célula que tenga una fracción de superficie celular que se desee ligar. A este respecto, muchos eventos de señalización celular se pueden mejorar con los métodos de la presente invención. Esas metodologías se pueden utilizar terapéuticamente en condiciones ex vivo para activar y estimular células para su infusión en un paciente, o se podrían utilizar in vivo para inducir eventos de señalización celular en una población de células diana. Sin embargo, como también se ha indicado anteriormente, el ejemplo prototipo que así se facilita está dirigido a células T, pero en absoluto queda limitado a éstas.

En relación con las células T, las poblaciones de estas células que resulten de las distintas metodologías de expansión que aquí se describen pueden tener diversas propiedades fenotípicas específicas dependiendo de las condiciones empleadas. Esas propiedades fenotípicas incluyen la expresión mejorada de CD25, CD154, IFN- y GM-CSF, así como la expresión alterada de CD137, CD134, CD62L y CD49d. La capacidad para controlar de manera diferencial la expresión de estas fracciones puede ser muy importante. Por ejemplo, niveles superiores de expresión superficial de CD154 en "células T a medida" mediante contacto con moléculas CD40 expresadas en células presentadoras de antígeno (como células dendríticas, monocitos e incluso células B leucémicas o linfomas) aumentará la presentación de antígeno y la función inmune. En la actualidad, varias empresas utilizan esas estrategias para ligar CD40 vía anticuerpos o CD40L recombinante. El enfoque que aquí se describe permite facilitar esta misma señal de una forma más fisiológica, p.ej., por la célula T. La capacidad para aumentar la secreción de IFN- personalizando el proceso de activación de células T (XCELLERATE) podría ayudar a fomentar la generación de respuestas inmune tipo TH1, importante para las respuestas anti-tumores y anti-virus. Al igual que CD154, una mayor expresión de GM-GSF puede servir para mejorar la función de las APC, especialmente mediante su efecto de promover la maduración de progenitoras APC en APC más competentes funcionalmente, como las células dendríticas. Modificar la expresión de CD137 y CD134 puede provocar que las células T tengan capacidad para resistir o ser susceptibles a señales apoptóticas. Controlar la expresión de los receptores de adhesión/`homing' (como CD62L o CD49d) puede determinar la capacidad de las células T para asentarse en órganos linfoides, sitios de infección o sitios de tumores.

Un aspecto adicional de la presente revelación proporciona una composición o una población de células T que ha sido disminuida de células CD8^{+} o CD4^{+} antes de la expansión. En una realización, las células CD8^{+} son disminuidas anticuerpos dirigidos al marcador CD8^{+}. Una persona con conocimientos normales en la técnica podría identificar fácilmente diversas metodologías específicas para disminuir muestra de células CD8^{+} o CD4^{+}, o por el contrario, enriquecer el contenido de células CD4^{+} o CD8^{+}. En relación con el enriquecimiento de células CD4^{+}, un aspecto de la presente invención se centra en la identificación de un perfil de la expresión de CD154 extremadamente robusto con la estimulación de las poblaciones de células T en las que se hayan disminuido las células T_{C} (CD8^{+}). Como se ha indicado anteriormente, CD154 es una importante molécula inmunomoduladora cuya expresión es extremadamente beneficiosa para amplificar la respuesta inmune. En consecuencia, un aumento en la expresión de CD154 es probable que lleve a composiciones de células T más eficaces.

Las propiedades fenotípicas de las poblaciones de células T de la presente revelación se pueden supervisar por distintos métodos, incluyendo métodos estándares de citometría de flujo y métodos ELISA conocidos por las personas diestras en la técnica.

Las personas con conocimientos normales en la técnica apreciarán rápidamente que las metodologías de estimulación celular que aquí se describen se pueden realizar en diversos entornos (es decir, contenedores). Por ejemplo, esos contenedores pueden ser matraces de cultivo, bolsas de cultivo o cualquier otro contenedor capaz de retener células, preferiblemente en un entorno estéril. En una realización de la presente invención, también es útil un biorreactor. Por ejemplo, varios fabricantes producen actualmente dispositivos que se pueden utilizar para cultivar células y se pueden utilizar en combinación con los métodos de la presente invención. Véase por ejemplo Celdyne Corp., Houston, TX; Unisyn Technologies, Hopkinton, MA; Synthecon, Inc. Houston, TX; Aastrom Biosciences, Inc. Ann Arbor, MI; Wave Biotech LLC, Bedminster, NJ. Además, las patentes que cubren esos biorreactores incluyen las patentes US nº: 6,096,532; 5,985,653; 5,888,807; 5,190,878, las cuales se incorporan al presente documento por referencia.

Métodos de Uso

Además de los métodos descritos anteriormente, las células estimuladas o activadas por los métodos que aquí se describen se pueden utilizar en distintos contextos. En relación con el ejemplo prototipo de células T, las metodologías aquí descritas se pueden utilizar para expandir selectivamente una población de células T CD28^{+}, CD4^{+}, CD8^{+}, CD45RA^{+} o CD45R0^{+} para su uso en el tratamiento de enfermedades infecciosas, cáncer e inmunoterapia. El resultado es que se puede producir una población de células T con un fenotipo exclusivo, que es policlonal con respecto a la reactividad del antígeno, pero básicamente homogénea en relación bien con CD4^{+} o con CD8^{+}. Además, el método permite la expansión de una población de células T en número suficiente para reconstituir la población de células CD4^{+} o CD8^{+} totales de un individuo (la población de linfocitos en una persona es aproximadamente 10^{1l}). La población de células T resultante también se puede transducir genéticamente y utilizar en inmunoterapia o se puede utilizar en métodos de análisis in vitro de agentes infecciosos. Por ejemplo, una población de linfocitos de infiltración en tumores se puede obtener a partir de un individuo afectado de cáncer y se pueden estimular las células T para que proliferen en número suficiente. La población de células T resultante se puede transducir genéticamente para que exprese el factor de necrosis tumoral (TNF) u otras proteínas y administrársela al individuo.

Un uso particular de las poblaciones de células T CD4^{+} de la revelación es el tratamiento de la infección VIH de un individuo. Una prolongada infección con VIH resulta eventualmente en un marcado declive del número de linfocitos T CD4^{+}. Esta disminución provoca por otro lado un profundo estado de inmunodeficiencia que hace susceptible al paciente a una serie de infecciones oportunistas que son una amenaza para la vida. Se puede esperar que la reposición del número de células T CD4^{+} a los niveles normales devuelva la función inmune a un grado significativo. Así, los métodos aquí descritos proporcionan un medio para expandir selectivamente células T CD4^{+} hasta el número suficiente para reconstituir esta población en un paciente infectado de VIH. También puede ser necesario evitar la infección de las células T durante la estimulación a largo plazo o puede ser deseable hacer que las células T sean resistente permanentemente a la infección VIH. Existen diferentes técnicas para hacer que las células T se hagan resistentes a la infección de VIH o incapaces de producir virus antes de devolver las células T al individuo infectado. Por ejemplo, se puede cultivar uno o más agentes anti-retrovirales con células T CD4^{+} antes de la expansión para inhibir la replicación del VIH o la producción viral (p.ej., fármacos dirigidos a la transcriptasa inversa u otros componentes de la maquinaria viral; véase por ejemplo, Chow et al. Nature 361:650-653, 1993).

Se pueden utilizar diversos métodos para transducir genéticamente células T para que produzcan moléculas que inhiban la infección VIH o la replicación. Por ejemplo, en diversas realizaciones, las células T se pueden transducir genéticamente para producir inhibidores transdominantes, "señuelos moleculares", moléculas antisentido o toxinas. Esas metodologías se describen con mayor detalle en las solicitudes de patente U.S. nº 08/253,751 y 08/253,964, y en la Publicación PCT nº WO 95/33823.

Los métodos para estimular y expandir una población de células T de antígeno específico son útiles en situaciones terapéuticas en las que sea deseable una regulación ascendente de una respuesta inmune (p.ej., inducir una respuesta o mejorar una respuesta existente) al administrar las células T a un sujeto. Por ejemplo, el método se puede utilizar para mejorar la respuesta de la célula T contra antígenos asociados a tumores. Las células tumorales de un sujeto expresan típicamente antígenos asociados a tumores, pero pueden no ser capaces de estimular una señal coestimuladora en células T (por ejemplo, porque adolecen de la expresión de moléculas coestimuladoras). Así, las células tumorales se pueden poner en contacto con células T de un sujeto in vitro y expandir las células T de antígeno específico según el método de la invención y devolver las células T al sujeto.

En concordancia, en una realización se pueden tratar tumores malignos como el Linfoma No Hodgkins (NHL) y la leucemia linfocítica crónica de células B (B-CLL). Aunque estudios iniciales que utilizaban células T expandidas se han ensayado en NHL (véase Liebowitz et al., Curr. Opin. Onc. 10:533-541, 1998), las poblaciones de células T de la presente revelación ofrecen características fenotípicas únicas que pueden mejorar drásticamente el éxito de la inmunoterapia proporcionando un mayor implante (probablemente facilitado por la estimulación de la señal CD28) y reactividad. No obstante, los pacientes con B-CLL presentan dificultades especiales, incluyendo un número relativamente bajo de células T con alta carga de células leucémicas en la sangre periférica, acompañado de una inmunosupresión general de células T. Las poblaciones de células T de la presente revelación puede proporcionar una eficacia altamente mejorada en el tratamiento de esta enfermedad, y especialmente cuando se combinan con terapia de transplante de células madre (CD34^{+}). En consecuencia, sería beneficioso un mayor funcionamiento de las células T y una mayor actividad de las células T anti-CLL con perlas coinmovilizadas de anti-CD3 x anti-CD28.

Por ejemplo, dado que la deficiente expresión de CD154 (el ligando para CD40) en las células T de pacientes B-CLL ha sido citado como un defecto inmunológico importante de la enfermedad; las poblaciones de células T de la presente revelación, las cuales pueden proporcionar altos niveles sostenidos de la expresión CD 154 a la re-infusión, podría ayudar en su tratamiento. Los investigadores informan que en CLL, la capacidad de las células T de un paciente para expresar CD 154 es defectuosa, así como la capacidad de las células B leucémicas para expresar CD80 y CD86. El fracaso de las células B leucémicas en CLL de expresar de forma adecuada los ligandos para CD28 podría resultar en no poder activar plenamente las células T de respuesta a tumores y por lo tanto, puede representar el mecanismo que subyace en el aparente estado de tolerancia de las células T. Los estudios en los que CD40 se acopla en células B CLL, bien vía anticuerpos anti-CD40 solubles o vía células B leucémicas con CD154 transducido, parece que corrigen el defecto en la expresión de CD80 y GD86 y se produce una regulación ascendente de la expresión de la superficie del MHC. Kato et al., J. Clin. Invest. 101:1133-114, 1998; Ranheim and Kipps, J. Exp. Med. 177:925-935, 1993. Las células tratadas de esta forma fueron capaces de estimular respuestas antitumorales específicas de las células T.

Con la expresión mejorada de CD154 en la superficie de la población de células T de la presente revelación se esperaría que esas células T interactuaran con células B-CLL autólogas, y así se aumentaría la inmunogenicidad de ese tumor aumentando la expresión de MHC, CD80 y CD86. Ello, a cambio, debe conducir a una potente respuesta antitumoral. Además, una persona con conocimientos normales en la técnica rápidamente comprenderá que el tratamiento de un paciente con las células T expandidas in vivo de la presente revelación se puede combinar con oncoterapias tradicionales, como la quimioterapia. A este respecto por ejemplo, un paciente puede ser tratado con un agente como fludarabina o campath, seguido de infusión con las poblaciones de células T de la presente invención o ambas.

De forma alternativa, las células T se pueden estimular y expandir como aquí se ha descrito para inducir o mejorar la capacidad de respuesta a agentes patógenos, como los virus (p.ej., virus de inmunodeficiencia humana), bacterias, parásitos y hongos.

La invención proporciona además métodos para expandir de forma selectiva una subpoblación específica de células. En particular, la revelación proporciona poblaciones enriquecidas específicamente de células T que tienen una relación mucho más alta de células T dobles positiva CD4^{+} y CD8^{+}.

Otra realización de la revelación proporciona un método para expandir de forma selectiva una población de células T_{H1} a partir de una población de células T CD4^{+}. En este método, las células CD4+ son coestimuladas con un anticuerpo anti-CD28, como el anticuerpo monoclonal 9.3, induciendo la secreción de citocinas específicas de T_{H1}, incluyendo IFN-\gamma, lo que resulta en el enriquecimiento de las células T_{H1} sobre las células T_{H2}.

La observación es que los rasgos fenotípicos de las células T activadas varían con el tiempo durante el proceso de expansión y el hecho de que se ha demostrado que las células T son activadas a las pocas horas (Lezzti et al., Immunity 8:89-95, 1998). En consecuencia, en combinación con las metodologías que aquí se describen, la presente ofrece la capacidad de expandir un subgrupo personalizado de una población de células T en un corto periodo de tiempo. En una realización, esta técnica se puede utilizar de forma hospitalaria, ambulatoria o domiciliaria, similar al uso de la diálisis de riñón. Por ejemplo, un método o dispositivo en el que se incuben células T en contacto con señales de activación (p.ej., anticuerpos anti-CD3 y anti-CD28 y similares) y sean devueltas inmediatamente al paciente en un flujo continuo o tras un periodo de expansión de unas pocas horas. En un aspecto, esas técnicas de expansión podrían ser cámaras aisladas con componentes de filtrado, como en las que se mezclan 3x28 perlas o micropartículas con un recubrimiento similar con un flujo continuo de sangre/células concentradas. En otra realización, las superficies sólidas del interior de un aparato pueden ser recubiertas o conjugadas directa (incluyendo covalentemente) o indirectamente (p.ej., estreptavidina/biotina y similares) con anticuerpos u otros componentes para estimular la activación y expansión de las células T. Por ejemplo, se puede utilizar una vía de flujo continuo desde el paciente a través de un dispositivo de recogida de sangre/células o un dispositivo desechable que contenga dos o más anticuerpos inmovilizados (p.ej., anti-CD3 y anti-CD28) u otros componentes para estimular los receptores necesarios para la activación de las células T antes de que las células vuelvan al sujeto (inmovilizadas en superficies plásticas o en micropartículas separables). Ese sistema podría implicar un instrumento de leucaféresis con un set desechable estéril acoplado al set desechable de los fabricantes actuales, o ser una adaptación del set desechable de los fabricantes (p.ej., la plataforma de la superficie sobre la que se inmovilizan/contienen los componentes anticuerpos/de activación está dentro de la bolsa/contenedor para la recogida de células mononucleares de sangre periférica durante la aféresis). Además, la superficie/plataforma de superficie sólida puede ser una parte de un inserto extraíble que se introduzca en una de las cámaras del dispositivo o puede estar presente físicamente en el interior de uno de los componentes desechables. En otra realización del aspecto de flujo continuo tratado anteriormente, el sistema puede incluir la puesta en contacto de las células con los componentes de activación a temperatura ambiente (o a una temperatura fisiológica) utilizando una cámara dentro de un dispositivo de recogida de sangre o una cámara de incubación montada en serie con la vía de flujo al paciente.

En otro ejemplo, se extrae sangre en un dispositivo desechable autónomo directamente desde el paciente que contiene dos o más anticuerpos inmovilizados (p.ej., anti-CD3 y anti-CD28) u otros componentes para estimular los receptores necesarios para la activación de las células T antes de que éstas sean administradas al paciente (p.ej., inmovilizadas en superficies plásticas o en micropartículas separables). En una realización, el dispositivo desechable puede tener un contenedor (p.ej., una bolsa de plástico o un matraz) con las conexiones apropiadas para combinar/acoplar a jeringas y dispositivos estériles de acoplamiento. Este dispositivo contendrá una superficie sólida para la inmovilización de los componentes de activación de las células T (p.ej., anticuerpos anti-CD3 y anti-CD28); pueden ser las propias superficies del contenedor o un inserto que será típicamente una superficie lisa, una superficie lisa grabada, una superficie irregular, una almohadilla porosa, fibra, fluido de hierro aceptable/seguro, perlas, etc. De forma adicional, cuando se utilice el dispositivo autónomo, el sujeto puede permanecer conectado al dispositivo o éste puede ser separable del paciente. Además, el dispositivo se puede utilizar a temperatura ambiente o se puede realizar la incubación a temperatura fisiológica utilizando una incubadora portátil.

Como son bien conocidos los dispositivos y métodos para la recogida y procesamiento de sangre y de productos sanguíneos, una persona diestra en la técnica reconocerá rápidamente que dadas las enseñanzas que aquí se facilitan, se pueden diseñar o modificar rápidamente diversos dispositivos que satisfagan las necesidades antes expuesta. En consecuencia, esos dispositivos y métodos no están limitados por las realizaciones específicas que aquí se exponen, pues incluirían cualquier dispositivo o metodología capaz de mantener la esterilidad y que mantenga sangre en forma de fluido, en el que la activación del complemento se reduzca y en el que los componentes necesarios para la activación de las células T (p.ej., anticuerpos anti-CD3 y anti-CD28 o ligandos de ellos) se puedan inmovilizar o separar de la sangre o producto sanguíneo antes de la administración al sujeto. Además, como las personas diestras en la técnica podrán apreciar fácilmente, en conjunción con los dispositivos y métodos que aquí se describen se pueden utilizar diversos productos sanguíneos. Por ejemplo, los métodos y dispositivos se podrían utilizar para proporcionar una rápida activación de células T a partir de sangre total crioconservada, células mononucleares de sangre periférica, otras células derivadas de sangre crioconservada o líneas de células T crioconservadas a la descongelación y antes de la administración al sujeto. En otro ejemplo, los métodos y dispositivos se pueden utilizar para reforzar la actividad del producto de células T expandido ex vivo previamente antes de la administración al sujeto, suministrando así un producto de células T altamente activado. Para finalizar, como se apreciará fácilmente, los métodos y dispositivos anteriores se pueden utilizar para terapias de células autólogas o alogénicas simultáneamente con el sujeto y el donante.

Los métodos de la presente invención también se pueden utilizar con vacunas para mejorar la reactividad del antígeno y aumentar el efecto in vivo. Además, dado que las células T expandidas mediante la presente invención tienen una vida media relativamente larga en el cuerpo, estas células podrían actuar como vehículos perfectos para terapia génica, portando una secuencia de ácido nucleico de interés y guiando potencialmente a sitios de cáncer, enfermedad o infección. En concordancia, las células expandidas mediante la presente invención se puede administrar a un paciente en combinación con una vacuna, una o más citocinas, uno o más anticuerpos terapéuticos, etc. Cualquier terapia que propicie una población de células T más robustas está dentro del contexto del método de uso aquí descrito.

Composiciones farmacéuticas

Las poblaciones de células diana, como las poblaciones de células T de la presente revelación, se pueden administrar en solitario o como composición farmacéutica en combinación con diluyentes o con otros componentes, como IL-2 u otras citocinas o poblaciones de células. En pocas palabras, las composiciones farmacéuticas de la presente revelación pueden comprender una población de células diana como la que aquí se describe, en combinación con uno o más portadores, diluyentes o excipientes aceptables farmacéutica y fisiológicamente. Esas composiciones pueden comprender tampones, como solución salina de tampón, solución salina de tampón fosfato y similares, carbohidratos como glucosa, mannosa, sucrosa o dextranos, manitol, proteínas, polipéptidos o aminoácidos como glicina, antioxidantes, agentes quelantes como EDTA o glutatione, adyuvantes (p.ej., hidróxido de aluminio) y conservantes. Las composiciones de la presente revelación se formulan preferentemente para administración intravenosa.

Las composiciones farmacéuticas de la presente revelación se pueden administrar de una forma apropiada para la enfermedad que se vaya a tratar (o prevenir). La cantidad y frecuencia de la administración vendrán determinadas por factores como el estado del paciente y el tipo y gravedad de la enfermedad, aunque las dosis apropiadas se pueden determinar con ensayos clínicos.

Además, todos los intervalos numéricos aquí utilizados incluyen explícitamente todos los valores enteros intermedios y se contempla la elección de valores numéricos específicos dentro del intervalo dependiendo del uso específico. Asimismo, los ejemplos siguientes se ofrecen a modo de ilustración y no como forma de limitación.

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Ejemplos

Ejemplo I

Estimulación de células T

En ciertos experimentos que aquí se describen se utilizó el proceso citado como XCELLERATE I^{TM}. En pocas palabras, en este proceso, las células T XCELLERATED (sometidas al proceso XCELLERATE) se fabrican a partir de productos de aféresis de células mononucleares de sangre periférica (PBMC). Después de su recogida en el paciente en sitios clínicos, la aféresis PBMC se lava y se incuba posteriormente con perlas DYNABEADS® M-450 Epoxy T "sin recubrimiento". Durante este tiempo, las células fagocíticas, como los monocitos, ingieren las perlas. Tras la incubación, las células y las perlas se procesan en un separador MaxSep Magnetic para retirar las perlas y cualquier célula monocítica/fagocítica adherida a ellas. Después del paso de disminución de monocitos, se toma un volumen que contenga un total de 5 x 10^{8} células T CD3^{+} y se ajusta con 1,5 x 10^{9} DYNABEADS® M-450 CD3/CD28 T para iniciar el proceso XCELLERATE^{TM} (aprox. 3:1 perlas-células T). La mezcla de células y DYNABEADS® M-450 CD3/CD28 T se incuba posteriormente a 37ºC, 5% CO_{2} durante 8 días aproximadamente para generar células T XCELLERATED para una primera infusión. Las restantes PBMC disminuidas de monocitos son crioconservadas hasta una segunda o adicional expansión del producto celular (21 días después aproximadamente), en cuyo momento son descongeladas y lavadas, y entonces se toma un volumen que contenga un total de 5 x 10^{8} células T CD3^{+} y se ajusta con 1,5 x 10^{9} DYNABEADS® M-450 CD3/CD28T para iniciar el proceso XCELLERATE para una segunda infusión. Durante el periodo de incubación de \approx8 días a 37ºC, 5% CO_{2}, las células T CD3^{+} se activan y expanden. El anti-CD3 mAb (OKT3) se obtiene en Ortho Biotech., (Raritan, NJ) y el anti-CD28 mAb (9.3) se obtiene en Bristol-Myers Squibb, (Stamford, Conn.).

Con un proceso modificado que se cita como XCELLERATE II^{TM}, el proceso anteriormente descrito se utilizó como algunas modificaciones en las que no hubo ningún paso independiente de disminución de monocitos, y en ciertos procesos, las células fueron congeladas antes del contacto inicial con las perlas y se realizó una concentración y estimulación adicionales. (Véanse las Figuras 5A y 5B). En una versión de este proceso, las células T se obtuvieron de sangre circulatoria de un donante o paciente mediante aféresis. Los componentes de un producto de aféresis contienen normalmente linfocitos, monocitos, granulocitos, células B, otras células nucleadas (glóbulos blancos, glóbulos rojos y plaquetas. Un producto típico de aféresis contiene 1 - 2 x 10^{10} células nucleadas. Las células se lavan con solución salina de tampón fosfato sin calcio y sin magnesio para eliminar las plaquetas y proteínas del plasma. El paso de lavado se realizó centrifugando las células y eliminando el fluido supernatante, el cual es sustituido después por PBS. El proceso se consiguió utilizando una centrifugadora semiautomática de "flujo continuo" (COBE 2991 System, Baxter). Las células se mantienen en un sistema cerrado mientras se procesan.

Las células se pueden procesar adicionalmente disminuyendo las células no enlazantes, incluyendo los monocitos (enriquecidos para células activadas) y continuando después con la estimulación. De forma alternativa, las células lavadas pueden ser congeladas, almacenadas y procesadas posteriormente, operación que aquí se demuestra que aumenta el vigor de la proliferación, así como la disminución de granulocitos. En un ejemplo, para congelar las células se coloca una suspensión de 35 ml de células en una bolsa de congelación Cryocyte de 250 ml junto con 35 ml de la solución de congelación. La suspensión celular de 35 ml contiene típicamente de 3,5x10^{9} a 5,0x10^{9} células en PBS. Se añade un volumen igual de solución de congelación (20% DMSO y 8% albúmina de suero humano en PBS). Las células tienen una concentración final de 50x10^{6} células/ml. La bolsa Cryocyte puede contener volúmenes en el intervalo de 30 a 70 ml, y la concentración celular puede oscilar entre 10 y 200 x10^{6} células/ml. Una vez llenada la bolsa Cryocyte de células y solución de congelación, la bolsa se coloca en un congelador de índice controlado y las células se congelan a 1ºC/minuto hasta -80ºC. Las células congeladas son colocadas posteriormente en un sistema de almacenamiento de nitrógeno líquido hasta que sean necesarias.

Las células son extraídas del sistema de almacenamiento de nitrógeno líquido y descongeladas a 37ºC. Para eliminar el DMSO (dimetil sulfóxido), las células descongeladas son lavadas con PBS exento de calcio y magnesio en el sistema COBE 2991. Las células lavadas se pasan después a través de un filtro con malla de 80 micrones.

Las células descongeladas (aproximadamente 0,5x10^{9} células CD3^{+}) son colocadas en una bolsa de plástico Lifecell de 1 litro que contiene 100 ml de PBS exento de calcio y magnesio. El PBS contiene 1% a 5% de suero humano. En la bolsa también se colocan 1,5x10^{9} perlas CD3xCD28 (Dynabeads M-450) con las células (3:1 DYNABEADS M-450 CD3/CD28 T:células T CD3^{+}). Las perlas y las células se mezclan a temperatura ambiente a 1 r.p.m. durante 30 minutos aproximadamente. La bolsa conteniendo las perlas y células se coloca en el separador MaxSep Magnetic Separator (Nexell Therapeuctics, Irvine, CA). Entre la bolsa y el MaxSep se coloca un separador de plástico (de 6 mm aprox. de espesor). (Para aumentar la fuerza magnética se retira el separador). Las perlas y todas las células adheridas son retenidas en el imán mientras el PBS y las células no unidas son extraídas por bombeo.

Las perlas CD3xCD28 y las células concentradas unidas a las perlas se enjuagan con medio de cultivo celular (1 litro conteniendo X-Vivo 15, Bio Whittaker; con 50 ml de `pool' de suero humano inactivado por calor, 20 ml 1M Hepes, 10 ml 200 mM L-glutamina con o sin aprox. 100.000 I.U. IL-2) en una bolsa de cultivo 3L Lifecell. Después de transferir las perlas CD3xCD28 y las células seleccionadas positivamente a la bolsa Lifecell, se añade el medio de cultivo hasta que la bolsa contiene 1.000 ml. La bolsa conteniendo las células se coloca en una incubadora (37ºC y 5% CO_{2}) y se deja que las células se expandan.

Las células se dividen de 1 a 4 a los días 3 y 5. La activación y proliferación de células T se midió recolectando células después de 3 días y 8 días en cultivo. La activación de las células T se evaluó midiendo el tamaño de las células y el nivel de expresión del marcador de superficie celular, en particular las expresiones de CD25 y CD154, al día 3 de cultivo. Al octavo día, las células se hicieron fluir bajo gravedad (aprox. 150 ml/min.) sobre el imán MaxSep para eliminar las partículas magnéticas y las células se lavaron y concentraron utilizando el dispositivo COBE indicado anteriormente, y fueron resuspendidas en una solución electrolítica equilibrada para administración intravenosa, como Plasma-Lyte A® (Baxter-Healthcare).

Como se describe en la especificación, XCELLERATE I^{TM} hace referencia a condiciones similares a las anteriores, salvo que no se practicó estimulación ni concentración y que la disminución de monocitos se llevó a cabo antes de la estimulación.

Se realizaron los procesos XCELLERATE I^{TM} y II^{TM} y la proliferación de células T se midió después de 8 días en cultivo. El producto de las células T expandidas fue superior cuando se concentraron células CD3^{+} antes del cultivo celular. (Véase la Tabla 1). Además, la población celular tenía más del 90% de células CD3^{+}.

TABLA 1 Expansión de Células T al Día 8

1

A este respecto se realizaron más experimentos que muestran el número total de células expandidas, así como la multiplicación de la expansión de nueve lotes de células estimuladas sin concentración CD3^{+} y cinco lotes de células estimuladas con concentración CD3^{+}. (Véanse las Figuras 1 y 2).

La concentración de las células aplicando una fuerza magnética antes del cultivo aumenta de forma eficaz la pureza de las células CD3+ e incrementa los niveles de CD154. (la Tabla 2, Figuras 3 y 4 muestran gráficamente los niveles de CD154). Además, la comparación de la proliferación de células T cuando se expusieron poblaciones de células T a imanes de distintas potencias mostró que la exposición a un imán más potente provocaba una mayor producción de células CD3^{+}. (Tabla 2).

TABLA 2 Comparación de la Proliferación de Células T y Marcadores de Superficie Celular después de la Concentración utilizando Imanes Débiles y Fuertes

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TABLA 2 (continuación)

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Se realizaron cinco experimentos adicionales comparando el proceso de XCELLERATE I^{TM} con el de XCELLERATE II^{TM}. Para las células activadas y expandidas en cultivo de acuerdo con los dos procesos, los marcadores de activación celular (tamaño de célula, expresión de CD25 y expresión de CD154) a los días 3 y 8 de cultivo se muestran en la tabla 3 siguiente y en las Figuras 6-7.

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(Tabla pasa a página siguiente)

TABLA 3 Marcadores de la Activación Celular al Día 3

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Los datos de la Tabla 3 y de las Figuras 6-7 muestran que el proceso XCELLERATE II^{TM} generó células cuyos marcadores de tamaño de célula y de activación de la expresión de CD25 al día 3 tenían un promedio similar, pero típicamente más alto y que siguieron siendo más altos tras la estimulación. Sin embargo, el marcador de activación CD154 al día 3 para células T del proceso XCELLERATE II^{TM} fue mucho más grande que para el de células T del proceso XCELLERATE I^{TM}. Además, como se ha mostrado anteriormente, el proceso XCELLERATE II^{TM} generó niveles de CD25 y CD 154 que fueron coherentemente superiores por donante que otros métodos.

La expresión de CD154 al día 3 del proceso XCELLERATE II^{TM} es efectivamente muy superior que para XCEL LERATE I^{TM}. Esta observación sugiere que las células T están en un estado superior de activación durante el proceso XCELLERATE II^{TM} que en el proceso XCELLERATE I^{TM}. Se prevé que todo ello se pueda traducir en un producto más eficaz cuando se administre in vivo.

También se determinó para cinco muestras de pacientes la pureza de las células CD3^{+}, la relación células CD4/célu-
las CD8 y la viabilidad celular al día 3 de cultivo. El fenotipo y viabilidad de las células utilizadas sometidas a los procesos XCELLERATE I^{TM} y XCEL LERATE II^{TM} se muestran en la siguiente Tabla 4 según medición mediante citometría de flujo o tinción con azul tripán.

TABLA 4

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Ejemplo II

Eficacia del enriquecimiento de células T CD3^{+}, disminución de monocitos y disminución de granulocitos

Para este estudio, cuando se recibió en el laboratorio Xcyte Therapies Development, el producto de aféresis PBMC se lavó, dividió y:

1.: Para el proceso XCELLERATE I se realizó un paso de disminución de monocitos y las PBMC disminuidas de monocitos CD14+ se crioconservaron y almacenaron en la fase de vapor de un congelador de nitrógeno líquido (como se ha indicado en el ejemplo I). El día de conFiguración del proceso XCELLERATE I se descongelaron las PBMC disminuidas de monocitos CD14^{+} y se inició el proceso XCELLERATE con las perlas DYNABEADS M-450 CD3/CD28 T que se detallan en el ejemplo I. En la tabla 5.1 se muestra el promedio de composición celular y el promedio de eficacia del enriquecimiento de células T CD3^{+}, la disminución de monocitos CD14+ y la disminución de granulocitos para donantes N = 5 en estos pasos iniciales; los datos de cada donante individual se muestran en la tabla 5.2.

2.: Para el proceso XCELLERATE II, las células producto de aféresis de PBMC fueron crioconservadas y almacenadas en la fase de vapor de un congelador de nitrógeno líquido. El día de conFiguración del proceso XCELLERATE II se descongelaron las células producto de aféresis de PBMC y las células T CD3+ se concentraron magnéticamente y se inició el proceso XCELLERATE II con las perlas DYNABEADS M-450 CD3/CD28 T que se detallan en el ejemplo I. En la tabla 5.1 se muestra el promedio de composición celular y el promedio de eficacia del enriquecimiento de células T CD3^{+}, la disminución de monocitos CD14^{+} y la disminución de granulocitos para los donantes N = 5 en estos pasos iniciales; los datos de cada donante individual se muestran en la tabla 5.2.

Como se muestra en las tablas 5.1 y 5.2, la combinación de congelación/descongelación del producto de aféresis de PBMC seguidas de concentración magnética de células T CD3+ del producto congelado de la aféresis de PBMC en la conFiguración del proceso XCELLERATE II provoca una eficaz eliminación de granulocitos y monocitos CD14+ (Tabla 5.1 y Tabla 5.2). La eficacia de la eliminación de los monocitos CD14^{+} y los granulocitos en el proceso XCELLERATE II es tan buena como la del proceso XCELLERATE I, con la ventaja de que elimina la necesidad de un paso independiente de disminución utilizando el reactivo adicional "no recubierto" DYNABEADS M-450 T y conduciendo de manera constante a una relación CD4/CD8 superior.

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(Tabla pasa a página siguiente)

TABLA 5.1 Promedio (N=5) de eficacia de enriquecimiento de células T CD3^{+}, disminución de monocitos CD14^{+} y disminución de granulocitos en los Pasos Iniciales de las ConFiguraciones de Procesos XCELLERATE I y XCELLERATE II

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TABLA 5.2 Comparación de la eficacia del enriquecimiento de células T CD3^{+}, disminución de monocitos CD14^{+} y disminución de glanulocitos en los pasos iniciales de las conFiguraciones de procesos XCELLERATE I y XCELLERATE II

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TABLA 5.2 (continuación)

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TABLA 5.2 (continuación)

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Además de la simplificación y de hacer más eficiente el proceso eliminando el paso de disminución de monocitos CD14^{+} y reactivos asociados, el paso de concentración magnética en el proceso XCELLERATE II^{TM} también proporciona una mayor pureza de células T CD3^{+} y una relación más alta de células T CD3^{+} CD4^{+}: CD3^{+} CD8^{+} al inicio de la activación de las células T (Tabla 5.1 y Tabla 5.2).

También se comparó Producción (Rendimiento), Pureza, Viabilidad y Composición de las células T CD3^{+} Activadas antes de la recolección al día 8 del proceso XCELLERATE I^{TM} y del proceso XCELLERATE II^{TM}.

Como se muestra en la Tabla 5.3, el promedio de producción, pureza y viabilidad de las células T CD3^{+} antes de la recolección al día 8 son típicamente mejoradas para el proceso XCELLERATE II^{TM} en comparación con el proceso XCELLERATE I^{TM}.

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TABLA 5.3 Producción (rendimiento), pureza, viabilidad y composición de las células T CD3^{+} activadas antes de la recolección al día 8 del proceso XCELLERATE I^{TM} y del proceso XCELLERATE II^{TM}

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TABLA 5.3 (continuación)

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Asimismo, como se muestra en la Tabla 5.3, el proceso XCELLERATE II^{TM} mantiene una relación más alta de células T CD3^{+} CD4^{+}: CD3^{+}CD8^{+} a lo largo del proceso. Ello puede ser debido a la concentración preferencial de células CD3^{+} CD4^{+} durante el paso de concentración magnética (Tablas 5.1 y 5.2).

"Entrante" hace referencia a células entrantes de aféresis frescas y lavadas. Las células de inicio que se relacionan en la Tabla 5.2 para el proceso XCELLERATE I^{TM} fueron células sometidas a aféresis que habían sido lavadas, disminuidas de monocitos o congeladas/descongeladas. Las células de inicio que se relacionan en la Tabla 5.2 para el proceso XCELLERATE II^{TM} fueron células de aféresis que habían sido lavadas, y congeladas/descongeladas.

* = Relación de células T CD3^{+} CD4^{+}: CD3^{+} CD8^{+}

La Tabla 5.3 muestra que el proceso XCELLERATE II^{TM} tuvo como resultado un producto celular que era más puro (en términos de % de células CD3^{+}) que el resultante del proceso XCELLERATE I^{TM}. Es decir, las células producto del proceso XCELLERATE II^{TM} tenían un promedio (\pm desviación estándar) de pureza de células CD3^{+} del 96% \pm 1%, mientras que las células del proceso XCELLERATE I^{TM} tenían un promedio de pureza del 93% \pm 2%.

Asimismo, como se muestra en la Tabla 5.3, el proceso XCELLERATE II^{TM} mantuvo una relación más alta de células CD4/CD8. Las células entrantes tenían un promedio de relación de células CD4/CD8 de 2:2 y las células producto del proceso XCELLERATE II^{TM} tenían una relación CD4/CD8 de 1:8, mientras que las células producto del proceso XCELLERATE I^{TM} tenían una relación CD4/CD8 de 1:2.

Los datos de la Tabla 5.3 también muestran que el proceso XCELLERATE II^{TM} resultó en células producto con un promedio de viabilidad del 98%, mientras que en el proceso XCELLERATE I^{TM} fue del 97%.

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Ejemplo III

Disminución de monocitos

Los monocitos (células fagocíticas CD14+) se eliminan de los preparados de células T vía disminución magnética utilizando una serie de perlas Dynal "irrelevantes" (es decir, no recubiertas de anticuerpos o no recubiertas de anticuerpos diana). La disminución se realizó mediante pre-incubación de sangre total tras separación en ficol o sangre periférica sometida a aféresis con perlas M-450 anti-ratón Dynal Sheep, o perlas Dynal recubiertas de albúmina de suero humana (M-450), o con perlas Dynal Epoxy (M-450) a una relación aproximada perla-célula de 2:1. Las células y las perlas se incubaron durante periodos de 1-2 horas a 22-37ºC, seguido de eliminación magnética de las células que se habían adherido a las perlas o que habían ingerido perlas. Las células restantes se colocaron en cultivo junto a células no manipuladas. El fenotipo celular se caracterizó mediante citometría de flujo antes y después de la disminución.

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Ejemplo IV

Ajustes de la citometría de flujo

Para todos los datos recogidos y presentados se utilizó un citómetro Becton Dickinson FACSCALIBUR. Para alcanzar datos idénticos, un operador con experiencia podría utilizar cualquier citómetro de flujo capaz de realizar análisis de 3 colores. Por ejemplo, un FACSCAN, Vantage Cell Sorter u otro producto BD funcionaría para recopilar datos similares. También funcionarían productos Coulter, como el Coulter Epic Sorter.

La configuración del instrumento que se facilita a continuación se puede utilizar como directriz general para la conformación del instrumento y recopilar datos como se hizo en estos estudios. Estos ajustes se utilizaron para los ejemplos que aquí se facilitan; sin embargo, un usuario de estos instrumentos con experiencia podría y debería introducir modificaciones en ellos para ajustar de forma apropiada los voltajes de compensación y del detector. Asimismo, el uso de distintos anticuerpos de detección con diferentes etiquetas fluorescentes exige realizar ajustes específicos para un instrumento en particular a fin de proporcionar la separación de señal óptima (voltaje) con la mínima descarga a otros canales (p.ej., compensación). Un operador experimentado que tenga una buena formación en el uso de controles de compensación, controles de isótopos y con conocimientos generales de la biología de las células T debería ser capaz de reproducir cualquier de los datos que se presentan a continuación.

Se debe indicar además que los distintos ajustes, en particular, el de voltaje, pueden variar dependiendo de la eficacia del láser del instrumento. Por ejemplo, los láseres más antiguos pueden necesitar más voltaje para general una señal comparable a la de un láser más nuevo. No obstante, los datos obtenidos, sea con mayor o menor voltaje, deberían reflejar pautas similares en la biología.

Ajustes usados en el FACSCALIBUR^{TM} (Becton Dickinson):

Detector/Amperios:

100

Aunque los voltajes son generalmente constantes, P3, P4 y P5 se pueden ajustar ligeramente al alza o a la baja para conseguir una separación de señal máxima manteniendo un valor negativo de señal de control en o cerca de la primera decena (0-10) en potencia de señal en el modo `log'.

Umbral:

Parámetro primario: FSC (`forward scatter' o dispersión frontal de la luz)

Valor: 52

Parámetro secundario: ninguno

Compensación:

FL1 - 4.0% FL2

FL2 - 21.4% FL1

FL2 - 2.6% FL3

FL3-15.2% FL2

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Aunque los ajustes facilitados se aproximan a los utilizados para recopilar la mayor parte de los datos que a continuación se presentan, los ajustes se pueden modificar y se deberían generar datos aproximadamente equivalentes en las células T estimuladas. Los intervalos aceptables generalmente para la compensación de los voltajes antes indicados son los que se muestran a continuación:

FL1-FL2: 0.4-4%

FL2-FL1: 18-27%

FL2-FL3: 2-8%

FL3-FL2: 10-16%

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La determinación de la compensación particular o los valores de voltaje debe realizarla un operador de citómetro de flujo que tenga experiencia con los siguientes objetivos:

1): Voltaje: Maximización de la separación de señal entre señales positiva y negativa (p.ej., marcador de antígeno de superficie negativo en comparación con bajos niveles de antígeno de superficie en comparación con altos niveles de antígeno de superficie).

2): Compensación: Minimización de la interferencia entre canales (`bleed-over') utilizando los controles de compensación.

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A medida que cambien los ajustes del voltaje, así lo hacen los ajustes de la compensación.

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Ejemplo V

Proliferación celular y ensayos de viabilidad

La proliferación celular y la viabilidad se midieron mediante tinción estándar de azul tripán y el conteo celular se realizó con un hemocitómetro. Véanse las Figuras 5A-5B.

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Ejemplo VI

Ensayos de marcadores de activación

CD154 se expresa en células T activadas de forma transitoria y ha quedado demostrado que es un elemento clave en la activación de las células T vía CD40 en las células presentadoras de antígeno (APC). El bloqueo de la interacción de estos dos receptores puede alteran efectivamente (e incluso cortar) una respuesta inmune. A los días 3, 5 y 8 se retiraron de un cultivo celular alícuotas de células T que fueron estimuladas mediante concentración con perlas paramagnéticas CD3xCD28 y se analizó el nivel de la expresión de CD154. El nivel de la expresión de CD154 se comparó con las células T que habían sido disminuidas de monocitos pero que no se incubaron con perlas paramagnéticas CD3xCD28 (es decir, las células T no fueron concentradas magnéticamente al inicio del cultivo). Se demostró una importante activación de las células T estimuladas mediante concentración magnética con perlas anti-CD3 y anti-CD28 por el triple aumento del nivel de expresión de CD154 al tercer día de cultivo en comparación con células que no fueron estimuladas de forma similar al inicio del cultivo. (Véanse las Figuras 4 y 7). Los niveles de CD25 medidos de una forma similar (Figura 6) muestran tendencia a una mayor activación.

En términos generales, la expresión del marcador se supervisó en distintos momentos. A este respecto, las células fueron etiquetadas con CD4 anti-humano (Immunotech, Fullerton, CA), CD11a anti-humano acoplado a isotiocianato de fluorescerina (FITC) (Pharmingen), CD26 anti-humano acoplado a FITC (Pharmingen), CD49d anti-humano acoplado a FITC (Coulter), CD54 anti-humano acoplado a FITC (Pharmingen and gecton Dickinson), CD95 anti-humano acoplado a FITC (Pharmingen), CD134 anti-humano acoplado a FITC (Pharmingen), anticuerpo CD25 anti-humano acoplado a FITC (Bedon Dickinson, Fullerton, CA), anticuerpo CD69 anti-humano acoplado a FITC (Bedon Dickinson), anticuerpo CD154 anti-humano acoplado a FITC o PE (Becton Dickinson) o anticuerpo de control de isótopo IgG1 acoplado a FITC o PE. Se etiquetaron 2x10^{5} células durante 20 minutos a 4ºC con 2 \mul de cada anticuerpo en un volumen final de 30 \mul, se lavaron y se resuspendieron en 1% paraformaldehído (Sigma, St. Louis,
MO).

La comparación de los niveles de expresión de la molécula del marcador de superficie celular se puede realizar mediante diversos métodos, por lo que los valores absolutos pueden diferir. Sin embargo, cuando se comparan dos valores, se pueden calcular con facilidad los valores relativos de multiplicación. Por ejemplo, los niveles de expresión de CD154 en células T generadas mediante distintos métodos de "activación" se pueden medir con relativa precisión mediante citometría de flujo. Utilizando un reactivo como anti-CD154 -PE Conjugate de Becton Dickinson (nº de catálogo 340477) se pueden tincionar células T en estado de reposo o activadas y medir los niveles de expresión para este marcador (u otros por medios bien conocidos para operadores de citómetros de flujos con experiencia). Aquí se describen métodos que proporcionan una mayor expresión de CD154 en células T, tanto CD4^{+} como CD8^{+}. Realizando simultáneamente la estimulación y concentración de células T al inicio del cultivo como aquí se describe, los niveles de expresión se pueden aumentar por encima de los valores obtenidos mediante activación 3x28 estándar, en el orden de un 20% a un 100% de aumento, con medición por intensidad fluorescente media (MFI) utilizando citometría de flujo (BD FACSCalibur y el anticuerpo descrito anteriormente). Por ejemplo, una célula T CD4^{+} no estimulada sería negativa para CD154 y proporcionaría por lo tanto valores MFI entre 1 y 10. A la activación mediante XCELLERATE I^{TM}, a los 3 días tras la activación, los valores MFI para CD154 en células T CD4^{+} podrían estar en el intervalo de 20-40, mientras que el proceso XCELLERATE II^{TM} podría facilitar valores MFI de CD154 de 60-200. Aunque estos valores no son absolutos en términos del número de moléculas CD154 expresadas en células T, son suficientes para determinar niveles relativos de aumento de la expresión. En concordancia, se puede demostrar un aumento de 1,1 a 20 veces en los niveles de CD154 entre 1-4 días post-activación con el proceso XCELLERATE II^{TM} en comparación con el proceso XCELLERATE I^{TM}.

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Ejemplo VII

Ensayos de citocinas

Las células se preparan como se ha descrito anteriormente. Los supernatantes de las células estimuladas durante diversos tiempos son sometidos a un ensayo ELISA de IL-2, IL-4, INF-gamma o TNF-\alpha de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Biosource International, Sunnyvale, CA).

En un ensayo alternativo, IL-2 se midió mediante tinción intracelular de células T CD4 utilizando citometría de flujo. Para el etiquetado intracelular de IL-2 o IFN-\gamma, las células se incuban primero con 1 \mug/ml de Monensin (Calbiochem) durante 4 horas antes del ensayo. Las células son sometidas posteriormente a tinción para detección de proteínas de superficie como se ha descrito anteriormente, se fijan y permeabilizan utilizando el kit de tinción intracelular Becton Dickinson, se etiquetan con IL-2 Ab anti-humano acoplado a PE y IFN-\gamma anti-humano acoplado a FITC o los correspondientes anticuerpos de control que describa el fabricante. La adquisición de datos y el análisis de citometría de flujo se realiza en un citómetro de flujo Becton Dickinson FACSCalibur utilizando el software Cellquest siguiendo el protocolo del fabricante (Bedon Dickinson).

Las concentraciones de IFN-gamma fueron aproximadamente 2, 3 y 4 (y en algunos casos 5) veces superiores al día 3 cuando se utiliza la metodología XCELLERATE II^{TM} en lugar de XCELLERATE I^{TM} (datos no mostrados). Además, los niveles de TNF-alfa fueron también marcadamente superiores (entre 1,5 a 3 veces más altos) hasta el día 5 tras la estimulación (datos no mostrados) en comparación con XCELLERATE I^{TM}.

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Ejemplo VIII

Análisis fenotípico celular tras la estimulación

Para el análisis de re-estimulación se tomaron 5x10^{6} células aproximadamente del cultivo el día de su finalización. En varios ejemplos, la fecha de finalización fue el día 8 de cultivo. Las células se colocan en 5 ml de medio Ex-vivo 15 con suero y con o sin IL-2 (como se ha indicado anteriormente) en un pocillo de una placa de seis pocillos. Aproximadamente 5x10^{6} perlas T Dynabeads M-450 CD3/CD28 del pocillo que contiene las células, y las células y las perlas se colocan en una incubadora 5% CO_{2} a 37ºC. Transcurridos dos días, las muestras se retiran y se ensaya su viabilidad, y se analizan mediante FACS para determinar el tamaño celular, los niveles de expresión del marcador celular o de citocina, como los niveles de expresión de CD25 y niveles de expresión de CD154. La Tabla 6 muestra estos resultados para cinco muestras de pacientes sometidas a los procesos XCELLERATE I^{TM} y
XCELLERATE II^{TM}.

TABLA 6 Resultados del Ensayo de Reestimulación de células T XCELLERATED Producidas utilizando los Procesos XCELLERATE I^{TM} y XCELLERATE II^{TM}

17

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Ejemplo IX

Recogida de células alternativas y protocolos de cultivo XCELLERATE^{TM}

Se hacen crecer células aisladas de sangre humana en medio X-vivo (Biowhittaker lnc., Walkersville, MD), y dependiendo del uso se complementan o no con 20 U/ml IL-2 (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN) y con suero humano 5% (Biowhittaker), 2 mM Glutamine (LifeTechnologies, Rockville, MD) y 20 mM HEPES (LifeTechnology). Se hicieron crecer células Jurkat E6-1 (ATCC, Manassas, VA) en RPMI 1640 (Life Technologies) complementadas con 10% FBS (Biowhittaker), 2 mM glutamina (Life Technologies), 2 mM Penicilina (Life Technologies) y 2 mM Estreptomicina (Life Technologies).

Se obtienen capas leucocitarias de donantes voluntarios humanos sanos (Cruz Roja Americana, Portland, OR). Se obtienen células mononucleares de sangre periférica (PBMC) utilizando Lymphocyte Separation Media (ICN Pharmaceuticals, Costa Mesa, CA) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

Se obtienen linfocitos de sangre periférica (PBL) de la fracción PBMC mediante incubación en matraz de cultivo (Costar, Pittsburgh, PA) con Dynabeads (Dynal, Oslo, Noruega) sin recubrimiento, 10^{8} células/ml, 2 perlas/célula, 2 h a 37ºC. Los monocitos y los macrófagos se pueden eliminar por adherencia al matraz de cultivo. De forma alternativa, se pueden eliminar mediante fagocitosis de las perlas paramagnéticas y disminución posterior de estas células por separación celular magnética de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Dynal). Las células CD4^{+} se purifican a partir de la fracción PBL mediante incubación con 10 \mug/ml de anticuerpos monoclonales contra CD8 (clon G10-1), CD20 (clon IF5), CD14 (clon F13) y CD16 (Coulter), 10^{8} células/ml, 20 min. a 4ºC. Después del lavado, las células son tratadas con perlas Dynabeads acopladas a Ig anti-ratón de oveja (10^{6} células/ml, 6 perlas/célula, 20 min. a 4ºC) y disminuidas posteriormente dos veces mediante separación celular magnética. La medición con citometría de flujo da una pureza habitual de las células del 91 al 95%.

Se generan células dendríticas adhiriendo primero PBMC al matraz de cultivo (Costar), 10^{8} células/ml, 2 h a 37ºC (sin perlas Dynabeads). Tras un amplio lavado, las células adherentes son cultivadas durante 7 días en un medio que contenga 500 U/ml GM-CSF (Boehringer Mannheim) y 12,5 U/ml IL-4 (Boehringer Mannheim). La población celular resultante es de débil adherencia y expresa las características de los marcadores de superficie de las células dendríticas (p.ej., expresa HLA-DR, CD86, CD83 y CD11c y no tiene expresión de CD4). (Todos los anticuerpos se obtienen en Becton Dickinson, San Jose, CA).

Otras técnicas pueden utilizar linfocitos de sangre periférica que contengan células T que sean incubadas en placas de cultivo de tejido o matraces de cultivo de tejido (bolsas Baxter) u otros vasos comunes de cultivo en medios, que podrían ser RPMI, X-Vivo o algún otro medio de cultivo de células T. Aunque no es necesario para la activación y crecimiento de células T, al medio de cultivo se añade glutamina y HEPES (N-2-Hidroxietilpiperacina-N'-2-Ácido Etanesulfónico). Al medio de cultivo se añade suero fetal bovino (10% final), suero A/B humano (5%) o suero humano autólogo (5%). El porcentaje de suero puede variar sin que resulte muy afectada la biología de las células T o el resultado del cultivo. En algunos casos, a los cultivos se añade IL-2 humana recombinante. En algunas ocasiones, las células CD14^{+} fagocíticas y otras células fagocíticas son eliminadas mediante disminución magnética como se describe más abajo. Se añaden perlas que tienen coinmovilizadas en su superficie anti-CD3 y anti-CD28 (3x28 perlas) con una relación perla-célula de 3:1. Los cultivos se mantienen a 37 grados al 5-7% CO_{2}. Las células se retiran a determinados momentos durante un periodo de 14 días para determinar la densidad celular (número de células), el tamaño de las células y el fenotipo de la superficie celular según medición vía análisis de citometría de flujo de una serie de antígenos de superficie. También se recogen supernatantes de los cultivos para determinar el perfil de secreción de citocina, incluyendo pero no quedando limitado a: IL-2, IL-4, IFN-\gamma y TNF-\alpha. A medida que crecen y se dividen las células activadas, los cultivos se mantienen a 0,2-2x10^{6} células T CD3^{+} por ml. Cuando la densidad de las células T supera 1,5x10^{6}/ml aproximadamente, los cultivos se dividen y se alimentan con medio fresco para proporcionar una densidad celular en el intervalo de 0,2-1,4x10^{6}/ml. En un plazo aproximado de 2 horas a 14 días tras la estimulación inicial, cuando las células T activadas muestran estar entrando en una fase más inactiva (p.ej., disminución de los niveles de CD25, reducción del tamaño celular determinado mediante dispersión frontal de la luz forward scatter, el índice de división celular puede haber disminuido), las células son infundidas al sujeto o estimuladas de nuevo con uno de los estímulos siguientes:

1): Sin estímulo

2): Fitohemaglutinina (PHA), 2 \mug/ml

3): (3x28 perlas) con una relación perla-célula de 1:1

Las células son analizadas de nuevo con el tiempo para determinar el fenotipo celular y el estado activación/funcio-
nal. Se recogen de nuevo los supernatantes para análisis de citocina secretada.

Las células se estimularon mediante tres metodologías distintas: 1) Perlas Dynabeads (M-450) acopladas covalentemente a anticuerpos anti-CD3 (OKT-3) y anti-CD28 (9.3) (3x28 perlas) de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Dynal), 3 perlas/célula; 2) lonomicina (Calbiochem, La Jolla, CA) (100 ng/ml) y forbol 12-miristato-13-acetato (PMA) (Calbiochem) (10 ng/ml); 3) células dendríticas alogénicas (25.000 células dendríticas/200.000 células CD4). Las células se estimulan a una concentración de 10^{6} células/ml. Los ensayos de proliferación se realizan por cuadruplicado en placas de base lisa de 96 pocillos. Las células son estimuladas a 10^{6} células/ml en un volumen final de 200 \mul. La proliferación se mide con ensayo MTT (kit de ensayo MTT, Chemicon International Inc., Temecula, CA) al día 3 (método de estimulación 1 y 2) o al día 6 (método de estimulación 3), y los resultados se presentan como valor promedio de los cuadruplicados. Los cultivos PBL o los cultivos celulares CD4^{+} se estimulan con 3x28 perlas, ionomicina/PMA o células dendríticas alogénicas.

Como se demuestra en las Figuras 8A-8B, el número de células (contador Coulter) aumenta drásticamente tras la estimulación con PHA, 3x28 perlas (anti-CD3 y anti-CD28 coinmovilizados en perlas) adheridas a las perlas vía anti-ratón de oveja (SAM), 3x28 perlas con los anticuerpos adheridos covalentemente a las perlas o anticuerpos inmovilizados sencilla o dualmente en una placa. La Figura 9 muestra también los incrementos en el número de células tras la estimulación con anti-CD3 y anti-CD28 inmovilizados covalentemente en perlas +/- disminución de monocitos y +/- 20 unidades de IL-2.

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Ejemplo X

Disminución de monocitos vía disminución magnética

Los monocitos (células fagocíticas CD14+) se eliminan de los preparados de células T vía disminución magnética utilizando una serie de perlas Dynal "irrelevantes" (es decir, no recubiertas de anticuerpos o no recubiertas de anticuerpos diana). La disminución se realizó incubando previamente sangre total ficolada o sangre periférica sometida a aféresis con una relación aproximada perla-célula de 2:1 de perlas M-450 anti-ratón de oveja Dynal Sheep, o perlas Dynal recubiertas de albúmina de suero humana (M-450), o con perlas Dynal Epoxy (M-450) durante periodos de 1-2 horas a 22-37 grados C, seguido de eliminación magnética de las células que se habían adherido a las perlas o que habían ingerido perlas. Las células restantes se colocaron en cultivo junto a células no manipuladas. Las células se caracterizaron mediante citometría de flujo para determinar el fenotipo celular antes y después de la disminución. La Figura 9 muestra la mayor proliferación en ausencia de monocitos.

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Ejemplo XI

Estudios cinéticos temporales pre y post activación

Se realizó una serie de experimentos en los que células T humanas aisladas a partir de sangre entera o de sangre periférica sometida a aféresis eran cultivadas bajo diversas condiciones. Esas condiciones incluían:

1): Sin estimulación

2): Estimulación con fitohemaglutinina (PHA), 2 \mug/ml

3): Estimulación con 3x28 perlas Dynabeads (perlas con perlas anti-CD3 y anti-C28 conjugadas en ellas) con una relación perla-célula T de 3:1 o 1:1.

4): Estimulación o cultivo en presencia o en ausencia de IL-2 humana recombinante añadida exógenamente a 10 U/ml (5 ng/ml).

5): Cultivo en presencia de monocitos (células fagocíticas CD14^{+}) o cultivo tras eliminación de las células antes mencionadas vía disminución magnética utilizando una serie de perlas Dynabead "irrelevantes". La disminución se realizó como se ilustra en el ejemplo 2.

Se analizaron los siguientes marcadores de superficie celular mediante citometría de flujo para determinar el fenotipo celular y el estado de activación: CD2, CD3, CD4, CDB, CD14, CD19, CD20, CD25, CD45RA, CD45R0, CD54, CD62L, CDw137 (41 BB) y CD154. También se examinó el tamaño celular determinado mediante perfiles de dispersión frontal de la luz forward scatter vía citometría de flujo.

Para determinar las subpoblaciones y los linajes de T, B y de monocitos se utilizaron marcadores como CD2, CD3, CD4, CDB, CD14, CD19, CD20, CD45RA y CD45RO, mientras que para determinar el estado de activación y las propiedades funcionales de las células se utilizó dispersión frontal de la luz forward scatter, CD25, CD62L, CD54, CD137 y CD154.

Se prepararon linfocitos de sangre periférica humana que contenían células T como se describe en el Ejemplo IX: Las células son analizadas con el tiempo para determinar el fenotipo celular y el estado activación/funcional. Se recogen los supernatantes para análisis de citocina secretada. Las Figuras 8 y 9 muestran las características generales de crecimiento de células T humanas tras la activación con 3x28 perlas +/- IL-2 humana recombinante a 10 u/ml y +/- disminución de monocitos. Todas las células fueron cultivas en matraces Baxter Lifecell (300 ml). La representación gráfica denominada "Scale up" hace referencia a un cultivo en matraz de 300 ml (sin IL-2/disminución de monocitos) que se amplió hasta un matraz Baxter Lifecell de 3 litros. La gráfica muestra una expansión logarítmica aproximada 2-4 de células T humanas bajo distintas condiciones.

La Figura 10 muestra el análisis cinético del tamaño celular según determinación mediante perfiles de citometría de flujo forward scatter con el tiempo. Se ve que las células T aumentan de tamaño poco después de la activación y lo disminuyen posteriormente de forma que el día 14 muestran perfiles de dispersión frontal de la luz forward scatter más pequeños, lo que indica un estado más inactivo.

La Figura 11 muestra la expresión del receptor IL-2 (CD25) con el paso del tiempo tras la estimulación con perlas 3x28. Tanto las células T CD4^{+} como CD8^{+} muestran un aumento temprano en el nivel del receptor. Al día 14, los niveles de expresión de CD25 se han reducido en gran manera en la mayoría de células T, lo que indica un estado más inactivo.

Cuando las células T estimuladas con 3x28 se hicieron más inactivas (bajo CD25, baja forward scatter) fueron estimuladas de nuevo como se muestra a continuación:

1): Sin estimulación

2): PHA, 2 ug/ml

3): Estimulación con perlas 3x28 (Xcellerate) a 1 perla/célula T CD3^{+}

Se realizó un análisis cinético del tamaño celular (forward scatter), del fenotipo de superficie, de la expresión del marcador de activación y de la secreción de citocina. La Figura 12 muestra la cinética de la dispersión frontal de la luz (tamaño celular) tras las estimulaciones primaria y secundaria. La Figura 13 muestra la cinética de la expresión de CD25 (Receptor IL-2) tras las estimulaciones primaria y secundaria. La Figura 16 muestra la expresión de CD54 (I-CAM) tras la estimulación secundaria, en células T CD4^{+} (A) y en células T CD8^{+} (B), en que la estimulación primaria fue bien PHA o perlas CD3xCD28, y la re-estimulación fue bien: ninguna, PHA o perlas 3x28. También se utilizaron los marcadores que se delinean entre las células positivas CD4 y CD8 para determinar su proporción relativa durante la activación con perlas de anticuerpo 3x28 (Figuras 19 y 22).

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Ejemplo XII

Análisis de las pautas de expresión de citocinas de células T coestimuladas

Se ha estudiado ampliamente el papel de diversas citocinas (incluidas IL-2, IFN-\gamma TNF- y IL-4 en relación con el mantenimiento, expansión y diferenciación de las células T. Se ha demostrado que IL-2 especialmente da soporte al mantenimiento y expansión de estas células. IFN-\gamma ha estado implicada en hacer que las células T se diferencien en respuestas inmune tipo T_{H1}, mientras que IL-4 en respuestas tipo T_{H2}. Se analizaron los niveles de liberación de citocinas en células T humanas primarias activadas mediante PHA o perlas CD3xCD28 estimulando las células T como en el Ejemplo IX, incluidos estudios cinéticos de respuesta a la estimulación primaria y respuesta a un segundo estímulo. Los datos se muestran en las Figuras 18A-C, y las Figuras 23-24 demuestran una característica única de la estimulación con perlas CD3xCD28. Entre los días 2 y 4 tras la estimulación inicial (el día uno no se valoró) se observaron niveles extremadamente altos de IL-2 y de IFN-\gamma. Se comprobó un aumento casi quíntuple en los niveles absolutos de secreción de IL-2 para células T estimuladas con perlas 3x28 en comparación con los niveles observados para células estimuladas con PHA. También se observó un aumento de 7 veces en los niveles de IFN\gamma en células T estimuladas con 3x28 en comparación con sus homólogas con PHA. En el caso de IL-4, el incremento no fue tan notable para la estimulación primaria. Resulta interesante, y posiblemente de gran importancia, el hecho de que después de que las células se volvieran inactivas (ya no se producía división o secreción de las tres citocinas indicadas anteriormente) tras la estimulación primaria, fueron estimuladas de nuevo con perlas CD3xCD28, PHA o se dejaron sin estimular. Las células T que habían recibido una señal de activación/expansión inicial mediante perlas CD3xCD28 secretaron niveles incluso más altos de -IFN-\gamma que los observados tras la estimulación primaria. En cambio, las células que fueron estimuladas inicialmente con PHA secretaron niveles de IFN-\gamma mucho más bajos que los observados en sus homólogas con 3x28. Se observaron diferencias similares para los niveles de
IL-4.

Los datos sugieren que las células obtenidas tras la activación/expansión mediada con perlas CD3xCD28 son funcionalmente distintas a las obtenidas por otros medios de expansión como PHA. Las células resultantes parecen tener una respuesta alterada a la secreción de citocinas, la que fomenta niveles altos de citocinas T_{H1} y T_{H2}, con un posible favorecimiento del perfil tipo T_{H1} (IFN-y). La secreción de esos altos niveles de estas citocinas en cultivo puede tener muchos efectos, incluyendo: forzar a las células T a un camino de diferenciación de T_{H1}, que es el que favorece respuestas anti-tumor y anti-virus; y también modificando la funcionalidad básica de las células T resultantes (como descender el umbral de activación e inhibir los caminos de muerte celular programados).

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Ejemplo XIII

Análisis de la expresión de CD54 de células T coestimuladas

La Figura 16 muestra la expresión de CD54 (I-CAM) tras la estimulación secundaria, en células T CD4^{+} (A) y en células T CD8^{+} (B), en que la estimulación primaria fue bien PHA o perlas CD3xCD28, y la re-estimulación fue bien: ninguna, PHA o perlas 3x28.

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Ejemplo XIV

Ensayos de marcador de activación a corto plazo

La expresión del marcador se supervisó en diversos momentos tras la estimulación de células T que se expone en el Ejemplo IX. A este respecto, las células fueron etiquetadas con CD4 anti-humano (Immunotech, Fullerton, CA), CD11a anti-humano acoplado a isotiocianato de fluorescerina (FITC) (Pharmingen), CD26 anti-humano acoplado a FITC (Pharmingen), CD49d anti-humano acoplado a FITC (Coulter), CD54 anti-humano acoplado a FITC (Pharmingen and gecton Dickinson), CD95 anti-humano acoplado a FITC (Pharmingen), CD134 anti-humano acoplado a FITC (Pharmingen), anticuerpo CD25 anti-humano acoplado a FITC (Bedon Dickinson, Fullerton, CA), anticuerpo CD69 anti-humano acoplado a FITC (Bedon Dickinson), anticuerpo CD154 anti-humano acoplado a FITC o PE (Becton Dickinson) o anticuerpo de control de isótopo IgG1 acoplado a FITC o PE. Se etiquetan 2x10^{5} células durante 20 minutos a 4ºC con 2 \mul de cada anticuerpo en un volumen final de 30 \mul, se lavan y se resuspenden en 1% paraformaldehído (Sigma, St. Louis, MO). Véanse las Figuras 21-22 y 26A-26L; como se demuestra en estas Figuras, aparecen diferencias importantes en el tiempo de activación, así como entre células CD4^{+} y CD8^{+}.

De todo lo anterior se apreciará que aunque aquí se han descrito realizaciones específicas de la invención a efectos de ilustración, se pueden introducir diversas modificaciones sin desviarse de la invención. En consecuencia, la invención no está limitada salvo por las reivindicaciones que se adjuntan. Además, todos los intervalos numéricos aquí citados incluyen explícitamente todos los valores enteros intermedios.

Claims

1. Método para estimular in vitro una población de células T mediante concentración de las células T y ligación de la fracción de superficie celular simultáneamente que comprende:

(a): proporcionar una población de células en la que una parte como mínimo de ellas son células T

(b): poner en contacto la mencionada población de células con una superficie, en la que la mencionada superficie tenga adherido uno o más agentes que ligue(n) una fracción de superficie celular de como mínimo una porción de las mencionadas células T y estimule(n) como mínimo la mencionada porción de células T.

(c): aplicar una fuerza que fuerce principalmente la concentración de células T y la ligación de la fracción de superficie celular, induciendo de esta forma la estimulación de células T.

2. Método de la reivindicación 1, en que la mencionada superficie tiene adherido un primer agente que liga una primera fracción de superficie celular de una célula T, y la misma o una segunda superficie tiene adherido un segundo agente que liga una segunda fracción de la mencionada célula T, en la que la mencionada ligación por el primer y el segundo agente induce la proliferación de la mencionada célula T.

3. Método de la reivindicación 1, en que las células T que son ligadas quedan separadas de las células T que no son ligadas.

4. Método de la reivindicación 1, en que las mencionadas células T estimuladas mejoran la disfunción de la respuesta inmune.

5. Método de la reivindicación 1, en que la mencionada superficie es biocompatible.

6. Método de la reivindicación 5, en que la mencionada superficie es natural o sintética.

7. Método de la reivindicación 6, en que la superficie se selecciona del grupo formado por cristal, sílice, silicio, colágeno, hidroxiapatita, hidrogeles, PTFE, polipropileno, poliestireno, nilón, dextrano y poliacrilamida.

8. Método de la reivindicación 1, en que la mencionada superficie es una partícula.

9. Método de la reivindicación 8, en que la partícula se selecciona del grupo formado por una perla, una microesfera, una nanopartícula y una partícula coloidal.

10. Método de la reivindicación 9, en que la mencionada perla tiene un diámetro entre aproximadamente 5 nanometros a aproximadamente 500 micrones.

11. Método de la reivindicación 6, en que la mencionada superficie incluye un polímero.

12. Método de la reivindicación 11, en que la mencionada superficie se selecciona del grupo formado por colágeno, proteínas purificadas, péptidos purificados, polisacáridos, glicosaminoglicanos y composiciones de matriz extracelular.

13. Método de la reivindicación 12, en que los polisacáridos se seleccionan del grupo formado por quitosán, alginato, dextrano, ácido hialurónico y celulosa.

14. Método de la reivindicación 11, en que el polímero se selecciona del grupo formado por poliésteres, poliéteres, polianhídridos, polialquilcianoacrilatos, poliacrilamidas, poliortoésteres, polifosfacenos, polivinilacetatos, copolímeros de bloque, polipropileno, politetrafluoroetileno (PTFE) o poliuretanos.

15. Método de la reivindicación 14, en que el polímero incluye ácido láctico.

16. Método de la reivindicación 11, en que el polímero es un copolímero.

17. Método de la reivindicación 16, en que el copolímero incluye ácido láctico y ácido glicólico (PLGA).

18. Método de la reivindicación 5, en que la superficie biocompatible es biodegradable.

19. Método de la reivindicación 5, en que la superficie biocompatible no es biodegradable.

20. Método de la reivindicación 19, en que la sustancia no biodegradable incluye un polímero seleccionado del grupo formado por poli(dimetilsiloxano) y poli(etileno-vinilo acetato).

21. Método de la reivindicación 5, en que la superficie biocompatible se selecciona del grupo formado por colágeno, metal, hidroxiapatita, biocristal, aluminato, materiales biocerámicos, polímeros de ácido hialurónico, alginato, polímero de éster acrílico, polímero de ácido láctico, polímero de ácido glicólico, polímero de ácido láctico/ácido glicólico, proteínas purificadas, péptidos purificados y composiciones de matriz extracelular.

22. Método de la reivindicación 5, en que la superficie biocompatible está asociada a un dispositivo implantable.

23. Método de la reivindicación 22, en que el dispositivo se selecciona del grupo formado por: un stent (endoprótesis), un catéter, una fibra, una fibra hueca, un parche y una sutura.

24. Método de la reivindicación 6, en que la mencionada superficie se selecciona del grupo formado por un lípido, una placa, un plato, una bolsa, una perla, una fibra y una malla.

25. Método de la reivindicación 1, en que el mencionado agente o ligando se selecciona del grupo formado por un anticuerpo o un fragmento de él que se una a un antígeno, un péptido, un polipéptido, un glicopéptido, un receptor soluble, un esteroide, una hormona, un mitógeno, un antígeno, un ligando, un superantígeno, un factor de crecimiento, una citocina, una lectina y una quimoquina.

26. Método de la reivindicación 25, en que como mínimo un ligando o un agente es un anticuerpo o un fragmento de él que se una a un antígeno.

27. Método de la reivindicación 25, en que como mínimo dos ligandos o agentes son un anticuerpo o un fragmento de él que se una a un antígeno.

28. Método de la reivindicación 25, en que estén presentes como mínimo dos ligandos o agentes y que son distintos anticuerpos o fragmentos de ellos que se unan a un antígeno.

29. Método de la reivindicación 25, en que como mínimo un ligando o agente es un anticuerpo anti-CD3, un anticuerpo anti-CD2 o un fragmento que se una a un antígeno de un anticuerpo anti-CD3 o anti-CD2.

30. Método de las reivindicaciones 25 o 29, en que como mínimo un ligando o agente es un anticuerpo anti-CD28 o un fragmento de él que se una a un antígeno.

31. Método de las reivindicaciones 25 o 29, en que como mínimo un ligando o agente es un ligando natural para CD28.

32. Método de la reivindicación 31, en que el mencionado ligando natural comprenda B7-1 o B7-2.

33. Método de la reivindicación 1, en que la mencionada superficie es una superficie de una partícula paramagnética.

34. Método de la reivindicación 1, en que la mencionada fuerza se selecciona del grupo formado por una fuerza superior a la fuerza de la gravedad, una fuerza hidráulica, una fuerza generada mediante presión transmembrana, una fuerza centrífuga y una fuerza magnética.

35. Método de la reivindicación 34, en que la fuerza magnética se genera mediante un imán que tiene una potencia de campo magnético que oscila entre aproximadamente 200 gauss a aproximadamente 12.000 gauss en la superficie del imán.