JP2023541705A - Ｔ細胞における生理学的発現のためのポリヌクレオチド - Google Patents
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Abstract
本発明は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含む免疫療法用のＴ細胞を産生するための改善された系に関する。
Description
本発明は、免疫療法用のＴ細胞を産生するための新たな技術に関する。特に、本発明は、キメラ抗原受容体（ｃｈｉｍｅｒｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ：ＣＡＲ）を含む免疫療法用のＴ細胞を産生するための改善された系を提供する。
エクスビボで産生された自己抗原特異的Ｔ細胞の移入を含む養子免疫療法は、ウイルス感染症及び癌を処置するための有望な戦略である。養子免疫療法に使用されるＴ細胞は、遺伝子操作による抗原特異的Ｔ細胞の増殖又はＴ細胞の再指示によって産生することができる。ウイルス抗原特異的Ｔ細胞の移入は、移植関連ウイルス感染症及びウイルス関連のまれな悪性新生物の処置に使用される、確立された方法である。同様に、腫瘍特異的Ｔ細胞の単離及び移入が黒色腫の処置に成功したことが証明されている。
トランスジェニックＴ細胞受容体又はキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）遺伝子移入によって、Ｔ細胞における新規の特異性がうまく産生された。ＣＡＲは、単一の融合分子中における１つ以上のシグナル伝達ドメインと会合した標的化部分からなる合成受容体である。概して、ＣＡＲの結合部分は、細胞内腔２５と、可撓性リンカーによって一緒に結合したモノクローナル抗体の可変フラグメントとを含む、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）の抗原結合ドメインからなる。受容体又はリガンドドメインに基づく結合部分もまた首尾よく使用されている。第１世代ＣＡＲのシグナル伝達ドメインは、Ｆｃ受容体又はＣＤ３ゼータ受容体ガンマ鎖の細胞質領域に由来する。第１世代ＣＡＲは、Ｔ細胞傷害性に首尾よく再指示することが証明されているが、しかしながら、第１世代ＣＡＲは、インビボでの長期増殖及び３０抗腫瘍活性を提供することができなかった。ＣＡＲ２改変Ｔ細胞の生存を改善し、増殖を増加させるために、ＣＤ２８、ＯＸ－４０（ＣＤ１３４）、及び４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）を含む共刺激分子のシグナル伝達ドメインを、単独で（第２世代）、又は組み合わせて（第３世代）添加した。ＣＡＲは、リンパ腫及び固形腫瘍を含む、異なる新生物の腫瘍細胞の表面上に発現される抗原に対してＴ細胞を首尾よく再指示することを可能にした。ほとんどのＢ細胞急性リンパ球性白血病（Ｂ－ｃｅｌｌ ａｃｕｔｅ ｌｙｍｐｈｏｂｌａｓｔｉｃ ｌｅｕｋｅｍｉａ：Ｂ－ＡＬＬ）５はＣＤ１９を均一に発現するが、一方でその発現は、非造血細胞、並びに骨髄細胞、赤血球、Ｔ細胞、及び骨髄幹細胞には存在しないので、ＣＤ１９は魅力的な免疫療法標的として提示されている。悪性Ｂ細胞腫瘍においてＣＤ１９を標的とする臨床試験が進行中であり、抗腫瘍応答が期待されている。それらのほとんどは、ＣＤ１９ ＦＭＣ６３特異的マウスモノクローナル抗体のｓｃＦｖ領域に由来する、特異性を有するキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するように遺伝子改変されたＴ細胞の注入を伴う。しかしながら、そのようなＣＡＲを発現する細胞が有意なレベルの臨床的利点に達することを可能にするために、Ｔ細胞増殖との改善された適合性を呈するようにＣＡＲ構築物を改善する必要性が依然として存在する。この意味において、かつ、ＣＡＲ－Ｔにより処置される患者にとって明らかな利益であるにもかかわらず、ＣＡＲを発現するために１５個の強力なプロモータを使用する現在の技術は、負の側面を有する。注入後の最初の数日間におけるＣＡＲ－Ｔ細胞の運動亢進に伴うサイトカイン放出症候群（ＳＲＣ）に主に起因する、患者の死を含む重篤な副作用が報告されている。更に、有意なパーセンテージの初期応答性患者は、投与されたＣＡＲ－Ｔ細胞の寿命（及び有効性）の低下の結果として再発した。Ｅｙｑｕｅｍ、Ｍａｎｓｉｌｌａ－Ｓｏｔｏら。２０は、ＴＲＡＣ遺伝子座のプロモータを介して導入遺伝子を発現するゲノム編集系を用いることによって、ＴＣＲ型発現がＣＡＲ－Ｔ細胞の抗白血病活性を改善することを既に証明している。しかしながら、ゲノム編集戦略は、臨床診療で実施するのが困難な高度に洗練された技術を使用する。
したがって、非常に正確な様式でＴＣＲの発現パターンを模倣し、Ｔ細胞活性化の８～２４時間後に導入遺伝子の発現の３～４倍の減少をもたらし、かつ４８～７２時間後にそれらの発現を再び回復させるポリヌクレオチドを開発することが必要である。
本発明者らは、ＴＣＲの発現パターンに従ってＣＡＲの発現を可能にし、非効率的な長期治療又はサイトカインストームなどの有害で生命を脅かす副作用に関連したＴ細胞の表面上における高い発現レベルを防止するシステムを開発した。本発明者らは、タンパク質レベル及びｍＲＮＡレベルの両方において、ＣＤ３／ＣＤ２８刺激後のＴＣＲの発現パターンを模倣するＣＡＲを発現するための良好な候補として、Ｂ２Ｍ遺伝子座の安定した発現及び制御領域を達成するための最良の系として、ＬＶ（レンチウイルス（ｌｅｎｔｉｖｉｒｕｓ）又はレンチウイルス（ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ））を選択した。
Ｂ２Ｍの制御領域に基づいて、本発明者らは、ＬＶ骨格への挿入を可能にする縮小サイズのＢ２Ｍ遺伝子座の制御領域の大部分を含む、２つの合成プロモータを作製した。
したがって、本発明の第１の態様は、配列番号１若しくは配列番号２の配列を含むか若しくはそれらのみからなるポリヌクレオチド、以下、本発明のポリヌクレオチド、又は少なくとも以下の配列番号１若しくは配列番号２と同一性を有する配列を含むか若しくはそれらのみからなるポリヌクレオチドに関する：
ａ．８０％
ｂ．８５％
ｃ．９０％
ｄ．９５％
ｅ．９９％
ａ．８０％
ｂ．８５％
ｃ．９０％
ｄ．９５％
ｅ．９９％
配列番号１
１１６１ｂｐ
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１１６１ｂｐ
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具体的には、Ｂ２Ｍ＿ＥＷＰ１ともまた称される配列番号１の本発明のポリヌクレオチドは、Ｂ２ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）フラグメントを含有する１１６１－ヌクレオチド配列である。
配列番号２
＞Ｂ２Ｍ＿ＥＷＰ２ １２６４ｂｐ
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＞Ｂ２Ｍ＿ＥＷＰ２ １２６４ｂｐ
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具体的には、Ｂ２Ｍ＿ＥＷＰ２ともまた称される配列番号２の本発明のポリヌクレオチドは、Ｂ２ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）フラグメントを含有する１２６４－ヌクレオチド配列である。
本発明のポリヌクレオチド（配列番号１又は配列番号２）のいずれかは、好ましくは、細胞におけるその安定な発現を可能にする目的でレンチウイルスベクターに含まれる。
膜貫通ポリペプチドを宿主細胞の分泌経路へと導くために、シグナル配列（また、リーダー配列、プレプロ配列、又はプレ配列としても知られる）を、本発明のポリヌクレオチド（配列番号１又は配列番号２）のいずれかの配列、又は前記ポリヌクレオチドを含む、レンチウイルスベクターなどのベクターの配列で提供することができる。分泌シグナル配列は膜貫通核酸配列へと作動可能に連結される、すなわち、２つの配列は、正しいリーディングフレームへと結合し、かつ新たに合成されたポリペプチドを宿主細胞の分泌経路へと導くように配置される。分泌シグナル配列は、通常、目的のポリペプチドをコードする核酸配列に対して５’に配置されるが、ある特定の分泌シグナル配列は、目的の核酸配列の任意の他の部分に配置することができる（例えば、Ｗｅｌｃｈ、米国特許第５，０３７，７４３号；Ｈｏｌｌａｎｄら、米国特許第５，１４３，８３０号を参照されたい）。当業者は、遺伝子コード変性を考慮して、これらのポリヌクレオチド分子の間でかなりの配列変異が可能であることを認識するであろう。好ましくは、本発明のポリヌクレオチドのいずれかの配列（配列番号１又は配列番号２）は、哺乳動物細胞における発現のために、好ましくはヒト細胞における発現のために最適化されたコドンを含み得る。コドン最適化とは、目的の配列において、所与の種の高発現遺伝子では概してまれであるコドンと、そのような種の高発現遺伝子では概して一般的であるコドンとの交換を指し、そのようなコドンは、交換されるコドンのようなアミノ酸をコードする。
したがって、本発明の別の態様は、本発明のポリヌクレオチド（配列番号１又は配列番号２）のいずれかを含む、遺伝子構築物、以下、本発明の遺伝子構築物に関する。好ましくは、本発明の遺伝子構築物は、ウイルスベクター、より好ましくはレンチウイルスベクターである。より好ましくは、本発明の遺伝子構築物は、その発現を駆動するためにＣＡＲの配列へと操作可能に結合した本発明のポリヌクレオチド（配列番号１又は配列番号２）のいずれかを含み、ここで、ＣＡＲは、少なくとも１つの細胞外リガンド結合ドメイン、膜貫通ドメイン、及び少なくとも１つの細胞内シグナル伝達ドメインを含む。
本発明の細胞
本発明の細胞
本発明の別の態様は、本発明のポリヌクレオチド（配列番号１若しくは配列番号２）のいずれかを含む細胞、以下、本発明の細胞、又は本発明のポリヌクレオチド（配列番号１若しくは配列番号２）のいずれかを次いで含む本発明の遺伝子構築物に関する。この態様の好ましい実施形態では、本発明の細胞は、免疫細胞である。より好ましくは、本発明の細胞集団が好ましい。
特定の実施形態では、本発明は、本発明のポリヌクレオチド（配列番号１若しくは配列番号２）のいずれか、又は本発明に係る遺伝子構築物若しくはベクターを、前記免疫細胞へと導入することと、前記細胞を増殖させることと、を含む、免疫療法のための免疫細胞の調製方法に関する。特定の実施形態では、本発明は、細胞を提供することと、前記細胞の表面上に少なくとも１つのＣＡＲを発現させることと、を含む、方法に関する。特定の実施形態では、本方法は、本発明のポリヌクレオチドの少なくともいずれか（配列番号１若しくは配列番号２）、又はＣＡＲの配列へと操作可能に結合した本発明のポリヌクレオチド（配列番号１若しくは配列番号２）のいずれかを含むベクター若しくは遺伝子構築物により、細胞を形質転換又は形質導入することと、かつ前記ポリヌクレオチドを前記細胞において発現させることと、を含む。換言すれば、好ましくは、細胞形質転換又は形質導入のために、本発明のポリヌクレオチド（配列番号１又は配列番号２）のいずれかを、目的のＣＡＲを含むベクターへとクローニングする。
別の実施形態では、前記方法は、ＴＣＲの構成成分、免疫抑制剤の標的、ＨＬＡ遺伝子、及び／又はＰＤ１若しくはＣＴＬＡ－４などの免疫チェックポイント遺伝子を発現する少なくとも１つの遺伝子を不活性化することによって、前記細胞を遺伝子改変する工程を更に含む。好ましい実施形態では、前記遺伝子は、ＴＣＲアルファ、ＴＣＲベータ、ＣＤ５２、ＧＲ、ＰＤ１、及びＣＴＬＡ－４からなる群より選択される。好ましい実施形態では、前記方法は、ＤＮＡ切断によって前記遺伝子を選択的に不活性化することができるレアカットエンドヌクレアーゼ（ｒａｒｅ－ｃｕｔｔｉｎｇ ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ）を、前記Ｔ細胞へと導入することを更に含む。より好ましい実施形態では、前記レアカットエンドヌクレアーゼは、ＴＡＬＥヌクレアーゼ又はＣａｓ９エンドヌクレアーゼである。
上記の異なる方法は、好ましくは、クローニングされた本発明のポリヌクレオチド（配列番号１又は配列番号２）を含む又は有する発現ベクターを用いた、細胞へのＣＡＲの導入を含む。非限定的な例として、前記ＣＡＲは、レンチウイルスベクターによってコードされる導入遺伝子として導入することができる。
免疫細胞
免疫細胞
本発明はまた、細胞を設計するための前記方法によって得ることができる単離された細胞又は細胞株に関する。特に、前記単離細胞は、少なくとも１つのＣＡＲ及びＢ２ミクログロブリンプロモータ、好ましくは本発明のポリヌクレオチド（配列番号１又は配列番号２）、特に配列番号１又は配列番号２のいずれかを含み、その発現を駆動するためにＣＡＲへと操作可能に結合している。別の実施形態では、前記単離細胞は、異なる細胞外リガンド結合ドメインを各々含む、発現を駆動するためにＣＡＲへと作動可能に連結された、Ｂ２ミクログロブリン遺伝子座のＣＡＲ及びプロモータ、特に配列番号１又は配列番号２の集団を含む。本発明の免疫細胞は、抗原結合メカニズムとは無関係に活性化され、増殖する。
単離された免疫細胞、好ましくは上記の方法のいずれかによって得られるＴ細胞もまた、本発明の範囲内に含まれる。前記免疫細胞は、自然免疫応答及び／又は適応免疫応答の開始及び／又は実行に機能的に関与する造血起源の細胞を指す。本発明に係る前記免疫細胞は幹細胞に由来し得る。幹細胞は、成体幹細胞、非ヒト胚性幹細胞、より具体的には非ヒト幹細胞、臍帯幹細胞、前駆細胞、骨髄幹細胞、人工多能性幹細胞、全能性幹細胞、又は造血幹細胞であり得る。代表的なヒト細胞はＣＤ３４＋細胞である。前記単離細胞はまた、樹状細胞、キラー樹状細胞、肥満細胞、ＮＫ細胞、Ｂ細胞、又はＴ細胞であり得る。好ましい実施形態では、炎症性Ｔリンパ球、細胞傷害性Ｔリンパ球、制御性Ｔリンパ球、又はヘルパーＴリンパ球からなる群より選択される、Ｔ細胞である。別の実施形態では、前記細胞は、ＣＤ４＋Ｔリンパ球及びＣＤ８＋Ｔリンパ球からなる群に由来し得る。本発明の細胞を増殖させ、かつ遺伝子改変する前に、細胞供給源を様々な方法によって対象から得ることができる。細胞は、末梢血単核球、骨髄、リンパ節の組織、臍帯血、胸腺の組織、感染部位の組織、腹水、胸水、脾臓の組織、及び腫瘍を含む、一連の非限定的な供給源から得ることができる。本発明のある特定の実施形態では、当業者に利用可能であり、かつ公知である、任意の数のＴ細胞株を使用することができる。別の実施形態では、前記細胞は、健康なドナー、癌と診断された患者、又は感染症と診断された患者に由来し得る。別の実施形態では、前記細胞は、異なる表現型特性を有する細胞の混合集団の一部である。本発明の範囲には、また、上記の方法に従って形質転換されたＴ細胞から得られる細胞株も包含される。免疫抑制処置に耐性であり、かつ前述の方法を用いて得ることができる改変細胞は、本発明の範囲内に包含される。
Ｔ細胞の活性化及び増殖
Ｔ細胞の活性化及び増殖
形質転換又は形質導入されたＴ細胞の産生の前又は後のいずれにおいても、たとえ本発明の改変された免疫細胞が抗原結合メカニズムとは無関係に活性化され、かつ増殖する場合であっても、免疫細胞、特に本発明のＴ細胞は、一般に、例えば、米国特許第６，３５２，６９４号；同第６，５３４，０５５号；同第６，９０５，６８０号；同第６，６９２，９６４号；同第５，８５８，３５８号；同第６，８８７，４６６号；同第６，９０５，６８１号；同第７，１４４，５７５号；同第７，０６７，３１８号；同第７，１７２，８６９号；同第７，２３２，５６６号；同第７，１７５，８４３号；同第５，８８３，２２３号；同第６，９０５，８７４号；同第６，７９７，５１４号；同第６，８６７，０４１号；及び米国特許出願公開第２００６０１２１００５号に記載される方法などの方法を用いて、更に活性化され、増殖され得る。Ｔ細胞はインビトロ又はインビボで増殖させることができる。一般に、本発明のＴ細胞は、Ｔ細胞の表面上のＣＤ３／ＴＣＲ複合体及び共刺激分子を刺激して、Ｔ細胞の活性化シグナルを作製する薬剤との接触によって増殖される。例えば、カルシウムイオノフォアＡ２３１８７、ホルボール１２－ミリスタート１３－アセタート（ＰＭＡ）、又はフィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）などの分裂促進性レクチンなどの化学物質を使用して、Ｔ細胞の活性化シグナルを作製することができる。
非限定的な例として、Ｔ細胞の集団は、表面に固定化された抗ＣＤ３抗体若しくはその抗原結合フラグメント若しくは抗ＣＤ２抗体との接触によって、又はカルシウムイオノフォアと一緒にプロテインキナーゼＣ活性化剤（例えば、ブリオスタチン）との接触によって、インビトロで刺激することができる。Ｔ細胞の表面上の補助分子の共刺激のために、補助分子に結合するリガンドが使用される。例えば、Ｔ細胞の集団を、Ｔ細胞増殖を刺激するのに好適な条件下において抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体と接触させることができる。Ｔ細胞を培養するのに適した条件としては、血清（例えば、ヒト又はウシ胎児血清）、インターロイキン－２（ＩＬ－２）、インスリン、ＩＦＮ－ｇ、１Ｌ－４、１Ｌ－７、ＧＭ－ＣＳＦ、－１０、－２、１Ｌ－１５、ＴＧＦ、及びＴＮＦ－、又は任意の他の細胞成長添加剤を含む、増殖及び生存に必要な因子を含有し得る好適な培地（例えば、最小必須培地又はＲＰＭＩ１６４０培地、又はＸ－ｖｉｖｏ５（Ｌｏｎｚａ））が挙げられる。他の細胞成長添加剤には、界面活性剤、プラスマネート、並びにＮ－アセチルシステイン及び２－メルカプトエタノールなどの還元剤が含まれるが、これらに限定されない。培地は、アミノ酸、ピルビン酸ナトリウム、及びビタミンが添加され、血清を含まないか、又は好適な量の血清（若しくは血漿）若しくは所定のホルモンセット、及び／又はＴ細胞の成長及び増殖に充分な量のサイトカインが補充されているかのいずれかである、ＲＰＭＩ１６４０、Ａ１Ｍ－Ｖ、ＤＭＥＭ、ＭＥＭ、ａ－ＭＥＭ、Ｆ－１２、Ｘ－Ｖｉｖｏ１、及びＸ－Ｖｉｖｏ２０を含むことができる。抗生物質、例えばペニシリン及びストレプトマイシンもまた、対象へと注入される細胞培養物ではなく、実験培養物に含まれる。標的細胞は、成長を支援するのに必要な条件下、例えば、好適な温度（例えば、３７℃）及び雰囲気（例えば、空気＋５％ＣＯ２）において維持される。数回の刺激時間にさらされたＴ細胞は、異なる特性を呈し得る。
別の特定の実施形態では、前記細胞は、組織又は細胞との共培養によって増殖させることができる。前記細胞はまた、例えば、前記細胞を対象へと投与した後、対象の血液中においてインビボで増殖させることができる。
本発明の組成物
本発明の組成物
本発明の別の態様は、本発明のポリヌクレオチドのいずれか（配列番号１又は配列番号２）を含む組成物、以下、本発明の組成物、本発明のポリヌクレオチドのいずれか（配列番号１又は配列番号２）を含む本発明の遺伝子構築物、又は本発明の細胞に関する。好ましい実施形態では、本発明の組成物は、薬学的に許容されるビヒクルを更に含む。別の好ましい実施形態では、本発明の組成物は、医薬組成物である。別の好ましい実施形態では、本発明の組成物は、１つ以上の追加の活性成分を含む。
本発明の医学的利用
本発明の医学的利用
本発明の別の態様は、治療におけるその使用のための、本発明のポリヌクレオチドのいずれか（配列番号１又は配列番号２）、本発明の遺伝子構築物、本発明の細胞、又は本発明の組成物に関する。
本発明の別の態様は、癌の処置のための、本発明のポリヌクレオチドのいずれか（配列番号１又は配列番号２）、本発明の遺伝子構築物、本発明の細胞、又は本発明の組成物に関する。好ましい実施形態では、癌は、新生物、Ｂ細胞新生物、リンパ腫、白血病、及び／又は骨髄腫からなる群より選択される。
上記のような異なる方法によって得られた単離細胞又は前記単離細胞に由来する細胞株は、医薬品として使用することができる。別の実施形態では、前記医薬品は、癌の処置、特にそれを必要とする患者のＢ細胞リンパ腫及び白血病の処置に使用することができる。別の実施形態では、本発明に係る前記単離細胞又は前記単離細胞に由来する細胞株は、それを必要とする患者の癌を処置するための医薬品の製造に使用することができる。
別の態様では、本発明は、それを必要とする患者を処置する方法に基づいており、前記方法は、以下の工程の少なくとも１つを含む：
（ａ）本発明のポリヌクレオチドのいずれか（配列番号１又は配列番号２）、本発明の遺伝子構築物、本発明の細胞、又は本発明の組成物、及び好ましくは、上記の方法のいずれかによって得ることができる免疫細胞を提供すること；
（ｂ）本発明のポリヌクレオチドのいずれか（配列番号１若しくは配列番号２）、本発明の遺伝子構築物、本発明の細胞、若しくは本発明の組成物、又はより好ましくは形質転換された免疫細胞を、前記患者に投与すること。
（ａ）本発明のポリヌクレオチドのいずれか（配列番号１又は配列番号２）、本発明の遺伝子構築物、本発明の細胞、又は本発明の組成物、及び好ましくは、上記の方法のいずれかによって得ることができる免疫細胞を提供すること；
（ｂ）本発明のポリヌクレオチドのいずれか（配列番号１若しくは配列番号２）、本発明の遺伝子構築物、本発明の細胞、若しくは本発明の組成物、又はより好ましくは形質転換された免疫細胞を、前記患者に投与すること。
一実施形態では、本発明の前記Ｔ細胞は、インビボで固体Ｔ細胞増殖を受けることができ、かつ長期間持続することができる。
前記処置は、対症的、治癒的、又は予防的であり得る。前記処置は、自己免疫療法の一部又は同種免疫療法治療の一部であり得る。自己とは、患者を処置するために使用される細胞、細胞株、又は細胞集団が、前記患者に由来することを意味する。同種異系とは、患者を処置するために使用される細胞又は細胞集団が、前記患者に由来せず、むしろドナーに由来することを意味すると理解される。
記載された方法で使用することができる細胞は前のセクションに記載されている。処置は癌と診断された患者を処置するために使用することができる。処置され得る癌は、非固形腫瘍（とりわけ、プレＢ ＡＬＬ（小児適応症）、成人ＡＬＬ、マントル細胞リンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫などを含む、血液腫瘍など）を含み得る。本発明のＣＡＲで処置される癌の種類は、特定のリンパ系新生物又は白血病が含まれるが、これらに限定されない。成人腫瘍／癌及び小児腫瘍／癌もまた含まれる。これは、抗体療法、化学療法、サイトカイン療法、樹状細胞療法、遺伝子療法、ホルモン療法、レーザー光療法、及び放射線療法の群から選択される１つ以上の癌療法と組み合わせた処置であり得る。
本発明の好ましい実施形態によれば、前記治療は、免疫抑制処置を受けた患者へと投与することができる。実際、本発明は、好ましくは、そのような免疫抑制剤の受容体をコードする遺伝子の不活性化に起因する少なくとも１つの免疫抑制剤に対して耐性にされた、細胞又は細胞集団に基づく。この態様では、免疫抑制処置は、患者の体内の本発明に係るＴ細胞の選択及び増殖に役立つはずである。
本発明に係る細胞又は細胞集団は、エアロゾル吸入、注射、摂取、輸血、インプラント、又は移植によってさえ、任意の好都合な様式で投与することができる。本明細書に記載の組成物は、患者に皮下、皮内、腫瘍内、結節内、髄内注射、筋肉内、静脈内注射若しくはリンパ内注射、又は腹腔内投与することができる。一実施形態では、本発明の細胞組成物は、好ましくは静脈内注射によって投与される。
細胞又は細胞集団の投与は、１０４～１０９細胞／ｋｇ体重、好ましくは１０５～１０６細胞／ｋｇ体重（これらの範囲内の細胞数の全ての整数値を含む）の投与からなり得る。細胞又は細胞集団は１つ以上の用量で投与することができる。別の実施形態では、前記有効量の細胞は、単回用量として投与される。別の実施形態では、前記有効量の細胞は、ある期間にわたって２回以上の用量として投与される。投与時間は主治医の裁量であり、患者の臨床状態に依存する。細胞又は細胞集団は、患者自身を含む、血液、バンク、又はドナーなどの任意の供給源から得ることができる。個々の必要性は様々であるが、特定の疾患又は状態に対する有効量である所与の種類の細胞の最適範囲の決定は、当業者の知識の範囲内である。
有効量とは、治療的又は予防的利益を提供する量を意味する。
投与される用量は、意図される患者の年齢、健康状態、及び体重、もしあれば同時処置の種類、処置の頻度、並びに所望の効果の性質に依存する。別の実施形態では、前記有効量の細胞又はそれらの細胞を含む組成物は、非経口投与される。前記投与は静脈内投与であり得る。前記投与は、腫瘍への注射によって直接行うことができる。
本発明のある特定の実施形態では、細胞は、とりわけ、抗ウイルス薬、シドホビル及びインターロイキン－２、シタラビン（ＡＲＡ－Ｃとしてもまた知られる）、又はナタリジイマブ療法などの薬剤による処置、ＭＳ患者の処置、又は乾癬患者のエファリズマブ処置、又はＰＭＬ患者の他の処置を含む、任意の数の治療形態と一緒に（例えば、前、同時、又は後に）患者へと投与される。他の実施形態では、本発明のＴ細胞は、化学療法、放射線、シクロスポリン、アザチオプリン、メトトレキサート、ミコフェノール酸、及びＦＫ５０６などの免疫抑制剤、ＣＡＭ ＰＡＴＨなどの抗体若しくは他の免疫除去剤、抗ＣＤ３抗体、又は他の抗体、シトキシン、フルダラビン、シクロスポリン、ＦＫ５０６、ラパマイシン、ミコプリエノール酸、ステロイド、ＦＲ９０１２２８、サイトカイン、及び照射療法と組み合わせて使用することができる。これらの薬物は、カルシウム－カルシニューリン依存性ホスファターゼ（シクロスポリン及びＦＫ５０６）を阻害するか、又は因子（ラパマイシン）誘発性シグナル伝達成長に重要なｐ７０Ｓ６キナーゼを阻害する（Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎ，Ｎａｙａら、１９９１年；Ｌｉｕ，Ａｌｂｅｒｓら、１９９２年；Ｂｉｅｒｅｒ，Ｈｏｌｌａｎｄｅｒら、１９９３年）。更なる実施形態では、本発明の細胞組成物は、骨髄移植、フルダラビンなどの化学療法剤を用いる切除Ｔ細胞療法、体外照射療法（ＸＲＴ）、シクロホスファミド、又はＯＫＴ３若しくはＣＡＭＰＡＴＨなどの抗体と共に（例えば、前、同時、又は後に）患者へと投与される。別の実施形態では、本発明の細胞組成物は、ＣＤ２０と反応する薬剤、例えばリツキサンなどの切除Ｂ細胞療法の後に投与される。例えば、一実施形態では、対象は、標準的な高用量化学療法処置に供され、その後、末梢血幹細胞移植に供され得る。ある特定の実施形態では、対象は、移植後に本発明の増殖免疫細胞の注入を受ける。更なる実施形態では、増殖させた細胞は、手術の前又は後に投与される。
他の定義
他の定義
－特に明記しない限り、「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」、及び「少なくとも１つ」は、交換可能に使用され、１つ以上を意味する。
－ポリペプチド配列中のアミノ酸残基は、本明細書では、例えば、ＱがＧｌｎ又はグルタミン残基を意味し、ＲがＡｒｇ又はアルギニン残基を意味し、ＤがＡｓｐ又はアスパラギン酸残基を意味する、一文字コードに従って指定される。
－アミノ酸置換は、あるアミノ酸残基を別のアミノ酸残基で置換することを意味し、例えば、ペプチド配列におけるアルギニン残基のグルタミン残基での置換とは、アミノ酸置換である。
－ヌクレオチドは以下のように指定される：一文字コードはヌクレオシドの塩基を指定するために使用される：ａはアデニンであり、ｔはチミンであり、ｃはシトシンであり、ｇはグアニンである。縮重ヌクレオチドの場合、ｒはｇ又はａ（プリンヌクレオチド）を表し、ｋはｇ又はｔを表し、ｓはｇ又はｃを表し、ｗはａ又はｔを表し、ｍはａ又はｃを表し、ｙはｔ又はｃ（ピリミジンヌクレオチド）を表し、ｄはｇ、ａ、又はｔを表し、ｖはｇ、ａ、又はｃを表し、ｂはｇ、ｔ、又はｃを表し、ｈはａ、ｔ、又はｃを表し、ｎはｇ、ａ、ｔ、又はｃを表す。
本明細書で使用される場合、「核酸」又は「ポリヌクレオチド」は、ヌクレオチド及び／又はポリヌクレオチド、例えば、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）又はリボ核酸（ＲＮＡ）、オリゴヌクレオチド、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって産生されたフラグメント、並びにライゲーション、切断、エンドヌクレアーゼ作用、及びエキソヌクレアーゼ作用によって産生されたフラグメントなどを指す。核酸分子は、天然に存在するヌクレオチド（ＤＮＡ及びＲＮＡなど）、又は天然ヌクレオチド類似体（例えば、天然ヌクレオチドのエナンチオマー形態）、又は両方の組合せである、モノマーで構成することができる。修飾ヌクレオチドは、糖及び／又はピリミジン又はプリン塩基部分に変化を有し得る。糖の修飾としては、例えば、１つ以上のヒドロキシル基をハロゲン、アルキル基、アミン基、及びアジド基で置換することが挙げられ、又は糖をエーテル若しくはエステルとして官能化することができる。更に、糖画分全体を、アザ糖及び炭素環式糖類似体などの立体的及び電子的に類似の構造で置き換えることができる。塩基部分の修飾の例としては、アルキル化プリン及びピリミジン、アシル化プリン若しくはピリミジン、又は他の周知の複素環置換が挙げられた。核酸モノマーは、ホスホジエステル結合又は前記結合の類似体によって結合することができる。核酸は一本鎖又は二本鎖であり得る。
－キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）は、標的細胞中に存在する構成成分に対する結合ドメイン、例えば所望の抗原（例えば、腫瘍抗原）に対する抗体ベースの特異性を、特異的抗標的細胞免疫を呈するキメラタンパク質を産生するために細胞内ドメイン受容体を活性化するＴ細胞受容体と組み合わせる分子を意味するものと理解される。概して、ＣＡＲは、Ｔ細胞抗原受容体（ｓｃＦｖ）複合体のゼータ鎖の細胞内シグナル伝達ドメインに融合された一本鎖細胞外抗体（ｓｃＦｖ）からなり、Ｔ細胞で発現される場合、モノクローナル抗体特異性に基づいて抗原認識を再指示することができる。
－「送達ベクター（単数）」又は「送達ベクター（複数）」は、本発明で必要とされる化学剤／物質及び分子（タンパク質又は核酸）を細胞又は細胞内区画へと細胞接触させる（すなわち、「接触する」）又は放出する（すなわち、「導入する」）ために、本発明で使用することができる任意の送達ベクターを意味すると理解される。それには、リポソーム放出ベクター、ウイルス放出ベクター、薬物放出ベクター、化学的担体、ポリマー担体、リポプレックス、ポリプレックス、デンドリマー、マイクロバブル（超音波造影剤）、ナノ粒子、エマルジョン、又は他の好適な移入ベクターが含まれるが、これらに限定されない。これらの放出ベクターは、分子、化学物質、高分子（遺伝子、タンパク質）、又はプラスミド、ペプチドなどの他のベクターの供給を可能にする。これらの場合、投与ベクターは分子担体である。「放出ベクター（単数）」又は「放出ベクター（複数）」はまた、トランスフェクションを行うことを意図した放出方法を意味するものと理解される。
－「ベクター（単数）」又は「ベクター（複数）」という用語は、それが連結されている別の核酸を輸送することができる核酸分子を指す。本発明における「ベクター」には、ウイルスベクター、プラスミド、ＲＮＡベクター、又は染色体分子、非染色体分子、半合成分子、若しくは合成核酸からなり得る線状若しくは環状ＤＮＡ若しくはＲＮＡ分子が含まれるが、これらに限定されない。好ましいベクターは、自律複製（エピソーマルベクター）及び／又はそれらが連結されている核酸の発現（発現ベクター）が可能なものである。多数の好適な市販のベクターが当業者に公知である。
ウイルスベクターとしては、レトロウイルス、アデノウイルス、パルボウイルス（例えば、アデノ随伴ウイルス）、コロナウイルス、例えばオルトミクソウイルス（例えば、インフルエンザウイルス）、ラブドウイルス（例えば、狂犬病及び水疱性口内炎ウイルス）、パラミクソウイルス（例えば、はしか及びセンダイ）などの負鎖ＲＮＡウイルス、例えばピコルナウイルス及びアルファウイルスなどの正鎖ＲＮＡウイルス、並びにアデノウイルス、ヘルペスウイルス（例えば、単純ヘルペスウイルス１型及び２型、エプスタインバー・ウイルス、サイトメガロウイルス）、及びポックスウイルス（例えば、ワクシニア、鶏痘、及びカナリア痘）を含む二本鎖ＤＮＡウイルスが挙げられる。他のウイルスとしては、例えば、ノーウォークウイルス、トガウイルス、フラビウイルス、レオウイルス、パポバウイルス、ヘパドナウイルス、及び肝炎ウイルスが挙げられる。レトロウイルスの例としては、トリ白血病・肉腫ウイルス、哺乳動物Ｃ型ウイルス、Ｂ型ウイルス、Ｄ型ウイルス、ＨＴＬＶＢＬＶ群、レンチウイルス、スプーマウイルスが挙げられる（Ｃｏｆｆｉｎ，Ｊ．Ｍ．、「Ｒｅｔｒｏｖｉｒｉｄａｅ：Ｔｈｅ ｖｉｒｕｓｅｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ」、Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ中、第３版、Ｂ．Ｎ．Ｆｉｅｌｄｓら編、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ－Ｒａｖｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ、１９９６年）。
－「レンチウイルスベクター」は、ＨＩＶベースのレンチウイルスベクターを意味するものと理解され、これは、比較的大きなパッケージング容量、免疫原性の低下、及び広範囲の異なる細胞型を高効率で安定に形質導入する能力に起因して、放出が非常に有望である。レンチウイルスベクターは、典型的には、プロデューサ細胞への３つ（パッケージング、包装、及び移送）以上のプラスミドの一過性トランスフェクション後に産生される。ＨＩＶと同様に、レンチウイルスベクターは、ウイルス表面糖タンパク質と細胞表面上の受容体との相互作用を介して標的細胞に入る。侵入すると、ウイルスＲＮＡは、ウイルス逆転写酵素複合体によって媒介される逆転写に供される。逆転写の生成は、感染細胞のＤＮＡにおけるウイルス組込みのための基質である、二本鎖線状ウイルスＤＮＡである。「組込み型レンチウイルスベクター（又はＬＶ）」は、例えば、限定されないが、標的細胞のゲノムを組み込むことができるベクターなどのベクターを意味するものと理解される。対照的に、「非組込み型レンチウイルスベクター（又はＮＩＬＶ）」は、ウイルスインテグラーゼの作用によって標的細胞のゲノムを組み込まない、効率的な遺伝子送達ベクターを指す。
－ベクター及び放出ベクターは、ソノポレーション若しくはエレクトロポレーション又はこれらの技術の誘導体などの任意の細胞透過処理技術を用いて、互いに会合又は組み合わせることができる。
－１つ又は複数の細胞は、インビトロ培養のためのこれらの生物に由来する任意の真核生物生細胞、初代細胞及び細胞株を意味するものと理解される。
「初代細胞（単数）」又は「初代細胞（複数）」は、生組織（すなわち、生検材料）から直接抽出され、インビトロでの成長のために確立された細胞、非常に少ない集団倍加を受けた細胞を意味すると理解され、したがって、連続的な腫瘍形成性又は人工的に不死化された細胞株と比較して、それらが由来する組織の主な構成成分及び特性をより代表する。
非限定的な例として、ＣＨＯ－Ｋ１細胞；ＨＥＫ２９３細胞；Ｃａｃｏ２細胞；Ｕ２－ＯＳ細胞；ＮＩＨ３Ｔ３細胞；ＮＳＯ細胞；ＳＰ２細胞；ＣＨＯ－Ｓ細胞；ＤＧ４４細胞；Ｋ－５６２細胞，Ｕ－９３７細胞；ＭＲＣ５細胞；ＩＭＲ９０細胞；Ｊｕｒｋａｔ細胞；ＨｅｐＧ２細胞；ＨｅＬａ細胞；ＨＴ－１０８０細胞；ＨＣＴ－１１６細胞；Ｈｕ－ｈ７細胞；Ｈｕｖｅｃ細胞；Ｍｕｄａ４細胞からなる群からの細胞株を選択することができる。
これらの細胞株は全て、目的の遺伝子又はタンパク質を生成、発現、定量、検出、研究するための細胞株モデルを提供するために、本発明の方法によって改変することができる。これらのモデルはまた、非限定的な例として、研究及び生成において、並びに化学、バイオ燃料、治療及び農学などの様々な分野において関心のある生物学的に活性な分子を選択するために使用することができる。
－「突然変異」は、ポリヌクレオチド（ｃＤＮＡ、遺伝子）又はポリペプチド配列中の最大１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、２０個、２５個、３０個、４０個、５０個まで、又はそれ以上のヌクレオチド／アミノ酸の置換、欠失、挿入を意味するものと理解される。突然変異は、遺伝子のコード配列又はその制御性配列に影響を及ぼし得る。それはまた、ゲノム配列の構造、又はコードされるｍＲＮＡの構造／安定性に影響を及ぼし得る。
「バリアント（複数可）」は、親分子のアミノ酸配列中の少なくとも１つの残基の突然変異又は置換によって得られる反復バリアント、バリアント、ＤＮＡ結合バリアント、ＴＡＬＥヌクレアーゼバリアント、ポリペプチドバリアントを意味するものと理解される。
－「機能的バリアント」は、タンパク質又はタンパク質ドメインの触媒的に活性な変異体を意味するものと理解される。前記変異体は、その親タンパク質若しくはタンパク質ドメインと比較して同じ活性、又は更なる特性、又はより高い若しくはより低い活性を有し得る。
－「同一性」とは、２つの核酸分子又はポリペプチド間の配列同一性を指す。同一性は、比較目的のためにアラインメントされ得る各配列中の位置を比較することによって決定され得る。比較される配列中の位置が同じ塩基によって占められる場合、分子はその位置で同一である。核酸又はアミノ酸配列間の類似性又は同一性の程度は、核酸配列によって共有される位置における同一又は一致するヌクレオチドの数に基づく。ＧＣＧ配列分析パッケージ（ウィスコンシン大学マディソン校、ウィスコンシン州）の一部として入手可能なＦＡＳＴＡ又はＢＬＡＳＴを含む、様々なアライメントアルゴリズム及び／又はプログラムを使用して、２つの配列間の同一性を計算することができ、例えば、所定の構成で使用することができる。例えば、本明細書に記載の特定のポリペプチドに対して少なくとも７０％、８５％、９０％、９５％、９８％、又は９９％の同一性を有し、かつ、好ましくは実質的に同じ機能を呈するポリペプチド、並びにそのようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが企図される。
－「類似性」は、２つ以上のポリペプチドのアミノ酸配列間の関係を表す。ＢＬＡＳＴＰはまた、ＢＬＯＳＵＭ４５、ＢＬＯＳＵＭ６２、又はＢＬＯＳＵＭ８０などの類似性マトリックスを用いて、参照アミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８７．５％、９０％、９２．５％、９５％、９７．５％、９８％、９９％の配列類似性を有するアミノ酸配列を同定するために使用することができる。別段の指示がない限り、類似性スコアはＢＬＯＳＵＭ６２の使用に基づく。ＢＬＡＳＴＰが使用される場合、類似性のパーセンテージはＢＬＡＳＴＰ陽性スコアに基づき、配列同一性のパーセンテージはＢＬＡＳＴＰ同一性スコアに基づく。ＢＬＡＳＴＰ「同一性」とは、同一である高スコア配列対中の全残基の数及び割合を示す；ＢＬＡＳＴＰ「陽性」とは、アライメントスコアが正の値を有し、互いに類似している残基の数及び割合を示す。本明細書に記載のアミノ酸配列との、これらの同一性若しくは類似性の程度、又は任意の同一性若しくは類似性の中間の程度を有するアミノ酸配列が、本開示によって企図され、包含される。類似のポリペプチドのポリヌクレオチド配列は、遺伝暗号を用いて推定され、従来の手段によって得ることができる。この種類の機能的バリアントをコードするポリヌクレオチドは、遺伝コードを用いてそのアミノ酸配列を逆翻訳することによって生成されるであろう。
「シグナル伝達ドメイン」又は「共刺激リガンド」は、Ｔ細胞中の類似する共刺激分子に特異的に結合し、例えば、ペプチドを負荷したＭＨＣ分子とのＴＣＲ／ＣＤ３複合体の結合によって提供される一次シグナルに加えて、増殖活性化、分化などを含むがこれらに限定されないＴ細胞応答を媒介するシグナルを提供する、抗原提示細胞中の分子を指す。共刺激リガンドとしては、とりわけ、ＣＤ７、Ｂ７－１（ＣＤ８０）、Ｂ７－２（ＣＤ８６）、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ２、４－１ＢＢＬ、ＯＸ４０Ｌ、誘導性共刺激リガンド（ＩＣＯＳ－Ｌ）、細胞接着分子（ＩＣＡＭ）、ＣＤ３０Ｌ、ＣＤ４０、ＣＤ７０、ＣＤ８３、ＨＬＡ－Ｇ、ＭＩＣＡ、Ｍ１ＣＢ、ＨＶＥＭ、リンホトキシンベータ受容体、３／ＴＲ６、ＩＬＴ３、ＩＬＴ４、Ｔｏｌｌリガンド受容体結合アゴニスト又は抗体、及びＢ７－Ｈ３に特異的に結合するリガンドを挙げることができる。共刺激リガンドはまた、とりわけ、Ｔ細胞中に存在する共刺激分子に特異的に結合する抗体、例えば、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４－ＩＢＢ、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ－１、ＩＣＯＳ、リンパ球機能関連抗原－１（ＬＦＡ－１）、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＴＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７－Ｈ３、ＣＤ８３に特異的に結合するリガンドなども包含するが、これらに限定されない。
「共刺激分子」は、共刺激リガンドに特異的に結合し、それによって増殖などの細胞の共刺激応答を媒介するＴ細胞中の同族結合パートナーを指すが、これに限定されない。共刺激分子には、ＭＨＣクラスＩ分子、ＢＴＬＡ、及びＴｏｌｌリガンド受容体が含まれるが、これらに限定されない。
本明細書で使用される場合、「共刺激シグナル」とは、ＴＣＲ／ＣＤ３ライゲーションなどの一次シグナルと組み合わせて、Ｔ細胞増殖及び／又は重要な分子の上方制御若しくは下方制御をもたらすシグナルを指す。
－本明細書で使用される場合、「細胞外リガンド結合ドメイン」という用語は、リガンドに結合することができるオリゴ又はポリペプチドとして定義される。好ましくは、ドメインは、細胞表面分子と相互作用することができる。例えば、細胞外リガンド結合ドメインは、特定の疾患状態に関連した標的細胞において細胞表面マーカーとして作用するリガンドを認識するように選択され得る。その意味で、リガンドとして作用し得る細胞表面マーカーの例としては、ウイルス、細菌、及び寄生虫感染症、自己免疫疾患、並びに癌細胞に関連したものが挙げられる。
本明細書で使用される場合、「対象」又は「患者」という用語は、非ヒト霊長類及びヒトを含む動物界の全てのメンバーを含む。
本発明の前述の説明は、元の説明の一部である、特に添付の特許請求の範囲の目的のために、当業者が本発明を作成及び使用することを可能にする。
本明細書で数値の限界又は範囲が示される場合、端点が含まれる。更に、数値の限界又は範囲内の全ての値及び部分範囲は、あたかも明示的に述べられているかのように具体的に含まれる。
好ましい実施形態に対する様々な修正は、当業者には容易に明らかであり、本明細書で定義される一般的な原理は、本発明の精神及び範囲から逸脱することなく他の実施形態及び用途に適用され得る。したがって、本発明は、示されている実施形態に限定されることを意図するものではなく、本明細書に記載の原理及び特徴に従って最も広い範囲が与えられるべきである。
本発明を一般的に説明してきたが、例示目的のためだけに本明細書で提供され、特に明記しない限り限定することを意図しない特定の具体例を参照することによって、更なる理解を得ることができる。
本明細書で具体的に定義されない限り、使用される全ての技術用語及び科学用語は、遺伝子療法、生化学、遺伝学、及び分子生物学の分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に記載の方法及び材料と類似又は同等の全ての方法及び材料を、本発明の実施又は試験に使用することができ、好適な方法及び材料を本明細書に記載する。本明細書で言及される全ての刊行物、特許出願、特許、及び他の参考文献は、その全体が参照により組み込まれる。矛盾する場合、定義を含む本明細書が優先される。更に、材料、方法、及び実施例は、単に例示的なものであり、特に明記しない限り、限定することを意図しない。別段の指示がない限り、本発明の実施は、当業者の知識の範囲内にある従来の細胞生物学、細胞培養、分子生物学、トランスジェニック生物学、微生物学、組換えＤＮＡ、及び免疫学技術を使用する。そのような技術が文献で充分に説明されている。例えば、「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」（Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ Ｍ．、ＡＵＳＵＢＥＬ、２０００年、Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ Ｉｎｃ、Ｌｉｂｒａｒｙ ｏｆ Ｃｏｎｇｒｅｓｓ、ＵＳＡ）；「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」、第３版（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、２００１年、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）；「Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ編、１９８４年）；Ｍｕｌｌｉｓら、米国特許第４，６８３，１９５号；「Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ」（Ｂ．Ｄ．Ｈａｒｒｉｅｓ及びＳ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編、１９８４年）；「Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ａｎｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ」（Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ及びＳ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編、１９８４年）；「Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ」（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ、Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．、１９８７年）；「Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｃｅｌｌｓ Ａｎｄ Ｅｎｚｙｍｅｓ」（ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ、１９８６年）；Ｂ．Ｐｅｒｂａｌ、「Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ Ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ」（１９８４年）；シリーズ「Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ」（Ｊ．Ａｂｅｌｓｏｎ及びＭ．Ｓｉｍｏｎ編、－ｉｎ－ｃｈｉｅｆ、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）、具体的には第１５４巻及び第１５５巻（Ｗｕら編）並びに第１８５巻、「Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ」（Ｄ．Ｇｏｅｄｄｅｌ編）；「Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｖｅｃｔｏｒｓ Ｆｏｒ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌｓ」（Ｊ．Ｈ．Ｍｉｌｌｅｒ及びＭ．Ｐ．Ｃａｌｏｓ編、１９８７年、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）；「Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｃｅｌｌ Ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」（Ｍａｙｅｒ及びＷａｌｋｅｒ編、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｌｏｎｄｏｎ、１９８７年）；「Ｈａｎｄｂｏｏｋ Ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」、第Ｉ～ＩＶ巻（Ｄ．Ｍ．Ｗｅｉｒ及びＣ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ編、１９８６年）；並びに、「Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ ｔｈｅ Ｍｏｕｓｅ Ｅｍｂｒｙｏ」（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．、１９８６年）を参照されたい。
概要
１．ＴＣＲシグナル伝達経路に関与する異なる分子のキメラプロモータのインシリコ産生。
１．ＴＣＲシグナル伝達経路に関与する異なる分子のキメラプロモータのインシリコ産生。
ａ．ＴＣＲシグナル伝達経路に関与した分子の選択。
ｂ．選択された分子の発現及びプロモータ機能に関与した調節エレメントのデータベース検索。
ｃ．インシリコでの最終構築物の設計。
２．ｅＧＦＰが異なるキメラプロモータの制御下において発現される、ｅＧＦＰ＋Ｔ細胞の産生。
２．ｅＧＦＰが異なるキメラプロモータの制御下において発現される、ｅＧＦＰ＋Ｔ細胞の産生。
ａ．ＧＦＰを用いたレンチウイルスベクターへのプロモータ配列のクローニング。
ｂ．異なる構築物を用いたレンチウイルスベクターの生成。
ｃ．ウイルスベクターによる細胞形質導入、並びにｍＲＮＡレベル及びタンパク質レベルの両方でのＧＦＰ発現動態の研究。
３．ＣＡＲが異なるキメラプロモータの制御下において発現される、ＣＡＲ－ＣＤ１９ Ｔ細胞の産生。
３．ＣＡＲが異なるキメラプロモータの制御下において発現される、ＣＡＲ－ＣＤ１９ Ｔ細胞の産生。
ａ．ＣＡＲ含有レンチウイルス骨格へのプロモータ配列のクローニング。
ｂ．異なる構築物を用いたレンチウイルスベクターの生成。
ｃ．ウイルスベクターによる細胞形質導入、並びにｍＲＮＡレベル及びタンパク質レベルの両方でのＣＡＲ発現動態の研究。
材料及び方法
１．キメラプロモータの設計
材料及び方法
１．キメラプロモータの設計
Ｇｅｎｅｃｏｐｏｅｉａ（ｃｈｒ１５：４５００２４４９－４５００３７０６）で定義されるプロモータを含有する構築物（Ｂ２Ｍ）を産生した。ＥＰＤ（ｃｈｒ１５：４５００３６６６－４５００３７２５）で定義されるプロモータ及びＳｗｉｔｃｈｇｅａｒで定義されるプロモータ３もまた、下流に加えた。これら２つのプロモータは、Ｂ２Ｍのエクソン１と部分的に重複する。エンハンサとしてＥｎｓｅｍｂｌによって定義される領域（ｃｈｒ１５：４５００４６９９－４５００４９９８）を下流に配置し、エクソン２と重複するＳｗｉｔｃｈｇｅａｒにより定義された別のプロモータを３’領域に配置した。Ｂ２Ｍ ＴｅｔＯ構築物は同一であるが、ＴｅｔＯ配列がＴＳＳの下流に配置されているのに対して、Ｂ２Ｍ Ｅｎｈ５’構築物では、Ｅｎｓｅｍｂｌによって定義されるエンハンサの位置が３’領域から５’領域に変更された。
２．ベクターの分子クローニング
２．ベクターの分子クローニング
構築物を２０μＬの超純水中で滅菌条件下において再構成した。
ａ．キメラプロモータを有するＳＥＷＰプラスミド
ａ．キメラプロモータを有するＳＥＷＰプラスミド
ＳＥＷＰは、ＳＦＦＶ（脾臓病巣形成ウイルス）ウイルスプロモータの制御下においてｅＧＦＰの発現を可能にするプラスミドである。このプラスミド（実験室で入手可能）を修飾して、プロモータをキメラ構築物で置換した。全ての構築物の複合消化を、ＢａｍＨＩ及びＥｃｏＲＩ制限酵素（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）により、緩衝液２．１（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を用いて、３７℃で１．５時間行った。超高純度アガロースゲル電気泳動を行い、ＱＩＡｑｕｉｃｋ（登録商標）Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）によってバンドを単離した。同時に、ＳＥＷＰ骨格を同じ酵素で消化して、プロモータを含まないフラグメントを得た。プロモータを、７：１のインサート：ベクター比でＴ４ ＤＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を用いて、ＳＥＷＰフラグメントとライゲーションした。反応を１６℃で一晩行った。コンピテントな大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｓｔｂｌ３細菌（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）をライゲーション生成物で形質転換し、以下のプログラムを用いてコロニーＰＣＲによって陽性コロニーを確認した：１倍（９５℃、１０分）；３５倍（９５℃、３０秒／６２℃、３０秒／７２℃、３０秒）；ＫＡＰＡ Ｔａｑ ＰＣＲキット（Ｋａｐａ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）及び以下のプライマー（Ｓｉｇｍａ）によって１倍（７２℃、１０分）：順方向ｃＰＰＴ（５’－ＡＣＡＧＣＡＧＡＧＡＴＣＣＡＧＴＴＴＧＧ－３’）及び逆方向ｅＧＦＰ（５’－ＴＣＡＣＴＣＴＣＧＧＣＡＴＧＧＡＣＧ－３’）（図５）。Ｗｉｚａｒｄ（登録商標）Ｐｌｕｓ ＳＶ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ ＤＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍキット（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いたミニプレップをライゲーション陽性コロニーについて行い、プラスミドＤＮＡをＨｉｎｄＩＩＩパターン及びシーケンシングによって確認した。
ｂ．キメラプロモータを有するＣＡＲ ３Ｇ
ｂ．キメラプロモータを有するＣＡＲ ３Ｇ
目的のプラスミドは、ＥＦ１－α（伸長因子１－α）プロモータを有する第３世代抗ＣＤ１９ ＣＡＲ（Ｃｒｅａｔｉｖｅ Ｂｉｏｌａｂｓ）から産生した。４つの構築物、すなわち、ＣＤ２４７、ＬＣＫ、Ｂ２Ｍ、及びＣＤ４Ｐ１を、ＣＡＲのレンチウイルス骨格へとクローニングした。その目的のために、ＣｌａＩ酵素及びＥｃｏＲＩ酵素並びに緩衝液３．１（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）による消化を、プロモータを放出するためにＣＡＲの元のプラスミドに対して、及びキメラプロモータを得るためにｐＵＣ５７の構築物に対して、３７℃で１．５時間行った。バンドを超高純度アガロースゲルから単離し、ライゲーションを同様に行った。コンピテント細菌を形質転換し、陽性コロニーを、プライマー順方向ｃＰＰＴ臨床（５’－ＧＴＧＣＡＧＧＧＧＡＡＡＧＡＡＴＡＧＴＡＧ－３’）及びＲｖ ＣＤ１９（５’－ＴＡＣＡＧＧＡＣＴＴＴＣＴＴＴＣＴＧＣＣ－３’）を用いたコロニーＰＣＲによって再度確認した。陽性コロニーのためのミニプレップを同じキットで実施し、ＨｉｎｄＩＩＩパターン及びシーケンシングによって確認した。
３．細胞培養
ａ．細胞株培養
３．細胞培養
ａ．細胞株培養
４つの細胞株を培養した。レンチウイルスベクターの生成に使用した細胞株は、ＨＥＫ－２９３Ｔ（ヒト胎児腎臓細胞、ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ－１１２６８（商標））であった。これらは、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）（Ｇｉｂｃｏ）及び１％ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｐ／Ｓ；各０．５％）（Ｂｉｏｗｅｓｔ）を補完した、ＤＭＥＭ（ダルベッコ改変イーグル培地）培地（Ｂｉｏｗｅｓｔ）を含むＴ１７５フラスコ中で培養した接着性細胞である。ＢｘＰＣ－３株（ヒト膵臓腺癌細胞、ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ－１６８７（商標））もまた、１０％ＦＢＳ及び１％Ｐ／Ｓを補完したＲＰＭＩ－１６４０（Ｒｏｓｗｅｌｌ Ｐａｒｋ Ｍｅｍｏｒｉａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）培地（Ｂｉｏｗｅｓｔ）を含むＴ２５フラスコ中で培養した接着細胞株である。Ｊｕｒｋａｔ株（急性Ｔ細胞白血病細胞株、ＡＴＣＣ（登録商標）ＴＩＢ－１５２（商標））及びＮａｍａｌｗａ株（バーキットリンパ腫細胞株、ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ－１４３２（商標））はまた、両方ともＴ２５フラスコで培養した、１０％ＦＢＳ及び１％Ｐ／Ｓを補完したＲＰＭＩ－１６４０培地で培養した懸濁細胞である。
４つの細胞株を３７℃の温度のインキュベータ内で保持した。ＨＥＫ－２９３Ｔを１０％の二酸化炭素（ＣＯ２）を含む雰囲気中で保持したが、一方で残りの３つの株は５％のＣＯ２を含む雰囲気で保持した。約１×１０６細胞／ｍＬの細胞密度を維持しながら、細胞を週に３回継代した。
ｂ．初代Ｔ細胞の培養
ｂ．初代Ｔ細胞の培養
健常ドナーの動員末梢血から初代Ｔ細胞を得た。末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を、その目的のために、リンパ球を分離するために特異的な培地であるＬｙｍｐｈｏｓｅｐ（Ｂｉｏｗｅｓｔ）を用いる密度勾配遠心分離によって末梢血から単離した。遠心分離は、停止又は加速をせずに４００ｇで３０分間行った。連続的な洗浄を実施し、ＣＤ３を除くほとんどのＰＢＭＣ表面マーカーを標的とする磁性ミクロスフェアコンジュゲート抗体の混合物からなる、ＭＡＣＳｘｐｒｅｓｓ（登録商標）Ｐａｎ Ｔ Ｃｅｌｌ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎキット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を用いて細胞カクテルからＴリンパ球を単離したので、Ｔ細胞（ＣＤ３＋）を除く全ての細胞型の負の枯渇に基づく磁気分離法を構成する。単離したＴ細胞を、５％ヒトＡＢ血清（Ｂｉｏｗｅｓｔ）、１％Ｐ／Ｓ、及び２０ＩＵ／ｍＬのインターロイキン－２（ＩＬ－２）（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）で補完したＴ細胞に特異的な培地である、ＴｅｘＭＡＣＳ（商標）培地（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を用いて培養し、３７℃及び５％ＣＯ２のインキュベータ内に保った。細胞成長を促進するために、ポリマー抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８ナノマトリックスであるＴ細胞ＴｒａｎｓＡｃｔ（商標）（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を用いて、ＴＣＲを通してＴ細胞を刺激した。１×１０６細胞／ｍＬの細胞密度を維持しながら、細胞を週に２回～３回継代した。
４．レンチウイルスベクターの生成
４．レンチウイルスベクターの生成
ベクターは、パッケージング細胞としてＨＥＫ－２９３Ｔ細胞を用いて生成した。細胞を、９０％を超えるコンフルエンスを有する６ウェルプレート（Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）に播種した。
ａ．トランスフェクション
ａ．トランスフェクション
３つのレンチウイルスゲノム由来プラスミドの使用を含む、第二世代のパッケージングシステム：（１）移入プラスミド（Ｂ２Ｍ－ＳＥＷＰ及びＢ２Ｍ－ＣＡＲ）；（２）ＨＩＶウイルスのパッケージングプラスミド（ｐＣＭＶ８．９）、及び（３）感染力の最大範囲を有するエンベローププラスミド（ｐＭＤ２．Ｇ）ＶＳＶ－Ｇを使用した。それぞれ１０：７：３の比率が前記プラスミド間で維持された。選択したトランスフェクタント剤は、ＬｉｐｏＤ２９３（商標）（ＳｉｇｍａＧｅｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）であった。トランスフェクションを無血清ＤＭＥＭで行い、トランスフェクションの５時間後にＯｐｔｉｍｅｎ（Ｇｉｂｃｏ）を用いて培地交換を行って、ＶＳＶ－Ｇの長期毒性を排除し、その後の濃縮を容易にした。
ｂ．ウイルス上清及び濃縮の回収
ｂ．ウイルス上清及び濃縮の回収
３回の収集を行い、第１の収集をトランスフェクションの２４時間後に行い、第２の収集を４８時間後に行い、第３の収集を７２時間後に行った。上清中に存在するウイルス粒子を滅菌５ｍＬシリンジ（Ｔｅｒｕｍｏ）を用いて回収し、孔径０．４５μｍのフィルタ（Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて濾過した。ウイルス粒子を、１００ｋＤのＡｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ－１５フィルタ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いて、１８００ｇにて４℃で遠心分離によって濃縮した。ベクターを－８０℃で保存した。
ｃ．滴定
ｃ．滴定
フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ Ｃａｎｔｏ ＩＩ、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）によって効率的な粒子を計算することによって、ベクター滴定（形質導入単位／ミリリットル；ＴＵ／ｍＬ）を行った。
５．細胞形質導入
５．細胞形質導入
ＧＦＰベクターの場合、５つの細胞型：Ｊｕｒｋａｔ、Ｎａｍａｌｗａ、ＨＥＫ－２９３Ｔ、ＢｘＰＣ－３、及び初代Ｔ細胞の形質導入を行った。Ｊｕｒｋａｔ及びＮａｍａｌｗａ細胞に関して、４８ウェルプレートにウェル当たりで１００，０００細胞を播種し、ウイルスベクターを添加した。形質導入効率を改善するために、細胞をスピノキュレーションに供した。接種は、細胞－ベクター接触を促進するための８００ｇ、３２℃、１時間での遠心分離プロセスである。２９３Ｔ細胞の場合、１００，０００個の細胞もまた播種した。ＢｘＰＣ－３細胞については、２４ウェルプレートにウェルあたり５０，０００個の細胞を播種した。最後に、Ｔ細胞の場合、９６ウェルプレートにウェル当たり２００，０００個の細胞を播種し、Ｔ細胞ＴｒａｎｓＡｃｔ（商標）を用いて２４時間にわたりＴＣＲに形質導入する前に活性化した。形質導入をスピノキュレーションによって行った。全ての場合において、形質導入の５時間後に培地交換を行い、形質導入されたＴ細胞のパーセンテージを３日後にフローサイトメトリーによって決定した。
ＣＡＲベクターの場合、Ｊｕｒｋａｔ細胞及び初代Ｔ細胞において、同じ方法に従って形質導入を行った。
６．ＲＴ－ＰＣＲ
６．ＲＴ－ＰＣＲ
この技術は、Ｔｒｉｚｏｌ（Ａｍｂｉｏｎ）でメッセンジャＲＮＡを抽出した約７００，０００個のＴ細胞を用いて行った。得られたら、全ての試料に同量のｍＲＮＡを入れることによってメッセンジャＲＮＡの逆転写を行った。その後、相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を希釈し、表１に添付したプライマーを用いて全試料のリアルタイムＰＣＲを２連で行った。
７．フローサイトメトリー
フローサイトメトリー実験のために、２０，０００個～５０，０００個の細胞を、表２に添付される異なる抗体で染色した。
８．統計データ分析
統計データ分析を、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ６を用いて、平均、平均に関連する標準偏差（ＳＥＭ）、及びｐ＜０．００１についての有意性＊＊＊を伴う両側対応のないスチューデントｔ検定を用いて行った。
結果
キメラプロモータのインシリコ設計
結果
キメラプロモータのインシリコ設計
本発明を達成するための最初の工程は、ｅＧＦＰ及びＣＡＲの発現を調節するためにその後使用されたプロモータを設計することであった。
β－２ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）は、ＴＣＲの発現パターンと同様の発現パターンを呈し得ることが観察されている。Ｂ２Ｍは、全ての有核細胞に存在するクラスＩ主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）の構造タンパク質である。その存在は、この複合体への安定な抗原結合にとって基本的であるが、一方でその非存在は、ＣＤ８＋Ｔ細胞を発達させることができない。
Ｂ２Ｍ由来プロモータは、ＴｅｔＯ領域の有無、及びＥｎｓｅｍｂｌによって定義されるエンハンサの位置が互いに異なる。
その後、プロモータをレンチウイルスＧＦＰ骨格にクローニングし、構築物をＣＡＲ含有レンチウイルス骨格へのクローニングのために選択した（図１Ａ）。
キメラプロモータを有するＧＦＰ＋Ｔ細胞の産生
キメラプロモータを有するＧＦＰ＋Ｔ細胞の産生
本発明のプロモータがレンチウイルスＧＦＰ＋骨格へとクローニングされると、レンチウイルスベクターを産生して初代Ｔ細胞を形質導入することを可能にし、これにより、以前に設計されたプロモータの各々の下でｅＧＦＰレポータ遺伝子を発現するＴ細胞を産生することができる。
レンチウイルスベクターを上記で説明した方法に従って産生し、本発明のベクターの力価をＴ細胞形質導入の前の工程で計算した。本発明のウイルスベクターが滴定されたら、同じプロセスに従って、７０％を超えるＴ細胞（ＣＤ３＋）の集団から以前に単離された初代Ｔ細胞を形質導入する。
Ｂ２ＭはＴＣＲの発現パターンを模倣する
Ｂ２ＭはＴＣＲの発現パターンを模倣する
Ｂ２Ｍ由来プロモータの制御下においてＧＦＰの発現を研究するために、タンパク質とメッセンジャＲＮＡとの両方を研究した。その意味で、ＧＦＰ及びＣＤ３メッセンジャ並びにタンパク質動態が産生された。
異なる時点でのＧＦＰ及び抗ＣＤ３抗体コンジュゲート蛍光色素の両方の蛍光中央値に基づいてデータを分析した。
Ｂ２Ｍ由来プロモータに関して、タンパク質レベルでは、ＧＦＰの発現がＣＤ３の生理学的発現を適正に複製することがＢ２Ｍ Ｅｎｈ５’において観察され得る。Ｂ２Ｍの場合、ＧＦＰの発現は、ＣＤ３の場合と異なり、０～８時間の間隔で増加する。興味深いことに、Ｂ２Ｍとの唯一の違いが転写開始部位から１０ｂｐのＴｅｔＯオペロンの挿入であるＢ２Ｍ ＴｅｔＯベクターでは、前記発現の増加が８時間で観察されるので、ＧＦＰの発現パターンはＣＤ３の発現パターンにより類似している。
メッセンジャＲＮＡレベルでは、タンパク質のパターンと非常に類似したパターンが観察され、Ｂ２Ｍ Ｅｎｈ５’ベクターは、ＣＤ３パターン、続いてＢ２Ｍ ＴｅｔＯプロモータを最もよく模倣するものである。しかしながら、両方の場合において、８時間でのｅＧＦＰの発現低下は、ＣＤ３で観察されたものよりも顕著である。８時間後、ｅＧＦＰとＣＤ３との間のパターンは実質的に同一である。
ＧＦＰ＋Ｔ細胞の表現型は、経時的に高分化状態へと変化する。
ＧＦＰ＋Ｔ細胞の表現型は、経時的に高分化状態へと変化する。
Ｔ細胞でのキメラプロモータの制御下におけるＧＦＰの発現動態の研究と並行して、細胞表現型の時間進化の研究を、その目的のために、２つの抗体、すなわち抗ＣＤ６２Ｌ抗体及び別の抗ＣＤ４５ＲＡ抗体、３つ全てのエクソンを保存するＣＤ４５イソ型を用いて行ったので、これは、全てのイソ型の中で最も高い分子量を有する。膜におけるこれらのマーカーの選択的発現は、Ｔ細胞に典型的な４つの表現型：メインメモリＴ細胞、セントラルメモリＴ細胞、エフェクタＴ細胞、及びエフェクタメモリＴ細胞を区別することを可能にする。
Ｂ２Ｍプロモータの場合、７日間細胞集団は依然として主なメモリ細胞集団である。
キメラＢ２Ｍプロモータを有するＣＡＲ＋Ｔ細胞の産生。
キメラＢ２Ｍプロモータを有するＣＡＲ＋Ｔ細胞の産生。
ＧＦＰを導入遺伝子として用いて結果が得られたら、ＢＭ２プロモータをＣＡＲベクターにクローニングした。プロモータを第３世代ＣＡＲのレンチウイルス骨格にクローニングし、材料及び方法のセクションで詳細に記載されているレンチウイルスベクターを産生した後、Ｔ細胞にＣＡＲベクターを形質導入した。
この構築物（図１及び図２）では、ＬＴＲは組込みを可能にする。ＥＧＦＲｔは、必要に応じてＣＡＲ＋細胞を枯渇させることを可能にし（モノクローナル抗体セツキシマブの使用）、蛍光色素コンジュゲート抗ＥＧＦＲｔ抗体を用いてＣＡＲを間接的に検出することを可能にする、切断型上皮成長因子の受容体をコードする。Ｔ２Ａは、長いペプチドを２つの短いペプチドに切断することを可能にする自己切断ペプチドである（ＣＡＲ及びＥＧＦＲｔは組換えタンパク質として一緒にコードされ、このメカニズムの結果として分離されるため）。ＷＰＲＥは、ウイルスベクター力価及び導入遺伝子発現の両方を増強する転写後調節エレメントである。
健常ドナーの動員末梢血からの陰性磁気免疫選択によって処理された新鮮Ｔ細胞を使用した。形質導入を、１００，０００個のＴ細胞において５０μＬのベクターを用いるスピノキュレーションによって行った。ＣＡＲの発現を形質導入の７２時間後に決定した。Ｂ２Ｍプロモータでは１８％のＣＡＲの発現が観察された。ＣＡＲ３Ｇ（ＣＡＲがＥＦ１－αプロモータの制御下において発現される、元のレンチウイルスベクター）を陽性染色及び形質導入対照として使用した。ＮＴＤ細胞を陰性対照として使用した。
Claims (15)
- 配列番号１若しくは配列番号２の配列を含む若しくはそれらのみからなる、又は配列番号１若しくは配列番号２と少なくとも９５％の同一性を有する配列を含む若しくはそれらのみからなる、ポリヌクレオチド。
- 配列番号１の前記配列を含む若しくはそれらのみからなる、又は配列番号１と少なくとも９５％の同一性を有する配列を含む若しくはそれらのみからなる、ポリヌクレオチド。
- 配列番号２の前記配列を含む若しくはそれらのみからなる、又は配列番号２と少なくとも９５％の同一性を有する配列を含む若しくはそれらのみからなる、ポリヌクレオチド。
- 配列番号１又は配列番号２の前記配列のみからなる、ポリヌクレオチド。
- 配列番号１の前記配列のみからなる、ポリヌクレオチド。
- 配列番号２の前記配列のみからなる、ポリヌクレオチド。
- 請求項１～６のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを含む、遺伝子構築物。
- 前記遺伝子構築物が、ウイルスベクターである、請求項７に記載の遺伝子構築物。
- 前記ウイルスベクターが、レンチウイルスベクターである、請求項８に記載の遺伝子構築物。
- 前記プロモータが、細胞外リガンド結合ドメイン、膜貫通ドメイン、及び少なくとも１つの細胞内シグナル伝達ドメインを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）に操作可能に結合している、請求項７～９のいずれか一項に記載の遺伝子構築物。
- 請求項１～６のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド又は請求項７～１０のいずれか一項に記載の遺伝子構築物で形質転換又は形質導入された、細胞。
- 前記細胞が、免疫細胞である、請求項１１に記載の細胞。
- 前記細胞が、炎症性リンパ球、細胞傷害性Ｔリンパ球、制御性Ｔリンパ球、又はヘルパーリンパ球からなる群より選択される、請求項１２に記載の免疫細胞。
- 治療における使用のための、請求項１～６のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド、請求項７～１０のいずれか一項に記載の遺伝子構築物、又は請求項１１～１３のいずれか一項に記載の細胞。
- 癌が、好ましくは、新生物、Ｂ細胞新生物、リンパ腫、白血病、及び／又は骨髄腫からなる群より選択される、癌の処置におけるその使用のための、請求項１～６のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド、請求項７～１０のいずれか一項に記載の遺伝子構築物、又は請求項１１～１３のいずれか一項に記載の細胞。
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